Гемоглобины человека: иммуннобиохимическая характеристика и медико-биологическое значение

Кривенцов, Юрий Алексеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Гемоглобины человека: иммуннобиохимическая характеристика и медико-биологическое значение
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Гемоглобины человека: иммуннобиохимическая характеристика и медико-биологическое значение"

На правах рукописи

Кривенцев Юрий Алексеевич

ГЕМОГЛОБИНЫ ЧЕЛОВЕКА: ИММУНОБИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

03.00.04. — Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва - 2009

ии34У77и4

003477704

Работа выполнена в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Астраханская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор АГМА

Никулина Дина Максимовна

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор

Терснтьев

Александр Александрович

доктор медицинских наук, профессор

Хватов

Валерий Борисович

доктор медицинских наук, профессор

Сучков

Сергей Викторович

Ведущая организация: - ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», Адрес: 127473, Москва, ул. Делегатская, д. 20/1.

Защита диссертации состоится 28 декабря 2009 г. в 15.00. часов на заседании Диссертационного Совета Д.208.072.01 при ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ по адресу:

117997, Москва, ул. Островитянова, 1. Автореферат разослан 15 сентября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор

П.Х. Джанашия

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние годы повышается интерес к отдельным типам гемоглобина как диагностически значимым маркерам. Существует разнообразие патологических состояний красной крови (та-лассемии, онкопатология, гипоксии и др.), при которых важное диагностически-прогностическое значение имеет не только изменение количества общего гемоглобина крови, но и отдельных его типов. К наиболее физиологически и диагностически значимым типам гемоглобина человека относятся гемоглобины взрослого НЬА|, НЬА2, фетальный гемоглобин (HbF) и эмбриональный гемоглобин (НЬР).

В современной клинической практике большинства стран для количественного анализа гемоглобинов в качестве стандартных применяются колориметрические циангемоглобиновые методы, рекомендованные комитетом по стандартизации Европейского и Международного Общества по Гематологии (Deutscher Normenausschuss, Normentwurf DIN 58931, 1964), основным из которых является унифицированный гемоглобинцианидный метод [Зорина Н.В., 1980; Делекторская JI.H., 1992; Гаранина Е.Н., 1997]. Большинство колориметрических методов количественного определения гемоглобина не отличаются избирательностью: с их помощью определяется лишь общее количество гемоглобина крови, а не отдельных его типов. Даже в случае определения щелочеустойчивой фракции гемоглобина по Зингеру и Бетке регистрируются несколько типов гемоглобина, а не только фетальный [Betke К., 1958; Betke К., 1979]. Кроме того, методы Бетке и Зингера несовершенны при определении малых концентраций гемоглобина. Методика определения гемоглобинов путем электрофореза в геле крахмала, агарозы или ацетата целлюлозы при рН 8,4-8,6 [Huisman, T.H.J. 1996, Тиц Н.У. 1997, Fairbanks, V.P. 1999] является полуколичественной.

В современной медицинской лабораторной практике четко прослеживается тенденция перехода от определений фракций веществ к индикации каждого вещества фракции в отдельности, что, очевидно, повышает качество диагностики и оценки состояния пациента. Безусловно, современная медицина нуждается в появлении новой схемы тестирования гемо-глобинового спектра человека, которая позволяла бы определять уровень каждого из основных типов гемоглобина. В последние годы появились единичные работы по изучению отдельных типов гемоглобина с помощью

иммунохимических тест-систем [Никулина Д.М. 2002; Токарев Ю.Н. 2003].

Огромным преимуществом иммунохимических методов является их высокая специфичность, которую обеспечивают интимные избирательные взаимодействия: антиген-антитело. Кроме того, к преимуществам иммунохимических методов можно отнести высокую чувствительность, позволяющую количественно определять белки в малых пробах, а также то, что эти методы позволяют исследовать сложные биологические смеси без какой-либо предварительной очистки и выделения исследуемого белка.

Таким образом, моделирование моноспецифических иммунохимических тест-систем на основные типы гемоглобина (НЬА|, НЬР, НЬР и др.), разработка комплексной схемы оценки гемоглобинового спектра крови и их внедрение в клиническую практику актуально и целесообразно.

Цель исследования

Оптимизация клинической оценки состояния красной крови путем пополнения фундаментальных сведений по основным типам гемоглобина и формирования комплексной иммунохимической схемы оценки гемоглобинового спектра.

Задачи исследования

1.Провести сравнительное иммунобиохимическое изучение физико-химических свойств НЬАЬ НЬА2, НЬР и НЬР.

2.Разработать рациональные способы выделения и очистки основных типов гемоглобина.

3.Смоделировать моновапентные иммунохимические тест-системы на гемоглобины Аь А2, Р и Р.

4.Разработать способы количественного иммунохимическо-го анализа основных типов гемоглобина.

5.Определить сроки начала и динамику продукции НЬР и НЬР на ранних этапах онтогенеза человека.

6.Создать комплексную схему оценки гемоглобинового спектра крови на основе иммунохимических тест-систем и установить ее клинико-диагностическое значение при патологии эри-трона и заболеваниях, сопровождающихся гипоксией.

Научная новизна исследования

Пополнены фундаментальные данные по физико-химическим свойствам НЬАЬ НЬА2, НЬР, получены новые сведения по некоторым физико-химическим свойствам эмбрионального гемоглобина: относительной элек-трофоретической подвижности в полиакриламидном и агарозном гелях, изоэлектрической точке, степени щелочной резистентности и отношению к осаждающим агентам, на основании чего разработаны и апробированы оригинальные алгоритмы их выделения и очистки.

Сконструирована моновалентная иммунохимическая тест-система на эмбриональный гемоглобин. Смоделированы и успешно апробированы новые точные и надежные оптимальные алгоритмы количественного анализа по гемоглобинам А], А2, Г и Р. Впервые разработана комплексная схема количественной оценки гемоглобинового спектра, отличающаяся точностью, специфичностью, надежностью и экономичностью.

Уточнены сроки начала продукции антенатальных гемоглобинов и проведен параллельный иммунохимический анализ динамики концентрации НЬР и НЬР в раннем эмбриогенезе.

Впервые выявлен НЬР и отмечено повышение концептарции НЬР в крови больных эритремией, сублейкемическим миелозом, острым и хроническим миелолейкозом, что доказывает значение этих белков как канце-роэмбрионапьных антигенов в диагностике миелопролиферативных заболеваний.

Впервые показано появление НЬР и достоверное изменение уровня НЬР в крови новорожденных с тяжелой внутриутробной гипоксией, задержкой внутриутробного развития и глубокой недоношенностью, доказывающее диагностическую роль тестов на НЬР и НЬР при патологии новорожденных.

Впервые отмечено значительное превышение концентрации феталь-ного гемоглобина в крови больных опийной наркоманией и алкоголизмом.

Практическая значимость работы

Предложенные оригинальные алгоритмы выделения и очистки гемоглобинов А,, А2, Р и Р, позволят экономить исходный биоматериал, реактивы, временные и финансовые ресурсы. Полученные белковые препараты могут быть использованы для научных исследований и для практиче-

ского применения.

Разработаны и используются в клинической практике следующие тесты: способ количественного анализа НЬГ ракетным электрофорезом с додецилсульфатом натрия, способ полуколичественного анализа НЬР путем трехэтапной иммунодиффузии по Оухтерлони, способ количественного анализа НЬА] и НЬА2 радиальной иммунодиффузией по Манчини. Составлена инструкция по применению сформированного набора реагентов для иммунохимической индикации НЬИ, НЬР, НЬА] и НЬА2. Разработана и используется в клинической практике комплексная схема оценки гемогло-бинового спектра, основанная на сочетании оптических и иммунохимиче-ских методов индикации гемоглобинов.

Результаты диссертационного исследования и предложенные рекомендации могут быть использованы в работе клинико-диагностических лабораторий, поликлинических, гематологических, педиатрических, не-онатологических, наркологических, пульмонологических, кардиологических, онкологических и терапевтических лечебно-профилактических учреждений.

Внедрение результатов исследования позволит оптимизировать способы аналитической и препаративной работы с основными типами гемоглобина человека, осуществлять более точный и полный анализ ге-моглобинового статуса и состояния красной крови, что будет способствовать улучшению диагностики, лечения и прогноза заболеваний, сопровождающихся изменением концентрации общего гемоглобина или отдельных его типов.

Внедрение результатов исследования в практику

Разработанные в диссертации методики и полученные результаты исследований внедрены в практическую деятельность КДЛ учебно-научно-диагностического центра ГОУ ВПО АГМА; МУЗ «Клинический родильный дом» г. Астрахань; ГУЗ Александро-Мариинской ОЦКБ, г. Астрахань; НУЗ Медико-санитарная часть, г. Астрахань; МУЗ клиническая больница №5, г. Астрахань. Теоретические положения используются в учебном процессе на биохимии с курсом клинической лабораторной диагностики, патологической физиологии ГОУ ВПО АГМА Росздрава.

Материалы научных исследований используются в научных разработках и в педагогическом процессе на всех факультетах на кафедрах биохимии с курсом клинической лабораторной диагностики и патологической физиологии Астраханской государственной медицинской академии.

Положения, выносимые на защиту:

1. При очистке основных типов гемоглобина наиболее эффективны методы фракционирования, основанные на разделении по изоэлектриче-ской точке: ионообменная хроматография и препаративный электрофорез. При электрофоретическом разделении гемоглобинов оптимальным является диапазон рН рабочего буфера от 6,0 до 6,6. Значительное влияние на электрофоретическую подвижность НЬАь НЬА2, НЬР и НЬР в агарозе и ПААГ оказывают додецилсульфат натрия, тритон, мочевина и бихромат калия. На ранних этапах выделения НЬР следует использовать модифицированную методику щелочной денатурации с 40-секундной экспозицией в 1,2 н№ОН.

2. Оптимальными для количественного определения основных типов гемоглобина являются методы иммунохимического анализа. Разработаны точные алгоритмы селективного количественного анализа НЬАь НЬА2, НЬР и НЬР, основанные на методах двойной иммунодиффузии, ракетного иммуноэлектрофореза и РИД по Манчини. Создана и внедрена в клиническую практику комплексная схема количественной оценки гемо-глобинового спектра по основным типам гемоглобина, основанной на модифицированных иммунохимических методах.

3. Иммунохимическим путем проведен количественный анализ динамики концентраций НЬР и НЬР в раннем эмбриогенезе (с 4 по 12 нед гестации), и уточнены сроки начала продукции антенатальных гемоглобинов.

4. Доказано значение НЬР и НЬР как канцероэмбрионапьных антигенов в диагностике миелопролиферативных заболеваний, оценке степени тяжести и прогноза гипоксии новорожденных, ЗВУР и глубокой недоношенности. Впервые отмечено значение иммунохимического теста на НЬР в оценке тяжести и эффективности лечения больных опийной наркоманией и алкогольной зависимостью.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на V научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» 2001; на III съезде биохимического общества РАН (Санкт-Петербург, 2002); на 2-й и 3-й научно-практической конференции и школе-семинаре для молодых ученых с международным участием «Белки-маркеры патологических состояний» (Астрахань-Москва, 2001, 2003); на научно-практической конференции с международным участием «Современные достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань-Москва, 2004), (Астрахань-Волгоград-Москва, 2006), (Астрахань-Москва 2008); на VIII Международной научной конференции «Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского моря» (Астрахань, 2005); на международной научной конференции, посвященной 450-летию г. Астрахани (Астрахань. 2007), на VI Всероссийской конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной онкологии» (Москва. 2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск. 2008), межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы кардиологии детей и взрослых-2009» (Астрахань. 2009), Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения больных в многопрофильном лечебном учреждении» (С-Пб., 2009).

Материалы диссертации были представлены на выставке: «Инновационные достижения России» XI Петербургского международного экономического форума (С-Петербург. 2007).

Публикации

По материалам диссертации опубликована 41 научная работа, в том числе 12 в рецензируемых научных изданиях, рекомендуемых ВАК, 1 патент.

Структура и объем работы: Диссертация изложена на 264 страницах текста, иллюстрирована 34 таблицами, 39 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, главы методов исследования, 6 глав собственных экспериментальных и клинических исследований, обсуждения, за-

ключения, выводов, практических рекомендаций. Указатель литературы содержит 251 отечественных и 139 иностранных авторов.

Личное участие автора в получении результатов исследования

Основной материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован лично автором. Исследования проведены на кафедре биохимии с курсом клинической лабораторной диагностики АГМА, КДЛ учебно-научно-диагностического центра ГОУ ВПО АГМА; МУЗ «Клинический родильный дом»; ГУЗ Александро-Мариинской ОЦКБ, НУЗ Медико-санитарная часть, МУЗ клиническая больница №5, г. Астрахань.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Исследование было проведено в период с 2003 по 2009 гг. на биологическом и клиническом материале общей численностью 1288 образцов. Объектом исследования являлись изучаемые гемоглобины типов Аь А2, Р и Р, источники получения которых приведены в табл. № 1.

Таблица 1

Перечень использованного в работе материала

Материал Число образцов Место получения биоматериала

Биоматериал: г. Астрахань

Эмбриональный материал 170 Отделение гинекологии МУЗ КБ №5

Плоды 12 Отделение патанатомии ГУЗ АМ ОЦКБ

Пуповинная кровь здоровых новорожденных 62 МУЗ «Клинический родильный дом»

Кровь беременных 57

Кровь здоровых доноров 84 Станция переливания крови

Клинический материал:

Пуповинная кровь новорожденных 196 МУЗ «Клинический родильный дом»

Кровь кардиологических больных 49 ПУЗ Медико-санитарная часть

Кровь наркологических больных 138 наркологический УНЛЦ АГМА

Кровь гематологических больных:

Гемобластозы 244 Отделение гематологии ГУЗ АМ ОЦКБ

Анемии 64 НУЗ Медико-санитарная часть

Здоровые доноры (группы контроля) 212 Станция переливания крови

ВСЕГО 1288

Биоматериал использовали как при изучении физико-химических свойств НЬА], НЬА2, НЬР и НЬР, так и в разработке новых способов выделения и очистки названных белков. Исходным материалом для очистки НЬА, и НЬА2 являлась кровь доноров и здоровых беременных

НЬА| и НЬАг являлась кровь доноров и здоровых беременных женщин; для очистки фетального гемоглобина - пуповинная кровь здоровых новорожденных и ткани плодов; для очистки НЬР — эмбриональный материал сроком гестации 5-9 нед.

Постановку и верификацию диагнозов в обследуемых группах проводили при участии квалифицированных специалистов. Исследованный клинический материал был разделен по нозологии натри группы:

1) Гепаринизированная кровь больных миелоприлиферативными заболеваниями. Всего было обследовано 244 образца крови (табл. 2). Т.к. в обследуемый спектр нозологии входили заболевания с редкой встречаемостью (эритремия, сублейкемический миелоз, эритроцитоз), если число вариант в выборке не превышало 20, применяли алгоритмы статистической обработки для малых групп.

Таблица 2

Перечень использованного в работе материала

Исследуемый материал (кровь больных) Количество проб

Эритремия 36

Сублейкемический миелоз 34

Хронический миелолейкоз 76

Острый миелолейкоз 36

Острый и хронический лимфолейкоз 56

Эритроцитоз 6

ВСЕГО 244

2) Гепаринизированная пуповинная кровь новорожденных, в количестве 196 образцов (табл. 3).

3) Гепаринизированная периферическая кровь наркологических больных (табл. 1). Были обследованы образцы крови от 138 человек, из них: 52 образца от пациентов с алкогольной зависимостью; 44 — от больных опийной наркоманией и 42 пробы от здоровых взрослых (контрольная группа). Возраст больных составил от 18 до 43-х лет. Клинический статус обследуемых соответствовал острому абстинентному синдрому.

Таблица 3.

Перечень использованного в работе материала

Исследуемый материал (пуповин-ная кровь новорожденных) Количество проб

Всего Мальчики Девочки

Здоровые дети (контрольная группа) 62 33 29

Дети с тяжелой внутриутробной гипоксией 52 27 25

Дети с тяжелой внутриутробной гипоксией и задержкой внутриутробного развития 43 21 22

Дети с тяжелой внутриутробной гипоксией и глубокой недоношенностю (масса тела не более 1000 г.) 39 18 21

ВСЕГО 196 99 97

Кровь брали пункцией кубитальной вены или пальца у взрослых людей, у новорожденных - из пуповины сразу после ее рассечения, у плодов - из сердца. Забор крови производили в пробирки с добавленным в них раствором гепарина. Эмбриональные ткани получали в ходе экстренных и запланированных медицинских абортов при участии квалифицированного врача-гинеколога, с письменного согласия пациенток. После получения материал упаковывали в стерильные, герметично закрытые емкости, которые тут же транспортировали в научную лабораторию кафедры биохимии с курсом КЛД в охлажденном состоянии. Хранили материал в морозильной камере при температуре -18°С.

При изучении физико-химических свойств НЬАЬ НЬА2, НЬР и НЬР, и при разработке новых способов выделения и очистки названных белков применяли методы механически-термического гемолиза, комбинированной щелочной денатурации (поэтапная обработка гемолизата раствором сульфата аммония 50% насыщенности и 1,2 М раствором едкого натра с последующей седиментацией при 8000 препаративного электрофореза в агаровом геле на 0,1 М цитратном буфере рН 6,0 (в авторской модификации), электрофореза в полиакриламидном геле, ионообменной и гель-

проникающей хроматографии (Л.А.Зильбер, ред., 1968; Davis 1964; Ornstein 1964; Г.Детерман, 1970; Г.Маурер, 1971; Э.Руослахти, 1979; Л.А.Остерман, 1985; Э.Гаапь и соавт., 1982; X. Фримель, ред., 1987; О.Микеш, ред., 1982; Р.Скоупс, 1985; А.М.Егоров и соавт., 1991). Идентификацию полученных препаратов проводили методами ИХА. Всего протестировано свыше 4500 образцов биоматериала.

Моновалентные антисыворотки на изучаемые типы гемоглобина получали самостоятельно методом иммунизации кроликов породы «шиншилл» дробными дозами чистого антигена с адъювантом Фрейнда по общепринятой схеме. При моделировании иммунохимических тест-систем применяли: выделение a-цепей пара-хлормеркурибензоатом, истощение антисывороток путем иммуноаффинной хроматографии на Bio Gel Р-200, электрофорез в агаре, иммуноэлектрофорез по Грабару и Уильямсу (Grabar P. eta). 1958).

Для индикации белков в био- и клиническом материале использовали:

• оптические методы определения: унифицированный гемогло-бинцианидный метод (по инструкции Департамента государственного контроля качества, эффективности, безопасности лекарственных средств и медицинской техники МЗ РФ 17.06.2000), определение фетапьного гемоглобина по Зингеру в модификации Бетке (Betke, К. 1979); определение общего белка биуретовым методом (набор реагентов фирмы «Vital», экс-тинкцию измеряли на фотоэлектроколориметре «Spicol-11») или спектро-фотометрически при 280 и 260 нм по Варбургу.

• иммунохимические методы: иммунодиффузионное титрование по Ouchterlony в модификации Н.И.Храмковой и Г.И.Абелева, РИД по Манчини в модификации Фехей и Мак-Келви (Fahey, J.L. 1965), ракетный электрофорез в агаровом геле в варианте Laurell C.B. и Merrill D в авторской модификации.

Для статистической обработки и анализа полученных результатов исследования, а также построения графиков был использован лицензионный пакет прикладных программ статистического анализа ExceI-2003 (Microsoft), Statistica 6.0 (StatSoft. Inc.). Для каждой выборки вычисляли средние величины (М), среднее квадратичное отклонение (о), среднюю ошибки средней арифметической (m). Проводили дисперсионный анализ с

подсчетом степеней свободы (умеж и увну) и критерия дисперсии (Р). С целью определения значимости Р различий сопоставляемых величин применялся критерий I Стьюдента и однофакторный дисперсионный анализ с вычислением критерия Р Фишера. Различие считали достоверным при Р<0,05. Для оценки межгрупповой зависимости проводился линейный корреляционный анализ Пирсона (коэффициент корреляции - г). Корреляция считалась высокой при приближении модульной величины г к единице. Статистические взаимосвязи между показателями оценивались применением корреляционного, регрессионного анализа и методов многомерной статистики (ГланцС., 1999).

Результаты исследования и их обсуждение

Сравнительное изучение физико-химических: свойств основных типов гемоглобина (НЬАь НЬА2, НЬР и НЬР) показало, что все изучаемые типы являются водорастворимыми хромопротеидами с электрофоретиче-ской подвижностью р-глобулинов. Установлено, что все методы обратимого и необратимого осаждения, за исключением осаждения слабыми растворами кислот и щелочей, не позволяют разделять типы гемоглобина, однако могут быть использованы для очистки НЬ от других белков и концентрирования препаратов гемоглобина. Показаны значительные отличия разных типов гемоглобина в способности осаждаться сульфатом аммония, что может быть использовано при их разделении. Установлено, что НЬР резистентен к действию щелочей, но его устойчивость ниже, чем у НЬР (табл. 4).

Экспериментально показано, что из четырех основных типов гемоглобина, как в ПААГ, так и в агарозном гелях максимальную электрофоре-тическую подвижность (как по альбумину, так и по гемоглобину А|) имеет эмбриональный гемоглобин, второй по скорости миграции - НЬА1. В агарозном геле минимальную подвижность среди названных протеинов имеет НЬА2, а в ПААГ - НЬР (рис. 1). Степень корреляции относительной элек-трофоретической подвижности изучаемых протеинов, как по альбумину, так и по гемоглобину Аь оказалась положительной и высокой (в агарозе: г = 0,88; в ПААГ: г =0,91).

Таблица 4

Сравнительный анализ физико-химических свойств гемоглобинов

Ф/х свойства 11ЬЛ, ньа2 НЬР

Растворимость в воде + + + +

Отношение к осаждаю-

щим реагентам

0,5% риванол осаждается осаждается осаждается осаждается

обратимо*** обратимо*** обратимо*** обратимо***

этанол осаждается осаждается осаждается осаждается

обратимо*** обратимо*** обратимо*** обратимо***

Отношение к (МЬ^СЬ

(в % насыщенности):

оптимум осаждения 55* 50* 70* 65*

диапазон осаждения 30-65* 30-65* 40-80* 35-80*

Относительная электро-

форетическая подвиж-

ность по альбумину:

в агарозе 0,258±0,009* 0,206±0,007* 0,217±0,008* 0,309±0,010*

0,29-0,30** 0,30-0,35**

вПААГ 0,610±0,022* 0,537±0,020* 0,512±0,019* 0,679±0,024*

0,63-0,68** 0,51-0,525** 0,50-0,52**

Изоэлектрическая точка 7,0±0,1 * 7,3 ±0,15* 7,1±0,13* 6,85±0,1 *

6,95-7,18** 7,4-7,6** 6,9-7,15**

Резистентность к дейст- Неустойчив** Неустойчив*** Устойчив*** Относительно

вию щелочей устойчив*

Устойчив**

Пероксидазная и ката- Активен*** Активен*** Активен*** Активен***

лазная активность

Характеристические

окраски:

белки (амидочерный)

общее железо (крас-

ная кровяная соль)

на гемоглобины (бен-

зидин, гваякол) +*** +***

гликопротеиды

липопротеиды

Гомогенность Гомогенен при Гомогенен при Гомог енен при Гомогенен при

э/ф в агарозе и э/ф в агарозе и э/ф в агарозе и э/ф в агарозе,

ПААГ*** ПААГ*** ПААГ*** гетерогенен

при э/ф в

ПААГ***

* - собственные данные

** - данные других авторов (Стародуб Н.Ф. (1987), ИржакЛ.И. (1985))

*** - собственные и литературные данные совпадают

_**** _ данные в литературе отсутствуют

Можно констатировать несовпадение литературных и полученных нами средних значений относительной электрофоретической подвижности по НЬА| в ПААГ и агарозном геле и по НЬР в агарозе. При этом полученные результаты заслуживают доверия в силу большой выборки количества проведенных идентичных экспериментов. Впервые получены статистически достоверные данные по относительной электрофоретической подвижности НЬР в полиакриламидном и агарозном гелях и НЬА2 в агарозном геле и значению его изоэлектрической точки (1=3,29; Р<0,01).

I НЬА1 В НЬА 2 ОНЬР ИНЬР

Рис.1. Относительная элек-трофоретическая подвижность основных типов гемоглобина (по НЬА,) при электрофорезе в агарозном геле (верхний рисунок) и в полиакриламидном геле (нижний рисунок)

Получены новые данные по действию некоторых детергентов на НЬР. Отмечено, что действие тритонов различных видов снижает элек-трофоретическую подвижность НЬР, мочевина и бихромат калия не изменяют электрофоретической подвижности НЬР, но делают его фракцию гетерогенной. Впервые показано, что ДСН меняет вектор электрофоретической подвижности НЬР на противоположный и

ческой подвижности НЬР на противоположный и увеличивает скорость движения этого белка (рис. 2).

<т-

Рис.2. Воздействие детергентов на электрофоретическую подвижность гемоглобинов:

1. НЬА

2. НЬР

3. НЬР

4. НЬР с сульфатом аммония

5. НЬР + тритон 100

6. НЬР + тритон Х-350

7. НЬР + мочевина

8. НЬР + ДСН

9. НЬР + бихромат калия

10. НЬР

Разработка новых способов выделения и очистки по каждому из изучаемых типов гемоглобина проводилась с учетом полученных на предыдущем этапе данных. Разработаны и апробированы оригинальные способы очистки по каждому из изучаемых типов гемоглобина. Новизна разработок состоит, прежде всего, в подборе оптимального методического сочетания и алгоритма выполнения способа получения чистого препарата по каждому белку.

Наиболее эффективным по большинству показателей является разработанный способ выделения и очистки фетального гемоглобина (рис. 3). Применение данного алгоритма приводит к получению белка наибольшей степени очистки с высоким его процентом в полученном препарате. Кроме того, данный способ оказывается наиболее экономным по биопродукту, выход которого довольно высок (табл. 5).

Способ выделения НЬА1 по эффективности и чистоте получаемого продукта практически не уступает способу очистки НЬИ, а по простоте и дешевизне превосходит его (табл. 6).

1 - гемолизат пу-повинной крови;

2 — альбумин;

3 - очищенный препарат (1ЬР;

4 - полуочищенный препарат.

1 - Очищенный препарат НЬР;

2 - гемолизат крови взрослого человека.

I 2

1 2

Рис. 3. Анализ чистоты полученных препаратов НЬР и НЬР методом электрофореза в ПААГ.

Менее эффективными по характеристикам оказались предлагаемые способы получения НЬА2 и НЬР (табл. 7 и 8; рис. 3). Это логично, учитывая, что НЬА2 является минорным, а НЬР получают из «грязного» абортивного материала сложным и трудоемким способом. Тем не менее, чистота каждого из полученных препаратов оказалось достаточной для получения качественных моновалентных иммунохимических антисывороток.

Таблица 5

Анализ качества выделения НЪР

Основные этапы выделения Общий белок, мг/л Кол-во продукта, мг|л Целевой продукт, % Степень очистки НЬИ Выход НЬГ (%)

Исходный материал 240189±316,2 3751±68,0 1,56 1 100

Получение гемолизата 128163±293,9 3118±73,2 2,42 1,55 82,66

Щелочное осаждение 4651±188,5 2816±54,9 60,21 38,59 76,66

Ионообменная хроматография 2912± 192,3 2542±46,5 85,58 54,86 67,73

а= 30,81. Р = 5,3.

Таблица 6

Анализ качества выделения НЬА,

Основные этапы выделения Общий белок, мг/л Кол-во продукта, мг|л Целевой продукт, % Степень очистки НЬА, Выход НЬА, (%)

Исходный материал 215112±218,1 145039± 172,9 67,44 1 100

Получение гемолизата 165128±221,5 138128±155,0 83,64 1,24 95,17

Препаративный электрофорез 53506± 183,3 51640± 129,3 95,52 1,42 35,62

Разведение 535±32,4 516,4±64,8 95,52 1,42 0,36

(Т= 68,17. Г =4,8.

Таблица 7

Анализ качества выделения НЬР

Основные этапы выделения Общий белок, мг/л Кол-во продукта, мг|л Целевой продукт, (%) Степень очистки НЬР Выход НЬР (%)

Исходный материал 165019±492,8 1851 ±64,9 1,12 1 100

Гомогенизация и экстрагирование 36113±378,5 961 ±85,3 2,66 2,38 51,89

Щелочное осаждение 5451 ±91,6 630±77,1 11,56 10,32 34,05

Ионообменная хроматография 1770±79,2 565±58,0 31,92 28,50 30,54

а=36,00. ^ = 6,1.

Очищенные препараты использовали, в частности, для получения специфических антисывороток методом иммунизации кроликов.

Иммунохимическое сопоставление полученной антисыворотки на НЬР с антигенными композитами (рис. 4) показало ее специфичность по отношению к экстракту тканей эмбриона и очищенному препарату НЬР. Идентификация методом иммуноэлектрофореза с экстрактом тканей эмбриона (рис. 5) также регистрировала одну дугу в зоне подвижности гемо-глобинов. Линии преципитации давали положительное окрашивание бен-

зидиновым и гваяколовым методами. Параллельное титрование нативного экстракта эмбриональной ткани и того же препарата, подвергнутого щелочной денатурации, показало, что в обоих случаях тестируемая антисыворотка работала идентично до одинаковых разведений, что служило свидетельством специфичности полученной антисыворотки к НЬР.

Таблица 8

Анализ качества выделения НЬА2

Основные этапы выделения Общий белок, мг/л Кол-во продукта, мг/л 1 Целевой продукт, (%) Степень очистки ньа2 Выход НЬА2 (%)

Исходный материал 221814±369,0 2951 ±155,8 1,33 1 100

Получение гемолизата 125603±294,5 2612±94,6 2,07 1,56 88,47

I Сепаративный электрофорез 26934± 119,7 1931 ±89,7 7,17 5,39 65,42

Ионообменная хроматография 236Ш28.6 834±39,6 35,32 26,564 28,26

сг= 51,88. =6,4.

Рис. 4. Контроль специфичности антисыворотки на НЬР

1 - антисыворотка на эмбриональный гемоглобин;

2 - антисыворотка на 11Ы-;

3 - сыворотка крови кролика без антител на НЬР,

4 - гемолизат пуповинной крови;

5 - очищенный препарат НЬАг;

6 - экстракт тканей эмбриона 6-12 нед.; Э - очищенный препарат НЬР;

Зё - сыворотка крови взрослого донора; Г - гемолизат крови взрослого донора.

Полученные антисыворотки на фетальный гемоглобин подвергались контролю качества по тому же алгоритму, что и антисыворотки на эмбриональный гемоглобин: ИДА, иммуноэлектрофорез, специфическое окрашивание и параллельное титрование нативного и подвергнутого щелоч-

Г ;

. с-1

г Э

ной денатурации препаратов НЬР. По всем названным тестам показана полная моноспецифичность полученных антисывороток к НЬР.

эё +

Рис. 5. Идентификация антисыворотки на НЬР методом

и м му ноэлектрофореза.

8(1 - сыворотка крови взрослого донора;

Эм - экстракт тканей эмбриона 6-12 нед.;

1 - полиспецифическая антисыворотка на белки плазмы донора;

2 - антисыворотка на НЬР

Иммунохимический анализ антисывороток на гемоглобин А2, как правило, выявлял дополнительную линию преципитации на НЬАь которая исчезала после истощения антисыворотки, методом аффинной сорбциии с а-цепями гемоглобина (в авторской модификации). Контроль качества антисывороток на гемоглобины А, и А2, проводимый методами иммуно-диффузионного анализа, иммуноэлектрофореза и специфического окрашивания показал их полную специфичность.

В результате проведенной работы впервые разработана специфическая иммунохимическая тест-система на эмбриональный гемоглобин, в которой тест-антигеном является очищенный препарат НЬР в рабочем разведении: 1/2 или экстракт тканей эмбриона (срок - 6-9 недель) в рабочем разведении 1/8-1/16. Порог чувствительности тест-системы 4,25±0,22 мг/л, (Р<0,01).

Смоделированы специфические иммунохимические тест-системы на: фетальный гемоглобин, в которой тест-антигеном является гемолизат

пуповинной крови в рабочем разведении: 1/64-1/256, порог чувствительности 2,21 ±0,26 мг/л, (Р<0,005); гемоглобин Аь тест-антигеном является гемолизат крови взрослых доноров в рабочем разведении: 1/128-1/512, порог чувствительности 3,24±0,18 мг/л, (Р<0,01); гемоглобин А2, в которых тест-антигеном является очищенный препарат НЬА2 в рабочем разведении: 1/32-1/64, порог чувствительности 4,42±0И$му1(а?с(Ш{О(0<1 ^ие моновалентные антисыворотки были использованы для моделирования оптимальных способов индикации изучаемых типов гемоглобина.

Для количественного анализа фетапьного гемоглобина разработан способ ракетного электрофореза в агаровом геле в собственной модификации (патент №2310204. от 10.11.2007), основанный на полученных данных о повышении скорости электрофоретической миграции гемоглобинов, обработанных ДСН (рис. 6). Эмпирически подобраны оптимальные параметры проведения методики, построена стандартная калибровочная кривая. Корреляционный анализ Пирсона показал высокую прямую линейную зависимость концентрации НЬИ в исследуемых образцах от квадрата диаметра кольца преципитации (г=0,96; Р<0,001). Преимущества способа: селективность; упрощение способа; высокая чувствительность (порог чувствительности 1,7±0,29 мг/л); точность (максимальная погрешность ±2%); достоверность определения, в том числе и при определении малых величин гемоглобина (Р<0,01; Р=8,4); экономия временных трудозатрат (10-12 часов).

Предложен и успешно апробирован способ восходящей трехэтапной индикации НЬР, включающий: РИД-тестирование в тест-системе с двойным наполнением лунки антисывороткой (порог чувствительности 2,13±0,19 мг/л); классическое РИД-тестирование (порог чувствительности 4,25±0,22 мг/л) и титрование в тест-системе в кратных разведениях антигена. В каждом последующем этапе тестировали только пробы, положительно прореагировавшие на предыдущем этапе.

Для определения НЬР в материале с заведомо высокой концентрацией НЬР разработан метод радиальной иммунодиффузии по Манчини в модификации Фехей и Мак-Келви. Сравнительный анализ качества предлагаемых методов определения эмбрионального гемоглобина (табл. 9) показал, что и полуколичесвенный анализ по Оухтерлони и количественный

по Манчини, в равной степени, характеризуются высокой точностью, специфичностью, достоверностью и надежностью.

. .

™

б ,„

;

7 .

-■¡яШШЯШИШ

Рис. 6. Определение НЬР методом ракетного электрофореза: лунки 1-2-образцы НЬИ, не обработанные ДСН;

лунки 3-7 - образцы НЬР, обработанные ДСН

Таблица 9

Сравнительный анализ предлагаемых способов количественного определения НЬР

Характеристики Полуколичесвенный анализ по Оухтерлони Количественный анализ поМанчини

Избирательность регистрации НЬР Специфичен Специфичен

Чувствительность Порог чувствительности 2,17±0,33 мг/л Порог чувствительности 2,8±0,4 мг/л

Точность получаемых результатов Максимальная погрешность ±2,7% Максимальная погрешность ±3,1%

Достоверность определения Достоверен, Р<0,01 Достоверен, Р<(),01

Время проведения Около 12 часов Около 36 часов

Разработаны и успешно апробированы способы количественного анализа НЬА1 и НЬА2, основанные на методе радиальной иммунодиффузии

по Манчини в модификации Фехей и Мак-Келви. Способы отличаются: специфичностью, чувствительностью (порог чувствительности от 2,1 ±0,32 до 2,9±0,41 мг/л; о=0,08); точностью (максимальная погрешность ±2,8%); достоверностью определения, в том числе и при определении малых величин гемоглобина (Р<0,01; Р=6,9); экономией трудозатрат за счет сокращения времени методики (не более 12 часов).

Создана новая комплексная схема количественной оценки гемогло-бинового спектра по основным типам гемоглобина. Алгоритм предлагаемой схемы включает: определение общего НЬ унифицированным гемогло-бинцианидным методом; определение НЬА2, НЬР и НЬР (при необходимости) описанными методами иммунохимической индикации и определение уровня НЬА], как разности между количеством общего НЬ и НЬА2, НЬР, НЬР.

В рамках этой работы проведен сравнительный анализ НЬА, НЬА2 и НЬР описанными иммунохимическими способами, параллельно с определением общего НЬ гемоглобинцианидным методом, в большой выборке доноров (табл. 10). Анализ показал, что средние значения концентрации НЬА| НЬА2 и НЬР, в пересчете на относительные единицы от общего НЬ составляют 94,3%, 2,1% и 2,9% соответственно. Статистический анализ показал высокую положительную корреляцию между суммой концентраций НЬА|, НЬА2 и НЬР (в мг/л), определенных иммунохимически и концентрацией общего гемоглобина, определенной гемоглобинцианидным методом (г=0,98). Ошибка метода составляет 0,68%.

Таблица 10

Показатели общего гемоглобина и его изоформ в исследуемой группе

Тип НЬ Методика определения Концентрация (г/л) о %НЬ

Общий НЬ Унифицированный гемоглобин-цианидны метод 145,8±24,4 15,62 100

НЬА, Радиальная иммунодиффузия по Манчини в модификации Фехей и Мак-Келви 137,5±19,7 13,09 94,3

ньа2 Радиальная иммунодиффузия по Манчини в модификации Фехей и Мак-Келви 3,07±0,12 0,10 2,1

НЬР Ракетный электрофорез в предлагаемой модификации 4,24±0,19 0,16 2,9

Преимущества разработанной схемы: комплексность анализа по общему НЬ и важнейшим его изоформам; специфичность; высокая чувствительность (порог чувствительности от 1,7±0,29 до 2,13±0,3 мг/л); точность (максимальная погрешность ±1,2%); достоверность определения (р<0,001); экономия трудозатрат за счет исключения из общей схемы этапа иммуно-химического определения НЬА|.

Разработанные на предыдущем этапе алгоритмы выявления НЬР и НЬР были успешно использованы для анализа продукции антенатальных типов гемоглобина (НЬР и НЬР) в раннем эмбриогенезе человека.

Настоящее исследование позволило иммунохимическим путем количественно определить динамику продукции НЬР и НЬР в раннем эмбриогенезе (рис. 7). Проведен полный анализ динамики концентраций НЬР и НЬР в доступном временном диапазоне гестационного возраста. Полученные данные являются достоверными и характеризуются малым разбросом и удовлетворительной дисперсией средних величин (Р - от 5,6 до 6,3).

НЬР|

ны^

4 5 6 7

9 10 11 12

Срок гестации (недели)

Рис. 7. Анализ концентраций эмбрионального и феталыю-го типов гемоглобина в раннем эмбриогенезе человека

Иммунохимически определены сроки начала продукции антенатальных гемоглобинов: НЬР - с 4-й недели ГВ, НЬР - с 5-й недели. Показа-

на высокая достоверная зависимость продукции антенатальных гемогло-бинов от сроков гестации (в диапазоне с 4 по 12 неделю). Для эмбрионального гемоглобина эта корреляция является нелинейной отрицательной (г=-0,898); для фетального гемоглобина - положительной (г=0,936), т.е. динамика изменений количественных показателей НЬР и НЬР в эмбриогенезе носила разнонаправленный характер (г = -0,94).

В изучении клинико-диагностического значения иммунохимических тест-систем на гемоглобины типов А¡, Л2, Р и Р наибольшего внимания заслуживают результаты по трем нозологическим группам: миелоприли-феративные заболевания крови, патология новорожденных, сопровождающаяся хронической гипоксией и наркологическая патология. Данные по количественному анализу НЬА| и НЬАг во всех перечисленных группах заболеваний, не имели достоверных отличий от аналогичных репрезентативных показателей в группах здоровых лиц, следовательно, имели информативную ценность нулевой гипотезы. Сведения по антенатальным типам гемоглобина (НЬР и НЬР), напротив, отличались новизной и фундаментально-прикладной значимостью.

При анализе гемоглобинового спектра в крови больных миелопро-лиферативными заболеваниями мы исходили из предположения, что названные формы патологии, связанные с понижением степени дифференци-ровки клеток миелоидного ростка (в т.ч. и эритроидных клеток) должны сопровождаться индукцией генов эмбриоспецифических белков, в частности, е-гена НЬР и у-гена НЬР.

Как и ожидалось, исходя из цитологической специфики данных опухолей эмбриональный гемоглобин не выявлен в контрольной группе и у больных острым и хроническим лимфолейкозом. Уровень фетального гемоглобина в крови больных острым и хроническим лимфолейкозами также не имел достоверных отклонений от такового в группе контроля (Р>0,3).

Эмбриональный гемоглобин впервые выявлен в крови больных эритремией (частота выявления 67,78%), сублейкемическим миелозом (49,41%), острым (24,44%) и хроническим миелолейкозом (и 20,53%). Причем средние концентрации эмбрионального гемоглобина в выборках с положительным результатом были близки к порогу чувствительности разработанной тест-системы на НЬР в классическом РИД-тестировании

(4,25±0,22 мг/л). Средняя концентрация НЬР у больных эритремией составила 4,07±0,23 мг/л; сублейкемическим миелозом - 3,89±0,25 мг/л; острым миелолейкозом - 3,71 ±0,20 мг/л; хроническим миелолейкозом - 3,27±0,19 мг/л. Математический анализ полученных результатов показал их статистическую значимость (Р<0,005; г>4,95; Р>5,2) (рис. 8).

Отмечено значительное достоверное (1>4,66; Р<0,005) повышение концентарции фетального гемоглобина в крови больных эритремией (на 78,8% выше референтных значений), сублейкемическим миелозом (на 42,7%), острым (на 58,06%) и хроническим (на 70,20%) миелолейкозом.

70 60 50 40 30 20

¿31

' « *

Г9 1 контрольная груша О 2 эритремия

Я 3 с^элейкегллческий миелоз в 4 острый миелолейкоз Й 5 иронический ¡миелолейкоз ■ бгимфалейкоэы

Рис. 8. Частота выявления НЬР при некоторых гемобластозах

Для максимальной верификации полученных результатов по НЬР, в тех же выборках было проведено их конвертирование в относительные величины: процент от общего гемоглобина в каждой нозологической группе. Полученные данные (в %), в целом адекватно соотносились с результатами иммунохимического тестирования НЬР (в мг/л) (рис. 9).

Полученные результаты свидетельствуют, что эмбриональный и фе-тальный гемоглобины могут рассматриваться как канцероэмбриональные антигены, иммунохомическая регистрация которых может повысить качество диагностики миелопролиферативных заболеваний. Следует отметить.

что в силу дешевизны, простоты и доступности (для проведения тестов на НЬР и НЬР по предложенной схеме достаточно 0,1 мл крови из пальца), разработанные иммунохимические тесты на НЬР и НЬР могут применяться в скрининг-обследовании групп риска по данной нозологии.

■ 1 контрольная группа 02 эритремия

О 2 субп ей комический миепоэ 04 острый миелопейкоз Н5 хронический миелопейкоз 06 лимфолейкозы

Рис. 9. Относительные величины НЬР (в %) от общего НЬ при миелопролиферативных заболеваниях

Проведен широкий иммунохимический анализ гемоглобинового спектра у новорожденных с внутриутробной гипоксией и сопутствующей патологией (табл. II). Показано значительное достоверное (1=5,52; Р<0,002; Р>4,8) повышение уровня НЬР в крови новорожденных с тяжелой внутриутробной гипоксией (на 30,08% выше, чем в группе контроля), и, особенно, с задержкой внутриутробного развития в сочетании с тяжелой внутриутробной гипоксией (на 68,46%). Концентрация НЬР в крови новорожденных с массой тела менее 1000 г, наоборот, оказалась на 58,25% ниже, чем в контрольной группе (1=7,3; Р<0,001; Р=9,2).

Сравнительный иммунохимический анализ НЬР у новорожденных по половому признаку впервые показал, что уровень фетального гемоглобина в крови новорожденных девочек достоверно (1=4,8; Р=0,001; Р=7,1) превышает таковой у новорожденных мальчиков (рис. !0). И если в группе здоровых детей эта разница невелика, то в группе новорожденных с внутриутробной гипоксией уровень НЬР в крови новорожденных девочек зна-

чительно выше, чем у мальчиков (1=7,2; Р<0,0005; Р=6,7).НЬР не выявлялся иммунохимически в крови здоровых новорожденных и в крови новорожденных с различными формами внутриутробной гипоксии легкой и средней степени тяжести.

Таблица 11

Результаты количественного определения НЬР у новорожденных по клиническому диагнозу

Исследуемые группы п Концентрация НЬЯ (мг/л) Стандартное отклонение (<*)

Здоровые дети (контрольная группа) 62 1096,7±64,1 45,3

Дети с тяжелой внутриутробной гипоксией 52 1426,6±73,5 52,1

Дети с тяжелой ВГ и задержкой внутриутробного развития 43 1847,7±98,2 69,7

Дети с тяжелой ВГ и глубокой недоношенностью (масса тела не более 1000 г.) 39 458,1±32,0 23,8

Всего 196

Рис. 10. Сравнительный анализ концентрации НЬР в крови здоровых новорожденных мальчиков и девочек (левый рисунок) и новорожденных с внутриутробной гипоксией (правый рисунок)

Эмбриональный гемоглобин впервые выявлен в крови новорожденных с тяжелой внутриутробной гипоксией (33,82% от общей выборки). Показано, что в крови новорожденных девочек с тяжелой степенью ВГ НЬР выявлялся в два раза чаще (табл. 12), чем у новорожденных мальчиков с той же патологией (42,76% и 23,85% соответственно). Анализ статистической значимости полученных результатов показал высокую степень достоверности как по нозологическому (Р=0,001; Р=8,6), так и по половому признаку (Р=0,003; Р=6,4).

Определение концентрации НЬР (полуколичественный анализ) проводилось только у пациентов с положительным тестом на этот белок. Средняя концентрация эмбрионального гемоглобина в крови новорожденных с тяжелой внутриутробной гипоксией с позитивной индикацией составила 3,81±0,21 мг/л; среди них, у девочек - 3,96±0,24 мг/л; у мальчиков - 3,65±0,18 мг/л.

Таблица 12

Частота выявления НЬР у новорожденных с внутриутробной гипоксией

тяжелой степени

Пол Число обследованных Среднее число положительных тестов на НЬР Частота выявления (в %)

Мальчики 26 6,2 23,85

Девочки 29 12,4 42,76

Всего 55 18,6 33,82

Повышение уровня НЬР и появление НЬР при гипоксии, очевидно, объясняется тем, что эти протеины имеет большее сродство к кислороду, чем гемоглобин взрослого, следовательно увеличение уровня антенатальных гемоглобинов в крови способствует более оптимальному тканевому газообмену в условиях тканевой гипоксии. Значительный разброс средних концентраций НЬР и частоты выявления НЬР в крови новорожденных мальчиков и девочек с внутриутробной гипоксией можно объяснить более высокими компенсаторными возможностями женского организма в этом онтогенетическом периоде.

Иммунохимический анализ гемоглобинового спектра у наркологических больных с алкогольной зависимостью и опийной наркоманией дал ценные сведения по НЬР. Впервые показно значительное превышение концентрации фетального гемоглобина в крови больных алкогольной зависимостью и опийной наркоманией почти в три раза, по сравнению с уровнем концентрации НЬР в крови доноров контрольной группы (табл. 13). Анализ статистической значимости полученных результатов показал высокую степень достоверности как в группе больных опийной наркоманией (1=7,21; Р<0,001), так и в группе больных алкоголизмом (1=6,38; Р<0,001).

Таблица 13

Результаты количественного определения НЬР в крови наркологических больных и здоровых доноров

Исследуемая группа п Концентрация НЬР (мг/л) а Процент НЬГ от общего НЬ

Кровь больных алкоголиз- 44 1631±83 68,69 3,76

мом

Кровь больных опийной 52 1848±99 74,01 4,26

наркоманией

Кровь здоровых (контрольная группа) 42 650±47 36,23 1,51

а по генеральной совокупности 60,81, Р = 5,7. умеж. = 2.

Активация у-гена фетального гемоглобина у наркологических больных, по нашему мнению, объясняется тем, что метаболические нарушения, возникающие в результате хронической интоксикации психоактивными веществами, затрагивают процессы аэробного окисления, что неизбежно приводит к развитию гипоксических состояний. А НЬР, как было сказано выше является хромопротеидом, эволюционно адаптированным к стабилизации тканевого газообмена в условиях хронической гипоксии. С другой стороны, возможно в результате хронической интоксикации ПАВ, в некоторых гемопоэтических стволовых клетках возникает трансформация ге-

нетических структур, ведущая к изменению интенсивности синтеза фе-тального гемоглобина.

ВЫВОДЫ

!. Получены новые достоверные сведения (Р<0,01) по некоторым физико-химическим свойствам эмбрионального гемоглобина: относительной электрофоретической подвижности в полиакриламидном и агарозном гелях, изоэлектрической точке, степени щелочной резистентности и отношению к осаждающим агентам. Аналогичные сведения по НЬАь НЬА и НЬР уточнены и дополнены.

2. Отмечено изменение электрофоретической подвижности НЬР под действием тритонов, мочевины и бихромата калия. Показано, что ДСН меняет вектор электрофоретической подвижности гемоглобинов на противоположный и увеличивает их скорость движения, что было положено в основу разработки способа количественного определения НЬР.

3. Разработаны и апробированы эффективные алгоритмы выделения и очистки четырех типов гемоглобина со степенью чистоты НЬР - 85,58%; НЬР -30,54%; НЬА) - 95,52%; НЬА2 - 35,32%, позволившие получить моновалентные антисыворотки на НЬА|, НЬА2, НЬР и НЬР.

4. Впервые сконструирована селективная иммунодиффузионная тест-система на эмбриональный гемоглобин с порогом чувствительности 4,25±0,22 мг/л и смоделированы иммунохимические тест-системы на фе-тальный гемоглобин с чувствительностью 2,21 ±0,26 мг/л; на гемоглобин А| и А2- с порогом чувствительности 3,24±0,18 мг/л и 4,42±0,19 мг/л соответственно.

5. Разработаны и успешно апробированы оптимальные алгоритмы количественного анализа изучаемых типов гемоглобина, отличающиеся простотой, специфичностью (Р<0,01), точностью (погрешность <3%), экономичностью: индикация НЬР модифицированным методом двойной им-мунодиффузии (чувствительность 2,17±0,33 мг/л); количественное определение НЬР методом ракетного иммуноэлектрофореза (чувствительность 1,7±0,29 мг/л); количественный анализ НЬА] и НЬА2 по Манчини (чувствительность 2,1 ±0,32 мг/л и 2,9±0,41 мг/л соответственно).

6. Создана и успешно апробирована на больших выборках клинического материала комплексная схема количественной оценки гемоглобино-вого спектра по основным типам гемоглобина, отличающаяся специфичностью, надежностью (коэффициент Пирсона 0,98), чувствительностью (порог от 1,7±0,29 до 2,13±0,3 мг/л), точностью (±1,2%), достоверностью (р<0,001), экономичностью.

7. Показана высокая достоверная зависимость продукции антенатальных гемоглобинов от сроков гестации в раннем эмбриогенезе человека (4-12 недель гестации): для эмбрионального гемоглобина корреляция является нелинейной отрицательной, г=-0,89; для фетального - положительной, г=0,94. Установлены сроки начала продукции НЬР с 4-й недели геста-ционного возраста, НЬР - с 5-й недели.

8. Доказано значение НЬР и НЬР как канцероэмбриональных антигенов в диагностике миелопролиферативных заболеваний: Эмбриональный гемоглобин впервые выявлен в крови больных эритремией (частота выявления 67,78%), сублейкемическим миелозом (49,41%), острым (24,44%) и хроническим миелолейкозом (20,53%). Отмечено достоверное повышение концентрации фетального гемоглобина в крови больных эритремией (превышение референтных значений на 78,8%), сублейкемическим миелозом (на 42,7%), острым (на 58,06%,) и хроническим (на 70,20%) миелолейкозом.

9. Определена диагностическая роль тестов на НЬР и НЬР при патологии новорожденных: впервые выявлен НЬР в крови новорожденных с тяжелой внутриутробной гипоксией (33,82%); отмечено повышение уровня НЬР в крови новорожденных с тяжелой внутриутробной гипоксией на 30,08%, - с ЗВУР в сочетании с тяжелой внутриутробной гипоксией на 68,46% и снижение концентрации НЬР в крови новорожденных с массой тела менее 1000 г на 58,25%. Отмечена корреляция уровней НЬР и НЬР с полом новорожденных (г=0,96 и г=0,93).

10. Установлено диагностическое значение иммунохимического теста на фетальный гемоглобин при наркологической патологии. Впервые отмечено достоверное превышение концентрации фетального гемоглобина в крови больных опийной наркоманией (на 184,3% превышает полученные референтные величины) и алкогольной зависимостью (выше на 150,9%) (Р<0,001).

Практические рекомендации

1. При очистке основных типов гемоглобина рекомендуется использовать методы фракционирования, основанные на разделении по изоэлек-трической точке (с учетом полученных данных по величинам pi): ионообменную хроматографию и препаративный электрофорез. При применении электрофоретических методов разделения гемоглобинов в качестве рабочего буфера эффективнее использовать буферы с рН от 6,0 до 6,6 (цитрат-ный, ацетатный и др.). На ранних этапах выделения НЬР использовать модифицированную методику щелочной денатурации с 40-секундной экспозицией в 1,2 н NaOH.

2. При получении антисывороток на HbA2, HbF и НЬР использовать только очищенные препараты этих протеинов. Иммунизацию проводить по описанной комбинированной схеме (адъювант Фрейнда и алюмовокалиевые квасцы). Проводить истощение а-цепями гемоглобина на Bio-Gel 300. При иммунизации препаратом НЬАь эффективно его предварительное разведение в 500-2000 раз.

3. Внедрить в клинико-лабораторную практику метод ракетного им-муноэлектрофореза с ДСН для количественного определении HbF; трех-этапную методику РИД-тестирования при индикации НЬР; РИД по Ман-чини в количественном анализе НЬА, и НЬА2. При применении названных методов определения гемоглобинов пользоваться смоделированными калибровочными графиками.

4. Внедрить разработанную схему количественного анализа гемо-глобинового спектра для комплексной оценки уровней НЬАь НЬА2, HbF и НЬР.

5. Рекомендуется использовать разработанные тесты на HbF и НЬР при скрининг-анализе и диагностике миелопролиферативных заболеваний: эритремии, сублейкемического миелоза, острых и хронических миелолейкозов.

6. Дополнять классические схемы оценки степени тяжести и прогноза гипоксии новорожденных, ЗВУР и глубокой недоношенности, иммуно-химическими тестами на эмбриональный и фетальный гемоглобины.

7. В оценке тяжести и эффективности лечения больных опийной наркоманией и алкогольной зависимостью целесообразно дополнение общепринятых схем тестом на НЬР.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Nikulina D.M., Kriventsev Y.A., Djachina M.N. Immunochemical test-systems for diagnostics and estimations to efficiency of the treatment of the inflammatory process // International journal of immunorehabilitation. - Israel. -Maj 2000. - V.2. - №2. P. 12.

2. Агапова А.Б., Дьякова O.H., Кривенцев Ю.А. Разработка диагностической иммунодиффузионной тест-системы на фетальный гемоглобин // Материалы конференции молодых ученых с международным участием "Белки-маркеры патологических состояний". - Астрахань-Москва. -2001. - С.101-102.

3. Агапова А.Б., Кривенцев Ю.А. Получение чистого антигена и моделирование тест-системы на фетальный гемоглобин // Материалы 82-й итоговой студенческой научной конференции АГМА. Астрахань. - 2001. -С.13.

4. Никулина Д.М., Дьякова О.Н., Кривенцев Ю.А., Корноухова И.Ю., Агапова А.Б. Фетальный гемоглобин как тест для диагностики ги-поксических состояний // Материалы III съезда биохимического общества РАН. - С-Пб. 2002.-С. 131.

5. Никулина Д.М., Сентюрова Л.Г., Кривенцев Ю.А., Агапова А.Б., Дьякова О.Н. Отчет о научно-исследовательской работе разработка иммунохимических тест-систем для выявления и оценки гипоксических состояний и деструкции тканей в организме человека // Отчет включен в национальный фонд РФ. Инвентарный № 02.2.00403489.

6. Метелкина Е.В., Коханов A.B., Агапова А.Б., Кривенцев Ю.А., Суринков Д.Б. Железосодержащие белки в остром периоде черепно-мозговой и скелетной травмы // Материалы научно-практической конференции и школы-семинара для молодых учёных с международным участи-

ем «Современные достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». - Астрахань-Москва. - 2004. - с.114-118.

7. Бисалиева P.A., Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Краморенко П.В. Разработка способа выделения эмбрионального гемоглобина и моделирование иммунохимической тест-системы на него / Материалы научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». - Астрахань-Волгоград-Москва. - 2006. - С.34-37.

8. Кривенцев Ю.А., Бисалиева P.A., Ковалева H.A., Лада J1.B. Получение специфической антисыворотки на фетальный гемоглобин / Материалы научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». - Астрахань-Волгоград-Москва. - 2006. - С.62-65.

9. Коханов A.B., Метелкина Е.В., Кривенцев Ю.А., Белопасов В.В. Суточные ритмы показателей системы эритрона у больных с тяжелой черепно-мозговой травмой / Труды Астраханской государственной медицинской академии. - Астрахань. - 2006. - Т.33. - С.264-267.

10. Кривенцев Ю.А., Бисалиева P.A., Никулина Д.М., Краморенко П.В., Семенова Т.Б. Иммунохимический анализ продукции эмбрионального гемоглобина в раннем эмбриогенезе человека / Материалы научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». - Астрахань-Волгоград-Москва. - 2006. - С.58-62.

11. Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисалиева P.A., Пичугина H.A. Разработка способа количественного определения фетального гемоглобина человека / Материалы научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». - Астрахань-Волгоград-Москва. - 2006. -С.65-68.

12. Никулина Д.М., Кривенцев Ю.А., Бахмутова Л.А., Бисалиева P.A., Штепо М.В., Лапеко C.B. Определение эмбрионального гемоглобина в крови новорожденных с внутриутробной гипоксией / Материалы научно-практической конференции с международным участием «Достижения

фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». - Астрахань-Волгоград-Москва. - 2006. - С.72-73.

13. Коханов A.B., Метелкина Е.В., Кривенцев Ю.А., Белопасов

B.В. Суточные ритмы показателей системы эритрона у больных с тяжелой черепно-мозговой травмой // Труды Астраханской государственной медицинской академии. - Астрахань. - 2006. - Т.ЗЗ. - С.264-267.

14. Кривенцев Ю.А., Бисалиева P.A., Носков И.А. Изучение воздействия детергентов на эмбриональный гемоглобин // Вестник Астраханского государственного технического университета. - Астрахань. - 2006. -№6. - Т.35. - С.69-72.

15. Бахмутова Л.А., Кривенцев Ю.А., Огуль J1.A. Выявление эмбрионального гемоглобина в крови новорожденных с внутриутробной гипоксией // Вопросы практической педиатрии. - М. - 2006. — Т.1. - №4. -

C.12.

16. Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисалиева P.A., Борисова Н.Б., Бисалиев Р.В. Экспрессия £-гена эмбрионального гемоглобина при гематологической патологии // Успехи современного естествознания. - М. - 2007. - №3. - С.72-75.

17. Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисалиева P.A. Иммунохи-мический анализ концентрации фетапьного гемоглобина в крови новорожденных мальчиков и девочек с внутриутробной гипоксией // Омский научный вестник. - Омск. - 2006. - №9. - Т.46. - С.272-274.

18. Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисалиева P.A., Борисока Н.В. Иммунохимический анализ содержания эмбрионального гемоглобина в крови больных с онкогематологической патологией // Омский научный вестник. - Омск. - 2006. - №8. - Т.44. - С.279-281.

19. Кривенцев Ю.А., Бисалиева P.A., Никулина Д.М., Носков А.И. Моделирование нового способа количественного анализа плодового гемоглобина человека// Фундаментальные исследования. М. 2007. №4. С.76-78.

20. Кривенцев Ю.А., Бисалиева P.A., Семенова Т.Б., Никулина Д.М., Краморенко П.В. Изучение относительной электрофоретической подвижности анте- и постнатальных типов гемоглобина человека / Астраханский медицинский журнал. - Астрахань. - 2007. - №2. - С. 102.

21. Никулина Д.М., Кривенцев Ю.А., Бахмутова JI.A., Бисалиева P.A., Лапеко C.B., Штепо М.В., Огуль Л.А. Фетальный и эмбриональный

типы гемоглобина в крови новорожденных с внутриутробной гипоксией / Астраханский медицинский журнал. - Астрахань. — 2007. - №2. — С. 132133.

22. Бисалиева P.A., Кривенцев Ю.А., Яблокова И.Ю., Ким И.В., Вафина P.A. Изучение подходов к выделению и очистке эмбрионального гемоглобина / Материалы конференции молодых ученых АГМА. - 2007. -С.30-31.

23. Кико Е.Е., Бисалиева P.A., Кривенцев Ю.А., Ким И.В., Яблокова И.Ю., Вафина P.A. Иммунохимическое определение эмбрионального гемоглобина у больных гемобластозами / Материалы VI Всероссийской конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной онкологии». - М. - 2007. - С.107-109.

24. Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисалиева P.A. Гемоглоби-ны человека // Вестник Астраханского государственного технического университета. - Астрахань. - 2007. - №6. - Т.41. - С.34-41.

25. Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М. Строение и биологическая роль белков гемоглобинового профиля / Гриф УМО 897 от 10.12.2007. Изд-во АГМА, Астрахань, 2007. 101 с.

26. Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисалиева P.A. Способ количественного определения фетального гемоглобина человека // Бюллетень «Изобретения. Полезные модели». - М. - 10.11.2007. - №31 (III ч.), С.666.

27. Никулина Д.М., Воробьева Т.Б., Кривенцев Ю.А. Стадиоспе-цифические белки как маркеры развития плода и состояния новорожденного // Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. - Новосибирск. - 2008. - С.474.

28. Бисалиева P.A., Кривенцев Ю.А., Краморенко П.В. Иммуно-химический анализ продукции фетального гемоглобина в раннем эмбриогенезе человека // Материалы конференции молодых ученых ГОУ ВПО «АГМА Росздрава». - Астрахань. - 2008. - С.4-6.

29. Бисалиева P.A., Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Краморенко П.В., Дьячкова Т.Б. Иммунохимический анализ продукции антенатальных гемоглобинов в раннем эмбриогенезе человека // Российский иммунологический журнал (РАН). - М. «Наука». 2008. -Т.2(11), № 2-3. С. 327.

30. Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисалиева P.A. Моделирование нового способа определения плодового гемоглобина человека // Астраханский медицинский журнал. - Астрахань. - 2008. - Т.З. - №2. - С.53-55.

31. Кривенцев Ю.А., Бисалиева P.A., Батуев Д.Г., Яблокова И.Ю., Вафина P.A.., Мустафаев И.М.-А. Пополнение сведений по физико-химическим свойствам гемоглобина типов: Аь А2, F и Р // Материалы 6-й международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». -Астраханский медицинский журнал. Астрахань-Москва. 2008. Т.З. №3. С.20-22.

32. Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Заклякова J1.B., Бисалиева P.A., Борисова Н.В., Кико Е.Е., Ким И.В. Иммунохимический тест на антенатальные гемоглобины в гематологии // Материалы 6-й международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». - Астраханский медицинский журнал. - Астрахань-Москва. - 2008. - Т.З. - №3. - С. 106-110.

33. Коханов A.B., Никулина Д.М., Кривенцев Ю.А., Белопасов В.В., Метелкина Е.В. Фетальный гемоглобин как маркер гипоксии при черепно-мозговой травме // Материалы 6-й международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». - Астраханский медицинский журнал. - Астрахань-Москва. - 2008. - Т.З. - №3. - С.171-173.

34. Никулина Д.М., Кривенцев Ю.А., Бисалиева P.A. Иммунохимический тест на примитивный гемоглобин: перспективы внедрения.// Материалы 6-й международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». - Астраханский медицинский журнал. - Астрахань-Москва. - 2008. - Т.З. -№3. - С.185-188.

35. Бисалиева P.A., Кривенцев Ю.А., Бисалиев Р.В., Капьной B.C. Иммунохимический анализ фетального гемоглобина в крови наркологических больных // Наркология. - М. - 2009. - №1(85). - С.95-97.

36. Кривенцев Ю.А., Бисалиева P.A., Никулина Д.М. Модификация способа количественного анализа эмбрионального гемоглобина человека // Материалы межрегиональной научно-практической конференции

«Актуальные проблемы кардиологии детей и взрослых-2009». - Астрахань. 2009. С Л 38-140.

37. Бисапиева P.A., Штепо М.В., Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М. Железосодержащие белки в крови новорожденных с внутриутробной гипоксией // Материалы международна наукова конференщя студенев та молодих вчених «Молодь медицин! майбутнього». — Одесса. - 2009. -С.71.

38. Кривенцев Ю.А., Бисапиева P.A., Никулина Д.М., Носков А.И. Разработка оптимального алгоритма для создания иммунохимической тест-системы на примитивный гемоглобин человека // Вестник российской военно-медицинской академии. - С.-Пб. - 2009. - №1 (25). - С.450.

39. Никулина Д.М., Кривенцев Ю.А., Бахмутова J1.A., Бисапиева P.A., Лапеко C.B. Эмбриональный гемоглобин как критерий оценки гипоксии новорожденных // Вестник российской военно-медицинской академии. - С.-Пб. - 2009. - №1 (25). - С.450-451.

40. Бахмутова Л.А., Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Лапеко C.B., Бисапиева P.A. Антенатальные гемоглобины в оценке течения раннего неонатального периода у новорожденных с задержкой внутриутробного развития // Вестник российской военно-медицинской академии. - С.-Пб. -2009. - №1(25). - C.45I.

41. Бахмутова Л.А., Никулина Д.М., Кривенцев Ю.А. Клиническое значение изучения антенатальных типов гемоглобина для прогноза ранней адаптации у недоношенных новорожденных детей // Вопросы современной педиатрии. - 2009. - Т.8. - №2. - С.120-122.

Патент на изобретение

Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисапиева P.A. Способ количественного определения фетального гемоглобина человека // Патент на изобретение №2310204. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений РФ 10.11.2007. г. Москва.-7 с.

Список использованных сокращений

НЬ гемоглобин

НЬА! и НЬА2 гемоглобины взрослого

НЬР эмбриональный или примитивный гемоглобин

НЬР фетальный гемоглобин

р1 изоэлектрическая точка

увну внутрифупповая степень свободы

АФП альфа-фетопротеин

ВГ внутриутробная гипоксия

ГВ гестационный возраст

ГПХ (ГФ) гель-проникающая хроматография (гель-фильтрация)

ДСН додецилсульфат натрия

ЗВУР задержка внутриутробного развития

ИДА иммунодиффузионный анализ

ИФА иммуноферментный анализ

ИХ ионообменная хроматография

ИХА иммунохимический анализ

ОЭП относительная электрофоретическая подвижность

ПААГ полиакриламидный гель

ПАВ психоактивные вещества

ПК пуповинная кровь

РИД радиальная иммунодиффузия

КРИВЕНЦЕВ Юрий Алексеевич

ГЕМОГЛОБИНЫ ЧЕЛОВЕКА: ИММУНОБИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

03.00.04,— Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Тираж 100 экз. Подписано в печать 14.09.09 г. Заказ № 2679

Издательство ГОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия Росздрава», 414000, г. Астрахань, ул. Бакинская, 121

Содержание диссертации, доктора медицинских наук, Кривенцов, Юрий Алексеевич

Список сокращений

ВВЕДЕИЕ.

Глава 1 ГЕТЕРОГЕННАЯ СИСТЕМА ГЕМОГЛОБИНА литературный обзор).

1.1. Основы эритропоэза человека.

1.2. Общие свойства гемоглобинов.

1.2.1. Структурная организация молекулы гемоглобина.

1.2.2. Физико-химические свойства гемоглобина.

1.2.3. Транспортно-дыхательная функция.

1.3 Гетерогенность системы гемоглобина.

1.3.1. Принципы классификации гемоглобинов.

1.3.2. Характеристика генотипов гемоглобина.

1.3.3. Эволюция гемоглобинов.

1.4. Клинико-диагностическое значение гемоглобинов.

1.4.1. Нормальные вариации продукции гемоглобинов.

1.4.2. Изменение концентрации гемоглобинов при патологических состояниях.

1.5. Методы определения гемоглобинов.

Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Характеристика и объем материала исследования.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Методы выделения и очистки.

2.2.2. Получение и обработка антисывороток.

2.2.3. Методы индикации белков.

2.2.4. Методы статистического анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Глава 3 ПОПОЛНЕНИЕ СВЕДЕНИЙ ПО ФИЗИКО

ХИМИЧЕСКИМ СВОЙСТВАМ НЬАЬ НЬА2, НЬР И НЬР

3.1. Изучение относительной электрофоретической подвижности НЬАЬ НЬА2, НЬР и НЬР.

3.1.1. Изучение относительной электрофоретической подвижности НЬА,, НЬА2, НЬР и НЬР в агарозном геле.

3.1.2. Изучение относительной электрофоретической подвижности НЬА,, НЬА2, НЬР и НЬР в ПААГ.

3.2. Изучение воздействия детергентов на гемоглобины.

3.2.1. Влияние детергентов на электрофорегическую подвижность гемоглобинов.

3.2.2. Гель-проникающая хроматография на С-10 с бихроматом калия.

3.3. Сравнительный анализ основных физико-химических свойств НЬА,, НЬА2, НЫт и НЬР.

Глава 4 РАЗРАБОТКА ОПТИМАЛЬНЫХ СПОСОБОВ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ ОСНОВНЫХ ТИПОВ ГЕМОГЛОБИНА ЧЕЛОВЕКА.

4.1. Выделение и очистка гемоглобина А,.

4.2. Выделение и очистка гемоглобина А2.

4.3. Выделение и очистка фетального гемоглобина.

4.4. Выделение и очистка эмбрионального гемоглобина.

4.5. Сравнительная характеристика качества новых способов выделения и очистки.

Глава 5 МОДЕЛИРОВАНИЕ ИММУНОХИМИЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ

5.1. Моделирование иммунохимической тест-системы на НЬР.

5.2. Моделирование иммунохимической тест-системы на НЬР.

5.3. Моделирование иммунохимических тест-систем на НЬА] и наНЬА2.

Глава 6 РАЗРАБОТКА СПОСОБОВ КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА ОСНОВНЫХ ТИПОВ ГЕМОГЛОБИНА ЧЕЛОВЕКА

6.1. Разработка способа количественного анализа НЬР.

6.2. Разработка способа количественного анализа НЬР.

6.3. Разработка способа количественного анализа НЬАз.

6.4. Разработка способа количественного анализа НЬА) и новой схемы количественной оценки гемоглобинового профиля по основным типам гемоглобина.

Глава 7 ИММУНОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПРОДУКЦИИ ЭМБРИОНАЛЬНОГО И ФЕТАЛЬНОГО ГЕМОГЛОБИНОВ В РАННЕМ ЭМБРИОГЕНЕЗЕ ЧЕЛОВЕКА.

7.1. Характеристика и обработка материала.

7.2. Результаты и их анализ.

Глава 8 ИЗУЧЕНИЕ КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОГО ЗНАЧЕНИЯ ИММУНОХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ГЕМОГЛОБИНОВОГО ПРОФИЛЯ 8.1. Обоснование клинического спектра апробации иммунохимических тестов на генотипы гемоглобина.

8.2. Иммунохимический анализ содержания эмбрионального и фетального гемоглобинов в крови больных с онкогематоло-гической патологией.

8.2.1. Характеристика и обработка клинического материала

8.2.2. Результаты и их анализ.

8.3. Иммунохимический анализ содержания фетального и эмбрионального гемоглобинов в крови новорожденных детей в норме и при патологии.

8.3.1. Определение фетального гемоглобина.

8.3.2. Определение эмбрионального гемоглобина.

8.3.3. Резюме.

8.4. Иммунохимический анализ фетального гемоглобина у наркологических больных.

8.4.1. Характеристика и обработка клинического материала

8.4.2. Результаты и их анализ.

8.5. Оценка диагностической эффективности иммунохимических тестов на НЬР и HbF.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гемоглобины человека: иммуннобиохимическая характеристика и медико-биологическое значение"

На сегодняшний день описаны сотни типов гемоглобина, которые можно разделить на три группы: постоянно присутствующие в крови человека; появляющиеся только на определенных этапах развития организма и патологические. В последние годы повышается интерес к отдельным типам гемоглобина как диагностически значимым маркерам. Существует большое разнообразие патологических состояний красной крови (талассемии, онкопатология, гипоксические состояния и др.), при которых имеет важное диагностически-прогностическое значение не только изменение количества общего гемоглобина крови, но и отдельных его типов. К наиболее физиологически и диагностически значимым типам гемоглобина человека относятся гемоглобины взрослого НЬАЬ НЬА2, фетальный гемоглобин (HbF) и примитивный гемоглобин (НЬР).

В современной клинической практике большинства стран для количественного анализа гемоглобинов в качестве стандартных применяются колориметрические циангемоглобиновые методы, рекомендованные комитетом по стандартизации Европейского и Международного Общества по Гематологии (Deutscher Normenausschuss, Nonnentwurf DIN 58931, 1964; Boroviczeny K.G. 1964), основным из которых является унифицированный гемоглобин-цианидный метод [45; 58; 78]. Большинство колориметрических методов количественного определения гемоглобина не отличаются избирательностью: с их помощью определяется лишь общее количество гемоглобина крови, а не отдельных его типов. Даже в случае определения щелочеустойчивой фракции гемоглобина регистрируются несколько типов гемоглобина, а не только фетальный, как указано в методах Зингера и Бетке [266; 267]. Кроме того, методы Бетке и Зингера далеки от совершенства при определении малых величин гемоглобина. Методика определения гемоглобинов путем электрофореза в геле крахмала, агарозы или ацетата целлюлозы при pH 8,4-8,6 [297; 323; 251] является полуколичественной и, к тому же, регистрирует лишь фракции ге-моглобинов со сходной электрофоретической подвижностью, а не отдельные типы.

В современной лабораторной медицинской практике четко прослеживается тенденция перехода от определений отдельных фракций веществ к индикации каждого вещества фракции в отдельности. Это повышает качество диагностики и оценки состояния пациента. Безусловно, современная медицина нуждается в появлении новой системы тестирования гемоглобиново-го спектра человека, которая позволяла бы определять уровень каждого из основных типов гемоглобина. В последние годы появились единичные работы по внедрению иммунохимических тест-систем в практику (Дьякова О.Н. 1999; Никулина Д.М. 2002; Токарев Ю.Н. 2003).

Несмотря на появление все новых методов качественного и количественного определения белков, можно сказать, что давно известные методы иммунохимической регистрации (методы Оухтерлони, Манчини, ИФА, им-муноблоттинг, иммунофлюоресценция и др.) остаются наиболее специфичными и точными. Иммунохимические методы идентификации и количественного определения белков широко используются в научных, и, в меньшей степени - в клинико-диагностических лабораториях. Огромным преимуществом иммунохимических методов является их высокая специфичность, которую обеспечивают интимные избирательные взаимодействия: антиген -антитело. Принципы видового различия белков основываются, прежде всего, на формировании уникальной совокупности антигенных детерминант [129]. Кроме того, к преимуществам иммунохимических методов количественного определения белков можно отнести высокую чувствительность, позволяющую количественно определять белки в малых пробах, а также то, что эти методы позволяют исследовать очень сложные смеси белков без какой-либо предварительной очистки и выделения исследуемого белка. Следовательно, определение различных типов гемоглобина с помощью иммунохимических методик имеет научное обоснование.

Таким образом, моделирование моноспецифических иммунохимических тест-систем на основные типы гемоглобина (НЬАь НЬР, НЬР и др.), разработка комплексной диагностической панели для оценки гемоглобинового спектра крови и внедрение в клиническую практику методов иммунохимиче-ского количественного анализа гемоглобина актуально и целесообразно, так как позволит проводить точное определение, как общего его количества, так и отдельных типов, что существенно облегчит и оптимизирует клиническую оценку состояния красной крови.

Цель исследования:

Задачи исследования

1. Провести сравнительное иммунобиохимическое изучение физико-химических свойств НЬАЬ НЬА2, НЬР и НЬР.

2. Разработать рациональые способы выделения и очистки основных типов гемоглобина.

3. Смоделировать моновалентные иммунохимические тест-системы на гемоглобины Аь А2, Р и Р.

4. Разработать способы количественного иммунохимического анализа основных типов гемоглобина.

5. Определить сроки начала и динамику продукции НЬР и НЬР на ранних этапах онтогенеза человека.

6. Создать комплексную схему оценки гемоглобинового спектра крови на основе иммунохимических тест-систем и установить ее клиникодиагностическое значение при патологии эритрона и заболеваниях, сопровождающихся гипоксией.

Новизна исследования

Пополнены фундаментальные данные по физико-химическим свойствам НЬАЬ НЬАг, НЬР, получены новые сведения по некоторым физико-химическим свойствам эмбрионального гемоглобина: относительной элек-трофоретической подвижности в полиакриламидном и агарозном гелях, изо-электрической точке, степени щелочной резистентности и отношению к осаждающим агентам, на основании чего разработаны и апробированы оригинальные алгоритмы их выделения и очистки.

Впервые разработана комплексная схема количественной оценки гемо-глобинового спектра, отличающаяся точностью, специфичностью, надежностью и экономичностью.

Впервые выявлен НЬР и отмечено достоверное повышение концентар-ции НЬР в крови больных эритремией, сублейкемическим миелозом, острым и хроническим миелолейкозом, что доказывает значение этих белков как канцероэмбриональных антигенов в диагностике миелопролиферативных заболеваний.

Отмечено значительное превышение концентрации фетального гемоглобина в крови больных опийной наркоманией и алкоголизмом.

Практическая значимость

Предложенные оригинальные алгоритмы выделения гемоглобинов А,, А2, Р и Р, позволят экономить исходный биоматериал, реактивы, временные и финансовые ресурсы. Полученные белковые препараты могут быть использованы для научных исследований и для практического применения.

Разработаны и используются в клинической практике следующие тесты: способ количественного анализа НЬР ракетным электрофорезом с ДСН, способ полуколичественного анализа НЬР путем трехэтапной иммунодиффу-зии по Оухтерлони, способ количественного анализа ПЬА1 и НЬА2 радиальной иммунодиффузией по Манчини. Составлена инструкция по применению сформированного набора реагентов для иммунохимической индикации НЬР, НЬР, НЬА| и НЬА2. Разработана и используется в клинической практике комплексная схема оценки гемоглобинового спектра, основанная на сочетании оптических и иммунохимических методов индикации гемоглобинов.

Результаты диссертационного исследования и предложенные рекомендации могут быть использованы в работе клинико-диагностических лабораторий, поликлинических, гематологических, педиатрических, неонатологиче-ских, наркологических, пульмонологических, кардиологических, онкологических и терапевтических лечебно-профилактических учреждений.

Разработанные в диссертации методики и полученные результаты исследований внедрены в практическую деятельность КДЛ учебно-научно-диагностического центра ГОУ ВПО АРМА; МУЗ «Клинический родильный дом» г. Астрахань; ГУЗ Александро-Мариинской ОЦКБ, г. Астахань; НУЗ Медико-санитарная часть, г. Астахань; МУЗ клиническая больница №5, г. Астрахань. Теоретические положения используются в учебном процессе на биохимии с курсом клинической лабораторной диагностики, патологической физиологии ГОУ ВПО АГМА Росздрава.

В 2007 году инвестиционный проект «Новые иммунохимические тест-системы для лабораторной диагностики осложненного течения беременности, гипоксии и деструктивных процессов» был представлен на выставке: «Инновационные достижения России» XI Петербургского международного экономического форума.

Основные положения, выносимые на защиту

1. При очистке основных типов гемоглобина наиболее эффективны методы фракционирования, основанные на разделении по изоэлектрической точке: ионообменная хроматография и препаративный электрофорез. При электрофоретическом разделении гемоглобинов оптимальным является диапазон рН рабочего буфера от 6,0 до 6,6. Значительное влияние на электрофо-рстическую подвижность НЬАи НЬА2, НЬР и НЬР в агарозе и ПААГ оказывают додецилсульфат натрия, тритон, мочевина и бихромат калия. На ранних этапах выделения НЬР следует использовать модифицированную методику щелочной денатурации с 40-секундной экспозицией в 1,2 н №ОН.

2. Оптимальными для количественного определения основных типов гемоглобина являются методы иммунохимического анализа. Разработаны точные алгоритмы селективного количественного анализа НЬАь НЬА2, НЬР и НЬР, основанные на методах двойной иммунодиффузии, ракетного иммуно-электрофореза и РИД по Манчини. Создана и внедрена в клиническую практику комплексная схема количественной оценки гемоглобинового спектра по основным типам гемоглобина, основанной на модифицированных иммуно-химических методах.

3. Иммунохимическим путем проведен количественный анализ динамики концентраций НЬР и НЬБ в раннем эмбриогенезе (с 4 по 12 нед геста-ции), и уточнены сроки начала продукции антенатальных гемоглобинов.

4. Доказано значение НЬР и НЬИ как канцероэмбриональных антигенов в диагностике миелопролиферативных заболеваний, оценке степени тяжести и прогноза гипоксии новорожденных, ЗВУР и глубокой недоношенности.

Впервые отмечено значение иммунохимического теста на HbF в оценке тяжести и эффективности лечения больных опийной наркоманией и алкогольной зависимостью.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань-Волгоград-Москва. 2006), международной научной конференции, посвященной 450-летию г. Астрахани (Астрахань. 2007), VI Всероссийской конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной онкологии» (Москва. 2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск. 2008), VI международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань-Москва, 2008), межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы кардиологии детей и взрослых-2009» (Астрахань. 2009), Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения больных в многопрофильном лечебном учреждении» (С-Пб., 2009).

По результатам диссертации опубликована 41 научная работа, 12 из них - в журналах, рекомендованных ВАК для докторских диссертаций. Получен патент на изобретение №2310204. от 10.11.2007 (приложение №1).

Объем диссетрации: 266 стр.; 39 рисунков; 34 таблицы; количество источников, включенных в список литературы - 395 (255 отечественных и 140 иностранных).

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Кривенцов, Юрий Алексеевич

220 ВЫВОДЫ

1. Получены новые достоверные сведения (Р<0,01) по некоторым физико-химическим свойствам эмбрионального гемоглобина: относительной электрофоретической подвижности в полиакриламидном и агарозном гелях, изоэлектрической точке, степени щелочной резистентности и отношению к осаждающим агентам. Аналогичные сведения по НЬАь НЪА и НЬР уточнены и дополнены.

3. Разработаны и апробированы эффективные алгоритмы выделения и очистки четырех типов гемоглобина со степенью чистоты НЬР - 85,58%; НЬР -30,54%>; НЬА) - 95,52%о; НЬА2 - 35,32%), позволившие получить моновалентные антисыворотки на НЬА|, НЬА2, НЬР и НЬР.

4. Впервые сконструирована селективная иммунодиффузионная тест-система на эмбриональный гемоглобин с порогом чувствительности 4,25±0,22 мг/л и смоделированы иммунохимические тест-системы на фетальный гемоглобин с чувствительностью 2,21 ±0,26 мг/л; на гемоглобин А] и А2-с порогом чувствительности 3,24±0,18 мг/л и 4,42±0,19 мг/л соответственно.

5. Разработаны и успешно апробированы оптимальные алгоритмы количественного анализа изучаемых типов гемоглобина, отличающиеся простотой, специфичностью (Р<0,01), точностью (погрешность <3%), экономичностью: индикация НЬР модифицированным методом двойной иммунодиффузии (чувствительность 2,17±0,33 мг/л); количественное определение НЬР методом ракетного иммуноэлектрофореза (чувствительность

1,7±0,29 мг/л); количественный анализ НЬА1 и НЬА2 по Манчини (чувствительность 2,1±0,32 мг/л и 2,9±0,41 мг/л соответственно).

6. Создана и успешно апробирована на больших выборках клинического материала комплексная схема количественной оценки гемоглобинового спектра по основным типам гемоглобина, отличающаяся специфичностью, надежностью (коэффициент Пирсона 0,98), чувствительностью (порог от 1,7±0,29 до 2,13±0,3 мг/л), точностью (±1,2%), достоверностью (р<0,001), экономичностью.

7. Показана высокая достоверная зависимость продукции антенатальных гемоглобинов от сроков гестации в раннем эмбриогенезе человека (4-12 недель гестации): для эмбрионального гемоглобина корреляция является нелинейной отрицательной, г=-0,89; для фетального - положительной, г=0,94. Установлены сроки начала продукции НЬР с 4-й недели гестационного возраста, НЬБ - с 5-й недели.

58,25%. Отмечена корреляция уровней НЬР и НЬР с полом новорожденных (г=0,96 и г=0,93).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При очистке основных типов гемоглобина рекомендуется использовать методы фракционирования, основанные на разделении по изоэлектриче-ской точке (с учетом полученных данных по величинам pi): ионообменную хроматографию и препаративный электрофорез. При применении электрофо-ретических методов разделения гемоглобинов в качестве рабочего буфера эффективнее использовать буферы с pH не выше 6,6 (цитратный, ацетатный и др.). На ранних этапах выделения НЬР использовать модифицированную методику щелочной денатурации с 40-секундной экспозицией в 1,2 н NaOH.

2. При получении антисывороток на НЬА2, HbF и НЬР использовать только очищенные препараты этих протеинов. Иммунизацию проводить по описанной комбинированной схеме (адъювант Фрейнда и алюмовокалиевые квасцы). Проводить истощение а-цепями гемоглобина на Bio-Gel 300. При иммунизации препаратом НЬА|, эффективно его предварительное разведение в 500-2000 раз.

3. Внедрить метод ракетного иммуноэлектрофореза с ДСН для количественного определении HbF; трехэтапную методику РИД-тестирования при индикации НЬР; РИД по Манчини в количественном анализе НЬА! и НЬА2. При применении названных методов определения гемоглобинов пользоваться смоделированными калибровочными графиками.

4. Внедрить разработанную схему количественного анализа гемоглобинового спектра для комплексной оценки уровней НЬАь HbA2, HbF и НЬР.

5. Рекомендуется использовать разработанные тесты на HbF и НЬР при скрининг-анализе и диагностике миелопролиферативных заболеваний: эрит-ремии, сублейкемического миелоза, острых и хронических миелолейкозов.

6. Дополнять классические схемы оценки степени тяжести и прогноза гипоксии новорожденных, ЗВУР и глубокой недоношенности, иммунохими-ческими тестами на эмбриональный и фетальный гемоглобины.

7. В оценке тяжести и эффективности лечения больных опийной наркоманией и алкогольной зависимостью целесообразно дополнение общепринятых схем тестом на HbF.

Разработанные схемы количественного иммунохимического анализа гемоглобинового спектра внедрены в работе: КДЛ учебно-научно-диагностического центра ГОУ ВПО АГМА; МУЗ «Клинический родильный дом» г. Астрахань; ГУЗ Александро-Мариинской ОЦКБ, г. Астахань; НУЗ Медико-санитарная часть, г. Астахань; МУЗ клиническая больница №5, г. Астрахань.

Библиография Диссертация по биологии, доктора медицинских наук, Кривенцов, Юрий Алексеевич, Москва

1. Список отечественной литературы

2. Авдеева, H.A. Оценка методов определения концентрации гемоглобина, применяемых в клинико-диагностических лабораториях / H.A. Авдеева//Лаб. дело. 1987. №10. С.786-788.

3. Агапова, А.Б. Фетальный гемоглобин как тест для диагностики гипоксических состояний / А.Б.Агапова, Д.М.Никулина, О.Н.Дьякова, Ю.А.Кривенцев, И.Ю.Корноухова // Материалы III съезда биохимического общества РАН. С-Пб. 2005. С. 131.

4. Агапова, А.Б. Фетальный гемоглобин у больных хронической ишемической болезнью сердца / А.Б.Агапова, О.Н.Дьякова, Т.Н.Панова // Журнал "Естественные науки". Астрахань, 2003. N 7. С.42-47.

5. Алексеев, И.В. Развитие системы кроветворения у плода человека / И.В.Алексеев, И.В.Замараева, Е.Б.Владимирская, Н.А.Курмашева // Гематология и трансфузиология. М. 1995. №5., Т.40 -С.26-28

6. Алексеев, H.A. Анемии / Н.А.Алексеев - СПб. Гиппократ. -2004. 512 с.

7. Анемии у детей: диагностика, дифференциальная диагностика, лечение. Пособие для врачей под редакцией ФиногеновоЙ H.A., 2 изд. / М.: МАКС-пресс. 2004. 416 с.

8. Антоненко, В.Т. Особенности кислородсвязывающей функции фетального гемоглобина: Обзор / В.Т.Антоненко, Ю.Н.Королев // Гематология и трансфузиология. 2006. Т.28. №5. С.61-64.

9. Арчаков, А.И. Что за геномикой: Протеомика / А.И.Арчаков // Вопр. медиц. химии. 2000. - Т.46, №4. - С.335-343.

10. Аршава, В.П. Фетальный гемоглобин при сердечно-сосудистой патологии / В.П. Аршава // Терапевт, арх. 1973. 45, №11. С.53-56.

11. Аскерова, Т.А. Оценка способа определения количества гликиро-ванного гемоглобина изоэлектрофокусированием / Т.А.Аскерова // Клиническая лабораторная диагностика. №2. 2001. С. 12-15.

12. Асланова, Н.К. Некоторые эритроцитарные показатели у больных хронической гипоксией различного генеза / Н.К.Асланова // Клиническая медицина. 1991 №4. С.56-58.

13. Ашмарин, И.П. Молекулярная биология / И.П. Ашмарин // J1. Издательство ленинградского университета. 1977. С. 105-121.

14. Бадалян, Т.О. Функциональные состояния эритроцитов у больных инфарктом миокарда / Т.О.Бадалян // Терапевтический архив. 2006. №11. С.23-28.

15. Балаховский, С.Д. Методы химического анализа крови / С.Д.Балаховский, И.С.Балаховский // М. Государственное издательство медицинской литературы МЕДГИЗ. 1953. С.557-578.

16. Баранов, A.A. Недоношенные дети в детстве и отрочестве (медико-психосоциальное исследование) / А.А.Баранов, В.Ю.Альбицкий, С.Я. Волгина и др. // М., 2007, с. 188.

17. Белки, пер. с англ., под ред. Г. Нейрата и К. Бейли, Т.З, ч 1, М., 1958. 382 с.

18. Березов Т.Т. Биологическая химия / Т.Т.Березов, Б.Ф.Коровкин. -Изд. 3-е М. : Медицина. 1998. - С.78-84

19. Бернштейн А.Н. Человек в условиях среднегорья. / А.Н.Бернштейн // Алма-Ата, 1997. 214 с.

20. Биология. В 2 кн., Кн 1: Учеб. для медиц. спец. вузов / В.Н. Яры-гин, В.И. Васильева, И.Н. Волков, В.В. Синельщикова; Под ред. В.Н. Ярыги-на. 2-е изд., испр. - М.: Высш. шк., 1999. 436 с.

21. Биохимия / Под ред. Е.С.Северина. М. Издательский дом ГЭО-ТАР-МЕД. 2003. С.751-758.

22. Бисалиев, Р.В. Суицидальные и несуицидальные формы аутоде-структивного поведения при опийной наркомании: Дисс. канд. мед. наук., М., 2007. 108 с.

23. Бисалиева, P.A. Иммунохимический анализ фетального гемоглобина в крови наркологических больных / Р.А.Бисалиева, Ю.А.Кривенцев, Р.В.Бисалиев, В.С.Кальной // Наркология. М. 2009. №1(85). С.95-97.

24. Блюменфельд, JI.A. Гемоглобин / Л.А.Блюменфельд // Соросов-ский образовательный журнал. 1998. №4. С.33-38.

25. Болезни перегрузки железом (гемохроматозы) / Под ред. А.Г.Румянцева и Ю.Н.Токарева М : ИД Медпрактика - М, 2006. 342 с.

26. Борисюк, М.В. Функциональная система транспорта кислорода и ее адаптивные способности / М.В.Борисюк // Сборник научных трудов «Система транспорта кислорода в норме и патологии». Гродно. 2007. С.8-14.

27. Бочков, Н.П. Медицинская генетика (Руководство для врачей) / Н.П.Бочков, А.Ф.Захаров, В.И.Иванов // АМН СССР. М., Медицина, 1984. 541 с.

28. Бурлев, В.А. Железодефицитные состояния у женщин в различные возрастные периоды / В.А.Бурлев, Е.Н.Коноводова // Русский медицинский журнал. 2007. Т. 15. №3. С. 189-193.

29. Вартанян, Ф.Е. Наркомании и сопутствующие им инфекционные заболевания / Ф.Е.Вартанян, К.П.Шаховский // Аддиктология. 2005. №1. С. 78-80.

30. Василенко, A.M. Максимальное потребление кислорода как критерий устойчивости человека к гипоксиии, гипертермии и гипотермии / А.М.Василенко//Косм. биол. и авиакосм. мед. 1980. Т. 14. № 6 С.3-10.

31. Великанова, Л.П Избранные вопросы наркологии: /

32. Л.П.Великанова, А.П.Меснянкин), О.В.Каверина, Р.В.Бисалиев, М.А.Чернова

33. Учебное пособие / Под редакцией Л.П. Великановой. Астрахань, 2007. -365 с.

34. Вилкинсон, Д. Принципы и методы диагностической энзимоло-гии / Д.Вилкинсон М. Медицина. 1981. 624 с.

35. Виллиг, Т.Н. Анемия Даймонда-Блекфена: современные проблемы / Т.Н.Виллиг // Гематология и трансфузиология. 2008. Т.43. - № 3. С.15-18.

36. Власов, В.В. Эффективность диагностических исследований / В.В.Власов-М. «Медицина». 1988. 36 с.

37. Воробьев, А.И. «Руководство по гематологии» / А.И.Воробьев -Москва, 2002. 213 с.

38. Воробьёв, С.И. Инфузионные растворы с кислороднотранспорт-ными свойствами / С.И.Воробьёв // Российский журнал анестезиологии и интенсивной терапии, 1999, N 2, с. 18-24

39. Гаджиев, О.Г. Определение содержания фетального гемоглобина в образцах из капиллярной крови / О.Г.Гаджиев, Р.Ш.Рустамов // Лаб. дело. №8. М. Медицина 1988. С.34-37.

40. Галь, Э. Электрофорез в разделении биохимических макромолекул / Э.Гааль, Г.Медьеши, Л.Верецки М. Знание. 1982. 446с.

41. Гаранина, E.H. Качество лабораторного анализа. Факторы, критерии и методы оценки / Е.Н.Гаранина//М. Лабинформ, 1997. С. 16-18.

42. Гипоксия. Адаптация, патогенез, клиника. / СПб, ООО "ЭЛБИ-СПб", 2000.-384 с.

43. Гланц, С. Медико-биологическая статистика. Пер. с англ. / Гланц С. М. «Практика». 1999. 459 с.

44. Горелова, Н.В. Состояние кислородтранспортной функции гемоглобина при гипоксии различного генеза. Механизмы аварийного регулирования и адаптации при воздействии на организм экстремальных факторов. / Н.В.Горелова// Свердловск, 2008. С.73-79.

45. Горохова, В.Г. Исследование состава белково-пептидного комплекса фетальных тканей человека и ювенильных тканей кролика / В.Г.Горохова, Э.Э.Кузнецова, А.Г.Горохов, А.А.Рунович // Бюлл. эксп. биологии и медицины. №4. 2004. С.423-425.

46. Грибова, И.А. Гематологическая норма. / Руководство по гематологии. Под ред. А.И.Воробьева, Ю.И.Лорие // М. Медицина. 1979. С.52.

47. Гринфельд, Е.С. Клинические рекомендации и алгоритмы для практикующих врачей. Избранные лекции для семейных врачей / Е.С.Гринфельд // Хирургия и урология. 2008. Т. 16, № 29. С. 19-44.

48. Громов, П.С. Изучение белков мембран эритроцитов человека методом двумерного электрофореза / П.С.Громов, А.М.Шандала, Л.И.Ковалев, С.С.Шишкин // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2006. №7. С.28-30.

49. Гуторанов, В.Г. Модификация метода определения концентрации гемоглобина в крови / В.Г.Гуторанов // Лаб. дело. 2. М. Медицина 1983. С.9-11.

50. Даштаянц, Г.А. Клиническая гематология / Г.А. Даштаянц Киев. «Здоровье». 1973. С.45-72.

51. Дворецкий, JI.И. Алгоритмы диагностики и лечения анемий / Л.И.Дворецкий // Русский медицинский журнал. 2003. Т.П. №8. С. 16-27.

52. Дворецкий, Л.И. Гипохромные анемии / Л.И.Дворецкий // Гематология. 2001. Т.З. N9. С.76-88.

53. Делекторская, Л.Н. Оценка диагностической информативности лабораторных тестов (методические рекомендации) / Л.Н.Делекторская, Л.М.Пименова, О.Г.Кадашева // Клин, лабораторная диагностика. 1992. №1/2. С.49-59.

54. Дементьева, И.И. Лабораторная диагностика полиорганной недостаточности / И.И. Дементьева // Клин, лабор. диагностика. 2005. № 9. С. 8.

55. Дергунов A.B., Кадыралиев А.К. Методические рекомендации по экспресс-диагностике скрытых форм недостаточности кровообращения, дыхания и их сочетания у военнослужащих перед выходом в горы. - Бишкек. - 1994.- 18 с.

56. Добродей М.А. К характеристике системы транспорта кислорода у больных ишемической болезнью сердца // Сборник научных трудов «Система транспорта кислорода в норме и патологии». - Гродно. - 1984. -С.23-27.

57. Дударев В.П. Роль гемоглобина в механизмах адаптации к гипоксии и гипероксии. / В.П.Дударев Киев: Наукова думка, 2008. 312 с.

58. Дудин И.Н., Радомская Н.В. Особенности формирования зависимости к каннабиноидам у лиц с коморбидной органической патологией // XIV съезд психиатров России: Материалы съезда 2005. М. С. 343.

59. Дудко Т.Н., Пузиенко В.А., Котельникова Л.А. Дифференцированная система реабилитации в наркологии: методические рекомендации -М., 2008.-39 с.

60. Дьякова О.Н. Фетальный гемоглобин - маркер адаптации к гипоксии // Белки-маркёры' патологических состояний (Материалы межвузовской научной конференции молодых учёных и студентов). -' Москва-Астрахань: Изд-во АГМА, 2006. С. 11-13.

61. Дьякова, О.Н. Клинико-патогенетическое значение структурно-функциональных изменений эритроцитов у больных ишемической болезнью сердца / О.Н.Дьякова // Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. АГМА, 2000. 22 с.

62. Евсеенко, Д.А., Роль плаценты в регуляции фетального эритропо-эза / Д.А.Евсеенко, Н.И.Цирельников // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. №11. 2001. С.519-521.

63. Ермакова, Т. А. Интегральная оценка окислительно-восстановительного метаболизма эритроцитов у больных с различными формами анемий / Т.А.Ермакова, Н.В.Цветаева // Гематология и коагулология. 2003. С.24-35.

64. Ермакова, Т.А. Прогностическая значимость биохимических показателей эритроцитов при наследственном дефиците Г-6-ФДГ / Т.А.Ермакова // Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. М., 1990. 21 с.

65. Журавская, Э.Я. Фетальный гемоглобин у больных ишемической болезнью сердца. В кн.: Новые методы для медицинской практики и медико-биологических исследований. / Э.Я.Журавская, Н.Г.Митерева, Т.Я.Леонова -Новосибирск, 1983. С.93-94.

66. Зайчик, А.Ш. Механизмы развития болезней и синдромов / А.Ш.Зайчик, Л.П.Чурилов // СПб.: ЭЛБИ-СПб, 2005. 507 с.

67. Зайчик, А.Ш. Основы патохимии / А.Ш.Зайчик, Л.П.Чурилов -С.-Пб. «Элби-СПб». 2000. 468 с.

68. Замараева, Н.В. Эритроцитарные параметры пуповинной крови новорожденных разных сроков гестации / Н.В. Замараева, Е.Б. Владимирская, М.В. Волынец и др. // Гематология и трансфузиология. 2008. Т.43. № 2. С.16-19.

69. Заседателев, A.C. Применение биочипов в лабораторной медицине / А.С.Заседателев, В.М.Михайлович, Д.А.Грядунов и соавт.// Клиническая лабораторная диагностика. 2008. № 9. С. 3.

70. Заяц, Р.Г. Общая и медицинская генетика. Лекции и задачи / Р.Г.Заяц, В.Э.Бутвиловский, И.В.Рачковская, В.В.Давыдов Серия «Учебники, учебные пособия». Ростов-на-Дону : Феникс, 2002. 251 с.

71. Золотницкая, Р.П. // Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник / Под ред. В.В.Меньшикова. М. 1987. С. 107-109.

72. Зорина, Н.В. Приобретенные гемоглобинопатии при гематологических заболеваниях / Н.В.Зорина // Пробл. гематологии и переливания крови. 1980. 25, №2. С.41-46.

73. Зотов, П.В. Некоторые аспекты смертности и суицидального поведения больных наркоманией / П.В.Зотов, С.М.Уманский, Н.В. Михайловская // Наркология. 2003. №12. С. 32-34.

74. Игнатов, C.B. Система эритрона при ожогах / С.В.Игнатов // Гематология и трансфузиология. 1990. № 3. С.22-26.

75. Ингрэм, В. Биосинтез макромолекул, пер. с англ. / В.М.Ингрэм -1966, С.188-197.

76. Иржак, Л.И. Гемоглобины и их свойства. / Л.И.Иржак М.: Наука, 1983. 150 с.

77. Иржак, Л.И. Дыхательная функция крови в условиях гипероксии, / Л.И.Иржак, В.В.Гладилов, Н.А.Моисеенко М.: Медицина, 1985.-176 с.

78. Исследование системы крови в клинической практике / Под ред. Г.И.Козинца, В.А.Макарова. М. 1997. 192 с.

79. Казеннов, A.M. Влияние мембранного скелета безъядерных эритроцитов на свойства транспортных АТФаз / А.М.Казеннов, М.Н. Маслова // Цитология. 1991. Т.ЗЗ, №11. С.32-41.

80. Калманова, В.П. Показатели эритропоэтической активности и обмена железа при гемолитической болезни плода и внутриутробных трансфузиях эритроцитов. / В.П.Калманова Автореф. дисс. канд. мед. наук, М., 2000. 22 с.

81. Камышников, B.C. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике: в 2 т. / B.C. Камышников. Мн., Беларусь, 2002. Т.1. 254 с.

82. Карлсон, Б. Основы эмбриологии по Пэттену: Пер. с англ. / Под ред. Б.В.Конюхова. М.: «Мир», 1983. Т.2 - 390 с.

83. Карпова, И.В. Кислородтранспортная активность гемоглобина при лимфосаркомах / К И.В.арпова, М.Г.Дмитриева, А.В.Пивник, Е.Е.Зыбунова, И.Н.Луценко // Гематология и трансфузиология. 1995. Т.40. № 6. С.10-14.

84. Кассирский, И.А. Клиническая гематология. / И.А.Кассирский, Г.А. Алексеев М. «Медицина». 1970. 801 с.

85. Киржанова, В.В. Распространенность наркологических расстройств в России в 2004 году / В.В.Киржанова, Н.Г.Ванисова // XIV съезд психиатров России: Материалы съезда. 2005, М. 2005. С. 347.

86. Клиническая лабораторная аналитика в пяти томах под общей редакцией В.В. Меньшикова / T.I. М. Агат-Мед. 2002. 297 с.

87. Клиническая оценка лабораторных тестов // Под ред. Н. Тица / Пер. с англ. М. Медицина, 1986. С. 16-25.

88. Клиническая ферментология / под ред. Э.Щеклика. Варшава. Польское гос.мед.изд-во. 1966. 489 с.

89. Ковалева, Л.Г. Современное состояние диагностики наследственных гемоглобино- и энзимопатий / Л.Г.Ковалева, Ю.Н.Токарев, А.Р.Еремьянц, М.М.Цибульская, А.А.Левина, Т.П.Молчанова, А.П.Андреева // Гематология и трансфузиология. №9. 1987. С.3-6.

90. Козинец Г.И. Исследование фетального гемоглобина в эриторо-цитах больных анемиями различного генеза / Г.И. Козинец, С.М. Дульцина, Н.С. Турбина, O.A. Дягилева и др. // Проблемы гематологии и переливания крови. 1980. Т.25. № 6. С. 33-37.

91. Козинец, Г.И. / Г.И.Козинец, С.М.Дульцина, Н.Д.Турбина, О.А.Дягилева, Л.П.Кишева, Н.Г.Пономарева // Проблемы гематологии и переливания крови. 1980. 25. №6. С.33-37.

92. Козинец, Г.И. Интерпретация анализов крови и мочи и их клиническое значение. / Козинец Г.И. М. : «Триада-Х», 1998. 104 с.

93. Козловская, Л.В. Учебное пособие по клиническим лабораторным методам исследования / Л.В.Козловская, М.А.Мартынова // М. Медицина. 1975. С.6-11.

94. Колб, В.Г. Справочник по клинической химии / Колб В.Г., Камышников B.C. Минск. 1982. С.47-51.

95. Коржуев, П.А. Гемоглобин / Коржуев П.А. М., Наука, 1964. 118с.

96. Корноухова, И.Ю. Параметры эритроцитов и гемоглобиновых дериватов при хронической обструктивной болезни легких / И.Ю.Корноухова, Г.А.Трубников, Д.М.Никулина Методическое пособие для врачей и студентов медицинских ВУЗов. Астрахань. 2006. 36с.

97. Корноухова, И.Ю. Структурно-функциональные особенности эритроцитов и состояние системы гемоглобина у больных бронхиальной астмой / И.Ю.Корноухова, Д.М.Никулина, А.Б.Агапова // Научные труды "Европейский конгресс по астме". -М., 2006. Т.2, №1. С. 135.

98. Коробов, В.H. Эволюционное становление кислородобеспечи-вающей системы и ее значимость в обеспечении надежности биологических объектов / В.Н.Коробов // Надежность биологических систем. Киев : Наукова думка. 1985. С.188-195.

99. Королев, В.А. Метод изоэлектрофокусирования и фотоколориметрия для определения гемоглобина А|С / В.А.Королев, В.И.Молчанов // Биомедицинская химия. Т.52, вып.2. М. 2006. С.113-222.

100. Королев, В.А. Анализ колориметрического метода опопределения гликилированного гемоглобина / В.А.Королев, Г.Г.Головская, В.П.Белокуренко, Н.И.Чимиричкина, О.Ю.Малахова, Г.И.Гордеева // Клиническая лабораторная диагностика. №12. 2001. С. 12-14.

101. Кривенцев, Ю.А. Гемоглобины человека / Ю.А.Кривенцев, Д.М.Никулина, Р.А.Бисалиева // Вестник Астраханского государственного технического университета. Астрахань. 2007. №6. Т.41. С.34-41.

102. Кривенцев, Ю.А. Изучение воздействия детергентов на эмбриональный гемоглобин / Ю.А.Кривенцев, Р.А.Бисалиева, И.А.Носков // Вестник Астраханского государственного технического университета. Астрахань. 2006. №6. Т.35. С.69-72.

103. Кривенцев, Ю.А. Иммунохимический анализ концентрации фе-тального гемоглобина в крови новорожденных мальчиков и девочек с внутриутробной гипоксией / Ю.А.Кривенцев, Д.М.Никулина, Р.А.Бисалиева // Омский научный вестник. Омск. 2006. №9. Т.46. С.272-274.

104. Кривенцев, Ю.А. Разработка способа количественного анализа эмбрионального гемоглобина человека / Ю.А.Кривенцев, Р.А.Бисалиева,

105. Д.М.Никулина и соавт.// Омский научный вестник. Омск. 2006. №8. Т.44. С.279-281.

106. Кривенцев, Ю.А. Способ количественного определения феталь-ного гемоглобина человека / Ю.А.Кривенцев, Д.М.Никулина, Р.А.Бисалиева // Патент №2310204. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений РФ 10.11.2007. М., 7 с.

107. Кривенцев, Ю.А. Экспрессия е-гена эмбрионального гемоглобина при гематологической патологии / Ю.А.Кривенцев, Д.М.Никулина, Р.А.Бисалиева и соавт.// Успехи современного естествознания. М. 2007. №3. С.72-75.

108. Кушаковский, М.С. Клинические формы повреждения гемоглобина / М.С.Кушаковский Л. 1968. С.22.

109. Кушманова, О.Д. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии / Кушманова О.Д., Ивченко Г.М. М. Медицина. 1983. С.41-42.

110. Лабораторные методы исследования в клинике / Под ред. проф. В.В.Меньшикова М. Медицина. - 1987. - С. 108-111.

111. Лакин, Г.Ф. Биометрия: Учебное пособие для биол. спец. Вузов -4-е изд., перераб. и доп. / Г.Ф.Лакин М.: Высш.шк., 1990. С.352.

112. Ленинджер, А. Основы биохимии : пер. с англ. под ред. В.А.Энгельгарда / А.Ленинджер - М. : Мир. 1985. Т. 1. С.27-123, 187-225.

113. Ленинджер, А. Основы биохимии : пер. с англ. под ред. В.А.Энгельгарда/А.Ленинджер-М. : Мир. 1985. Т. 3. С.768-771.

114. Лопатина, Н.И. Иммунологическая гетерогенность гемоглобина. Иммунологические исследования в клинике и эксперименте. / Лопатина Н.И. - Л., 1981.229 с.

115. Лосев, Н.И. Патофизиология гипоксических состояний и адаптация организма к гипоксии / Н.И.Лосев Учебное пособие - М.: ММИ, 1982. 74 с.

116. Майнулов, В.Г. Основы научно-литературной работы в медицине / В.Г.Майнулов, В.С.Лучкевич, А.П.Румянцев, В.В.Семенова СПб.: СПбГМА. 1996. 128 с.

117. Майнулов, В.Г. Основы научно-литературной работы в медицине / В.Г.Майнулов, В.С.Лучкевич, А.П.Румянцев, В.В.Семенова СПб.: СПбГМА. 1996. 128 с.

118. Макешова, А.Б. Особенности регуляции эритропоэза у жителей высокогорья / А.Б.Макешова, А.А.Левина, Ю.И.Мамукова, А.Р.Раимжанов // Терапевтический архив. 2004. №11. С.43-51.

119. Мари, Р. Биохимия человека / Р.Марри, Д.Греннер, П.Мейес, В.Родуэлл. М. : Мир, том 1, 2004. С.52-62, 123-124, 335-366.

120. Мари, Р. Биохимия человека / Р.Марри, Д.Греннер, П.Мейес, В.Родуэлл. М. : Мир, том 2, "Мир", Москва 2004. С.71, 98-100.

121. Маршалл, В.Дж. Клиническая биохимия / Пер. с англ. под ред. Н.И.Новикова. -М. BINOM. 1999. 359 с.

122. Маурер, Г. Диск-электрофорез : (Теория и практика электрофореза в полиакриламидном геле) / Г.Маурер М. : Мир. 1971. 250с.

123. Машковский, М.Д. Лекарственные средства / М.Д.Машковский-15-е изд. М. РИА «Новая волна», Издатель Умеренков. - 2007. - 1206 с.

124. Медицинская лабораторная диагностика (программы и алгоритмы): справочник / Под ред. А.И. Карпищенко. СПб.: Интермедика, 2001. 544 с.

125. Медицинские лабораторные технологии и диагностика / Под ред. А.И. Карпищенко. Справочник, Т.1, С.-Пб., 1998,- 408 с.

126. Михайлова, Е.И. Онкомаркеры в кале в диагностике колоректаль-ного рака / Е.И. Михайлова, С.И. Пимонов, Е.В. Воропаев // Клиническая медицина: научно-практический журнал. 2007. Т. 85. №12. С. 62-67.

127. Молекулярная генетика / Под ред. Т. Тейлор, русск. перев. 1964. Т.1. С.113.

128. Москаленко В.Д. Психическая предрасположенность к развитию зависимости от ПАВ (личностные, социальные, семейные факторы риска): Руководство по наркологии в 2-х т. / Под редакцией H.H. Иванца. М.: Мед-практика - М., 2002. Т.2. С. 182-189.

129. Мутовин Г.Р. Основы клинической генетики / Г.Р.Мутовин -Учеб. пособие для мед. и биол. спец. вузов. 2-е изд., испр. и доп. - М.: Высш. шк. 2001. 166 с.

130. Наджар, М.Х. Лабораторные маркеры системного воспалительного ответа при оптимизации искусственного кровообращения / М.Х.Наджар, Ю.Г.Матвеев, В.В.Долгов и соавт. // Клин, лабор. диагностика. 2007. № 1. С. 19-22.

131. Назаров, С.Б. Закономерности развития эритрона белых крыс в пренатальном и раннем постнатальном онтогенезе Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук / С.Б.Назаров Иваново. 1995. 20 с.

132. Назаров, С.Б. Системный подход к изучению физиологии эри-трона и его реализация в онтогенетических исследованиях / С.Б.Назаров, JI.C.Горожанин // Вестник Ивановской медицинской академии. 1996. Т. 1. №3-4. С.30-37.

133. Николаев А .Я. Биологическая химия : учеб. для. студ. мед. вузов / А.Я. Николаев. Изд. 3-е. - М. : Мед. информац. агенство, 2004. - 566 с.

134. Никулина, Д.М. Практическое освоение иммунохимических методов. Метод.рекомендации / Д.М.Никулина Астрахань, 2007. 36 с.

135. Никулина, Д.М. Фетальный гемоглобин как тест для диагностики гипоксических состояний / Д.М.Никулина, О.Н.Дьякова, Ю.А.Кривенцев, И.Ю.Корноухова, А.Б.Агапова // Тезисы научных докладов "III съезд биохимического общества". Санкт-Петербург, 2002. С. 131.

136. Никулина, Д.М. Эмбриональный гемоглобин как критерий оценки гипоксии новорожденных / Д.М. Никулина, Ю.А.Кривенцев, Л.А.Бахмутова, Р.А.Бисалиева, С.В.Лапеко // Вестник российской военно-медицинской академии. С.-Пб. 2009. №1(25). С.450-451.

137. Об утверждении протокола ведения больных «реабилитацияSбольных наркоманией (Z 50.3). Приказ от 22 октября 2003 г. № 500. Москва, 2003. 135 с.

138. Обучение медицинской статистике. Двадцать конспектов лекций и семинаров. Пер. с анг. / ВОЗ. Под ред. С.К. Лванга, М.: Медицина, 1989216 с.

139. Овсянников, М.В. Клинические и психоаналитические аспекты исследования суицидального поведения у больных опийной наркоманией / М.В.Овсянников // Дискуссионные вопросы наркологии: профилактика, лечение и реабилитация : Иваново, 2005. С. 57-59.

140. Овчинников, Ю.А. Биоорганическая химия / Овчинников Ю.А. -М. Просвещение. 1987. С.120, 205-207.

141. Остерман, Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами / Л.А.Остерман М. Наука. 1983. 418 с.

142. Остерман, Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. / Остерман Л.А. М.: Наука, 1981. С.288.

143. Остерман, Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот // М. Наука. / Л.А.Остерман 1985. С. 115-167, 301-314.

144. Павленко, Е.Ю. Аспекты судебно-медицинской диагностики / Е.Ю.Павленко // Неотложные состояния в наркологии; под ред. Б.Д. Цыганкова. М.: Медпрактика М. 2002. С. 29-33.

145. Павлов А.Д. Эритропоэтин: биологические свойства и применение в клинической практике. / А.Д.Павлов, Е.Ф.Морщакова, А.Г.Румянцев -М.: Геотар, Медицина, 2001. 331 с.

146. Павлов, А.Д. Молекулярная структура регуляции эритрона / А.Д.Павлов // М. Гематология и трансфузиология. №4. 1988. С. 12-15.

147. Павлов, А.Д. Регуляция эритропоэза: онтогенетические аспекты / А.Д. Павлов, Е.Ф. Морщакова, А.Г. Румянцев // Гематология и трансфузиология. 1999. Т.44. № 6. С.62.

148. Павлов, А.Д. Регуляция эритропоэза: Физиологические и клинические аспекты / А.Д.Павлов, Е.Ф.Морщакова М.: Медицина, 1987, 272 с.

149. Павлов, А.Д. Синдром неадекватной продукции эритропоэтина при анемии / А.Д. Павлов, Е.Ф. Морщакова // Гематология и трансфузиология. 1999. Т.44. № 3. С.30-32.

150. Павлов, А.Д. Современные концепции о механизмах образования и действия эритропоэтина.- В кн.: Проблемы патофизиологии гемопоэза и циркуляции крови / Павлов А.Д. Рязань, 1978. С.6-9.

151. Павлов, А.Д. Эритропоэтин: молекулярно-генетические и клинические аспекты / А.Д. Павлов, Е.Ф. Морщакова // Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии. 2007. Т. 6. №2. С. 30-38.

152. Павлов, А.Д. Эритропоэтин: новые аспекты и перспективы / А.Д. Павлов, А.Г.Румянцева // Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии. 2008. Т.7. №2. С 5-7.

153. Пасман, Н.М. Показатели фетального гемоглобина при беременности, осложненной поздним токсикозом // Перинотальная охрана плода у женщин Сиб. региона: Сб. статей / Под ред. Анастасьевой Н.В.-Новосибирск. 1988. С.40-43.

154. Перутц, М., Молекула гемоглобина, в сборнике: Молекулы и клетки / М.Перутц М., 1966. 449 с.

155. Петрова, О.В. Уровни ферритина в тканях больных с алкогольной болезнью / О.В.Петрова, А.В.Коханов, А.А.Лапин и соавт. // Вопросы наркологии. 2008. №5. С. 54-57.

156. Пехов, А.П. Биология с основами экологии / А.П.Пехов СПб.: Издательство «Лань», 2000. 592 с.

157. Постников, Ю.В. Пренатальная диагностика наследственных ге-моглобинопатий / Ю.В.Постников, Ю.Н.Токарев // М. Гематология и транс-фузиология. №1. 1988. С.39-44.

158. Преображенский, H.A. Химия природных соединений / Преображенский H.A. М.: Химия, 1976. 456 с.

159. Приндулл, Г. Гемопоэз в желточном мешке / Г.Приндулл // Гематология и трансфузиология. 1998. Т.43. № 3. С.14-15.

160. Пупкова В.И. / В.И.Пупкова, Л.И.Банина, Н.И.Войтова // Патент РФ № 2159442, G 01 N 33/72,33/52, опубл. 20.11.2000. Бюл. № 32.

161. Пупкова, В.И. Определение гемоглобина в крови. Информационно-методическое пособие / В.И. Пупкова Кольцово, 2001. 17 с.

162. Пясецкая Н.М. Рекомбинантный эритропоэтин (эпоэтин-бета) и ранняя анемия недоношенных / Н.М.Пясецкая // Зб1рник наукових праць сшвробггниюв КМАПО т. П.Л. Шупика. Кшв. 2003. С.629-636.

163. Рапопорт, С.М. Медицинская биохимия, пер. с нем. / С.М.Рапопорт М., 1966. 428 с.

164. Рогов, O.A. Механизмы повреждения эритроцитов при остром отравлении монооксидом углерода (экспериментальное исследование). Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук / Рогов O.A. Иркутск. 2006. 25 с.

165. Рогов, O.A. Перекисное окисление липидов в эритроцитах при экспериментальном отравлении монооксидом углерода / О.А.Рогов,

166. И.А.Шперлинг, В.В.Новицкий, Н.В.Рязанцева // Фундаментальные исследования: 2006. № 6. С. 93-95.

167. Руководство по гематологии / Под ред. А.И.Воробьева, Ю.И.Лорие. М. 1979. 331 с.

168. Руководство по клиническим лабораторным исследованиям / Под ред. Л.Г.Смирновой. М. МЕДГИЗ. 1960. С.480-483.

169. Руководство по клинической лабораторной диагностике. Под ред.1. B.Меньшикова.

170. Румянцев, А.Г. Эритропоэтин: диагностика, профилактика и лечение анемий / А.Г.Румянцев, Е.Ф.Морщакова, А.Д.Павлов М., 2003. 448 с.

171. Рупперт, Й. Быстрое получение результатов: высокотехнологичные простые тест-системы для исследований по месту лечения / И.Рупперт, Н.Кузьмина // Клиническая лабораторная диагностика. 2008. № 9.1. C.З.

172. Русанов, В.М. Фракционирование белков плазмы в производстве препаратов крови / В.М.Русанов, Л.И.Скобелев М. Медицина. - 1983. С.128-129.

173. Савельев, О.Н. Определение свободного гемоглобина плазмы крови гемоглобинцианидным методом / О.Н.Савельев, В.П.Сухоруков, А.В.Киселева, Г.А.Королева//Лаб. дело. №10. М. Медицина 1988. С.45-47.

174. Сарычева, Т.Г. Морфофункциональная характеристика эритрона в норме (обзор литературы) / Т.Г.Сарычева, Г.И.Козинец // Клин. лаб. диагн. №5. 2001. С.3-8.

175. Сарычева, Т.Г. Некоторые особенности эритрона при эритремии / Т.Г.Сарычева, Е.А.Стрелецкая, Г.И.Козинец // Клин. лаб. диагн. №7. 2001. С.35-38.

176. Сарычева, Т.Г. Эритрон и почечная патология (обзор литературы) / Т.Г.Сарычева, Г.И.Козинец // Клин. лаб. диагн. №6. 2000. С.20-24.

177. Семенечева, Э.Б. Типы гемоглобина в норме и при воздействии на организм некоторых химических веществ : Автореферат диссертации на соискание степени доктора медицинских наук / Э.Б.Семенечева Киев. 2006. 53 с.

178. Серов, В.Н. Информационное пособие для акушеров-гинекологов. / В.Н.Серов, В.Н.Дрилепская, Е.В.Жаров, С.А.Шаповаленко,1. B.В.Яглов М. 2002. 15с.

179. Сингер, М. Гены и геномы: В 2-х томах. Пер. с англ. / Сингер М., П.Берг-М.: Мир, 1998. 878 с.

180. Сметанина, Н.С. Вторичный эритроцитоз у ребенка с артериове-нозным свищом левой почки / Н.С. Сметанина, И.С. Тиганова, A.A. Масчан и др. // Гематология и трансфузиология. 2000. Т.45. № 1. С.37-39.

181. Сметанина, Н.С. Наследственный семейный эритроцитоз / Н.С. Сметанина, Ю.Н. Токарев, А.И. Сергеева // Гематология и трансфузиология. 1999. Т.44. № 3. С.33-35.

182. Сметанина, Н.С. Соотношение генотипа и особенностей клинических проявлений ß-талассемии / Н.С.Сметанина, Е.Г.Казанец, Ю.Н.Токарев // Гематология и трансфузиология. 2001. Т.46. № 1. С.31-34.

183. Современные методы в биохимии / Под ред. В.Н.Ореховича. М. 1977. С.241-248.

184. Соколовский, В.В. Антигипоксанты в профилактике и терапии заболеваний / В.В.Соколовский // Международн. мед. обзоры. 1993.- №1.1. C.11-14.

185. Соловьева, Н.П. Степень генетической детерминации малых ге-моглобиновых фракций (А2, F) у здоровых лиц / Н.П.Соловьева, Е.Н.Сотникова, Р.Ф.Гарькавцева, И.Н.Лунга // Физиология человека. 1980. №3. Т.6. С.501-504.

186. Солодилова, М.А. Роль генетических и средовых факторов в детерминации количественного содержания основных белков мембран эритроцитов человека. Дис. на соискание ученой степени к.б.н. / М.А.Солодилова -М., 1999. С.160.

187. Солоненко, Ю.Т. Фетальный гемоглобин как индикатор длительной гипоксемии / Ю.Т.Солоненко, М.А.Лис, К.Н.Соколов // Достижения медицинской науки Республики Беларусь, 2009. С. 107-108.

188. Солохин, Е.В. Отравления опиатами (анализ секционного материала) / Е.В.Солохин, А.А.Каниболоцкий, И.А.Чернолихова и др. // Судебно-медицинская экспертиза. 2007. №2. С. 32-35.

189. Спивак, В.А. Генетическая гетерогенность аномальных гемогло-бинов человека. Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук / В.А.Спивак М. 2003. 251 с.

190. Справочник по лабораторным методам исследования / Под ред. Л.А. Даниловой. СПб.: Питер, 2003. 736 с.

191. Стародуб Н.Ф. Гетерогенная система гемоглобина: структура, свойства, синтез, биологическая роль / Н.Ф. Стародуб, В.И. Назаренко // АН УССР, Ин-т молекулярной биологии и генетики. Киев: Наукова думка, 1987. 198с.

192. Стародуб, В.Ф. Гетерогенная система гемоглобина. Синтез гемоглобина отдельных типов в онтогенезе и при патологии организма / В.Ф.Стародуб // Успехи современной биологии. 1986 №3. С 49-68.

193. Стародуб, Н.Ф. Молекулярно-генетические основы регуляции синтеза отдельных типов гемоглобинов / В.Ф.Стародуб // Цитология и генетика. 1980. №4. С.80-88.

194. Стародуб, Н.Ф. Радиационное поражение гемоглобина / Н.Ф.Стародуб, Г.М.Рекун, И.М.Шурьян Киев. Наукова думка. 1976. С. 1641.

195. Стародуб, Н.Ф. Образование комплекса гемоглобина с органическими фосфатами и его физиологическая роль / Н.Ф. Стародуб, И.А. Крикливый, Г.М. Рекун // Успехи соврем, биологии.-1975.-№3.-с.414-422.

196. Стоцкая, Г.Е. Фетальный гемоглобин у новорожденных детей в зависимовти от гестационного возраста / Г.Е.Стоцкая, Л.Н.Юрченко // Лаб. дело. 2006. Т.28. №11. С.13-15.

197. Стоцкая, Г.Е. Фетальный гемоглобин у новорожденных детей в зависимости от гестационного возраста / Г.Е.Стоцкая, Л.Н.Юрченко // Вопросы охраны материнства и детства. 1983. Т.28. № 11. С.13-15.

198. Страйер Л. Биохимия / Под. ред. С.Е.Северина. М. «Мир». 1998. Т.З. С.77, 154.

199. Страйер Л. Биохимия / Под. ред. С.Е.Северина. М. «Мир». 1998. Т.1. С.50-81.

200. Строев, Е.А. Биологическая химия / Е.А.Строев М. Высшая школа. 1986. С.102-107.

201. Строев, Е.А. Практикум по биологической химии / Е.А.Строев

202. B.Г.Макарова -М. Высшая школа. 1986. С.45-48.

203. Ступникова, С.К. Выделение и исследование белков /

204. C.К.Ступникова, Т.В.Токарева, И.К.Миронова // Издательство СГУ. 1982.-С.23-31.

205. Тейлор Д.Ф. Выделение белков. В кн."Белки" / Плд. ред. Нейрот и Бейли - И.Л.-М. 1967. 1056. Т.1. С.67-69.

206. Тодоров, И. Клинические лабораторные исследования в педиатрии / Й.Тодоров София. Медицина и физкультура. 1968. С.278-310.

207. Токарев, Ю.Н. Гемоглобинопатии: итоги и перстпективы ис-слндования / Ю.Н.Токарев // М. Гематология и трансфузиология. №3. 1986. С.7-11.

208. Токарев, Ю.Н. Лечение талассемии у детей, Учебное пособие для врачей / Ю.Н.Токарев, Д.Г.Газиев, Н.А.Карамян, и др. М.: 2003. 234 с.

209. Токарев, Ю.Н. Наследственные анемии и гемоглобинопатии / Ю.Н.Токарев, Ю.В.Постников, Н.Н.Скачилова М. 1983. С.245-289.

210. Толочко, Т.А. Спектрофотометрические исследования гемоглобина и его дериватов у рабочих промышленных предприятий / Т.А.Толочко // Мед. аспекты охраны окружающей среды: Тезисы конференции. Тарту, 2006. С.144-146.

211. Топунов, А.Ф. Гемоглобины: эволюция, распространение и гетерогенность / А.Ф.Топунов, Н.Э.Петрова // Успехи биологической химии. Т.41. 2001. С. 199-228.

212. Торубарова, H.A. Эмбриональный и фетальный гемопоэз: актуальные вопросы / Н.А.Торубарова // М. Гематология и трансфузиология. №5. 1991. С.20-24.

213. Тотолян, A.A. Значение оценки системы цитокинов в лабораторной диагностике / А.А.Тотолян // Клин, лабор. диагностика. 2008. № 9. С. 3.

214. Тутаева, В.В. Значение молекулярных маркеров в дифференциальной диагностике эритремии и вторичного эритроцитоза. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук / В.В.Тутаева М. 2006. 26 с.

215. Управление качеством клинических лабораторных исследований. Нормативные документы. // М. Лабпресс. 2000. С. 6-57.

216. Фогель, Ф. Генетика человека: В 3-х томах. Пер. с англ. / Фогель Ф., Мотульски А. М.: Мир, 1990. 695 с.

217. Хайруллина, А.Я. Метод экспресс-анализа дериватов гемоглобина в цельной крови / А.Я.Хайруллина // Проблемы создания аппаратуры для медицинских лабораторных исследований: Тезисы докладов. Л. 2006. С.28-29.

218. Хапугин, В.А. Клиническое значение фетального гемоглобина (НЬИ) при некоторых заболеваниях системы крови / В.А.Хапугин, З.В.Маркина, И.С.Симонова // Проблемы гематологии и переливания крови. 2007. №3. Т.21. С.60.

219. Храмкова, Н.И. Клиническая ценность иммунологической реакции на гонадотропин при нормальной и некоторых формах патологической беременности. Канд. Дисс. / Н.И.Храмкова Киев. - 1972. 125 с.

220. Цырусь, Т.П. Исследование двойных связей жирных кислот ли-пидов методом озонирования у онкологических больных / Т.П. Цырусь, В.И. Прохорова, Л.А. Державец и соавт. // Клиническая лабораторная диагностика. 2006. №6. С.41-43.

221. Чертков, И.Л. Нормальное кроветворение / И.Л.Чертков // М. Гематология и трансфузиология. №2. 1990. С.30-33.

222. Чертков, И.Л. Стволовая кроветворная клетка и ее микроокружение / И.Л.Чертков, О.А.Гуревич М., Медицина, 1984, -240с.

223. Шабанов, П.Д. Наркология: Практическое руководство для врачей / П.Д.Шабанов М.: ГЭОТАР - МЕД, 2003. 560 с.

224. Шевченко, В.А. Генетика человека: Учебник для студ. высш. учеб. заведений / В.А.Шевченко, Н.А.Топорнина, Н.С.Стволинская М.: Туманит. изд. центр ВЛАДОС, 2002. 361 с.

225. Шевченко, Н.Г., Марцишевская Р.Л. Клинико-диагностическое значение определения железа // Лаб. дело. 1. - М. Медицина. - 1983. - С.52-56.

226. Крюкова, A.A. Солохина, B.B. Томилина, Г.П. Джувалякова, А.Ф. Кинле. -М., 2007. С. 121 123.

227. Шимкевич, И.А. Современное состояние вопроса о кислород-транспортной системе крови (обзор литературы) / И.А.Шимкевич, С.Ш.Харнас, Л.С.Смирнов, Е.Д.Вовк // Анестезиология и реаниматология. 1985. №4. С.65-69.

228. Ширинова, Э.А. Иммунохимические методы и изоэлектрофоку-сирование в диагностике важнейших гемоглобинопатий / Э.А.Ширинова, Ю.Н.Токакрев, А.М.Ахундова, и соавт. // Баку. Азмеджурнал. №5. 2003. С.60-65.

229. Шиффман Ф.Дж. Патофизиология крови : пер. с англ. / Ф.Дж. Шиффман. М. : БИНОМ ; СПБ. : Невский диалект, 2000. - 448 с.

230. Шперлинг, И.А. Роль мембранно-связанного гемоглобина в патогенезе отравления оксидом углерода / И.А.Шперлинг, Н.В.Рязанцева, В.В.Бас и др. // Актуальные проблемы патофизиологии: Сб. материалов межгор. конф. молодых ученых. СПб, 2004. - С. 161.

231. Щербак И.Г. Биологическая химия. Учебник для медицинских вузов / Щербак И.Г. С-Пб.: Издательство СПбГМУ, 2005. - 480 с.

232. Эйхгорн, Г. Неорганическая биохимия / Под ред. М.Е.Вольпина и К.Б.Яцимирского. Перев. с англ. -М. Мир. 1978. Т.2. С.218-253.

233. Элиот, В. Биохимия и молекулярная биология / В.Эллиот, Д.Эллиот М. Издательство РШИ Биомедицинской химии РАМН. 2000. С.311-321.

234. Энциклопедия клинических лабораторных тестов / Под ред. Н.У.Тица. М. Лабинформ. 1997. С.124-136, 418-420.

235. Эфроимсон, В.П. Введение в медицинскую генетику / В.П. Эфро-имсон М. Медицина. 1998. С. 124-139.

236. Юдина, М.В. Клинико-лабораторная характеристика и показатели порфиринового обмена у детей с анемиями, лечение / М.В.Юдина Екатеринбург. 2007. 24с.

237. Ягубова, В.И. Содержание метгемоглобина и его сравнение с количеством глобиновых и мембранных белков эрмтроцитов у больных с 13-талассемиями / В.И.Ягубова, Г.А.Алекперова, Т.А.Аскерова и соавт. // Клиническая лабораторная диагностика. №5. 2004. С1-56.

238. Яцык, Г.В. Перспективы применения эритропоэтина в неонатоло-гии / Яцык Г.В., Одинаева Н.Д.// Вопросы современной педиатрии. М. 2002, т. 1, №5, С.32-36.

239. Список иностранной литературы

240. Abraham, Е.С. Hemoglobin / E.C.Abraham, T.Ozawa, C.A.Niazi et at. -2007. Vol.1, -p.691-695.

241. Acker, T. Hypoxia and hypoxia inducible factors (HIF) as important regulators of tumor physiology / T.Acker, K.H.Plate // Cancer Treat. Res. 2004. Vol.117. P.219-248.

242. Ahmed, A.I. Studies on the holf-lifeon schwangerschaftsprotein / A.I.Ahmed, A.Klapper// Brit. J. Obstet.Gynaecol. 1983. V.90. №10. P.904-907.

243. Alfrey, C.P. Erythropoietin an elusive hormone / C.P.Alfrey, S.A.Biggs // J. Lab. Clin. Med., 2006, 97. p.141-143

244. Alippi, R.M. Erythropoietin responce to hypoxia in mice with polycythemia induced by hypoxia or transfusion / R.M.Alippi, A.C.Barcelo, C.E.Bozz-ini // Exp. Hematol., 1983, 97. p.141-143.

245. Amiconi, G. Interaction of hemoglobin wish salts: effects on the functional properties of human hemoglobin / G.Amiconi, E.Antonini, M.Brunori et al. // Mol. Biol. 1981. Vol.152(1). P.lll-130.

246. Andreux, J.R. Erythropoietic progenitor cells in human fetal blood / J.R.Andreux, M.Renard, F.Dqffos et al. // Nouv. Rev. Franc. Hematol., 1991, 33, p.223-226.

247. Antonini, E. Hemoglobin, «Annual Review of Biochemistry» / E.Antonini, M.Brunori 1970, v. 39, p.977-1042.

248. Bard, H. The relative rates of hemoglobins A and F in immature red cells of newborn infants / H.Bard, E.L.Macowski, G.Meschia, E.C.Battaglia // Pediatrics. 1970. Vol.45, p.766-772.

249. Bertles, J.F. Human fetal hemoglobin: significance in disease / J.F.Bertles // Ann. N. Y. Acad. Sei. 1974. 241, p.638-652.

250. Betke, K. Fetaler und bleibender Blutfarbstoff in Erithrozyten und Erithroblasten von menschlischen Feten und Neugeboreren / K.Betke, E.Kleinhauer//Blut. v.5. p.241-249. 1958.

251. Betke, K. Hemoglobin in Blood / K.Betke, H.R.Marte, I.Schlift // Nature. 1979. Vol.184, p.1877-1878.

252. Black,V.D. Neonatalpolycythemiaandhyperviscosity-Pediatr / V.D.Black, L.D.Lubchenko // Clin. North. Am., 1982, 29, p.l 137-1148.

253. Boissel, J.-P.R. Erythropoietin: mammalian sequences and scanning deletions support a four alpha-helical bundle structural model / J.-P.R.Boissel, D.Wen, H.F.Bunn//Ann. N.Y. Acad. Sei., 1994, 718. p.203-212.

254. Bolton, W. Three dimensional fourier synthesis of horse desoxy-haemoglobin at 2,8 A resolution / W.Bolton, M.F.Perutz // Nature. 1970. V.228, N.5271. p.551-552.

255. Bowman, J.E. Distribution and Evolution of Hemoglobin and Globin Loci / Bowman J.E.// The University of Chicago Sicke Cell Center Hemoglobin Symposia, 4. 2006. 360 p.

256. Branden, C. Introduction to a protein structure / C.Branden, J.Tooze // Garland Publishing. 1991. N. 7. p.51-52.

257. Brown, S. Spontaneous increase in erythropoietin and hematocrit value associated with transient liver enzyme abnormalities in an anephric patient undergoing hemodialisis / S.Brown, J.Caro, A.J.Erslev et al. // Am. J. Med., 1980, 68. p.280-284.

258. Bunn, H. Regulation of hemohlobin function in mammals / H.Bunn// Amer. Zool. 1980. 20. №1. p. 199-211.

259. Bunn, H.F. Hemoglobin: Molecular, genetic and clinical aspects / H.F.Bunn, B.G.Forget // Philadelphia etc.: Saunders, 1986.-VII, 690. P.l 11.

260. Calhoun, D.A. Consistent approaches to procedures and practices in neonatal hematology / D.A.Calhoun, R.D.Christensen., C.S.Edstrom et al. // Clin Perinatal, 2000, vol. 27, p. 733-753.

261. Cantor, C.R. Biophysical Chemistry, p.l. The Conformation of Biological Macromolecules / C.R.Cantor, P.R.Schimmel // Freeman, San Francisco. 2007. V.13,p. 183-188.

262. Cotes, P.M. Changes in serum immunoreactive erythropoietin during the menstrual cycle and normal pregnancy / P.M.Cotes, C.E.Canning // Br. J. Obstet. Gynaecol., 1983, 90, p.304-311.

263. Cotes, P.M. Immunoreactive erythropoietin in serum. I. Evidence for the validity of the assay method and the physiological relevance of estimates / P.M.Cotes // Brit. J. Haematol., 1982, 50. p.427-438.

264. Dayhoff, M.O. Biomedical Research Foundation, Silver Spring / M.O.Dayhoff // Atlas of Protein Sequence and Structure, V.4, National. 2006. p.16-19.

265. De Halleux, V The effect of blood transfusion on the hemoglobin oxygen dissociation curve of very early preterm infants during the first week of life / V. De Halleux, A.Truttmann, C.Gagnon et al. // Semin Perinatol. 2002. 26(6): p.411-415.

266. Dean, A. Heterogeneity of erythroid precursor cells. Hemoglobin quantitationins single clones by radioimmunoassay/ A.Dean, A.N.Schechter,

267. T.Parayannopoulou, G.Stomatoyannopoulou // Biol. Chem. 1981. 256(3).-P.863-872.

268. Dean, J. Sickle-cell anemia: Molekular and lubar basis of therapeutic approaches. (3 parts) / J.Dean, A.N.Schechter // N.E.Med. 1978. p.299, 752, 804, 863.

269. Dessypris, E.H. Effect of pure erythropoietin on DNA-synte-sis by human marrow day 15 erythroid burst forming units in short-term liquid culture / E.H.Dessypris, S.B.Krantz // Brit. J. Haematol., 1984, 56. p.295-306.

270. Dhindsa, D.S. Postnatal changes in oxygen affinity of rat blood / D.S. Dhindsa, J. Netcalf, D.W. Blackmore, R.D. Koler // Comp. Biochem. and Physiol.A. 2001. Vol.69 №2. P.279-293.

271. Dinkelaar, R.B. Metabolic studies on erythropoietin (Ep): II The role of liver and kidney in the metabolism of Ep. / R.B.Dinkelaar, E.G.Engels A.A.Hart et al.// Exp. Hematol., 1981, 9. p.796-803

272. Doshkind, K. Regulation of hemopoiesis by bone marrow stromal cells and their products / K.Doshkind // Ann. Rev. Immunol., 1990, 8. p. 111-137.

273. Drysdale, J.W. The separation of human and animal hemoglobins by isoelectric separation focusing in polyacrylamide gel / J.W.Drysdale, P.Righetti, H.F.Bunn // Biochim. et biophys. acta. 2006. 229, N1. p.42-50.

274. Eckardt, K.-U. Serum immunoreactive er thropoietin of children in health and disease / K.-U.Eckardt, W.Hartmann, U.Vetter et al.// Eur. J. Pediatr., 1999. 149, p.459-464.

275. Eckardt, K.U. The ontogeny of biological role and production of erv-tiB poietin / K.U.Eckardt // J. Perinatal Med., 1995, 23, p. 19-29.

276. Efremov, G.D. Structural variants of human hemoglobin / G.D.Efremov // Period, biologorum. 1984. 86 (2). P.83-94.

277. Eichhorn, K.H. Lack of assoc;i: between fetal and maternal erythropoietin at birth / K.H.Eichhom, C.Bauer, K.U.Eckardt et al.// Eur. J. C:-Gynecol. Reprod-Biol., 2003, p.50, 47-52.

278. Erslev, A.J. Clinical erythrokinetics: a critical review / A.J.Erslev // Blood Rev., 1997, 11. p.160-167.

279. Erslev, A.J. Pure red-cell aplasia: a review / A.J.Erslev, A.Soltan // Blood Rev, 2006, 10. p.20-28.

280. Eschbach, J.W. A comparison of the responses to recombinant human erythropoietin in normal and uremic subjects / J.W.Eschbach, FI.R.Haley, J.C.Egrie etal. // Kidney Int. 1992. Vol.42, p.407-416.

281. Fahey, J.L. Quantitative determination of serum immunologlobulins in antibody-agar plates / J.L.Fahey, E.M.McKelvey // J. Immunol. 1965. pp.84-90.

282. Fairbanks, V.P. Hemoglobinopathies and Thalassmias / V.P.Fairbanks // Laboratory Methods and Case Studies. New York, Themestatton, Inc., 1999. V.22. p.531-536.

283. Fanelli, A.R. Hemoglobin and myoglobin / A.R.Fanelli, E.Antonini, A.Caputo // Advances in Protein Chemistry. 1964. V.19. p. 173-222.

284. Finne, P.H. Regulation of erythropoiesis in the fetus and newborn / P.H.Finne, S.Halvorsen // Arch. Dis. Childhood, 2006, V.47, p.683-687.

285. Fischer, L. An introduction to gel chromatography / L.Fischer // North-PIolland. Amsterdam. 1969. P. 148-151.

286. Fitch, W.M. Evidence suggesting a partial, internal duplication in the ancestral gene for heme-containing globins / W.M.Fitch // J. Molecular Biology. 1996. Vol.16. №1. p. 17-27.

287. Florkin, M. Elsevier / M.Florkin, E.H.Stotz // Comprehensive Biochemistry, 13, Amsterdam, 2nd end. 1995. p. 18.

288. Garcia, J.F. Radioimmunoassay of erythropoietin: circulating levels in normal and polycythemic human beings / J.F.Garcia, S.H.Ebbe, L.Hollander et al. // J. Lab. Clin. Med., 1982, 99. p.624-635.

289. Garric, L. Rat haemoglobin heterogeneity. Two structuraldistinct cx-chains and functional behaviour of selected components / L.Garric, V.S.Sharma, M.J.McDonald, II.M.Ranney // Biochem. J. 2005. Vol.149, N8. p.245-258.

290. Goldwasser E. Structure-function relationship of erythropoietin. In: Erythropoietin-Molecular, Cellular and clinical Biology / Eds. A.J.Erslev, J.W.Adamson, J.W.Eschbach, C.Winnearls. Baltimore, 1991, p.41-52.

291. Grabar, P. Methode permettant tetude cunjuguse des propriétés elec-triphoretigues et immunichimigues d un melange de proteines. Application au serum sanguin / P.Grabar, C.P.Williams // Biochim. Biophus. Acta. 1953. V.10. P. 193.

292. Green, A.R. SCL is coexpressed with GATA-1 in hematopoietic cells but is also expressed in developing brain / A.R.Green, T.Lints, J.Visvader et al. // Oncogene, 1992, 7. p.653-660.

293. Grilli, G. Variations in erythroid and myeloid progenitor cell numbers in normal human peripheral blood / G.Grilli, F.Garbonell, T.M.Fliedner // Brit. J. Plaemat, 1980, 44. p.679-681.

294. Haemoglobin Cyanide Standart Preparation. International Committee for Standartisation in Haematology // Wld Hlth. Org. Tech Rep. 1967. Ser. 384, p.14.

295. Hall, C. Essential biochemistry and physiology of (NT-pro)BNP / C.Hall // European J. Heart Failure. 2004. Vol. 6. №.3. 257-261.

296. Halleux, V. The effect of blood transfusion on the hemoglobin oxygen dissociation curve of very early preterm infants during the first week of life / V. Halleux, A. Truttmann, C. Gagnon, H. Bard // Semin. Perinatol. 2008. V. 26. №6. P.411 -415.

297. Hammerman, C. «Bloodless» may not be «harmless» / C.Hammerman, M.Kaplan // J Perinatol. 2000. V. 3, p. 206.

298. Hays, S. Transfusion malgre erythropoietine recom-binante: echec ou limite du traitement? Etude d'une cohorte annuelle de poids de naissance inferieur a 1500 g. / S.Hays, B.Guy, M.S.Boulard et al. // Arch Pediatr, 2001. Vol.8, p. 355360.

299. Hellebostad, M. Serum immunoreactive erythropoietin in healthy normal children. / M.Hellebostad, P.Haga, P.M.Cotes // Br. J. Haematol., 2006, Vol.70, -p.247-250.

300. Hill, R.L. Evolution of hemoglobin primates / R.L.Hill // Proc. Nat. Acad. Sci. 2006. 50. №5. p. 885-892.

301. Hoard, J.L. Erythropoietin in healthy normal human / Hoard J.L., M.J.Hamor, T.A.Hamor, W.S.Caughey // J. Am. Chem. Soc., 87, 2312. 2003. Vol.59, -p.347-350.

302. Hoard, J.L., in: A.Rich, N.Davidson (eds), Structrural Chemistry and Molecular Biology / W.H.Freeman San Francisco. 1968. 573 p.

303. Hoidal, J.R. Cellular and biochemical mechanisms in chronic obstructive pulmonary disease / J.R.Hoidal, P.K.Jeffery // Eds: Postma D.S., Siafakas N.M. The European Respiratory Society Monograph, 7 May, 1998. p. 1-302.

304. Huch, R. Erythropoietin in obstetrics / R.Huch, A.Huch // Hematol. Oncol. Clin. North. Am., 1994, 8, p. 1021-1040.

305. Huch, R. Maternal and fetal erythropoietin: physiological aspects and clinical significance / R.Huch, A.Huch // Ann. Med., 1993, 25, p.289-293.

306. Huisman, T.H.J. The Hemoglobinopathies / T.H.J.Huisman // Methods in Haematology. Edinburgh, Churchill Livingstone, 1996. Vol.15, p. 769-843.• A

307. Huisman, T.H.J, y -type of the hereditary persistence of fetal hemoglobin with (3-chain production in cis / T.H.J.Huisman, A.Miller, W.A.Schroeder // Amer. J. Human Genet. 2005. Vol.27, N6. p.765-777.

308. Ireland, R. Fetal and maternal erythropoietin levels in normal pregnancy / R.Ireland, A.Abbas, B.Thilaganathan et al.// Fetal Diagn. Then, 1992, Vol.7, p.21-25.

309. Jacobs, P. Better tolerance of iron polymaltose complex compared with ferrous sulfate in the treatment of anemia / P.Jacobs // Hematology. 2000. Vol.5: p.77-83.

310. Juul, S.E. Non erythropoietic roles of erythropoietin in the fetus and neonate / S.E.Juul // Clin Perinatol. 2007. Vol. 27. p. 527-541.

311. Kamuzora, H. The ¿¡-chain, an a-like chain of human embrionic haemoglobin / H.Kamuzora, R.T.Jonnes, H.Lehmann // FEBS Lett. 1974. Vol.46, N 1. P.195-199.

312. Keintsch-Engel, R. New enzyme-linked immunosorbent assay method for measurement of serum erythropoietin levels and erythropoietin antibodies / R.Keintsch-Engel, K.Iiallermayer, A.Dessauer etal. // Blood Purif., 1990. Vol.8. -p.255-259.

313. Klotz, I.M. Ritional approaches chemotherapy: Antisickling agents / I.M.Klotz, D.N.Haney, L.C.King// Sience. 1981. p. 219.

314. Koury, M.J. Erythropoietin messenger RNA levels in developing mice and transfer of 125J-erythro-poietin by the placenta / M.J.Koury, M.C.Bondurant, S.E.Graber et al. // J. Clin. Invest., 1988, Vol.82, p. 154-159.

315. Koury, M.J. Erythropoietin retards DNA breakdown and prevents programmed death in erythroid progenitor cells / M.J.Koury, M.C.Bondurant // Science. 1990. Vol.248, p.378-381.

316. Koury, M.J, The fate of erythroid progenitor cells / M.J.Koury, L.L.Kelley, M.C.Bondurant//Ann. N.Y. Acad. Sci. 1994. Vol.718, p.259-270.

317. Koury, M.J. The maintenance by erythropoietin of viability, proliferation and maturation of murine erythroid precursor cells / M.J.Koury, M.C.Bondurant // J. CellPhysiol. 1988. Vol.137, p.65-74.

318. Koury, M.J. The molecular mechanism of erythropoietin action L M.J.Koury, M.C.Bondurant // Eur. J. Biochem., 2007, Vol.210, p.649-663.

319. Lappin, T.R. The effect of erythropoietin and other factors on DNA synthesis by mouse splen cells / T.R.Lappin, J.Rich, E.Goldwasser // Exp. Hema-tol., 1983. Vol.11, p.661-666.

320. Lee, G.R. Lea end Febiger / G.R.Lee, T.C.Bithell, J.Foerster, et al. // Wintrobes Clinical Hematology, 9th ed Philadelphia, 2006. Vol.11. p.661-666.

321. Levi, Z. A quantitative immunoichemical fecal occult blood test for colorectal neoplasia / Z. Levi et. al // Ann. Intern. Med. 2007. 146. P.244-255.

322. Loffler G. Basiswissen Biochemie mit Pathobiochemie / G.Loffler. 5 Aufl. Springer, 2003. - 834 p.

323. Maier, R.F. Umbilical venous erythropoiei;r and umbilical pH in relation to morphologic placental abnormalities / R.F.Maier, A.Gunther, M.Vogel et al.// Obstet. Gynecol., 2007. Vol.84, p.81-87.

324. Malek, A. Lack of transport of erythropoietin across the human placenta as studied by an in vitro perfusion system / A.Malek, R.Sager, K.-U.Eckardt et al. // Pflugers Arch., 1994, 427, p. 157-161.

325. Martin, O.J.K. Expression of an erythroid transcription factor in megakaryocyte and mast cell lineages / O.J.K.Martin, L.J.Zon, G.Mutter // Nature. 1990. Vol.344, p.444-447.

326. Matioli, G. Kinetics of the alkali denaturation of hemoglobin in the single erythrocyte / G.Matioli, B.Thorell // Blood. 1963. Vol.21. №1. p. 1-7.

327. Matolh, G. Regulation of erythropoiesis in the fetal rat / G.Matolh, R.Zaizov // Isr. J. Med. Sci. 1971, Vol.7, p.839-845.

328. Mladenovic, J. Erythroid colony growth in culture: analysis of erythroid differentiation and studies on human disease states. -In: Recent advances in haematology / J.Mladenovic, J. W.Adamson // Ed. A.V.Hoffrand, Edinburgh. 2006. Vol.3, p.95-107.

329. Monod, J. Allosteric Proteins and Cellular Control Systems / J.Monod, J.P.Changeux, F.Jacob // J. Mol. Biol. 1963. Vol.6. P.306.

330. Monod, J. On the Nature of Allosteric Transitions: A Plausible Model /J.Monod, J.Wyman, J.P.Changeux// Ibid. 1995. Vol.12. P. 88.

331. Muramatsu, S. Shortening of the peroid of primary immuneresponse by the prior injection of Freunde's adjuvants / S.Muramatsu // Nature. 2005. Vol.201. №4924. P.1141.

332. Nicolaides, K.H. Cordocentesis in the investigation of fetal erythropoiesis / K.H.Nicolaides, B.Thilaganathan, R.S.Mibashan // Am. J. Obstet. Gynecol., 1989. Vol.161, p.l 197-1200.

333. Nienhuis, A.W. Mapping the human genome / A.W.Nienhuis // N. Eng. J. Med. 2008. Vol.299, N4. p.195-196.

334. Okunuki, K. Structure and Function of Cytochromes / K.Okunuki, M.D.Kamen, I.Seruzu // University of Tokio Press. 2005. Vol.45, N3. p.225-23 1.

335. Oski, FA. The erythrocyte and its disorders. In: Hematology of Infancy and Childhood / FA.Oski, D.G.Nathan, F.A.Oski. // Philadelphia, W.B. Saunders Company, 1987, p. 16-43.

336. Oudin, G. Method d'analyse immunochimigue par precipitación speci-figue en milien gelifie / G.Oudin // Compt. Rend. Acad. Sci. 2006.-V.222. P. 195.

337. Pataryas, H.A. Hemoglobins in human fetuses: evidence for adult hemoglobin production after the 11-th gestation week / H.A.Pataryas, G.Stamatoyannopulos // Blood. 1972. 39, N5. p.688-696.

338. Patel, V.P. The fibronectin receptor on mammalian erythroid precursor cells: Characterization and developmental regulation / V.P.Patel, H.F.Lodish // J. Cell Biol., 1986. Vol.102, p.449-456.

339. Perutz, M.F. Molecular Anatomy, Physiology, and Pathology of Hemoglobin / M.F.Perutz Molecular Basis of Blood Diseases. Ed. C. Stammata-gayanopoulus et al. Philadelphia: Saunders, 1987. 349 p.

340. Perutz, M.F. Hemoglobin structure and respiratory transport / M.F.Perutz // Sci. Am. (Dec.), 1978. Vol.239, p.92.

341. Perutz, M.F. Nature of Haem-Haem interaction / M.F.Perutz // Ibid. 1972. Vol.237, N5357. p.495-499.

342. Perutz, M.F. Stereochemistry of cooperative effects in haemoglobin / M.F.Perutz//Nature. 1970. Voí.228. N5273. p.726-734.

343. Perutz, M.F. The regulation of oxygen-affinity of hemoglobin: Influence of structure of globin on heme iron / M.F.Perutz // Annu. Rew. Biochem. 1979. Vol.327., №13, p.669-672.

344. Pollak, A. Effect of intravenous iron supplementation on erythropoi-esis in erythropoietin-treated premature infants / A.Pollak, M.Hayde, M.Hayn et al.//Pediatrics. 2001. Vol.107, p.78-85.

345. Rege, A.B. A radioimmunoassay for erythropoietin: serum levels in normal subjects and patients with hemopoietic disorders / A.B.Rege, J.Brookins, J.W.Fisher//J. Lab. Clin. Med., 1982. Vol.100, p.829-843.

346. Romeo, P.H. Megakaryocyte and erythrocyte lineages share specific transcription factors / P.H.Romeo, M.H.Prandini, V.Joulin et al. // Nature, 1990. Vol.344, p.447-449.

347. Rossi-Fanelli, A. Studies on the structure of hemoglobin. 1. Physi-cichemical properties of human globin / A.Rossi-Fanelli, E.Antonini, A.Caputo // Biochem. and Biophys. acta. 1958. Vol.30, N.3. p.608-615.

348. Sahli, H. Lehrbuch der klinischen Untersuchungsmethoden, 2 aufl. / H.Sahli Leipzig. 1899. 18 p.

349. Salvado, A.J. Characterization of multiple erythroid progenitors evail-able in large quantity from rabbit marrow / A.J.Salvado, A.J.Sytkowski // Exp. Hematol., 1981, Vol.9, p.595-603.

350. Schooley, J.C. Erythropoietin complexed with the F(ab)2 fragment of anti-erythropoietin retains its biologic activity / J.C.Schooley // Exp. Iiematol., 2006. Vol.8, p.830-836

351. Schroder, J.W. Interleukin-3 // The Cytokine Handbook / Ed. A. Thomson N.Y.Academic Press, 1991. — p.101-118.

352. Schwartz E., Gill F.M. Hematology of the newborn. In: Hematology / Eds. W.J.Williams, Beutler E. et al. N.Y. McGraw-Hill Book Company, 1983. p.37-47.

353. Semenza, G.L. Erythropoietin of synthesys haemohlobin / G.L.Semenza, G.L.Wang//Mol. Cell Biol. 2002. Vol. 12. P. 5447.

354. Shatkin, A.J. mRNA cap bindingproteins: Essential factors for initiat-ingtranslation / A.J.Shatkin // Cell. 1985. Vol.40, p.223.

355. Singer, K. Studies of abnormal haemoglobins. 1. Their demonstration in sickle cell anemia and other hematolic disorders by means of alkali denaturation / K.Singer, A.J.Chernofi, L.Singer// Blood. 1951. Vol.6. №5. p.413-429.

356. Steinmeier, R.C. Kinetic studies on the five principal components of normal adult human hemoglobin / R.C.Steinmeier, L.I.Parkhurst // Biochemistry. 1975. Vol.14, N8. p.1564-1572.

357. Stevenson, D.K. Increased immunoreac-tive erythropoietin in cord plasma and neonatal bilirubin production in normal term infants after labor /

358. D.K.Stevenson, L.R.Bucalo, R.S.Cohen et al. // Obstet. Gynecol., 1986, Vol.67, p.69-73.

359. Teramo, K.A. Amniotic fluid erythropoietin correlates with umbilical plasma erythropoietin in normal and abnormal pregnancy / K.A.Teramo, J.A.Widness, G.K.Demons et al. // Obstet. Gynecol., 2007. Vol.69, p.710-716.

360. Thomas, R.M. Erythropoietin and conll blood haemoglobin in the regulation of human fetal erythropoie / R.M.Thomas, C.E.Canning, P.M.Cotes et al. // Brit. J. Obstet. Gynaecol., 1983. Vol.90, p.795-800.

361. Thompson, S.M. Whatman advanced ion exchange celluloses / S.M.Thompson //Laboratory manual, W.R. Ralston. 2002. Vol.19, p.449-454.

362. Tietz, N.W. Fundamentals of Clinical Chemistry / N.W. Tietz Philadelphia, W.B. Saunders Co., 1986. 483 p.

363. Ulman, J. The role of erythropoietin in erythropoiesis regulation in fetuses and newborn infants / J.Ulman // Ginekologia Plska. 1996. Vol.67, p.205-209.

364. Wade-Evans, V.l. Erythropoietin and the early anaemia of prematurity / V.l.Wade-Evans // Erythropoiesis. 1991. Vol.2, p.41-46.

365. Weatherall, D.J. The Thalassaemic Syndromes, 3rd ed. / D.J.Weatherall, J.B.Clegg Oxford, Blackwell Scientific Publications, 1981. p.750-767.

366. Wetland, E. In vivo activity of asialo-erythropoietin in combination with asialo-glycoproteins / E.Wetland, W.Hoppner, F.Blaker et al. // Blut, 1982. Vol.44, p.173-175

367. Widness, J.A. Impermeability of the ovine placenta to 35-S-recombinant erythropoietin / J.A.Widness, T.A.Malone, R.A.MuJson // Pediatr. Res., 1989. Vol.25, p.649-651.

368. Williams, W.J. The regulation of oxygen-affinity of hemoglobin: Influence of structure of globin on heme iron / W.J.Williams, E.Beutler, A.J.Erslev et al. // Hematology, 3rtl ed. New York, McGraf-Hill Book Co., 2000. Vol.31, p. 121128.

369. Wilson, J.G. Microenvironmental factors involved in the establishment of erythropoiesis in bone marrow / J.G.Wilson, M.Tavassoli // Ann. N.Y. Acad. Sci., 1994. 718. p.271-284.

370. Winslow, R.M. The hemoglobonopathies, Page 1666. In: The Metabolic Basis of Inherited Disease, 5th ed., Stanburi / R.M.Winslow, W.F.Anderson //Blood. 2001. Vol.91, p.328-339.

371. Wognum, A.W. An enzyme-linked immunosorbent assay for erythropoietin using monoclonal antibodies, tetrameric immune complexes, and substrate amplification / A.W.Wognum, P.M.Lansdorp, A.C.Eaves // Blood. 1989. Vol.74, p.622-628

372. Wolk, M. Blood cells with fetal haemoglobin (F-cells) detected by immunohistochemistry as indicators of solid tumours / M.Wolk, J.E.Martin, R.Constantin//Journal of Clinical Pathology. 2004. Vol.57. P.740-745.

373. Wolk, M. Structural variants of human hemoglobin / M.Wolk, R.Constantin, J.E.Martin // Journal of Clinical Pathology. 2004. Vol.57, p.740-745.

374. Wood, W.G. Plaemoglobin synthesis during human foetal development / W.G.Wood, D.J.Weatherall //Nature. 1973. Vol.244. N5412. p. 162-165.

375. Yeo, C.L. Effect of recombinant human erythropoietin on transfusion needs in preterm infants / C.L.Yeo, S.Choo, L.Y.Ho // J. Paediatr Child Health. 2001. Vol.37, p.352-358.

376. Zanjani, E.D. Erythropoietin does not cross the placenta into fetus / E.D.Zanjani, J.S.Pbdey, N.Slotnik et al // Pathobiology. 1993. Vol.61, p.211-215.

Информация о работе

Кривенцов, Юрий Алексеевич
доктора медицинских наук
Москва, 2010
ВАК 03.00.04

Диссертация

Гемоглобины человека: иммуннобиохимическая характеристика и медико-биологическое значение - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы