Иммунохимическое изучение эмбрионального и фетального гемоглобинов на ранних этапах онтогенеза

Бисалиева, Рината Альбкалиевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Иммунохимическое изучение эмбрионального и фетального гемоглобинов на ранних этапах онтогенеза
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Иммунохимическое изучение эмбрионального и фетального гемоглобинов на ранних этапах онтогенеза"

На правах рукописи

Бисалпсва Рината Альбкалиевна

ИММУНОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЭМБРИОНАЛЬНОГО И ФЕТАЛЬНОГО ГЕМОГЛОБИНОВ НА РАННИХ ЭТАПАХ ОНТОГЕНЕЗА

03.00.04 - биохимия

ЧНрМ

0034804Э1

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Краснодар 2009

Работа выполнена в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Астраханская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (ГОУ ВПО АГМА Росздрава)

Научный руководитель: кандидат медицинских наук, доцент

Никулина Дина Максимовна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Павлюченко Иван Иванович доктор медицинских наук, профессор Ефрсменко Виталий Иванович

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава», г. Самара)

Защита состоится ноября 2009 г. в 10 часов на заседании диссерта-

ционного совета Д 208.038.02 при ГОУ ВПО КГМУ Росздрава (350063, г. Краснодар, ул. Седина, 4, тел. {861} 262-73-75).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО КГМУ Автореферат разослан «_»__2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 208.038.02 профессор

Л.А. Скорикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РА КОТЫ

Актуальность исследования. Исследования процесса внутриутробного развития человека представителями различных специальностей в течение длительного времени не снизили актуальности этой проблемы [И.В. Алексеев и соавт., 1995; С.Б. Назаров, Л.С. Горожанин, 1996]. Появление современных технологий позволяет изучать и детализировать на новом уровне условия и факторы, влияющие па развитие плода [ A.B. Лукьянснко, 1987].

В результате дифференциальной активности генов в процессе онтогенеза изменяется качественный набор белков. С этой точки зрения хрестоматийным примером является гетерогенная система гемоглобина, определяемая цепями глобина а ß, у, £, соотношение которых в крови существенно изменяется в процессе индивидуального развития организма, а также при патологических состояниях. Субъединицы глобина, являющиеся продуктами активности структурных генов, при различных сочетаниях определяют тип гемоглобина: эмбриональный (НЬР) - с.,, а фетапьный (HbF) - а2у2; взрослый (НЬА|) - a2ß:- Поэтапная смена данных типов гемоглобина обусловлена изменением гомеостатических условий организма в процессе онтогенеза с преимущественным функционированием более приспособленного к этим условиям типа [Н.Ф. Стародуб, Ю.Н. Токарев. 1986; Н.Ф. Стародуб, 1987; А.Ф. Топунов, Н.Э. Петрова, 20011.

патологических состояний, сопровождающихся перестройками интенсивности кроветворения и оксигеиации тканей [Г.И. Козинец, 1980; О.Н. Дьякова, 1999; Д.М. Никулина и соавт., 2002; А.Б. Агапова, 2003; А.Б. Агапова, Д.М. Никулина, Т.Н. Панова, 2003]. В последнее время появились сведения об использовании HbF в качестве «индикатора» процесса развития некоторых онкологических заболеваний человека [M. Wolk, J.E. Martin, R. Constantin, 2004]. Прикладная значимость эмбрионального гемоглобина до сих пор остается не изученной, что связано с устоявшимся мнением об отсутствии у этого белка диагностической ценности, так как активность его гена полностью репрессирована как у детей, так и у взрослых. Хотя в литературе имеются единичные сведения с) возобновлении синтеза этого белка у недоношенных детей с аномалиями развития [Е.Ф. Морщакова, А.Д. Павлов, Л.Г. Румянцев, 1999]. Следует отметить, что в доступной литературе мы не нашли работ но иммунохимическому изучению продукции этих белков в онтогенезе. В этой связи представленная работа является актуальной и имеет важное научное и практическое значение.

Цель исследования. Получить новые данные о свойствах, динамике синтеза па ранних этапах анте- и постнатального онтогенеза и возможном клиническом использовании эмбрионального и фетального типов гемоглобина.

Задачи исследовании:

1. Определить и уточнить физико-химические свойства эмбрионального п фегалыюго типов г емоглобина.

2. Разработать способ выделения и очистки эмбрионального гемоглобина и модифицировать способ выделения и очистки фетального гемоглобина.

3. Смоделирован, моноспецифические иммунодиффузионные тест-системы на эмбриональный и фетальный гемоглобины.

4. Определить уровень НЬР и HbF в различные сроки ame- п постна-тального онтогенеза человека, и том числе мри осложненном развитии плода.

Научная новнзна работы: Впервые разработан алгоритм выделения и очистки эмбрионального гемоглобина. Впервые получена и апробирована иммунохимическая тест-система на эмбриональным гемоглобин. Разработан способ количественного определения фетального гемоглобина. Проведен количественный иммунохимический анализ динамики продукции эмбрионального и фетального гемоглобинов на ранних этапах аитс- и по-стнатального онтогенеза человека и установлены особенности их синтеза при осложненном развитии плода.

Научно-практическая значимость

Разработанный метод выделения и очистки эмбрионального гемоглобина и модифицированный метод выделения и очистки фетального гемоглобина позволяют экономить исходный биоматернал, реактивы, временные и финансовые ресурсы. Полученные белковые препараты llb могут быть использованы для научных исследований и для практического применения.

Результаты изучения биосинтеза эмбрионального н фетального гемоглобинов в онтогенезе могут служить основой для дальнейших исследований, в ходе которых будут разработаны алгоритмы оценки состояния эри-трона при различной патологии.

Выявленные качественные и количественные изменения 1Смоглобинового спектра у недоношенных детей могут бьт> использованы в качестве маркера степени зрелости и оценки тяжести гипоксии новорожденных.

Внедрение результатов работы: Результагы работы используются при обучении студентов, интернов, ординаторов, аспирантов н слушателей курсов ФПО на кафедрах биохимии с курсом клинической лабораторной диагностики, сестринского дела и ухода за больными с курсом перинато-

логин, педиатрии лечебного факультета ГОУ ВПО АГМА Росздрава.

Разработанные иммунохимические тест-системы на эмбриональный и фе-тальпым гемоглобины используют ся для оценки состояния новорожденных детей в МУЗ «Клинический родильный дом» г. Астрахани.

В 2007 и 2008 годах новые способы и иммунохимические тест-системы для лабораторной оценки состояния новорожденных, включающие результаты данного исследования, были удостоены 2 золотых медалей на VII и VIII Московских международных салонах инноваций и инвестиций. В 2007 году инвестиционный проект «Новые иммунохимические тест-системы для лабораторной диагностики осложненного течения беременности, гипоксии и деструктивных процессов» был представлен на выставке: «Инновационные достижения России» XI Петербургского международного экономического форума.

Основные положении диссертации, выносимые на защиту:

1. Выявленные физико-химические особенности НЬР и HbF по подвижности в носителях и отношению к осаждающим агентам служат основой разработанных способов их выделения и очистки.

2. Смоделированные иммунохимические тест-системы на НЬР и HbF для качественного и количественного анализа их продукции в биологических объектах позволили уточнить динамику изменений концентрации НЬР н HbF на этапах развития эмбриона и плода, выражающейся в разнонаправленном характере с 5 по 12 недели гестации.

3. Уровни НЬР и HbF у недоношенных детей зависят от гестационного возраста и особенностей течения неонатапьного периода и могут служить маркером степени зрелости плода, тяжести внутриутробной гипоксии.

Апробации результатов исследования. Материалы диссертации доложены и обсуждены на научных заседаниях кафедры биологической химии с курсом клинической лабораторной диагностики ГОУ ВПО АГМА Росздрава, на проблемных комиссиях ГОУ ВПО АГМА Росздрава. на итоговых и темати-

ческих конференциях ГОУ ВПО ЛГМА Росздрава; на 5-и и 6-й научно-практических конференциях с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины», Астрахань-Москва, 2006, 2008; на международной научной конференции, посвященной 450-летию города Астрахани, Астрахань, 2007; на международной научной конференции «Молодежь - медицине будущего», Одесса, 2009.

Результаты работы были представлены на IV международном конкурсе научных работ молодых ученых журнала «Лечащий врач», Москва, 2007.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 24 научные работы, из них 2 в журналах, рекомендованных ВАК для публикации результатов, полученных при выполнении диссертаций на соискание ученой степени кандидата медицинских наук, получен I патент на изобретение.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, методического раздела, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, приложения. Библиография включает в себя 127 отечественных и 56 зарубежных источников. Иллюстрированный материал представлен 1 7 таблицами, 20 рисунками.

Диссертационная работа выполнена на базе кафедры биохимии с курсом КЛД ГОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» в соответствии с планом научных исследований в рамках внутриву-зовской научной комплексной работы «Изучение диагностической значимости иммунохимических тест-систем на железосодержащие белки человека при соматической патологии» (КОД ГАСНТИ 31.27.03). номер государственной регистрации 01200614203.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования. Объектом исследования явились эмбриональный и фетальный гемоглобины человека в эмбриональных тканях, выделенных из абортивного материала от женщин со сроком беременности 4-12 педель, и в крови новорожденных различных периодов гес-тации.

Для решения поставленной задачи было исследовано:

- 126 образцов эмбриональных тканей, распределенных по 9 группам в зависимости от срока эмбриогенеза (в неделях);

- 145 образцов пуповинной крови (ПК) новорожденных детей, составивших три группы: 52 доношенных здоровых ребенка; 14 новорожденных с гестациопным возрастом (ГВ) 28-31 недели; 31 - с ГВ 32-34 недели; 48 -с ГВ 35-36 недель.

- 78 образцов венозной крови недоношенных детей (две группы с ГВ 28-34 и ГВ 35-36 недель) с различными проявлениями гипоксии.

Все 349 образцов исследуемого материала были протестированы на содержание НЬР и НЬР иммунодиффузионными методами с помощью авторских тест-систем.

В работе использовали иммунохимические и биохимические методы исследований (солевое осаждение, гель-проникающая и ионообменная хроматография; иммунизация лабораторных животных и моделирование тест-систем; различные виды иммуноэлектрофореза и т.д.), а также статистические методы.

Приготовление антигенов (Аг) и получение антисывороток (Ас) для создания моноспецифических тест-систем на НЬР и НЬР наряду с их конструированием составило существенную часть собственных исследований.

В качестве Аг использовали белковые препараты, полученные из биологических образцов крови и тканей сочетанием методов высаливания, гель-проникающей п ионообменной хроматографии. Исходным биомате-

риалом для выделения и очистки НЬР служил абортивный материал от беременных женщин сроком 7-9 недель.

Исходным биоматериалом для выделения и очистки ИЬГ служила пу-повинная кровь, собранная в родах и помещенная в пластиковые одноразовые пробирки с антикоагулянтом (10 мкл 10% ЭДТД на I мл крови) для предотвращения образования сгустка. Фракцию эритроцитов отмывали от примеси сывороточных белков путем многократного центрифугирования при 3000 об/мин в течение 20 мин и повторного их рссуспеидирования в изотоническом растворе NaCl (0,15 М).

Вследствие трудностей получения плодовых тканей после 12-й недели гестации изучение продукции антенатальных типов гемоглобина у плодов проводили в ПК недоношенных детей. Поскольку ПК идентична крови плода того ГВ, при котором произошли роды, то изучение гемоглобиново-го спектра в ПК недоношенных новорожденных разных сроков гестации может дать ценную информацию о развитии кроветворения в позднем фе-тогенезе.

Идентификацию Аг проводили классическими пммупохимическими методами: двойной встречной иммулодиффузией в агаровом геле по Оу\-терлони и методом радиальной иммунодиффузии по Манчини в модификации Фехей и Мак-Келви.

Процесс получения Ас состоял из следующих этапов: приготовления иммунизирующего Аг (иммуногена); иммунизации животного; оценки полученной Ас.

Результаты исследований были обработаны с помощью пакета статистического анализа Statistica 6, SPSS V 10.0.5, программ «STATLAND», «EXCEL-97», «Basic Statistic» с учетом стандартных методик вариационной статистики, включая вычисление критерия t Стыодепта для оценки достоверности различий. Данные представлены в виде Mini, различия считались статистически достоверными при р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение. В соответствии с задачами исследования были изучены иммунохимические и физико-химические свойства НЬР и НЬИ, разработаны оптимальные способы их выделения и очистки, с последующим получением моноспецифических Ас и формированием тест-систем на НЬР и НЬИ.

Определены особенности физико-химических свойств разных типов НЬ путем осаждения сульфатом аммония, ацетоном, разбавленными растворами кислот и щелочей. Проведено изучение относительной электро-форетической подвижности (ОЭП) НЬА¡, НЬА2, НЬИ и НЬР в полиакрила-мидном (ПААГ) и агарозном гелях. С помощью метода изоэлектрофокуси-рования в ПААГ были определены отдельные изоформы гемоглобинов по р1 (изоэлектрическая точка). Этот параметр, также как и ОЭП, характеризует поверхностный заряд макромолекул. Установленные нами различия в физико-химических характеристиках НЬИ и НЬР, легли в основу разработанных нами методов их выделения и очистки (табл. 1).

Наиболее целесообразным для выделения НЬР и НЬР является сочетание методов щелочного осаждения и ионообменной хроматографии. Основные этапы выделения препаратов НЬР и НЬР и количественные характеристики процесса представлены в таблицах 2, 3. Новые способы выделения и очистки воспроизводимы, доступны, не требуют расхода дорогостоящих реактивов и позволяют получать НЬР и НЬР человека в любых количествах для аналитических и препаративных целей.

Анализ чистоты полученных препаратов осуществляли методом вертикального электрофореза в ПААГ (рис. 1, 2).

Разработанные схемы выделения препаратов НЬР и НЬР обладают достаточно высокими суммарными количественными показателями, в частности, степенью очистки и итоговым выходом конечного продукта.

Таблица 1

Сравнительный анализ физико-химических свойств гемоглобинов, полученных самостоятельно и другими авторами

Ф/х свойства ньл, ньл2 НЫ' НЬР

Растворимость в воде + + + +

Отношение к сульфату

аммония (в % насыщен-

ности): оптимум осажде- 55* 50* 70* 65*

ния

диапазон осаждения 30-65* 30-65* 40-80* 35-80*

Относительная электро-

форетическая подвиж-

ность по альбумину:

в агарозе 0,258±0,009* 0,206±0,007* 0,217±0,008* 0,309±0,0*

0,29-0,30** _**** 0,30-0,35**

вПААГ 0,610±0,022* 0,537±0,020* 0,51210,019* 0,679±0,024*

0,63-0,68** 0,51-0,525** 0,50-0,52**

Изоэлектрическая точка 7,0* 7,3* 7,1* 6,85*

6,95-7,18** 7,4-7,6** 6,9-7,15** .+»**

Резистентность к дейст- Неустойчив*** Неустойчив*** Устойчив*** Относитель-

вию щелочей но устойчив*

Устойчив**

Пероксидашая и ката- Активен*** Активен*** Активен*** Активен***

лазная активность

Характеристические ок-

раски:

белки (амидочерный)

общее железо (красная +*** + ***

кровяная соль)

гемоглобину (бензидин, +***

гваякол)

гликопротеиды (Шифф) .*** >** -

липопротеиды (судан)

-***

Гомогенность

при ')/ф в агарозе Гомогенен *** Гомогенен *** Гомогенен *** Гомоген. ***

в ПАА Г Гомогенен *** Гомогенен *** Гомогенен *** Гетерог,- ***

* - собственные данные

** - данные других авторов (Стародуб Н.Ф. (1987), ИржакЛ.И. (1985))

*** - собственные и литературные данные совпадают

**** - данные в литературе отсутствуют

Таблица 2

Этапы выделения НЬР

Основные этапы выделе- Общий Кол-во Целевой Степень Выход

ния белок, мг/л проду1ста, мг/л продукт, % очистки НЬР НЬР (%)

Исходный материал 165000 1850 1,12 1 100

Гомогенизация и экстраги- 36000 960 2,66 2,38 51,89

рование

Щелочное осаждение 5450 630 11,56 10,32 34,05

Ионообменная хроматогра- 1770 565 31,92 28,50 30,54

фия

Рис. 1. Анализ чистоты полученного препарата НЬР

1. Очищенный препарат НЬР

2. Гемолизат эритроцитов донора

3. Полуочищенный препарат НЬР

1 2 3

Таблица 3

Этапы выделения НЬР

Основные этапы выделения Общий белок, мг/л Кол-во продукта, мг|л Целевой продукт, % Степень очистки НЬР Выход НЬР(%)

Исходный материал 240000 3750 1,61 1 100

Получение гемолизата 128000 3100 2,42 1,5 82,66

Щелочное осаждение 4650 2800 60,21 37,40 76,66

Ионообменная хроматография 2900 2540 85,58 53,16 67,73

Рнс.2. Анализ чистоты полученного препарата НЬР

1 - Гемолизат пуповинной крови;

2 - альбумин;

3 - очищенный препарат НЬР;

4 - полуочшценный препарат.

1 2 3 4

Полученные препараты НЬР и НЬИ использовали для иммунизации кроликов и получения моновалентных Ас на эмбриональный и фетальный гемоглобины. Их иммунная специфичность к НЬР и НЬР доказана сопоставлением в ИДА (иммунодиффузионный анализ) с различными антигенами (рис. 3,4).

!Л| .. • • Л4'

Г Э 6

Г '

1 ;•) 1 ■,

3 г Э

2 " ' 5

1'нс.З. Контроль специфичности антисыворотки на эмбриональный гемоглобин

1 - антисыворотка на эмбриональный гемоглобин;

2 - антисыворотка на НЬР;

3 - неудавшаяся антисыворотка на НЬР;

4 - гемолизат пуповинной крови;

5 - очищенный препарат НЬА];

6 - экстракт тканей эмбриона 7-8 нед.; Э - очищенный препарат НЬР;

- сыворотка крови взрослого донора; Г - гемолизат крови взрослого донора.

Линии преципитации давали положительное окрашивание бензиди-ном и гваяколом, что подтверждало еще раз гемоглобиновую природу антигена и доказывало специфичность полученной антисыворотки.

В редких случаях при взаимодействии с другими антигенами проводили дробное истощение антисывороток соответствующими белковыми фракциями. После каждого истощения проводили повторный контроль Ас путем иммунодиффузии (рис.5).

Рис.4. Контроль специфичности антисыворотки на фе-тальный гемоглобин

1 - антисыворотка на НЬР; 2 - гемолизат пуповинной крови; 3 - очищенный препарат НЬИ; 4 - очищен, препарат НЬАь 5 - очищенный препарат НЬАг; 6 - очищен, препарат НЬР; 7 - сыворотка крови донора.

Рис. 5. Истощение антисыворотки на фетальный ч 1 гемоглобин

^ V-.-' 1 - неистощенная антисыворотка;

V - ' 2 - истощенная антисыворотка на НЬР;

5С1 \ 3 - антисыворотка на альфафетопротеин; ч- 4 - гемолизат крови плода 28 нед.;

Бс! - сыворотка крови взрослого донора.

Сопоставление полученных моновалентных антисывороток на НЬР и НЬР в ИДА давало полное перекрещивание преципитационных линий (рис. 6), что служило доказательством неидентичности полученных антисывороток.

Важным этапом контроля специфичности являлось сопоставление полученной антисыворотки с эталонной антисывороткой на фетальный гемоглобин, полученной ранее в научной лаборатории кафедры биохимии с курсом КЛД АГМА (г. Астрахань). Эталонная антисыворотка на НЬР была получена иммунизацией кролика очищенным препаратом НЬР, для подтверждения чистоты которого был проведен анализ Ы-концевых аминокислот в Институте молекулярной биологии РАН, г. Москва.

Рис. 6. Контроль специфичности антисывороток на НЬР и НЬК

1 -антисыворотка на НЬР;

2 - антисыворотка на НЬР;

3 - сывороточный альбумин;

4 - очищенный препарат НЬА1;

5 - экстракт тканей эмбриона 10-12 недель.

Путем подбора эквивалентных разведений антигена и антисыворотки сформированы моновалентные иммунохимические тест-системы для количественного определения НЬР и НЬР.

Для моделирования моновалентных иммунохимических тест-систем разводили препарат НЬР или экстракт тканей эмбриона (7-9 недель). Причем рабочим разведением очищенного препарата являлось 'Л, экстракта -1/8-1/16 . Чувствительность смоделированных тест-систем составила от 4 до 5 мг/л.

В зависимости от качества Ас были разработаны тест-системы на НЬР с близкой чувствительностью в диапазоне от 2 до 3 мг/л, в которых тест-антигеном являлся гемолизат пуповинной крови в рабочем разведении: 1/256-1/512. Характеристика моноспецифических антисывороток на НЬР и НЬР представлена в таблицах 4,5.

Полученные тест-системы позволяют определять содержание НЬР методом иммунодиффузионного титрования в агаре по Оухтерлони в модификации Храмковой и Абелева с последующей полуколичественной оценкой результатов реакции (рис. 7).

Рис. 7. Полуколичественный анализ НЬР методом титрования в РИД по Оухтерлони

1 - моновалентная антисыворотка на НЬР;

2 и 5 - тест-антиген (НЬР в рабочем разведении); 3, 4, 6, 7 - исследуемая проба в разведении 1; 1/2; 1/4; 1/8 соответственно.

Г 2 4

Таблица 4

Характеристика полученных тест-систем на НЬР

Шифр Ас Разведение антигена Максимальное разведение антисыворотки Абсолютная чувствительность тест-систем (мг/л) Наличие дополнительных линий преципитации

Максимальное Оптимальное

As 31 (II) 1/64 1/4-1/8 1/2 5 нет

As 433 (III) 1/64 1/8-1/16 1/4 4 нет

Количественное определение НЬБ проводили методом радиальной иммунодиффузии по Манчини. По стандартным образцам строили кривую зависимости квадрата диаметра кольца преципитации от концентрации антигена. По калибровочной кривой рассчитывали концентрацию НЬР в опытных пробах. При этом для каждой антисыворотки необходимо построение собственной калибровочной кривой.

Таблица 5

Характеристика полученных тест-систем на HbF

Максимальное Оптимальное

As39 (I) 1/1000 1/64 1/16 3 нет

As39 (II) 1/2000 1/128 1/16 3 нет

As41 (I) 1/4000 1/256 1/16 2 нет

As41 (II) 1/4000 1/128 1/16 2 нет

Для количественного определения HbF был разработан способ с использованием метода ракетного электрофореза в агаровом геле в варианте Laurell C.B. и Merrill D. с предварительной обработкой препаратов HbF раствором ДСН (додецилсульфата натрия) (рис. 8). Связано это с тем, что гемоглобин имеет меньшую электрофоретическую подвижность в агаро-

вом носителе, чем что усложняет образование пиков преципитации. ДСН, абсорбируясь на молекуле гемоглобина, придает ему выраженный отрицательный заряд, что увеличивает электрофоретическую подвижность к аноду.

Опытным путем отрабатывали оптимальное образование пиков преципитации с подбором состава, ионной силы и рН рабочего буфера и концентрация обрабатывающего вещества (ДСН), а также рабочие разведения исследуемых образцов. Высоту пиков преципитации соотносили с разведениями стандартного НЬР и по этим данным строили калибровочную кривую.

3 .

1 Рис.8. Количественное определение НЬР

4 методом ракетного электрофореза:

1-2 - образцы НЬР, не обработанные ДСН;

5 , 3-7 - образцы НЬР, обработанные ДСН

Г Ей-V: | ■ I 1'

Анализ качества разработанного способа показал следующие его преимущества: регистрацию только фетального гемоглобина, обеспечиваемую специфичностью моновалентной антисыворотки к НЬР; высокую чувствительность метода (нижний порог чувствительности 1,7±0,29 мг/л).

Результаты количественного определения НЬР и НЬР в 126 образцах эмбриональных тканей, разделенных на 9 групп в зависимости от срока гестации, представлены на рис. 9.

Динамика количественных изменений НЬР и НЬИ носила разнонаправленный характер: уровень НЬР плавно снижался, составляя при 8 неделях ГВ всего 12% от максимального значения, а НЬИ - к 12 неделям воз-

растал в 4 раза по сравнению с исходными значениями. Такое угасание синтеза НЬР объясняется начавшимися после 5-й недели внутриутробного развития атрофическими процессами в желточном мешке, который является местом синтеза данного белка. Синтез HbF, по мнению H.A. Торубаро-вой (1991), связан с новым этапом в развитии гемопоэза - эмбриональное и фетальное кроветворение наступает с 5-ой недели и продолжается до конца гестационного периода, но в отличие от внеэмбрионального имеет органную локализацию - печень, функционирующую наиболее активно после 12-й недели внутриутробного периода.

4 5 6 7 8 9 10 11 12 Срок гестации (недели)

Рис 9. Анализ концентраций эмбрионального и фетального типов гемоглобина в раннем эмбриогенезе человека

Изучение НЬР и НЬИ в пуповинной крови новорожденных позволило установить наличие фетального гемоглобина в 100 % случаев (табл. 6). Выявлено значительное повышение концентрации НЬР в группе недоношенных детей на фоне достоверной обратной зависимости от сроков гестации, что соответствует представлениям о динамике синтеза фетального гемоглобина, уровень которого резко снижается после рождения. Наиболее низкое содержание НЬР было обнаружено у здоровых доношенных ново-

80 т

НЬР HbF

рожденных детей, у которых анте- и интранатальный период прошли без осложнений - 109,67±4,4 мг/л, наиболее высокие у глубоконедоношенных новорожденных (28-31 недели) - 412± 17,4 мг/л.

НЬР обнаруживали в значительной части, но не во всех образцах крови. Число отрицательных случаев нарастало с увеличением ГВ недоношенных новорожденных. В крови доношенных здоровых детей НЬР при уровне чувствительности примененного метода не был обнаружен ни в одном случае.

Таблица 6

Содержание НЬР и НЬР в пуповинпой крови недоношенных детей

Кровь недоношенных новорожденных п Концентрация НЬР при положительных результатах, мг/л Отрицательные результаты Концентрации НЬР, мг/л

п % п М±П1 Р

** 28-31 недели 14 4,64±0,78 4 28,57 14 412± 17,4 Р***<0,05

*** 32-34 недели 31 5,89±0,66 9 29,03 31 394±30,1 р*<0,001

35-36 недель 48 4,48±0,48 12 25 48 368±34,1 р**<0,05

Всего 93 25 93 -

* Кровь здоровых доношенных новорожденных 52 - 52 100 109,7±4,4

Обнаружены различия по частоте выявляемое™ НЬР в гестационных группах (табл. 7) в зависимости от концентрации. В группе с ГВ 28-34 недели превалировала частота выявления НЬР на уровне 5-10 мг/л, а в группе с ГВ 35-36 недель лишь на уровне 2,5 мг, что может служить показателем зрелости и адаптационных возможностей плода к внеутробному существованию.

В связи с этим было проведено сопоставление средних концентраций НЬР в крови у недоношенных и особенностей течения раннего неонатапь-ного периода. Обоснованным представлялось изучение связи содержания НЬР в крови детей с различными проявлениями гипоксии ЦНС. Для этого мы исследовали 78 образцов венозной крови новорожденных, взятой в первые сутки жизни.

Таблица 7

Зависимость частоты выявления НЬР от его концентрации

в крови недоношенных новорожденных

Кровь недоношенных п Частота выявления НЬР ( %)

новорожденных при концентрации в мг/л

2-3 5 10 15

28-31 недели 14 14,29 28,57 28,57 0,00

32-34 недели 31 9,68 19,35 32,26 9,68

28 - 34 недели 45 11,11 22,22 31,11 6,67

35-36 недель 48 29,17 20,83 20,83 4,17

28-36 недель 93 20,43 21.51 25,81 5,38

Так, при гипоксически-ишемическом поражении ЦНС средние концентрации НЬР почти в 2 раза были ниже, чем при более тяжелой патологии - гипоксически-геморрагическом поражении ЦНС, причем самая высокая концентрация 15 мг/л была обнаружена при ВЖК Ш-1У степени.

При исследовании уровня НЬР в крови недоношенных новорожденных детей (ГВ 28-34 недели) с различными формами гипоксического поражения ЦНС выявлена наиболее высокая концентрация при гипоксически-ишемическом поражении ЦНС - 476,2±18,4 мг/л, что в 1,47 раза превышает продукцию фетапьного гемоглобина при гипоксически-геморрагическом поражении.

Следовательно, изменение уровней НЬР и НЬР, с одной стороны, может отражать степень зрелости новорожденного, с другой стороны, являться критерием оценки развития гипоксических состояний. Последний факт требует дальнейших детальных исследований для формирования практических рекомендаций.

ВЫВОДЫ:

1. Установлено, что антенатальные типы гемоглобинов (НЬР, НЬР) отличаются по показателям относительной электрофоретической подвижности в агарозе и ПААГ, изоэлектрической точки, устойчивости к действию щелочей. Причем, НЬР обладает менее выраженной щелочной резистентностью, чем НЬР.

2. Разработан способ выделения и очистки НЬР и модифицирован алгоритм получения НЬР на основе выявленных физико-химических особенностей изученных типов гемоглобина, в результате которых получены препараты достаточной степени чистоты для последующего использования их в качестве антигенов при иммунизации лабораторных животных.

3. Показана возможность использования смоделированных иммунохими-ческих тест-систем на НЬР и НЬР для качественного и количественного анализа их продукции в биологических объектах. В качестве тест-антигенов при иммунодиффузии по Оухтерлони использованы очищенный препарат НЬР или экстракт эмбриональных тканей, стандартом в радиальной иммунодиффузии по Манчини и ракетном иммуноэлектро-форезе по Лоурелю - выделенный из пуповинной крови новорожденных НЬР.

4. Определенная иммунохимическим тестированием динамика продукции эмбрионального НЬ в период 4-12 недель гестации совпадает с литературными данными. Его максимальная концентрация наблюдалась в 5 недель, однако некоторые авторы указывают на 8 недель гестации. Изменения концентрации НЬР и НЬР с 5 по 12 недели имеют разнонаправленный характер.

5. Выявлено достоверное различие частоты выявления НЬР на уровне 5-10 мг/л в группе недоношенных детей с ГВ 28-34 недели (в 1,5 раза выше) по сравнению с группой гестационного возраста 35-36 недель. Уровень

HbF у недоношенных детей с ГВ 28-31 недели в 3,8 раза, ГВ 32-34 недели - в 3,6 раза, ГВ 35-36 недель - в 3,4 раза выше, чем в группе доношенных новорожденных детей.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Иммунохимическая идентификация НЬР и HbF является преимущественной по сравнению с рутинными методами. Количественное определение HbF можно проводить методом Манчини или иммуноэлектрофо-резом по Лоурелю с предварительной обработкой исследуемых образцов ДСН.

2. Смоделированные иммунохимические тест-системы на НЬР и HbF следует применять для выявления антенатальных типов гемоглобина в биологических образцах для оценки степени зрелости плода.

3. Результаты определения динамики продукции НЬР и HbF в онтогенезе могут быть использованы как исходные данные для дальнейшего изучения состояния эритрона при патологических состояниях.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Бисапиева P.A., Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Краморенко П.В. Разработка способа выделения эмбрионального гемоглобина и моделирование иммунохимической тест-системы на // Материалы научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». - Астрахань-Волгоград-Москва. - 2006. - С. 34-37.

2. Кривенцев Ю.А., Бисапиева P.A., Никулина Д.М., Краморенко П.В., Семенова Т.Б. Иммунохимический анализ продукции эмбрионального гемоглобина в раннем эмбриогенезе человека // Материалы научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». - Астрахань-Волгоград-Москва. - 2006. - С. 58-62.

3. Кривенцев Ю.А., Бисапиева P.A., Ковалева H.A., Лада Л.В. Получение специфической антисыворотки на фетальный гемоглобин // Материалы научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». -Астрахань-Волгоград-Москва. - 2006. - С. 62-65.

4. Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисалиева P.A., Пичугина H.A. Разработка способа количественного определения фетального гемоглобина человека // Материалы научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». - Астрахань-Волгоград-Москва. - 2006. - С. 65-68.

5. Никулина Д.М., Кривенцев Ю.А., Бахмутова J1.A., Бисалиева P.A., Ште-по М.В., Лапеко C.B. Определение эмбрионального гемоглобина в крови новорожденных с внутриутробной гипоксией // Материалы научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». - Астрахань-Волгоград-Москва. - 2006. - С. 72-73.

6. Кривенцев Ю.А., Бисалиева P.A., Носков И.А. Изучение воздействия детергентов на эмбриональный гемоглобин // Вестник Астраханского государственного технического университета. - 2006. - №6. - Т. 35. - С. 69-72.

*7. Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисалиева P.A. Иммунохимический анализ концентрации фетального гемоглобина в крови новорожденных мальчиков и девочек с внутриутробной гипоксией // Омский научный вестник. - 2006. - №9. - Т.46. - С. 272-274.

*8. Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисалиева P.A., Борисова Н.В. Иммунохимический анализ содержания эмбрионального гемоглобина в крови больных с онкогематологической патологией // Омский научный вестник. -2006.-№8-1.-С. 279-281.

9. Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисалиева P.A., Борисова Н.В. Экспрессия Е-гена эмбрионального гемоглобина при гематологической патологии // Успехи современного естествознания. - М. - 2007. - №3. - С. 7275.

10. Кривенцев Ю.А., Бисалиева P.A., Семенова Т.Б., Никулина Д.М., Кра-моренко П.В. Изучение относительной электрофоретической подвижности анте- и постнатальных типов гемоглобина человека // Астраханский медицинский журнал. - 2007. - Т. 2. - №2. - С. 102.

11. Никулина Д.М., Кривенцев Ю.А., Бахмутова Л.А., Бисалиева P.A., Лапеко C.B., Штепо М.В., Огуль Л.А. Фетальный и эмбриональный типы гемоглобина в крови новорожденных с внутриутробной гипоксией // Астраханский медицинский журнал. - 2007. - Т. 2. - №2. - С. 132-133.

12. Бисалиева P.A., Кривенцев Ю.А., Яблокова И.Ю., Ким И.В., Вафина P.A. Изучение подходов к выделению и очистке эмбрионального гемоглобина // Материалы конференции молодых ученых АГМА. - 2007. - С. 3031.

13. Кико Е.Е., Бисалиева P.A., Кривенцев Ю.А., Ким И.В., Яблокова И.Ю., Вафина P.A. Иммунохимическое определение эмбрионального гемоглобина у больных гемобластозами // Материалы VI Всероссийской конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной онкологии». - М.: НИА-Природа 2007. - С. 107-109.

14. Кривенцев Ю.А., Никулина Д.M., Бисапиева P.A. Способ количественного определения фетапьного гемоглобина человека. Патент № 2310204 РФ (7 с.).- Приоритет от 13.03.2006,- Опубл. 10.11.2007,- БИ №31 (III ч.).

15. Бисапиева P.A., Кривенцев Ю.А., Краморенко П.В. Иммунохимический анализ продукции фетального гемоглобина в раннем эмбриогенезе человека // Материалы конференции молодых ученых ГОУ ВПО «АГМА Росзд-рава». - Астрахань. - 2008. - С. 4-6.

16. Бисапиева P.A., Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Краморенко П.В., Дьячкова Т.Б. Иммунохимический анализ продукции антенатальных гемо-глобинов в раннем эмбриогенезе человека // Российский иммунологический журнал (РАН). - М. «Наука». - 2008. - Т.2 ( 11), № 2-3. - С. 327.

17. Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисалиева P.A. Моделирование нового способа определения плодового гемоглобина человека // Астраханский медицинский журнал. - Астрахань. - 2008. - Т. 3. - №2. - С. 53-55.

18. Кривенцев Ю.А., Бисалиева P.A., [Батуев ДХ\|, Яблокова И.Ю., Вафина P.A., Мустафаев И.М.-А. Пополнение сведений по физико-химическим свойствам гемоглобина типов: А|, А2, F и Р // Астраханский медицинский журнал. - 2008. - Т. 3. - №3. - С. 20-22.

19. Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Закпякова JI.B., Бисапиева P.A., Борисова Н.В., Кико Е.Е., Ким И.В. Иммунохимический тест на антенатальные гемоглобины в гематологии // Астраханский медицинский журнал. -2008. - Т. 3. - №3. - С. 106-110.

20. Никулина Д.М., Кривенцев Ю.А., Бисалиева P.A. Иммунохимический тест на примитивный гемоглобин: перспективы внедрения // Астраханский медицинский журнал. - 2008. - Т. 3. - №3. - С. 185-188.

21. Бисалиева P.A., Штепо М.В., Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М. Железосодержащие белки в крови новорожденных с внутриутробной гипоксией // «Молодь - медицин! майбутнього»: м1жнародна наукова конференшя студентт та молодих вчених, присвячена 150-р1ччю з дня народження проф. М.Ф. Гамалеь 23-24 кв1тня 2009 року: тези доповщей. - Одесса: Одес. Держ. Мед.ун-т, 2009. - С. 71.

22. Кривенцев Ю.А., Бисалиева P.A., Никулина Д.М., Носков И.А. Разработка оптимального алгоритма для создания иммунохимической тест-системы на примитивный гемоглобин человека // Вестник Российской военно-медицинской академии.- Приложение (часть II). - 2009. - №1 (25). -С. 450.

23. Никулина Д.М., Кривенцев Ю.А., Бахмутова Л.А., Бисалиева P.A., Ла-пеко C.B. Эмбриональный гемоглобин как критерий оценки гипоксии новорожденных // Вестник Российской военно-медицинской академии,- Приложение (часть II). - 2009. - №1 (25). - С. 450-451.

24. Бахмутова Л.А., Кривенцев (O.A., Никулина Д.М., Лапеко C.B., Бисалиева P.A. Антенатальные гемоглобины в оценке течения раннего неона-тального периода у новорожденных с задержкой внутриутробного разви-

тия // Вестник Российской военно-медицинской академии.- Приложение (часть II). - 2009. - №1 (25). - С. 451.

* - работа, опубликована в журнале, включенном ВАК в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

НЬ - гемоглобин

НЬР - эмбриональный или примитивный гемоглобин

НЬР-фетапьный гемоглобин

НЬА - взрослый гемоглобин

Аг-антиген, иммуноген

Ас - антисыворотка

ПК - пуповинная кровь

ГВ - гестационный возраст

ОЭП - относительная электрофоретическая подвижность

ПААГ - полиакриламидный гель

р1 - изоэлектрическая точка

РИД - радиальная иммунодиффузия

ИДА - иммунонодиффузионный анализ

ДСН - додецилсульфат натрия

ЦНС - центральная нервная система

ВЖК - внутрижелудочковое кровозлияние

Бисалиева Рината Альбкалиевна

ИММУНОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЭМБРИОНАЛЬНОГО И ФЕТАЛЫЮГО ГЕМОГЛОБИНОВ МЛ РАННИХ ЭТАПАХ ОНТОГЕНЕЗА

03.00.04 - Биохимии

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Заказ № 1921. Тираж 100 экз. Уч.-изд. л. 1,6. Усл. печ. л. 1,5. Оттиражировано в Издательском доме «Астраханский университет» 414056. г. Астрахань, ул. Татищева, 20 факс (8512) 25-17-18, тел. (8512) 54-01-87, 54-01 -89; Г-таМ: asupress@yandex.ru

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Бисалиева, Рината Альбкалиевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 Структурная и функциональная гетерогенность гемоглобина обзор литературы).

1.1. Номенклатура и эволюция гемоглобинов.

1.2. Основные этапы и регуляция кроветворения у человека.

1.3. Структурно-функциональные и физико-химические разли- 20 чия типов гемоглобина.

1.4. Клинико-диагностическое значение определения гемоглобинов.

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Характеристика и объем материала исследования.

2.2. Лабораторные методы исследований.

2.2.1. Биохимические методы.

2.2.2. Иммунохимические методы.

2.3. Статистические методы.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

ГЛАВА 3 Уточнение физико-химических свойств, выделение и очист- 55 ка онтогенетических типов гемоглобина.

3.1. Сравнительная физико-химическая характеристика эмбрио- 55 нального (НЬР), фетального (HbF) гемоглобинов с гемогло-бинами взрослого типа (HbAi, НЪА2).

3.2. Разработка оптимальных способов выделения и очистки 63 НЬР и HbF.

ГЛАВА 4 Иммунохимическое изучение эмбрионального и фетального гемоглобинов.

4.1. Моделирование иммунохимических тест-систем на НЬР и

4.2. Разработка способов количественного определения феталь- 77 ного гемоглобина.

ГЛАВА 5 Иммунохимическое изучение продукции антенатальных ге- 83 моглобинов в ранних периодах пренатального и постна-тального онтогенеза.

5.1. Иммунохимическое определение продукции антенатальных 83 гемоглобинов в эмбриогенезе.

5.2. Иммунохимическое определение продукции антенатальных 85 гемоглобинов в раннем постнатальном онтогенезе.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Иммунохимическое изучение эмбрионального и фетального гемоглобинов на ранних этапах онтогенеза"

Актуальность работы. Исследования процесса внутриутробного развития человека представителями различных специальностей в течение длительного времени не снизили актуальности этой проблемы [9, 77, 78]. Появление современных технологий позволяет изучать и детализировать на новом уровне условия и факторы, влияющие на развитие плода [69].

В результате дифференциальной активности генов в процессе онтогенеза изменяется качественный набор белков. С этой точки зрения хрестоматийным примером является гетерогенная система гемоглобина, определяемая цепями глобина (а Р, у, s), соотношение которых в крови существенно изменяется в процессе индивидуального развития организма, а также при различных патологических состояниях. Субъединицы глобина, являющиеся продуктами активности структурных генов, при различных сочетаниях между собой определяют тип гемоглобина: эмбриональный (НЬР) — a 2S2 (£4); Фатальный (HbF) — (Х2У2; взрослый (НЬА) — а2Рг- Поэтапная смена данных типов гемоглобина обусловлена изменением гомеостатических условий организма в процессе онтогенеза с преимущественным функционированием более приспособленного к этим условиям типа НЬ [110, 111, 118].

Особый интерес представляет изучение антенатальных гемоглобинов: эмбрионального и фетального, являющихся основными типами во внутриутробном периоде развития человека. Несмотря на значительное число работ, посвященных изучению разных типов гемоглобинов в онтогенезе и при патологии, в литературе описаны лишь некоторые физико-химические свойства фетального типа гемоглобина, которые носят противоречивый характер, и практически нет данных по эмбриональному гемоглобину. Определена клинико-диагностическая ценность фетального гемоглобина при ряде патологических состояний, сопровождающихся перестройками интенсивности кроветворения и оксигенации тканей [2, 3, 4, 6, 7, 33, 58, 80]. В последнее время появились сведения об использовании HbF в качестве «индикатора» процесса развития некоторых онкологических заболеваний человека [182]. Прикладная значимость эмбрионального гемоглобина до сих пор остается не изученной, что связано с устоявшимся мнением об отсутствии у этого белка диагностической ценности, так как активность его гена полностью репрессирована как у детей, так и у взрослых. Хотя в литературе имеются единичные сведения о возобновлении синтеза этого белка у недоношенных детей с аномалиями развития [75]. Следует отметить, что в доступной литературе мы не нашли работ по иммунохимическому изучению продукции этих белков в онтогенезе. Поэтому исследования в этом направлении антенатальных типов гемоглобина позволят открыть иные стороны, как теоретических знаний, так и клинического применения гемоглобинов. В этой связи представленная работа является актуальной и имеет важное научное и практическое значение.

Цель исследования:

Получить новые данные о свойствах, динамике синтеза на ранних этапах анте- и постнатального онтогенеза и возможном клиническом использовании эмбрионального и фетального типов гемоглобина.

Задачи исследования:

1. Определить и уточнить физико-химические свойства эмбрионального и фетального типов гемоглобина.

3. Смоделировать моноспецифические иммунодиффузионные тест-системы на эмбриональный и фетальный гемоглобины.

4. Определить уровень НЬР и HbF в различные сроки анте- и постнатального онтогенеза человека, в том числе при осложненном развитии плода.

Новизна исследования:

1. Впервые разработан алгоритм выделения и очистки эмбрионального гемоглобина.

2. Впервые получена и апробирована иммунохимическая тест-система на эмбриональный гемоглобин.

3. Разработан способ количественного определения фетального гемоглобина.

4. Проведен количественный иммунохимический анализ динамики продукции эмбрионального и фетального гемоглобинов на ранних этапах анте- и постнатального онтогенеза человека и установлены особенности их синтеза при осложненном развитии плода.

Научно-практическая значимость

Разработанный метод выделения и очистки эмбрионального гемоглобина и модифицированный метод выделения и очистки фетального гемоглобина позволяют экономить исходный биоматериал, реактивы, временные и финансовые ресурсы. Полученные белковые препараты НЬ могут быть использованы для научных исследований и для практического применения.

Результаты изучения биосинтеза эмбрионального и фетального гемоглобинов в онтогенезе могут служить основой для дальнейших исследований, в ходе которых будут разработаны алгоритмы оценки состояния эритрона при различной патологии.

Выявленные у недоношенных детей качественные и количественные изменения гемоглобинового спектра могут быть использованы в качестве маркера степени зрелости и оценки тяжести гипоксии новорожденных.

Внедрение в практику

Результаты работы используются при обучении студентов, интернов, ординаторов, аспирантов и слушателей курсов ФПО на кафедрах биохимии с курсом клинической лабораторной диагностики, сестринского дела и ухода за больными с курсом перинатологии, педиатрии лечебного факультета ГОУ ВПО АГМА Росздрава.

Разработанные иммунохимические тест-системы на эмбриональный и феталь-ный гемоглобины используются для оценки состояния новорожденных детей в МУЗ «Клинический родильный дом» г. Астрахани.

В 2007 и 2008 годах новые способы и иммунохимические тест-системы для лабораторной оценки состояния новорожденных, включавшие результаты данного исследования, были удостоены 2 золотых медалей на VII и VIII Московских международных салонах инноваций и инвестиций. В 2007 году инвестиционный проект «Новые иммунохимические тест-системы для лабораторной диагностики осложненного течения беременности, гипоксии и деструктивных процессов» был представлен на выставке: «Инновационные достижения России» XI Петербургского международного экономического форума.

Основные положения, выносимые на защиту

2. Смоделированные иммунохимические тест-системы на НЬР и HbF для качественного и количественного анализа их продукции в биологических объектах позволили уточнить динамику изменений концентрации НЬР и HbF на этапах развития эмбриона и плода, выражающейся в разнонаправленном характере с 5 по 12 недели гестации.

3. Уровни НЬР и HbF у недоношенных детей зависят от гестационного возраста и особенностей течения неонатального периода и могут служить маркером степени зрелости плода, тяжести внутриутробной гипоксии.

Апробация работы:

Материалы диссертации доложены и обсуждены на научных заседаниях кафедры биологической химии с курсом клинической лабораторной диагностики ГОУ

ВПО АГМА Росздрава, на проблемных комиссиях ГОУ ВПО АГМА Росздрава, на итоговых и тематических конференциях ГОУ ВПО АГМА Росздрава; на 5-й и 6-й научно-практических конференциях с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины», Астрахань-Москва, 2006,2008; на международной научной конференции, посвященной 450-летию города Астрахани, Астрахань, 2007; на международной научной конференции «Молодежь -медицине будущего», Одесса, 2009.

По теме диссертации опубликовано 24 научные работы, из них 2 в журналах, рекомендованных ВАК для публикации результатов, полученных при выполнении диссертаций на соискание ученой степени кандидата медицинских наук, получен 1 патент на изобретение.

Структура и объем диссертации:

Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, методического раздела, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, приложения. Библиография включает в себя 127 отечественных и 56 зарубежных источников. Иллюстрированный материал представлен 17 таблицами, 20 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Бисалиева, Рината Альбкалиевна

выводы

1. Установлено, что антенатальные типы гемоглобинов (НЬР, HbF) отличаются по показателям относительной электрофоретической подвижности в агарозе и ПААГ, изоэлектрической точки, устойчивости к действию щелочей. Причем, НЬР обладает менее выраженной щелочной резистентностью, чем HbF.

2. Разработан способ выделения и очистки НЬР и модифицирован алгоритм получения HbF на основе выявленных физико-химических особенностей изученных типов гемоглобина, в результате которых получены препараты достаточной степени чистоты для последующего использования их в качестве антигенов при иммунизации лабораторных животных.

3. Показана возможность использования смоделированных иммунохими-ческих тест-систем на НЬР и HbF для качественного и количественного анализа их продукции в биологических объектах. В качестве тест-антигенов при иммунодиффузии по Оухтерлони использованы очищенный препарат НЬР или экстракт эмбриональных тканей, стандартом в радиальной иммунодиффузии по Манчини и ракетном иммуноэлектрофорезе по Лоурелю - выделенный из пуповинной крови новорожденных HbF.

4. Определенная иммунохимическим тестированием динамика продукции эмбрионального НЬ в период 4-12 недель гестации совпадает с литературными данными. Его максимальная концентрация наблюдалась в 5 недель, однако некоторые авторы указывают на 8 недель гестации. Изменения концентрации НЬР и HbF с 5 по 12 недели имеют разнонаправленный характер.

5. Выявлено достоверное различие частоты выявления НЬР на уровне 510 мг/л в группе недоношенных детей с ГВ 28-34 недели (в 1,5 раза выше) по сравнению с группой гестационного возраста 35-36 недель. Уровень HbF у недоношенных детей с ГВ 28-31 недели в 3,8 раза, ГВ 32-34 недели - в 3,6 раза, ГВ 35-36 недель — в 3,4 раза выше, чем в группе доношенных новорожденных детей.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Иммунохимическая идентификация НЬР и HbF является преимущественной по сравнению с рутинными методами. Количественное определение HbF можно проводить методом Манчини или иммуноэлектрофорезом по Лоурелю с предварительной обработкой исследуемых образцов ДСН.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Бисалиева, Рината Альбкалиевна, Краснодар

1. Авдеева, Н.А. Оценка методов определения концентрации гемоглобина, применяемых в клинико-диагностических лабораториях / Н.А. Авдеева // Лабораторное дело. 1987. №10. С. 786 788.

2. Агапова, А.Б. Клинико-диагностическое значение определения фетального гемоглобина у больных при некоторых заболеваниях, сопровождающихся гипоксией // Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. — Астрахань, 2003.

3. Агапова, А.Б. Фетальный гемоглобин у больных хронической ишемиче-ской болезнью сердца / А.Б. Агапова, О.Н. Дьякова, Т.Н. Панова // Естественные науки. 2003. № 7. С. 42 47.

4. Агапова, А.Б. Фетальный гемоглобин как тест для диагностики гипоксиче-ских состояний / А.Б. Агапова, Д.М. Никулина, О.Н. Дьякова, Ю.А. Кривенцев, И.Ю. Корноухова // Материалы III съезда биохимического общества РАН. С-Пб, 2002. С. 131.

5. Агапова, А.Б. Сравнительная оценка продукции фетального гемоглобина в зависимости от патогенетических механизмов при хронической ишемиче-ской болезни сердца и хронической обструктивной болезни легких / А.Б.

6. Агапова, Д.М. Никулина, Т.Н. Панова // Материалы 3-й научной конференции и школы-семинара для молодых ученых «Белки-маркеры патологических состояний». Астрахань-Москва, 2003. С. 50 - 56.

7. Алексеев, Н.А. Анемии. СПб.: Гиппократ, 2004. 512 с.

8. Алексеев, И.В. Развитие системы кроветворения у плода человека / И.В. Алексеев, И.В. Замараева, Е.Б. Владимирская, Н.А. Курмашева // Гематология и трансфузиология 1995. Т. 40. № 5. С. 26 29.

9. Аномальные гемоглобины человека (Россия, Средняя Азия, Закавказье): Справочное пособие. Благотворительный фонд "Гематология и интенсивная терапия" в помощь практическому врачу / Под ред. Е.А Асеева.- М.: Медицина, 1993.-32 с.

10. Антитела. Методы в 2 т. / Под ред. Д. Кэтти. М.: Мир, 1991. Т. 1. - 287с.

11. Антоненко, В.Т. Особенности кислородсвязывающей функции фетального гемоглобина / В.Т. Антоненко, Ю.Н. Королев // Гематология и трансфузиология 1983. Т. 28. №5. С. 61 64.

12. Аршава, В.П. Фетальный гемоглобин при сердечно-сосудистой патологии / В.П. Аршава // Терапевтический архив. 1973. Т. 45. №11. С. 53 56.

13. Аскерова, Т.А. Оценка способа определения количества гликированного гемоглобина изоэлектрофокусированием / Т.А. Аскерова // Клиническая лабораторная диагностика 2001. №2. С. 12 15.

14. Асланова, Н.К. Некоторые эритроцитарные показатели у больных хронической гипоксией различного генеза / Н.К. Асланова // Клиническая медицина 1991. №4. С. 56-58.

15. Блюменфельд, Л.А. Гемоглобин / Л.А. Блюменфельд // Соросовский образовательный журнал. 1998. № 4. С. 33 38.

16. Борисюк, М.В. Функциональная система транспорта кислорода и ее адаптивные способности / М.В. Борисюк // Сборник научных трудов «Система транспорта кислорода в норме и патологии». — Гродно, 1984. С. 8 14.

17. Василевский, М.Г. О фетальных эритроцитах в периферической крови матери / М.Г. Василевский // Здравоохранение Казахстана. 1979. № 5. С. 62 -65.

18. Василенко, A.M. Максимальное потребление кислорода как критерий устойчивости человека к гипоксии, гипертермии и гипотермии / A.M. Василенко // Космическая биология и авиакосмическая медицина. 1980. Т. 14. №6. С. 3-10.

19. Виллиг, Т.Н. Анемия Даймонда-Блекфена: современные проблемы / Т.Н. Виллиг, С.Е. Болл, Ж. Тчерниа // Гематология и трансфузиология. 1998. Т. 43. №3. С. 15 18.

20. Гааль, Э. Электрофорез в разделении биохимических макромолекул / Э. Гааль, Г. Медьеши, JI. Верецки М., 1982. - 446 с.

21. Гаджиев, О.Г. Определение содержания фетального гемоглобина в образцах из капиллярной крови / О.Г. Гаджиев, Р.Ш. Рустамов // Лабораторное дело. 1988. С. 34 37.

22. Гланц, С. Медико-биологическая статистика. Пер. с англ. / Гланц С. М. «Практика». 1999. 459 с.

23. Горохова, В.Г. Исследование состава белково-пептидного комплекса фетальных тканей человека и ювенильных тканей кролика / В.Г. Горохова, Э.Э. Кузнецова, А.Г. Горохов, А.А. Рунович // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2004. №4. С. 423 425.

24. Гриценко, В.В. Определение свободного гемоглобина в сыворотке крови реактивом азопираму больных после протезирования аортального клапана /

25. B.В. Гриценко, В.В. Давыденко, П.И. Орловский, Л.М. Мягкова, М.Г. Скоро-богатых // Лабораторное дело. 1988. №7. С. 34 37.

26. Громов, П.С. Изучение белков мембран эритроцитов человека методом двумерного электрофореза / П.С. Громов, A.M. Шандала, Л.И. Ковалев, С.С. Шишкин // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1986. №7.1. C. 28 30.

27. Гуторанов, В.Г. Модификация метода определения концентрации гемоглобина в крови / В.Г. Гуторанов // Лабораторное дело. 1983. №2. С. 9 11.

28. Данилова, JI.A. Идентификация компонентов гемоглобина, получаемых при электрофорезе в геле агара / JI.A. Данилова // Лабораторное дело. 1976. №9. С. 531 -534.

29. Данилов, И.П. Содержание фетального гемоглобина у детей, проживающих на загрязненных радионуклидами территориях / И.П. Данилов, Л.Я. Крылова // Здравоохранение Беларуси. 1992. №5. С. 8-11.

30. Делекторская, Л.Н. Оценка диагностической информативности лабораторных тестов (методические рекомендации) / Л.Н. Делекторская, Л.М. Пи-менова, О.Г. Кадашева // Клиническая лабораторная диагностика. 1992. №1/2. С. 49 59.

31. Дергунов, А.В. Методические рекомендации по экспресс-диагностике скрытых форм недостаточности кровообращения, дыхания и их сочетания у военнослужащих перед выходом в горы / А.В. Дергунов, А.К. Кадыралиев — Бишкек, 1994. 18 с.

32. Добродей, М.А. К характеристике системы транспорта кислорода у больных ишемической болезнью сердца / М.А. Добродей // Сборник научных трудов «Система транспорта кислорода в норме и патологии». Гродно, 1984. С. 23-27.

33. Дьякова, О.Н. Фетальный гемоглобин — маркер адаптации к гипоксии / О.Н. Дьякова // Белки-маркёры патологических состояний (Материалы межвузовской научной конференции молодых учёных и студентов). Москва-Астрахань: Изд-во АГМА, 1999. С. 11 - 13.

34. Дьякова, О.Н. Клинико-патогенетическое значение структурно-функциональных изменений эритроцитов у больных ишемической болезнью сердца. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук / О.Н. Дьякова АГМА, 2000.

35. Евсеенко, Д.А. Роль плаценты в регуляции фетального эритропоэза / Д.А. Евсеенко, Н.И. Цирельников // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2001. №11. С. 519 521.

36. Ермакова, Т.А. Прогностическая значимость биохимических показателей эритроцитов при наследственном дефиците Г-6-ФДГ. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук / Т.А. Ермакова -М., 1990.

37. Ермакова, Т.А. Интегральная оценка окислительно-восстановительного метаболизма эритроцитов у больных с различными формами анемий / Т.А. Ермакова, Н.В. Цветаева // Гематология и коагулология. 2003. С. 24 35.

38. Ермоленко, В.М. Эритропоэтин: биологические свойства и применение в клинической практике / В.М. Ермоленко, А.Ю. Николаев // Терапевтический архив. 1991. №6. С. 81-86.

39. Замараева, Н.В. Эритроцитарные параметры пуповинной крови новорожденных разных сроков гестации / Н.В. Замараева, Е.Б. Владимирская, М.В. Волынец и др. //Гематология и трансфузиология. 1998. Т. 43. № 2. С. 16 19.

40. Зеньков, JI.H. Сульфогемоглобинообразование при некоторых заболеваниях / JI.H. Зеньков, Г.В. Дервиз // Клиническая медицина 1980. № 11. С. 78 -81.

41. Зорина, Н.В. Приобретенные гемоглобинопатии при гематологических заболеваниях / Н.В. Зорина // Проблемы гематологии и переливания крови. 1980. №2. С. 41 -46.

42. Игнатов, С.В. Система эритрона при ожогах / С.В. Игнатов // Гематология и трансфузиология. 1990. № 3. С. 22 26.

43. Идельсон, Л.И. и др. Второй случай носительства НЬ Такома в Москве / Л.И. Идельсон, Т.П. Молчанова, Е.А.Асеева и др. // Гематология и трансфузиология. 1987. № 9. С. 45 46.

44. Иржак, Л.И. Гемоглобины и их свойства / Л.И. Иржак М.: Наука, 1975. -240 с.

45. Иржак, Л.И. Гемоглобины и их свойства. / Л.И. Иржак М.: Наука, 1983. - 150 с.

46. Иржак, Л.И. Дыхательная функция крови в условиях гипероксии / Л.И. Иржак, В.В. Гладилов, Н.А. Моисеенко М.: Медицина, 1985. - 176 с.

47. Казанец, Е.Г. Наследственные цианозы, обусловленные присутствием в крови аномальных НЬ группы М: выявление, идентификация, свойства / Е.Г. Казанец, А.П. Андреева, С.В. Хангулов, Ю.Н. Токарев // Гематология и трансфузиология. 1990. № 3. С. 9 13.

48. Казеннов, A.M. Влияние мембранного скелета безъядерных эритроцитов на свойства транспортных АТФаз / A.M. Казеннов, М.Н. Маслова // Цитология. 1991. Т. 33. №11. С.32 41.

49. Камышников, B.C. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике: в 2 т. / B.C. Камышников. Мн., Беларусь, 2002. Т.1. - 254 с.

50. Камышников, B.C. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике: в 2 т. / B.C. Камышников Мн., Беларусь, 2002. Т.2. - 318 с.

51. Карпова, И.В. Кислородтранспортная активность гемоглобина при лим-фосаркомах / И.В. Карпова, М.Г. Дмитриева, А.В. Пивник, Е.Е. Зыбунова, И.Н. Луценко // Гематология и трансфузиология. 1995. Т. 40. №6. С. 10 14.

52. Кассирский, И.А. Клиническая гематология / И.А. Кассирский, Г.А. Алексеев —М.: Издательство «Медицина», 1970. 799 с.

53. Клиническая лабораторная аналитика в пяти томах под общей редакцией В.В. Меньшикова / T.I. М. Агат-Мед. 2002. 297 с.

54. Ковалева, Л.Г. и др. Современное состояние диагностики наследственных гемоглобино- и энзимопатий / Л.Г. Ковалева, Ю.Н. Токарев, А.Р. Еремьянц и др. //Гематология и трансфузиология. 1987. № 9. С. 3 6.

55. Козинец, Г.И. и др. Исследование фетального гемоглобина в эритороци-тах больных анемиями различного генеза / Г.И. Козинец и др. // Проблемы гематологии и переливания крови. 1980. Т.25. № 6. С. 33 37.

56. Королев, В.А. и др. Анализ колориметрического метода определения гли-килированного гемоглобина / В.А. Королев и др. // Клиническая лабораторная диагностика. 2001. №12. С.12 14.

57. Королев, В.А. Метод изоэлектрофокусирования и фотоколориметрия для определения гемоглобина А.с / В.А.Королев, В.И. Молчанов // Биомедицинская химия. 2006. Т.52. Вып.2. С.113 222.

58. Кулиев, A.M. и др. Первый случай пренатальной диагностики серповид-ноклеточной анемии в СССР / A.M. Кулиев, О.Л. Мазурова, В.Б. Бирюков и др. // Гематология и трансфузиология. 1990. № 3. С. 8 9.

59. Лабораторные методы исследования в клинике / Под редакцией В.В. Меньшикова. — М.: «Медицина», 1987. 368 с.

60. Лопатина, Н.И. Определение фетального гемоглобина в крови с помощью фотоэлектроколориметра / Н.И. Лопатина, А.Л. Геронимус, Е.П. Трепестова // Лабораторное дело. 1976. № 6. С. 328 331.

61. Лосева, М.И. Некоторые особенности поражения эритрона матери и плода при поздних токсикозах беременности / М.И. Лосева, Н.М. Пасман, М.К. Соболева и др. // Гематология и трансфузиология. 1984. № 9. С. 44 48.

62. Лукьяненко, А.В. и др. Выбор ДНК-зондов для анализа полиморфизма глобинового кластера у больных талассемией / А.В. Лукьяненко и др. // Гематология и трансфузиология. 1987. № 12. С. 22 25.

63. Макешова, А.Б. Особенности регуляции эритропоэза у жителей высокогорья / А.Б. Макешова, А.А. Левина, Ю.И. Мамукова, А.Р. Раимжанов // Терапевтический архив.2004. №11. С. 95.

64. Маурер, Г. Диск-электрофорез: (Теория и практика электрофореза в поли-акриламидном геле) / Г. Маурер М.: Мир, 1971. — 250 с.

65. Медицинская лабораторная диагностика (программы и алгоритмы): справочник / Под ред. А.И. Карпищенко. СПб.: Интермедика, 2001. - 544 с.

66. Михайлов, А.Т. Эмбриональные индукторы / А.Т. Михайлов. М.: Наука, 1988.-216 с.

67. Михайлова, Е.И. Онкомаркеры в кале в диагностике колоректального рака / Е.И. Михайлова, С.И. Пимонов, Е.В. Воропаев // Клиническая медицина: научно-практический журнал. 2007. Т. 85. №12. С. 62-67.

68. Морщакова, Е.Ф. Эритропоэз и его регуляция в эмбриональном, феталь-ном и неонатальном периодах / Е.Ф. Морщакова, А.Д. Павлов, А.Г. Румянцев // Российский вестник перинатологии и педиатрии. 1999. № 3. С. 12 16.

69. Мышкин, А.Е. Феррицианидный способ тестирования препаратов гемоглобина / А.Е. Мышкин, Л.Д. Богданова // Гематология и трансфузиология. 1990. №9. С. 33-35.

70. Назаров, С.Б. Закономерности развития эритрона белых крыс в прена-тальном и раннем постнатальном онтогенезе. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук /С.Б. Назаров Иваново, 1995.

71. Назаров, С.Б. Системный подход к изучению физиологии эритрона и его реализация в онтогенетических исследованиях / С.Б. Назаров, Л.С. Горожанин // Вестник Ивановской медицинской академии. 1996. Т.1. №3-4. С. 30 -37.

72. Никулина, ДМ. Практическое освоение иммунохимических методов. Метод. Рекомендации / Д.М.Никулина Астрахань, 1991. - 36 с.

73. Остерман, JI.A. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие) / JI.A. Остерман. М.: Наука, 1981. - 288 с.

74. Остерман, JI.A. Использование биологических макромолекул электрофо-кусированным иммунофорезом и радиоизотопным методами. / JI.A. Остерман -М.: Медицина, 1983. 304 с.

75. Остерман, JI.A. Хроматография белков и нуклеиновых кислот / JI.A. Остерман М., Наука. - 1985. - 536 с.

76. Павлов, А.Д. Молекулярная структура регуляции эритрона / А.Д. Павлов // Гематология и трансфузиология. 1988. № 4. С. 12 15.

77. Павлов, А.Д. Регуляция эритропоэза: Физиологические и клинические аспекты / А.Д. Павлов, Е.Ф. Морщакова. М.: Медицина, 1987. - 272 с.

78. Павлов, А.Д. Синдром неадекватной продукции эритропоэтина при анемии / А.Д. Павлов, Е.Ф. Морщакова // Гематология и трансфузиология. 1999. Т. 44. №3. С. 30-32.

79. Павлов, А.Д. Эритропоэтин: молекулярно-генетические и клинические аспекты / А.Д. Павлов, Е.Ф. Морщакова // Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии. 2007. Т. 6. №2. С. 30-38.

80. Павлов, А.Д. Регуляция эритропоэза: онтогенетические аспекты / А.Д. Павлов, Е.Ф. Морщакова, А.Г. Румянцев // Гематология и трансфузиология. 1999. Т. 44. №6. С. 62.

81. Павлов, А.Д. Эритропоэтин: новые аспекты и перспективы / А.Д. Павлов, А.Г. Румянцев // Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии. 2008. Т.7. №2. С 5-7.

82. Пасман, Н.М. Показатели фетального гемоглобина при беременности, осложненной поздним токсикозом // Перинатальная охрана плода у женщин Сибирского региона: Сб. статей / Под ред. Н.В.Анастасьевой Новосибирск, 1988. С. 40-43.

83. Постников, Ю.В. Пренатальная диагностика наследственных гемоглоби-нопатий / Ю.В. Постников, Ю.Н. Токарев // Гематология и трансфузиология. 1988. № 1.С. 39-44.

84. Приндулл, Г. Гемопоэз в желточном мешке / Г. Приндулл // Гематология и трансфузиология. 1998. Т. 43. № 3. С. 14 15.

85. Прогонная, В.В. К оценке результатов определения фетального гемоглобина методами щелочной и кислотной денатурации при некоторых гематологических заболеваниях / В.В. Прогонная // Лабораторное дело. 1972. № 1. С. 57-58.

86. Пупкова, В.И. Определение гемоглобина в крови. Информационно-методическое пособие / В.И. Пупкова Кольцово, 2001. - 17 с.

87. Рихарт, К. Изменение состава гемоглобина у пожилых и у больных сердечно-сосудистыми заболеваниями / К. Рихарт, С.С. Ивад // Лабораторное дело. 1971. №7. С. 401 -402.

88. Румянцев, А.Г. Эритропоэтин: биологические свойства, возрастная регуляция эритропоэза, клиническое применение / А.Г. Румянцев. Изд-во: Гэо-тар-Мед ИД ООО, 2002. - 400с.

89. Румянцев, А.Г. Эритропоэтин: диагностика, профилактика и лечение анемий / А.Г. Румянцев, Е.Ф. Морщакова, А.Д. Павлов. М.: 2003 - 448 с.

90. Савельев, О.Н. Определение свободного гемоглобина плазмы крови гемо-глобинцианидным методом / О.Н. Савельев, В.П.Сухоруков, А.В. Киселева, Г.А. Королева//Лабораторное дело. 1988. №10. С.45 47.

91. Сарычева, Т.Г. Эритрон и почечная патология (обзор литературы) / Т.Г. Сарычева, Г.И. Козинец // Клиническая лабораторная диагностика. 2000. №6. С. 20 24.

92. Сарычева, Т.Г. Морфофункциональная характеристика эритрона в норме / Т.Г. Сарычева, Г.И. Козинец // Клиническая лабораторная диагностика. 2001. №5. С. 3 -8.

93. Сарычева, Т.Г. Некоторые особенности эритрона при эритремии / Т.Г. Сарычева, Е.А.Стрелецкая, Г.И. Козинец // Клиническая лабораторная диагностика. 2001. №7. С. 35 38.

94. Семенечева, Э.Б. Типы гемоглобина в норме и при воздействии на организм некоторых химических веществ. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук / Э.Б. Семенечева Киев, 1972.-53 с.

95. Сергеева, Н.А. Гликозилированный гемоглобин у больных механической желтухой неопухолевого происхождения / Н.А.Сергеева, Т.Т. Чеснокова //Клиническая медицина. 1982. № 9. с. 81-85.

96. Скоупс, Р. Методы очистки белков / Р. Скоупс. М.: «Мир», 1985. - 385 с.

97. Сметанина, Н.С. Соотношение генотипа и особенностей клинических проявлений Р-талассемии /Н.С. Сметанина, Е.Г. Казанец, Ю.Н. Токарев // Гематология и трансфузиология. 2001. Т. 46. №1. С. 31 34.

98. Сметанина, Н.С. Вторичный эритроцитоз у ребенка с артериовенозным свищом левой почки / Н.С. Сметанина, И.С. Тиганова, А.А. Масчан и др. // Гематология и трансфузиология. 2000. Т. 45. № 1. С. 37 39.

99. Сметанина, Н.С. Наследственный семейный эритроцитоз / Н.С. Сметанина, Ю.Н. Токарев, А.И. Сергеева // Гематология и трансфузиология. 1999. Т. 44. №3. С. 33 -35.

100. Справочник по лабораторным методам исследования / Под ред. JI.A. Даниловой. СПб.: Питер, 2003. - 736 с.

101. Стародуб, Н.Ф. Гетерогенная система гемоглобина. Синтез гемоглобина отдельных типов в онтогенезе и при патологии организма / Н.Ф. Стародуб, Ю.Н. Токарев // Успехи современной биологии. 1986. Т. 101. Вып. 3. С. 374 -389.

102. Стародуб, Н.Ф. Гетерогенная система гемоглобина: структура, свойства, синтез, биологическая роль / Н.Ф. Стародуб, В.И. Назаренко. АН УССР, Ин-т молекулярной биологии и генетики. Киев: Наукова думка, 1987. — 198 с.

103. Стоцкая, Г.Е. Фетальный гемоглобин у новорожденных детей в зависимости от гестационного возраста / Г.Е. Стоцкая, JI.H. Юрченко // Вопросы охраны материнства и детства. 1983. Т. 28. № 11. С. 13 15.

104. Строение и биологическая роль белков гемоглобинового профиля: Учебное пособие для студентов / Под ред. Ю.А. Кривенцева, Д.М. Никулиной. Астрахань: АГМА, 2006. - 103 с.о о

105. Тодоров, И. Клинические лабораторные исследования в педиатрии / И. Тодоров. София. Медицина и физкультура. 1968. - 1064 с.

106. Токарев, Ю.Н. Гемоглобинопатии: итоги и перспективы исследований / Ю.Н. Токарев // Гематология и трансфузиология. 1986. № 3. С. 7 11.

107. Токарев, Ю.Н. и др. Иммунохимический метод ряда гемоглобинопатий / Ю.Н. Токарев и др. // Метод, рекомендации. Баку, 1982. - 9 с.

108. Толочко, Т.А. Спектрофотометрические исследования гемоглобина и его дериватов у рабочих промышленных предприятий / Т.А. Толочко // Мед. аспекты охраны окружающей среды: Тезисы конференции. Тарту, 1986. С. 144- 146.

109. Топунов, А.Ф. Гемоглобины: эволюция, распространение и гетерогенность / А.Ф. Топунов, Н.Э. Петрова // Успехи биологической химии. 2001. Т. 41. С. 199-228.

110. Торубарова, Н.А. Эмбриональный и фетальный гемопоэз: актуальные вопросы / Н.А. Торубарова // Гематология и трансфузиология. 1991. № 5. С. 20 24.

111. Хасаев, А.Ш. Вторая семья с гемоглобином Дагестан (а 60 Лиз Глу) / А.Ш. Хасаев, И.А. Шамов, Е.А. Асеева, В.А. Спивак // Гематология и транс-фузиология. 1990. № 3. С. 6 - 7.

112. Храмкова, Н. И. Предел чувствительности метода преципитации в агаре / Н.И. Храмкова, Г.И. Абелев // Бюллетень экспериментальной биологии 1961. № 12. С. 107- 109.

113. Хуцишвили, Г.Э. Современное представление о структуре нормальных и некоторых патологических гемоглобинов / Г.Э. Хуцишвили // Лабораторное дело. 1971. № 8. С. 454 456.

114. Чертков, И.Л. Нормальное кроветворение / И.Л. Чертков // Гематология и трансфузиология. 1990. № 2. С. 30 33.

115. Чертков, И.Л. Стволовая кроветворная клетка и ее микроокружение / И.Л. Чертков, О.А. Гуревич М., Медицина, 1984 - 240 с.

116. Ширинова, Э.А. и др. Иммунохимические методы и изоэлектрофокуси-рование в диагностике важнейших гемоглобинопатий / Э.А. Ширинова и др. // Азербайджанский медицинский журнал. 2003. №5. С. 60 65.

117. Яцык, Г.В. Перспективы применения эритропоэтина в неонатологии / Г.В. Яцык, Н.Д. Одинаева // Вопросы современной педиатрии. 2001. Т.1. №5. С. 32-36.

118. Altinkaynak, S. Serum ferritin and hemoglobin levels of mothers and their newborns/ S. Altinkaynak, H. Alp, A. Bastem, M. Selimoglu, M. Energin // Turk. J. Pediatr. 1994. Oct-Dec.; 36 (4). P. 289-293.

119. Alfrey, C.P. Erythropoietin — an elusive hormone / C.P. Alfrey, S.A. Biggs // J. Lab. Clin. Med. 1981. Vol. 97. P. 141 143.

120. Alippi, R.M. Erythropoietin response to hypoxia in mice with polycythemia induced by hypoxia or transfusion / R.M. Alippi, A.C. Barcelo, C.E. Bozzini // Exp. Hematol. 1983. Vol. 97. P. 141 143.

121. Amiconi, G. Interaction of hemoglobin wish salts: effects on the functional properties of human hemoglobin /G. Amiconi, E. Antonini, M. Brunori et al. // Mol. Biol. 1981.Vol. 152. №1. P. Ill 130.

122. Andreux, J.R. Erythropoietic progenitor cells in human fetal blood / J.R. An-dreux, M. Renard, F. Dqffos, F. Forestier //Nouv. Rev. Franc. Hematol. 1991. Vol. 33. P. 223 226.

123. Bolton, W. Three dimensional fourier synthesis of horse desoxyhaemoglobin at 2,8 A resolution / W. Bolton, M.F. Perutz // Nature. 1970. Vol. 228. №.5271. P. 551 -552.

124. Braunitzer, G.R. et al. Haemoglobin-Colloquium Wien / G.R. Braunitzer et al. -Stuttgart, 1961. 15 p.

125. Bunn, H. Regulation of hemohlobin function in mammals / H. Bunn // Amer. Zool. 1980. Vol.20. №1. P.199 211.

126. Cotes, P.M. Immunoreactive erythropoietin in serum. I. Evidence for the validity of the assay method and the physiological relevance of estimates / P.M.

127. Cotes // Brit. J. Hematology. 1982. Vol. 50. P. 427 438.i

128. Cotes, P.M. Changes in serum immunoreactive erythropoietin during the menstrual cycle and normal pregnancy / P.M. Cotes, C.E. Canning // Br. J. Obstet. Gynaecol. 1983. Vol. 90. P. 304 311.

129. Dessypris, E.H. Effect of pure erythropoietin on DNA-synte-sis by human marrow day 15 erythroid burst forming units in short-term liquid culture / E.H. Dessypris, S.B. Krantz // Brit. J. Hematol. 1984. 56. P. 295 306.

130. Dickerson, R.E. Hemoglobin: Structure, Funktion, Evolution, and Pathology / R.E. Dickerson, I. Geis // Benjamin Cummpings, Menlo Park, Calif. 1982.

131. Doshkind, K. Regulation of hemopoiesis by bone marrow stromal cells and their products / K. Doshkind // Ann. Rev. Immunol. 1990. №8. P. 111 137.

132. Drysdale, J.W. The separation of human and animal hemoglobins by isoelectric separation focusing in polyacrylamide gel / J.W. Drysdale, P. Righetti, H.F. Bunn // Biochim. et biophys. acta. 1971. Vol. 229. №1. P.42 50.

133. Eckardt, K.U. The ontogeny of biological role and production of erythropoietin / K.U. Eckardt // J. Perinatal. Med. 1995. Vol. 23. P. 19 29.

134. Eckardt, K.U. Serum immunoreactive erythropoietin of children in health and disease. / K.U. Eckardt, W. Hartmann, U. Vetter et al. // Eur. J. Pediatr. 1990. Vol. 149. P. 459-464.

135. Efremov, G.D. Structural variants of human hemoglobin / G.D. Efremov // Period, biologorum. 1984. Vol. 86 №2. P. 83 94.

136. Erslev, A J. Clinical erythrokinetics: a critical review / A J. Erslev // Blood Rev. 1997. Vol. 11. P. 160 167.

137. Erslev, A J. Pure red-cell aplasia: a review / A.J. Erslev, A. Soltan // Blood Rev. 1996. Vol. 10. P.20 28.

138. Eschbach, J.W. A comparison of the responses to recombinant human erythropoietin in normal and uremic subjects / J.W. Eschbach, H.R. Haley, J.C. Egrie, J.W. Adamson // Kidney Int. 1992. Vol. 42. P. 407 416.

139. Garcia, J.F. et al. Radioimmunoassay of erythropoietin: circulating levels in normal and polycythemic human beings / J.F. Garcia, S.H. Ebbe, L. Hollander et al. // J. Lab. Clin. Med. 1982. Vol. 99. P. 624 635.

140. Goldwasser, E. Structure-function relationship of erythropoietin. In: Erythro-poietin-Molecular, Cellular and clinical Biology / Eds. A.J. Erslev, J.W. Adamson, J.W. Eschbach, C. Winnearls // Baltimore. 1991. P. 41 52.

141. Green, A.R. et al. SCL is coexpressed with GATA-1 in hematopoietic cells but is also expressed in developing brain / A.R. Green, T. Lints, J. Visvader et al. // Oncogene. 1992. №7. P. 653 660.

142. Grilli, G. Variations in erythroid and myeloid progenitor cell numbers in normal human peripheral blood / G. Grilli, F. Garbonell, T.M. Fliedner // Brit. J. Haemat. 1980. Vol. 44. P. 679 681.

143. Halleux, V. The effect of blood transfusion on the hemoglobin oxygen dissociation curve of very early preterm infants during the first week of life / V. Halleux, A. Truttmann, C. Gagnon, H. Bard // Semin. Perinatol. 2002. Vol. 26. №6. P. 411 -415.

144. Hellebostad, M. Serum immunoreactive erythropoietin in healthy normal children / M. Hellebostad, P. Haga, P.M. Cotes // Br. J. Haematol. 1988. Vol. 70. P. 247 250.

145. Howe, D.T. The influence of maternal hemoglobin and Ferritin on mid-pregnancy placental volume / D.T. Howe, T. Wheeler, C. Osmond // British. Journal of Obstetrics and Gynecology. 1995. V.102. №3. P. 213--219.

146. Huch, R. Maternal and fetal erythropoietin: physiological aspects and clinical significance / R. Huch, A. Huch // Ann. Med. 1993. Vol. 25. P. 289 293.

147. Huch, R. Erythropoietin in obstetrics / R. Huch, A.Huch // Hematol. Oncol. Clin. North. Am. 1994. Vol. 8. P. 1021 1040.

148. Ireland, R. et al. Fetal and maternal erythropoietin levels in normal pregnancy / R. Ireland, A.Abbas, B. Thilaganathan et al. // Fetal Diagn. Then. 1992. Vol. 7. P. 21-25.

149. Jonoff, A.S. et al. Modification of Human Eruthrocyte Membrane Structure by Membrane Stabilizers / A.S. Jonoff, D.L. Mazorow, R.T. Coughlin et al. // Am. J. Hematol. 1981. Vol. 10. P. 171 179.

150. Juul, S.E. Non erythropoietic roles of erythropoietin in the fetus and neonate / S.E. Juul // Clin Perinatol. 2000. Vol. 27. P. 527 541.

151. Keintsch-Engel, R. New enzyme-linked immunosorbent assay method for measurement of serum erythropoietin levels and erythropoietin antibodies / R. Keintsch-Engel, K. Hallermayer, A. Dessauer, L. Wieczorek // Blood Purif. 1990. Vol. 8. P. 255 259.

152. Koury, M.J. Erythropoietin retards DNA breakdown and prevents programmed death in erythroid progenitor cells / M.J. Koury, M.C. Bondurant // Science. 1990. Vol. 248. P. 378 381.

153. Koury, M.J. The molecular mechanism of erythropoietin action / M.J. Koury, M.C. Bondurant//Eur. J. Biochem. 1992. Vol. 210. P. 649 663.

154. Koury, M.J. The fate of erythroid progenitor cells / M.J. Koury, L.L. Kelley M.C. Bondurant // Ann. NY. Acad. Sci. 1994. Vol. 718. P. 259 270.

155. Lappin, T.R. The effect of erythropoietin and other factors on DNA synthesis by mouse spleen cells / T.R. Lappin, J. Rich, E. Goldwasser // Exp. Hematol. 1983. Vol. 11. P. 661 -666.

156. Levi, Z. A quantitative immunoichemical fecal occult blood test for colorectal neoplasia / Z. Levi et. al // Ann. Intern. Med. 2007. 146. 244-255.

157. Maier, R.F. et al. Umbilical venous erythropoiei;r and umbilical pH in relation to morphologic placental abnormalities / R.F. Maier, A. Gunther, M. Vogel et al. // Obstet. Gynecol. 1994. Vol. 84. P. 81- 87.

158. Malek, A. et al. Lack of transport of erythropoietin across the human placenta as studied by an in vitro perfusion system / A. Malek, R. Sager, K.U. Eckardt et al. // Pflugers Arch. 1994. Vol. 427. P. 157 161.

159. Martin, O.J.K. Expression of an erythroid transcription factor in megakaryocyte and mast cell lineages / O.J.K. Martin, L.J. Zon, G. Mutter, S.H. Orkin // Nature. 1990. Vol. 344. P. 444 447.

160. Milman, N. The influence of blood donation on iron stores assessed by serum ferrin and hemoglobin in a population survey of 1359 Danish women / N. Milman, M. Kirchhoff// Ann. Hematol. 1991. Jul. 63 (1). P. 27-32.

161. Perutz, M.F. Hemoglobin structure and respiratory transport / M.F. Perutz // Sci. Am. 1978. Vol. 239. P. 92.

162. Rege, A.B. A radioimmunoassay for erythropoietin: serum levels in normal subjects and patients with hemopoietic disorders / A.B. Rege, J. Brookins, J.W. Fisher // J. Lab. Clin. Med. 1982. Vol. 100. P. 829 843.

163. Romeo, P.H. et al. Megakaryocyte and erythrocyte lineages share specific transcription factors / P.H. Romeo, M.H. Prandini, V. Joulin et al. // Nature. 1990. Vol. 344. P. 447 449.

164. Schooley, J.C. Erythropoietin complexed with the F(ab)2 fragment of anti-erythropoietin retains its biologic activity. / J.C. Schooley // Exp. Hematol. 1980. Vol. 8. P. 830-836.

165. Teramo, K.A. et al. Amniotic fluid erythropoietin correlates with umbilical plasma erythropoietin in normal and abnormal pregnancy / K.A. Teramo, J.A. Widness, G.K. Demons et al. // Obstet. Gynecol. 1987. Vol. 69. P. 710 716.

166. Ulman, J. The role of erythropoietin in erythropoiesis regulation in fetuses and newborn infants / J. Ulman // Ginekologia Plska. 1996. Vol. 67. P. 205 209.

167. Wade-Evans, V.I. Erythropoietin and the early anaemia of prematurity /V.I. Wade-Evans // Erythropoiesis. 1991. Vol. 2. P. 41 46.

168. Wieczorek, L. Molecular biology of Erythropoietin / L. Wieczorek, P. Hirth, K.B. Schope // Prod Develop Pharmac. 1991. Vol. 2. P. 13-16.

169. Wognum, A.W. An enzyme-linked immunosorbent assay for erythropoietin using monoclonal antibodies, tetrameric immune complexes, and substrate amplification / A.W. Wognum, P.M. Lansdorp, A.C. Eaves, G. Krystal // Blood. 1989. Vol. 74. P. 622 628.

170. Wolk, M. Structural variants of human hemoglobin / M. Wolk, R. Constantin, J.E. Martin // Journal of Clinical Pathology. 2004. Vol. 57. P. 740 745.

171. Wolk, M. Blood cells with fetal haemoglobin (F-cells) detected by immuno-histochemistiy as indicators of solid tumours / M. Wolk, J.E. Martin, R. Constantin // Journal of Clinical Pathology 2004. Vol. 57 P. 740 745.

172. Zanjani, E.D. et al. Erythropoietin does not cross the placenta into fetus / E.D. Zanjani, J.S. Pbdey, N. Slotnik et al. // Pathobiology. 1993. Vol. 61. P. 211 215.

Информация о работе

Бисалиева, Рината Альбкалиевна
кандидата медицинских наук
Краснодар, 2009
ВАК 03.00.04

Диссертация

Иммунохимическое изучение эмбрионального и фетального гемоглобинов на ранних этапах онтогенеза - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы