Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИММУНОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ PCEUDOMONAS CEPACIA

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ИММУНОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ PCEUDOMONAS CEPACIA"

л-аэт

ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ДРУЖШ НАРОДОВ АКАДЙМИЯ НАУК УКРАИНСКОЙ ССР

ОРД Ш. ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ МИКРОШДОГИИ И ВИРУООЛОПШ IM. Д. К. ЗАШШТДОГО

№ оравах ру*ошв»

СОДДАТКИНА МАРШ АЛЕКСАНДРОВНА

'УЖ 579.841.11.283

ИИШЮДШЧВСКОЕ ЙССЛШВДНИЕ ЛИПОШДИСАХАРЮЩ 998UDOMOIA8 01MOU

03.00.07 - KMKpodBoiKtVM ■ " .

Автореферат

дхоовргшщя н* софкаяя» учено! отвпвд* ««иада»* аиодагшчвоню нву!

Киев -1969

Работе выполнена в отделе Йнохяшш микроорганизмов ордена Трудового Красного Знамени Института микробиологии я вирусологии Л1.Д.К,Эв(1олотного АН УССР

Научный руководитель ; Заслуженные деятель науки УССР,

'профессор, доктор <5«ологячеокиж наук И,Я.Захарова ' -

Официальные оппоненты : доктор химических наук

Л,В.Бакиновокий

кандидат апологических наук, В.Н.Васильев '

Ведущее учреждение - Киевский государственный университет ' им.Т.Г.Шевченко -

. Защита состоится "¿0" МллцЛфТхИ 1989 г, в 10 чао. на заседание специализированного совета Д 016,06.01 по защите диссер-тадий на ооискавпе ученой степени доктора биологических неук при Институте микробиологии и вирусологи» им.Д.К.Заболотного АН УССР . (252143« Киев-143, ул.Д.К.Эаболотнвго 154, Институт кикройкологик ■ вирусологии АН УССР)

. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии и вирусологии им.Д.К.Забо лотного /Н УССР.

Автореферат разослан " аЛ'ЩШЮ. 1989 г.

Учений оекретарь специализированного совета4 ■ '

кандидат биологических наук Э.А.Коваленко

\

\

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. ПроОлейа борьбы с уоловво-патогешшин микроорганизмами, на долю которых по данный Всемирной Организации Здравоохранения приходится более половины общего числа илфекцион- -. них заболевании, является одной из важнейших а современно!) медицинской микробиологии. Особое место среди условий-латогенных бактерий занимает микроорганизм Pseudomonas cepacia («z Buikbolder 1950) Pelloroal and Holmea 1981 ВВИДУ своей неприхотливости к используемым источникам питания и широкого спектра устойчивости к антибиотикам, Особув опасность P.cepacia представляет для больных с иымунодефицитными состояния««,. Вследствие высокой устойчивости P.cepacia к действию антибиотиков наиболее перспективными представляются иммунологические методы "борьбы с вызываемыми ии инфекциями. В последние годы в этой связи активно разрабатывается серологическая классификационная схема вида (Uontsil, I9BI| Heidt, 1963» Hafcemurs, 1986); В то же время для успешной разработки 'методов иммунотерапии необходимо помимо иммунологического и иммунохимическое и химическое изучение поверхиосткых антигенов P.cepacia, в том числе и липополисахаридов {ЛПС), являющихся соматическими антигенами у грамотрицвтельных бактерий. Исследование ЛИС P.cepacia представляется важный как s плане выяснения молекулярных механизмов взаимодействия бактерии с макроорганизмоц и иммунной системой хозяина, так и для решения практических задач здравоохранения, таких, как создание единой классификационной схемы P.cepacia, необходимой для надежной иммунодиагностики заболевания, а также получения искусственных вакцин.

Цддр и задачи исследования. Основная цель'настоящего исследования состояла я разработке единой классификационной схемы вида P.cepacia на основе результатов ннмунохимического анализа ЛПС воех описанных до настоящего времени О-серогруш P.cepacia.

Для достижения поставленной цели было необходимо ;редшгь следующие задачи!

1. Получить лииополисахарщды из клеток P.cepecia различной серологической принадлежности, провести их деградации, выделить и изучить препараты липида А и^-специфических полиоахаридов (О-ПС).

2. Получить О-антисыворотки к исследуемым штакнам P.cepacia и с их помощью исследовать серологические характеристики ЛПС,

3. Провести хи лй^и^^Ц,^Jj^^м^и^полисахаридов

ЬИ jtjt J , Г.З 'M ГСЛГ

сгаеког з: £Ьш с:: «даю H.A. nr.. (д.омзмй

- г -

штаммов P.cepacia, относящихся к различным О-серогрупла«, изу- . чить особенности их ионосахаридного состава и строения.

4, Исследовать распространенно различных О-серогрупп среди штаммов P.cepacia, выделенных в некоторых регионах СССР.

5. На основании данных химического анализа к серологических ясследований ЛПС P. cepacia провести ревизию существующих классификационных схек вида.

Раучнвд. новизна.у практическая ценность работы. Впервые проведено иммунохимическое исследование ЛПС 22 штампов P.cepacia„ pa-" нее s этой плане не пзучевшихся{ охарактеризованы серологические особенности ЛПС штаммов P.cepacia, относящихся х различным О-се-рогрулпам.

Продемонстрирована значительная степень однородности жирнокио-лотного состава лклида А ряда штаммов P. cepacia, не зависящая от источника выделения штамма и его серологической принадлежности.

Структурные исследования позволили впервые установить строение повторяющихся звеньев О-специфическкх полисахаридов P.eepeoia у штаммов 4202, 4204, 4205, 4207, 4208, 4211, 4216, 673/2, относящихся к серогруппам 3, S, б, А, 6, Е, J, L, соответственно, а также штаммов HUB 4176 и 598/2. Исследован мояосахарядный состав: я строение 0-ПС штаммов 4200, 4201, 4203, 4209, 4210, 4213,4214, 4215, относящихся к серогруппа« I, 2, 4, С, D, g, H и I,соответственно, а также штамма 696. Данные химического анализа 0-ПС по-еволнют утверждать, что О-серогруппы 2 и с, 4 и С идентичны друг-другу, в то время как О-серогруплы I и Б, 9 и I, описанные в литературе ( ГвКшпчга, 1986) как аналоги,, имеют 0-ПС различного строения и, следовательно, не идентичны друг другу.

Описаны'2 новые О-оерогруппы Р. cepeda - серогрушш К и l¿t для 0-ПС первой из них характерно строение линейного О-рэшшнэ, а 0-ПС второй содержит в своем составе х-глэдеро-с-ианяо-гелтозу.

- На основании данных иммунохимическлх исследований предлагается создание единой классификационной схемы Р¿sapada 1 с обозначением О-серогрупп арабскими цифрами от I до 14 и далее, включающей описанные в настоящем исследовании серогруппы К и 1 под номерами 13 и 14, соответственно, серогруюту 4 (вместо серогрулп 4 и С)» серогруппу 2 (вместо серогрупп 2 и о), серогруппы А, В, E,J,для которых характерны структуры повторяющихся звеньев 0-ПС, описанные в настоящей работе, под номерами 7, 8, 9, II» соответственно. Серогруппы I и с, 3 и i, характеризующиеся высоким серологическим

родствоы, но обладающие О-ПС различного строения, до окончательного установления структуры О-ПС предлагается отнести к различным серотипau внутри одной серогрушш (I иди 3, соответственно).

Впервые проведено серотипирование штаммов Р.cepacia, выделенных из ризосферы различных видав растений и почвы в некоторых регионах СССР. Показано, что в этоИ группе штвиыов наиболее часто встречается 4 0-серогруппы: X, 13 и

Результаты работы имеют теоретическую ценность в плане выяснения мруктурной организации « биологической роли липополисахари-доа, для таксоношш бактерий рода Pseudоооаае, а также могут быть использованы для дальнейших разработок классификационноИ схемы вида P.cepacia в целях успешной ииыунодиагйоотики вида в клинике.

Апробация работы » Основные результаты и-положения работы представлялись на: УЫ Всесоюзной конференции "Химии и биохимия угле- ; водов" (Тбилиси, 1987} и УШ Советско-Иведском симпозиуме по химии углеводов (Киев, 1968). Диссертационная работа доложена на заседании научно-тематической микробиологической секции Инотвтута микробиологии и вирусологии АН УССР.

. . Рубликаииц. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Одъем работы.Работа изложена на 170 страницах машинописного текста и иллюстрирована 82 таблицами к 22 рисунками. Диссертация состоит из'введения, обзора литературы, экспериментальной чаете» обсуждения результатов, выводов и списка литературы, содержащего 182 источника, из них 147 иностранных авторов*

СОДЕРЖАНИЕ РАБОМ

Материал и методы. Объектом исследования на различных этапах работы служили 46 штаицов P.cepacia. ' Ha них SX штамм был получен из музея живых культур отдела антибиотиков Института микробиологии и вирусологии (HUB) АН УССР." К числу указанных штаммов относились следующие s 5757 (-500/1), 5758,.5759, 8767-5772, 5777, 6779 (*598/г), 579I-SW, 5795 (=673/2), 5?98(<=69б), 5864, 5874, 5Й77, 5987, 5939, 5979, 5980, 3161, 3X89, 6891, 5892, 5913, выделенные из почвы и ризосферы растения в Бётумскоы ботаническом оа-ду и Норильска, а также типовой, птамм HUB 4187 («АТСС 25416) и штамп 1ШВ 4176 («CCI! 2815). Кроме того, были научены еще 16 штампов клинического происхождении (штаммы 4200-4205 и 4207-4215),

"Автор выражает глубокую благодарность к.О.н, 0.И.Бойко за любеа-по предоставленные культуры P.cepacia

предетавлищие 0-серогруппы 1-6 и A-j, соответственно» » клесси- . фикациокных схомэх Heiat. (1983) и Накатите (1986) и любезно переданные шш доктором Монтоем из коллекции Института Постера (Франция) в доктором Шигега из коллекции медицинского колледжа в Фуку-пи ие (Япония). * .

Культуры бактерий вырасшвали на иясо-пептониои агаре при 80°С в течение 24 часов* клетки смывали 0,85£-ы раствором Unci, сушили ацетоном и эфиром. Лилополисахэрады из сухой бактериальной массы I? штаммов видел пли фа кол-вод noil экстракцией (Weetpiiai, 1954), очищали от принесен нуклеиновых кислот по методу Scott (I960). Общее содержание углеводов в ЛПС определяли реакцией с фенолом и серной кислотой ( Dubois, 1956); белка - по методу ( НоЪгоок, 1976 )t фосфора - по методу (Rethbvm, 1969) Р используя в качестве восстановителя : хлористое олово нуклеиновые киолоты определяли по абсорбции при Z60 ни.

Препараты структурах частей макромолекулы ЛПС получали уксуснокислым или щелочным гидролизом по методу (liuller - seltz, 1968). Липид А отделили центрифугированием( a О-спсцифический полисахарид и олигосахаркд кора выделяли путем гель-фильтрации углеводной составляющей на колонке с сефадексом ^G-50,

Лирнокислотный состав липида А исследовали путем газохромато-графического анализа метиловых эфиров жирных кислот не газовом ; . хроматографе "Цвет-ПО". Метилирование и трифторацетилированив . жирных кислот проводили ло методике Нова (1973), гидрирование согласно методу (Бергфильд, I964)i '.*•''

Восходящую буиажну» хроматография выполняли на бумага Flf-15 в системе к-бутанол t пиридин.: вода'(Chargaff,. 1948). ГКХ иоио-оахаридов проводили на хроматографа "сьгоа-5 " (ЧССР), ацетаты по-лполов получали ло методике Alb«reheiti (1967). Аминосоединения в гидролизагах О-ЛС анализировали на аминокислотном анализаторе "KIA-5" (HitsсЬД, Япония). В ряде случаев для идентификации ами-носоединений использовали метод деааиинированип (Дмитриев, 1974) о последующим анализом продуктов методом ГХХ.

Структурный анализ полисахаридов проводили методом ЯМР-спектроскопии. Спектры снимали на приборах TiP-бО, . Ш-250, (вгикег, ФРГ). Удельное оптическое вращение полисахаридов определяли на поляриметре "Perkin - Elmar", «одел! 141 (США). Метилирование полисахаридов проводили по методу Conrad (1972)» дезацети-лирование - с использованием триэтиламина, периодатное окисление - по методу Goldstein (1965).

G-антисывороиш к гретым культурам P.cepacia получали иммунизацией кроликов в соответствии с методикой (itonteii, 1981). Специфичность и титр О-антасывороток, серологическую активность и специфичность ЛПС контролировали реакцией колщепрецилитоции по общепринятой методике, ив тою и двойной пинунодиффуаин в агаре (Ouchterloni, 1У48) и в реакции пассивной геыагглютинации (LiaJ-berg, 1У ÓQ ) • Серотипированио шташюв P.cepacia проводили ието-дои агглютинации клеток на стекле в соответствии с методикой {Hoatell, , X98IJ,

Общая характеристике ДПС Р.cepacia

" 1С

Из сухой бактериальной uaccu 1? «таймов p.cepacia были выделены и очищены препараты ЛПС, содержание которых составляло примерно 5,5-10,5 % от сухого веса клеток. Do компонентному составу препараты ЛПС различных штаюдов P. cepacia несколько отличались друг от друга и в среднем содержали.от 20 до 60 Я углеводов, oí X до 7 % нуклеиновых кислот и от 2,5 до белковых примесей, Содержание фосфоре в препаратах ЛИС не превышало I,5-2¿, что отмечалось ранее и длн некоторых других видов рода Pseudomonaa (Каоннчук, 1979). ■ . * '

Путей уксуснокислой или« в некоторых случаях, щелочной деградации ЛПС о последующей гель-фильтрацией на сефадексе G-50 были получены Л1шид А, О-специфические полисахариды и олигосахариди кора» выход которых составлял от 1б до 40Í, от 15 до ff?% и от 5 до 12.% от исходного ЛПС, соответственно. Профили элюции углеводной составляющей всех без исклнчения шташгов P. cepacia свидетельствовали о то ti) что липополисахариды P. cepeda имеют строение, характерное для s-форы ЛГСС^граиотрицательных бактерий. Препараты ЛПС, 0-ПС и липида А были использованы в дальнейших- исследованиях.

Исследование жирнокислотного оостава липида Р.cepeda

Изучение жирнокислотного состава липида Л штаммов Р. cepacia

^Пропороты ЛПС P. cepacia штаммов LD1B 4137, 3181, 5Ü0/I, 696, 598/2 были любезно переданы нам мл.науч.сотр. 1ШВ Н.В.Танатар и были исследованы на различных этапах работы-

- б -

иожвт способствовать решения проблемы систематики атого весьма гетерогенного фанотипическа н серологнчеокя айда, так как сосредоточенны*) в липидв А 3-оксижирныа* кислоты служат надежный xeuo-таксономическим критерием (Ojeliu, 1983)» В »то!) связи было проведено сравнительное исследование жирнокяслотного состава липида А у 15 вггаммов клинического происхождения н ? штаммов, выделенных из ризосферы растений.

Как показали исследования (теблЛ), состав жирных кислот лилм-да А у большинства изученных нами штампов был качественно иденти5-чен и представлен насыщенными» ненасыщенными и окси-жирными кислотами. В наибольшей количестве в лилидв А содержались характерные для вида Э-окс«жирные кислоты: 3-оксигетрэдекэновая и Э-окся-гексадекановая, Основное различие в яирнокислотном составе липида. А итаииов P.cepacia • заключалось в количественных соотношениях до-декановой и тетрадекановой жирных кислот; однако разделение ютам- • ков по указанному признаку на две группы не дало корреляции с.распределением по феиотяпмческим признакам и с источниками выделения птаичов.

У двух штвмМов P.cepacia (штвмиы 4214 и 4211) были обнаружены некоторые особенности,жирнокислотного состава липида А. Липид А штамма 4214 содержал повышенное (по сравнении с другими »таймами) количество Z-окситетрадекановой кислоты* е также в высоком количестве неидентифицированнуи нами оксикислоту о числом атомов углерода свыше 16. Этот штамм Р. cepeda отличался от остааьных ло чувствительности к антибиотика)!: он был чувствителен к тетрациклину» эритромицину я канзмицину, что для F*cepacia является редкость» (Monteil, I98I)t Липид А ытаима 4211 обладал уникальным спектром жирных кислот« по—видимому! разветвленных и нами пока не идентифицированных; по спектру чувствительности к антибиотикам штамм 4211 был типичен, но-по ряду фенотипических приэнбков . отличался от остальных штаммов ?.cepacia.

Таким обрааоМ) полученные данные свидетельствовали о том» что ло составу жирных кислот липида А исследованная нами группа штам-. мов F, cepacia является весьма однородной (sa исключением итаммов 4211 и 42X4).

Серологические характеристики ЛПС

Серологические исследования ЛПС Р.espuela представляли для пас особый интерес, так как в литературе отмечалась значительная

, , Тайлаца I

Сэстав кгрншс кислот лдпада i P.cepaoia (соотношение дано в процентах до площади пиков ГН)

Li tslhi С12:0 С13:0 Р З-ОН С13:0 С15:0 2-0Н CI4iO З-ОН CI6:I г З-ОН CI6:0 CI5jG с 'З-ОН 1 х С16:0 С18:1 CI8iO .

4200 3,8 1,6 24,4 1,5 2,4 0,5 32,5 2,2 11,0 0,6 0,5 10,0 5,0 2,2

4201 0,9 Сл. 31,0 Сл. 1,1 2,2 30,5 3,8 5,5 0,5 2,5 13,6 5,5 '.2,6

4202 1,1 Сл. 29,4 Сл. Сл. ' 0,5 43,0 1,7 2,7 0,6 0,6 ■ 15,6 3,1 Сл.

4205 13,5 1,5 3,8 1,8 3,2 0, 8 32,8 5,3 12,7 0,5 2,1 11,5 7,8 2,4

4204 21,0 Сл. 4,8 0,5 0,5 Сл. 36,6 2,0 4,2 Сл. 1,1 15,6 5,2 7,1

4205 17,5 1,5 6,4 2,4 ' Сл. 25,1 5,3 10,3 0,8 2,5 14,6 9,9 2,1

4207 0,6. Сл. 29,8 Сл. Сл. 0,7 24,1 9,0 13,0 Сл. СЛ. 10,0 9,2 1,8

4206 . Сл. Сл. ' 35,0 0,8 1,7 0,7 32,7 2,0, 5,3 0,7 1,0 15,2 3,7 0,6

4209 21,8 Сл. 10,7 Сл. 0,6 СЛ. 33,7 1,0 4,3- 0,5 1,6 20,9 3,0 0,7

4210 Сл. Сл. 36,8 0,9 0,9 - 37,3 • i»o 4.3 Сл. 0,9 13,8 2,6 0,8

4213 Сл. Сл. 27, Т' I.I 1,8 .1,6 28,5 3,9 11,6 . I.I 2,1 11,0 6,1 2,4

4214 0,6 Сл. 27,1 0,8 1,8 10,3 26,7 1,4 2,9 М 3,0 Сл. 1,3 Сл.*

4215 0,7 5,7 19,0 4,0 4,1 2,7 17,6 4,0 13,7 Г,6 7,1 7,6 8,5 4,0

4216 0,5 1,0 21,3 1,0 1,9 7,0 32,3 1,9 7,6 0,5 2,5 12,2 6,0 2,0 .

500/1 17,0 0,5 6,8 Сл. Сл. Сл. 46,9 I»? 2,5 Сл. 0,5 20,2 2,7 Сл.

598/2 24,1 Сл. 9,8 Сл. Сл. Сл. 47,4 1.6 3,1 Сл. 0,5 11,8 1,4 Сл.

i-A > 050 1,2 Сл. - 40,0 Сл. Сл. Сл. 34,7 2,5 4,3 Сл. 0,9 И, 8 2,5 0,9

3ISI 20,5 Сл. '6,5 0,5 ■ Сл. Сл. 41,2 I.I 5,1 0,6 1,8 18,1 3,6 0,5

673/2 0,8 Сл. 42,8 0,6 Сл. Сл. 35,3 1,2 1,8 0,5 0,7 14,5 Ii* СЛ.

4X37 1,9 Сл. 40,7 Сл. 0,8 Сл. 30,9 1,6 5,6 .0,7 2,1 12,5 2,3 0,7 .

4176 3,4 0,5 22,4 1,8 2,3 2,0 24,0 6,6 11,0 2,3 2,1 8,8 8,7 4,0

.Вриаечание: Сл. - жирка я кислота содержиюя в количестве менее 0,53i * в лапвде Д данного атааиа содержится неидентифицированная онсшсислота с чиелои аюиов углерода > 16 (- 20%). '

серологическая неоднородность вида (Heidt, 1983( Нзкашиго, 1986), «о икиуяохиси'юская специфичность ЛПС не исследовалась. Для рсое-лил отоИ задачи бшш лолучеин О-антисыворотни к 15 штаммам p.cepacia различно!! серологической принадлежности. Полученные 0-антисы-воротки характеризовались в большинстве случаев относительно невысокими титрздш в реакции кольцзпрецилитации с гомологичными ЛПС (в средней от I : 50 ООО до I : 400 ООО) и давали одну дугу преципитации (п редких случаях - 2 дуги) с гомологичными ЛПС в реакции двойной иммуиоди'уфузии в агоре.

Изучение серологических характеристик ЛПС P.cepacia при помощи 15 О-тияирующих аитисывороток типа 1-6 и A-J подтвердило идентичность четырех О-серогрупп в японской и французской классификационных схемах (1 и D, 2 к О, 3 и 1, 4 и С), описанных в работе Hakemura (1986) как серогруппы-аналоги (табл.2). Следует отметить, что дли итзкков 4202 и 4215, серогрушш 3 и 1, соотсетсгвен-но, серологическая взаимосвязь била односторонней, а антисыворот-кк к итаммам 4203 и 420У давали низкие титры с гомологичными ЛПС. По данным реакции пассивной reieагглютинации (табл.2), 3 штампа , (598/2, 4X37, 696) относятся к серогруЛло 2 (=о)» I штамм (4176) -к серогруппе 3 (= I), а итаммн 673/1, 3161 и 500/1 не поддаются тяпированюо указанными выше О-антискворотками. Высокие титры в реакции пассивной генагглютинацки д;ш ЛПС этих трех чтаммоп наблюдались лишь с гомологячниап О-антисыворотками, причем било обнаружено, что JSnc и темпов 3181 n 500/1 обладают идентичными серологическими характеристиками. В это;) связи ми решили ввести две новые О-серогруппы в классификационную схему P.cepacia - серогруппу К, К которой относится штошш 3131 и 500/1, и серогрулпу 1, к которой относится штамм ¿73/2.

Исследование серологических характеристик ЛПС ряда штаммов P.cepacia (табл.2) покозэло также, что в большинстве случаев липо полисахариды обладают высоко!! серологической активность», характеризуемой в реакции пассивной геиагглютинации обратными титрами 256-Ю24 с гомологичными 0-антисыворотками. При этом следует отметить, что для вида P.cepacia характерно практически полное отсутствие внутривидовых О-антигенных свнзеК (таол.2) и относительная однородность О-антигенного состава ЛПС (количество полос преципитации ЛПС с гомологичной 0 -а н тис ыворо г ко ii, как правило, не лревыоа ет одно!1 - двух). Высокие перекрестные тигры отмечались только между серогруппами-аналогами 1 и D, 2 и а, 3 и t, 4 и С. Отсутствие перекрестных серологических реп Кц и El и езду J.ilC, выдели i!H!t:.:u из

Антиген

Серологические характеристики ЛИС ?.серас1а (указана обратные три ъ резкам пассивной геиагглюшнащкО

Серо- А в т л с и в о р о ! к а

группа

ТаЗлша 2

12 '3 А 5 б А В С Б Е в В 1 I ' К I

^гоо I 256 - -- -- ----512 - - -- -- -

4201 2 - 256 - - -- -- -- - ,25а - - - 32 -

4202 3 - - 256 - -- -- -- -- - Ю24 - - -

4203 4

4204 5 - - -- 256 - -- -- -- -- -- -

4205 6. - - - 25О - -- -- -- -- -4207 А - - -- - - 256 - -- -- -- -- -4208 В - - -- -- -256 - -- -- -- -4209 - С - - - ¿2.-- - - 32. - -- -- -- -4210 » 1225 - -- -- -- - 102$ ------4211 Е - - -- -- -- -- 1024 -----4213 О - - 12В - -- -- -- -- ¿55 _ _ _ зг -

4214 Н ----------- - 125----

4215 I - - -- -- -- -- -- -Ю24---

4216 3 ------------ - 32-4137 - 512 ---------- 126 - - - 32 -

3161 - 16 -- - - -- -- - 32 - -- 256 -50071 16 - -- -- -- -- 16 - -- 256 -673/2 - - -- -- -- -- -- -- -- 128 598/2 - 16 - -- - 32 -- -- 32 ----4176 - - 126 ---- ----- - 32 --696 - . - 64-------- - 16-----

¡¡ряиечавие: выделены перекрестные титры серогрулв-аналогов.

из штаммов различной серологической принадлежности, свидетельствовало о большой разнообразии химического строения 0-ПС.указанных штаммов. В то же время высокие титры перекрестных реакций между ДПС серогрупп-аналогов говорили в пользу предположения об идентичности строения 0-ПС этих штампов или о наличии в составе их 0-спе-цифических полисахаридов общих иммунодоиинантных участков. Для подтверждения этих гипотез были проведены структурные исследования ЛПС P.cepacla.

» "

Химический анализ 0-специфических полисахаридов P.cepacla

Эта часть нашего исследования.была посвящена изучению строе- . яия О-специфических полисахаридов штаммов P.cepacla различной серологической принадлежности при помощи целого комплекса методов химического анализа углеводов, таких» как к 13С-НМР-спектро-скопия» метилирование-ГЮС^-масс-спектрометрия,' определение.удельного оптического вращения и рада других.

Так» методом 3С-ЛМР-с л ек тро скопи и было показано, что струн-' тура .0-специфического полисахарида P.cepacla штамм 4202 (серогруппа 8) идентична таковой P.aeruginosa 012 (Кпирель, 1985), структура 0-ПС P.cepacla штамм 4204 (серогруппа 6) - структуре 0-ПС Р.aeruginosa X (классификация Кейтерта) (Книрель, 1986), структура 0-ПС P.cepacla штамм 500/1 (серогруппа К) - структуре 0-ПС серологически родственного штамма P.cepacla 3181 (Книрель, 1980) (табл.Э).

. Строение О-специфичес'ких полисахаридов P.cepacla штаммы 4207, 420В и 4205 (серогруппы А, В и 6, соответственно) было установлено на основании данных о моносахаридном составе 0-ПС, метилирования, бездеструктивного анализа методами и 13С-ЯНР-спектроско-пиа и расчета удельного оптического вращения (таби.3)|таккак О-специфические полисахариды штаммов 4207 и 4205 содержали 0-аце-ткльные группы (у последнего - в нестехиометрическом по отношении . к новосахаридным остаткам количестве), их исследовали также катодом ^С-ГШР-спектроскопии после дезацетилирования водным раствором триэтиламина. В результате для 0-ПС штаммов 4207, 4208, 4205 были установлены уникальные структуры повторяющихся звеньев 0-ПС, приведенные в табл.Э.

^Структурные исследования О-специфических полисахаридов проводились на базе Института органической химии им.Н.Д.Зелинского АН СССР (Москва) совместно с г.х.иД^'ГКлирелом и д.^х,н.AVC,î'la:i!itоры-л, котором "автор шражает глубок у>1_Здаголараость;

~ ** ~ Таблица 3

Структуры О-специфических полисакаридных цепей ЛПС и таймов Р. се рас I а

Штами

Серо-Грулпа

Структура повторяющегося звена О-ПС

4202

4204

4205

42 О? ' 4208 4211

4216

500/1 673/2

4176 598/2

5

6

А

В Б

К

X.

-4 )-ы,-Еиоа1рНДс- (1 - 2)- Р-Еишьг-О-

—4 )—«и1г»И1вр— (1 — 3 }- Р -1>-М«п11Ао-(1 —

-3 >-р-11-Ое1Г-(1—3 )-р _1>-11в11р-(1— ~ 6550Ао

2 ОАо

-»4)- р -ХМЛср-(1 -3)- р -С-Мапр-(1 —

ч-з )_р_0_аа1 г-< 1 — з )_ <ч-щ-Тиср-(1—

—3)- Р-Ю-СХсрНАо-О—3)-<*-Миер- (1— . . ..ОАо .

-1Мг1шр-(1-3)-<*-1>-Ю1ар-(>-р-1>-Ю1ер-( 1— » 3 )- ы-О-ЕЬар- )_л-и_ИЬар- (1 -Й >- < (

1ПС; структуре;идентична таковой шт.4202 • 2П01-4)- р -Г»-0в1ИАо- (1—4 >-^-1)- Оа1Мо-(1—

ЮС: структура идентична таковой от. 4187 (Книрель, 1935) .

2ПС: отруктура идентична таковой и г. 4207"

При установлении строения О-специфических полисахаридов 4-х штаммов P.cepacta (штаммы 4211, 4216, 4203, 4209« серогруппы Е, J, 4 и С, соответственно) после того, как был исследован их моносаха-ридный состав, бил' использован анализ ^-ЯНР-спектров с применением расчетного uегода на ЗДШ (Липкинд, 1987). В результате для 0-ПС штаммов 4211 и 4216 было подобрано ло структуре« для которых расчетный спектр был наиболее близок к экспериментальному ^C-WJP-спектру и которые были подтверждены анализом методом метилирования, расчетом удельного оптического вращения полисахарида (штамм 4211) или определением удельного оптического вращения моносахаридов« входящих в состав 0-ПС (птаим 42X6) (табл.3). Для штаммов 4203 и 4209 катодои ^С-Щ1Р-спектроскопии была установлена идентичность строения их О-специфических полисахаридов, построенных из трисахаридных повторяющихся звеньев« содержащих в своем составе ло два остатка галактозы и по одному остатку. н-ацетилгалактозамина) методом компьютерного анализа 13С-ЯМР-спектров указанных полисахаридов были выдраны три оптимальные линейные структуры данного моносахаридного состава, отличающиеся друг от друга положением замещения остатка f-галантопираноэы; ...

- 8) - p-D-Geliac-(1-3W-D-Üal-(1-2)- Р -D-Gal-(1-* _ 3) - р.-В-0а1Шс-(1-3>—<-D-Cal-(1-3)- P-D-Gel-(1-

-3) -p-D-0alHlo-(n-3)-ti-D-Gel-O-H)-p-D-Gal-(1-Для вибора единственно» структуры необходимы дальнейшие исследования (метилирование, периодаткое окисление), а пока строение повторявшихся звеньев 0-ПС штаммов 4203 и 4209 остается окончательно не установленным.

Необычный компонент был найден в составе О-слецифическоЯ лоли-сахаридной цепи P.cepacla штамм 673/2 (серогруппа L), Методом'1ЭС-(ШР-спектроскопии 0-ПС било показано, что он является регулярным и достроен из триоахаридних повторяющихся звеньев, содержащих по 2 б-деаоксигексознмх: остатка и по одному остатку гептозы. Присутству-щий-в-болыием количестве моносахарид был идентифицирован как рам-ноза, а для гептозы в результате ряда исследований (периодатное окисление полисахарида« "С-ЯМР-спектроскопия и определение удельного оптичеокого вращения выделенного в индивидуальном виде моносахарида) была установлена L-глицеро-Ь-иан но -ко нфи гу ра ци я (Та б л. 3). По навим данным; ь-глицерм>-манно-гептоэа - характерный компонент .коровой области ЛПС грамотрицательных бактерий - в составе О-специ-фической полисахаридной цепи обнаружена впервые.

Как показали исследования, О-специфические полисахарида штаи-

мов 4176 и 598/2 имеют более слокный О-антигенвый.состав, чем описанные выше О-ПС. Так, по данным 13С-ЯМР-сле ктро с копи и, О-ПС штамма 4176 содержит в своем составе два различных по строению полисахарида в примерно равном соотношении, причем структура одного из них идентична таковой О-ПС штамма 4202, построенного из дисаха-ридных повторяющихся звеньев, содержащих рибозу и. м-ацетил-галак-тозамин, а второй полисахарид представляет из себя гомополимер N-ацетилгалввгозаиина и также построен из дисахаридных повторявшихся звеньев. Структура этого второго полисахарида была установлена методами 13С-ЯМР-спек*роскопии и анализом методом метилирования после того, как он был выделен из О-ПС путем парциального гидролиза последнего щавелевой кислотой о последующей гель-фильтрацией продуктов гидролиза на сефздехсе G-15 (табл.З).

Наличие в составе О-ПС штамма 4176 двух полисахаридов различного строения подтвердили результаты серологических исследований, продемонстрировавшие различную серологическую специфичность двух полисахаридпых цепей, а также серологическое родство праймов Р.се-pacta 4176, 4202 и Р.aeruginosa 012, которое основано на идентичности строения ПС I и О-ПС этих штаммов. ■

В *С-ЯМР-спактре О-ПС штамма 598/2 присутствовали две серии сигналов с соотношением интегральных интенсивностей 2,5 : X. Сопоставление спектра атого полисахарида со спектрами О-ПС штаммов ■ P.cepacla 4137 (Книрель, 1985) и 4207 ^1 ока зало, что основная серия сигналов в спектра исследуемого полисахарида-идентична спектру О-ПС штамма 4137 со структурой, описанной в работе(Книрель,1985)s

— 4) -e<-D-Gal-<1-2)-«i-L-Itba-(1— ~ ^

Минорная серия сигналов спектра О-ПС образовала спектр, идентичный таковому О-ПС штамма 4207, Таким образам, в составе О-ПС штамма 598/2 в соотношении 2,5 г I содержатся два полисахарида, один из которых идентичен по структуре О-ПС штамма .4137, а второй - * О-ПС - штамма 4207. Этот вывод подтвердили данные по моносахарйд-ному составу полисахаридной фракции штамма 598/2.

Таким образом, нами были установлены полные структуры повторяющихся звеньев О-слецифических полисахаридов II штаммов Р.сера-cia (табл.3), причем было показано, что у двух штаммов P.cepacla структуры 0-4IC идентичны таковым двух серогрупп Р. eeruginoaa, а два штокма P.cepacla содержат в составе своих,О-аятигеяов по два полисахарида различного строения. Кроме того», структурные.исследования О-ПС подтвердили1идентичность серогрупп-аналогов 4 и С, основанную на идентичности строения их О-специфических полисахаридов.

Для остальных ? штаммов Р.серас to получены лишь предварительные данные о строении их О-специфических полисахаридов (тайлЛ).

■. '■ Таблица 4

ионосахаридный состав и строение 0-специфических полисахаридов штаммов P.cepacia

:о-свРо-: Штамм ,'грлта "

:Количе- ¿Поличе-

Ыоносахаридный состав О-ПС

:ридных :ридных остатков: цепей и

• • : 0-ПС :хиометрия

4201 г ПС I ; Gal + Hha - I ; I 2 ПС I ; ПС 2

' '' , ПС 2 t Man + Bhe - I I 3 Э : I

4213 ' а ПС t i Gal + Rkia - I * I 2 . ПС I i ПС г

ПС 2 t Man + Bbe -I > X 3 I 1 I

696 ПС I t Qai + Bba - i i I 2 ПС I 1 ПС г

ПС 2 i Hen + She - - Z : I 3 г i I

4200' I Glu + GluUio - I i i 2 I

4210 d . Glu + QluWAc - I » 1 3 I

4215 1 ПС I 1 FttC+GalM(c -1 » I 2 ПС I : ПС г

ПС Z j Puo ♦ Eba ~ I i I г 2 : I

4214 .;. "н Bba +■ Glu f suHHOcaxsp 5 X

. "■=■ BLJ

- I ' I ' I-

Так, данные о моносахаридном составе и строении О-ПС штаммов 4201) 4219 и 695 позволили выяснить причины серологического родства этих штаммов. Методом ГЖХ в виде полных ацетатов полиолов в составе О-ПС штаммов 4201, 4213 и 696 были идентифицированы одни и те «в моносахариды, но в различной стехиометрии; рамноза, галактозе и нанвоза (табл.4). Анализ *^С-ЯЦр-спектров указанных штампов позволил установить, что спектры О-ПС штаммов 4201 и 4219 Полностью) а штаммов 4201 (4213) и 696 частично идентичны друг другу и содержат полный спектр сигналов О-ПС штамма 4137,. имеющего структуру, описанную выше. Из дачных -ЯМР-опектроскопии следовало также, что второй (минорный) полисахарид в составе О-ПС штаммов 4201 и 4213 имеет одну и ту же структуру маннорамнапа с три-сахаридныа повторяющимся звеном, но отличается от маннорамнана,

входящего в состав О-ПС штамма 696 и имеющего другу» структуру. Соотношение галакторамнана и маннорамнана в составе О-ПС втих трех втаммов было различным и составляло S i 1,1 : 1 и 2 t I для ютам-мов 4201, 42X8 и 696, соответственно.

Исследование строения О-ПС штаммов 4200 н 42X0, представляющих по данным литературы {Hakamura, 1986) и данным наших серологических исследований.серогругаш-аналоги X и D, показало, что 0-специфические полисахариды этих втаммов имеют различные химические структуры, хотя по моносахаркдному составу идентичны я содержат глюкозу и н-ацет ил глюкоз аыинв соотношении примерно Iil. ^С-ЯКР-спектры О-ПС штаммов 4200 и 42X0 были различны и свидетельствовали о наличии регулярной структуры с дисахарвдным повторяющимся звеном у штамма. 4200 я с т^исахаридиым - jr штампа 42X0.

Аналогичным способом было показано» -что серогрулпы-аналоги В и t обладают О-ЛС о различными структурами. Структура 0-ПСвтам-ма 4202, серогрулпа 3, описана нами выше: его дисахаридные звенья построены из остатков рибозы и н-ацетилгалактоэаиива. По данным *%-ЯМР-спектрооколии О-ПС птамма 4215 представляет собой смесь двух полисахаридов, каждый из которых построен на днсахерндных повторяющихся звеньев, причем содержащийся в большем количестве полисахарид содержит рамнозу и N-ецеткягалвктозамия, а минорный полисахарид построен из остатков рамнозы и фукозы, Им предполагаем, что серологическое родство штаммов 4202 и 42X8 может быть связано с присутствием в составе О-ПС этих штаммов Н-ецетиягалакто-гаиива) однако для окончательных выводов необходимы дальнейшие серологические и структурные доследования«

И* наконец, было исследовано строение О-ПС итемма~4214, серогрулпа Н. Методом ГХХ посла девамшшровевкя гидроялзата было установлено, что О-ПС этого втамма содержит в примерно*равных количествах рамнозу» Глюкозу н аминосахар, нами пока не идентифицированный. Из данных 18С-ЯМР-спвктроскопии лолвоёхариде следовало» что он имеет регулярное строение н построек ив пвнтесахаркдшдс со» вторяпщихоя звеньев. Наличие неитасахарядного повторяющегося ввена у О-специфического полисахарида является* наряду » Необычный жир- • нокислотяым составом лилида А«ецв одной чертой» отличающей втамм 4214 от всех остальных исследованных нами втаммов P.cepaota. Установление структуры О-ПС зтога штамма требуетдальнвйпшх иссдедова-' ннй; . [

На основании данных серологических н структурных исследований ЛПС и О-ПС P.cepacta мы предлагаем ввести следующие изменения в

- 16 -

суцеотвусцие классификационные схемы вида (рис.I), Во-первьы, ввести единую систему обозначения серогрупп арабскими цифрами от I до и далее. Серогруппы Накамуры А, В, Е, Р, И, J ввести в схему под обозначениями ?, 8) 9, 10, II и 12, соответственно.

0-серогруппы ■ О-серогруппы О-серогруппы >

Хейдга (1983) в новой схеме Накаиуры (1986)

I :

I ■■ серотид 1а • с

V/

Н

серотип 1в ——---------- I)

2 - 2- О

3 :

8---серотип За

серотип Эв-:-1 I

ч- 4-С

■ 5-.-:- 5

б--- б

/7/--:-— 7 -А

8 -В

.'9-

Ю -

И -

12 ----а

13 (-К) и <-Ь)

Рис.1, Новая классификационная схема вида Р,серас1а.

// - ЛИС и О-ПС не исследованы ввиду отсутствия в музее ИМВ .соответствующих штаммов.

( ) - серогруплы, описанные в настоящем исследовании.

Во-вторых, на основании данных структурного и иымунохиыи-ческого анализаЛПС, показавшего идентичность серогрупп 2 и о. ; •V» С» обьедииить указанные серогруппы попарно, введя их в классификационную Схему црд соответствующим обоеначением (2 или 4). В-третыис, ввести в классификационную схему две новых 0-оеро-группы, описанные в настоящем исследовании как серогруплы К и Ь< для О-ПС,первой из которых характерна структура линейного о-раы-вана, а для второй серогруппы - О-ПС, содержащий в своем составе ь-глицеро-о-ианно-гептоэу. Серогруппы К и ь ввести в классификационную схему под номерами 13 и 14, соответственно. В четвертых, ввиду серологического родства при различиях в строении О-ПС и

-I? -

одновременном сходстве moroсехарядного состава .полисахаридов объединить попарно серогруппы I и D ,3 и.1» введя их в ранге серо-типов в серогруппы I и 3* соответственно, в новую классификационную схему. Для окончательных выводов о серологических: взаимосвязях серогрулл I и D, 3и1 необходимо завершить структурные исследования О-ПС этих штаммов и локализовать имну нодомина нт низ участки в их полисахаридах.

В заключение необходимо отметить, что судя по результатам наших исследовании и денным литературы (Beiat, I963f Hekamura, 19861, существующие классификационные схемы P.cepacia являются неполными. Так, нами было проведено серотипирование 29 штаммов P.cepacia, выделенных из ризосферы растений и почвы в некоторых регионах СССР, при помощи 17 О-типирующих антисывороток (типа 1-6, A-J, i l l), (табл.5).' Полученные данные позволили установить, что в этой группе штаммов наиболее часто встречаются 4 0-серогрулпы:'I, 13 и 14. Однако тот факт, что более ZS% м*аммов

. - Таблица 5 .

О-серологичаская принадлежность штаммов P.cepacia

из коллекции ИМВ . .■ (

Номер штамма в коллекции ИМВ S^ymw" чествоКШШ~

5757, 5770, 5771, 3181, 9139 18 5

5758, 5791, 5792, 5794, 5795, 5891 .14 6

5759, 5364, 5892* I ......3,,

5779, 5798, 5979, 5930, 4137 - 2 5

5939 4 .1 • ;

5767, 5768, 5769, 5777, 5793, н/в е

5377; 5937, 5918

5772, 5874' с/а ' 1 2 .

Примечание: я/а -> не агглютинируется; с/а - самовгглютинируется.

из числа исследованных.нами не поддавалось нитрованию ни одной из 17 О-антисывороток, свидетельствовал о присутствии в атой группе штаммов новых? еще на описанных серогрулл Р.серас1а, что указывает на необходимость дальнейших структурных в серологических исследований О-антнгенов вида Р.серас1а.

- 18 -В Ы В О Д Ы

I. Получены и исследованы липополисахариды 22 штампов P.cepacia различной серологической принадлежности. Показано« что в большинства случаев ЛИС P.cepacia обладают высокой серологической специфичность» и активность».

2* Установлено, что состав липида А, Р,cepacia качественно . идентичен у большинства исследованных шташов. В количественном отношении доминирующими являются 8-о кс ит етр аде какова я и З-оксигэкса-двкановая жирные кислоты.

3. Проведен химический анализ 0-специфических полисахаридов ¿0 штаммов P.cepacia. Установлены полные структуры повторяющихся звеньев 0-ПС у II штампов P.cepaola, относящихся к 9 различный 0-серогруплам) исследован коносахаридный состав и строение 0-ПС у 9 штампов P.cepacia, относящихся к 8 О-серо группам. Обнаружено, что у 5 штампов J »cepacia. в составе 0-ilC содержится по два полисахарида^ различными структурами.

. Описаны две новые ,0-серогруппы P.cepacia, для 0-ПС нервов из которых (серогруппа 13) характерно строение линейного В -рамна-ка* О^ПС второй серогрупды (серогруппы 14} содержит в своем составе . L-глицеро-В- манно-гептозу.

5* Исследовано распространение различных 0-серогрущ среди шташов P.cepaola, выделенных на территории СССР из почвы и ризосферы растения. Установлено, что в этой группе штаммов чаще всего встречается 4 О-серогрупши I, 2, 18 и 14. - .

б» На осковании данных серологических и структурных исследове-нийЛПС и 0-ПС P.cepaola предлагается новая классификационная схема вида. ,

По теме^диссертации опубликованы следующие работы:

1. Танатар Н.В., Смдатшша U.A., Захарова И.Я., Кнмредь U.A. Шщу-нохимичесхое изучение лолисахарвдной цепи липололисахарида Pseudomonas cepaoia ИЦВ 673/2 // У1 Всеооюз.конф. "Химия и биохи-

' лия углеводов* (Тбилиси, 1987); Тев.докл. - Пущино, 1987. -С.123-124.

2. Ннирель U.A., Танатар Й.В,, Солдаткина U.A., Шашков A.C., Захарова 19.Я». Антигенные полисахариды бактерий. Структура О-сле-цифической полисахаридной цепи липололисахарида Pseudomonas cepacia HUB 673/2, содержащей Ь-глицеро-О-манно-гептозу // Био-ОрГ. химия, г 1988. - Т. 14, 16 I. - С.77-81.

8; Книрель Ю.А., Пашков А.С., Солдат гаша М.А., Параионов Н.А., Захарова И.Я. Антигенные полисахариды бактерий* 82. Структура 0-специфичесяих полисахаридных цепей липополиоахаридов Peeudoao-naa cepacia, серотипов В и Б, содержащих. в-фукоеу // Биоорган, химия. - 1988. - T.I4, 1«! 9. - С.1208-ШЗ. . 4. Книрель 10.А., Шашков'А.С., Солдвткинв И.А., Захарова И.Я, Антигенные полисахариды бактерий. 83. Структура О-специфической полисам ридвой цепи липополисахарида Раеибоиопва cepacia серотип . 6 // Биоорган.химия. - 1988. - Т.14, ft 10, - С.1413-1418. б. Княрель D.A., Солдвткинв И.А., ШвиКов А.С.». Taestsp В.В., Парамонов Н.А., Захарова И.Я. Антигенные полисахариды бактерий. 34. Структура О-специфических полисахаридных цепей лшюполясагари-дов Pseudomonaa cepacia 1ШВ 4207 (серотип А) и И1Ю 598/2 // Биоорган.химия. — 1988^ - ТЛ»>.,* 12. - C.I678-I683.' -б. Книрель Ю.А., Танатар Н.В., Солдвткинв М.А., Захарова И.Я* Антигенные полисахариды бактерий. 95. Установление.структуры полноа-рндных цепей липополисахаридов Раеиаоловв» oeptela VWB 4176 я ИМВ 4202 (серотип 3) // Биоорган .химия. - 1988. - Т.14, №12. -С.1684-1689.

7* Солдаткина И.А., Книрель В. А., Танатар Н.В., Захарова И*fl* Иммунологические и структурам« исследования лялополис ахвридов P*eu-йошоаав cepacia // Ынкробнол.журя* - 1989. - T.5I, ft 2. - С.В2-

38.

Подо, к hWílVO Форич^'tu/tБуи»г»Zíu .

П«<. офс, Усл. я*ч. j. 1,(7 ' Уч.-вад. л. /> ^ Т«р»жМО 3»*. Í JitfV. Бмпл«тма #

Киевская ккажиля тнлогряфвя ндучноА кннгк. Кнев, Регмша» 4.