Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммунологическая реактивность при геморрагической лихорадке с почечным синдромом и разработка препаратов антител для этиотропной терапии

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Иммунологическая реактивность при геморрагической лихорадке с почечным синдромом и разработка препаратов антител для этиотропной терапии"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ХАБАРОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ

РГВ ол

На правах рукописи

ВЛАДИМИРОВА

ТАМАРА ПЕТРОВНА

ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ РЕАКТИВНОСТЬ ПРИ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКЕ С ПОЧЕЧНЫМ СИНДРОМОМ И РАЗРАБОТКА ПРЕПАРАТОВ АНТИТЕЛ ДЛЯ ЭТИОТРОПНОЙ ТЕРАПИИ

03.00.06 - вирусология

ДИССЕРТАЦИЯ

в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук

Хабаровск - 1997

Официальные оппоненты:

д.ы.н., чл.-корр. РАМН Злобин В.И.,

д.б.н. Локтев В.Б.,

д.ы.н., профессор Евстропов А.Н.

Ведущая организация - Владивостокский институт эпидемиологии и микробиологии СО РАМН

Защита состоится 2 октября 1997 г. в II00 на заседании диссертационного совета Д 074.20.01 в ГНИ вирусологии и биотехнологии "Вектор", Кольцово Новосибирской области.

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ вирусологии и биотехнологии "Вектор".

Диссертация в виде научного доклада разослана

Ученый секретарь диссертационного совета

Шубина Т.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) является одним из тяжелых природно-очаговых заболеваний вирусной этиологии. Очаги ГЛПС широко распространены на территории России и за рубежом. В России'заболевания ГЛПС зарегистрированы на территории 40 автономных республик, краев и областей (И.Н.Гавриловская, В.А. Бойко, 1985). Заболеваемость в целом по стране в течение 1987-1991 гг. колебалась от 1,9 до 5,6 на ЮОтыс.населения. Наивысшие показатели заболеваемости регистрируются- в районах Предуралья и Средней Волги от 15,7 до 73,9 на ЮОтыс. населения. На Дальнем Востоке эндемичными по ГЛПС являются Приморский край и южные районы Хабаровского края и Амурской области. За последние 5 лет заболеваемость ГЛПС по Хабаровскому краю составляет от 2,4 до 5,1 на 100 тыс. населения.

ГЛПС впервые клинически была описана в 1935г. в г.Хабаровске как вариант острого нефрита, протекающего с лихорадкой, геморрагическим синдромом, азотемией, протеинурией и другими изменениями в моче (В.А.Тарганская, 1935). В конце 30-х и в 40-х годах на территории юга Дальнего Востока приходило интенсивное изучение новой болезни. Отечественными специалистами была описана клиника, патологическая анатомия, в прямых наблюдениях на людях установлена вирусная природа возбудителя и связь заболевания с дикими мышевидными грызунами (А.В.Чурилов, 1940, 1941; .Л.И.Казбинцев, 1941; Г.М.Цыганков, 1941; (З.Г.Чудаков; Л.С.Лейбин, 1940; А.Г.Кестнер и А.И.Зеленский, 1943;

A.А.Смородинцев и др., 1944, 1963; Ш.И.Ранер, 1947, 1962; И.И.Рогозин, . 1952).

В последующие десятилетия ГЛПС как новая природно-очаговая инфекция широко изучалась в европейской территории страны и на Дальнем Востоке России в клиническом и патогенетическом аспектах, проводились экспериментальные исследования, были установлены некоторые закономерности эпидемиологии, достигнут значительный прогресс в клинической диагностике и патогенетическом лечении (М.П.Чумаков и др., 1956; А.Д.Лебедев, 1958; Т.А. Башкирев, 1958, 1963; С.Е.Шапиро с соавт. 1959; Ю.А.Мясников и др., 1960; Е.В.Лещинская, 1960; А.К.Янковский, 1960; Ш.И.Ратнер, 1962; А.А.Константинов, 1963;

B.И.Рощупкин, 1968,1970; Т.П.Владимирова, 1964; Л.А.Востриков, 1967; В.А.Фигурнов, 1967; А.И.Зеленский, 1969; Б.К.Гаврилюк, 1969; Г.С.Ковальский, 1970; И.С.Старостина, 1971; А.К.Пиотрович, 1973; Г.СЛобастова, 1977; З.В.Сиротина, 1980; Г.П.Сомов и Н.Н.Беседнова, 1981; Б.З.Сиротин и Г.СЛобастова, 1982 и другие).

Вместе с тем проблема ГЛПС в плане этиологии, специфической диагностики, иммунного реагирования, природной очаговости долгие годы оставалась нерешенной из-за трудностей изоляции и поддержания возбудителя в лабораторных условиях. Началом вирусологической эры ГЛПС послужило открытие в 1978г. корейскими исследователями Н.\Л/.1.ее и др. вируса ГЛПС в легочной ткани полевых мышей (Аройетиэ адганиэ) с помощью непрямого метода флуоресцирующих антител (НМФА). Был изолирован первый штамм вируса 76-118, получивший название Хантаан и зарегистрированный в Международном каталоге.

Использование НМФА и изоляция хантавируса открыли широкие перспективы не только специфической диагностики инфекции у больных, но и изучения эпидемиологического и эпизоотологического процесса, проведения вирусологических и иммунологических исследований.

Актуальность исследования иммуногенеза, оценка функционирования Т и В - систем иммунитета при ГЛПС, определяется ролью иммунного ответа в инфекционной патологии в свете современных представлений о защитной и повреждающей функциях иммунного реагирования (Б.Ф.Семенов, 1985). Вирусы вызывают неспецифическую модуляцию иммунного ответа и индуцируют изменения иммунокомпетентных клеток с развитием временного иммунодефицита (Б.Ф.Семенов с соавторами, 1982). Элементы иммунопатологии при вирусных инфекциях могут оказать существенное влияние на течение и исход заболевания. Полное восстановление иммунных механизмов, сбалансированность регулятор-ных функций, прекращение иммунопатологических реакций характеризует полноту выздоровления при вирусных болезнях.

Гуморальный иммунный ответ при ГЛПС был исследован в основном при серодиагностике этого заболевания, наиболее полно динамика серологических сдвигов была изучена по тесту НМФА при инфекции, индуцированной европейским вариантом возбудителя (М.Вгиттег-Коп/епсопйо и др. 1980; М.П.Чумаков и др., 1981; М.А.Захарова и др., 1981; Т.К.Дзагуроваи др., 1983; Б.А.Баранов и И.Н.Гавриловская, 1984; Г.А.Гасанова, 1985).

Динамика накопления антител у больных и длительность их сохранения у реконвалесцентов при инфекции, вызванной первым антигенным вариантом вируса ГЛПС была впервые описана НЖ1.ее и др.(1978) при корейской геморрагической лихорадке. Закономерности формирования гуморального иммунитета по данным НМФА у больных ГЛПС в Приморском крае выявлены Р.А.Слоновой с соавторами (1981, 1983, 1993), Г.И.Астаховой и др. (1986). Процесс антителообразования по данным НМФА у больных ГЛПС Хабаровского края начал изучаться нами с 1981. Для решения вопроса о роли гуморального иммунного ответа в патогенезе и выздоровлении при ГЛПС необходимы были также исследования

определяющие дифференциацию антител по классам М и б иммуноглобулинов в остром периоде, при реконвалесценции и в отдаленный период после заболевания, так как продолжительность виремической фазы инфекционного процесса зависит от интенсивности и полноценности гуморального иммунного реагирования.

Важная роль в патогенезе вирусных инфекций принадлежит иммунным комплексам, их элиминирующему или патологическому действию (Ю.В.Первиков, Л.Б.Эльберт,1984). Возможности повреждающего действия иммунных комплексов при ГЛПС обсуждались в работах В.И.Рощупкина (1974), Е.Локтеп и др. (1978), \/.СоИап и др. (1978), К.Пенттинен с соавторами (1978, 1981), И.Н.Гавриловской и др. (1980), Т.А.Башкирев и Ю.Г.Забусов'(1980), О.Уап (1981).

Учитывая, что формирование иммунных комплексов является обязательным компонентом нормального иммунного ответа, определяющим выздоровление, а повреждающее действие иммунных комплексов проявляется только при определенных условиях, следовало провести сопоставление динамики и длительности циркуляции их с другими факторами иммунного ответа и системой комплемента при ГЛПС. Особенно важным было провести мониторинг ЦИК для прогнозирования течения и исходов заболевания, так как установлена связь при инфекционном процессе между длительной персистенцией ЦИК и недостаточностью макрофа-гально-фагоцитирующей системы (С.К.Евтушенко и др. 1984; Т.В.Виноградова, 1988; Т.Г.Шемеровская, В.Г.Барашнов, 1988; Б.3.Сиротин, И.А.Шапиро, О.А.Конева, 1991).

Изучение клеточных показателей функционирования Т- и В- систем иммунитета при ГЛПС ограничено единичным и достаточно противоречивыми работами (Ф.С.Жарская и Т.Н.Спиридонова, 1979; Л.Н.Новомлин-цева, 1981, 1984; Р.М.Фазлуева и др. 1991; М.И.Петричко и др., 1991). Имеющиеся в литературе сведения о содержании в динамике основных классов иммуноглобулинов при ГЛПС также разноречивы (1_.1_аЬс1е71|1а, 1971; И.С.Старостина и др., 1978; Б.З.Сиротин и др., 1978; З.В.Сиротина, 1978; НЖ!.ее, 1982; Л.Н.Еланская, 1983).

Представлялось актуальным изучить иммуномодулирующиее действие возбудителя ГЛПС по количественным и функциональным характеристикам клеточных показателей иммунного ответа и определить значение Т и В клеточного иммунитета в иммунопатогенезе этой инфекции. Понимания глубины и продолжительности количественных расстройств иммунного реагирования, индуцированных вирусной инфекцией вооружает клинику знанием сущности не только процессов патогенеза, но и саногенеза.

Применение на этой основе препаратов для иммунотерапии и им-мунокоррекции может оказать положительное влияние на ускорение процессов выздоровления и реабилитации.

Попытки применения сыворотки реконвалесцентов как специфического средства для лечения ГЛПС предпринимались давно. Однако результаты были различны: от положительного терапевтического эффекта (С.Л.Глазунов, Е.В.Лещинская, А.М.Дубнякова,1957) до полного отсутствия его и даже наступления ухудшения (Э,А. Гальперин , 1960). Отсутствие унифицированного подхода к испытанию (различные сроки взятия крови у реконвалесцентов, разброс в днях и дозах введения сыворотки), а также малое число наблюдений не позволили сделать вывод об эффективности и целесообразности серотерапии. К началу наших разработок препаратов антител для лечения ГЛПС сведений об эффективности и оптимальных дозах, а также путях получения стандартных препаратов не имелось.

Цель и задачи исследования

Цель исследования:

Характеристика иммуногенеза при ГЛПС с установлением роли факторов иммунологической реактивности в патогенезе инфекции и показателей иммунопатологического процесса, а также разработка и испытание клинической эффективности иммунных препаратов.

Задачи исследования:

1. Установить основные закономерности иммунного реагирования с помощью количественных и.функциональных характеристик иммуноком-иетентных клеток Т и В - систем иммунитета.

2. Получить характеристику гуморального иммунного ответа, определить динамику, интенсивность и полноценность антителообразования в течение инфекции, реконвалесценции и в отдаленный период в сопоставлении с формами заболевания.

3. Исследовать процесс иммунного комплексообразования с учетом возможности повреждающего действия ЦИК.

4. Определить иммунопатологические показатели, имеющие патогенетическую и прогностическую значимость.

5. Изучить клинико-иммунологические особенности ГЛПС в Приамурье, установить связь клинически выраженных форм с серотипом хантавируса, выявить наличие антипичных, стертых форм инфекции, уровни латентного инфицирования на очаговых территориях.

6. Разработать и испытать клиническую эффективность иммунных препаратов: иммунной плазмы и иммуноглобулина направленного действия против ГЛПС.

Научная новизна и практическая значимость результатов работы

В результате проведенных исследований получена многоаспектная характеристика иммунологической реактивности, которая существенно расширяет представление о значении реакций иммунитета в патогенезе ГЛПС:

- Впервые показано, что инфекционный процесс при ГЛПС сопровождается развитием вторичного иммунодефицита, проявляющегося в поражении Т-системы иммунитета в форме снижения относительного и абсолютного числа Т-лимфоцитов, угнетения пролиферативной активности лимфоцитов, недостаточности хелперной активности и кратковременном проявлении эффекта гиперсупрессии. Т-дефицит выявляется на исех стадиях инфекции и формах тяжести заболевания.

- Хантавирусная инфекция приводит к активизации В-системы иммунитета, что регистрируется резким увеличением содержания В-лимфоцитов по относительным и абсолютным показателям во все периоды инфекции, а также фракции незрелых В-лимфоцитов. Нормализация содержания В-лимоцитов наступает в периоде клинического выздоровления только при легкой форме ГЛПС.

- Впервые изучены различные аспекты гуморального иммунного ответа при ГЛПС; установлены общие закономерности продуцирования неспецифических иммуноглобулинов, динамика накопления антител и специфических иммуноглобулинов.

- Впервые установлена неполноценность гуморального иммунного ответа у больных и переболевших ГЛПС, связанная с длительной продукцией 1д М антител и медленной выработкой высокоаффинных 1д в антител.

Длительный синтез !д М антител свидетельствует о затяжном характере инфекционного процесса вследствие вероятной продолжительной персистенции возбудителя.

- Выявлены общие закономерности формирования циркулирующих иммунных комплексов и нарушений в системе комплемента при ГЛПС. Установлена прямая взаимосвязь длительности циркуляции ИК и снижения гемолитической активности сыворотки крови больных с тяжестью клинического течения, что определяет вероятность патологической роли иммунного комплексообразования в утяжелении заболевания и затяжном инфекционном процессе.

- Впервые получены иммунологические показатели, имеющие важное значение для разработки критериев реабилитации, прогнозирования тяжести к длительности течения патологического процесса, а также отдаленных последствий ГЛПС. Прогностически неблагоприятными показателями следует считать длительную продукцию 1д М-антител, низкие уровни ЦИК в периодах ранней и поздней реконвалесценции (авторское свидетельство на изобретение "Способ прогнозирования хронической патологии почек у переболевших ГЛПС" 165544747 08.02.1991).

- Представлены результаты серологической диагностики, свидетельствующие об этиологической роли первого серотипа вируса ГЛПС в Приамурье. Получены данные о наличии атипичных и стертых форм, а также о величине и динамике иммунной прослойки среди здорового населения очаговой территории.

Полученные характеристики иммунопатогенеза ГЛПС впервые позволили научно обосновать необходимость применения лечебных препаратов антител.

Впервые разработан способ лечения больных ГЛПС путем введения специфической иммунной плазмы ГЛПС, защищен авторским свидетельством на изобретение N 1131508 от 1.09.84г.

Проведенные клинические испытания экспериментально-производственных серий препарата "Иммунная плазма против ГЛПС показали целесообразность и эффективность его применения в комплексном лечении больных.

- Получен новый препарат "Иммуноглобулин человеческий, жидкий против восточного антигенного варианта ГЛПС". Представлена нормативно-техническая документация (НТД), прошли государственный контроль экспериментально-производственные серии препарата. Завершены клинические испытания препарата в шифрованном опыте по программе, утвержденной Комитетом МИБП МЗ СССР 24.05.88, и разрешению от 9.12.88 N 01-07/473.

Материалы исследований включены в информационно-методические издания "Прогнозирование течения геморрагической лихорадки с почечным синдромом", Хабаровск, 1994, и "Показатели естественной резистентности и иммунитета у жителей Дальневосточного региона России", Хабаровск, 1994, которые используются как учебно-методические пособия для врачей и студентов медицинских институтов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В патогенезе ГЛПС важное значение имеет иммуномодулирую-щее действие возбудителя, которым индуцируются значительные де-

фекты иммунологической реактивности. Иммунологическая реабилитация отстает от клинического выздоровления.

2. Патогенетически значимыми являются глубокий и продолжительный количественный дефицит и функциональная недостаточность Т-лимфоцитов, нарушение соотношения Т и В- иммунокомпетентных клеток.

3. Противовирусный гуморальный иммунитет характеризуется увеличением содержания В-лимфоцитов, высокой продукцией иммуноглобулинов основных классов, интенсивным антителообразованием с долголетним сохранением антител.

4. Особую роль в патогенезе инфекции играет дефектность гуморального иммунного ответа, связанная с длительной персистенцией 1д М-антител и ингибицией синтеза высокоаффинных 1д в-антител.

5. Установлены закономерности формирования циркулирующих иммунных комплексов, связь продолжительности комплексообразующего процесса с тяжестью заболевания, прогностическое значение низких уровней ЦИК в развитии хронической патологии почек как последствий ГЛПС.

6. Ведущее значение в этиологии манифестных форм ГЛПС в Хабаровском крае принадлежит 1 серотипу хантавируса, выявлено наличие атипичных, стертых форм инфекции, а также бессимптомное инфицированное, приводящих к формированию естественного иммунитета у населения очаговой территории.

7. Разработаны препараты антител и показана их эффективность в комплексной терапии ГЛПС.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на XIV Тихоокеанском научном конгрессе (Хабаровск, 1979), сессии Сибирского филиала АМН СССР (Владивосток, 1979), Республиканской проблемной комиссией "Природно-очаговые заболевания" (Омск, 1980), IV пленуме союзной проблемной комиссии "Нефрология" (Тбилиси, 1987), Дальневосточной зональной научно-практической конференции "Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом" (Хабаровск, 1987), научно-практической конференции "Вопросы экологии и проблемы здоровья населения Забайкалья и КНДР (Чита, 1989). Международном симпозиуме по ГЛПС (Ленинград, 1991), на заседаниях Ученого совета и научных конференциях Хабаровского НИИЭМ, Владивостокского НИИЭМ СО РАМН, Хабаровского отделения Всероссийского научного общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (1983, 1985, 1988, 1989, 1990, 1994).

В завершенном виде диссертационная работа обсуждена на заседании отдела природно-очаговых инфекций Хабаровского НИИЭМ с участием кафедр инфекционных болезней, детских инфекций, факультетской терапии, Хабаровского государственного медицинского института. По теме диссертации опубликовано 65 работ, основные положения диссертации отражены в 35 работах.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для решения поставленных задач было обследовано в динамике инфекционного процесса 622 больных ГЛПС, 102 переболевших ГЛПС в сроки в течение года и до 10 лет и более, 92 больных со снятым диагнозом ГЛПС. Клинические испытания иммунных препаратов были проведены на 81 случае ГЛПС.

С помощью иммунологических и иммунологических и иммунобио-химических тестов было исследовано 2107 проб крови от больных, а также 557 контрольных проб от здоровых (доноры крови). Для изучения иммунной прослойки и сырьевой базы для производства иммуноглобулина против ГЛПС тестировано 12759 проб крови доноров, абортной и плацентарной крови из очаговых территорий Приамурья.

Для оценки иммунологической реактивности при ГЛПС были применены ряд иммунологических, серологических и иммунохимических тестов.

Клеточные показатели Т- и В- систем иммунитета в относительном и абсолютном выражении определяли с помощью тестов спонтанного розеткообразования (Е-РОК), по методу 1\/иопс)а1 е.а. (1972) и комплементарного розеткообразования (ЕАС-РОК) по методу В.Мепйеэ е.а.(1973) с подсчетом общего количества лейкоцитов и лимфоцитов в крови больных. Функциональное состояние Т-лимфоцитов характеризо-иали с помощью реакции бласт-трансформации (РБТ) с неспецифическим митогеном фитогемагглютинином (ФГА) по методу Ноге^ого (1964). Субпопуляции Т-лимфоцитов учитывались по тесту с теофиллином (Э.итаАЬи! е.а., 1978).

Гуморальный иммунитет исследовали непрямым методом флуоресцирующих антител (НМФА) с коммерческим культуральным антигеном вируса ГЛПС и антигенсодержащими криостатными срезами легких полевых мышей из очагов ГЛПС Хабаровского сельского района. Для сравнительного изучения с II серотипом использовали криостатные срезы инфицированных легких рыжих полевок (Удмуртия).

Дифференциацию антител по классам М и G иммуноглобулинов (Ig) проводили в иммуноферментном анализе Elisa с культуральным антигеном вируса Хантаан (прототипный штамм 76-118) с конъюгатами анти- Ig М и анти- IgG в тест-ситеме, разработанной в лаборатории аренавирус-ных инфекций института полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН. Количественное определение трех основных классов А, М, G осуществляли методом радиальной иммунодиффузии по G.Mancini и др. (1965).

Для выявления циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) был применен метод определения оптической плотности преципитата (ОД2во) при осаждении полиэтиленгликолем (ПЭГ) с М.М.6000 дальтон по критерию M.Digeon и др., (1977), а также по Ю.А.Гриневич и А.М.Алферову (1981). Определение уровней комплемента в сыворотке крови проводили по 50% гемолизу (С1 Н50) фотонолориметрически согласно методическим рекомендациям по применению унифицированных клинических лабораторных методов исследования (1973), а также по 100% гемолизу (Н.В.Гринбаум, Г.Б.Савельвольф, 1967).

Совместно с Хабаровской краевой станцией переливания крови (Ю.И.Яковлев) приготовлено 102 серии препарата "Имунная плазма против ГЛПС" на основе типового регламента производства сухой плазмы, утвержденному МЗ СССР 5.02.72 и "Инструкции на заготовку нативной плазмы" от 9.12.88 МЗ СССР.

Совместно с Хабаровским предприятием бактерийных препаратов (директор - А.С.Песков) по производственной технологии (спиртовое осаждение по Кону, вариант В) было приготовлено 8 экспериментально-производственных серий иммуноглобулина против ГЛПС.

Клинические испытания иммунных препаратов проводились в клиниках инфекционных болезней Хабаровского (зав. кафедрой проф. Г.С.Ковальский) и Благовещенского (завкафедрой проф. В.И.Фигурнов) медицинских институтов.

Клиническая разработка материала осуществлялась при участии асс. кафедры инфекционных болезней Хабаровского мединститута канд. мед. наук Т.В.Ковальской.

Раздел работы по иммунологическому прогнозированию развития хронической почечной патологии у переболевших ГЛПС выполнен совместно с кафедрой факультетской терапии Хабаровского мединститута (зав.каф. проф. Б.З.Сиротин, кандидаты мед. наук И.А.Шапиро, О.А.Конева).

Частично исследования проведены на базе института полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН (доктор мед.наук И.Н.Гавриловская; доктор мед. наук Е.А.Ткаченко, ст. научн. сотр. А.П.Иванов).

Статистическая обработка результатов исследования проведена методом вариационного анализа с вычислением средних показателей и средней ошибки, часть результатов обработана на ПЭВМ типа 1ВМ РС с использованием программы 51а1дга^

Диссертационная работа выполнена в рамках научно-исследовательских тем Хабаровского НИИ эпидемиологии и микробиологии (Гос.рег. №№76079498;77065032;01.870082049.

2. КЛЕТОЧНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ Т- В- СИСТЕМ ИММУНИТЕТА ПРИ ГЛПС.

Современная классификация ГЛПС по тяжести течения выделяет очень тяжелые, тяжелые, средне-тяжелые и легкие формы заболевания (С.Е.Шапиро и Г.С.Ковальский, 1968); А.И.Зеленский, Г.С.Ковальский, А.А.Константинов и др., 1979).

В клиническом течении ГЛПС различают 4 периода - лихорадочный, период ранней апирексии или олигоанурический, период ранней реконвалесценции или полиурический, период поздней реконвалесценции.

Каждый из периодов течения заболевания характеризуется определенными клиническими проявлениями и продолжительностью. Продолжительность периодов зависит от тяжести инфекционного процесса.

При тяжелой и среднетяжелой форме первые два периода лихорадочный и олигоанурический, которые мы условно обозначили как "острый период" продолжается от 6 до 18 дней и характеризуется такими тяжелыми проявлениями как геморрагический и почечный синдромы с развитием острой почечной недостаточности. В этот период могут возникнуть грозные осложнения: азотемическая уремия, отек легких, эклампсия, тяжелый менинго-энцефалит и другие.

При легких формах ГЛПС острый период значительно укорачивается до 4-8 дней, проявления олигоанурии нерезко выражены и быстро наступает полиурия. Основным клиническим признаком, знаменующим начало ранней реконвалесценции является нарастание диуреза, переходящее затем в полиурию при постепенном улучшении общего состояния и нормализации показателей мочи и крови. Этот период начинается в среднем на 11,35 ± 0,77 день болезни при тяжелых формах на 10,06 ± 0,44 день при формах средней тяжести и на 6,91 ± 0,63 день при легкой форме.

Выздоровление (поздняя реконвалесценция) начинается у тяжелых больных на 4-ой неделе от начала заболевания (23,15 ±1,3 день), у (Зольных средней тяжести в конце 3-й недели (20,1 ± 0,64 день) и в легких случаях через две недели от начала заболевания 14,08 ± 1,02.

В соответствии с клиническими периодами проводились динамические исследования иммунокомпетентных клеток периферической крови.

За основу нормы были взяты показатели Т и В - лимфоцитов контрольных групп - доноров крови. Контрольные наблюдения проводились дважды в 1983 и 1990 гг. в осенне-зимний сезон соответственно сезону ГЛПС (табл.1).

Таблица 1.

Нормоиммунограмма доноров г.Хабаровска в осенне-зимний периоды 1983,1990 гг.

Год исследования Число наблюдений Е-РОК % (х 109/л) ЕАС-РОК (Х10э/л)

1983 36 62,88+0,94 1,41±0,06 21,710,9 0,49±0,03

1990 35 57,9±1,1 1,15±0,06 19,8±0,98 0,42±0,04

Обобщенный контрольный показатель 70 60,8±1,01 1,28±0,06 20,7±0,94 0,45±0,02

Полученные показатели соответствуют нормоиммунограмме населения страны по данным иммунологического мониторинга больших групп людей и согласуются с данными ВОЗ (Р.В.Петров, Р.М.Хаитов, И.В.Орадовская, 1992), которые представлены следующими параметрами: Т-лимфоциты (Е-РОЛ) 61,5 ± 0,07 %; В-лимфоциты (ЕАС-РОЛ) -13,7±0,16%. Они также соотносятся с нормативными показателями иммунного статуса населения Сибири и крайнего Севера по разработке института клинической иммунологии СОАМН (1990): Е-РОК - 64,5%, ЕАС-РОК -19,2 %.

В остром периоде болезни у 55,5 % больных ГЛПС с тяжелыми и среднетяжелыми формами наблюдается лейкоцитоз. Особенно высок лейкоцитоз при тяжелом течении, достигая 25,5 - 51,0 х 109/л, в среднем 16,35±2,49 х 109/л. Обычно лейкоцитоз сочетается с нейтрофиллезом в ряде случаев с резким сдвигом формулы влево с увеличением палочко-ядерных, появлением юных и нередко миелоцитов и промиелоцитов.

Для всех форм тяжести ГЛПС в остром периоде характерна относительная лимфоцитопения (табл.2). Однако существенное снижение удельного веса лимфоцитов не приводит к уменьшению их абсолютного содержания вследствие лейкоцитоза. Содержание лимфоцитов в крови прями коррелирует с содержанием лейкоцитов (коэффициент корреляции 0,54 ±0,15). Тяжелая форма ГЛПС, характеризуется более продолжи

Таблица 2

ПОКАЗАТЕЛИ Т-КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА ПРИ ГЛПС ПО ФОРМАМ ТЯЖЕСТИ И ПЕРИОДАМ КЛИНИЧЕСКОГО ТЕЧЕНИЯ

ПЕРИОДЫ Лейкоциты Лимфоциты Е-РОК ФОРМА

(х109/л) % (Х10э/Л) % (Х10э/л)

ОСТРЫЙ ПЕРИОД М± ш п р 16,35 2.49 23 <0,001 19, 47 1,91 23 <0, 05 3,14 0, 57 23 43,78 3,29 23 <0, 001 1,44 0,39 23 Т Я Ж Е Л А Я Ф 0 Р м А

РАННЯЯ РЕКОН-ВАЛЕС-ЦЕНЦИЯ М± ш п Р 8.07 0.81 33 25,30 1,53 33 <0,001 1,91 0,15 33 <0,05 48,66 2, 04 33 <0,001 0,93 0,09 33 <0, 01

ПОЗДНЯЯ РЕКОН-ВАЛЕС-ЦЕНЦИЯ М± т п Р 6,93 0,28 24 26,8 1,4 24 <0,01 1.84 0,18 24 <0.05 50,41 1,84 24 <0,001 0,89 0, 07 24 <0,001

ОСТРЫЙ ПЕРИОД М± ш п р 10,6 1,07 23 <0. 01 22,76 3, 0 23 <0, 01 2,41 0,35 23 42,6 3,6 23 <0,001 0,94 0, 12 23 <0,05 С Р Е Д Н Е И Т Я Ж Е С Т И

РАНЯЯ РЕКОН-ВАЛЕС-ЦЕНЦИЯ М± и п р 10,22 2,36 21 21,57 2,52 21 <0, 001 2,10 0,44 21 47,6 3,0 21 <0,001 0,96 0,13 21 <0,05

ПОЗДНЯЯ РЕКОН-ВАЛЕС-ЦЕНЦИЯ М± ГН п р 6,94 0,53 20 28,8 1,7 20 1, 98 0, 17 20 49,8 1,4 20 <0,001 0,97 0,08 20 <0,01

ОСТРЫЙ ПЕРИОД М± ш п Р 8,9 1,8 17 25,70 2,05 17 <0,01 2.3 0,4 17 41,70 3,29 17 <0. 001 0,89 0.11 17 <0.01 Л Е Г К А Я Ф 0 р м А

РАНЯЯ РЕКОН-ВАЛЕС-ЦЕНЦИЯ М± ш п Р 8,5 1,7 18 28,1 4,4 18 2.16 0,32 18 42,37 2.37 18 <0,001 0.91 0.15 18 <0,05

ПОЗДНЯЯ РЕКОВА-ЛЕСЦЕН-ЦИЯ И± т п Р 6,24 0,72 15 30,0 5,14 15 2.04 0.32 15 51.40 2.94 15 <0,01 1,05 0, 16 15

Контроль (доноры) М± ш п 7,15 0,2 70 31, 55 0,69 70 2,27 0,09 70 60,80 1,01 70 1,28 0,06 70

тельной относительной лимфоцитопенией, регистрируемой и в периодах ранней и поздней реконвалесценции (р< 0,001; р<0,01), а также снижением абсолютного содержания лимфоцитов в эти периоды (р<0,05, р<0,05). При среднетяжелом течении относительная лимфоцитопения наблюдается в периоде ранней реконвалесценции с восстановлением нормального уровня при выздоровлении. При легкой форме нормализация процентного содержания лимфоцитов происходит уже в периоде ранней реконвалесценции.

При анализе иммунологического статуса больных ГЛПС обнаружен иммунодефицит Т-лимфоцитов (Е-РОК) в относительных и абсолютных показателях при всех формах и почти все периоды клинического течения с достоверностью по сравнению с контрольным показателем от р< 0,05 до р<0,001. Исключение составляет острый период при тяжелой форме, где при значительном почти полуторакратном относительном снижении Т-лимфоцитов, их абсолютное число находится на уровне нормы. Это явление объясняется достаточным балансом иммунокомпетентных Т-лимфоцитов на фоне высокого лейкоцитоза и резко повышенного абсолютного содержания лимфоцитов от 3,53 до 12,69 х 109 /л у 26% больных ГЛПС с тяжелой формой. Выявлена высокая прямая зависимость между содержанием лимфоцитов и'Е-РОК (коэффициент корреляции 0,77+0,17). Нормализация абсолютного содержания Е-РОК наступает только при легких формах в периоде выздоровления.

Отчетливо прослеживается подавляющее влияние инфекции на способность Т-лимфоцитов периферической крови претерпевать морфологическую трансформацию и пролиферацию в ответ на митогенный стимул. (Табл.3). В течение острого периода в 1,5 раза уменьшается число клеток, трансформированных в бласты при культивировании лимфоцитов с ФГА ( р<0,001 ). Функциональная активность Т-лимфоцитов остается угнетенной и в полиурическом периоде и в периоде поздней реконвалесценции ( р< 0,001; р<0,05), хотя при выздоровлении функции Т-системы имеет выраженную тенденцию возвращения на нормальный уровень.

Дефективность Т-клеточного иммунитета при ГЛПС проявляется также в некотором дисбалансе иммунорегуляторных Т-лимфоцитов. Проведенное исследование хелперной и супрессорной активности Е-РОК с помощью теофиллинового теста (рис.1) показали, что в периоде ранней реконвалесценции определяется достоверная относительная и абсолютная недостаточность теофиллинрезистентных розеткообразующих клеток (ТФР-РОК), несущих хелперную активность - 28,4 ±1,92 % и 0,56 ± 0,09 х 109 /л при соответствующих показателях у доноров 41,05 ± 1,8 % и 0,84 ± 0,06 х 109 /л. Этот дефицит Т- хелперной активности сохраняется и при выздоровлении. - ТФР- РОК 28,6 ±2,35% и 0,40 ± 0,06 х 109/л.

Теофиллинчувствительная (ТФЧ-РОК) субпопуляция Т-лимфоцитов (супрессорная активность) в остром периоде и в периоде выздоровления находится на уровне контрольного показателя (17,5 %), достоверно повышаясь (р<0,025) по относительному показателю 24,3 ± 2,9 % по сравнению с нормой 16,85 ± 1,21 % в периоде ранней реконвалесценции.

Таблица 3.

Показатели бластной трансформации лимфоцитов под действием фитогемагглютинина у больных ГЛПС и здоровых лиц (М± т %)

Период болезни Острый период Ранняя реконвален-сценция Поздняя рековален-сиенция

Тяжесть течения БТЛ/ФГА БТЛ спонт. БТЛ/ФГА БТЛ спонт. БТЛ/ФГА БТЛ спонт.

Тяжелое 41,6±2,9 р<0,001 3,4+0,42 55,7±3,4 р<0,01 3,6±0,62 60,1±3,3 р<0,05 3,9±0,58

Средней тяжести 45,1 ±3,5 р<0,001 5,1 ±0,27 55,5+1,1 р<0,01 6,6±1,44 56,6±3,5 р<0,05 3,4±0,75

Легкое 44,6+2,3 р<0,001 3,8±1,2 54,0±2,9 р<0,01 2,5±0,6 58,6±1,36 р<0,05 4,6±0,9

Здоровые 68,4+2,07 3,4+0,009

Уменьшение хелперной активности T- лимфоцитов в сочетании с нормальной и несколько повышенной в стадии ранней реконвалесценции супрессорной активностью свидетельствует о хелперной недостаточности и преобладании супрессорного эффекта иммунного реагирования в ходе инфекционного прогресса ГЛПС. Явление гиперсупрессии, выраженное в периоде ранней реконвалесценции можно рассматривать с точки зрения негативной регуляции, приводящей к дефектам синтеза иммуноглобулинов в частности к супрессии продукции поликлональных lg G (Б.Ф.Семенов, Д.Р.Каулен, И.Г.Баландин, 1982).

Однако выраженного дефицита динамического равновесия в балансе иммунорегуляторных T- лимфоцитов при ГЛПС не выявлено, об этом говорят и средние величины иммунорегуляторного индекса (I - 3,25 ± 0,4; II - 2,07 ± 0,47; III - 2,83 ± 0,83).

Рис.1. Соотношение иммунорегуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов при ГЛПС по клиническим периодам

Инфекционный процесс при ГЛПС сопровождается резко выраженной стимуляцией В- системы иммунитета. Уже в остром периоде относительное и абсолютное количество ЕАС-РОК возрастает в 1,5 - 2 раза; причем в одинаковой мере при всех формах тяжести. Такое активированное состояние В- системы сохраняется и в последующие периоды клинического течения до выздоровления. Фракция незрелых В- лимфоцитов (М - РОК) также во все периоды клинического течения оставалась повышенной примерно в два раза по сравнению с нормальным показателем (рис. 2).

EAC-PO

'A^/ M-POK

период 1 период 2 период 3

доноры

Рис.2. Показатели В-клеточного иммунитета по периодам клинического течения ГЛПС.

Доказано, что для развития полноценного гуморального иммунного ответа необходим высокий уровень соотношения Т и В- лимфоцитов. Анализ данных числа Т и В -лимфоцитов у больных ГЛПС показывает выраженную недостаточность их соотношения. В остром периоде ГЛПС отношение E-РОК: ЕАС - РОК составляет 1,0 ± 0,05, в периоде ранней рековаленсценции -1,33 ± 0,05, в периоде выздоровления 1,48 ± 0,05 при контрольном показателе у доноров 3,09 ± 0,16. Выявленное нарушение не может не влиять на процесс Т-В кооперации и как следствие на формирование полноценного гуморального иммунного ответа. Известно, что определяющим фактором результативной Т-В кооперации является оптимальное соотношение Т-лимфоцитов к В - лимфоцитам составляющее 1,5 - 2,5 Т- клетки на одну В -клетку ( Р.В.Петров, 1976 ). E.Deia Concha е.а. ( 1977 ) считают оптимальным соотношение 80:20. Именно от ре-

зультативности Т-В кооперации зависит выработка высокоаффинных IgG - антител. Очевидно с этих позиций можно объяснить значительный дефект в продукции IgG - антител при ГЛПС, что будет показано в следующем разделе.

Таким образом проведенные исследования иммунного реагирования при ГЛПС на уровне иммунокомпетентных клеток показали, что возбудителем индуцируются значительные дефекты иммунологической реактивности. Инфекционный процесс сопровождается относительной лимфоцитопенией. Имеет место глубокий и продолжительный дефицит Т- лимфоцитов, не восстанавливающийся и в период клинического выздоровления при тяжелых и среднетяжелых формах ГЛПС. Помимо количественных нарушений Т- системы резко угнетена пролифиративная активность Т - лимфоцитов, их способность трансформироваться в блас-ты под влияние митогенного стимула. Обращает на себя внимание и недостаточность Т - лимфоцитов с хелперной активностью и преобладание супрессорного влияния на второй стадии инфекционного процесса. Lewis R.M. е.а. (1991) также обнаружили увеличение Т - супрессоров в процессе инфекции ГЛПС, показав зависимость продолжительности и тяжести заболевания от повышения содержания лейкоцитов и супрессорных клеток.

Усиление супрессорной активности может быть связано с достаточно долгим воспроизведением возбудителя в организме, когда ограничение иммунного ответа становится необходимым. Нами установлено (Т.Д.Елисова с соавторами, 1994), что при ГЛПС длительное время в периоде клинического выздоровления выявляется антиген возбудителя с помощью НМФА в эпителиальных клетках осадка мочи и с помощью ИФА в пробах мочи после обработки ПЭГом М.М.6000 с использованием тест-системы "Хантагност". При этом в поздние сроки на 4-6 неделе болезни антиген хантавируса обнаруживается у больных с тяжелой и среднетя-желой формой более, чем в 50% случаев. Эти данные свидетельствуют о длительной элиминации антигена возбудителя с мочой и подтверждают продолжительную персистенцию вируса ГЛПС в организме больного особенно при тяжелых и среднетяжелых формах.

Установленное угнетающее действие возбудителя ГЛПС на Т - систему иммунитета может быть обусловлено механизмом прямой виру-синдуцированной иммуномодуляции. Как показало Yao-Zhi-Qiang е.а. (1989) хантавирус обнаруживается в мононуклеарах у больных на 4-7 дни болезни. Gu - Xian -shi с соавт.(1990) с помощью техники моноклональ-ных антител регистрировали вирусный антиген в острой фазе инфекции ГЛПС в 87,3 - 95,7% образцов Т и В - лимфоцитов, что может говорить о репликации хантавируса в этих клетках.

Инфекционный процесс сопровождается резкой стимуляцией В -системы иммунитета и при угнетении Т - системы по количественным и функциональным показателям развивается недостаточный уровень соотношения Т В - клеток, который приближается к нормальному только в периоде выздоровления. При этом несомненно страдает результативность Т В кооперации, а следовательно выработка высокоаффинных антител класса в (Р.В.Петров, 1976). Ниже будет показано, что для ГЛПС характерно выраженное искажение гуморального иммунного ответа, когда имеет место длительное и массивное продуцирование 1д М - антител и резкое подавление продукции 1д в - антител особенно при тяжелых формах. Механизмом дисфункции гуморального иммунного ответа может быть также высокая концентрация вирусного антигена. И.Н.Гавриловская (1988) определила, что иммунные комплексы при ГЛПС формируются в условиях избытка антигена в соотношении антиген: антитело - 7:4; 7:5; 7:6. Такое соотношение сохраняется до 21-30 дня заболевания. гЬапд Т1ап тюд е.а. (1993) отметили наличие связи между высокой концентрацией вируса в крови больных и тяжестью течения ГЛПС. При высокой концентрации вирусного антигена (избыточная антигенемия) стимулируются В - лимфоциты - предшественники плазматических клеток, продуцирующие антитела с низким аффинитетом (Ю.В.Первиков, Л.Б.Эльберт, 1984).

Нельзя исключать также непосредственное вирусное поражение В -лимфоцитов, с которым может быть связано торможение смены синтеза с 1д М на 1д в - антитела.

3. ГУМОРАЛЬНЫЕ ФАКТОРЫ ИММУННОГО ОТВЕТА ПРИ ГЛПС

3.1. Неспецифические и специфические иммуноглобулины

Увеличение числа В - лимфоцитов сопровождается с первых дней заболевания повышением синтеза сывороточных иммуноглобулинов (1д) основных классов А, М, в уровни которых достоверно превышает контрольные показатели (рис.3).

На первой неделе заболевания наиболее интенсивно продуцируется иммуноглобулин М, содержание которого более чем в 2 раза превышает концентрацию его доноров. Достоверно по сравнению с контролем, хотя и менее показательно нарастают и иммуноглобулины в и А.

На второй неделе содержание иммуноглобулина М еще более увеличивается и достигает пика при тяжелых и средне-тяжелых формах: (4,2

|д гл

|д б

|д А

Суоки обследования в днях

'-*- ТЯЖЕЛАЯ ФОРМА СРЕДНЕЙ ТЯЖЕСТИ Г.ЕГКАЯ еОРМА -»-КОНТРОЛЬ

Рис. 3 Концентрация иммуноглобулинов основных классов в динамике при различных формах ГЛПС. 21

- 3,6 г/л соответственно), что почти в 3 раза выше контрольного показателя.

На третьей неделе болезни в полиурическом периоде происходит резкое увеличение иммуноглобулина в (в 1,5 раза по сравнению с контролем), увеличивается также содержание иммуноглобулина А, при этом уровень иммуноглобулина М продолжает оставаться довольно высоким (средние показатели 3,9 - 3,5 г/л). Статистически достоверного различия в величине средних показателей Iд М на протяжении трех недель заболевания не отмечено. Высокая продукция всех иммуноглобулинов сохраняется и в периоде выздоровления на 4-5 неделях, при этом нормализации содержания иммуноглобулинов к моменту выписки больных из клиники не отмечено ни при одной форме болезни.

Для тяжелых и среднетяжелых форм ГЛПС характерна повышенная секреция всех иммуноглобулинов. При тяжелой и среднетяжелой формах ГЛПС содержание 1д М в отдельных случаях достигает 9,5 - 8 г/л соответственно, а максимальные значения при легкой форме не превышают уровня 3,5 - 4,0 г/л. При тяжёлых и среднетяжелых формах концентрация 1д 0> на 3-ей неделе заболевания достоверно превышает его содержание в остром периоде, секреция его при легкой форме идет менее активно.

Наши данные по динамике иммуноглобулинов основных классов расходятся с результатами НЖЬее (1982), установившим быстрое снижение содержания 1д М до исходных показателей после острого периода болезни и появление после этого 1д С и 1д А, пик 1д в отмечен им на 2 неделе заболевания. Л.Н. Еланская (1983) при изучении динамики иммуноглобулинов у больных западным вариантом ГЛПС отметила снижение 1д М в полиурическом периоде, однако нормализация этого показателя наблюдалась ею позже 120 дня от начала заболевания.

Известно, что нейтрализация вирусов в организме в значительной мере определяется свойствами антител, такими как комплементарность к антигенным детерминантам и принадлежность к определенным классам иммуноглобулинов. Специфические иммуноглобулины разных классов обладают различной противовирусной активностью, что и определяет их роль в иммунной инактивации возбудителя.

Для решения вопроса о роли гуморального иммунного ответа в патогенезе и выздоровлении при ГЛПС необходимы были исследования, определяющие дифференциацию антител по классам М и С - иммуноглобулинов в остром периоде и при реконвалесценции.

1д М - антитела при ГЛПС появляются в самые ранние сроки, зафиксированы на второй день болезни. Частота обнаружения на первой неделе заболевания достигает 80% (рис.4), средняя геометрическая величина титра (СГТ) 9,8 ±1,3 1од2. На 3-4 неделях болезни частота реги-

страции антител этого класса снижается до 83,8%, несколько уменьшается и концентрация - СП" 10,7 ± 1,9 1од2.

Характерной особенностью ГЛПС является длительная персистен-ция 1д М - антител в отдаленные сроки до 4 месяцев более, чем у половины (53%) обследованных больных со СП" 6,2 ± 0,9 1од2 по совокупности всех форм. Тяжелые формы ГЛПС чаще (83,3%) реагируют длительным (до 6 мес.) синтезом 1д М - антител с более высокой концентрацией СП" 10,2 ± 1,2 1од2 . У отдельных переболевших антитела этого класса обнаруживались через 1 год после перенесенной инфекции с титром до 10 1од2.

Антитела класса в на первой неделе (рис.4) заболевания обнаруживаются лишь в 26,7% случаев в очень низких концентрациях СП" 3,3 ± 0,7!од2 , на 2-й неделе частота выявления 1д в - антител увеличивается до 54,4 %, в 2 раза увеличивается и их содержание 6,5 ± 0,75 1од2. С 3-й

СРОКИ НАБЛЮДЕНИЯ

О1д М-антитела ■ 1д в-антитела

Рис.4. Частота обнаружения 1е М и С-антител к Хантавирусу у больных ГЛПС в динамике.

недели до 1 мес. отмечается интенсивная продукция lg G -антител, концентрация их нарастает до 9,65 ± 1,0 log2. Однако lg G - антитела регистрируются только у 73,5% выздоравливающих. В течение года после перенесенного заболевания лишь у 80% лиц обнаружены lg G - антитела, в том числе с полным переключением синтеза lg М—► lg G в 48,6% случаев. У 20% переболевших в сроки от 1,5 до 3 месяцев продолжалась продукция только lg М - антител в высоких концентрациях 11-14 log2. Эти данные говорят о медленной выработке высокоаффинных lg G - антител при ГЛПС и могут косвенно свидетельствовать о продолжающейся пер-систенции возбудителя и затяжном инфекционном процессе.

Через 2-4 года (срок наблюдения) у переболевших регистрировались только lg G -антитела, СП" -12,8 ± 0,6 log2.

Отличительной особенностью иммунологических нарушений при ГЛПС является выраженное искажение гуморального иммунного ответа при тяжелых формах. Эти формы дают достоверно более интенсивный и длительный синтез lg М - антител с одной стороны и выраженную инги-бицию селекции lg G -антител на протяжении первых двух недель болезни с другой.

Последнее подтверждается показателями частоты обнаружения и СГТ lg G -антител в остром периоде, которые обратно коррелируют с тяжестью течения. Так при тяжелой форме в первую-вторую недели заболевания lg G -антитела выявляются в 17,4 - 36,4% случаев, при средне-тяжелой в 40-52,1 %, при легкой 16,7 - 75%. Концентрация антител этого класса при тяжелой форме также отстает: 2,05 - 3,55 log2 ,при среднетя-желой форме соответственно 4,7 - 6,65 log2, и легкой - 3,5 - 9,3 log2.

Таким образом, нами впервые показано, что при ГЛПС более, чем у половины больных имеет место длительная персистенция lg М - антител, у отдельных больных - до года. У части переболевших в эти сроки не происходит переключения синтеза lg М-* lg G, что является прогностически неблагоприятным признаком и свидетельствует о продолжающейся персистенции вируса вероятно за счет нестабильных иммунных комплексов, формирующихся чаще при соединении с lg М - антителами. J .Shivers, O.Daniels (1979), C.Mims (1979), B.Mandel (1984) установлено, что антитела, принадлежащие к )g М классу при взаимодействии с вирусами чаще формируют непрочные иммунные комплексы с остаточной инфекционностью, что может иметь отягчающее значение в патогенезе и исходах острой вирусной инфекции в результате слабой незавершенной нейтрализации вирусного агента. Подтверждением этого феномена являются экспериментальные исследования O.Tanishita е.а. (1986), по пер-систирующей хантавирусной инфекции у молодых крыс, связанной с длительной продукцией lg М - антител, не дающих полноценной гуморальной иммунной защиты.

3.2. Циркулирующие иммунные комплексы и показатели уровней комплемента в крови больных

Выявлены общие закономерности циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в зависимости от тяжести патологического процесса.

Определение циркулирующих ИК по показателю ОЦ2еош * 0,125 согласно критерию Дигона показало, что при тяжелом течении ГЛПС в остром периоде 53 ± 5,4% сывороток содержат ИК, в полиурическом периоде в 75 ± 4,8% констатируется наличие ИК и две трети сывороток (75 ± 6,5%) сохраняют их в периоде поздней реконвалесценции до месяца и более. При среднетяжелом течении циркулирующие ИК появляются закономерно позже: в остром периоде только 26 ± 3,3% сывороток больных дают показатель ОДгзо™ г 0,125 и в 35 ± 5,2% сывороток ИК сохраняются в периоде выздоровления. При легкой форме наблюдается аналогичная картина - острый период 25 ± 6,2%, полиурический - 57 ± 4,2 % и в периоде выздоровления 33 ± 5,5% сывороток реагируют положительно.

Таким образом, для тяжелой формы ГЛПС наиболее характерным является раннее появление и длительная циркуляция ИК до месяца и более, т.е. в периоде клинического выздоровления. При среднетяжелой форме ЦИК регистрируются в основном в полиурическом периоде и отсутствуют у большинства больных в острой фазе болезни и в периоде поздней реконвалесценции. Для легкой формы ГЛПС характерна та же закономерность, но в полиурическом периоде ЦИК обнаруживается только у половины больных, что говорит о кратковременности циркуляции ИК, а следовательно о более короткой фазе репродукции вируса. При обследовании части больных ГЛПС в динамике было обращено внимание на отсутствие ЦИК в полиурическом периоде, а также в периоде поздней реконвалесценции в 28,5% случаев, в связи с тем, что именно в эти сроки на 2-4 неделе от начала заболевания при наиболее интенсивном антите-лообразовании должно происходить массивное удаление ИК из мест репродукции вируса. Прямое участие хантавируса в поражении почечной ткани доказано электронно-микроскопическим методом с применением иммуно-коллоидного золота Ханг-Тао (1991), обнаружившего хантави-русные вирионы и электронно-плотные преципитаты комплекса антиген-антитело на базальных мембранах почечных канальцев. Нами также (В.А.Деменев и др., 1993) методом электронной микроскопии в почечном биоптате больного ГЛПС в периоде олигурии были выявлены зрелые вирионы 108 ± 5 нм и морфогенетические признаки острого вирусного поражения клеток, что может свидетельствовать с репликации вируса ГЛПС в почечной ткани.

Отсутствие ЦИК (нерегистрируемое превышение показателя ОДгэонм ^ 0,125) в периоде ранней и поздней реконвалесценции у части

больных ГЛПС может говорить о сдерживании их удаления из очагов поражения, в том числе с поверхности инфицированных почечных клеток. Одним из факторов, способствующих проявлению патологического действия ИК является синтез низкоаффинных антител (Ю.В.Первиков, А.Б.Эльберт, 1984), что имеет место при ГЛПС в условиях длительного и массивного продуцирования 1д М - антител и ингибации синтеза 1д в - антител. Комплементарность к антигену молекул 1д М - антител значительно ниже, чем у 1д в - антител и первые, обладая низкой авидностью, чаще формируют нестабильные ИК с остаточной инфекционностью. Диссоциация нестабильных ИК приводит к дополнительному инфицированию чувствительных клеток и к дополнительной антигенной стимуляции им-мунокомпетентных клеток, что может явиться причиной длительно текущего патологического процесса с развитием морфологических и функциональных повреждений почек..

Б.З.Сиротиным и Г.С.Лобастовой (1978, 1980) показано, что у лиц, перенесших ГЛПС примерно в 20-22% случаев развивается хроническая почечная патология, которую в силу особенностей ее формирования, как правило, обнаруживают в отдаленные после перенесенного заболевания сроки (от одного года до четырех-пяти лет) путем углубленного обследования переболевших ГЛПС с помощью комплекса клинических и лабораторных методов исследования, в том числе детального исследования функций почек, ультрасонографии, радиоизотопной ренографии, экскреторной урографии. Наиболее частое последствие ГЛПС - латентный одно- или двусторонний хронический пиелонефрит, развивающийся в среднем у 16% переболевших ГЛПС. Кроме того, у небольшого числа переболевших (до 6% случаев) отмечается формирование интерстициально-го нефрита или нефрофиброза.

До настоящего времени единственным способом прогнозирования исходов ГЛПС, в том числе развития хронической патологии почек у переболевших является тяжесть течения болезни. Комплексообразующий процесс при ГЛПС как прогностический признак был изучен нами при обследовании 78 больных с 16 по 30 дни болезни с помощью определения количественных показателей ЦИК по Ю.А.Гриневичу и А.И.Алферову (1981). Было установлено, что в этот период (вторая половина ранней реконвалесценции и поздняя рековалесценция) количественные показатели ЦИК колеблются в пределах от 30 до 450 ед/100 мл, при контрольном показателе у здоровых 50,72 ± 1,48 ед/100мл, 16 пациентов (20,5%) имели в период выздоровления низкие уровни ЦИК от 30 до 110 ед. и были выделены в группу риска в отношении неблагоприятного прогноза в плане формирования хронической патологии почек.

В дальнейшем в различные сроки (через 1-3 года) в клинике факультетской терапии ХГМИ было проведено углубленное обследование

этих 16 перенесших ГЛПС и 10 переболевших, у которых на основании показателей ЦИК был сделан прогноз о полном выздоровлении и восстановлении функции почек.

Обследование больных включало изучение жалоб и анамнеза, общие анализы мочи и крови, бактериологический анализ мочи, пробы по Нечипоренко и Зимницкому; экскреторную урографию, радиоизотопную ренографию, ультрасонографию почек, определение фильтрационно-реабсорбционной и осморегулирующей функций почек, функции почек в регуляции кислотно-основного состояния. Большая часть переболевших (80,8%) обследована в сроки от 1 до 3 лет после перенесенной ГЛПС, 5 человек (19,2%) - в течение первого года после ГЛПС.

В результате проведенного углубленного комплексного обследования установлено, что из 16 переболевших ГЛПС, выделенных ранее в группу риска, у 14 (88%) выявлена хроническая патология почек, у 2 (12%) функции почек не были нарушены. Из 10 переболевших ГЛПС, у которых ранее был сделан благоприятный прогноз (полное выздоровление функций почек), у 9(90%) патологии почек при углубленном обследовании не выявлено, у 1(10%) отмечено незначительное снижение концентрационной способности почек, однако и у этого больного убедительных данных в пользу формирования латентного хронического пиелонефрита не получено.

Таким образом было установлено, что показатели ЦИК в пределах 30-110 единиц в сроки с 16 по 30 дни болезни (периоды ранней и поздней реконвалесценции) можно считать прогностически неблагоприятными (рис.5), и с большой вероятностью (88%) прогнозировать формирование хронической патологии почек у переболевших (авт. свид 1654747 08.02.1991).

Для ГЛПС характерно существенное снижение уровня комплемента по показателю СН'50 у большинства ГЛПС в остром периоде болезни.Так, в лихорадочном и олигоанурическом периоде при тяжелой и среднетя-желой форме уровни комплемента были ниже нормы (40 условных единиц) в 83 ± 4,6% сывороток. Частота снижения показателя СН'5о У доноров 12 ± 1,2%. В периоде ранней реконвалесценции (полиурия) 43 ± 5,6% сывороток больных с тяжелым и среднетяжелым течением ГЛПС имели пониженный уровень комплемента. Стой же частотой снижение гемолитической активности сыворотки сохранялось у тяжелых больных в периоде выздоровления. При среднетяжелых формах ГЛПС нормальный уровень комплемента при выздоровлении восстанавливался чаще, только одна треть сывороток имела пониженный показатель СНи- Легкая форма ГЛПС по показателю СН'5о не отличалась от среднетяжелой. Было отмечено, что у части больных (8%), обследованных в динамике, содер-

жание комплемента на всем протяжении болезни находилось на нормальном уровне.

Метод определения уровня комплемента по 100% гемолизу является менее чувствительным, однако и он выявил отчетливое снижение содержания комплемента в остром периоде при тяжелых и среднетяжелых формах в 40 ± 3,7 % сывороток больных ГЛПС по сравнению с 18 ± 2,7% в контрольных пробах. На протяжении последующих периодов клинического течения уровень комплемента у этих больных был средним (31-50 условных единиц). При легких формах на всем протяжении болезни отмечался средний уровень комплемента.

15 20 „ 25

ДНИ БОЛЕЗНИ

-в- БП1 -о БП2 -®-НП1 НП2 ВГПЗ НГПЗ

Рис. 5. Динамика ДИК у больных ГЛПС при благоприятном (БП1. БП2) и неблагоприятном (НП1. НП2) прогнозе формирования хронической патологии почек. ВГПЗ - верхняя граница прогностических значений: НГПЗ - нижняя граница прогностических значений.

Обнаруженные в системе комплемнта при ГЛПС изменения нельзя объяснить только действием ИК, так как совпадающие значения СН'5о < 40ед. и ОД28о2 0,125 обнаружены в 30% исследованных проб преимущественно при тяжелом и среднетяжелом течении ГЛПС. В 44% случаев содержание комплемента было понижено при нерегистрируемых иммунных комплексах, следовательно при ГЛПС, по-видимому, имеют место иные механизмы повреждения системы комплемента без участия ИК.

Результаты проведенных исследований позволяют говорить о том, что при ГЛПС иммунное комплексообразование выполняет в основном протективную функцию, однако нельзя исключить его патологическую роль в утяжелении и длительности инфекционного процесса и возможном повреждающем действии, формирующем у части больных хроническую патологию почек. О последнем говорят продолжительная перси-стенция ИК при тяжелых формах, прогностически неблагоприятные (низкие) показатели ЦИК в разгар иммунной элиминации возбудителя, затяжное продуцирование 1д М антител с ингибицией синтеза 1д в антител, низкая гемолитическая активность сыворотки, уменьшающая эффект иммуноинактивации.

Таким образом, впервые при ГЛПС были определены иммунологические показатели, которые можно оценивать как прогностически неблагоприятные в отношении полноты выздоровления: длительная продукция 1д М антител, низкие уровни ЦИК в период ранней и поздней ре-конвалесценции.

3.3. Клинико-иммунологическая характеристика ГЛПС

Клиническая характеристика ГЛПС в Дальневосточном регионе отличается превалированием тяжелых и среднетяжелых форм инфекции. В период наблюдений в разные годы тяжелые и среднетяжелые формы составляли от 76 до 85 %. Суммарно на долю тяжелых и среднетяжелых форм приходилось 81,8 % случаев, в том числе тяжелые-33,6 %, средней тяжести-48,2 %, легкие-18,2 %.

По числу случаев и тяжести ГЛПС в районах Дальнего Востока отличается от заболеваемости в европейских очагах, где в качестве источника инфекции доминирует рыжая полевка, в этих районах заболеваемость выше, а по клиническому проявлению преобладают средне -тяжелые и легкие формы до 80 - 90 % (Е. В. Лещинская и др., 1990). Летальность как показатель тяжести составляет в европейских очагах 1-3%, достигая в дальневосточных очагах в отдельные годы 8-10 %.

Специфическая серологическая диагностика ГЛПС и исследование процесса антителообразования в НМФА осуществлялась нами с 1981 г. на основе двух антигенных препаратов: 1) на антигенсодержащих

криостатных срезах легких полевых мышей; 2) на препаратах тканевой культуры-культуральный антиген вируса Хантаан (шт. 76 -118,1 серотип). В период наблюдения обследовано в динамике 208 больных с клиническим диагнозом ГЛПС и 92 случая с предварительным диагнозом ГЛПС, но с другими окончательными диагнозами.

При использовании в НМФА антигенсодержащих срезов легких полевых мышей выявлено: флуоресцирующие антитела регистрируются со второго дня болезни, на первой неделе серопозитивы 88,3+3,6 % проб, СП" составляет 5,99±0,6 1одг, к 14 дню частота обнаружения достигает 94,6 %, концентрация антител возрастает в среднем на 2,6 1одг- В последующем с 15 дня сероконверсия определяется в 97,5+5,1 %, а при тяжелых формах в 100 %, концентрация антител увеличивается и выходит на плато, составляя 9,9±0,7; 10,5+0,65 1одг на 3,4 - 5 неделях соответственно.

Динамика антителообразования у больных ГЛПС Дальневосточного региона по отношению к второму серотипу возбудителя ГЛПС (серотип Clethrionomys) была исследована с помощью антигенсодержащих криостатных срезов легких инфицированных рыжих полевок (Удмуртия), Табл. 4.

Таблица 4.

Уровни антител у больных ГЛПС по отношению к гомологичному (1 серотип Арос1ети8) и гетерологичному антигену вируса (2 серотип С1еШпопотув)

Антигенные варианты Хан-тавируса Среднегеометрическая величина титра антител ( 1092)

Сроки заболевания

1 неделя 2 неделя | 3 неделя 4 неделя 5 неделя

Антигенсодер-жащие срезы легких полевых мышей (Арос1ети8) 5,99 ч 8,6 9,9 10,3 10,6

Антигенсодер-жащие срезы легких рыжих полевок (□еШпопотуэ) 0,6 1,7 4,8 7,8 7,0

Показано, что гуморальный иммунный ответ у больных к 2 серотипу значительно запаздывает и происходит по прошествии двух недель от начала заболевания, напряженность нарастает медленно, уровни антител на третьей неделе на 5,1 log2 ниже уровня антител к гомологичному варианту и к месяцу титры антител с гетерологичным антигеном остаются пониженными. Эти данные свидетельствуют о том, что манифестная инфекция ГЛПС Приамурья этиологически обусловлена в основном первым серотипом Хантавируса (Apodemus) и антигены из штаммов второго серотипа менее пригодны для диагностических целей на востоке страны. Использование культура л ьного диагностикума для определения антител в НМФА показало также высокую чувствительность метода. Доля серо-позитивных больных на первой неделе болезни составляет 67,0 ± 5,7%, СГТ- 5,4 ± 0,8 log2 На второй неделе сероконверсия регистрируется в 85,7±5,0% случаев, с этого периода уровень антител повышается до 7,6+1.3 log2 и выходит на плато. В периоде выздоровления с третьей недели до месяца сероконверсия достигает 87,2 ± 5,3%. Пик антителообра-зования отмечается на 3-4 неделях, причем у 85 % выздоравливающих регистрируются высокие уровни антител 11-13 log2 (1:2560-1:10240). Кратность нарастания титра антител к этому периоду от 4 до 1024 раз.

Вместе с тем у 40 % больных не выявлено диагностического нарастания титра антител или имеет место падение титра на 1-2 log2, у 6,7% больных происходит "угасание" антителообразования - вторая проба отрицательна. Оптимальными сроками забора крови для специфической диагностики в НМФА следует считать день поступления в стационар (чаще первая неделя болезни), затем через 10 -14 дней.

Тест-система непрямого Elisa с референс - штаммом 76-118 хантавируса, разработанная в институте полиомелита и вирусных энцефалитов РАМН в лаборатории аренавирусных инфекций, при испытании показала более высокую степень чувствительности, Антитела обнаруживаются на второй день болезни, сероконверсия на первой неделе 80%, на второй неделе - 91,4%. Преимущество метода в ранней диагностике по одной пробе сыворотки.

Установлено, что имеет место клиническая гиподиагностика ГЛПС, связанная с атипичным течением инфекции, у 20% больных с клинически снятым диагнозом ГЛПС и с такими окончательными диагнозами, как "нефротический синдром", "кишечная колика", "острая дизентерия" и др. Серологически диагностируется ГЛПС : Ig М - антитела обнаруживаются в титрах 13-16 log2, флуоресцирующие антитела с диагностическим нарастанием.

Серодиагностика ГЛПС по данным Elisa и НМФА выявила наибольшую результативность теста Elisa на Ig М-антитела, однако в настоящее время использование этого метода даже в специализированных

лабораториях затруднено в связи с отсутствием коммерческих тест-систем.

Наши результаты согласуются с данными Т. К. Дзагуровой и др. (1983), показавшими, что совпадение клинического и серологического диагноза ГЛПС в европейских областях страны вариируют от 44,4% до 100%, а среди больных с другими клиническими диагнозами серологически ГЛПС подтверждается в 5,2-33,3 % случаев. Р. А. Слонова (1993) показала, что четырех-восьми кратное нарастание титра специфических антител в НМФА выявлено только у 45,8% обследованных больных Приморского края в сроки - первая неделя заболевания и через 2-3 недели (вторая проба), что также соответствует нашим данным.

Отмечен более активный процесс продукции НМФА антител у больных с тяжелой формой по сравнению с легкой. Это достоверно проявляется в начальном периоде инфекционного процесса: на первой неделе болезни доля серопозитивных тяжелых больных 79,2 ± 8,3%, среднетя-желых-82,6 ±7,9%, при легкой форме- 46,2 ±13,8% (р<0,05, р<0,05). Тенденции к преобладанию более высоких титров антител с возрастанием тяжести болезни нами не выявлено. Антитела к вирусу ГЛПС сохраняются у 95% перенесших инфекцию в течении многих лет (срок наблюдения 10 лет и более) на уровне 6-71од2 (табл.5).

Таблица 5.

Средняя геометрическая титра антител к вирусу Хантаан у переболевших ГЛПС

Переболевшие Число проб Количество положительных СГТ 1од2± т

6 мес. -1 год 24 24 7,32 ± 0,36

до 2 лет 24 23 7,28 ± 0,46

3 года 26 25 6,96 ± 0,37

4 года 9 8 6,45 ± 0,41

5-10 лет 13 11 7,05 ±0,68

свыше 10 лет 6 5 6,52 ± 0,94

102 96 6,93 ± 0,94

Общепризнано, что при ГЛПС имеют место не только легкие, стертые и атипичные формы, но и бессимптомное течение инфекции, приво-

дящее к формированию естественного иммунитета среди здорового населения нозоареала. Иммунная прослойка в очагах ГЛПС составляет 2,12 % в Еврейской АО, 3,42 % в районе им. Лазо, 1,79 % в Вяземском районе, 1,93 % в Амурской области. Динамичное помесячное исследование в течение 3-х лет (1988 - 1990) проб донорской крови из Еврейской АО свидетельствует о наиболее стабильной, хотя и невысокой доли иммунных лиц. Показатели колебались от 6,3 ± 0,97 % до 0,8 ± 0,41 %. Обобщенные помесячные показатели иммунной прослойки представлены на рис. 6. Как видно, наиболее низкие показатели характерны для весенне-летних месяцев (апрель-май), включая июнь (1,44 ± 0,34 % -1,65 ± 0,27 %), с августа месяца идет достоверное повышение (р<0,05) латентного инфицирования, достигая максимального 3,58 ± 0,51 % в октябре, и оставаясь на том же уровне 2,48 ± 0,44 % - 2,74 ±0,37 % в зимние месяцы ноябрь-февраль, включая март. Динамика величины иммунной прослойки отражает эпизоотический процесс в очагах и сезонность заболеваемости ГЛПС.

Наши данные сопоставимы с величиной иммунной прослойки в Южной Корее (H.w. Lee 1982), где в эндемичных районах она составляет 3,8 %, в районах соседних с эндемичными - 2,7 %.

В Европейской части страны (ТкасИепко Е.А.., 1982) антитела у здоровых лиц обнаруживаются в среднем в 5,3 % с большим разбросом от 18 % в Башкирии до 1,5% во Владимирской области.

4. РАЗРАБОТКА И ИСПЫТАНИЕ ИММУННЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ ГЛПС

Иммунная плазма против ГЛПС

Как было показано, при ГЛПС имеет место длительное и массивное продуцирование 1д М-антител, у 53 % обследованных больных антитела этого класса продуцируются до 4-х месяцев после переболевания, Тяжелые формы ГЛПС характеризуются более выраженным нарушением синтеза специфических иммуноглобулинов. 1д М - антитела синтезируется при этой форме в 83,3% до полугода. Полное переключение синтеза 1д М на 1д в в течение года после болезни происходит только в 48,6 %. Общепризнанно, что иммуноглобулины класса М обладают низким аффинитетом, неспособны эффективно нейтрализовать вирусный патоген, образуя диссоциирующие иммунные комплексы, сохраняющие остаточную ин-фекционность.

И.Н. Гавриловская (1988) определила формирование иммунных комплексов при ГЛПС в условиях избытка антигена, в том числе в позднем периоде до 21-30 дня заболевания.

Полученные нами данные (Т.Д. Елисова с соав., 1994) о длительной элиминации антигенов вируса ГЛПС с мочой больных до 32-47 дня болезни (срок наблюдения) косвенно подтверждают продолжительное воспроизведение возбудителя в организме, особенно при тяжелых и сред-нетяжелых формах инфекции.

Указанные характеристики иммунопатогенеза ГЛПС: длительная циркуляция низкоаффинных антител в условиях достаточно активной длительной и избыточной антигенемии являются несомненным обоснованием для применения лечебных препаратов антител. Совместно с группой авторов (Л.А. Берета, Ю.И.Яковлев, Г.М. Воронкова) был разработан способ лечения больных ГЛПС путем введения специфической иммунной плазмы переболевших ГЛПС, защищенный авторским свидетельством на изобретение № 1131508 от 1.09.84, регламент производства препарата "Плазма крови человека для лечения геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС), сухая" был разработан на основе типового регламента производства сухой плазмы. Сырьем для приготовления препарата служила плазма крови людей, переболевших

ГЛПС, взятая не ранее, чем через 6 месяцев после перенесенной инфекции и содержащая антитела к вирусу ГЛПС.

Отбор доноров производился на основе титрования сыворотки крови в НМФА с поливалентным культуральным диагностикумом ГЛПС производства института полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН.

Обследование доноров проводилось в соответствии с "Инструкцией о медицинском освидетельствовании доноров крови", утвержденной МЗ СССР 17.10.78. Длительное сохранение антител к вирусу у переболевших ГЛПС позволяет привлекать к донорству практически всех переболевших, не имеющих медицинских противопоказаний. Возможно также формирование постоянной группы доноров на основе неоднократной кроводачи. Вместе с тем, как показали наши наблюдения, частые крово-дачи в ряде случаев приводят к падению антител или даже к исчезновению НМФА-антител. Однако у большинства испытуемых доноров титры антител к вирусу ГЛПС сохранялись на неизменном уровне в течении 3-6 лет наблюдения иногда возрастая от года после болезни к 3-6 годам от 1:80 до 1:640 - 1:1280.

Характеристика препарата "Иммунная плазма против ГЛПС" включает следующие параметры: препарат выпускается в сухом виде во флаконах емкостью 250 мл объемом 100 мл препарата для внутривенного введения, содержит в себе консерванты "Глюгицир" (ВФС 42-10 64-80) или "Цитроглюкофосфат" (ВФС 42-1137-81) и глюкозу 5 %.

Каждая серия представляет собой одну партию флаконов, высушенных одновременно, до 30 флаконов в серии. В каждом флаконе находится плазма крови от одного донора, проходящая перед сушкой обязательный контроль на НВ3 - антиген, ВИЧ - антитела и стерильность. После сушки проводится выборочный контроль стерильности, растворимости, остаточной влажности и специфической активности. Специфическая активность в НМФА в приготовленных сериях была 1:80 - 1:1024. В процессе сушки титры антител не изменились. При хранении в течении 15 лет сухой плазмы титры антител были, как правило стабильными. Всего было выпущено 102 серии препарата. Программа испытания экспериментально-производственных серий препарата была утверждена Комитетом вакцин и сывороток 08.12.81 № 702.

Согласно программе на больных ГЛПС с тяжелой формой испыты-вались реактогенность, безвредность, специфическая активность препарата. Иммунную плазму получил 31 больной ГЛПС, нормальную плазму -контрольная группа, -состоящая из 21 больного. Были также проанализированы исторт болезни 29 больных ГЛПС, леченных симптоматическими средствами и не получавших иммунной и нормальной плазмы.

Первое переливание иммунной плазмы в дозе 50 или 100 мл в 61,2% случаев проводили на 5-8 дни болезни, что зависело от поступле-

ния большей части больных в указанные сроки. Второе введение плазмы осуществлялось на следующий день или через день в той же дозе. Части больным одномоментно вводилась вся доза до 200 мл препарата. Лечение всех испытуемых больных было компклесным и апробированным клиникой: преднизолон, пенициллин, гемодез, солевые растворы и др.

Оценка лечебной эффективности препарата в соответствии с программой испытания проводилась по клиническим и лабораторным показателям. Наиболее показательным признаком лечебного эффекта иммунной плазмы оказалось сокращение сроков самого тяжелого олигоану-рического периода болезни и более раннее увеличение диуреза и наступления полиурии - начала периода ранней реконвалесценции. Отсчет этих сроков проводился со дня введения иммунной плазмы. У больных, получавших иммунную плазму диурез увеличивался в среднем в течение суток. Полиурия как признак разрешения патологического процесса в почках при лечении иммунной плазмой наступала на 2,1 день после введения препарата, а в группе лиц, получавших нормальную плазму - только через 4,2 дня от начала лечения. Наилучший лечебный эффект наблюдался у 10 больных, леченных иммунной плазмой и дезинтоксикаци-онным средством - гемодезом, средний срок наступления полиурии 1,3 дня, а у получивших только гемодез - через 3 дня. Позднее на 5,0 день появлялась полиурия у больных, леченных симптоматическими средствами. (Табл. 6). У 19 больных из 31 (61,3 %), получавших иммунную плазму, полиурия наступила в первые 2 дня после введения, у леченных нормальной плазмой в эти сроки полиурия наступила у 19 % больных, а в 57 % (12 случаев из 21) на 3-6 день болезни.

Таблица 6.

Сроки наступления полиурии у больных ГЛПС в зависимости от применяемого лечения

Форма болезни Иммунная плазма Иммунная плазма и гемодез Нормали ная плазма Гемодез Симптоматическое лечение

1* 2* 1 2 1 2 1 2 1 2

Тяжелая 23 2,2 6 1,4 21 4,2 11 3,0 13 4,8

Средне-тяжелая 8 2,0 4 1,2 - - 10 3,0 16 5,2

Всего 31 2,1 10 1,3 21 4,2 21 3,0 29 5,0

[

Примечание : '1- количество больных

2- срок наступления полиурии (в днях от начала лечения)

Несомненное значение для получения клинического эффекта имеет наиболее ранее начатое специфическое лечение. Так у больных, получавших препарат на 3 - 5 сутки болезни, наступление полиурии отмечалось в 1-е сутки в 100 % случаев, введение на 6 - 9 сутки заболевания разрешало патологический процесс только у 26,6 %. Однако даже позднее введение препарата на 10 - 13 дни болезни у 25 % больных вызывало наступление полиурии в течение первых суток.

Сравнительный анализ течения болезни в группах леченных иммунной и нормальной плазмой указывает также на более быстрое появление других признаков улучшения общего самочувствия больных при лечении препаратом антител против ГЛПС, что выражалось в прекращении рвоты, появлении аппетита, нормализации сна и т. д. На следующий день после введения специфического препарата нормализовалась температура (г=0,96). Отмечено более быстрое снижение уровня мочевины в крови по сравнению с контрольной группой (в среднем на 18,9 день против 25,3 соответственно).

С целью оценки влияния активности иммунной плазмы на сроки наступления полиурии проведены расчеты условной нейтрализующей дозы (обратная величина титра антител х суточную дозу в мл). Из табл. 7 видно, что эффект достигается при введении 8000 - 16000 условных нейтрализующих доз. При применении 16000 условных нейтрализующих доз препарата больным П-ву (4-й день болезни), Ж-вой Г.А. (6-ой день болезни) полиурия наступила в первые сутки от начала лечения. Когда больные получали препарат 2000 условных нейтрализующих доз даже в ранние сроки болезни 3-5 дни лечебный эффект не проявлялся.

У группы больных, получавших иммунную плазму были изучены белковые показатели крови в динамике. Исследовали концентрацию иммуноглобулинов С, М и А классов. Контрольной служила группа больных, не получавших специфическую терапию. Наиболее демонстративно влияние иммунной плазмы прослеживается на динамике содержания 1д в и особенно 1д М. У больных ГЛПС, леченных иммунной плазмой, на третьей - в начале четвёртой недели наступает нормализация содержания 1д в в крови - 11,38 г /л -12,37 г /л. Особенно важное значение имела динамика 1д М, поскольку длительная и массивная продукция 1д М - антител при ГЛПС несомненно является отягощающим фактором иммуно-патогенеза и не способствует быстрой элиминации возбудителя из организма больного. У больных ГЛПС отмечается резкое повышение в 2-3 раза 1д в в первые 2-е недели заболевания. К исходу четвёртой недели

при клиническом выздоровлении уровни 1д М по-прежнему превышают не менее чем в 2 раза нормальный показатель.

У получивших иммунную плазму больных ГЛПС на первой - второй неделе болезни также отмечается увеличение содержания 1д М в 2 раза по сравнению с контролем, однако уже на 3-ей неделе уровень 1д М приближается к норме 1,54 г/л и на 4-ой неделе от начала заболевания практически нормализуется 1,42 г/л. Эти данные свидетельствуют в пользу позитивной роли введённых антител, с помощью которых происходит разрыв замкнутого круга патологических иммунных реакций. Введённые антитела связывают избыток свободно циркулирующего антигена, освобождающегося из постоянно диссоциирующих непрочных иммунных комплексов с 1д М антителами.

Таблица7.

Влияние активности препарата иммунная плазма на сроки наступления полиурии у больных ГЛПС

Имунная плазма Больной День введения препарата (заболевания) Доза введения в мл. Кол-во условных нейтрализующих доз. День наступления полиурии

Титр антител

1:640 П-да В.В. 9 200 128000 1

1:160 П-ов A.B. 4 100 16000 1

1:160 Г-ов А.П. 13 10 0 16000 1

1:80 Ж-ва Г.А. 6 200 16000 1

1:80 Г-в А.П. 11 100 8000 2

1:10 С-в Н.И. 5 200 2000 8

1:10 М-ва Л.Я. 3 200 2000 10

1:10 Б-ин Н.И. 12 100 1000 Переведен на

гемодиализ

Применение иммунной плазмы наряду с другими лечебными средствами в комплексном лечении больных ГЛСП целесообразно и эффективно, т.к. позволяет в более короткие сроки добиться значительного улучшения самочувствия больных, приблизить наступление периода ранней реконвалесценции, а следовательно и выздоровления. С точки зрения восстановления нарушенных иммунологических показателей, в частности прекращения циркуляции патогенных иммунных комплексов, по-видимому способствует прекращению персистенций возбудителя в организме и окончательному выздоровлению.

4.2. Разработка препарата иммуноглобулина против

ГЛПС

При разработке препарата иммуноглобулина крови человека для лечения ГЛПС жидкого одним из основных вопросов был вопрос о сырьевых возможностях для промышленного выпуска препарата для Дальневосточного региона.

Одним из источников сырья для производственного выпуска иммуноглобулина так же как для выпуска иммунной плазмы являются переболевшие ГЛПС, которые могут быть привлечены в качестве постоянных доноров.

ГЛПС относится к числу заболеваний с тяжёлой патологией почек и дающих до 22,5 % осложнений в форме хронического пиелонефрита после перенесения тяжёлой формы, а также наблюдаются такие последствия как нефрогенная гипертония, реже - хронический интерстициаль-ный нефрит.

Указанное в значительной мере ограничивает привлечение переболевших ГЛПС к донорству с получением от них сыворотки крови для производства и иммунной плазмы и иммуноглобина.

Однако большим преимуществом использования такого сырья для иммунных препаратов являются высокий уровень антител после перебо-левания, сохраняющийся практически пожизненно (раздел 3.3).

Антитела к вирусу ГЛПС имеются в крови не только переболевших, но и здорового населения эндемичных районов от 1,79 % до 3,42 %.

В период разработки препарата была организована система сбора сырья через СПК Еврейской автономной области (ЕАО) и отделения Хабаровской краевой СПК. Из 17226 проб доноров крови из ЕАО положительными оказались 378 проб - 2,12±0,11 %. По годам и месяцам иммунная прослойка давала значительные колебания в пределах статистической достоверности от 6,3 +0,97 % до 0,8 ±0,41 %. Наблюдения, проведённые в ЕАО, свидетельствуют о возможности планомерного ежеме-

сячного отбора донорских проб, содержащих антитела для создания сырьевой базы производства иммуноглобулина против ГЛПС.

По производственной технологии (спиртовое осаждение по Кону, вариант В ) было приготовлено 8 экспериментально-производственных серий иммуноглобулина против ГЛПС.

6 серий (табл.8) прошли контроль в ОБК Хабаровского предприятия по производству бакпрепаратов.

Все экспериментально-производственные серии были стерильны, апирогенны, не токсичны, электрофоретически однородны (фракция иммуноглобулинов составляла не менее 97% общего белка). По данным иммуноэлектрофореза серии содержали преимущество Ig G с небольшим количеством Ig М и Ig А и примесей. Молекулярные параметры серий соответствовали требованиям нормативно-технической документации (НТД) - содержание мономеров и димеров составляло более 85% и колебалось в пределах от 86,6 до 91,82 % мономеров и 13,4 - 7,5 % димеров, РН серий был от 6,9 до 7,2, содержания белка в пределах от 9,10% до 11,22%.

5 были направлены в ГИСК им. Л.А.Тарасевича за исключением серии I (из-за небольшого количества). По заключению ГИСКа по физическим свойствам термостабильности, апирогенности, степени очистки и титру антител серии соответствовали требованиям НТД. Серия 8 была разрешена как препарат сравнения из-за невысокого уровня антител.

Особый интерес представляло изучение серий ИГ, полученного из сырья, собранного в Дальневосточном регионе, с помощью реакции нейтрализации на культуре ткани Vero - Е6 с прототипными штаммами хан-тавируса I и II серотипов. Проверены 3 серии (№ 2,3,5) с титром антител в НМФА 1: 256, 1: 640, 1: 256 соответственно. Серии препарата обладали нейтрализующим действием в отношении I серотипа хантавируса в титрах от I : 32 до 1: 256, не имея нейтрализинов ко II "клетриономус-ному" серотипу вируса.

Эти данные обосновывают необходимость приготовления препарата ИГ из крови доноров и переболевших Дальневосточного региона, в связи с тем, что манифестная инфекция ГЛПС на востоке страны, как показано нами (раздел 3.3 ) и Р.А.Слоновой ( 1993) этиологически в основном связана с I серотипом хантавируса, И.Н.Гавриловской ( 1988 ) также была определена однонаправленность "западного" препарата ИГ: титр нейтрализующих антител ко П серотипу составлял I : 417, а к I серотипу I : 52. Таким образом "неперекрываемость" препаратов делает очевидным целесообразность выпуска самостоятельных препаратов ИГ против восточного и западного антигенных вариантов вируса ГЛПС.

Таблица 8.

Характеристика экспериментально-производственных серий ИГ для лечения ГЛПС

№№ Объём Выход РН Содер- Сырьё для Титр Титр

серии плазмы ИГ (л) жание приготовления НМФА- НМФА-

ИГ в за- белка серии антител антител

грузке % в сырье в пре-

(л) парате

1 2,7 0,03 7,09 9,16 Донорские сы- 1:8- 1:128

воротки 1:32

2 4,8 0,1 6,97 9,10 Плазма крови 1:256

переболевших

80%

Донорские сы- 1:8- 1:256

воротки 20% 1:32

3 7,8 0,17 7,2 9,47 Плазма крови 1:256 1:640

переболевших

70%

Донорские сы- 1:8-

воротки 30% 1:16

4 11,7 0,3 6,9 9,58 Донорские сы- 1:20 1:320

воротки

5 14,0 0,5 7,1 11,22 Донорские сы- 1:8 - 1:256

воротки 1:16

6 13,5 0,15 7,05 10,9 Донорские сы- 1:16 1:64

воротки

Клинические испытания препарата "Иммуноглобина против геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС) человеческого жидкого" были проведены на основании разрешения комитета вакцин и сывороток (КВС) 9.12.88 по Программе, утверждённой 24.05.88 г.. Для изучения клинической эффективности ГИСК' ом им. Л.А.Тарасевича были зашифрованы 4 серии препарата параллельно с 3 сериями иммуноглобулина нормального. Шифрованные испытания осуществляли по 2-м схемам: I - на курс лечения 24 мл препарата в течение двух дней по 6 мл

с интервалом 10-12 часов; 2 - на курс лечения 12 мл препарата в течение двух дней по 4 мл в первый день 2 раза, на второй день по 2 мл, 2 раза с тем же интервалом. Введение иммуноглобулина начинали в первые 4-11 дней болезни. Ограниченные государственные испытания прошли на 29 больных ГЛПС : 24 мужчины и 5 женщин. Возраст: 16-25 лет - 9 человек ; 26-40 лет -13 человек; 41-55 лет - 6 человек, старше -1 больной. В группу испытуемых вошли преимущественно больные со среднетяжёлым течением (18 человек) и тяжёлым течением (7 человек). У 4 больных ГЛПС протекала в лёгкой форме.

Оценку состояния проводили по следующим клиническим критериям: исчезновение геморрагического синдрома, улучшение самочувствия (прекращение тошноты, рвоты, головной боли, головокружения, появления аппетита), сроки наступления полиурии (суточный диурез 2000 мл/сутки ), длительность пребывания в стационаре.

При дешифровании результатов клинического испытания оказалось, что ИГ против ГЛПС получили 14 больных, нормальный ИГ - 15 больных ГЛПС. Распределение больных по тяжести течения в опытной и контрольной группе было примерно одинаковым.

Испытуемый иммуноглобулин был безвреден и ареактогенен.

При сравнительном анализе клинических критериев эффективности в опытной и контрольной группе было выявлено (табл. 9), что при лечении специфическим иммуноглобулином улучшение самочувствия в днях от начала заболевания наступает на 3,7 дня раньше (р< 0,05). На 3,1 дня меньше этот показатель при расчёте его со дня начала введения иммуноглобулина при сравнении с контрольным препаратом (р<0,05). Уменьшение интоксикации и улучшение самочувствия после начала лечения ИГ ГЛПС наступало на первый-второй день у 70% больных, в то время, как в контрольной группе в эти сроки такой же эффект наблюдается лишь в 15% случаев.

При специфическом лечении длительность пребывания в стационаре в расчёте от начала болезни сокращалась на 6,4 дня (р<0,05). Также достоверно меньше на 4,2 дня в опытной группе была продолжительность нахождения в стационаре больных после начала лечения иммуноглобулином (р< 0,05).

Не удалось обнаружить преимуществ специфического препарата в отношении сроков наступления полиурии (в суммарной опытной группе при введении на 4-11 дни болезни и курсовых дозах в 24 и 12 мл), а также его влияния на сроки проявления геморрагического синдрома. Однако при анализе влияния дозировок и сроков введения ИГ против ГЛПС на эффект появления полиурии выявлена тенденция к более быстрому наступлению ранней реконвалесценции на 2,5 дня раньше при курсовой до-

зе в 24 мл и при введении до 8 дня болезни (через 2,3 дня при 24 мл и через 4,8 дня при 12 мл от начала лечения).

Таблица 9.

Анализ эффективности иммуноглобулина для лечения ГЛПС

Клинические Дни проявления при лечении

критерии ИГ ГЛПС ИГ нормальный

От начала От начала От начала От начала

заболевания лечения заболевания лечения

Улучшение самочувствия

Длительность болезни до выписки из стационара

Длительность пребывания в стационаре от начала лечения

Регресс признаков геморрагического синдрома

Наступление полиурии

8,8+0,8 р<0,05

20,2±1,4 р<0,05

9,8+0,9

10,6+0,9

2,3±0,4 р<0,05

15,9±1,1 р<0,05

3,4±1,0

12,5+1,7

26,6+1,8

5,4+1,5

10,6+0,8

3,8±0,7 10,5±0,4

20,1 ±1,5

4,2+0,7

4,0+0,3

Заметно воздействие дозировок вводимого препарата на регресс признаков геморрагического синдрома в днях от начала болезни. На 2,6 дня этот показатель меньше при введении 24 мл. Тенденция влияния дозировки и раннего введения сохраняется и при расчете времени регресса от начала лечения ( 2,0 дня при 24 мл против 4,3 при 12 мл).

Отмечено положительное влияние ИГ против ГЛПС на показатели Т-клеточного иммунитета, а также отсутствие какого-либо депрессивного действия на прогресс антителообразования. У больных, лечённых ИГ

против ГЛПС хотя и сохраняется относительная недостаточность Т-лимфоцитов в периоде выздоровления ( 52,0 ± 2,5% ), однако их абсолютное содержание в среднем приходит к норме (1,33 + 0,13 х 109/л). Не выявлено также хелперной недостаточности, характерной для этого периода: относительный и абсолютный показатели ТФР-РОК при выздоровлении в пределах нормы ( 43,6 + 3,2% и 1,02 ± 0,12 х 109/л ). Супрессор-ная активность Т-лимфоцитов (ТФЧ-РОК) в относительном 13,3 + 2,4% и абсолютном выражении 0,33 ± 0,88 х 109/л также находилась на нормальных уровнях. Относительный и абсолютный показатели В-лимфоцитов (М-РОК) в периоде выздоровления регистрируются в пределах нормы (11,0 ± 0,8%; 0,29 + 0,02 х 10%). Динамика НМФА-антител и их титры не отличались какими-либо отклонениями от антителообразо-вания у больных, не получавших испытуемый препарат.

Таким образом государственные клинические испытания препарата иммуноглобулина для лечения хантавирусной инфекции I серотипа человеческого жидкого в шифрованном опыте в условиях клиники показали его безвредность и наличие лечебного эффекта. Это проявляется в сокращении длительности интоксикационного синдрома, быстром улучшении самочувствия и уменьшении сроков стационарного лечения. При адекватных дозировках и ранних сроках введения раньше наступает по-лиурия и прекращается развитие геморрагического синдрома. Препарат оказывает положительное влияние на нормализацию иммунологических показателей и способствует иммунологической реабилитации, пассивно введённые антитела не подавляют процесс антителообразования. Отчёт о клиническом испытании иммуноглобулина против ГЛПС по результатам дешифрования отправлен в государственный институт стандартизации и контроля им. Л.А.Тарасевича для утверждения представленной нормативно-технической документации.

ВЫВОДЫ

1. Иммунологическая реактивность при ГТ1ПС характеризуется развитием вторичного иммунодефицита, вызванного модулирующим действием возбудителя инфекции.

2. У больных ГЛПС в начальном периоде регистрируется относительная лимфоцитопения, продолжительное снижение циркулирующих в периферической крови Т-лимфоцитов по относительным и абсолютным показателям , депрессия бласттрансформации, кратковременная недостаточность хелперной активности и преобладание супрессорного влияния в балансе иммуно-регуляторных клеток. Глубина Т-дефицита проявляется независимо от тяжести течения заболевания, продолжительность нарушений имеет прямую связь с формой заболевания.

3. Реагирование В-системы иммунитета отличается резкой активизацией, в 1,5 - 2 раза увеличивается относительное и абсолютное содержание В-лимфоцитов при всех формах тяжести, при клиническом выздоровлении показатели не приходят к норме. С первой недели заболевания происходит интенсивное продуцирование плазменных иммуноглобулинов основных классов. Пик синтеза иммуноглобулина М приходится на 2-3 неделю, на 3 неделе болезни значительно увеличивается содержание иммуноглобулинов в и А, нормализация концентрации иммуноглобулинов не наступает на протяжении всего клинического периода.

4. Угнетение Т-системы иммунитета и стимуляция В-системы приводит к нарушению оптимального соотношения Т- и В-лимфоцитов, необходимого для результативной Т-В кооперации и выработки полноценного гуморального иммунного ответа.

5. Деффектность гуморального иммунного ответа проявляется длительной персистенцией 1д м-антител у 53% переболевших до 4-6 месяцев после клинического выздоровления, медленной выработкой 1д в-антител, регистрируемых только у 73,5% выздоравливающих. В течение года после заболевания лишь у 80% лиц обнаружены 1д в-антитела, при этом отмечается задержка полного переключения синтеза 1д М на 1д 6 более чем в 50% случаев. Феномен нарушения селекции высокоаффинных 1д в-антител наиболее выражен при тяжёлых формах ГЛПС.

6. Иммунное комплексообразование по длительности обнаружения ЦИК находится в прямой связи с тяжестью течения ГЛПС. На основании продолжительного и массивного продуцирования 1д М-антител и торможения синтеза 1д С-антител следует считать, что комплексообразующий процесс при ГЛПС в части случаев имеет патологический характер, обусловленный формированием ИК преимущественно с 1д М-антителами, низкий аффинитет которых способствует нестабильности и остаточной инфекционности ИК, что приводит при их диссоциации к дополнительному инфицированию чувствительных клеток и вероятной длительной пер-систенции возбудителя.

7. На основе-дефектов иммунологической реактивности определены иммунологические показатели, являющиеся прогностически неблагоприятными в отношении длительности течения инфекционного процесса с развитием возможных морфологических и функциональных повреждений и формирования хронической патологии почек. Прогностически значимыми являются длительная продукция 1д М антител и низкие уровни ЦИК в пределах 30-110 единиц в периоде ранней и поздней реконвалес-ценции. Эти показатели позволяют выделять группу риска, нуждающуюся в диспансеризации.

8. Показано, что манифестная инфекция ГЛПС в Приамурье этиологически обусловлена в основном первым серотипом хантазируса

(Аройетиэ ). Пик антителообразования по данным НМФА приходится на 3-4 неделю заболевания, когда у 85% больных отмечены наиболее высокие титры антител от 11 до 13 1од2. Антитела к хантавирусу сохраняются у 95% переболевших в течение многих лет ( 10 и более по сроку наблюдения ) на уровне 6-7 (од2.

9. Применение специфической диагностики позволило установить наличие атипичных и стёртых форм ГЛПС у 20% больных со снятым клиническим диагнозом ГЛПС и с другими окончательными диагнозами.

Среди здорового населения очаговых территорий Дальнего Востока благодаря латентному инфицированию формируется иммунная прослойка, составляющая от 3,4% до 1,79% в разных районах. Динамические исследования показали возрастание доли иммунных лиц с конца лета с максимальным уровнем в осенне-зимние месяцы, что отражает сезонность заболеваемости ГЛПС.

10. Разработаны и прошли государственные клинические испытания препараты антител "Плазма крови человека для лечения геморрагической лихорадки с почечным синдромом ( ГЛПС ), сухая" и " Иммуногло-бин против геморрагической лихорадки с почечным синдромом ( ГЛПС ) человеческий жидкий".

11. Препараты специфических антител в комплексном лечении больных ГЛПС позволяют в более короткие сроки добиться значительного улучшения самочувствия больных, приблизить наступление ранней реконвалесценции, сократить сроки стационарного лечения. Иммунные препараты оказывают положительное влияние на нормализацию иммунологических показателей, способствуя иммунологической реабилитации.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Разработка методов специфической диагностики и изучение эпидемиологии ГЛПС / Л.А.Верета, Т.П.Владимирова, В,И,Волков и др. -Мат. симпозиума проблемной комиссии "Полиомиелит и другие вирусные инфекции". М., 1974, с. 137-138.

2. Выявление КС антител у переболевших ГЛПС /Т.П.Владимирова, Л.А.Верета, Г.М.Воронкова и др. - Мат. юбилейной конференции "40 лет изучения ГЛПС", Хабаровск, 1975, с. 38-39.

3. Результаты эколого-эпидемиологического и лабораторного исследования ГЛПС в Хабаровском крае / Л.А.Верета, Т.П.Владимирова и др. - Там же, с. 6-7.

4. Некоторые подходы к разработке методов выявления антигенов возбудителя ГЛПС / Л.А.Верета, Т.П.Владимирова, Т.В.Мжельская и др. -Вопросы медицинской вирусологии. Тез. докл., М. 1975, с. 249-250.

5. Методические рекомендации по изучению природной очаговости., заболеваемости и специфическим серологическим исследованиям ГЛПС /Л.А.Верета, В.И.Волков, Т.П.Владимирова и др., Хабаровск, 1976, с.38.

6. Разработка и применение чувствительных реакций в исследованиях при ГЛПС / Л.А.Верета, Т.П.Владимирова, Г.М.Воронкова и др. -Тез. докл. советско-финского симпозиума по ГЛПС - эпидемической неф-ропатии, Москва 1979, с. 13-14.

7. Дальнейшее эколого-эпидемиологическое и клинико-иммуноло-гическое изучение ГЛПС с применением чувствительных методов иммунологических реакций / Л.А.Верета, Т.П.Владимирова, В.И.Волков и др. -Заключительный отчёт НИР, задепонирован инв. Б 745460, 1979, 38 стр.

8. Использование чувствительных серологических реакций и имму-нохимического анализа в исследованиях ГЛПС / Л.А.Верета, Т.П.Владимирова, Г.М.Воронкова и др. - Тез. докл. Х1У Тихоокеанского научного конгресса, Москва-Хабаровск, 1979, с. 18-19.

9. Результаты эколого-эпидемиологического и иммунологического изучения ГЛПС в Приамурье / Л.А.Верета, Т.П.Владимирова, В.И.Волков и др. - Мат. сессии СО АМН СССР "Природно-очаговые заболевания Сибири и Дальнего Востока", Владивосток, 1979, с.24-25.

10. Особенности геморрагической лихорадки с почечным синдромом на Дальнем Востоке / Л.А.Верета, Т.П.Владимирова, В.И.Волков и др. - Вестник АМН СССР, 1980,10, с. 54-60.

11. Итоги и перспективы изучения природно-очаговых инфекций на Дальнем Востоке / Л.А.Верета, В.И.Волков, Т.П.Владимирова и др. - Сб. Природно-очаговые инфекции. Омск, 1981, с. 22-29.

12. Характеристика Т- и В-лимфоцитов при ГЛПС /Т.П.Владимирова. Г.С.Ковальский, Т.В.Ковальская. - Сб. Природно-очаговые инфекции и инвазии. Хабаровск, 1982, с.12-17.

13. Циркулирующие иммунные комплексы при ГЛПС /Т.П.Владимирова, Н.М.Пуховская, Г.И.Ким. - Сб. Природно-очаговые инфекции и инвазии, Хабаровск, 1983, с. 39-45.

14. Авторское свидетельство СССР № 1131508 Способ лечения больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом /Л.А.Верета, Ю.И.Яковлев, Т.П.Владимирова и др. // 01.09.84.

15. Лабораторные тесты в исследованиях при ГЛПС (Применение , перспективы разработок) / Л.А.Верета, Т.П.Владимирова, Г.М.Воронкова и др. - Сб. ГЛПС и другие арбовирусные инфекции, Хабаровск, 1985, с.З-13.

16.Гуморальный иммунный ответ при ГЛПС /Т.П.Владимирова, И.С.Старостина. - Сб. ГЛПС и другие арбовирусные инфекции, Хабаровск, 1985, с. 15-19.

17. Динамика антителообразования у больных ГЛПС дальневосточного региона по отношению к азиатскому и европейскому антигенным вариантам возбудителя / Т.П.Владимирова, Л.А. Верета, Г.М.Воронкова и др. - Вопр. вирусологии, 1986, 4, с. 498-501.

18. Иммунологическая реактивность у больных ГЛПС /Т.П.Владимирова, Г.М.Воронкова, Л.А.Верета и др. - Сб. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом, Хабаровск, 1987, с. 26-28.

19. Диагностические возможности НМФА с различными видами антигенов при ГЛПС / Г.М.Воронкова, Т.П.Владимирова, Л.А.Верета и др. Сб. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом, Хабаровск, 1987, с. 91-93.

20. Перспективы изготовления препаратов антител для лечения и профилактики ГЛПС I Л.А.Верета, Т.П.Владимирова, Ю.И.Яковлев и др. -Сб. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом, Хабаровск, 1987, с. 106-109.

21. Клинико-серологические параллели при геморрагической лихорадке с почечным синдромом (ГЛПС) / В.З.Сиротин, Л.А.Верета, Т.П.Владимирова и др. - Сб. Этиология нефропатии 1У пленума союзной проблемной комиссии "Нефрология", тез. докладов, Тбилиси, 1987, с. 26.

22. Enzyme immunoassay for the detection of virus specific Ig G and Ig M antibody in patients of with HFRS ( A.P.Ivanov, E.A.Tkachenko,

V.A.Petrov..........T.P.VIadimirova e.a. - Arch, of Virology, 1988, vol.100, N1 -

2, p. 1 - 7.

23. Особенности синтеза специфических иммуноглобулинов при ГЛПС / Т.П.Владимирова, Г.М.Воронкова, А.П.Иванов, Е.А.Ткаченко, - Сб. Природно-очаговые инфекции Дальнего Востока, Хабаровск, 1989, с. 912.

24. Прогнозирование формирования хронической патологии у переболевших ГЛПС / И.С.Старостина, Т.П.Владимирова, И.А.Шапиро и др. -Сб. Вопросы экологии и проблемы улучшения здоровья населения Забайкалья и КНДР, тез. докл., Чита, 1989, с. 82-83.

25. Актуальные задачи и перспективы разработки сырьевой базы препарата иммуноглобулина против ГЛПС / Л.А.Верета, Г.М.Воронкова, Т.В.Мжельская, Т.П.Владимирова и др. - Сб. Природно-очаговые инфекции Дальнего Востока, Хабаровск, 1989, с. 3-9.

26. Сдвиги в системе иммунокомдетентных клеток у больных ГЛПС. / Т.П.Владимирова, Г.М.Воронкова. - Сб. Инфекционные болезни Дальнего Востока, Хабаровск, 1990, с. 30-34.

27. Авторское свидетельство СССР № 1654747 Способ прогнозирования хронической патологии почек у переболевших ГЛПС /И.С.Старостина, Т.П.Владимирова, И.А.Шапиро и др. - 08.02.91.

28. Разработка препаратов антител против ГЛПС вызываемой восточным серотипом вируса / Л.А.Верета, Г.М.Воронкова, Т.В.Мжельская, Т.П.Владимирова и др. - Мат. международного симпозиума по геморрагической лихорадке с почечным синдромом, Ленинград, 1991, с. 25.

29. Характеристика гуморального иммунного ответа при ГЛПС /Т.П.Владимирова, Г.М.Воронкова, Л.А.Верета. Сб. Инфекционные болезни Дальнего Востока, Хабаровск, 1993, с. 31-33.

30. Электронно-микроскопическое обнаружение хантаподобных вирусных частиц в почечном биоптате больного ГЛПС / В.А.Деменев, М.А.Щинова, А.Е.Родин, Т.П.Владимирова и др. - Сб. Инфекционные болезни Дальнего Востока, Хабаровск, 1993, с. 34-40.

31.Прогнозирование течения геморрагической лихорадки с почечным синдромом / Б.З.Сиротин, Л.А.Верета, Т.П.Владимирова и др. - Информационное письмо, Хабаровск, 1994, с. 13.

32. Показатели естественной резистентности и иммунитета у жителей Дальневосточного региона России / И.С.Старостина, В.В.Богач, Т.П.Владимирова и др., Хабаровск, 1994, с. 25.

33. Характеристика экспериментально-производственных серий иммуноглобулина для лечения ГЛПС, вызываемый I серотипом Хантави-руса / Г.М.Воронкова, Т.В.Мжельская, Л.А.Верета, Т.П.Владимирова и др. - Инфекционная патология в Приморском крае. Тез. докл. научно-практической конференции. Владивосток, Дальнаука, 1994, с. 120-121.

34. Получение препарата "Плазма крови человека для лечения ГЛПС, сухая" и оценка его терапевтической эффективности / Л.А.Верета, Ю.И.Яковлев, Т.П.Владимирова и др. - Актуальные вопросы медицинской вирусологии, Екатеринбург, 1994, с. 192-199.

35. Ранняя специфическая диагностика ГЛПС, основанная на исследовании проб мочи / Т.Д.Елисова, Л.А.Верета, Г.М.Воронкова, Т.В.Мжельская, Т.П.Владимирова. - Там же, с. 171-176.

СПИСОК ДОКУМЕНТОВ ПО ВНЕДРЕНИЮ НАУЧНЫХ ДОСТИЖЕНИЙ В ПРАКТИКУ

1. Инструкция по изготовлению и контролю плазмы крови человека для лечения ГЛПС, сухой, 1980. - 13 с.

2. Программа и методика испытания лечебных свойств плазмы крови человека для лечения ГЛПС. Утверждена Комитетом вакцин и сывороток 08.12.81 № 702-21 с.

3. Отчёт о результатах испытания препарата "Плазма крови человека для лечения ГЛПС", 1991. - 29 с.

4. Типовой регламент производства плазмы крови человека для лечения ГЛПС, сухой, 1991. - 20 с.

5. Временная фармакопейная статья на плазму крови человека для лечения ГЛПС, 1991. - 7с.

6. Инструкция по применению плазмы крови человека для лечения ГЛПС, сухой, 1991. -4 с.

7. Временная фармакопейная статья на "Иммуноглобулин против геморрагической лихорадки с почечным синдромом человеческий жидкий". -1988. 9 с.

8. Инструкция по применению " Иммуноглобулина против геморрагической лихорадки с почечным синдромом человеческого жидкого", 1988. - 12 с.

9. Программа и методика апробации препарата "Иммуноглобулин для лечения геморрагической лихорадки с почечным синдромом человеческий жидкий". Утверждена Комитетом вакцин и сывороток 24.05.88. -12 с.

10. Разрешение Комитета МИБП на проведение шифрованных клинических испытаний иммуноглобулина против ГЛПС от 09.12.1988 № 01-07/473.

11.Заключения ГИСКа им. ЛАТарасевича на образцы иммуноглобулина человеческого против геморрагической лихорадки с почечным синдромом серий 2, 3, 4, 5, 8. - 4 с.

12. Отчёт Комитету МИБП о результатах клинических испытаний иммуноглобулина для лечения ГЛПС человеческого жидкого в шифрованном опыте. - 1993. - 69 с.

13. Авторское свидетельство № 1131508 на изобретение "Способ лечения больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом". Зарегистрировано 01.09.1984.

14. Авторское свидетельство № 1654747 на изобретение "Способ прогнозирования хронической патологии почёк у переболевших ГЛПС. Зарегистрировано 08.02.1991 г.