Иммунологические показатели при экспериментальном моделировании генерализованных инфекций

Букин, Евгений Константинович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Иммунологические показатели при экспериментальном моделировании генерализованных инфекций
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Иммунологические показатели при экспериментальном моделировании генерализованных инфекций"

ио - £

На правах рукописи

Букин Евгений Константинович

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ МОДЕЛИРОВАНИИ ГЕНЕРАЛИЗОВАННЫХ ИНФЕКЦИЙ

03.00.06 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Кольцове -2008

Работа выполнена в ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России.

Научны й руков одит ел ь:

доктор медицинских наук, профессор Игнатьев Георгий Михайлович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Орловская Ирина Анатольевна

доктор биологических наук Таранин Александр Владимирович

Ведуи/ая организация:

ГУ Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (г. Москва)

Защита состоится « 23 » мая 2008 года в '/ часов на заседании диссертационного совета Д.208.020.01 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово Новосибирской области, 630559; тел. (8-383) 336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор».

Автореферат разослан « > апреля 2008 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Карпенко Л.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

----- Актуальность работы. В течение длительного времени разработка средств профилактики и

лечения инфекционных заболеваний носила эмпирический характер. Лишь последние достижения иммунологии позволили сформулировать общие принципы создания иммунобиологических препаратов. В част ности, экспертами Комитета по биологической стандартизации ВОЗ рекомендовано проводить разработку средств вакцинопрофилактики инфекций в тесной взаимосвязи с изучением иммунопатогенеза заболевания [Capron ct al., 1994]. Имея сведения об особенностях патогенеза изучаемой нозологии, можно вести прицельный поиск терапевтических агентов, влияющих на ключевые патологические звенья заболевания. В связи с этим доклинические испытания вакцин необходимо осуществлять на адекватной экспериментальной модели заболевания, имитирующей основные патофизиологические звенья заболевания у человека. Данный подход подразумевает установление общих закономерностей изменения неспецифических и специфических факторов иммунитета у иммунизированных животных не только в ходе вакцинального процесса, но и после заражения [Игнатьев, 2003]. Без этого нельзя решить принципиальный вопрос: исследуемый препарат неэффективен при данной инфекционной патологии или выбранная экспериментальная модель непригодна для тестирования иммунобиологических препаратов.

Экспериментальные и клинические исследования показывают, что в ответ на внедрение инфекционного агента организм отвечает универсальной, генетически запрограммированной реакцией, реализующейся в виде воспаления. Существуют сложные механизмы регуляции воспаления, но ведущая роль в поддержании гомеостаза отводится системе цитокинов [Черешнев и др., 2001]. Цитокпны - главные сигнальные молекулы иммунной системы, модулирующие активность ей клеток, определяющие активацию врожденного и формирование адаптивного иммунного ответа. В зависимости от превалирующей способности активировать или подавлять развитие воспалительной реакции цнтокнпы подразделяются на провоспалнтельные и противовоспалительные. В последнее время появились убедительные данные о том, что клинический исход инфекции во многом зависит от баланса продукции про-/противовоепалнтельных медиаторов [Черешнев и др., 2001; Bidwell ct al., 1999; Dinarello, 2001; Feldmann e! al., 2004; Rice ct al., 2005]. Кроме того, при системной активации цитокины воздействуют на ткани и органы, не вовлечённые в инфекционный процесс, В этом случае медиаторы вместо защитной функции оказывают повреждающее действие, что наблюдается при генерализованных формах инфекционных заболеваний. Для генерализованных инфекций характерно развитие синдрома системного воспалительного ответа (SIRS - systemic inflammatory response syndrome), концепцию которого разработал R.C.Bone [Bone et al., 1992; Bone, 1996; Bone ct al., 1997]. SIRS - это манифестация определенных клшшко-лабораторных критериев, свидетельствующих об активации цитокиновой сети и комплекса функционально связанных клеток (система фагоцитов, полиморфно-ядерных лейкоцитов, лимфоцитов). Следовательно, изучение реакции цитокиновой

системы играет важную роль для оценки адекватности используемой экспериментальной модели и исследования влияния испытываемых препаратов на течение генерализованных инфекций.

Данный подход мы применили для изучения иммунопатогепеза некоторых генерализованных бактериальных и вирусных инфекций, для которых ранее были разработаны экспериментальные модели на мышах линии BALB/c.

Среди возбудителей кишечных инфекций человека следует выделить энтерогеморрагическую E.coli 0157:Н7, которая вызывает развитие гемолитико-уремичсского синдрома (ГУС), являющегося ведущей причиной острой почечной недостаточности у детей [Karch ct al., 2005]. Многочисленные данные свидетельствуют о том, что ГУС - системная патология, связанная с активацией цитокинового каскада [Ochoa et al., 2003]. Существующие средства терапии E.coli 0157:1-17 инфекции малоэффективны, поэтому разработка вакцин для профилактики заболевания остается актуальной задачей. В настоящий момент все исследованные вакцинные препараты оказались неэффективными, но в ходе испытаний стала ясна протективная роль мукозалыюго иммунитета [Li ct al., 2000; Lovelt, 1998]. Поэтому в качестве кандидатной вакцины нами был предложен препарат ЕНЕС CIP 0157:Н7, полученный по технологии ghosts. Препарат представляет собой бактериальную стенку со всеми поверхностными антигенами в нативной форме, что возможно благодаря контролируемой экспрессии гена Е фага фХ174 в культуре бактерий [Lubitz et al., 1999; Szostak et al., 1996], и способен индуцировать мукозальный иммунитет [Jalava et al., 2003].

Первоначально развитие SIRS ассоциировали с бактериальными инфекциями, но подобный феномен системной активации системы цитокинов встречается и при ряде вирусных заболеваний. В первую очередь это относится к вирусным геморрагическим лихорадкам, в т.ч. и лихорадке Денгс, вызываемой представителем сем. Flaviviridae - вирусом Денге (ВД). Заболевание является наиболее значимой арбовирусной инфекцией человека: только по официальным данным ежегодно регистрируется свыше 50 миллионов случаев лихорадки, и летальность при тяжелых формах заболевания достигает 20% [WHO, 2002]. Несмотря на громадную значимость лихорадки Денге, до сих пор не создано средств специфической профилактики и лечения инфекции. Это диктует необходимость поиска патогенетических средств терапии заболевания.

Ведущим патогенетическим событием при развитии лихорадки Денге является усиление проницаемости сосудистого русла, обусловленного «цитокинопым штормом» и нарушением кадгеринового комплекса эндотелия [Schnittler et al., 2003]. Изменение структуры кадгеринового комплекса возникает в результате его взаимодействия с р-цепыо фибрина, включающего Аминокислотные остатки с 15 по 42-ой (Вр,м2) [Bach et al., 1998]. Показано, что синтетический олнгопептид ВРи.« (препарат FX-06) при моделировании на животных острого нарушения коронарного кровообращения оказывал протективный эффект на сосуды [Pctzelbauer ct al., 2005]. Несколько позднее была установлена способность препарата ингибировать системную продукцию

провоспалительных цитокинов [Zacharowski et al., 2007]. Совокупность этих данных послужила основой для изучения влияния препарата FX-06 на течение экспериментальной ВД-инфекции.

Не менее значимым представителем сем. Flaviviridae является вирус клещевого энцефалита (КЭ), который остаётся ведущей причиной нейроинфекций в Евразии [Burke et al., 2001; Gresikova et al., 1997]. Вирусный КЭ, в отличие от лихорадки Денге, протекает преимущественно с поражением центральной нервной системы, но при ряде летальных случаев, вызванных новыми субтипами вируса, отмечалось развитие геморрагического синдрома [Temovoi et al., 2003]. Подобно лихорадке Денге, при вирусном КЭ генерализация инфекции так же сопровождается системной гиперпродукцией ряда цитокинов, что подтверждено экспериментально [Игнатьев и др., 2003] и клиническими наблюдениями [Тимофеев и др., 2002; Atrasheuskaya et al., 2003]. В настоящее время наблюдается эволюция данной природно-очаговой инфекции: изменение клинической картины заболевания, случаи инфекции среди иммунизированных людей, что, вероятно, связано с проникновением в эндемичные регионы новых субтипов вируса и индивидуальными особенностями иммунного реагирования [Иерусалимский, 2001]. В связи с этим необходим тщательный анализ клинических и экспериментальных данных для решения практической задачи оценки прогноза развития и исхода инфекции КЭ, оценки протективности существующих вакцин. В частности, представляется целесообразным определение общих закономерностей развития иммунного ответа у вакцинированных животных после заражения.

В связи с этим целью работы являлось изучение иммунологических показателей при генерализованных инфекционных заболеваниях на моделях бакгериальной (эитерогеморрагическая Escherichia coli 0157:117) и вирусных (вирус клещевого энцефалита и вирус лихорадки Денге) инфекций, выявление общих факторов иммунопатогенеза и использование новых подходов дня оценки профилактических и лечебных препаратов.

Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:

1. Выявление особенностей иммунного ответа у мышей линии BALB/c при экспериментальном моделировании E.coli 0157:Н7 инфекции.

2. Оценка иммуногенных и протективных свойств препарата ЕНЕС CIP 0157:Н7 ghosts при парентеральной и мукозальной иммунизации мышей BALB/c по показателям неспецифического и специфического иммунитета.

3. Сравнительное изучение системной продукции цитокинов, динамики гуморального и клеточного иммунитета после заражения вирусом клещевого энцефалита интактных мышей BALB/c и мышей, иммунизированных вакциной клещевого энцефалита.

4. Исследование динамики гематологических показателей и системной продукции цитокинов при моделировании у мышей BALB/c экспериментальной лихорадки Денге.

5. Оценка влияния синтетического фрагмента молекулы фибрина ВР1542 (препарат FX-06) на течение экспериментальной вирусной лихорадки Денге.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Впервые продемонстрирована способность препарата ЕМЕС CIP 105282 ghosts индуцировать специфический гуморальный и клеточный иммунный ответ в эксперименте. Показано, что мукозальная иммунизация мышей данным препаратом обеспечивает формирование протективного иммунитета к заражению гетерологичным штаммом E.coli 0157:117.

Впервые показано, что применение препарата FX-06 (синтетического деривата молекулы человеческого фибрина) оказывает терапевтический эффект при экспериментальном моделировании лихорадки Денге на мышах. Полученные данные могут лечь в основу для дальнейшей разработки патогенетических средств терапии вирусной лихорадки Денге у людей.

В результате проделанной работы при моделировании E.coli OI57:H7 инфекции и флавивирусных инфекций была показана возможность динамического мониторинга системного уровня цитокинов для определения тяжести течения и прогнозирования исхода инфекционного процесса, оценки эффективности вакцин и терапевтических препаратов. Положения, выносимые па защиту:

1. Цитокиювая реакция при моделировании E.coli 0157:Н7 инфекции на мышах линии BALB/c соответствует системной продукции некоторых цитокинов (ФНО-а, ИЛ-lp, ИЛ-6 и ИЛ-10) при патологии, обусловленной E.coli 0157:Н7, у людей.

2. Препарат ЕНЕС CIP 105282 ghosts стимулирует специфический гуморальный, в том числе мукозалыгый, и клеточный иммунный ответ. Мукозальная иммунизация препаратом ЕНЕС СИ1 105282 ghosts превосходит по иммуногенным и протектнвным свойствам парентеральный способ иммунизации.

3. Динамика и концентрация сывороточных цитокинов у ннтактных мышей BALB/c и иммунизированных вакциной клещевого энцефалита после заражения вирусом клещевого энцефалита достоверно отличаются.

4. Динамика изменения гематологических показателей и реакция цитокиновой системы при заражении мышей BALB/c адаптированным штаммом вируса Денге 2-го серотипа соответствуют данным характеристикам при вирусной лихорадке Денге у человека.

5. Показана возможность патогенетической •терапии экспериментальной лихорадки Денге с помощью синтетического фрагмента молекулы фибрина врщз.

Апробация работы н публикации. Результаты работы были представлены на следующих международных конференциях: 16th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (Nice, April 1-4, 2006); Молекулярная диагностика инфекционных болезней (Минск, 17-18 мая 2007 года). По материалам диссертации опубликовано пять печатных работ, в том числе три в реферируемых научных журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела «Результаты и обсуждение»,

заключения, выводов и списка цитируемой литературы (26 источников на русском языке и 253 - на английском). Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста, включает 11 таблиц и 14 рисунков.

Список использованных сокращений: в/б — внутрибрюшинно, в/м — внутримышечно, ВД — вирус лихорадки Денге, ГУС - гемолитико-уремический синдром, ИЛ - интерлейшш, ИФА -иммуноферментный анализ, ИФН-у - интерферон-гамма, КЭ - клещевой энцефалит, ЛПС -липополисахариды, ОСО - отраслевой стандартный образец, ОТ-ПЦР - обратная транскрипция -полимеразная цепная реакция, РБТ - реакция бласттрансформации, ФНО-а - фактор некроза опухолей альфа, ЕНЕС - энтерогеморрагнческая Е. coli, CARS - compensatory anti-inflammatory response syndrome (синдром компенсаторного противовоспалительного ответа), SIRS - systemic inflammatory response syndrome (синдром системного воспалительного ответа).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Животные. В работе были использованы сосунки и 4-6-недельные самцы мышей линии BALB/c (гаплотиц Н-211). Животные содержались на стандартном рационе с достаточным количеством воды.

Бактериальные препараты. Энтерогеморрагнческая E.coli серотипа 0157:117 (штамм CIP 103571, получен из коллекции Института Пастера, Франция). Количество жизнеспособных бакгерий в суспензии и в биологических образцах определялось методом подсчёта колоний, образуемых на агаризованной среде Луриа-Бертани. Проверка принадлежности культуры E.coli к серогруппе 0157 осуществлялась с помош>ю лагексного агглгогинационного набора E.coli 0157 Latex Test (Oxoid Ltd., Англия) согласно инструкции производителя.

Препарат ЕНЕС CIP 105282 ghosts был любезно предоставлен профессором Werner Lubitz (University of Vienna, Австрия).

Вирусные препараты. В работе использовали вирус КЭ (штамм Absettarov) и вирус Денге 2-го серотипа (ВД-2, номер депонента в музее вирусов ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» - V345, номер доступа в GcnBank - AY927231), ранее адаптированный к мышам линии BALB/c [Atrashenskaya et al., 2003]. Инфекционную активность вирусных суспензий определяли методом титрования на 4-недельных самцах мышей линии BALB/c при в/б заражении животных. Расчёт активности производили методом Кербера в модификации Ашмарина-Воробьбва [Ашмарин и др., 1962].

Вакцины КЭ. В работе использованы ОСО иммуногснности вакцин КЭ (№ 42-28-48-04П, МИД50 0,007/мл) и культуральная очищенная концентрированная инактивированная сухая вакцина КЭ (серия №884, на основе штамма 205) производства ФГУП НИИПВЭ.

Препарат FX-06 - синтетический олигопептид (GHRPLDKKREEAPSLRPAPPPISGGGYR), содержащий N-коицевой участок ß-цепи молекулы фибрина человека (Bßu^), был любезно предоставлен профессором Peter Petzelbauer (Medical University of Vienna, Австрия).

Диагностическая ОТ-ПЦР для обнаружения РНК вируса КЭ проводилась по ранее описанному протоколу [Годовикова и др., 1994]. Наличие РНК ВД-2 в исследуемом образце осуществляли двухраундовой ОТ-ПЦР с использованием праймеров, структура которых была рассчитана на основании имеющихся в базе GenBank последовательностей ВД с помощью программы OligoScan v. 3.0, разработанной и любезно предоставленной д.б.н. К.М.Чумаковым (Laboratory of Methods Development, FDA, США).

Исследование продукции специфических антител в сыворотке крови и образцах кишечных смывов осуществлялось методом твердофазного ИФА. В качестве специфических антигенов были использованы препарат ЕНЕС CIP 105282 ghosts и вирусные антигены, полученные методом сахарозно-ацетоновой экстракции из мозга инфицированных сосунков мышей.

Исследование показателей клеточного иммунитета проводилось определением числа y-IFN-продуцирующих спленоцитов в ответ на стимуляцию специфическими антигенами с помощью коммерческого набора «ELISpot mouse IFN-y» (R&D Systems, Inc., Minneapolis, CILIA) в соответствии с инструкцией производителя. Параллельно оценивалась пролиферация спленоцитов фотометрическим методом по ранее описанной методике [Scudiero et al., 1988].

Концентрация сывороточных цнтокииов измерялась иа иммуноферментных тест-системах производства «R&D Systems» (Minneapolis, США) в соответствии с инструкцией производителя.

Определение гематологических показателей (количества эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов и величины гематокрита) проводили на гематологическом анализаторе Cell-Dyn 900 (Sequoia-Turner corporation, США) в соответствии с рекомендациями производителя.

Определение концентрации фнбрнногепя в плазме крови проводилось спектрофотометрически по модифицированной методике Wycoff [Wycoff, 1960].

Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения STATISTICA 6.0 (StatSoft, Inc., 2001). В зависимости от эксперимента, были использованы пепараметрические (критерий %2, точный критерий Фишера) и параметрические (дисперсионный анализ) критерии сравнения. Для оценки степени взаимосвязи между показателями рассчитывался ранговый коэффициент корреляции Спирмена (р). Расчёт кривых выживаемости проводился моментным методом Каплаиа-Мейера. Для сравнения кривых выживаемости использовался логранговый критерий.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Изучение нммуногеиных и протективных свойств препарата ЕНЕС CIP 105282 ghosts 1.1 Свойства препарата ЕНЕС CIP 105282 ghosts при пероральном и парентеральном способе иммунизации. Оценка иммуногенных и протективных свойств препарата ЕНЕС CIP 105282 ghosts проводилась на мышах линии BALB/c. Было выбрано несколько схем иммунизации, которые представлены в таблице 1.

Таблица 1

Характеристика групп мышей в эксперименте по изучению свойств препарата ЕНЕС CIP 105282

Группа Количество мышей Препарат Путь введения Кратность ччшщтации Про1псктивность,%

А 70 EHECCIP 105282 (1мг, соответствует 4,8x10'' микробных клеток, в 30 мкл фосфатио-солсвого буфера) пероральный 0 сутки 86,7

В 70 0 и 28 сутки 93,3

С 70 внутримышечный 0 сутки 40,0

D 70 0 и 28 сутки 46,7

Е 70 фосфатно-солевой буфер (30 мкл) пероральный 0 сутки 26,7

F 70 0 и 28 сутки 30,0

Введение исследуемого препарата, так же как и применение плацебо, не вызывало видимых изменений в поведении животных. На 55-е сутки после первой иммунизации все мыши были иптрагастрально заражены гетерологичным, по отношению к вакцинному препарату, штаммом CIP 103571 E.coli 0157:Н7 (Ю8КОЕ/мышь). Перед заражением исследование фекалий мышей во всех группах на наличие E.coli серогруппы 0157 дало отрицательный результат. Наблюдение за животными осуществлялось на протяжении 21 суток после инфицирования. С 4-х суток наблюдали внешние проявления инфекции: снижение двигательной активности и реакции на внешние раздражители, отказ от корма, перед гибелью у большинства мышей отмечались судороги. Гибель животных наблюдалась до 10-х суток. После заражения у мышей группы А и В выделение возбудителя с испражнениями происходило с 1 по 3-й сутки, в то время как в группах, иммунизированных в/м и плацебо, бактерия в фекалиях обнаруживалась в течение 7 суток. Следует отмстить, что в крови у мышей контрольных групп на 5 и 6-е сутки после инфицирования выявили присутствие E.coli серогруппы 0157. У мышей, иммунизировшшых препаратом ЕНЕС CIP 105282, развитие бактериемии не было обнаружено.

Лучший протектившлй эффект был достигнут у животных, иммунизированных per os. Достоверных различий между показателями выживаемости мышей, иммунизированных в/м, и контрольных групп выявлено не было (х2=2,32; р=0,128).

В ходе эксперимента проводилось исследование формирования специфического гуморального иммунитета как системного, так и мукозального (рис. 1). Во всех группах продукция специфических IgG в кишечном тракте была ниже порога чувствительности метода.

Сывороточные IgG

»н

зи-

hJ 2 -

О •

Сьшороточные Ig А

РШЙ

В i J

14 21 28 35 42 40 57 64 71

■ А

□ В

ВС

¡9 D

ИЕ

В F

I*» Р 3

'2 о. 3 я

Е s S г

ю * 5

ЙЛ J

IgA в кишечных смывах

Л Fi

Л J 1 J

■ 1 1 ■ ail ■ Л I SHSRf

21 28 35 42 49 сутки от нячапп экспернме1гта

■ А

□ В

нс

ИЕ BF

Рис. 1 Динамика формирования гуморального иммунитета у мышей BALB/c при пероральной (группы А и В) и в/м иммунизации (группы С и D) препаратом ЕНЕС CIP 105282 ghosts (1мг/мышь) и последующего заражения гетерологичным штаммом E.coli 0157:Н7 (на 55-е сутки, интрагастрально, 10SKOE/Mbinn>). Е и F - контрольные группы. Результат представлен как среднее показателей у 3 мышей ± стандартное отклонение.

Системный IgG-ответ формировался как при пероральном, так и парентеральном введении ЕНЕС CIP 105282. Однако только введение препарата per os индуцировало продукцию специфических IgA в сыворотке и кишечном тракте. Системный и мукозальный IgA-ответ у иммунизированных в/м, так же как и у контрольных животных (группа Е и F), формировался только после заражения,

Оценка формирования клеточного иммунитета у мышей проводилась еженедельно после иммунизации ЕНЕС СГР 105282 и на 2, 9,16-е сутки после заражения гетерологичным штаммом E.coli 0157:Н7. Достоверный прирост показателей пролиферативной активности сплеиоцитов при стимуляции антигенами E.coli 0157:Н7, определяемый в РБТ, у иммунизированных мышей отмечался уже на 14-е сутки: индекс стимуляции составлял 1,40*0,10 (показатели у интактных мышей -1,04±0,08, р=0,0082). При этом динамика показателей пролиферативной активности сплеиоцитов не зависела от способа иммунизации. Установлено, что увеличение индекса стимуляции на 49-е сутки у

животных, иммунизированных двукратно (1,62±0,12 и 1,60±0,14 в группе В и D соответственно), по сравнению с показателями на 28-е сутки (1,46±0,10 и 1,42±0,12 в группе В и D соответственно), было недостоверно (р>0,05). У мышей контрольных групп индекс стимуляции достигал максимальных значений (1,20±0,10) на 16-е сутки после заражения, но статистически не отличался от исходных показателей пролиферативиой активности спленоцитов (р=0,097).

Независимо от РБТ спленоцитов, формирование специфического клеточного ответа оценивалось в тесте ELISpol по количеству спленоцитов, продуцирующих ИФН-у в ответ на стимуляцию антигенами Е.соИ 0157:Н7. Динамика показателей теста была аналогична показателями РБТ: формирование пула антиген-специфических лимфоцитов отмечалось на 14-е сутки после иммунизации препаратом ЕНЕС CIP 105282, в контрольных группах достоверное увеличение количества у-ИФН-подуцирующих спленоцитов не наблюдалось даже после заражения.

Важно отметить, что во всех группах мышей на протяжении всего эксперимента пролиферативный ответ спленоцитов при стимуляции Т-клеточным митогеном (конканавапином А) сохранялся на постоянном уровне (индекс стимуляции - 2,26±0,18). Это подтверждает отсутствие у препарата ЕНЕС CIP 105282 иммупосупрессивного действия. Кроме того, показатели РБТ и ELISpot теста при стимуляции спленоцитов неспецифическим антигеном вируса кори в ходе эксперимента достоверно не увеличивались. Это свидетельствует в пользу отсутствия у исследуемого препарата неспецифического стимулирующего действия.

В ходе эксперимента также были установлены особенности реакции цитокиновой системы у контрольных и вакцинированных мышей после заражения гетерологичным штаммом Е.соИ 0157:Н7. Как видно на рис. 2, у мышей, получавших плацебо (группа Е и F), происходило прогрессивное нарастание до 9-х суток системной продукции провоспалительных медиаторов - ФНО, ИЛ-1, ИЛ-6, причём начальный подъем сывороточной концентрации этих цитокинов по времени совпадал с развитием бактериемии (5-е сугки). Таким образом, активация продукции провоспалительных медиаторов в контрольных группах отражала развитие SIRS.

Развитие инфекции у иммунизированных ЕНЕС CIP 105282 мышей также сопровождалось увеличением системной продукции провоспалительных медиаторов на 5-9 сутки. Однако, концентрации цитокинов повышались не столь выражено и возвращались к исходному уровню на 11-е сутки после инфицирования. Более того, у иммунных животных отмечена прямая корреляция системной продукции ИФН-у и ИЛ-12 с показателями ELISpot теста, отражая активацию клеточного иммунитета. Выраженный подъем уровня данных цитокинов в контрольной группе указывал на системный характер воспаления.

ФНО-альфа

■ А

□ в

■ с ¡3d ше

■ F

ИЛ-6

ИИФ-гамма

■ а

□ В

гас

BD ШЕ BF

150 100 •

50 •

О J

200 150 -100 • 50 -

О -

ИЛ-10

t Й J д

(fiJ J i

□в

■ с

■ d sb bf

■ A ob

■ С

■ D BE

■ F

ИЛ-1бета

■ A □ В

■ С BD BE BF

300 250 200 ISO 100 50

ИЛ-12

ink

■ A

□ В HC BD

■ E BF

Рис. 2. Динамика системной продукции цитокинов у мышей BALB/c контрольных групп (Е и F) и мышей, иммунизированных препаратом ЕНЕС CIP 105282 ghosts (А и В - перорально, С и D - в/м, 1мг/мышь), после заражения Е.соН 0157:Н7, штамм 103571 (на 55-е сутки, интрагастрально, Ю8КОЕ/мышь). Е и F - контрольные группы. По оси абсцисс - сутки после заражения, по оси ординат - концентрация (пг/мл). Результат представлен как среднее показателей у 3 мышей ± стандартное отклонение.

1.2 Свойства препарата БНЕС CIP 105282 ghosts при ректальном способе иммунизации

Стратегия создания профилактической вакцины против инфекций, вызываемых энтерогеморрагическими штаммами Е.соН, в первую очередь, должна быть направлена на предотвращение колонизации возбудителем кишечного тракта [Conlan et al., 1999b; Li et al., 2000]. Вероятно, это и определило эффективность пероральной иммунизации препаратом ЕНЕС CIP 105282 ghosts за счёт индукции мукозального иммунитета. Но возникает вопрос о влиянии кислотного содержимого желудка и протеолитических ферментов кишечного тракта на свойства препарата. В связи с этим, нами были изучены свойства препарата ЕНЕС CIP 105282 ghosts при введении per rectum.

Оценка иммуногенных и протективных свойств препарата при ректальном введении проводилась по схеме, аналогичной предыдущему эксперименту: после первичной вакцинации половина мышей была повторно иммунизирована на 28-е сутки, в качестве контроля были использованы мыши, которым в эти же сроки ректально вводился фосфатный буфер (таблица 2).

Таблица 2

Характеристика групп мышей в эксперименте по изучению иммуногенных и протективиьгх свойств препарата ЕНЕС С1Р 105282 при ректальном способе введения

Группа Количество мышей Препарат Кратность иммунизации Протективпость, %

А 70 ЕНЕС CIP 105282 (1мг, соответствует 4.8x10' микробных клеток, в 30 мкл фосфатно-солевого буфера) 0 сутки 100

В 70 0 и 28 сутки 100

С 70 фосфатао-солевой буфер (30 мкл) 0 сутки 53,3

D 70 0 и 28 сутки 53,3

После заражения мышей на 55-е сутки гетерологичным штаммом С1Р 103571 E.coli 0157:Н7 (Ю8КОЕ/мышь) отмечалось развитие инфекции. Ранее описанные проявления инфекции в контрольных группах наблюдались на 4-9 сутки, в то время как для иммунизированных мышей было характерно только некоторое снижение двигательной активности У контрольных животных регистрировалось длительное выделение возбудителя с испражнениями (с 1 по 7-е сутки) и транслокация бактерии в системный кровоток на 5 и 6-е сутки после инфицирования. У вакцинированных мышей наличие бактерии в фекалиях было транзиторным (1-3 сутки) и не сопровождалось развитием бактериемии.

Неожиданным стал тот факт, что при ректальной иммунизации препарат ЕНЕС CIP 105282 ghosts, вне зависимости от кратности введения, обладал 100% протекгивными свойствами. Доля выживших животных в контрольных группах была одинакова (53,3 %).

Динамика формирования клеточного иммунитета соответствовала показателям предыдущего эксперимента. После ректальной иммунизации ЕНЕС CIP 105282 ghosts, так же как и при введении препарата per os, формирование пула специфических лимфоцитов отмечалось с 14-х суток, что подтверждено результатами РБТ спленоцитов и ELISpot теста. Однако, было выявлено принципиальное отличие: повторная иммунизация в группе В индуцировала достоверно более высокий пролиферативный ответ спленоцитов на 49-е сутки, по сравнению с показателями в группе А.

Особого внимания заслуживают показатели специфического гуморального иммунитета после ректального введения исследуемого препарата. В частности, интересны результаты анализа мукозалыюго отпета в различных отделах кишечного тракта (дуоденальный, поперечноободочный и ректальный).

Ректальное введение ЕНЕС CIP 105282 ghosts индуцировало синтез специфических сывороточных IgG и IgA уже к 14-м суткам (рис. 3). После повторной вакцинации в группе В отмечалось достоверное усиление продукции сывороточных иммуноглобулинов G к 49-м суткам. Кроме того, у иммунизированных животных к 14-м суткам после первичного введения препарата отмечалось появление специфических IgA в смывах из прямой кишки (рис. 4). Повторная

иммунизация вызывала практически двукратное нарастание синтеза специфических антител в ректальном отделе кишечника. Появление ^А в смывах из поперечной ободочной кишки наблюдали только на 7-е сутки после заражения мышей. Несмотря на проведённую иммунизацию, продукции специфических во всех отделах кишечного тракта, а также 1§А в проксимальных отделах кишечника не зарегистрировано на протяжении всего эксперимента.

Рис. 3. Динамика формирования системного гуморального иммунитета у мышей BALB/c при ректалы-юй иммунизации препаратом ЕНЕС CIP 105282 ghosts (1мг/мышь) и последующего заражения E.coli 0157:Н7, штамм 103571 (на 55-е сутки, интрагастральио, Ю8КОЕ/мышь). Результат представлен как среднее показателей у 3 мышей ± стандартное отклонение.

После заражения у мышей контрольных групп также формировался системный IgG и IgA ответ. Продукция IgA в ректальном отделе кишечника отмечалась к 7-м суткам после инфицирования, но содержание антител в смывах было достоверно ниже, чем у иммунизированных мышей. Кроме того, в контрольных группах специфические IgA в смывах из поперечной ободочной кишки выявлялись только с 14-х суток после заражения.

Tj»A D СМЗ.ГЕ1 UV Ш linncitc'llioii ободочной KII11KH 2 -

а 7 И 21 2Й 35 42 49 55 62 69 76 Сутки от начали эксперимент

3 2,5 '- 1 2 В I 1>3 || 1 3 0,5 о

IgA ц cAiuoax in прямой кишки

—---—__—

гН н 1 и ill

■ А

□ в! ПС| Ей D

14 21 28 35 42 49 53 62 (¡У 76 сутки от начиля эксперимента

Рис. 4. Динамика мукозапьного иммунитета у мышей BALB/c при ректальной иммунизации препаратом EI-IEC CIP 105282 ghosts (1мг/мышь) и последующего заражения E.coli 0157:Н7, штамм 103571 (интрагастральио, Ю8КОЕ/мышь). Результат представлен как среднее показателей у 3 мышей ± стандартное отклонение.

Цитокиновая реакция при моделировании E.coli 0157:Н7 инфекции у мышей, иммунизированных рекгально, не отличалась от показателей у мышей, иммунизированных per os. Благоприятный исход заболевания коррелировал с усилением продукции Thl-цитокинов (ИФН-у и ИЛ-12) на ранних этапах инфекции и незначительным подъёмом уровня провоспалительных

медиаторов (ФНО-а, ИЛ-lß) и ИЛ-6. Напротив, легальны!! исход ассоциировался с ранним усилением системной продукции ФНО-а, ИЛ-Iß и последующим резким повышением концентраций в сыворотке крови всех исследованных цитокинов. На 5-9 сутки отмечалось выраженное повышение активности ИЛ-б и ИЛ-10, что, по-видимому, отражало развитие регуляторного дисбаланса в иммунной системе.

Полученные данные свидетельствуют о том, что существует связь между течением н исходом экспериментальной E.coli 0157.Н7 инфекции и системной продукцией цитокинов в процессе развития заболевания. Важно отметить, что динамика цитокинового ответа в контрольных группах соответствовала клиническим данным при развитии генерализованных форм инфекции [Litalien et nl., 1999; Kita et al„ 2000; Lee et al„ 2002; Torres et al., 2006]. Общность ключевых патогенетических механизмов, описанных в ходе клинических исследований и полученных в нашем эксперименте, п очередной раз указывают на правомерность использования мышей BALB/c в качестве экспериментальной модели E.coli 0157:Н7 инфекции.

Сравнительное изучение различных способов введения ЕНЕС CIP 105282 ghosts позволяет угверждать, что только при мукозальной иммунизации достоверно снижается летальность у инфицированных мышей. По-видимому, формирующийся при в/м введении препарата системный IgG-ответ предотвращает развитие бактериемии, а протективный иммунитет обусловлен преимущественно факторами мукозапьного иммунитета. Дополнительным свидетельством в пользу ключевой роли мукозального иммунитета в развитии резистентности к E.coli 0157:Н7 является тот факт, что даже однократная иммунизация ЕНЕС CIP 105282 ghosts per rectum обеспечила 100% выживаемость мышей после заражения. Можно предположить, что клеточный иммунитет так же играет позитивную роль при E.coli 0157:Н7 инфекции, на что указывает формирование пула антиген-специфических лимфоцитов у иммунизированных мышей.

2. Изучение иммунологических показателей при экспериментальном моделировании вирусного клещевого энцефалита (КЭ)

Исследование иммунологических показателей у мышей BALB/c, иммунизированных вакциной КЭ, после заражения вирусом КЭ проводилась в рамках государственных испытаний вакцины серии № 884 (на основе штамма 205). В качестве препарата сравнения был использован ОСО - отраслевой стандартный образец вакцины КЭ. Животным осуществлялось подкожное введение препаратов на 0, 2 и 5-е сутки, в контрольной группе в эти же сроки вводилась буфер для разведения. Через 7 сугок после последней иммунизации всех мышей заражали в/б вирусом КЭ (штамм Absettarov) в дозе 3,14 1§ЛД50/мышь. Развитие инфекции во всех группах было подтверждено обнаружением в крови на 3-м сутки после инфицирования РНК вируса КЭ методом ОТ-ПЦР. Все животные контрольной группы погибли к 9-м суткам, средняя продолжительность жизни павших животных составил 7,48±0,43 сугок. Напротив, все иммунизированные мыши выжили.

При изучении гуморального иммунитета было установлено, что перед заражением у [мунизмрованных животных специфические IgG содержались в титре 1:640. На 5 и 21-е сутки после заражения у иммунных мышей тигр IgG увеличился и составил 1:1280 и 1:2560 соответственно. В контрольной группе не было выявлено продукции специфических к вирусу КЭ иммуноглобулинов класса G, по отмечалось на 7-е сутки после заражения появление специфических IgM в низких титрах

(1:20).

При исследовании клеточного иммунитета методом ELISpot по продукции у-ИФН и в РБТ спленоцптов было показано, что введение вакцины серии №884 и ОСО вызывает появление пула лимфоцитов, отвечающих пролиферацией на введение антигенов КЭ: перед заражением индекс стимуляции в этих группах составлял 1,76±0,18 и 1,78±0,14, в контрольной группе - 1,06*0,08. После заражения у иммунных мышей наблюдалось усиление пролиферативного ответа спленоцптов и увеличение количества продуцирующих у-ИФН клеток. В контрольной группы достоверных изменений показателей тестов не было выявлено. При этом у вакцинированных животных сохранялся высокий уровень ответа на стимуляцию конканавахгином А и ЛПС S. lyphimurium, что свидетельствовало об отсутствии у инактивированной вакцины КЭ выраженных иммуносупрессивпых свойств. Пролиферативный ответ на стимуляцию неспецифическими антигенами вируса Мачупо статистически достоверно не отличался от спонтанной пролиферации сплсноцитов в холе всего эксперимента, подтверждая отсутствие значимого неспецифического стимулирующего влияния исследуемых вакцинных препаратов на иммунную систему животных.

Анализ системной продукции цитокинов показал различную динамику этих показателей после заражения у интакгпых и вакцинированных мышей (рис. 5). В контрольной группе после заражения отмечалось раннее и прогрессивное усиление продукции провоспалительных цитокинов (ФНО-а, ИЛ-1р, ИЛ-6, ИЛ-12), свидетельствующее о развитии у этих животных SIRS. Кроме того, ранее была установлена взаимосвязь между уровнем ИЛ-6 и поражением ЦНС [Gruol et al„ 1997], что проявлялось развитием у мышей перед гибелью судорожного синдрома. Полученные данные об активности цитокинов у павших животных во многом совпадают с результатами клинических исследований случаев тяжёлого течения КЭ у людей [Тимофеев и др., 2002; Atrasheuskaya et al„ 2003].

Напротив, после заражения у вакцинированных животных отмечено увеличение уровней провоспалительных цитокинов (ФНО-а, ИЛ-1|3 и ИЛ-12) на ранних сроках- 1-3 сутки с последующим их снижением к 7-м суткам. Необходимо отметить, что у этих животных отсутствовало увеличение продукции ИЛ-6. При этом у иммунных мышей отмечались более высокие концентрации у-ИФН.

ФНО-яльфя

игъ, njr л 41 дгг-- TFw

О 1

ИФН-гамма

И.Л-2

ИЛ-10

О 1 3 5 7 9 21

ИЛ-1бета

600 400 200 О

a- xj hp 1

««, IB Г n __

-Sb—ai ь

ГН H ft -gi -frfl-

О 1 3 5 7 9 21

сутки после злрпжемня

3M 200 100 О

ИЛ-6

JBiL

jb_jssl

1 3 5 7 9 сутки после заражения

■ - ООО

I | - вакцина КЭ (серия №884) Ц - контрольная группа

Рис. 5 Динамика системной продукции цитокинов у мышей линии BALB/спосле заражения вирусом КЭ (штаммом Absettarov, 3,14 ^ЛД5о/мышь). По оси ординат - концентрация (пг/мл). Данные представлены как среднее показателей у 3 мышей ± стандартное отклонение.

Следовательно, проведенная вакцинация способствует ранней активации цитокииового ответа по Thl-типу после заражения вирусом КЭ. Ранняя поляризация Т-клеточного ответа по данному типу, как правило, позволяет эффективно контролировать развитие вирусных инфекций, в частности благодаря синтезу ИФН-у [Ruby et al., 1991; Karupiali, 1998], что и наблюдалось у иммунных животных. Полученные данные могут быть использованы для разработки новых подходов к оценке протективности вакцин КЭ.

3. Изучение патогенеза и новых направлений терапии экспериментальной вирусной лихорадки Денгс (ВД)

3.1 Патогенетические аспекты экспериментальной ВД-инфекции.

Адекватная животная модель инфекционного заболевания должна по ряду клинико-лабораторных изменений соответствовать течению инфекции у людей. В связи с этим мы изучали

влияние адаптированного штамма вируса Денге 2-го серотипа (ВД-2) на продукцию цитокинов и гематологические показатели у мышей линии ВАЬВ/с.

Было установлено, что при в/б инфицировании данным штаммом в дозе 5ЛД50 все животные погибают к 9-м суткам, У павших животных при вскрытии были выявлены признаки развития геморрагического синдрома: усиление сосудистого рисунка на брюшине, наличие очагов фокального геморрагического некроза в селезёнке и печени, дёгтеобразное содержимое в кишечнике.

В/б введение вируса в дозе 0,1ЛД5о не приводило к гибели мышей, но сопровождалось снижением двигательной активности животных, развитием вирусемии на 3-7 сутки, что было подтверждено результатами ОТ-ПЦР, и формированием вирус специфических в титре 1:160 на 28-е сутки после заражения.

Данные по изучению динамики гематологических показателей при заражении различными дозами ВД-2 приведены на рис. 5.

Эритроциты

11 21

Гемптокрит

1 3 5 7 9 11 21 сутки после заряжения_

Лейкоциты

Тромбоциты

fabril

11III

1 3 5 7 9 И 21 сутки после за ряже шш

Рис. 5. Изменение гематологических показателей у мышей ВАЬВ/с после в/б заражения адаптированным штаммом ВД-2 в дозе 5ЛД50 ( ■) и дозе ОДЛД50 (■). Данные представлены как среднее показателей у 3 мышей ± стандартное отклонение.

В целом динамика показателей крови при летальном течении экспериментальной ВД-2 инфекции соответствовала патофизиологическим изменениям, регистрируемым у человека при тяжёлых форма заболевания: развивалась анемия, тромбоцитопения, лейкопения; наблюдалось увеличение показателей гематокрита, отражающее усиление проницаемости эндотелия [Непс1т1 е! а1., 1990], У выживших мышей развитие инфекции сопровождалось лейкоцитозом, а снижение

содержания эритроцитов, тромбоцитов и нарастание гематокрита были менее выражены, чем у павших животных.

Заражение различными дозами ВД-2, как видно на рис.6, индуцировало у экспериментальных животных продукцию как провоспалительных (ФНО-а, ИЛ-10, ИЛ-12), так и противовоспалительных цитокинов (ИЛ-10).

ФНО-альфа

400

100 0

0 1 3 5 7 9

ИЛ-1бета

Шш

О 1 3 5 7 9 И 21 сутки после заражения

ИЛ-12

200 0

Й JA Л

О 1 3 5 7 9 11 21 сутки после заражения

Рис. 6. Изменение системной продукции цитокинов у мышей BALB/c после в/б заражения адаптированным штаммом ВД-2 в дозе 5ЛД50 (■) и ОДЛД5о (■). По оси ординат-концентрация (пг/мл). Данные представлены как среднее показателей у 3 мышей ± стандартное отклонение.

При летальном течении инфекции доминировала продукция провоспалительных цитокинов - ФНО-а, ИЛ-lß. Причем прогрессивное увеличение сывороточной концентрации данных медиаторов подтверждало развитие SIRS у павших животных. У выживших животных развитие иммунного ответа происходило преимущественно по Thl-типу (высокий уровень ИЛ-12, ИФН-у), что наблюдается при лёгких формах лихорадки у людей [Bethell et al., 1998; Chaturvedi et al., 2000]. Развитие тяжелых форм лихорадки Денге ассоциировано с гиперпродукцией Th2-цитокинов, в частности ИЛ-10 [Chaturvedi et al., 1999; Green et al., 1999]. Показательным являлось соотношение ИЛ-12/ИЛ-10: у выживших мышей отмечалось увеличение данного показателя, при летальном развитии экспериментальной ВД-инфекции- снижение.

Полученные а эксперименте данные подтверждают адекватность моделирования ВД-2 инфекции на мышах ВАЬВ/с и свидетельствуют о возможности использования предложенной модели для оценки различного рода иммунобиологических препаратов.

3.2 Изучение возможности коррекции экспериментальной ВД-ннфскцлн

Традиционно скрининг терапевтических средств для лечения вирусных геморрагических лихорадок основан на изучении их противовирусного действия, по мало внимание обращается на индукцию факторов неспецифического иммунитета, играющих едва ли не ключевую роль в исходе инфекции. Поэтому целесообразным является поиск препаратов, влияющих на данное звено патогенеза лихорадки Дснге. В связи с чем было исследовано влияние олигопептидного препарата ЯХ-Об, ннгибирующего системную продукцию провоспалительных цитокинов [£ас1шпт51а с! а!., 2007], на течение и исход экспериментальной ВД-инфекции при моделировании на мышах ВАЬВ/с.

При подборе дозы препарата РХ-06 основывались на результатах ранее проведбнных исследований [Ре1ге1Ьаиег е1 а!., 2005]. Нескольким группам мышей ВАЬВ/с, инфицированным 5ЛД5о адаптированного штамма ВД-2, препарат вводился в/б 2 раза в сутки в дозе 600, 1200, 2400, 4800 и 9600 мкг/(кг*сут). Введение проводилось с 3 по 9-е сутки включительно, т.е. в период, характеризовавшийся наиболее выраженными изменениями продукции цитокинов. При статистическом анализе кривых выживаемости было установлено, что лучшие показатели выживаемости (40%) наблюдаются при использовании РХ-06 в суточной дозе 4800 мкг/(кг*сут).

Для уточнения возможного механизма протективного действия препарата РХ-06 при экспериментальной лихорадке Денге было изучено его влияние на динамику гематологических показателей и системную продукцию цитокинов. После заражения животных летальной дозой ВД-2 (5ЛД50) препарат применяли в оптимальной дозе (4800 мкг/кг*сут) с 3-х суток. Контрольной группе животных по аналогичной схеме вводился разводящий буфер.

Все мыши в контрольной группе погибли. Средняя продолжительность жизни павших животных в этой группе составила 6,02 ± 0,36 суток. Как видно на рис. 7, заболевание сопровождалось развитием анемии, тромбоцитопении, лейкопении. Нарастание гематокрита свидетельствовало о потери жидкой составляющей циркулирующей крови. Содержание фибриногена в плазме критически снижалось, косвенно подтверждая развитие ДВС-синдрома. Введение препарата инфицированным ВД-2 мышам, по сравнению с контрольной группой, достоверно снижало летальность до 55% (р=0,0012). Средняя продолжительность жизни павших животных в группе, получавшей терапию, составила 7,87+0,32 суток. Введете исследуемого препарата предотвращало развитие выраженной анемии и тромбоцитопении, стабилизировало показатели гематокрита. Несмотря на то, что у леченных животных также наблюдалось снижение

Эритроциты

:МШЙ1

о 1 3 3 7 9 11 21 сутки после заражения

Лейкоциты

I I1 , , 1 11 , , , ) ' I

о 1 3 5 7 9 11 21 суткк после заражения

Фибриноген

1 3 5 7 9 1121 сутки после заражения

Гематокрит

1 3 5 7 9 и сутки после заражения

Тромбоциты

3 5 7 Я II сутки после заражения

■ контрольная группа

- терапия РХ-06

Рис. 7. Динамика показателей гемостаза при экспериментальном моделировании ВД-инфекции на мышах ВАЬВ/с в контрольной группе и группе, получавшей препарат РХ-06 (4800мкг/кг*сут, на 3-9 сутки). Данные представлены как среднее показателей у 3 мышей ± стандартное отклонение.

концентрации фибриногена до 7-х суток после заражения, но, начииая с 9-х суток, данный показатель вернулся к исходным значениям.

РХ-06 оказывал существенное влияние на цитокиновую систему (рис. 8). Активность главных медиаторов воспаления (ФНО-а, ИЛ-1Р и ИЛ-6) у мышей на фоне введения препарата на 5, 7 и 9-е сутки была достоверно ниже, чем в контроле. Кроме того, в указанной группе отмечалась ранняя активация продукции ИФН-у. Подобная динамика изменения сывороточной концентрации была отмечена и для ИЛ-12. Продукция ИЛ-10 в «критический период» с 5 по 9-е сутки нарастала в обеих группах, но в группе, получавшей РХ-06, подъём был не столь выраженным.

Результаты проведённого исследования указывают на то, что препарат РХ-06 обладает протективным действием при использовании его для терапии экспериментальной лихорадке Денге. Препарат положительным образом влияет на течение ВД-2 инфекции у мышей ВАЬВ/с и на динамику основных показателей крови. Кроме того, изучаемый олигопептид модулирует активность цитокиновой системы, влияя на системную продукцию как провоспалительных, так и противовоспалительных медиаторов. Однако, применение препарата не позволило полностью предотвратить летальность. Причин тому может быть несколько: неполная (82%) гомология последовательности изучаемого препарата и аналогичного фрагмента мышиного фибрина;

Рис. 8 Дииамика системной продукции цитокинов при экспериментальном моделировании ВД-инфекции на мышах BALB/c в контрольной группе ( Н) и группе, получавшей препарат FХ-06 (4800мюг/кг*сут, на 3-9 сутки, Щ). По оси ординат - концентрация (пг/мл). Данные представлены как среднее показателей у 3 мышей ± стандартное отклонение.

неадекватная дозировка и схема терапии. Более детальное исследование влияния FX-06 не только на основные гематологические показатели и продукцию цитокинов, но и параметры коагуляционной системы, изучение фармакокинетики препарата, разработка новых лекарственных форм помогут скорректировать схемы лечения. Но полученные результаты уже позволяют надеяться, что FX-Об может стать кандидатным средством патогенетической терапии различных форм лихорадки Денге у человека.

Благодарности. Особую благодарность автор выражает проф. Г.М. Игнатьеву за научное руководство при выполнении работы и Отрашевской Е.В. за участие в обсуждении результатов исследования. Автор признателен коллегам по лаборатории и сотрудникам ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор", оказавшим консультативную и практическую помощь в выполнении отдельных разделов диссертационной работы: А.П.Агафонову, Л.Б.Дьячковой, Т.Г.Степановой, В.А.Евсеенко, И.В.Плясунову; сотрудникам ГИСК им Л.А. Тарасевича М.С.Воробьёвой, М.Н.Расщепкиной; сотруднику FDA А.А.Неверову. Автор благодарит австрийских коллег, проф^етег Lubitz (University of Vienna) и проф. Peter Petzelbauer (Medical University of Vienna), за предоставление экспериментальных препаратов и критическую оценку результатов работы.

выводы

1. Впервые показано, что мукозальная иммунизация (оральная или ректальная) мышей лишш BALB/c препаратом ЕНЕС CIP 105282 gliosis приводит к формированию специфического клеточного, i-уморального и мукозального иммунитета, обеспечивающего протсктнвпмй эффект.

2. Показано, что при экспериментальной E.coli 0157:Н7 инфекции у мышей BALB/c с 3-х суток после заражения возрастает системная продукция ФНО-а, ИЛ-lß, ИЛ-6, ИЛ-10 и достигает максимума на 9-е сутки. У мышей, иммунизированных препаратом ЕНЕС CIP 105282 gliosis, системная продукция данных цитокинов на 5 - 9 сутки достоверно ниже и в дальнейшем возвращается к исходным значениям.

3. Развитие экспериментального клещевого энцефалита у мышей линии BALB/c сопровождается прогрессивным увеличением системной продукции ФНО-а, ИЛ-Iß, ИЛ-2, ИЛ-б, ИЛ-12 и ИФН-у до момента гибели животных. У вакцинированных животных после заражения на фоне активации специфического гуморального и клеточного иммунитета отмечается увеличение системной продукции цитокинов на 3 - 5 сутки наблюдения с последующим достоверным снижением их активности.

4. Установлено, что летальное течение экспериментальной лихорадки Денге у мышей лишш BALB/c характеризуется развитием анемии, лейкопении, тромбоцитопении, увеличением системной продукцией ФНО-а, ИЛ-lß и ИЛ-6 с 3-х суток после заражения и до момента гибели (9-е сутки). Нелетальное течение инфекции характеризуется лейкоцитозом, менее выраженной анемией и тромбоцитопенией; увеличение системной продукции ФНО-а, ИЛ-lß и ИЛ-6 отмечается на 3-7 сутки, после чего возвращается к исходным показателям.

5. Показано, что при моделировании лихорадки Денге на мышах BALB/c внутрнбрюшиннос введения синтетического фрагмента молекулы фибрина Bßl5-42 приводит к достоверному снижению летальности до 55% (р=0,0012).

Список публикаций по итогам работы:

1. Mayr U.B., Haller С., Haidinger W., Atrasheuskaya A., Bukin Е„ Lubitz W„ Ignalyev G. Bacterial ghosts as an oral vaccine: a single dose of Escherichia coli 0157:H7 bacterial ghosts protects mice against lethal challenge // Infect Immun.- 2005. - Vol.73(8). - p. 4810-4817.

2. Игнатьев Г.М., Букин E.K., Отращевская E.B., Расщепкина М.Н., Воробьева М.С. Иммунологические показатели у мышей, иммунизированных вакциной клещевого энцефалита, после заражения вирусом клещевого энцефалита // Вопросы вирусологии. -2006. - Т. 51. - № 5.- С. 22-27.

3. Букин Е.К., Отрашевская O B., Воробьева М.С., Игнатьев Г.М. Изучение показателей гемостаза и продукции цитокнпов при экспериментальной инфекции Денге // Вопросы вирусологии - 2007. - Т.52. - № 2. - С. 32-36.

Доклады и тезисы конференций I. Bukin Е., Atrasheuskaya A., Rasshepkina М., Vorob'eva М., Ignafyev G. Comparison of immune response in immunized and non-immunized mice after challenge with tick-borne encephalitis virus // I6lh European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. Nice, April 1-4, 2006.

2 Букин K.K., Atrasheuskaya A.V., Mauro M. Tcixeira, Игнатьев P.M. Применение ОТ-ПЦ13 для клинической диагностики лихорадки Депге // Международная научно-практическая конференция «Молекулярная диагностика инфекционных болезней». Минск, 17-18 мая 2007 I .

Подписано к печати 16 апреля 2008г Тираж 100 экз. Заказ №714. Qi печатано "Документ-Сервис". 6300У0. Новосибирск, Институтская 4/1. тел. 335-66-00

2007503704

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Букин, Евгений Константинович

Страница

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Современное представление о патогенезе инфекционных заболеваний.

1.1.1 Понятие о цитокинах.

1.1.2 Провоспалительные и противовоспалительные цитокины.

1.1.3 Thl/Th2 - ответ при инфекционных заболеваниях.

1.1.5 Цитокины и противовирусный ответ.

1.1.6 Цитокины: защита на грани патологии.

1.2 Энтерогеморрагическая E.coli 0157:Н7.

1.2.1 Общая характеристика бактерий вида Escherichia coli.

1.2.2 Клинико-эпидемиологические аспекты E.coli 0157:Н7 инфекции.

1.2.3 Патогенез заболевания, вызываемого E.coli 0157:Н7.

1.2.4 Экспериментальное моделирование E.coli 0157:Н7 инфекции.

1.2.5 Средства лечения и профилактики E.coli 0157:Н7 инфекции.

1.3 Флавивирусные инфекции.

1.3.1 Общая характеристика флавивирусов.

1.3.2. Вирус КЭ.

1.3.2.1 Клинико-эпидемиологические аспекты вирусного КЭ.

1.3.2.2 Патогенез вирусного КЭ.

1.3.2.3 Средства специфического лечения и профилактики вирусного КЭ.

1.3.3 Вирус лихорадки Денге.

1.3.3.1 Эпидемиология вирусной лихорадки Денге.

1.3.3.2 Клиническая картина ВД-инфекции.

1.3.3.3 Патогенез ВД-инфекции.

1.3.3.4 Экспериментальные модели ВД-инфекции.

1.3.3.5 Лечение и профилактика ВД-инфекции.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Животные.

2.2 Бактериальные препараты.

2.2.1 Escherichia coli.

2.2.2 Препарат ЕНЕС CIP 105282 ghosts.

2.3 Вирусные препараты.

2.3.1 Вирус лихорадки Денге.

2.3.2 Вирус клещевого энцефалита.

2.3.3 Вакцины клещевого энцефалита.

2.4 Препарат FX-06.

2.5 Методы.

2.5.1 Получение образцов сыворотки крови.

2.5.2 Получение образцов кишечных смывов.

2.5.3 Определение наличия E.coli 0157:Н7 в образцах фекалий.

2.5.4 Определение наличия E.coli 0157:Н7 в образцах крови.

2.5.5 Определение инфекционной активности вирусных препаратов методом титрования на мышах.

2.5.6 Определение концентрации цитокинов сыворотки крови.

2.5.7 Определение суммарного содержания IgA в кишечных смывах.

2.5.8 Определение специфических IgA и IgG к E.coli 0157:Н7.

2.5.9 Приготовление антигенов ВД и вируса КЭ.

2.5.10 Определение специфических IgM и IgG к вирусу КЭ и ВД.

2.5.11 Приготовление суспензии клеток селезёнки мыши.

2.5.12 Определение концентрации жизнеспособных клеток.

2.5.13 ELISpot (enzyme-linked immunospot assay) анализ.

2.5.14 Исследование пролиферативной активности спленоцитов.

2.5.15 Выделение суммарной РНК.

2.5.16 Проведение реакции обратной транскрипции.

2.5.17 Диагностическая ОТ-ПЦР для обнаружения РНК вируса КЭ.

2.5.18 Диагностическая ОТ-ПЦР для обнаружения РНК ВД.

2.5.19 Определение гематологических показателей.

2.5.20 Измерение концентрации фибриногена.

2.5.21 Статистический анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

ГЛАВА 3. ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОГЕННЫХ И ПРОТЕКТИВНЫХ СВОЙСТВ

ПРЕПАРАТА ЕНЕС CIP 105282 ghosts.

3.1 Влияние пероральных и парентеральных схем иммунизации препаратом ЕНЕС CIP 105282 ghosts на течение и исход E.coli 0157:Н7 инфекции у мышей BALB/c.

3.1.1 Динамика системной продукции цитокинов у мышей BALB/c, иммунизированных препаратом ЕНЕС CIP 105282 ghosts, после заражения.

3.1.2 Динамика показателей гуморального иммунитета у мышей BALB/c, иммунизированных препаратом ЕНЕС CIP 105282 ghosts.

3.1.3 Динамика показателей специфического клеточного ответа у мышей BALB/c, иммунизированных препаратом ЕНЕС CIP 105282 ghosts.

3.2 Исследование иммуногенных свойств препарата ЕНЕС CIP 105282 ghosts при ректальном способе введения.

3.2.1 Влияние ректальных схем иммунизации препаратом ЕНЕС CIP 105282 ghosts на течение и исход E.coli 0157:Н7 инфекции у мышей BALB/c.

3.2.2 Динамика системной продукции цитокинов у мышей BALB/c, иммунизированных ректально препаратом ЕНЕС CIP 105282 ghosts, после заражения.

3.2.3 Динамика специфического гуморального иммунитета у мышей BALB/c при ректальной иммунизации препаратом ЕНЕС CIP 105282 ghosts.

3.2.4 Динамика клеточного иммунитета у мышей BALB/c при ректальной иммунизации препаратом ЕНЕС CIP 105282 ghosts.

ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ МОДЕЛИРОВАНИИ ВИРУСНОГО • КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА.

ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ ПАТОГЕНЕЗА И НОВЫХ НАПРАВЛЕНИЙ ТЕРАПИИ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВИРУСНОЙ ЛИХОРАДКИ ДЕНГЕ.

5.1 Патогенетические аспекты экспериментальной ВД-инфекции.

5.1.1 Клинические особенности течения экспериментальной ВД-2 инфекции у мышей.

5.1.2 Изменение гематологических показателей и системной продукции цитокинов при экспериментальной ВД-инфекции.

5.2 Изучение возможности коррекции экспериментальной ВД-инфекции.

5.2.1 Оценка влияния препарата FX-06 в различных дозах на исход экспериментальной ВД-инфекции.

5.2.2 Изучение влияния препарата FX-06 на клинико-лабораторные показатели у мышей BALB/c при экспериментальной ВД-инфекции.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Иммунологические показатели при экспериментальном моделировании генерализованных инфекций"

Актуальность проблемы. В течение длительного времени разработка средств профилактики и лечения инфекционных заболеваний носила эмпирический характер. Обобщение фактов, накопленных со времён Эдварда Дженнера, на основании последних достижений иммунологии позволило сформулировать общие принципы создания иммунобиологических препаратов.

Многочисленные экспериментальные исследования и клинические наблюдения показывают, что в ответ на повреждения различной природы, в том числе на внедрение инфекционного агента, организм отвечает универсальной, генетически запрограммированной реакцией, реализующейся в виде воспаления. Воспаление направлено на активацию защитных механизмов в зоне повреждения и, в конечном итоге, должно обеспечивать элиминацию фактора агрессии и восстановление структуры и функции повреждённой ткани. Развитие воспаления сопровождается вовлечением в процесс многих типов клеток, субклеточных структур и систем организма, прежде всего иммунной и нейроэндокринной. Существуют сложные механизмы регуляции воспалительной и иммунной реактивности как на местном, так и организменном уровне, но ведущая роль в поддержании гомеостаза отводится системе цитокинов [Черешнев и др., 2001]. Практически любой инфекционный агент способен индуцировать продукцию цитокинов клетками иммунной системы. За счёт активности данных медиаторов осуществляется регуляция дифференцировки и пролиферации иммунных клеток, их миграция в очаг воспаления и представление ими антигенов [Durum, 2004]. Таким образом, цитокины - главные сигнальные молекулы иммунной системы, модулирующие активность её клеток, определяющие активацию врождённого и формирование адаптивного иммунного ответа. В то же время, системная продукция провоспалительных цитокинов, наблюдающаяся при генерализованных формах инфекции, не означает высокую эффективность противоинфекционного иммунитета. При системной активации цитокины воздействуют на ткани и органы, не вовлечённые в инфекционный процесс. В этом случае медиаторы вместо защитной функции оказывают повреждающее действие, приводя, в конечном итоге, к развитию полиорганной недостаточности. Именно избыточная продукция провоспалительных цитокинов является причиной развития септического шока и раннего летального исхода при генерализованных инфекциях [Черных и др., 2001; Dinarello, 2001; Rice et al., 2005]. На основании данных наблюдений R.C.Bone сформулировал новую концепцию патогенеза сепсиса, основанную на понятии синдрома системного воспалительного ответа (SIRS — systemic inflammatory response syndrome) [Bone, 1996; Bone et al., 1992; Bone et al., 1997]. Последующее изучение иммунопатогенеза отдельных инфекций показало, что клинический исход инфекционного процесса зависит от баланса продукции провоспалительных и противовоспалительных цитокинов [Черешнев и др., 2001; Bidwell et al., 1999; Dinarello, 2001; Feldmann et al., 2004; Rice et al., 2005].

Новое восприятие сущности инфекционного процесса не могло не отразиться на таких чисто практических проблемах, как оценка иммунологических свойств существующих и разрабатываемых вакцин, изучение эффекта новых терапевтических препаратов. Экспертный Комитет по биологической стандартизации ВОЗ выдвинул ряд рекомендаций к разрабатываемым вакцинам, и общие требования касаются, прежде всего, безопасности и специфической активности препаратов. Основные характеристики современных вакцин были определены на Конференции по безопасности и эффективности новых вакцин, организованной в г. Лиль в ноябре 1992 г., и должны соответствовать следующим критериям [Capron et al., 1994]:

1. хорошая адаптация к эпидемической ситуации,

2. хорошая иммуногенность и длительное сохранение поствакцинального иммунитета во всех возрастных группах,

3. доступный и простой способ вакцинации,

4. отсутствие ранних и поздних местных реакций,

5. отсутствие эффектов, потенцирующих заболевание.

Последний критерий означает, что вакцинация не должна приводить ни к активации хронических инфекций, ни к формированию такого специфического иммунитета, который, в случае инфицирования, вызывает более тяжёлое клиническое течение заболевания у привитых, по сравнению с невакцинированными. В связи с этим доклинические испытания вакцинных препаратов следует проводить в тесной связи с изучением иммунопатогенеза заболевания, для профилактики которого направлена вакцина. Изучение свойств вакцин на доклиническом этапе возможно при наличии экономически выгодной, простой и чувствительной экспериментальной модели заболевания, имитирующей основные патофизиологические звенья заболевания у человека. Подобные исследования помогуть выявить факторы резистентности при той или иной инфекции. Кроме того, данный подход подразумевает установление общих закономерностей изменения неспецифических и специфических факторов иммунитета у иммунизированных животных не только в ходе вакцинального процесса, но и после заражения [Игнатьев, 2003]. Без этого нельзя решить принципиальный вопрос: исследуемый препарат неэффективен при данной инфекционной патологии или выбранная экспериментальная модель непригодна для тестирования иммунобиологических препаратов. Более того, имея сведения об особенностях патогенеза изучаемой инфекции, можно вести прицельный поиск терапевтических агентов, влияющих на ключевые патологические звенья заболевания. В данном аспекте изучение реакции цитокиновой системы играет важную роль для оценки адекватности используемой экспериментальной модели и исследования влияния испытываемых препаратов на инфекционный процесс.

С предложенной позиции нам представлялось многообещающим изучение иммунопатогенеза некоторых генерализованных бактериальных и вирусных инфекций в эксперименте, а так же исследование свойств новых препаратов для профилактики и лечения данных заболеваний.

В настоящий момент одной из значимых проблем мирового здравоохранения являются острые кишечные инфекции, уступая в этом лишь острым респираторным заболеваниям. Однако, более веским аргументом, подтверждающим значимость этой проблемы в патологии человека, является не высокая заболеваемость, а наблюдаемые качественные изменения в структуре кишечных инфекций [Blackburn et al., 2002]. Особо среди возбудителей кишечных заболеваний следует выделить энтерогеморрагическую E.coli 0157:Н7, способную вызывать у человека генерализованную инфекцию. Особенностью бактерии является продукция экзотоксина (Stx-токсин), который поражает желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) и приводит к развитию гемолитико-уремического синдрома (ГУС), включающего нефропатию, гемолитическую анемию и тромбоцитопению [Воусе et al., 1995]. Считается, что ГУС — ведущая причина острой почечной недостаточности у детей [Karch et al., 2005]. В среднем летальность при развитии данного осложнения составляет 2-7%, но среди пожилых людей она достигает 50% [Karmali, 2002; WHO, 2005]. Существующие средства терапии и профилактики ГУС у больных с диареей, обусловленной энтерогеморрагическими штаммами E.coli, малоэффективны. Назначение антибиотиков на ранних стадиях инфекции не только не сокращает длительность заболевания, но, по мнению ряда исследователей, являляется фактором риска ГУС [Carter et al., 1987; Ostroff et al., 1989]. Экспериментальные и клинические данные указывают на то, что ГУС - системная патология, связанная с активацией цитокинового каскада [Ochoa et al., 2003]. Дальнейшее изучение патофизиологической цепи событий, приводящей к развитию микроангиопатии и острой нефропатии, может стать основой для разработки новых способов лечения заболевания. Но для предотвращения распространения инфекции в человеческой популяции и среди крупного рогатого скота, основного природного резервуара E.coli 0157:Н7, требуется создание вакцинных препаратов. В недавнем прошлом была начата разработка вакцин против E.coli 0157:Н7 [WHO, 1999], а некоторые кандидатные препараты были тестированы на животных моделях [Conlan et al., 1999а; Conlan et al., 2000; Funatogawa et al.,

2002; Ishikawa et al., 2003]. В ходе испытаний было высказано предположение о том, что протективная вакцина должна предотвращать колонизацию возбудителем ЖКТ, что возможно, если вакцина включает основные компоненты клеточной стенки, участвующие в прикреплении бактерии к кишечному эпителию [Li et al., 2000; Lovett, 1998]. При получении инактивированных бактериальных вакцин под воздействием физических или химических факторов происходит изменение структуры поверхностных антигенов бактериальной стенки, что значительно снижает иммуногенные и протективные свойства подобных препаратов. В качестве альтернативы возможно создание субъединичных вакцин, но получаемые препараты не всегда обладает достаточной иммуногенностью, что требует добавления адъювантов. Перечисленных недостатков лишены бактериальные препараты, созданные по технологии ghost («бактериальные тени»). Препараты представляют собой пустую бактериальную стенку со всеми поверхностными антигенами в нативной форме, что возможно благодаря контролируемой экспрессии гена Е фага фХ174 в бактериальной культуре [Lubitz et al., 1999; Szostak et al., 1996]. Ранее с помощью технологии ghost удалось получить препарат Vibrio cholerae, содержащий в неизменном виде такие лабильные структуры, как бактериальные ворсинки [Eko et al., 2000]. Более того, компоненты бактериальной стенки обладают адъювантными свойствами и способны индуцировать мукозальный иммунитет [Jalava et al., 2003]. На основании имеющихся предпосылок представляется перспективным исследование иммуногенных и протективных свойств препарата ЕНЕС CIP 0157:Н7, полученного по технологии ghosts.

Первоначально развитие SIRS ассоциировали с бактериальными инфекциями и объясняли запуск патологического цитокинового каскада гиперстимуляцией клеток макрофагально-моноцитарного ряда компонентами бактериальной стенки [van der Poll, 2001]. Но подобный феномен системной активации системы цитокинов встречается при ряде вирусных инфекций. В первую очередь это относится к вирусным геморрагическим лихорадкам, которые характеризуются лихорадочным синдромом, спонтанными кровотечениями и молниеносным развитием циркуляторного шока [Schnittler et al., 2003]. Синдром «вирусной геморрагической лихорадки» вызывается представителями различных семейств, но особого внимания среди них заслуживает вирус лихорадки Денге (ВД). ВД является представителем семейства Flaviviridae и циркулирует в природе в виде 4 различных серотипов. Возбудитель относится к наиболее значимым для человечества арбовирусам. На сегодняшний день ВД-инфекция встречается на территории более чем 100 стран, где, в общей сложности, проживает около половины населения земного шара. Заболевание, вызываемое данным возбудителем, клинически может протекать в виде классической лихорадки (DF - dengue fever), геморрагической лихорадки Денге (DHF - dengue hemorrhagic fever) и шокового синдрома Денге (DSS - dengue shock syndrome) [Henchal et al., 1990]. По официальным данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ), ежегодно регистрируется свыше 50 миллионов случаев лихорадки, и летальность при тяжёлых формах заболевания (DHF и DSS) достигает 20% [WHO, 2002]. Кроме того, высокая заболеваемость вносит негативный вклад в экономику развивающихся стран [Clark et al., 2005]. Однако, несмотря на громадную значимость лихорадки Денге, до сих пор единственным способом ограничения распространения заболевания остаётся контроль над переносчиком инфекции — комарами вида Aedes aegypti [Mackenzie et al., 2004]. Огромные усилия исследователей из разных стран, направленные на разработку эффективных вакцинных и лекарственных препаратов, в настоящий момент не принесли видимого успеха. Неудачи, в частности, связаны с недостатком знаний о иммунопатогенезе ВД-инфекции. Большинство последних представлений о сути патологических изменений построены на обобщении клинических случаев ВД-инфекции в гетерогенной человеческой популяции. Несмотря на наличие множества неясностей, не вызывает сомнения тот факт, что сама иммунная система при лихорадке играет двоякую роль - защитную и губительную. Клинико-эпидемиологические данные указывают на участие в патогенезе лихорадки Денге кросс-реактивных к гетерологичному серотипу ВД антител, которые способствуют репликации вируса в клетках моноцитарно-макрофагальной линии [Halstead, 1988; Rothman, 2003]. Важное значение отводится и кросс-реактивным Т-лимфоцитам памяти, которые не способны элиминировать инфицированные клетки, но продуцируют в большом количестве цитокины [Mongkolsapaya et al., 2006]. Массивная активация субпопуляций лимфоцитов, сопровождающаяся «цитокиновым штормом», вызывает увеличение проницаемости сосудистого эндотелия и последующее развитие DHF/DSS. Следовательно, ключевая роль в патогенезе ВД-инфекции отводится не самому возбудителю, а иммунопатологическим механизмам, опосредованным цитокинами [Chaturvedi et al., 2000; Green et al., 2006; Pang et al., 2007]. Дальнейшие изучение иммунопатогенеза лихорадки, в частности с использованием адекватных экспериментальных моделей, поможет уточнить причины DHF/DSS.

Отсутствие безопасной и эффективной вакцины против ВД диктует необходимость разработки патогенетических средств терапии заболевания. Хотя во многом молекулярные механизмы усиления проницаемости сосудистого русла при вирусных геморрагических лихорадках неясны, экспериментальные данные свидетельствуют о изменение структуры белков, участвующих в образовании межклеточных контактов сосудистого эндотелия, в частности кадгеринового комплекса [Schnittler et al., 2003]. Кроме того, кадгериновый комплекс при взаимодействии с р-цепью молекулы фибрина инициирует диапедез лейкоцитов, тем самым усиливая тканевое воспаление [Petzelbauer et al., 2005]. Ранее было установлено, что эндотелиальный кадгерин имеет участок связывания для N-концевого фрагмента Р-цепи фибрина, включающего аминокислотные остатки с 15 по 42-ой (В[515^2) [Bach et al., 1998]. Синтетический олигопептид BP 15-42 (препарат FX-06) был успешно использован для коррекции реперфузионного поражения миокарда при моделировании на животных острого нарушения коронарного кровообращения [Petzelbauer et al., 2005; Roesner et al., 2007]. Недавно были выявлены терапевтический эффект препарата при экспериментальном эндотоксиновом шоке и его способность ингибировать системную продукцию провоспалительных цитокинов [Zacharowski et al., 2007]. Эти сведения послужили основой для изучения влияния препарата FX-06 на течение экспериментальной ВД-инфекции.

Не менее значимым представителем семейства Flaviviridae является вирус клещевого энцефалита (КЭ), который так же, как и ВД, способен вызывать у человека генерализованную инфекцию с вовлечением в патологический процесс нескольких органов и систем [Иерусалимский, 2001]. В отличие от лихорадки Денге, для вирусного КЭ не характерно развитие геморрагического синдрома и циркуляторной недостаточности, но генерализация инфекции сопровождается системной гиперпродукцией ряда цитокинов, что подтверждено экспериментально [Игнатьев и др., 2003] и клиническими наблюдениями [Тимофеев и др., 2002; Atrasheuskaya et al., 2003Ь]. Вирус КЭ остаётся одной из главных причин нейроинфекций человека в Евразии. Вспышки заболевания, передающегося человеку иксодовыми клещами, регистрируются на обширных территориях от Европы до Дальнего Востока России и Японии [Burke et al., 2001; Gresikova et al., 1997]. С 90x гг. прошлого века наблюдается рост заболеваемости вирусным клещевым энцефалитом на всех эндемичных территориях и сейчас составляет более 10 000 случаев в год [Suss, 2003]. Увеличение заболеваемости отмечается и на территории России. Согласно официальной статистики, приведённой на сайте Роспотребнадзора [Роспотребнадзор, 2007], на 15 августа 2007 г. в 67 субъектах Российской Федерации зарегистрировано 2 367 больных с первоначальным диагнозом вирусный КЭ, из них диагноз подтвержден лабораторно у 1 772 человек (на этот же период 2006 г. 1661 и 934 человек соответственно). Особо угрожающий характер эпидемиологическая ситуация по клещевому энцефалиту приобрела в Новосибирской области. По данным Территориального управления Роспотребнадзора на 15 августа 2007 г. с начала эпидсезона в регионе выявлено 130 случаев инфекции, восемь из которых закончились летально. Помимо роста заболеваемости, отмечается изменение клинической картины вирусного КЭ. В 1999 году в Новосибирске зарегистрировано восемь летальных случаев атипичного течения инфекции, сопровождавшихся развитием геморрагического синдрома [Ternovoi et al., 2003].

Учитывая социально-экономическую важность инфекции, продолжается разработка новых средств специфической профилактики и лечения КЭ. Маловероятно, что применение мер неспецифической профилактики (контроль над грызунами, являющимися резервуаром инфекции, и клещами - переносчиками возбудителя) позволит в достаточном объёме сдержать рост заболеваемости. Существующие противовирусные препараты не показали достаточной эффективности при различных формах заболевания. Данные исследований по безопасности и эффективности применения препаратов специфических иммуноглобулинов противоречивы [Леонова и др., 2000; Arras et al., 1996; Waldvogel et al., 1996]. Единственным эффективным средством специфической профилактики КЭ остаётся вакцинация, обеспечивающая после завершения адекватной схемы иммунизации 96-100% уровень защиты [Barrett et al., 2003]. Показателен опыт Австрии: начатая в 1981 г. в этой стране программа по проведению иммунизации против КЭ, к настоящему моменту охватила более 90% населения и позволила в некоторых эпидемиологически неблагоприятных регионах снизить заболеваемость более чем в тридцать раз [Kunz, 2003]. В то же время документально зарегистрированы несколько случаев тяжёлого течения энцефалита у людей, прошедших полный курс активной иммунизации [Bender et al., 2004; Kaiser, 1999], причём при исследовании специфического иммунного статуса у них была исключена вакцинная недостаточность. Клинические исследования демонстрируют более длинный инкубационный период у вакцинированных людей в сравнении с непривитыми против КЭ, но различий в тяжести заболевания между этими группами установить не удалось [Леонова, 1997].

Изменение клиники КЭ, случаи заболевания среди иммунизированных людей, вероятно, обусловлены проникновением в эндемичные регионы новых субтипов вируса и индивидуальными особенностями иммунореагирования. В целом, эти явления отражают единый процесс - эволюцию природно-очаговой инфекции [Иерусалимский, 2001]. В связи с этим необходим тщательный анализ клинических и экспериментальных данных для решения практической задачи оценки прогноза развития и исхода инфекции КЭ, оценки протективности существующих. вакцин. В частности, представляется целесообразным изучение на адекватной модели инфекции особенностей иммунного реагирования в ответ на вакцинацию. Причём особый интерес представляет установление общих закономерностей изменения неспецифических и специфических факторов иммунитета у иммунизированных животных после заражения.

Учитывая вышеперечисленное, была определена цель работы.

Целью настоящего исследования являлось изучение иммунологических показателей при генерализованных инфекционных заболеваниях на моделях бактериальной (энтерогеморрагическая Escherichia coli 0157:Н7) и вирусных (вирус клещевого энцефалита и вирус лихорадки Денге) инфекций, выявление общих факторов иммунопатогенеза и использование новых подходов для оценки профилактических и лечебных препаратов. В связи с этим в задачи исследования входило:

Научная новизна и практическая значимость работы.

Впервые продемонстрирована способность препарата ЕНЕС CIP 105282 ghosts индуцировать специфический гуморальный и клеточный иммунный ответ в эксперименте. Показано, что мукозальная иммунизация мышей данным препаратом обеспечивает формирование протективного иммунитета к заражению гетерологичным штаммом E.coli 0157.-Н7.

В результате проделанной работы при моделировании E.coli 0157:Н7 инфекции и флавивирусных инфекций была показана возможность динамического мониторинга системного уровня цитокинов для определения тяжести течения и прогнозирования исхода инфекционного процесса, оценки эффективности вакцин и терапевтических препаратов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Цитокиновая реакция при моделировании E.coli 0157:Н7 инфекции на мышах линии BALB/c соответствует системной продукции некоторых цитокинов (ФНО-а, ИЛ-ip, ИЛ-6 и ИЛ-10) при патологии, обусловленной E.coli 0157:Н7, у людей.

2. Препарат ЕНЕС CIP 105282 ghosts стимулирует специфический гуморальный, в том числе мукозальный, и клеточный иммунный ответ. Мукозальная иммунизация препаратом ЕНЕС CIP 105282 ghosts превосходит по иммуногенным и протективным свойствам парентеральный способ иммунизации.

3. Динамика и концентрация сывороточных цитокинов у интактных мышей BALB/c и иммунизированных вакциной клещевого энцефалита после заражения вирусом клещевого энцефалита достоверно отличаются.

5. Показана возможность патогенетической терапии экспериментальной лихорадки Денге с помощью синтетического фрагмента молекулы фибрина ВР15.42.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих международных конференциях: 16th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (Nice, April 1-4, 2006); Молекулярная диагностика инфекционных болезней (Минск, 17-18 мая 2007 года).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано пять печатных работ, в том числе три в реферируемых научных журналах. Статьи в журналах:

1. Mayr U.B., Haller С., Haidinger W., Atrasheuskaya A., Bukin Е., Lubitz W., Ignatyev G. Bacterial ghosts as an oral vaccine: a single dose of Escherichia coli 0157:H7 bacterial ghosts protects mice against lethal challenge // Infect Immun.- 2005. - Vol.73(8). - p. 48104817.

2. Игнатьев Г.М., Букин E.K., Отрашевская E.B., Расщепкина М.Н., Воробьева М.С. Иммунологические показатели у мышей, иммунизированных вакциной клещевого энцефалита, после заражения вирусом клещевого энцефалита // Вопросы вирусологии. - 2006. - Т.51. - № 5 - С. 22-27.

3. Букин Е.К., Отрашевская Е.В., Воробьева М.С., Игнатьев Г.М. Изучение показателей гемостаза и продукции цитокинов при экспериментальной инфекции Денге // Вопросы вирусологии. - 2007. - Т.52. - № 2. - С. 32-36.

Тезисы конференций:

4. Bukin Е., Atrasheuskaya A., Rasshepkina М., Vorob'eva М., Ignatyev G. Comparison of immune response in immunized and non-immunized mice after challenge with tick-borne encephalitis virus II 16th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. Nice, April 1-4, 2006.

5. Букин E.K., Atrasheuskaya A.V., Mauro M. Teixeira, Игнатьев Г.М. Применение OT-ПЦР для клинической диагностики лихорадки Денге // Международная научно-практическая конференция «Молекулярная диагностика инфекционных болезней». Минск, 17-18 мая 2007 г.

Вклад автора. Результаты моделирования экспериментальной E.coli 0157:Н7 инфекции, оценки иммуногенных и протективных свойств препарата ЕНЕС CIP 105282 ghosts, динамика иммунологических показателей при моделировании ВД-инфекции получены непосредственно автором.

Работы по изучению иммунных реакций при экспериментальном вирусном клещевом энцефалите у иммунных мышей выполнялись совместно с сотрудником ГИСК им. Л.А.Тарасевича к.б.н. М.Н. Расщепкиной под руководством проф. Г.М. Игнатьева и проф. М.С. Воробьёвой на базе ФГУН НИИ Полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН.

Основная часть данных по изучению гематологических показателей при экспериментальном моделировании вирусной лихорадки Денге получены проф. Г.М. Игнатьевым на базе НИИ Клинической иммунологии при поддержке д.м.н. И.А. Орловской.

Автор выражает искреннюю признательность проф. Werner Lubitz (University of Vienna, Австрия) за предоставление токсин-продуцирующих штаммов E.coli 0157:Н7, препарата ЕНЕС CIP 105282 ghost и оказание консультативной поддержки.

Автор благодарит проф. Peter Petzelbauer (Medical University of Vienna, Австрия) за любезно предоставленную возможность исследовать свойства препарата FX-06.

Особую благодарность автор выражает проф. Г.М. Игнатьеву за научное руководство при выполнении работы и Отрашевской Е.В. за участие в обсуждении результатов исследования. Автор признателен коллегам по лаборатории и сотрудникам ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор", оказавшим консультативную и практическую помощь в выполнении отдельных разделов диссертационной работы: А.П.Агафонову, Л.Б.Дьячковой, Т.Г.Степановой, В.А.Евсеенко, И.В.Плясунову; сотруднику FDA А.А.Неверову.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Букин, Евгений Константинович

117 ВЫВОДЫ

1. Впервые показано, что мукозальная иммунизация (оральная или ректальная) мышей линии BALB/c препаратом ЕНЕС CIP 105282 ghosts приводит к формированию специфического клеточного, гуморального и мукозального иммунитета, обеспечивающего протективный эффект.

2. Показано, что при экспериментальной E.coli 0157:Н7 инфекции у мышей BALB/c с 3-х суток после заражения возрастает системная продукция ФНО-а, ИЛ-ip, ИЛ-6, ИЛ-10 и достигает максимума на 9-е сутки. У мышей, иммунизированных препаратом ЕНЕС CIP 105282 ghosts, системная продукция данных цитокинов на 5 - 9 сутки достоверно ниже и в дальнейшем возвращается к исходным значениям.

3. Развитие экспериментального клещевого энцефалита у мышей линии BALB/c сопровождается прогрессивным увеличением системной продукции ФНО-а, ИЛ-ip, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-12 и ИФН-у до момента гибели животных. У вакцинированных животных после заражения на фоне активации специфического гуморального и клеточного иммунитета отмечается увеличение системной продукции цитокинов на 3 — 5 сутки наблюдения с последующим достоверным снижением их активности.

4. Установлено, что летальное течение экспериментальной лихорадки Денге у мышей линии BALB/c характеризуется развитием анемии, лейкопении, тромбоцитопении, увеличением системной продукцией ФНО-а, ИЛ-ip и ИЛ-6 с 3-х суток после заражения и до момента гибели (9-е сутки). Нелетальное течение инфекции характеризуется лейкоцитозом, менее выраженной анемией и тромбоцитопенией; увеличение системной продукции ФНО-а, ИЛ-ip и ИЛ-6 отмечается на 3 - 7 сутки, после чего возвращается к исходным показателям.

5. Показано, что при моделировании лихорадки Денге на мышах BALB/c внутрибрюшинное введения синтетического фрагмента молекулы фибрина Bp 15-42 приводит к достоверному снижению летальности до 55% (р=0,0012).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Научные достижения последних лет коренным образом изменили современное представление о иммунопатогенезе инфекционных заболеваний. Клинические и экспериментальные исследования показали, что исход взаимодействия инфекционного агента с макроорганизмом определяется рядом факторов, среди которых особое значение имеют иммунные реакции, оказывающие как защитное, так и повреждающее воздействие на организм хозяина. В особенности это касается генерализованных инфекций, при которых развивается синдром системного воспалительного ответа (SIRS). Данное патологическое состояние обусловлено дисбалансом в продукции про-/противовоспалительных цитокинов.

Данные положения должны приниматься в расчёт при изучении патогенеза экспериментальных инфекций, а так же при доклинической оценке новых иммунобиологических препаратов. Традиционные методы оценки поствакцинального иммунитета включают, главным образом, определение специфических показателей гуморального и клеточного иммунитета, но не учитывают изменение неспецифических факторов, прежде всего цитокинов. Однако, исследование реакции цитокиновой системы является важнейшим составляющим в изучении иммунопатогенеза генерализованных инфекций [Игнатьев, 2003]. При этом использование инбредных мышей в качестве экспериментальной модели для изучения патологических изменений при инфекциях позволяет применить некоторые иммунологические методы, оптимизированные для данного вида животных, а также провести сравнительный анализ экспериментальных данных с клиническими данными у людей.

Указанный подход мы применили для изучения иммунопатогенеза некоторых генерализованных инфекций в эксперименте, а так же для оценки влияния иммунобиологических препаратов на течение и исход заболевания.

В качестве объекта исследования мы выбрали бактериальную инфекцию, вызываемую E.coli 0157:Н7, и флавивирусные заболевания (вирусный КЭ и ВД-инфекция). Согласно данным литературы, в иммунопатогенезе указанных нозологий определённую роль играет гиперцитокинемия, что и определило наш выбор. Кроме того, в настоящий момент эти инфекционные заболевания представляют огромную проблему для мирового здравоохранения.

Несмотря на широкий спектр антибактериальных препаратов и совершенствование методов терапии критических состояний, проблема E.coli 0157:Н7 инфекции остаётся не решённой до сих пор. По-прежнему инфекция является главной причиной развития острой почечной недостаточности у детей младшего возраста. Более перспективным способом снижения доли осложнений заболевания следует признать создание специфических вакцин, чем разработку неспецифических средств лечения.

Эпидемиологическая значимость лихорадки Денге не вызывает сомнения. Помимо роста заболеваемости на эндемичных территориях, в последние годы отмечается увеличение случаев ВД-инфекции в Европе у людей, вернувшихся из тропических стран [Hill, 2006]. Ситуация усугубляется отсутствием средств специфического лечения и профилактики, что требует разработки новых направлений патогенетической терапии.

Не менее тревожащей является эпидемиологическая обстановка по вирусному КЭ в Российской Федерации, особенно это касается Новосибирской области, где за прошедший сезон 2007 года зарегистрировано наибольшее количество летальных случаев инфекции. Такая ситуация наблюдается в условиях существования достаточно эффективной вакцины и осуществляемой серотерапии по экстренным показаниям.

При моделировании указанных инфекций на мышах BALB/c нам удалось воспроизвести ряд патологических изменений, характерных для течения заболеваний у людей. Наиболее важными следует признать данные по изучению цитокиновой реакции у животных. Участие цитокинов в регуляции иммунных механизмов и воспаления, позволяет говорить об их участии в развитии множества патологических состояний [Feldmann et al., 2004]. Поэтому вполне предсказуем тот факт, что, несмотря на различную этиологию экспериментальной инфекции, летальный исход развивался на фоне схожей реакции цитокиновой системы. Это подтверждает универсальность механизмов иммунного реагирования при генерализованной инфекции, в особенности в терминальных её стадиях. Являясь составной частью неспецифической резистентности организма, выработка этих медиаторов усиливается уже на начальных этапах, отражая активацию врождённого иммунитета. Цитокины первичного звена (ФНО-а и ИЛ-lp) в дальнейшем индуцируют синтез вторичных медиаторов (ИЛ-6, ИЛ-10), что следует рассматривать как включение компенсаторного противовоспалительного ответа (CARS). Анализ данных, полученных в экспериментальных Е.coli 0157:Н7 и флавивирусных инфекциях, выявил нарушение баланса между провоспалительными и противовоспалительными цитокинами, что, вероятно, во многом и определяло характер течения и исход заболевания.

Напротив, после заражении мышей, иммунизированных исследуемыми вакцинными препаратами (ЕНЕС CIP 105282 ghosts и вакцины КЭ), активность провоспалительных медиаторов (ФНО-а и ИЛ-ip) не была столь выражена и отмечалось быстрое восстановления цитокинового баланса на фоне активации адаптивного иммунитета.

Представляют интерес и результаты о влиянии синтетического фрагмента молекулы фибрина (препарат FX-06) на исход и течение летальной экспериментальной ВД-инфекции.

Помимо положительного воздействия на динамику показателей гемостаза, препарат модулировал активность системы цитокинов. Общие закономерности можно было выявить при сравнении цитокинового профиля у животных после заражения нелетальной дозой адаптированного штамма ВД и у мышей, инфицированных летальной дозой и получавших FX-06. Это в очередной раз подтверждает участие цитокинов в иммунопатогенезе инфекции и указывает на возможные подходы её терапии.

Подводя итог всему вышесказанному, следует подчеркнуть, что динамическое исследование продукции цитокинов может быть использовано для выявления закономерностей развития инфекций и оценки иммунологических свойств различных препаратов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Букин, Евгений Константинович, Кольцово

1. Аммосов А.Д. Клещевой энцефалит. Кольцово: 2002. - 94 с.

2. Ашмарин И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П.Ашмарин, А.А.Воробьёв. Ленинград: Государственное издательство медицинской литературы, 1962. - 182 с.

3. Верета Л.А. Природная гетерогенность и целенаправленный отбор штаммов вируса клещевого энцефалита / Л.А.Верета, М.С.Воробьёва. Москва: Медицина, 1990. - 128 с.

4. Воробьёва М.С. 1985. Принципы стандартизации и совершенствование методов контроля вакцин против клещевого энцефалита: Автореф. дисс. . д-ра мед.наук, Москва. 52 с.

5. Вотяков В.И., Протас И.И., Жданов В.М. Западный клещевой энцефалит /

6. B.И.Вотяков, И.И.Протас, В.М.Жданов. Минск, Беларусь: 1978. - 256 с.

7. Гланц С. Медико-биологическая статистика. Москва: Практика, 1999. - 460 с.

8. Игнатьев Г.М. 2003. Экспериментальные препараты для профилактики фило- и аренавирусных геморрагических лихорадок: Дисс. д-ра мед.наук, Кольцово. 276 с.

9. Игнатьев Г.М., Отрашевская Е.В., Воробьёва М.С. Продукция некоторых цитокинов при экспериментальной инфекции вирусом клещевого энцефалита у мышей // Вопросы вирусологии. 2003а. - № 48(1). - С. 18-21.

10. Игнатьев Г.М., Отрашевская Е.В., Воробьёва М.С. Активность цитокинов при иммунизации вакциной против клещевого энцефалита в эксперименте // Вопросы вирусологии. 20036. - № 48(2). - С.22-25.

11. Иерусалимский А.П. Клещевой энцефалит. Руководство для врачей. Новосибирск: 2001.-360 с.

12. Кан Г.А. 1986. Иммунобиологическое обоснование отбора линий инбредных мышей для контроля вакцин против клещевого энцефалита: Автореф. дисс. . канд. биол. наук. Москва. 24 с.

13. Кветкова Е.А., Переходова С.К. Развитие клеточного иммунитета при экспериментальном клещевом энцефалите // Вопросы вирусологии. -1981.-№211. C.67-72.

14. Лакин Г.Ф. Биометрия. Москва: Высшая школа 1990. - 352 с.

15. Леонова Г.Н. Клещевой энцефалит в Приморском крае. Владивосток: Дальнаука, 1997.- 187 с.

16. Леонова Г.Н., Исачкова Л.М., Борисевич В.Г., Фисенко А.Ю. Экспериментальный клещевой энцефалит у золотистых хомячков на фоне специфической иммунотерапии // Вопросы вирусологии. 2000. - № 45. - С.28-33.

17. Лобзин Ю.В. Избранные вопросы терапия инфекционных больных: руководство для врачей. Санкт-Петербург: Фолиант, 2005. - 853 с.

18. Погодина В.В. Экспериментальное изучение клещевого энцефалита при алиментарном заражении // Вопросы вирусологии. 1960. - № 3. - С.272-285.

19. Погодина В.В. Хронический клещевой энцефалит / В.В.Погодина, М.П.Фролова, Б.А.Эрман. Новосибирск: Наука, 1986. - 78 с.

20. Приказ МЗ СССР № 141 от 9 апреля 1990 года «О дальнейшем совершенствовании мероприятий по профилактике КЭ».

21. Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Санитарно-эпидемиологическая обстановка по заболеваемости вирусным клещевым энцефалитом, http://www.rospotrebnadzor.ru/sanepid/. 2007.

22. Титенко A.M., Бахум С.В., Андаев Е.И., Борисова Т.И., Ботвинкин А.Д. Определение вирусофорности клещей Ixodes persulcatus при мониторинге территорий, эндемичных для клещевого энцефалита // Ветеринарная патология. 2002. - № 2. - С. 115-119.

23. Черешнев В.А., Гусев Е.Ю. Иммунология воспаления: роль цитокинов // Медицинская иммунология. 2001. - № 3.' - С.361-368.

24. Черницына Л.О., Коненков В.И., Иерусалимский А.П. Прогнозирование предрасположенности и резистентности к заболеванию клещевым энцефалитом. Методические рекомендации. Новосибирск: 1993. - 41 с.

25. Aberle J.H., Aberle S.W., Kofler R.M., Mandl C.W. Humoral and cellular immune response to RNA immunization with flavivirus replicons derived from tick-borne encephalitis virus // J Virol. 2005. - Vol.-79. - p.l5107-15113.

26. Arend W.P. Interleukin-1 receptor antagonist // Adv Immunol. 1993. - Vol.-54. - p.l 67227.

27. Arras C., Fescharek R., Gregersen J.P. Do specific hyperimmunoglobulins aggravate clinical course of tick-borne encephalitis? // Lancet. 1996. - Vol.-347. - p. 1331.

28. Atrasheuskaya A., Petzelbauer P., Fredeking T.M., Ignatyev G. Anti-TNF antibody treatment reduces mortality in experimental dengue virus infection // FEMS Immunol Med Microbiol. 2003a. - Vol.-35. - p.33-42.

29. Atrasheuskaya A.V., Fredeking T.M., Ignatyev G.M. Changes in immune parameters and their correction in human cases of tick-borne encephalitis // Clin Exp Immunol. 2003b. -Vol.-131. - p.148-154.

30. Bach T.L., Barsigian C., Yaen C.H., Martinez J. Endothelial cell VE-cadherin functions as a receptor for the betal5-42 sequence of fibrin // J Biol Chem. 1998. - Vol.-273. - p.30719-30728.

31. Barrett P.N., Schober-Bendixen S., Ehrlich H.J. History of TBE vaccines // Vaccine. 2003. -Vol.-21 Suppl l.-p.S41-49.

32. Bender A., Jager G., Scheuerer W., Feddersen В., Kaiser R., Pfister H.W. Two severe cases of tick-borne encephalitis despite complete active vaccination—the significance of neutralizing antibodies // J Neurol. 2004. - Vol.-251. - p.353-354.

33. Bente D.A., Melkus M.W., Garcia J.V., Rico-Hesse R. Dengue fever in humanized NOD/SCID mice // J Virol. 2005. - Vol.-79. - p. 13797-13799.

34. Bente D.A., Rico-Hesse R. Models of dengue virus infection // Drug Discov Today. 2006. - Vol.-3. -p.97-103.

35. Bertini R., Bianchi M., Ghezzi P. Adrenalectomy sensitize mice to the lethal effects of interleukin-1 and tumor necrosis factor // J. Exp. Med. 1988. - Vol.-167. - p.1708-1712.

36. Bethell D.B., Flobbe К., Cao X.T., Day N.P., Pham T.P., Buurman W.A., Cardosa M.J., White N.J., Kwiatkowski D. Pathophysiologic and prognostic role of cytokines in dengue hemorrhagic fever // J Infect Dis. 1998. - Vol.-177. - p.778-782.

37. Bidwell J., Keen L., Gallagher G., Kimberly R., Huizinga Т., McDermott M.F., Oksenberg J., McNicholl J., Pociot F., Hardt C., D'Alfonso S. Cytokine gene polymorphism in human disease: on-line databases // Genes Immun. 1999. - Vol.-l. - p.3-19.

38. Billiau A., Vandenbroeck K. 2004. IFN-gamma. In: Oppenheim J., Feldman M., Durum S., Hirano Т., Vilcek J. and Nicola N. (Eds), Cytokine Reference Book, Academic Press, pp. 641-688.

39. Blackburn C.d.W., McClure P.J., eds, 2002. Foodborne pathogens. Hazards, risk analysis and control Woodhead Publishing Limited, Cambridge, England.

40. Bone R.C. Sir Isaac Newton, sepsis, SIRS, and CARS // Crit. Care. Med. 1996. - Vol.-24. -p.l 125-1129.

41. Bone R.C., Godzin C.J., Balk R.A. Sepsis: a new hypothesis for pathogenesis of the disease process // Chest. 1997. - Vol.-l 12. - p.235-243.

42. Bosworth B.T., Samuel J.E., Moon H.W., O'Brien A.D., Gordon V.M., Whipp S.C. Vaccination with genetically modified Shiga-like toxin lie prevents edema disease in swine // Infect Immun. 1996. - Vol.-64. - p.55-60.

43. Boyce T.G., Swerdlow D.L., Griffin P.M. Escherichia coli 0157:H7 and the hemolytic-uremic syndrome // N Engl J Med. 1995. - Vol.-ЗЗЗ. - p.364-368.

44. Brandtzaeg P. Role of secretory antibodies in the defence against infections // Int J Med Microbiol. 2003. - Vol.-293. - p.3-15.

45. Brandtzaeg P., Farstad I.N., Haraldsen G., Jahnsen F.L. Cellular and molecular mechanisms for induction of mucosal immunity // Dev Biol Stand. 1998. - Vol.-92. - p.93-108.

46. Burke D.S., Nisalak A., Johnson D.E., Scott R.M. A prospective study of dengue infections in Bangkok // Am J Trop Med Hyg. 1988. - Vol.-38. - p. 172-180.

47. Callard R., George A.J., Stark J. Cytokines, chaos, and complexity // Immunity. 1999. -Vol.-ll. - p.507-513.

48. Capron A., Locht C., Fracchia G.N. Safety and efficacy of new generation vaccines // Vaccine. 1994. - Vol.-12. - p.667-669.

49. Chaturvedi U., Nagar R., Shrivastava R. Dengue and dengue haemorrhagic fever: implications of host genetics // FEMS Immunol Med Microbiol. 2006. - Vol.-47. - p.155-166.

50. Chaturvedi U.C., Agarwal R., Elbishbishi E.A., Mustafa A.S. Cytokine cascade in dengue hemorrhagic fever: implications for pathogenesis // FEMS Immunol Med Microbiol. 2000. - Vol.-28. -p.183-188.

51. Chaturvedi U.C., Mukeijee R., Dhawan R. Active immunization by a dengue virus-induced cytokine // Clin Exp Immunol. 1994. - Vol.-96. - p.202-207.

52. Chen H.C., Hofman F.M., Kung J.T., Lin Y.D., Wu-Hsieh B.A. Both virus and tumor necrosis factor alpha are critical for endothelium damage in a mouse model of dengue virus-induced hemorrhage // J Virol. 2007. - VoL-81. - p.5518-5526.

53. Chungue E., Poli L., Roche C., Gestas P., Glaziou P., Markoff L.J. Correlation between detection of plasminogen cross-reactive antibodies and hemorrhage in dengue vims infection // J Infect Dis. 1994. - Vol.-170. - p.1304-1307.

54. Clark D.V., Mammen M.P., Jr., Nisalak A., Puthimethee V., Endy T.P. Economic impact of dengue fever/dengue hemorrhagic fever in Thailand at the family and population levels // Am J Trop Med Hyg. 2005. - Vol.-72. - p.786-791.

55. Coffman R.L., Mosmann T.R. CD4+ T-cell subsets: regulation of differentiation and function // Res. Immunol. 1991. - Vol.-142. - p.7-9.

56. Conlan J.W., Bardy S.L., KuoLee R., Webb A., Perry M.B. Ability of Escherichia coli 0157:H7 isolates to colonize the intestinal tract of conventional adult CD1 mice is transient // Can J Microbiol. 2001. - Vol.-47. - p.91-95.

57. Conlan J.W., KuoLee R., Webb A., Perry M.B. Salmonella landau as a live vaccine against Escherichia coli 0157:H7 investigated in a mouse model of intestinal colonization // Can J Microbiol. 1999b. - Vol.-45. - p.723-731.

58. Conlan J.W., Perry M.B. Susceptibility of three strains of conventional adult mice to intestinal colonization by an isolate of Escherichia coli 0157:H7 // Can J Microbiol. 1998. - Vol.-44. - p.800-805.

59. Cottrez F., Hurst S.D., Coffman R.L., Groux H. T regulatory cells 1 inhibit a Th2-specific response in vivo // J. Immunol. 2000. - Vol.-165. - p.4848-4853.

60. Dewi B.E., Takasaki Т., Kurane I. In vitro assessment of human endothelial cell permeability: effects of inflammatory cytokines and dengue virus infection // J Virol Methods. 2004. - Vol.-121. - p.171-180.

61. Dhawan R., Khanna M., Chaturvedi U.C., Mathur A. Effect of dengue virus-induced cytotoxin on capillary permeability // J Exp Pathol (Oxford). 1990. - Vol.-71. - p.83-88.

62. Dinarello C.A. Anti-Cytokine Therapies in Response to Systemic Infection // Journal of Investigative Dermatology Symposium Proceedings. 2001. - Vol.-б. - p.244-250.

63. Dinarello C.A. Anti-cytokine therapeutics and infections // Vaccine. 2003. - Vol.-21. -p.24-34.

64. Durum S.K. 2004. Cytokines and the immune system. In: Oppenheim J., Feldman M., Durum S., Hirano Т., Vilcek J. and Nicola N. (Eds), Cytokine Reference Book Vol. 1, Academic Press, pp. 95-98.

65. Ecker M., Allison S.L., Meixner Т., Heinz F.X. Sequence analysis and genetic classification of tick-borne encephalitis viruses from Europe and Asia // J Gen Virol. 1999. - Vol.-80 ( Pt 1). - p.179-185.

66. Eko F.O., Mayr U.B., Attridge S.R., Lubitz W. Characterization and immunogenicity of Vibrio cholerae ghosts expressing toxin-coregulated pili // J Biotechnol. 2000. - Vol.-83. -p.115-123.

67. Esmon C.T. The impact of the inflammatory response on coagulation // Thromb Res. 2004. - Yol.-l 14. - p.321-327.

68. Fang F.C. Mechanisms of nitric oxide-related antimicrobial activity // J Clin Invest. 1997. -Vol.-99. -p.2818-2825.

69. Fattori E., Cappelletti M., Costa P., Sellitto C., Cantoni L., Carelli M., Faggioni R., Fantuzzi G., Ghezzi P., Poli V. Defective inflammatory response in interleukin 6-deficient mice // J. Exp. Med. 1994. - Vol.-180. - p.1243-1250.

70. Feldmann M., Brennan F.M. 2004. Cytokines and disease. In: Oppenheim J., Feldman M., Durum S., Hirano Т., Vilcek J. and Nicola N. (Eds), Cytokine Reference Book Vol. 1, Academic Press, pp. 35-51.

71. Feldmann M., Brennan F.M., Maini R.N. Role of cytokines in rheumatoid arthritis // Ann Rev Immunol. 1996. - Vol.-14. - p.397-400.

72. Feng P., Lampel K.A., Karch H., Whittam T.S. Genotypic and phenotypic changes in the emergence of Escherichia coli 0157:H7 // J Infect Dis. 1998. - Vol.-177. - p.1750-1753.

73. Fenwick B.W., Cowan L.A. 1998. Canine model of the hemolytic uremic syndrome. In: Kaper J.B. and O'Brien A.D. (Eds), Escherichia coli 0157:H7 and Other Shiga Toxin-Producing E. coli Strains, ASM, Washington, DC, pp. 268-277.

74. Funatogawa K., Ide Т., Kirikae F., Saruta K., Nakano M., Kirikae T. Use of immunoglobulin enriched bovine colostrum against oral challenge with enterohaemorrhagic Escherichia coli 0157:H7 in mice // Microbiol Immunol. 2002. - Vol.-46. - p.761-766.

75. Garcia G., Arango M., Perez A.B., Fonte L., Sierra В., Rodriguez-Roche R., Aguirre E., Fiterre I., Guzman M.G. Antibodies from patients with dengue viral infection mediate cellular cytotoxicity // J Clin Virol. 2006. - Vol.-37. - p.53-57.

76. Giradin E., Grau G.E., Dayer J.M., al. e. Tumor necrosis factor and interleukin-1 in the serum of children with severe infectious purpura // N. Engl. J. Med. 1988. - Vol.-319. -p.397-400.

77. Glukhov B.N., Jerusalimsky A.P., Canter V.M., Salganik R.I. Ribonuclease treatment of tick-borne encephalitis // Arch Neurol. 1976. - Vol.-33. - p.598-603.

78. Green S., Rothman A. Immunopathological mechanisms in dengue and dengue hemorrhagic fever // Curr Opin Infect Dis. 2006. - Vol.-l 9. - p.429-436.

79. Greiner D.L., Hesselton R.A., Shultz L.D. SCID mouse models of human stem cell engraftment // Stem Cells. 1998. - VoL-16. - p.166-177.

80. Gresikova M., Kaluzova M. Biology of tick-borne encephalitis virus // Acta Virol. 1997. -Vol.-41. -p.l 15-124.

81. Griffin P.M., Tauxe R.V. The epidemiology of infections caused by Escherichia coli 0157:H7, other enterohemorrhagic E. coli, and the associated hemolytic uremic syndrome // Epidemiol Rev. 1991. - Vol.-l3. - p.60-98.

82. Gritsun T.S., Lashkevich V.A., Gould E.A. Tick-borne encephalitis // Antiviral Res. 2003. ! - Vol.-57. -p.129-146.

83. Gruol D.L., Nelson Т.Е. Physiological and pathological roles of interleukin-6 in the central nervous system // Mol Neurobiol. 1997. - Vol.-15. - p.307-309.

84. Gubler D.J., Reiter P., Ebi K.L., Yap W., Nasci R., Patz J.A. Climate variability and change in the United States: potential impacts on vector- and rodent-borne diseases // Environ Health Perspect. 2001. - Vol.-109 Suppl 2. - p.223-233.

85. Gubler D.J., Trent D.W. Emergence of epidemic dengue/dengue hemorrhagic fever as a public health problem in the Americas // Infect Agents Dis. 1993. - Vol.-2. - p.383-393.

86. Haidinger W., Mayr U.B., Szostak M.P., Resch S., Lubitz W. Escherichia coli ghost production by expression of lysis gene E and Staphylococcal nuclease // Appl Environ Microbiol. 2003. - Vol.-69. - p.6106-6113.

87. Hales B.A., Hart C.A., Batt R.M., Saunders J.R. The large plasmids found in enterohemorrhagic and enteropathogenic Escherichia coli constitute a related series of transfer-defective Inc F-IIA replicons // Plasmid. 1992. - Vol.-28. - p.183-193.

88. Halstead S.B. Etiologies of the experimental dengues of Siler and Simmons // Am J Trop MedHyg. 1974. - Vol.-23. - p.974-982.

89. Halstead S.B. Pathogenesis of dengue: challenges to molecular biology // Science. 1988. -Vol.-239.-p.476-481.

90. Halstead S.B. Antibody, macrophages, dengue virus infection, shock, and hemorrhage: a pathogenetic cascade // Rev Infect Dis. 1989. - Vol.-l 1 Suppl 4. - p.S830-839.

91. Halstead S.B., Nimmannitya S., Cohen S.N. Observations related to pathogenesis of dengue hemorrhagic fever. IV. Relation of disease severity to antibody response and virus recovered // Yale J Biol Med. 1970. - Vol.-42. - p.311-328.

92. Halstead S.B., O'Rourke E.J. Antibody-enhanced dengue virus infection in primate leukocytes //Nature. 1977a. - Vol.-265. - p.739-741.

93. Halstead S.B., O'Rourke E.J. Dengue viruses and mononuclear phagocytes. I. Infection enhancement by non-neutralizing antibody // J Exp Med, 1977b. - Vol.-146. - p.201-217.

94. Halstead S.B., Shotwell H., Casals J. Studies on the pathogenesis of dengue infection in monkeys. I. Clinical laboratory responses to primary infection // J Infect Dis. 1973. - Vol.-128.-p.7-14.

95. Halstead S.B., Suaya J.A., Shepard D.S. The burden of dengue infection // Lancet. 2007. -Vol.-369. - p.1410-1411.

96. Haslberger A.G., Kohl G., Felnerova D., Mayr U.B., Furst-Ladani S., Lubitz W. Activation, stimulation and uptake of bacterial ghosts in antigen presenting cells // J Biotechnol. 2000.- Vol.-83.-p.57-66.

97. Heinz F.X. Epitope mapping of flavivirus glycoproteins // Adv Virus Res. 1986. - Vol.-31.- p.103-168.124.125.126,127.128129130131,132,133,134.135.136.

98. Heinz F.X., Allison S.L., Stiasny K., Schalich J., Holzmann H., Mandl C.W., Kunz C. Recombinant and virion-derived soluble and particulate immunogens for vaccination against tick-borne encephalitis // Vaccine. 1995. - Vol.-13. - p.1636-1642.

99. Henchal E.A., Putnak J.R. The dengue viruses // Clin Microbiol Rev. 1990. - Vol.-3. -p.376-396.

100. Hill D.R. The burden of illness in international travelers // N Engl J Med. 2006. - Vol.-354.- p.115-117.

101. Jessie К., Fong M.Y., Devi S., Lam S.K., Wong K.T. Localization of dengue virus in naturally infected human tissues, by immunohistochemistry and in situ hybridization // J Infect Dis. -2004. Vol.-189. - p. 1411-1418.

102. Johnson A.J., Roehrig J.T. New mouse model for dengue virus vaccine testing // J Virol. -1999. Vol.-73. - p.783-786.

103. Johnson W.M., Lior H., Bezanson G.S. Cytotoxic Escherichia coli 0157:H7 associated with haemorrhagic colitis in Canada // Lancet. 1983. - Vol.-l. - p.76.

104. Judge N.A., Mason H.S., O'Brien A.D. Plant cell-based intimin vaccine given orally to mice primed with intimin reduces time of Escherichia coli 0157:H7 shedding in feces // Infect Immun. 2004. - Vol.-72. - p. 168-175.

105. Kagi D., Ledermann В., Burki K., al. e. Molecular mechanisms of lymphocyte-mediated cytotoxicity and their role in immunological protection and pathogenesis in vivo // Annu Rev. Immunol. 1996. - Vol.-14. - p.207-232.

106. Kaiser R. Inoculation against FSME (early summer meningoencephalitis)—a questionable use of antibody determination for checking the immunity status. // Dtsch Med Wochenschr.- 1999. Vol.-124.-p.542.

107. Karch H., Tarr P.I., Bielaszewska M. Enterohaemorrhagic Escherichia coli in human medicine // Int J Med Microbiol. 2005. - Vol.-295. - p.405-418.

108. Karmali M.A. Infection by verocytotoxin-producing Escherichia coli // Clin Microbiol Rev.- 1989. Vol.-2.-p.15-38.

109. Karmali M.A. 2002. The Medical Significance of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli Infections. In: Philpott D. and Ebel F. (Eds), E. coli: Shiga Toxin Methods and Protocols Vol. 73, Humana Press, Totowa, NJ, pp. 1-7.

110. Karmali M.A., Petric M., Lim C., Fleming P.C., Steele B.T. Escherichia coli cytotoxin, haemolytic-uraemic syndrome, and haemorrhagic colitis // Lancet. 1983a. - Vol.-2. -p.1299-1300.

111. Karpman D., Andreasson A., Thysell H., Kaplan B.S., Svanborg C. Cytokines in childhood hemolytic uremic syndrome and thrombotic thrombocytopenic purpura // Pediatr Nephrol. -1995.- Vol.-9. p.694-699.

112. Karupiah G. Type 1 and type 2 cytokines in antiviral defense // Vet. Immun. Immunopath. -1998.-Vol.-63.-p.105-109.

113. Keenan K.P., Sharpnack D.D., Collins H., Formal S.B., O'Brien A.D. Morphologic evaluation of the effects of Shiga toxin and E coli Shiga-like toxin on the rabbit intestine // Am J Pathol. 1986. - Vol.-125. - p.69-80.

114. Kelso A. Thl and Th2 subsets: paradigm lost? // Immunol. Today. 1995. - V0I.-I6. -p.374-379.

115. Kondrusik M., Pancewicz S., Zajkowska J., Hermanowska-Szpakowicz T. Tumor necrosis factor alpha and interleukin 1-beta in serum of patients with tick-borne encephalitis. // Pol Merkuriusz Lek. 2001. - Vol.-l 1. - p.26-28.

116. Konowalchuk J., Speirs J.I., Stavric S. Vero response to a cytotoxin of Escherichia coli // Infect Immun. 1977. - Vol.-l8. - p.775-779.

117. Kozlowski P.A., Cu-Uvin S., Neutra M.R., Flanigan T.P. Comparison of the oral, rectal, and vaginal immunization routes for induction of antibodies in rectal and genital tract secretions of women // Infect Immun. 1997. - Vol.-65. - p.1387-1394.

118. Kuhn R., Lohler J., D. R., al. e. Interleukin- 10-deficient mice develop chronic enterocolitis // Cell. 1993. - Vol.-22. - p.263-274.

119. Kunz С. TBE vaccination and the Austrian experience // Vaccine. 2003. - Vol.-21 SuppI 1. - p.S50-55.

120. Kurane I., Innis B.L., Nisalak A., Hoke C., Nimmannitya S., Meager A., Ennis F.A. Human T cell responses to dengue virus antigens. Proliferative responses and interferon gamma production//J Clin Invest. 1989a. - Vol.-83. - p.506-513.

121. Kurane I., Meager A., Ennis F.A. Dengue virus-specific human T cell clones. Serotype crossreactive proliferation, interferon gamma production, and cytotoxic activity // J Exp Med. 1989b. - Vol.-170. - p.763-775.

122. Kurane I., Okamoto Y., Dai L.C., Zeng L.L., Brinton M.A., Ennis F.A. Flaviviras-cross-reactive, HLA-DR15-restricted epitope on NS3 recognized by human CD4+ CD8- cytotoxic T lymphocyte clones // J Gen Virol. 1995. - Vol.-76 ( Pt 9). - p.2243-2249.

123. Kurioka Т., Yunou Y., Kita E. Enhancement of susceptibility to Shiga toxin-producing Escherichia coli 0157:H7 by protein calorie malnutrition in mice // Infect Immun. 1998. -Vol.-бб.-p.1726-1734.

124. Lanciotti R.S., Calisher C.H., Gubler D.J., Chang G.J., Vorndam A.V. Rapid detection and typing of dengue viruses from clinical samples by using reverse transcriptase-polymerase chain reaction // J Clin Microbiol. 1992. - Vol.-30. - p.545-551.

125. Lee J.E., Kim J.S., Choi I.H., Tagawa M., Kohsaka Т., Jin D.K. Cytokine expression in the renal tubular epithelial cells stimulated by Shiga toxin 2 of Escherichia coli 0157:H7 // Ren Fail. 2002. - VoL-24. - p.567-575.

126. Lepej S.Z., Misic-Majerus L., Jeren Т., Rode O.D., Remenar A., Sporec V., Vince A. Chemokines CXCL10 and CXCL11 in the cerebrospinal fluid of patients with tick-borne encephalitis // Acta Neurol Scand. 2007. - Vol.-l 15. - p.l09-114.

127. Li Y., Frey E., Mackenzie A.M., Finlay B.B. Human response to Escherichia coli 0157:H7 infection: antibodies to secreted virulence factors // Infect Immun. 2000. - V0I.-68. -p.5090-5095.

128. Libraty D.H., Pichyangkul S., Ajariyakhajorn C., Endy T.P., Ennis F.A. Human dendritic cells are activated by dengue virus infection: enhancement by gamma interferon and implications for disease pathogenesis // J Virol. 2001. - Vol.-75. - p.3501-3508.

129. Ling L.M., Wilder-Smith A., Leo Y.S. Fulminant hepatitis in dengue haemorrhagic fever // J Clin Virol. 2007. - Vol.-38. - p.265-268.

130. Lior H. 1996. Classification of Escherichia coli. In: Gyles C.L. (Ed), Escherichia coli in domestic animals and humans CAB International, Wallingford, United Kingdompp. 31-72.

131. Litalien С., Proulx F., Mariscalco M.M., Robitaille P., Turgeon J.P., Orrbine E., Rowe P.C., McLaine P.N., Seidman E. Circulating inflammatory cytokine levels in hemolytic uremic syndrome // Pediatr Nephrol. 1999. - Vol.-13. - p.840-845.

132. Lovett R.A. Training a molecular gun on killer E. coli // Science. 1998. - Vol.-282. -p. 1404.

133. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J Biol Chem. 1951. - Vol.-193. - p.265-275.

134. Mackenzie J.S., Gubler D.J., Petersen L.R. Emerging flaviviruses: the spread and resurgence of Japanese encephalitis, West Nile and dengue viruses // Nat Med. 2004. - Vol.-10. -P.S98-109.

135. Mader H.J., Szostak M.P., Hensel A., Lubitz W., Haslberger A.G. Endotoxicity does not limit the use of bacterial ghosts as candidate vaccines // Vaccine. 1997. - Vol.-15. - p.195-202.

136. Malavige G.N., Fernando S., Fernando D.J., Seneviratne S.L. Dengue viral infections // Postgrad Med J. 2004. - Vol.-80. - p.588-601.

137. Malinoski F.J., Hasty S.E., Ussery M.A., Dalrymple J.M. Prophylactic ribavirin treatment of dengue type 1 infection in rhesus monkeys // Antiviral Res. 1990. - Vol.-13. - p.139-149.

138. Marcato P., Mulvey G., Read R.J., Vander Helm K., Nation P.N., Armstrong G.D. Immunoprophylactic potential of cloned Shiga toxin 2 В subunit // J Infect Dis. 2001. -Vol.-183. - p.435-443.

139. McBride W.J., Bielefeldt-Ohmann H. Dengue viral infections; pathogenesis and epidemiology // Microbes Infect. 2000. - Vol.-2. - p. 1041-1050.

140. McDaniel Т.К., Jarvis K.G., Donnenberg M.S., Kaper J.B. A genetic locus of enterocyte effacement conserved among diverse enterobacterial pathogens // Proc Natl Acad Sci USA. 1995. - Vol.-92. - p.1664-1668.

141. Melton-Celsa A.R., O'Brien A.D. 2002. Animal Models for STEC-Mediated Disease. In: Philpott D. and Ebel F. (Eds), E. coli: Shiga Toxin Methods and Protocols, Humana Press, Totowa, NJ, pp. 291-306.

142. Michie H.R. Metabolism of sepsis and multiple organ failure // World J. Surg. 1996. -Vol.-20. - p.460-464.

143. Mitrakul C. Bleeding problem in dengue haemorrhagic fever: platelets and coagulation changes // Southeast Asian J Trop Med Public Health. 1987. - V0I.-I8. - p.407-412.

144. Moake J.L. Haemolytic-uraemic syndrome: basic science // Lancet. 1994. - Vol.-343. -p.393-397.

145. Monath T.P. Dengue: the risk to developed and developing countries // Proc Natl Acad Sci USA.- 1994. Vol.-91. - p.2395-2400.

146. Moncada S., Palmer R.M.J., Higgs E.A. Nitric oxide: physiology, pathophysiology, and pharmacology//Pharmacol. Rev. -1991. Vol.-43. - p.109-142.

147. Morens D.M. Antibody-dependent enhancement of infection and the pathogenesis of viral disease // Clin Infect Dis. 1994. - Vol.-l9. - p.500-512.

148. Mourya D.T., Gokhale, Basu A., Barde P.V., Sapkal G.N., Padbidri V.S., Gore M.M. Horizontal and vertical transmission of dengue virus type 2 in highly and lowly susceptible strains of Aedes aegypti mosquitoes // Acta Virol. 2001. - Vol.-45. - p.67-71.

149. Nataro J.P., Kaper J.B. Diarrheagenic Escherichia coli // Clin Microbiol Rev. 1998. - Vol.-11.-p. 142-201.

150. Nataro J.P., Maher K.O., Mackie P., Kaper J.B. Characterization of plasmids encoding the adherence factor of enteropathogenic Escherichia coli // Infect Immun. 1987. - Vol.-55. -p.2370-2377.

151. Nguyen T.L., Nguyen Т.Н., Tieu N.T. The impact of dengue haemorrhagic fever on liver function // Res Virol. 1997. - Vol.-l 48. - p.273-277.

152. O'Brien A.D., LaVeck G.D., Griffin D.E., Thompson M.R. Characterization of Shigella dysenteriae 1 (Shiga) toxin purified by anti-Shiga toxin affinity chromatography // Infect Immun. 1980. - Vol.-30. - p. 170-179.

153. O'Brien A.D., Tesh V.L., Donohue-Rolfe A., Jackson M.P., Olsnes S., Sandvig K., Lindberg A.A., Keusch G.T. Shiga toxin: biochemistry, genetics, mode of action, and role in pathogenesis // Curr Top Microbiol Immunol. 1992. - Vol.-180. - p.65-94.

154. O'Brien A.O., Lively T.A., Chen M.E., Rothman S.W., Formal S.B. Escherichia coli 0157:H7 strains associated with haemorrhagic colitis in the United States produce a Shigella dysenteriae 1 (SHIGA) like cytotoxin// Lancet. 1983. - Vol.-l. - p.702.

155. Ochoa T.J., Cleary T.G. Epidemiology and spectrum of disease of Escherichia coli 0157 // Curr Opin Infect Dis. 2003. - Vol.-16. - p.259-263.

156. Oschmann P., Kraiczy P., Halperin P., Brade V., eds, 1999. Lyme Borreliosis and Tick-Borne Encephalitis. UNI-MED, Bremen.

157. Ostroff S.M., Kobayashi J.M., Lewis J.H. Infections with Escherichia coli 0157:H7 in Washington State. The first year of statewide disease surveillance // Jama. 1989. - Vol.262. - p.355-359.

158. Pai C.H., Kelly J.K., Meyers G.L. Experimental infection of infant rabbits with verotoxin-producing Escherichia coli // Infect Immun. 1986. - Vol.-51. - p. 16-23.

159. Pang Т., Cardosa M.J., Guzman M.G. Of cascades and perfect storms: the immunopathogenesis of dengue haemorrhagic fever-dengue shock syndrome (DHF/DSS) // Immunol Cell Biol. 2007. - Vol.-85. - p.43-45.

160. Reiner S.L., Locksley R.M. The regulation of immunity to Leishmania major // Annu. Rev. Immunol. 1995. - Vol.-13. - p.151-177.

161. Rengarajan J., Szabo S.J., Glimcher L.H. Transcriptional regulation of Thl/Th2 polarization // Immunol. Today. 2000. - Vol.-10. - p.479-483.

162. Ribes J.A., Ni F., Wagner D.D., Francis C.W. Mediation of fibrin-induced release of von Willebrand factor from cultured endothelial cells by the fibrin beta chain // J Clin Invest. -1989. Vol.-84. - p.435-442.

163. Rice T.W., Bernard G.R. Therapeutic intervention and targets for sepsis // Annu Rev Med. -2005. Vol.-56. - p.225-248.

164. Richardson S.E., Rotman T.A., Jay V., Smith C.R., Becker L.E., Petric M., Olivieri N.F., Karmali M.A. Experimental verocytotoxemia in rabbits // Infect Immun. 1992. - Vol.-бО. -p.4154-4167.

165. Rosen L. Experimental infection of New World monkeys with dengue and yellow fever viruses // Am J Trop Med Hyg. 1958. - Vol.-7. - p.406-410.

166. Rosen L. Mechanism of vertical transmission of the dengue virus in mosquitoes // С R Acad Sci III. 1987. - Vol.-304. - p.347-350.

167. Rothman A.L. Immunology and immunopathogenesis of dengue disease // Adv Virus Res. -2003. Vol.-бО. -p.397-419.

168. Ruby J., Ramshaw I. The antiviral activity of immune CD8+ T cells is dependent on interferon-gamma // Lymphokine Cytokine Res. 1991. - Vol.-10. - p.353-358.

169. Rumyantsev A.A., Chanock R.M., Murphy B.R., Pletnev A.G. Comparison of live and inactivated tick-borne encephalitis virus vaccines for safety, immunogenicity and efficacy in rhesus monkeys // Vaccine. 2006. - Vol.-24. - p.133-143.

170. Russell P.K., Nisalak A., Sukhavachana P., Vivona S. A plaque reduction test for dengue virus neutralizing antibodies // J Immunol. 1967. - Vol.-99. - p.285-290.

171. Safdar N., Said A., Gangnon R.E., Maki D.G. Risk of hemolytic uremic syndrome after antibiotic treatment of Escherichia coli 0157:H7 enteritis: a meta-analysis // Jama. 2002. -Vol.-288. - p.996-1001.

172. Scherer W.F., Russell P.K., Rosen L., Casals J., Dickerman R.W. Experimental infection of chimpanzees with dengue viruses // Am J Trop Med Hyg. 1978. - Vol.-27. - p.590-599.

173. Schnittler H.J., Feldmann H. Viral hemorrhagic fever—a vascular disease? // Thromb Haemost. 2003. - Vol.-89. - p.967-972.

174. Serreze D.V., Leiter E.H., Worthen S.M., Shultz L.D. NOD marrow stem cells adoptively transfer diabetes to resistant (NOD x NON)Fl mice // Diabetes. 1988. - Vol.-37. - p.252-255.

175. Sher A., Coffman R.L. Regulation of immunity to parasites by T cells and T cell-derived cytokines //Annu. Rev. Immunol. 1992. - Vol.-lO. - p.385-409.

176. Shresta S., Sharar K.L., Prigozhin D.M., Beatty P.R., Harris E. Murine model for dengue virus-induced lethal disease with increased vascular permeability // J Virol. 2006. - Vol.80. - p.10208-10217.

177. Shu Q., Gill H.S. A dietary probiotic (Bifidobacterium lactis HN019) reduces the severity of Escherichia coli 0157:H7 infection in mice // Med Microbiol Immunol (Berl). 2001. -Vol.-189. -p.147-152.

178. Sittisombut N., Maneekarn N., Kanjanahaluethai A., Kasinrerk W., Viputtikul K., Supawadee J. Lack of augmenting effect of interferon-gamma on dengue virus multiplication in human peripheral blood monocytes // J Med Virol. 1995. - Vol.-45. -p.43-49.

179. Sumarmo, Talogo W., Asrin A., Isnuhandojo В., Sahudi A. Failure of hydrocortisone to affect outcome in dengue shock syndrome // Pediatrics. 1982. - Vol.-69. - p.45-49.

180. Suss J. Epidemiology and ecology of TBE relevant to the production of effective vaccines // Vaccine. 2003. - Vol.-21 Suppl 1. - p.19-35.

181. Szostak M.P., Hensel A., Eko F.O., Klein R., Auer Т., Mader H., Haslberger A., Bunka S., Wanner G.; Lubitz W. Bacterial ghosts: non-living candidate vaccines // J Biotechnol. -1996. Vol.-44. - p.161-170.

182. Tana, Watarai S., Isogai E., Oguma K. Induction of intestinal IgA and IgG antibodies preventing adhesion of verotoxin-producing Escherichia coli to Caco-2 cells by oral immunization with liposomes // Lett Appl Microbiol. 2003. - Vol.-36. - p. 135-139.

183. Tesh V.L. 1998. Cytokine response to Shiga toxin. In: Kaper J.B. and O'Brien A. (Eds), Escherichia coli 0157:H7 and other Shiga toxin-producing E.coli strains, ASM, Washington, pp. 226-235.

184. Torres A.G., Li Y., Tutt C.B., Xin L., Eaves-Pyles Т., Soong L. Outer membrane protein A of Escherichia coli 0157:H7 stimulates dendritic cell activation // Infect Immun. 2006. -Vol.-74. - p.2676-2685.

185. Tracey K.J., Beutler В., Lowry S., al. e. Shock and tissue injury induced by recombinant human cachectin // Science. 1986. - Vol.-234. - p.470-474.

186. Tracey K.J., Fong Y., Hesse D.G., al. e. Anti-cachectin/TNF monoclonal antibodies prevent septic shock during lethal bacteremia // Nature. 1987. - Vol.-330. - p.663-664.

187. Twiddy S.S., Farrar J.J., Vinh Chau N., Wills В., Gould E.A., Gritsun Т., Lloyd G., Holmes E.C. Phylogenetic relationships and differential selection pressures among genotypes of dengue-2 virus // Virology. 2002. - Vol.-298. - p.63-72.

188. Twiddy S.S., Holmes E.C., Rambaut A. Inferring the rate and time-scale of dengue virus evolution // Mol Biol Evol. 2003. - Vol.-20. - p. 122-129.

189. Volk Т., Кох W.J. Endothelium function in sepsis // Inflamm Res. 2000. - Vol.-49. -p, 185-198.

190. Waldvogel K., Bossart W., Huisman Т., Boltshauser E., Nadal D. Severe tick-borne encephalitis following passive immunization // Eur J Pediatr. 1996. - Vol.-155. - p.775-779.

191. Walterspiel J.N., Ashkenazi S., Morrow A.L., Cleary T.G. Effect of subinhibitory concentrations of antibiotics on extracellular Shiga-like toxin I // Infection. 1992. - Vol.-20.- p.25-29.

192. Watanabe H., Wada A., Inagaki Y., Itoh K., Tamura K. Outbreaks of enterohaemorrhagic Escherichia coli 0157:H7 infection by two different genotype strains in Japan, 1996 // Lancet. 1996. - Vol.-348. - p.831-832.

193. Whittam T.S., Wolfe M.L., Wachsmuth I.K., Orskov F., Orskov I., Wilson R.A. Clonal relationships among Escherichia coli strains that cause hemorrhagic colitis and infantile diarrhea//Infect Immun. 1993. - V0I.-6I. - p.1619-1629.

194. WHO, 1997. Dengue Haemorrhagic Fever: Diagnosis, Treatment, Prevention and Control.

195. WHO. New frontiers in the development of vaccines against enterotoxinogenic (ETEC) and enterohaemorrhagic (ЕНЕС) E. coli infections. Part II. Enterohaemorrhag(EHEC) E. coli vaccines. // Wkly. Epidemiol. Rec. 1999. - Vol.-74. - p. 105-111.

196. WHO. Dengue and dengue haemorrhagic fever. Fact sheet N.l 17. 2002.

197. WHO. Enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC). http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs 125/en/ 2005.

198. WycoffH.D. Assay of fibrinogen in small blood samples // Clin Chem. 1960. - Vol.-б. -p.429-433.

199. Xing Z., Gauldie J., Cox G., Baumann H., Jordana M., Lei X.F., Achong M.K. IL-6 is an antiinflammatory cytokine required for controlling local or systemic acute inflammatory responses // J Clin Invest. 1998. - Vol.-l01. - p.311-320.

200. Zivny J., DeFronzo M., Jarry W., Jameson J., Cruz J., Ennis F.A., Rothman A.L. Partial agonist effect influences the CTL response to a heterologous dengue virus serotype // J Immunol. 1999. - Vol.-163. - p.2754-2760.

Информация о работе

Букин, Евгений Константинович
кандидата медицинских наук
Кольцово, 2008
ВАК 03.00.06

Диссертация

Иммунологические показатели при экспериментальном моделировании генерализованных инфекций - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы