Влияние излучения газоразрядной плазмы на структурно-функциональное состояние прокариотических и эукариотических клеток

Трофимова, Светлана Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние излучения газоразрядной плазмы на структурно-функциональное состояние прокариотических и эукариотических клеток
ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние излучения газоразрядной плазмы на структурно-функциональное состояние прокариотических и эукариотических клеток"

На правах рукописи Трофимова Светлана Владимировна

ВЛИЯНИЕ ИЗЛУЧЕНИЯ ГАЗОРАЗРЯДНОЙ ПЛАЗМЫ НА СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОКАРИОТИЧЕСКИХ И ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК

03.03.01 физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

6 ИЮН 2013

005061182

Нижний Новгород - 2013

005061182

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского» Министерства образования и науки Российской Федерации на кафедре биомедицины биологического факультета.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, доцент Иванова Ирина Павловна

Официальные оппоненты: Андреева Наталья Николаевна

доктор биологических наук, профессор кафедры нормальной физиологии им. Н.Ю. Беленкова ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Тулупов Геннадий Васильевич

кандидат биологических наук, доцент кафедры физиологии животных ФГБОУ ВПО «Нижегородская сельскохозяйственная академия» Министерства сельского хозяйства Российской Федерации

Ведущая организация:

ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П.Огарева» Министерства образования и науки Российской Федерации, г. Саранск.

Защита состоится 21 июня 2013 года в Ю00 на заседании диссертационного совета Д 220.047.01 при ФБГОУ ВПО «Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия» по адресу: 603107, Н. Новгород, пр. Гагарина, 97.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия».

Автореферат разослан 21 мая 2013 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета (¿¿С-О'Язх-с Иващенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность

Исследование механизмов влияния различных физических факторов является актуальной проблемой биологии. Выявление и анализ биологических эффектов, которые определяются физическими воздействиями на клеточном уровне и организме в целом представляет огромный интерес для исследователей мирового сообщества. В последние несколько десятилетий внимание ученых привлекает низкотемпературная газоразрядная плазма и в частности излучение газоразрядной плазмы (Laroussi М., 1995, 1996; Fridman А. 2008; Иванова И.П., 2005, 2009, 2012; Пискарев И.М., 2013).

Установлены такие эффекты плазмы как бактериццый и спороцидный, активация апоптоза, регенерация, которые представлены в зарубежных научных публикациях (Kieft I.E., 2006; Fridman А., 2008; Kalghatgi S.U., 2006; Laroussi M., 1995, 1996, 2002, 2004, 2009).

К настоящему моменту непосредственные механизмы действия низкотемпературной газоразрядной плазмы не известны, однако в работах: Laroussi М. et al., 2002; Mogul R. et al., 2003; Kieft I. E. et al., 2005; Fridman G., et al., 2006; Kalghatgi S. U., 2006, 2007; Shashurin A. et al., 2008 указывается на изменения структуры мембран, ДНК, ферментативной активности как прокариотических, так и эукариотических клеток.

Данные полученные в научных лабораториях оказываются противоречивыми в отношении вклада различных факторов плазмы (ионы, радикалы, электромагнитные поля, излучение плазмы) в цитотоксическое действие, поэтому исследования в данном направлении представляют интерес.

Известно, что излучение плазмы искрового разряда вызывает торможение пролиферативной активности клеток (Иванова И.П., 2005, 2009, 2012). В зоне разряда в процессе плазмохимических реакций образуются радикальные продукты и активные частицы (Piskarev I.M., 2012; Joshi S.G., 2011; Fridman А., 2008), однако их роль в биологических эффектах не изучена.

До настоящего времени не оценены продукты, образующиеся как в газовой, так и в жидкой фазе после воздействия излучением плазмы и не проводилось исследования структурно-функционального состояния мембран, надмембранных структур, метаболической активности клеток после воздействия излучением плазмы искрового разряда.

В связи с этим комплексное изучение продуктов газовой и жидкой фаз и исследование структурно-функционального состояния прокариотических и эукариотических клеток после воздействия излучением плазмы искрового разряда является актуальным.

Цель и задачи исследования

Цель работы - исследование основных продуктов, образующихся в газовой и жидкой фазах, при генерации искрового разряда. Оценка изменений структурно-функционального состояния прокариотических и эукариотических' клеток под действием излучения плазмы искрового разряда.

Основные задачи исследования

1. Изучение продуктов, образующихся в газовой фазе при генерации излучения плазмы искрового разряда

2. Анализ основных продуктов, образующихся в жидкой фазе, под действием излучения плазмы искрового разряда

3. Исследование функциональных и структурных параметров прокариотических клеток после воздействия излучением плазмы искрового разряда

4. Оценка структурно-функционального состояния эукариотических клеток (эритроцитов, лимфоидных и эпителиальных клеток) после воздействия излучением плазмы искрового разряда

Научная новизна

Доказано образование нитросоединений, содержащих группы СЫ, N11, и органических соединений содержащих группы СН, СС в газовой фазе при генерации излучения плазмы искрового разряда с изучаемыми параметрами.

Впервые показано, что основной вклад в снижение рН и накопление окислителей и восстановителей под действием излучения плазмы искрового разряда дает ультрафиолетовый диапазон с длиной волны Х>185 нм и образующиеся азотистые соединения. Установлено, что под действием изучения плазмы искрового разряда в воде не образуются первичные гидроксильные радикалы и образуются радикалы Н02\ Идентифицировано образование ионов N0," и ЫН4\ Выявлено, что в жидкости под действием излучения плазмы искрового разряда не накапливаются молекулы Н202.

Установлено, что поверхностные надклеточные структуры, гидрофобность мембраны, внутриклеточное рН, перекисное окисление липидов, восстановленное состояние коферментов не оказывают влияния на жизнеспособность прокариотических клеток. Ведущими механизмами в снижении жизнеспособности прокариотических клеток после обработки излучением плазмы искрового разряда являются окислительная модификация белков, повреждение и отслаивание клеточной стенки, а также деградация рибосом и нуклеоида. Показано, что повреждение пептидогликана способствует проникновению излучения плазмы во внутренние структуры

спор и деструктивным процессам в молекулах ДНК.

Впервые в мире показано, что определяющими в механизмах повреждения цитоплазматических мембран эритроцитов под действием излучения плазмы являются окислительная модификация белковых молекул, увеличение восстановленного НАД(Ф)Н и окисленного ФАД. Установлено, что под действием излучения плазмы искрового разряда в эритроцитах не наблюдается интенсификации процессов ПОЛ и значительных изменений в структуре липидов и фосфолипидов мембран.

Впервые показано, что ведущими механизмами в снижении жизнеспособности эпителиальных и лимфоидных клеток являются деградация белковых молекул и надмембранных структур, увеличение восстановленного НАД(Ф)Н и окисленного ФАД, нарушения в структуре цитоплазматической и ядерной мембран, деструктивные процессы в ДНК.

Впервые в мире установлено, что эритроциты крыс, лимфоидные и эпителиальные клетки являются более устойчивыми к действию излучения плазмы искрового разряда, чем прокариотические клетки.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные данные позволяют объяснить биологические эффекты излучения плазмы искрового разряда и дать физиологически обоснованные рекомендации по их использованию при проведении биологических исследований и применении в ветеринарии. Результаты, полученных исследований положены в основу разработанных в НИИ ядерной физики имени Д.В. Скобельцына МГУ имени М.В. Ломоносова в 2011 году экспериментальных устройств ПИЛИМИН серии ИР-10 и ИР-1, генерирующих излучение плазмы искрового разряда. Устройства используются для физиолого-биохимических и физико-химических исследований в НИИ ПФМ НижГМА и НИИ ядерной физики имени Д.В. Скобельцына МГУ.

Данные о механизмах действия излучения плазмы искрового разряда на структурно-функциональное состояние прокариотических и эукариотических клеток могут быть включены в учебные программы по курсам биологии, физиологии, биохимии и патофизиологии при подготовке специалистов медико-биологического и ветеринарного профиля.

Положения, выносимые на защиту

1. При генерации излучения плазмы искрового разряда в газовой фазе разряда образуются нитросоединения (-N-N=0) и соединения содержащие группы -С-Ы и -Ы-Н, а также органические соединения с -С-Н- и -С-С- группами.

2. Под действием излучения плазмы разряда в пробах воды и растворе хлорида натрия снижается рН, накапливаются окислители и восстановители, увеличивается окислительно-восстановительный потенциал. В растворах глюкозы и альбумина под действием излучения плазмы преобладают окислительные процессы.

3. Излучение плазмы искрового разряда обладает бактерицидным действием в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. Ведущими механизмами в снижении жизнеспособности прокариотических клеток после обработки излучением плазмы разряда являются окислительная модификация белков, повреждение и отслаивание клеточной стенки, а также деградация рибосом и нуклеоида.

4. Окислительная модификация белковых молекул, увеличение восстановленного НАД(Ф)Н и окисленного ФАД являются определяющими в механизмах повреждения цитоплазматических мембран эритроцитов.

5. Факторами определяющими цитотоксический эффект излучения газоразрядной плазмы в отношении лимфоидных и эпителиальных клеток являются снижение вязкости мембраны, окисление белковых молекул, увеличение восстановленного НАД(Ф)Н и окисленного ФАД, нарушение целостности цитоплазматической и ядерной мембран, повреждения ДНК.

Апробация работы

Основные результаты диссертации докладывались и обсуждались на: X научной сессии молодых ученых и студентов «Современные решения актуальных научных проблем в медицине (Н.Новгород, 2011); VI региональной конференции молодых ученых-онкологов «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2011); II международной научной конференции «Высокоинтенсивные физические факторы в биологии, медицине, сельском хозяйстве и экологии» (Саров, 2011); VII региональной конференции молодых ученых-онкологов «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2012); VII International conference plasma physics and plasma technology PPPT-7 Reportes (Minsk, 2012); 17-ой Нижегородской сессии молодых ученых (Нижегородская обл., Арзамасский р-н, 2012); международной научной конференции «Приоритетные направления развития науки, технологий и техники» (Шарм-эль-Шейх, 2012); II международной научно-практической конференции «Проблемы и перспективы развития науки в начале третьего тысячелетия в странах СНГ» (Переяслав-Хмельницкий, 2012); международной научной конференции «Актуальные вопросы науки и образования» (Москва, 2012); 40-ой международной Звенигородской конференции по физике плазмы и управляемому термоядерному синтезу (Звенигород, 2013); научной конференции «Ломоносовские чтения» (Москва, 2013).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 15 научных работ из них 7 работ в рецензируемых журналах рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 172 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, характеристики материалов и методов исследования, четырех глав собственных исследований и их обсуждения с заключениями по каждой главе, общим заключением и выводами по работе. Список цитируемой литературы включает 241 источник, из них 84 отечественных и 157 зарубежных авторов. Работа содержит 33 рисунка и 33 таблицы.

Глава 1. Обзор литературы.

В первой главе диссертации изложен литературный обзор научных исследований, посвященных изучению элементарных плазмохимических процессов, факторов плазмы, определяющих биологические эффекты, радикалов и активных частицы, участвующих в метаболизме клетки. Приводиться обзор, имеющихся на сегодняшний день данных о влияние плазмы на прокариотические и эукариотические клетки.

Глава 2. Материалы и методы исследования

В работе использовался генератор излучения плазмы искрового разряда «Пилимин» со следующими характеристиками: 100 мкс - длительность одного импульса, 11 кВ - напряжение, 5,9 х 10"2 Дж - энергия в одном импульсе, 10 Гц - частота импульсов. Устройство «Пилимин» разработано И.М. Пискаревым, ведущим научным сотрудником института ядерной физики им. Д.В. Скобельцына МГУ им. М.В. Ломоносова в 2011 году.

Источником ультрафиолетового излучения служил ОУФК-04 «Солнышко» - облучатель ультрафиолетовый кварцевый 2009 г. выпуска, производства ОАО «ГЗАС им. А.С.Попова», Россия. Диапазон эффективного спектрального излучения примерно 205-315 нм. Облученность объектов в эффективном диапазоне: 1,4 Вт/м2 на расстоянии 0,5м от поверхности.

Все эксперименты выполнены in vitro и объектами исследования служили: 1. газовая фаза разряда; 2. бидистиллированная вода; 3. раствор хлорида натрия; 4. растворы глюкозы и альбумина; 5. грамположительные микроорганизмы Staphylococcus aureus 5913; 6. грамотрицательные микроорганизмы Escherichia coli 775-3; 7. споры микромицетов Alternaría altérnala ВКМ F-1120, Aspergillus niger ВКМ F-1119, Chaetomium globosum BKM F-109, Penicillium chrysogenum BKM F-245; 8. эритроциты белых аутбредных крыс линии Wistar; 9. лимфоидные и 10. эпителиальные клетки аутбредных крыс линии Wistar.

Основные этапы исследования и количество проведенных измерений представлены в таблице 1.

На первых этапах эксперимента идентифицировались активные продукты газовой (по ИК спектрам поглощения бромида калия) и жидкой фаз, во время генерации излучения плазмы искрового разряда. Анализ

продуктов газовой фазы проводили по ИК спектрам поглощения бромида калия. Для оценки продуктов, образующихся в жидкой фазе, использовали бидистиллированную воду (рН-6,2-6,5), физиологический раствор (натрий хлорид 9г/л), растворы глюкозы (1г/л) (Рокетт Фрер, Франция) и альбумина бычьего сывороточного (22г/л) (BioWest, France).

Исследование функционального и структурного состояния прокариотических клеток проводили на антибиотико-резистентном штамме Staphylococcus aureus 5913 и штамме Escherichia coli 775-3, культуры получены в музее микроорганизмов кафедры микробиологии и иммунологии НижГМА. Бактериальные клетки ресуспендировали в растворе Хенкса (Биолот, Россия) до концентрации 10-15х106 клеток в 1 мл.

Для уточнения действия излучения плазмы на пептидогликан и ДНК были использованы споры микромицетов Alternaría altérnala ВКМ F-1120, Aspergillus niger ВКМ F-1119, Penicillium chrysogenum ВКМ F-245, Chaetomium globosum BKM F-109. Культуры получены из Всероссийской коллекции микроорганизмов. Для анализа готовились суспензии с концентрацией 2*106 спор в 1 мл.

Изучение структурного и функционального состояния эукариотических клеток проводили на эритроцитах, лимфоидных и эпителиальных клетках аутбредных крыс линии Wistar.

Для приготовления взвеси эритроцитов, животных после введения гепарина, под эфирным наркозом декапитировали. Гепаринизированную кровь осаждали при 3000 об./мин. Эритроциты три раза отмывали физиологическим раствором с рН 7,2-7,4 и готовили суспензию в растворе Хенкса (Биолот, Россия) в соотношении 1:800.

Штаммы лимфоидных и эпителиальных клеток приобретены в РОНЦ им. Н.Н. Блохина, Москва. Штамм эпителиальных клеток RMK1 получен в 1958 г из протоков молочной железы самок белых беспородных крыс, представлен, в частности альвеолярными структурами и атипичными эпителиальными клетками. Штамм лимфоидных клеток получен в 1958 г от беспородной крысы, получавшей 3,3-дихлорбензидин. Для анализа лимфоидные и эпителиальные клетки ресуспендировали в растворе Хенкса (Биолот, Россия) до концентрации 4-6х 106 в мл.

В работе были использованы методы исследования, представленные в таблице 2.

Полученные в экспериментальных исследованиях значения обрабатывали с помощью прикладных стандартных пакетов программ «Excel» и «Statistica v.6.0». Статистическую значимость различий оценивали по критерию Стьюдента. Результаты экспериментов представлены в таблицах и графиках как М±ш, где М - среднее арифметическое, m - ошибка среднего. К статистически значимым относили различия со значениями показателей на уровне р<0,05 (Гланц С., 1998).

Таблица 1

Основные этапы исследования (п - количество проведенных _измерений)__

№ Этап исследования Экспериментальные серии Кол-во животных

1 Оценка активных продуктов, образующихся в газовой и жидкой фазах, при генерации разряда. Диапазон временных режимов: От 60 до 3600 секунд Газовая фаза (п=20) Бидистиллированная вода (п=470) Раствор хлорида натрия (п=352)

2 Анализ окислительно-восстановительных процессов в растворах. Диапазон временных режимов: От 5 до 600 секунд Р-р глюкозы (п=72) Р-р альбумина (п=63) Р-р глюкоза+альбумин (п=63)

3 Исследование влияния излучения плазмы искрового разряда на структурно-функциональное состояние прокариотических клеток и спор микромицетов. Диапазон временных режимов: От 5 до 1200 секунд Staphylococcus aureus 5913 (n=507) Escherichia coli 775-3 (n=519) Alternaría altérnala BKM F-1120 (n=5) Aspergillus niger BKM F-1119(n=5) Pénicillium chrysogenum BKM F-245 (n=5) Chaetomium globosum BKM F-109 (n=5)

4 Изучение влияния излучения плазмы искрового разряда на структурно-функциональное состояние эритроцитов. Диапазон временных режимов: От 30 до 1800 секунд Эритроциты белых беспородных крыс (n=632) 10

5 Анализ влияния излучения плазмы искрового разряда и УФ-излучения на структурно-функциональное состояние лимфоидных и эпителиальных клеток. Диапазон временных режимов: От 30 до 1800 секунд Эпителиальные клетки (п=647) Лимфоидные клетки (п=658) 9 11

Всего животных 30

Таблица 2

Основные методы исследования_ _

Этапы исследования Методы исследования

Идентификация продуктов в газовой фазе разряда ИК-спекгроскопия (Васильев A.B., 2007)

Анализ продуктов, в жидкой фазе, . при генерации излучения плазмы разряда над поверхностью жидкости 1. pH и окислительно-восстановительный потенциал среды 2. Концентрация окислителей и восстановителей (Беляева Т.В., 2004) 3. Идентификация ОН" и НОг*радикалов (Беляева Т.В., 2004) 4. Концентрация пероксида водорода (Шарло Г., 1969) 5. Образование ионов Ж)з~ 6. Концентрация ионов ЫН4*(Чибисова Н. В., 1999) 7. Идентификация нитрозаминов (Анисимова H.A.,2009)

Оценка окислительно-восстановительных процессов в растворах глюкозы и альбумина 1. pH и окислительно-восстановительный потенциал среды 2. Концентрация окислителей и восстановителей (Беляева Т.В., 2004)

Изучение структурно- функционального состояния прокариотических и эукариотических клеток 1. Оценка жизнеспособности (Скурихина И.М., 1998; Izumov D.S., 2004; Mosmann Т., 1983; Niks М„ 1990) 2. Резистентность мембран эритроцитов (Гитгельзон А.И., 1962; Stolarek R.et al., 1998, Герасимов И. Г.,2007) 3. Молекулярные продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ): низкомолекулярные неокисленные продукты, диеновые конъюгаты, молекулы с цис- и транс-коньюгированными двойными связями, триеновые коньюгаты, ТБК-активные продукты, основания Шиффа (Folch J., 1957; Shenstone F.S., 1971; Wheatley R. Alan, 2000; Smith J B., 1976; Fletcher D.L., 1973) 4. Липидный и фосфолипидный состав мембран (тонкослойная хроматография) (Шаршунова М., 1980; Кейте М., 1975) 5. Окислительная модификация белков (ОМБ): флуоресценция битирозина, триптофана, гликозилированных белков (Davies K.J., 1987; Дубинина Е. Е., 2002; Munch G., 1997) 6. Концентрация сиаловых кислот (Камышников B.C., 2003) 7. Концентрация НАД(Ф) /НАД(Ф)Н+Н и ФАД /ФАДН2 (Farabegoli G., 2003; Жердева В.В., 2012) 8. Гидрофобность мембран (флуоресценция зонда 1,6-дифенил-1,3,5-гексатриена (ДФГ) (Batrakova Е.А., 2003) 9. Микровязкость мембран (флуоресценция пирена) (Луценко М.Т, 2010) 10. Анализ внеклеточного и внутриклеточного (флуоресценция зонда флуоресцеин) pH (Туровецкий В.Б., 1992) 11. Электронно-микроскопический анализ (Саркисов Д.С., 1996) 12. Метод ДНК-комет (Дурнев А.Д., 2006; Östling О., 1984) 13. Окислительно-восстановительный потенциал 14. Концентрация витаминов А и Е (Тарасюк И.В., 2008)

Глава 3. Результаты исследования и обсуждение

3.1. Оценка продуктов образующихся в газовой фазе искрового разряда

После ИК-анализа было установлено, что в газовой фазе образуются нитросоединения такие как нитрозамины (-N-N=0), и соединения содержащие группы -C-N и -N-H, а также органические соединения с -С-Н и -С-С- группами. С увеличением времени воздействия наиболее интенсивно накапливаются нитрозамины. Плазмохимические реакции проходят в воздухе, в составе которого около 75 % азота, 23 % кислорода, до 4% воды и около 0,05% углекислого газа. Ионизация, реакции отрыва атомов и электронов, процессы рекомбинации и прилипания проходят между этими элементами и как следствие, идет образование нитрозосоединений, в частности, таких как -N-N=0 и -N-N-02. Известно, что азотсодержащие соединения, например такие как оксид азота, являются многофункциональными метаболитами (Сосунов A.A., 2000, Ванин А.Ф., 2011), и в зависимости от концентрации вызывают активацию или ингибирование биохимических и физиологических реакций.

Далее была проведена оценка уровня окислителей, восстановителей и некоторых радикальных продуктов в водной фазе.

3.2. Анализ продуктов образующихся в водной фазе при воздействии излучением плазмы искрового разряда

Для оценки влияния различных спектральных областей излучения плазмы на процессы окисления и восстановления обработку проб проводили, поочередно закрывая излучатель фильтрами: 1) 278 нм и выше; 2) 185 нм и выше; 3) без фильтра. Выявлено, что при обработке проб открытым излучателем без фильтра и с фильтром, у которого Л,> 185 нм, наблюдается снижение pH до уровня 2,8-3,0 (рис.1).

Рис. 1. Величина рН в пробах воды после воздействия излучением плазмы в различных режимах

* - статистически значимо относительно контрольной серии, р<0,05.

Накапливаются окислители и восстановители. Однако концентрация восстановителей, титрующихся КМп04 при использовании кварцевого

фильтра, уменьшается в 10 раз в случае с бидистиллированной водой и в 2 раза в случае с раствором хлорида натрия (р<0,05). Вероятно, значительная часть восстановителей образуется в газовой фазе разряда, и затем попадает в жидкость.

Было установлено, что под действием изучения плазмы искрового разряда в воде не образуются первичные гидроксильные радикалы, но образуются радикалы Н02". Перекись водорода образуется в концентрациях ниже 5-30"5 моль/л, присутствуют ионы 1ЧН4+.

УФ-спектроскопический анализ показал наличие в жидкости нитрозаминов. Концентрация этих продуктов при обработке в течение 600 и 1200 секунд возрастает (р<0,05), а при увеличении времени воздействия до 1800 секунд снижается (р<0,05). Можно предположить, что образующиеся нитрозамины расходуются при взаимодействии с другими продуктами.

С помощью ионоселективных электродов идентифицировано образование ионов ЫОз" (азотной кислоты) (рис.2). Концентрация обнаруженных этим методом ионов Ы03" соотносится со снижением рН примерно на 90%.

Время воздействия, сек

Рис. 2. Концентрация N03 в пробах воды после воздействия излучением плазмы

* - статистически значимо относительно контрольной серии, р<0,05.

Величина окислительно-восстановительного потенциала (ОВП) в пробах бидистиллированной воды под действием излучения плазмы повышается с 533±15 до 634±9,8 (р<0,05), т.е. под действие излучения плазмы в воде преобладают окислительные процессы.

При оценке интенсивности окислительно-восстановительных процессов протекающих в растворах глюкозы и альбумина под действием излучения плазмы было показано, что снижение уровня pH и накопление окислителей в растворах органических соединений происходит только при длительном времени воздействия. Концентрация восстановителей в растворе глюкозы после воздействия излучением плазмы возрастает с увеличением времени воздействия, а в растворах, содержащих альбумин, накопления восстановителей не наблюдается, что может быть связано с антиоксидантными свойствами альбумина (Синичкин A.A., 1997). Редокс

потенциал раствора альбумина под действие излучения плазмы увеличивается с увеличением времени воздействия от 314,5±23,7 до 558,8±5,3 (р<0,05). Вещества, растворённые в воде (в нашем случае альбумин), участвуют в окислительно-восстановительных реакциях. Таким образом, в растворе альбумина, исходя из полученных данных, после обработки излучением плазмы усиливаются процессы окисления. 3.3. Влияние излучения плазмы на прокариотические клетки

Установлено, что излучение плазмы искрового разряда,. обладает бактерицидным действием, и обработка в течение 60 секунд приводит к 100% ингибированию пролиферативной активности грамположительных, и грамотрицательных микроорганизмов (концентрация клеток в 1 мл 10х106).

Под действием излучения плазмы при электронно-микроскопическом исследовании выявлено набухание клеток, расслаивание клеточной стенки и отслоение от цитоплазматической мембраны, электронная плотность цитоплазмы неоднородна, рибосомы и нуклеоид не определялись.

Величина гидрофобности цитоплазматической мембраны повышалась на 16-32% (р<0,05) в зависимости от времени воздействия и вида микроорганизма.

Концентрация сиаловых кислот увеличивалась во внеклеточной среде в 1,8 раз (р<0,05) относительно контроля для грамположительных бактерий.

При воздействии излучением плазмы до 30 секунд на бактериальные штаммы в клетках преобладала окисленная форма НАД+, к моменту гибели клеток наблюдался переход в восстановленную форму более значимый для стафилококков, что может свидетельствовать о снижение эффективности работы дегидрогеназ и электрон-транспортной цепи.

Под действием излучения плазмы наблюдалось снижение относительной концентрации молекулярных продуктов ПОЛ в суспензиях обоих штаммов бактериальных клеток: для грамположительных бактерий уровень диеновых коньюгатов (ДК) снижался в 4,5-9 раз (р<0,05), уровень триеновых коньюгатов (ТК) - в 5 раз (р<0,05), уровень оснований Шиффа (ОШ) — в 1,5-1,9 раз (р<0,05); для грамотрицательных бактерий уровень ДК снижался в 3-6 раз (р<0,05), уровень ТК - на 20-50% (р<0,05), уровень ОШ -в 1,5-3 раза (р<0,05). Наблюдалась деградация нейтральных липидов и фосфолипидов с увеличением времени воздействия излучением плазмы, в последнюю очередь деградировала фракция стеринов (рис.2).

В случае с S.aureus уровень флуоресценции битирозина и гликозилированных белков возрастал к 60 секундам обработки в 1,5 и 1,8 (р<0,05) раз соответственно, уровень флуоресценции триптофана снижался на 28-36% (р<0,05) при воздействии в течение 15-30 секунд. Для Е.соИ уровень флуоресценции триптофана при воздействии в течение 15-30 секунд повышался на 33-37% (р<0,05), а уровень флуоресценции гликозилированных белков при тех же временных режимах снижался на 28% (р<0,05).

3000000 2500000

2000000

без воэд. 15 30 60

Время воздействия, сек

□ Оборе кол-во липидов В Кол-во стеринов

Рис. 2. Количество липидов и стеринов в экстракте S.aureus после обработки излучением плазмы искрового разряда

* - статистически значимо по сравнению с контрольной серией, р<0,05 Сравнительный анализ биоцидного и спороцидного эффектов УФ-излучения и излучения плазмы показал, что УФ-излучение ртутной (кварцевой) лампы приводит к более эффективной инактивации бактерий и не приводит к инактивации спор микромицетов. По-видимому, пептидогликан оболочек споры не проницаем для УФ-излучения ртутной (кварцевой) лампы. А некоторые факторы излучения плазмы разрушают многослойный пептидогликан и ДНК внутри споры. Эти данные согласуются с электронно-микроскопическим исследованием. Под действием излучения плазмы наблюдается нарушение целостности внешней оболочки спор и внутриспоровых перегородок.

3.4. Влияние излучения плазмы на эукариотические клетки

3.4.1. Влияние излучения плазмы на структурно-функциональное

состояние эритроцитов

При воздействии излучением плазмы на эритроциты в течение 30-1200 секунд внеклеточная концентрация гемоглобина возрастает от 0,17±0,05 до 0,79±0,14 г/л (р<0,05) что вероятно, связано с образованием пор. Количество теней эритроцитов возрастает при увеличении времени воздействия. В контрольной серии доля теней от общего количества клеток составлял 0,5% (р<0,05); в пробе, обработанной в течение 1200 секунд - 49% (р<0,05) (рис. 3).

Уровень низкомолекурярных неокисленных продуктов снижался при длительном времени воздействия на 31-41% (р<0,05), уровень оснований Шиффа к 1200 секундам снижался на 32% (р<0,05). Изменений остальных показателей ПОЛ зарегистрировано не было. К 1200 секундам обработки доля свободных жирных кислот снижалась на 28% (р<0,05), что согласуется с данными о снижение относительной концентрации низкомолекулярных неокисленных продуктов. Фракция сфингомиелина уменьшалась после обработки излучением плазмы на 25-29% (р<0,05).

без возд. 30 60 300 1200

Время воздействия, сек

В Количество клеток □ Количество теней

Рис. 3. Количество не разрушенных клеток и теней в суспензии эритроцитов до и после обработки излучением плазмы

* - статистически значимо по сравнению с контрольной серией, р<0,05

Относительная концентрация битирозина возрастала постепенно и к 1200 секундам обработки увеличивалась в 17,7 раз (р<0,05). Уровень гликозилированных белков также увеличивался при длительном времени воздействия на 37% (р<0,05).

Содержание сиаловых кислот во внеклеточной среде под действием излучением плазмы уменьшался с 1,9±0.4 до 0,6±0,003 ммоль/л (р<0,05), что указывает на отщепление кислот от поверхности мембраны и процессы распада сиалированных остатков во внеклеточной жидкости.

Окислительно-восстановительный потенциал (ОВП) под действием УФ-излучения монотонно снижался от 214±7.7 до 141,5±16,2 (р<0,05). Воздействие излучением плазмы в течение 60 секунд приводило к снижению ОВП с 222,3±6,6 до 187,6±6 (р<0,05), увеличение времени обработки вызывало незначительное повышение ОВП. Вероятно, изменения ОВП может выступать фактором, способствующим пробою цитоплазматической мембраны, дестабилизации мембрансвязанных ферментов и формированию пор.

Под действием излучения плазмы в эритроцитах увеличивалась доля восстановленного НАД(Ф)Н и окисленного ФАД на 37,5% и 63% (р<0,05) соответственно относительно контрольной серии. Можно предположить, что увеличение доли восстановленного НАД(Ф)Н и окисленного ФАД является результатом нарушений в работе глутатионредуктазы, что в свою очередь приводит к изменению соотношения восстановленной и окисленной формы глутатиона, смещению редокс-равновесия и нарушениям не только в метаболических процессах клетки но и в антиоксидантной защите. 3.4.2. Анализ структурно-функциональных изменений в лнмфоидных и эпителиальных клетках под действием излучения плазмы искрового разряда в экспериментах in vitro

Установлено, что воздействие излучением плазмы в течение 600 секунд

является полулетальной дозой для лимфоидных и эпителиальных клеток. Цитотоксический эффект УФ-излучения кварцевой лампы и излучения плазмы при воздействии в течение 300 секунд является сопоставимым.

Электронно-микроскопический анализ показал, что в лимфоидных и эпителиальных клетках при обработке излучением плазмы в течение 30 минут наблюдались нарушения в структуре цитоплазматической и ядерной мембран.

Гидрофобность мембран лимфоидных клеток при воздействии УФ-излучением кварцевой лампы постепенно возрастала с увеличением времени воздействия от 0,15±0,06 до 0,79±0,17 (р<0,05), а при воздействии излучением плазмы гидрофобность достигала максимальных значений к 300 секундам обработки в 2,2 раза (р<0,05) и снижалась при более длительных временных режимах в 1,75 раз относительно контроля и в 3,9 раз относительно пробы, обработанной в течение 300 секунд (р<0,05). Изменения гидрофобное™ мембран эпителиальных клеток под действием УФ-излучения носили схожий характер, а под действием излучения плазмы изменений гидрофобное™ выявлено не было.

Микровязкость мембран лимфоидных и эпителиальных клеток под действием излучения плазмы снижалась и в липидном бислое и в зоне белок-липидных контактов в 1,7-2,6 раз (р<0,05). Однако изменения микровязкости белок-липидных зон в мембранах эпителиальных клеток были менее выражены, чем для лимфоидных клеток, как и изменения гидрофобное™ мембран.

Концентрация сиаловых кислот во внеклеточной среде эпителиальных клеток максимально возрастала к 600 секундам обработки на 43% (р<0,05), увеличение времени воздействия приводит к уменьшению концентрации сиаловых кислот на 41% (р<0,05) относительно пробы обработанной в течение 600 секунд. Статистически значимое увеличение концентрации сиаловых кислот в суспензиях лимфоидных клеток происходило только после обработки в течение 1200 секунд и возрастало на 61% (р<0,05) относительно контрольной пробы.

Накопления продуктов перекисного окисления липидов под действием излучения плазмы зарегистрировано не было. Процентное содержание холестерина к 1200 секундам обработки увеличивалось на 14-19% (р<0,05). Доля триглицеридов уменьшалась на 39-46,5% (р<0,05). Изменения основных компонентов фосфолипидов мембран для изученных типов клеток имели разнонаправленный характер. В случае с эпителиальными клетками процентное содержание фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина возрастало на 36,8% и 38% (р<0,05), а для лимфоидных клеток -уменьшалось на 35% и 86% (р<0,05). Однако доля фосфатидилэтаноламина снижалась при увеличении времени воздействия на эпителиальные клетки на 30% (р<0,05). Для лимфоидных клеток было выявлено увеличение содержания фосфатидной кислоты на 6%, фосфатидилсерина и сфингомиелина в 2 раза на длительных режимах воздействия (р<0,05).

В лимфоидных клетках под действием излучения плазмы к 1200

секундам обработки уровень битирозина и гликозилированных белков возрастал в 2,4 и 2,3 раза (р<0,05) соответственно, содержание триптофана снижалось 7,6 раз (р<0,05). В эпителиальных клетках возрастание содержания битирозина и гликозилированных белков было менее выражено на 15% и 43% (р<0,05) соответственно, уровень триптофана снижался к 1200 секундам обработки в 9 раз (р<0,05).

Таблица 3

Уровни битирозина, триптофана и гликозилированных белков в суспензиях лимфоидных и эпителиальных клеток после обработки излучением плазмы,

отн.ед./мг белка

Время возд, сек Лимфоидные клетки Эпителиальные клетки

Битирозин Триптофан Глик. белки (хЮ"1) Битирозин Триптофан Глик. белки (хЮ"')

Без возд. 70±1,6 39,7±0,1 1,8±0,02* 30±0,69 39,7±0,5 1,6±0,02

30 80±2,2* 32,4±1,2* 0,21 ±0,02* 30,6±0,19 36,8±0,4* 1,8±0,03*

60 103,8±0,52* 25,9±0,2* 2,7±0,04* 29,7±0,22 30,3±0,7* 1,8±0,06*

300 106,6±3,4* 20±0,1 * 2,9±0,03* 28,1±0,09 5,8±0,3* 2±0,06*

600 145, 9±1,7* 15,2±0,1* 3,3±0,05* 34,4±0,38* 5,1±0,3* 3±0,5*

1200 165,2±0,7* 5,2±0,1 * 4,1±0,1 * 35,3±0,38* 4,3±0,2* 2,8±0,5*

- статистически значимо относительно необработанной серии, р<0,05

30 60 150

бремя воздействия, сек

□ тип 0

В тип 1

□ тип 2

□ тип 3

П тип 4

Рис. 4. Процентное соотношение лимфоидных клеток с разной степенью повреждения ДНК после воздействия излучением плазмы: тип 0 - от 0 до 5%; тип 1 - от 5.1 до 10%; тип 2 - от 10,1 до 15%; тип 3 - от 15 до 20%; тип 4 - > 20% ДНК в хвосте кометы.

* - статистически значимо относительно необработанной серии, р<0,05

Анализ липофильных антиоксидантов показал, что содержание ретинола и токоферола в эпителиальных клетках снижался при воздействии в

течение 600 секунд в 2,6 и 3,5 раза (р<0,05) соответственно, к 1200 секундам их уровень статистически значимо возрастал относительно этих значений. В лимфоидных клетках относительная концентрация токоферола возрастала к 60 секундам обработки на 17% (р<0,05), а ретинола к 600 секундам на 39% (р<0,05), однако к 1200 секундам их содержание снижалось.

Оценка окислительно-восстановительного потенциала показала, что при воздействии УФ кварцевой лампы происходило монотонное уменьшение ОВП на 15-19%, при воздействии излучением плазмы - возрастание на 2337%. Рост окислительно-восстановительного потенциала, вероятно, способствует образованию пор в мембране, а увеличение времени воздействия может приводить к электрическому пробою мембраны.

Под действием излучения плазмы происходило увеличение содержания восстановленной формы НАД(Ф)Н и окисленной ФАД для изученных типов клеток. Вероятно, такие изменения могут быть результатом нарушений в метаболических путях клетки и являться индуктором, в частности, и апоптотических процессов в клетке.

Оценка степени повреждения ДНК показала, что к 1200 секундам обработки количество клеток с более чем 20% ДНК в хвосте комет увеличивается до 81% (р<0,05). Таким образом, излучение плазмы оказывает деструктивное действие на молекулы ДНК эукариотических клеток.

Заключение

Таким образом, по ИК спектрам поглощения установлено накопление нитросоединений (ниитрозаминов) и органических соединений с группировками -С-Н, -С-С— различной кратности в газовой фазе разряда.

Под действием излучения плазмы разряда в пробах воды, растворах хлорида натрия, глюкозы и альбумина снижается рН, увеличивается ОВП, накапливаются окислители и восстановители. Доказано наличие в жидкости радикалов Н02*. В снижение рН растворов основную роль играют окислы азота.

Вероятно, продукты, образующиеся под действием излучения плазмы могут действовать как посредники внутри клетки и участвовать в метаболических процессах, в частности, индуцировать или блокировать апоптоз и пролиферацию клеток (Rauen U. et al., 2007, Chae H. J. et al., 2001, Farias-Eisner R. et al., 1996, Kotamraju S. et al., 2003, Yoshioka Y. et al., 2006). Именно поэтому, изучение отклика клеток на излучение плазмы актуально для биологических и физиологических исследований.

Показано, что излучение плазмы искрового разряда, обладает бактерицидным действием, и обработка в течение 60 секунд приводит к 100% ингибированию пролиферативной активности грамположительных, и грамотрицательных микроорганизмов (концентрация клеток в 1 мл 10x10°). Наблюдается прямая зависимость между повреждением бактериальных клеток и временем воздействия. С увеличение концентрации микроорганизмов в 1 мл время необходимое для 100% ингибирования роста также необходимо увеличивать.

При изучении механизмов бактерицидного действия излучения плазмы искрового разряда показано, что поверхностные надклеточные структуры, гидрофобность мембраны, внутриклеточное рН, перекисное окисление липидов, восстановленное состояние коферментов не оказывают влияния на жизнеспособность прокариотических клеток. Окислительная модификация белков, повреждение, и отслаивание клеточной стенки, а также деградация рибосом и нуклеоида являются ведущими механизмами в снижении жизнеспособности прокариотических клеток после обработки излучением плазмы разряда.

УФ-излучение ртутной (кварцевой) лампы приводит к более эффективной инактивации бактерий и не приводит к инактивации спор микромицетов. Повреждение пептидогликана, способствует проникновению излучения плазмы во внутренние структуры спор и деструктивным процессам в молекулах ДНК.

Механизмы действия излучения плазмы на эукариотические клетки представлены в научной литературе недостаточно, хотя известно об активации процессов апоптоза, некроза а также регенерационных процессах под действием плазмы.

В наших исследованиях, по выявлению ведущих механизмов действия излучения плазмы разряда на эукариотические клетки первоначально, было оценено влияние излучения плазмы на эритроциты лабораторных крыс.

С увеличением времени воздействия на эритроциты внеклеточная концентрация гемоглобина возрастает в 4,6 раза, а внутриклеточное содержимое уменьшается, на 49% возрастает количество теней эритроцитов. При этом не наблюдается интенсификации процессов ПОЛ, и значительных изменений в структуре липидов и фосфолипидов мембран, защита которых обеспечивается липофильными антиоксидантами.

Окислительная модификация белковых молекул (флуоресценция битирозина возрастает в 17,7 раз), увеличение восстановленного НАД(Ф)Н на 37,5% и окисленного ФАД на 63%, вероятно являются определяющими в механизмах повреждения цитоплазматических мембран эритроцитов под действием излучения плазмы.

Далее были исследованы цитотоксические эффекты излучения плазмы искрового разряда на лимфоидных и эпителиальных клетках.

Воздействие излучением плазмы в течение 600 секунд является полулетальной дозой для лимфоидных и эпителиальных клеток.

Изменения гидрофобности, относительных концентраций молекулярных продуктов ПОЛ, липидного и фосфолипидного состава, липофильных антиоксидантов, внутриклеточного рН под действием излучения плазмы не оказывают значительного влияния на жизнеспособность лимфоидных и эпителиальных клеток. Факторами, определяющими цитотоксический эффект излучения плазмы в отношении лимфоидных и эпителиальных клеток, являются повреждение надмембранных структур, снижение вязкости мембраны, окисление белковых молекул, увеличение доли восстановленного НАД(Ф)Н и

окисленного ФАД, нарушение целостности цитоплазматической и ядерной мембран, повреждение ДНК.

Можно заключить, что ведущими механизмами бактерицидного, спороцидного и цитотоксического действия излучения плазмы искрового разряда являются процессы повреждения в молекулах гликопротеинов, протеинов и ДНК. Эукариотические клетки примерно в 10 раз устойчивее к действию излучением плазмы, чем прокариотические.

Выводы

1. В газовой фазе искрового разряда образуются нитросоединения такие как нитрозамины (-N-N=0), и соединения содержащие группы -С-Ы и -Ы-Н, а также органические соединения с -С-Н и -С-С— группами различной кратности.

2. Под действием излучения плазмы разряда в жидкости снижается рН, увеличивается окислительно-восстановительный потенциал, накапливаются окислители и восстановители.

3. Прокариотические клетки под действием излучения плазмы набухают, отслаивается клеточная стенка, рибосомы и нуклеоид деградируют.

4. Повреждение пептидогликана способствует проникновению излучения газоразрядной плазмы во внутренние структуры спор и процессам деградации в молекулах ДНК.

5. С увеличением времени воздействия излучением плазмы разряда на эритроциты внеклеточная концентрация гемоглобина возрастает в 4,6 раза, за 600 - 1200 секунд повреждается 50% мембран эритроцитов.

6. Окислительная модификация белковых молекул, увеличение восстановленного НАД(Ф)Н на 37,5% и окисленного ФАД на 63%, являются определяющими в механизмах повреждения цитоплазматических мембран эритроцитов под действием излучения плазмы.

7. Излучение газоразрядной плазмы вызывает снижение (1,7 - 2,6 раз) вязкости цитоплазматической мембраны и нарушение в структуре мембран лимфоидных и эпителиальных клеток.

8. Излучение плазмы разряда оказывает повреждающее действие на молекулы ДНК эукариотических клеток (количество клеток с содержанием ДНК в хвосте комет более чем 20% увеличивается до 81%).

9. Мембраны эритроцитов крыс, эпителиальные и лимфоидные клетки более устойчивы к излучению плазмы искрового разряда (после воздействия в течение 600 секунд остается 50% жизнеспособных клеток), чем прокариотические клетки (100% ингибирование роста через 60-120 секунд).

Практические рекомендации

1. Полученные данные позволяют дать физиологически обоснованные рекомендации по рациональному использованию излучения плазмы искрового разряда в исследовательских и прикладных целях.

2. Обработка поверхностей излучением плазмы в течение 60-120 секунд приводит к 100% бактерицидному эффекту. Обработка в течение 10-20 минут приводит к инактивации спор микромицетов.

3. Полученные в работе данные по влиянию излучения плазмы искрового разряда на структурно-функциональное состояние эукариотических и прокариотических клеток могут быть включены в учебные программы по курсам физиологии, биохимии, биологии и при подготовке специалистов медико-биологического и ветеринарного профиля.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Публикации в рецензируемых изданиях рекомендованных ВАК РФ:

1. Иванова, И.П. Влияние активных форм кислорода низкотемпературной газоразрядной плазмы на резистентность мембран клеток / И.П. Иванова, С.В.Трофимова, И.М. Пискарёв // Вестник Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского. - 2011. - №2(2). - С. 190-195

2. Иванова, И.П. Анализ активных продуктов излучения плазмы искрового разряда, определяющих биологические эффекты в клетках / И.П. Иванова, C.B. Трофимова, Н. Карпель Вель Лейтнер // Современные технологии в медицине. - 2012. - №2. - С. 20-30

3. Иванова, И.П. Исследование механизмов биоцидного действия излучения плазмы искрового разряда / И.П. Иванова, С.В.Трофимова, И.М. Пискарев // Современные технологии в медицине. — 2012. -№3.-С. 12-18

4. Пискарев, И.М. Образование активных частиц при искровом электрическом разряде и их возможное применение / И.М. Пискарев, И.П. Иванова, C.B. Трофимова // Химия высоких энергий. - 2012. - №5. - С. 406411

5. Трофимова, C.B. Анализ структурных изменений прокариотических и эукариотических клеток под действием излучения плазмы искрового разряда / C.B. Трофимова, И.П. Иванова, М.Л. Бугрова // Фундаментальные исследования. - 2013. -№4. - С. 130-133

6. Иванова, И.П. Влияние излучения плазмы искрового разряда на модификацию белков и липидов / И.П. Иванова, C.B. Трофимова, И.М. Пискарев//Фундаментальные исследования.-2013. —№1.-С. 572-575

7. Пискарев, И.М. Химические эффекты самостоятельного искрового разряда, моделирование процессов в жидкости / И.М. Пискарев, И.П. Иванова, C.B. Трофимова // Химия высоких энергий. - 2013. - №2. - С. 152156

Публикации в научных журналах, сборниках научных статей, материалах конференций:

1. Трофимова, C.B. Исследование спороцидного эффекта некогерентного импульсного излучения плазмы искрового разряда / C.B. Трофимова, И.П. Иванова, Д.В. Кряжев // Медицинский альманах. Спецвыпуск. - 2011. — С. 174

2. Трофимова, С.В. Влияние ультрафиолетового излучения на клетки лимфосаркомы Плисса в эксперименте in vitro / С.В. Трофимова, О.О. Сошникова, О.Е. Бурхина // Сибирский онкологический журнал. Приложение № 1.-2011.-С. 116

3. Иванова, И.П., Влияние излучения низкотемпературной плазмы на уровень флуоресценции тирозина и триптофана эритроцитов интактных крыс и с лимфосаркомой Плисса в эксперименте in vitro / И.П. Иванова, С.В. Трофимова, В.А. Сысоева // Сибирский онкологический журнал. Приложение №1.-2012.-С. 160-161

4. Trofimova, S.V. Influence of main factors of plasma spark radiation on the functional state of the cells / S.V. Trofimova, I. P. Ivanova, I. M. Piskarev // VII International conference plasma physics and plasma technology PPPT-7. - Minsk, Belarus. - September 17-21, 2012. - P. 690-693

5. Иванова, И.П., Влияние плазмы искрового разряда на уровень окислителей и восстановителей в модельных растворах / И.П. Иванова, С.В. // Международный журнал экспериментального образования. - 2012. - №6. -С. 12

6. Трофимова, С.В. Влияние основных факторов излучения плазмы на окисление в модельных растворах / С.В. Трофимова // II Международная научно-практическая конференция «проблемы и перспективы развития науки в начале третьего тысячелетия в странах СНГ». - Переяслав-Хмельницкий. -2012.-С. 8-10

7. Иванова, И.П. Влияние излучения плазмы искрового разряда на модификацию белков и липидов / И.П. Иванова, С.В. Трофимова, И.М. Пискарев // Современные наукоемкие технологии. — 2012. —№2. — С. 30-32

8. Ivanova, I.P. Initial stage of lipid peroxidation with H02- radicals. Kinetic study / I.P. Ivanova, I.M. Piskarev, S.V. Trofimova // American Journal of Physical Chemistry. - 2013. - Vol. 2(2). - P. 44-51

Выражаем искреннюю благодарность за помощь в обсуждении результатов, участие в постановке методов и публикации совместных работ к.физ.-мат.н., в.н.с. НИИ ядерной физики им. Д.В. Скобельцина МГУ Пискареву И.М.. Благодарим за помощь в подготовке и осуществлении метода ДНК-комет к.б.н., с.н.с. отдела биохимии ЦНИЛ НижГМА Жабереву А.С., за консультацию и помощь в проведении МТТ теста и оценку жизнеспособности клеток к.б.н., с.н.с. группы клеточных технологий НИИ ПФМ НижГМА Ведунову М.В.

Список сокращений

ДК — диеновые конъюгаты ИК - инфракрасный

НАД (Ф) — никотинамиддинуклеотид(фосфат) ПОЛ - перекисное окисление липидов ТК — триеновые конъюгаты ФАД - флавинадениндинуклеотид

Подписано в печать 20.05.2013 Формат 60x84 1/16. Печать офсетная Печ.л. 1 Тираж 100 экз. Заказ №164 Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия 603107, г. Нижний Новгород, проспект Гагарина, 97

Типография НГСХА

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Трофимова, Светлана Владимировна, Нижний Новгород

На правах рукописи 0420135VI 66 г-

Трофимова Светлана Владимировна

ВЛИЯНИЕ ИЗЛУЧЕНИЯ ГАЗОРАЗРЯДНОЙ ПЛАЗМЫ НА СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОКАРИОТИЧЕСКИХ

И ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК

03.03.01 физиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук

Иванова Ирина Павловна

На правах рукописи

Трофимова Светлана Владимировна

ВЛИЯНИЕ ИЗЛУЧЕНИЯ ГАЗОРАЗРЯДНОЙ ПЛАЗМЫ НА СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОКАРИОТИЧЕСКИХ

И ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК

03.03.01 физиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук

Иванова Ирина Павловна

Оглавление

Введение 5

Глава 1. Обзор литературы 11

1.1. Понятие плазмы 11 1.1.1.Элементарные плазмохимические процессы и промежуточные 14 частицы плазмы

1.1.2 Плазмохимические процессы 16

1.2. Факторы плазмы, определяющие биологические эффекты 18

1.3. Радикалы и активные частицы в метаболизме клетки 21

1.4. Влияние плазмы на биологические объекты 24

1.4.1. Влияние плазмы на прокариотические клетки 24

1.4.2. Влияние плазмы на эукариотические клетки 30 Глава 2. Материалы и методы исследования 36

2.1. Характеристика экспериментального материала 3 7

2.2. Параметры исследуемых физических факторов 40

2.3. Основные этапы исследования 41

2.4. Характеристика методов исследования 43

2.4.1. Анализ продуктов газовой фазы, образующихся во время генерации искрового разряда 43

2.4.2. Анализ продуктов, образующихся в водной фазе, после генерации искрового разряда над поверхностью жидкости 43

2.4.3. Оценка структурных и функциональных изменений в клетках 44

2.4.3.1. Жизнеспособность клеток 44

2.4.3.2. Резистентность мембран эритроцитов 46

2.4.3.3. Электронно-микроскопический анализ морфологических изменений в клетках 46

2.4.3.4. Оценка состояния цитоплазматической мембраны 47

2.4.3.5. Определение внеклеточной концентрации сиаловых кислот 48

2.4.3.6. Анализ внеклеточного и внутриклеточного рН. Изучение окислительно-восстановительного потенциала 48

2.4.3.7. Оценка изменений метаболической активности клеток 49

2.4.3.8. Определение уровня ретинола и альфа-токоферола 49

2.4.4. Оценка относительной концентрации молекулярных продуктов радикального окисления липидов. Анализ фосфолипидного и липидного состава мембран 50

2.4.5. Анализ окислительной модификации белков 51

2.4.6. Метод регистрации повреждений ДНК (ДНК-комет) 52

2.4.7. Методы статистической обработки 53 Глава 3. Результаты и их обсуждение 55

3.1. Оценка продуктов образующихся в газовой фазе искрового разряда 55

3.2. Анализ продуктов, образующихся в водной фазе, при воздействии излучением плазмы искрового разряда 58

3.3. Влияние излучения плазмы на прокариотические клетки 74

3.3.1. Структурно-функциональное состояние прокариотических клеток после воздействия излучением плазмы 74

3.3.2. Сравнение биоцидного и спороцидного эффектов УФ-излучения и излучения плазмы искрового разряда 90

3.4. Исследование структурно-функционального состояния эукариотических клеток после воздействия излучением плазмы 97

3.4.1. Изучение влияния излучения плазмы на структурно-функциональное состояние эритроцитов 97

3.4.2. Анализ структурно-функциональных изменений в лимфоидных и эпителиальных клетках под действием излучения плазмы искрового разряда в экспериментах in vitro 113 Заключение 143 Выводы 148 Список цитированной литературы 149

Список сокращений

АОА - антиоксидантная активность

АТФ - аденозинтрифосфорная кислота

АФК - активные формы кислорода

ДК - диеновые конъюгаты

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИК - инфракрасный

ИП - излучение плазмы

ЛФХ - лизофосфатидилхолин

МДА - малоновый диальдегид

+ +

НАД(Ф) /НАД(Ф)Н+Н - никотинамидцинуклеотид(фосфат)

ОВП - окислительно-восстановительный потенциал

ОШ - основания Шиффа

ПОЛ - перекисное окисление липидов

РЛНД - ртутная лампа низкого давления

СЖК - свободные жирные кислоты

СМ - сфингомиелин

СРП - свободно-радикальные процессы

ТБК - 2-тиобарбитуровая кислота

ТГ - триглицериды

ТК - триеновые конъюгаты

УФ - ультрафиолет

ФАД /ФАДН2 - флавинадениндинуклеотид

ФК - фосфатидные кислоты

ФС - фосфатидилсерин

ФХ - фосфатидилхолин

ФЭА - фосфатидилэтаноламин

ХС - холестерин

ЭХС - эфиры холестерина

Введение

Установлены такие эффекты плазмы как бактерицдый и спороцидный, активация апоптоза, регенерация, которые представлены в зарубежных научных публикациях (Kieft I.E., 2006; Fridman А., 2008; Kalghatgi S.U., 2006; Laroussi M., 1995, 1996, 2002,2004, 2009).

До настоящего времени не оценены продукты, образующиеся как в газовой, так и в жидкой фазе после воздействия излучением плазмы и не

проводилось исследования структурно-функционального состояния мембран, надмембранных структур, метаболической активности клеток после воздействия излучением плазмы искрового разряда.

Цель и задачи исследования

Цель работы - исследование основных продуктов, образующихся в газовой и жидкой фазах, при генерации искрового разряда. Оценка изменений структурно-функционального состояния прокариотических и эукариотических клеток под действием излучения плазмы искрового разряда.

Основные задачи исследования

1. Изучение продуктов, образующихся в газовой фазе при генерации излучения плазмы искрового разряда

2. Анализ основных продуктов, образующихся в жидкой фазе, под действием излучения плазмы искрового разряда

Научная новизна

Впервые показано, что основной вклад в снижение рН и накопление окислителей и восстановителей под действием излучения плазмы искрового разряда дает ультрафиолетовый диапазон с длиной волны А>185 нм и образующиеся азотистые соединения. Установлено, что под действием изучения плазмы искрового разряда в воде не образуются первичные гидроксильные радикалы и образуются радикалы Н02в. Идентифицировано образование ионов >Ю3~ и 1ЧН4+. Выявлено, что в жидкости под действием излучения плазмы искрового разряда не накапливаются молекулы Н2Ог.

Теоретическая и практическая значимость работы

Положения, выносимые на защиту 1. При генерации излучения плазмы искрового разряда в газовой фазе разряда образуются нитросоединения (-N-N=0) и соединения содержащие группы -С-Ы и -Ы-Н, а также органические соединения с -С-Н- и -С-С— группами.

Апробация работы

вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2012); VII International conference plasma physics and plasma technology PPPT-7 Reportes (Minsk, 2012); 17-ой Нижегородской сессии молодых ученых (Нижегородская обл., Арзамасский р-н, 2012); международной научной конференции «Приоритетные направления развития науки, технологий и техники» (Шарм-эль-Шейх, 2012); II международной научно-практической конференции «Проблемы и перспективы развития науки в начале третьего тысячелетия в странах СНГ» (Переяслав-Хмельницкий, 2012); международной научной конференции «Актуальные вопросы науки и образования» (Москва, 2012); 40-ой международной Звенигородской конференции по физике плазмы и управляемому термоядерному синтезу (Звенигород, 2013); научной конференции «Ломоносовские чтения» (Москва, 2013).

Публикации

Глава 1. Обзор литературы

К настоящему времени созданы устройства и источники плазмы для биомедицинского применения и исследований: искровые, коронные, барьерные разряды (Kogelschatz U., 2010), струи плазмы (Lu X. et al., 2012) и т.д. Наиболее известные плазмотроны в России для медицины разработаны в МГТУ им. Баумана - это модели "Плазон" и "Гемоплаз-ВП" (Кабисов Р.К. и др., 2001). Созданы установки плазменной очистки питьевой воды (Пискарев И.М., 2001). Ведутся исследования по взаимодействию плазмы с различными веществами (Аристова H.A. и др., 2003; Пискарев И.М. и др., 2013; Иванова И.П. и др., 2013), в том числе с биологическими объектами (Иванова И.П. и др., 2004; Kieft I.E. et. al., 2005; Dobrynin D. et. al., 2009; Suresh G. et. al., 2011; Ivanova I.P. et. al., 2012; Трофимова C.B. и др., 2013). Опыт использования плазменных технологий в хирургии - коблация ("холодное разрушение" - cold ablation: coblation), к настоящему времени насчитывает более 20 лет.

В настоящее время технологии на основе плазмы используются в Японии, США, Франции, Англии, Швеции, Германии, Китае, Сингапуре и на Кубе. Исследования в направлении изучения биологических эффектов плазмы ведутся с использованием разнообразных плазмообразователей (кислород, аргон, азот, воздух и др.). Данные полученные многочисленными группами ученых оказываются противоречивыми в отношении основных действующих факторов плазмы, но некоторые биологические эффекты плазмы (такие как биоцидное действие) подтверждены независимыми лабораториями. 1.1. Понятие плазмы

Известно, что плазма это состояние вещества наиболее распространенное во вселенной (ионосфера Земли, ионосферы планет, звезды и межзвездная среда). На Земле в естественных условиях плазменные образования - это грозовые разряды и определенные виды пламени. Известно, также, что любое вещество может быть в четырёх состояниях: твёрдое состояние, состояние жидкости, газообразное состояние и состояние плазмы.

В лабораториях и промышленности, вещества в состоянии плазмы - это электрические разряды, сварка, неоновая реклама и т.д.

В переводе с греческого плазма - «оформленное», термин, который ввели в XIX в. американские физики Ирвинг Лэнгмюр и Леви Тонко в 1923г. при описании ионизации в газовом разряде.

Процессы выбивания электронов из атомов идут в любом веществе, нагретом до очень высокой температуры, или если через вещество пропускается электрический ток. Атом после отрыва электрона, приобретает положительный заряд и становится ионом - это процесс ионизации. Во время ионизации образуются свободные частицы с положительными и отрицательными зарядами - плазма. Плазма - это газ, который состоит из нейтральных и электрически заряженных частиц, суммарный электрический заряд такого газа равен нулю и выполняется условие квазинейтральности. Квазинейтральность означает, что суммы отрицательных и положительных зарядов примерно равны (Райзер Ю.П., 1987, Чен Ф., 1987).

Степень ионизации плазмы - это важная характеристика, определяющаяся соотношением ионизованных а�

Информация о работе

Трофимова, Светлана Владимировна
кандидата биологических наук
Нижний Новгород, 2013
ВАК 03.03.01

Диссертация

Влияние излучения газоразрядной плазмы на структурно-функциональное состояние прокариотических и эукариотических клеток - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Влияние излучения газоразрядной плазмы на структурно-функциональное состояние прокариотических и эукариотических клеток - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы