Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммунохимические и биологические свойства мембранных структур лептоспир

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Иммунохимические и биологические свойства мембранных структур лептоспир"

РГ5 ОД

i • л

, J 'v-.v

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ЩЕРАЩИ РОСТОВСКИЙ 0FJEH4 ДЭТВЫ ШОДОБ. 1ЭДШЮКИЙ ИНСТИТУТ

На правах руяопвои

ВАЧАКВ Бордо Федоровкч

ШШЖШШЧВСШЕ И ШСШОШЕСКИЕ СВОЙСТВА МЕМБРАННЫХ СТРУКТУР ЛЕПТОСПЙ?

03.00.0? - ыяаробяологня 03.00 .64 - биохдшя

АВТОРЕФЕРАТ

двооерхадад на соиованпе ученой степени кандидата йиолситлесних науя

19 9 3

Работа вшашвза в Ростеве&ои НИН шкройяодогяя я паразитология ШЮ "Бяопрвяара*".

Научннэ руководима:

доктор ьадкщшсдях nays, профессор ИЙШКВ Í..I,

кавдяди иэдвдшсюос кауг, старший ваучннй сотрущшх Э.А.

Официальные оппонентаî

да2сгви?ейышй члеи PMS я ЕШ,

ДОКХОр бЯОДОГЯЧвОКЯХ, доктор шдяцеиоенх наук, врофзосор ДШАРМСЮЙ И.В. лектор дедвдвдсдгх наук, профессор ГШШО Z.H.

Ведущая организация:

Заодгеа состоятся

Ексгг?уу шагр оба одогял я адддвмв»-догяя як. E.í.rauajoaa Piffî

I9S3 г. a

«mesa

Ka васеданяя спвцгаяяаярованного совета' I 0d4.S3.QI оря ' Ростовском ордена Дружбы народов медицинском ннсгвиута (344700 г.Ростов-на~Доку, гюр.8атевансмй, 29).

С диеоэрмвдюй kmœq оавдгоиаться в öHtoorese Ростовского ордена Друвбн народов медицинского шстута,

Ж. ^

ABíopa^apíí pasocm

Учеивй секретарь оавдгалйзяроваБвого coeeta досеет

„1993г.

Н.Я.Коргеноа

ОБЩШ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Автуальвоогь проблеын: Лепгосгшроз, вав природноочаго-воз зоовозное заболевание, раопроотраяея глобально на всех" ыатерявах земного шара, порагает ыногде вида дяяаз, промысловых, сельскохозяйственных зивотшх, человека я праводи!" г ЗБачдчельжщ ооцяалъно-эйоноыичесниы последствиям во многих отравах ияра. . .

В PooonSoKofi Федерация заболеваенооть людей лептосшаро-зок регястряруетоя правтячеона во воех регионах.

В атяологячеоной о грунту ре лептоспярозсв людей резво .." юзроо удельный £20 яатерсгеморрагвческого лептоопяроза, характеризующегося гяаелэд клпнячесвяу течением я еысовой летальное еьв.

Однеы из зффевтявнкх оредств борьбн о этой янфевцяей являв тоя ав тинная, иммунизация населения. Од щи о успех лавцяно-црофалззтяви во много« завиоят ог свойств антигенов, из вото-рнх азтЬтбалев препарат, а тавге налетая ? последней баласт-еыз: Еещеотв, иовнааюзух реазтогеяяоеть закцянн.

В последние года за рубегом янтеяоявво ведутся работы в облаотя антягевяоетя различал: консонантов лептосшгр о целью внявлеяш! их участия в стимуляция специфической резистентности и возыокного использования изолированных структур для изготовления иммунобиологических препаратов» Известно, что нево-торка протевтявнне антигены локализуются в влеточной оболо^ве мкрооргаяязыов, тогда вав антигены цитопяезыы я других Енутри-влегочшх структур не только не стицулирупт форцврованяе специфической ре^лотенгнооги, но овавнвазот даже имиунодепреосяв-ноз действие (Стандолавазий S.C., 1971). Вероятно поэтому, в пастоящее времл особое внимание уделяетоя свойствам клеточных оболочек лепгоопир (Хясамов Г.З., Волхова В .А., 1989; Аигая IÍ.3, , Johnson Н.С., 2971; Bay В.5., 1974; Bay Е.Е., Johnson B.C. , I982| Uaouzavra 2. , Hakamura R. , 1989:й др.).

¿налпз литературы свидетельствует о яедоотаточноетя наших знаний об этих отрунтурах лепгоопвр. Ранее разработанные метода выделения мембран не позволяют получить достаточно чиотые, изолированна от компонентов оредн и цитоплазмы вле-ТОЧНКе оболочки (Auran IT.S, Johnson R.C., I9?2j Zgigler J .л.,

Vaa Bseitiae W.E. , 1975), Мембраны пасогенных ж оапрофатных ттаммоЕ eßs не подеергалйоь всестороннему сравнительному бяо-хшшчеогоку, а'ауяохийдчеоЕоггу а бяологячеовойу анализу, а -немногочисленные данязе о ловалаэадаи. прогевгивншс ледтоспя-розшх ЕНТйгевоЕ ( Hyers D.U. , Coltorti S.A., 1978; fferpat-jra I. f Yaaagawa E. , 1975; Caociaputi В., Ciceroni I., I98S) воогеяно подтверздаюг, -rao ояи раошмюжены на по-Еерхяоагя влзгав, полушага se ex нелооредотЕенно из мембранных струвтур лептосглр нова не удав'алооь.

Дальнейшие углубланняе доследования 's вышеизложенной направления позволят не згольво раоврыгь колекуляряне осноэд организация а функционирования этйх гажных структур лепгоспир, но д.дадуг Евро пен ткну создания Ерог&Еолэпгоогщрозных биопре~ парагог нового поволенвя для профдяакмнд а диагностик леа-тоогшрозоЕ,

Дельо настоящего доследования яалялооь язучеяае яыыуно-пшячеовях 2 бйологкчеоявх овойом «выбранных структур лепто-опир да щрспевгиного ионетру ироЕяшя коекх шмуяобиолога-чеоаях препаратов.

Для рейлдзацаа увазанной цела была доотавлеш следующие задач!.:

1. Разработать кегодк полученая зощенхрароваяной бяо-масоы ледтоопяр.

2. Разрзбогагь йетод получения очящанных, шунвцяошлько ан TüEfiHX ьембраншж струг тур лесгоошр.

2. Прогеоги сравнительную хшшчеохухухаравяераоглиу со-огага мембранных структур деш^опир патогенного a . оапрофЕгяого штащов.

4. Иэуадгь шщуяозишЕчеовве св'ойorsa ¡¿еабрэчнкх отдув-тур лептооикр.

5. Изучать баологячеовве свойства ыеыбран лецтосшр (ан-тщреннооть, протевтйвнуэ антавноотъ, говоичнооть).

6. Разработать подхода получения опзтфачеокгх антигенов пз злеточных оболочек патогенного атаныа лептоопир.

Положения, ш»яооямые на запяту:

~ M023S неубранная технология Еокцентрирогаяля биокассы

лепгосшш;

- метод получения ватявных очищенных мембранных отрунтур из сферогошотов лептоопяр;

- сравнительная бяохиыячесяая я аиыунохяыячесвая характеристика мембран патогенного и сапрофитного штацков лептоопир;

- технология выделения антигенов яз ыембран лептоопир;

- бвологячеояив овойотва очищенных ыеыбраа лептоопир. Научная новизна:

В результате проведенных доследований разработана новая Кеыбранная технология концентрирования бюмассн лептоопир. а еспользование« тангенциальной фильтрация на полых полиамидных воловнах. Разработана новая методам выделения функционально автивных очищенных кецбралных структур лептосгшр с предварительным получением лизодлыных с^еропластов. Внявлено, что в оболочках лептоопир преобладают лапидные яомпонеяты. Установлено, что оболочня лептоопир содержат пав специфические, так и общедрдоЕые антигены, Впервые выделены а охарартеризованн группоспецифлчеокай и обцеродоной антигены яз не«Сран патогенного штампа ьлептосшар. Показало, что протеятивныки свойствами обладают оболочня тольво патогенных лептосгшр. Установлено, что ыеибраки патогенных лептоопир обладают антиовся-дантноЗ активностью, при этом из них выделен яонпонея? поля-сахарядной природа, отвечавший за данное свойство.

Теоретическая я практическая значимость работа:

На субклеточно« уровне установлено, что протек тивнка) -свойствами обладают только, спевд^пчесвие антигены, расположенные на неубранных структурах лептосгшр. В результате проведенных ясследоваел2 сформированы цредс:тавленяя о возмоккос-ти использования меибран патогенных лептоопир и их специфических антигенов для получения вавцин я диагностических препаратов. Результаты работы ввличены в яортявно-техничесяую документацию (ВйС я ЭПР) пс пряготоалешэ очищенной ионцентрг.-роЕанной лептоаоирозной вакцины»

Апробация работы:

Материалы диссертации дслоне рм на УП .'/еаду на родной Европейской и П Всесоюзной конференция по лепгоспирозу (Москва, карт, 1990 г.); научно* конйерендик молодох ученых "Автуалъ-

- € -

ще цроблеык эшщемйояопш, даегясюгизд и елеешш ивфевдаоЕ-тх за боле га ¿шгп Шооказ, изнь 1992 г.).

Апробация даооергадаи проведала ш заседаем ученого совета 'ШО "Еяс>цргш;ра?п 8 так 1993 т.

Пубдивздия материалов яоследования:

По •rem доооертащш опубяиБОЕаяо 9 научных работ, вз нах 2 в »¿ездународаой й 3 в центральной печам.

Струвтура а объеы работы: Диооертацая состоят из ьведе-аая, обзора датерагуры, к а терна лов и ыетодов доследования, результатов соботвеяшх яссдздоЕангй, гавлегееяия, енеодов,.. указателя литературы. Работа язлогзяз на страницах ка-шношошго тевста, .шшмтрироваш 21 рдсушаа и 14 таблицам. Указатель литературы включает 47 отечественных и 124 зарубешах шгочшка.

ВДВЕШН И ЫЩЩ ИСОВДОВАШ

В работе яошльзОЕала культуру Leptospira interrogans оерогрупш iotahaesorrliagiae cepOEap Copenhagen а та Hi; Криса 2 Й культур? Leptospira biflexa оерогруппа sanaranga coposap patoo шташ Patcc i.

Бакгериальауа ыаосу получала методом вультишронания лепгоонир на клдяой питательной среде, состоящей из 0,015 Ы фосфатного буфера рН 7,2-7,4 и 5 % вролачьей сыЕоротвв, а на-вопательной нолуедягегичеовоа ореде (Ягоезйн Э.А., Костнш Н.К., Зачаез 1990).

Чавробные влетай ЕощентрдроЕали цептрифугироЕанаеы е течение I ч яря 6000 g л 4 °С z с лепользоналиец «еыбраяяой технологий на ультраф&льтрацйояно'й уо та конке УПЛ-С S.

фунЕПиодальнуо акгаЕкооть мембран лептоспир характеризовала / по актдлностй Щ(Р)Н-овсвдаз {Ugeti s.et al., 1968). Содерванве белка. оаешвали .о хтощьа ыетода Bradford ( Bradford ii.E. , I97S), углевода определяла до Dubois (Lxftcis К. et al., IS56), еущу яуллеяяоаа алолот - по Сплряду (Стран АД., 1958), Разделение белновнх компонентов неыбран осуществляли 8левipofopesGM с полаанрилаищцш reJie по методу laanaii (baetaali O.K., 1570).

Амияовиолотннй анализ белзов мембран лептоспир проводили на аииновяслотяоы анализаторе ААА-363 (ЧССР) о использование« нолота оо оиолой "Дау-эвс" и оиотеин буферов с пределаыя рН 3,5-9,4 по ревокеадвцдям фирмы.

Лапада экстрагировали аетодоы Biigh и Dyer (.Bxigh, з.а., Dyer \t,j. , 1959). Общие лигшда и фосфолипиды разделяли тонкослойной хроматографией ш пластинах аилакагеля £ системе хлорофоры-метанол-вода (Бергельаок Л.Д., Дятлоницная Э.В., 1981).

Антигенный cocía&хвлеточных оболочек лептоопир изучала в реаящш двойной иккунодиффззаоняой преципитация в геле по " Ouoiiterlony ( Ouchterlony О. , 1949) и иннуяоблогиягои (ЛевхоффГ., 1983), со пользуя экспериментальные гапершмуняые прецидитирущие вролачьа фворотви в штампа« interrogans Крыоа 2 И X.biflexa Patoo 1.

Изучение биологлчеоннх сво&гв иен Оран лептоспир ьрого-дяли a ¡a£a£BSpjw о вошерчеокоа поливалентной вавпияой производства ШО "Аллерген" и эпоперяменгадьяой лептоопирозноЯ вавциной (Яговвин Э.А. а др., 1990).

Товавчкость препаратов изучали в соответствии с требованиями приваза В 31 1/3 СССР от 13.01.83 г. унифицированных методах вонтроля ыедицл;:авах и твднобиологичеоких препаратов на беопородных белых индах".

Реакцию гиперчувотяительноотн замедленного типа определяли на белых шизах по изменению маооы зонечноота животного в соответствии о РД 42-28-8-89 "Довлиничеовие яс питания новых медицинских дмиунобиологичеових препаратов".

Антигенную апгивноогь изучали на вролкяах порода шиншилла путем 2-нратного подзорного введения мембран о интервалом в Ю дней.

Тигры аятител в сыворотках животных выявляли реавцией иивроагтлатанации и лизиоа (ШАЛ), а гавяе имнуяоферыентнкм анализом (HS4), взяв за основу ""етодачесние реномендации в проведению аднунофермеятной диагностики лептоспироза", утвера-дендае КЗ СССР 14,05.86 г. В ЕФА в качестве антигенов для оеноибилизациа панелей использоезли лизат клеточных оболочег. лептоошзр.

Дяя дифференциации антител по ялаосаы иммуноглобулинов. использовали 2-иерваптоэтанол (Чернуха Ю.Г., 1979) я воыыер-чэовий огафалововвовый реагент, оодераащий белов А (ШИЭЫ ям.Паагера, С.-Пегербург).

' Протевгивше свойогва исолвдовалш в теоге активной защиты ш золотяоешс хокявах. Наждай препарат £ объеме I мл; 0,12 мл; 0,06 мл; 0,03 мл; 0,015 кл; 0,0075 мл вводили внут-рибршишю 2-вретно о интервалом в 10 дней. Через ГО дней шоле иммунизация, хомяков зарааала внутрябршинно 1.1аЪегго-еапв Крыоа 2 в дозе, соответствующей 122

Влияние мембран на функциональную автивяооть нейтрофи-лов Брови человека изучали, иопользуя метод хемилхшшесцевдия ( Райеп я. о! а1., 1982). Определение цроводшш на хеыилши-ноыеуре ХЯ-3603 производства фирмы "Диалог"-.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИСШЩЦОВАШЯ И ИХ ОБСУЩНИЕ

Получение воизевтришванной биомаооы лептоодир.

Успехи в облаотп изучения иамунопшии и биохимии лепго-ошр во многом определяв тая возможностью получения в достаточной волачеотве биомаооы, т.н. для исследования и выделения структурных компонентов в антигенов необходимо достаточно большое волачесгво биологичесвого материала. Особенности культивирования лвптоогар о использованием онвороточяых оред, ах у ¿шальная двигательная автявность, способность пронивать • через антибактериальные фильтры делают проблему вовценгриро-ваяия ыивробярх влетоа лептоопир трудно выполнимой, что существенно одерживало работа по иммунохимии лептоопир.

Такие метода, вая улмрацентряфугяроваяие, ультрафильтрация через антибактериальные фильтры малоэффективны.

Учитывая вышеизложенное, нами была разработана ноеая технология вовдентрироЕания и очиотви биомаооы лептоопир с использованием отечественной установвя УПЛ-0,6 для тангенциальной фильтрации ва полых полиамидных волокнах. Технологическая охека и принцип работы представлзны на ряоунве I.

Уогановва ЛШ-0,6 состоят из ультрафальтрацяояных коло-ное с шлйаыидныыа полыми волокнами с диаметром пор, пропус-вашим-макромолекула ыаосой до .100 кД ), пердатальтячесвого

?ао. 2. Тех.чологячеовая схема вояцентрлроЕашя' л очаогад биомасоы лептоопар о иопользоЕашеи ыеыбрапяой технологий на полых волокнах

I

ю [

I* Ульърафяльтрэцлошшя волояна о полаамядшмя полымя полокяами

2. Периотальтичеииий наооо

3. Слогегза гибнлх хлорвиниловых шшягов

4. Емвоогь для ионцентрата штроорганазяоп

5. Еивоотъ о разбавленной биомасоой

6. Еаиооть о фильтратом (среда иуль?явироЕаиял)

7. Эалчщ.

ю _

аасоаа (2), сиагегш гябгих хлорвиниловых шлангов (3), зажила (7) а трех еывоотей (бутылей) зместадосты) И л (4-6).

Принцип технологий основан на том, что выращенная не-аотцентрированная йяоыаооа лептоосир подаетоя перисталыичео-виы наооооц в ультра фильтрационную волонву о лолаакадншг полнив воловнами, е воторой происходит отделение вулыгуральной зеидвосгл от кивробннх адетов.

По э^февтлЕнооти тангенциальная фильтрация превышает. сентрифугировааие а обычкув ультра фадьтрацив е 5-Ю раз (таб. лица I).

Таблица I

Сравнительный анализ методов концентрирования лзптоошр

м ц/в

" 1 " ;"' ""-•' ■■ 1 ' ' ' ц" ■ ..... | 1

Характер ¡Объем исход- ¡Количество ¡Количество операций ;ной"биоыаосн,¡влетов до ¡влетов I свощеЕтраро-;воЕцентраиаи'| после ¡ванной за ;а I ыл . )вощентрацш

|1 ч до 0,5 л } -¡в I ыл

1 и) 1 ?

! < !

I. . Центрифугирование 1.5 30-40 • Ю6 60-75 • Юб

2. Ультрафильтрация 2,5 30-40 . Ю6 80-100 • Ю6

3. Тангенциальная ■ фильтрация ш полых воловнах Ю 30-40 . Ю6 5Ю-650 . Ю6

Разработанная технология вошла I нормативно-техничесвую документацию (ВФС, ШР) на новую вонцентрированную очищенную лзптоспирозную вакцину, что свидетельствует о большой правти-чеовой значимости полученных результатов.

. Получение я очиства оболочек лептоопир. .

Пошши выделать мембранные о труз туры лептоопир проводились еща о оередузш 60-х годов (Уапаав*а й., УаШе 5. , 1966; Тая Кве1 Ыпе Я.Р. о! а1. , ,1959; Аигад Н.В, «I а1. , 1972; 2е1е1аг ¿.а, еъ а1. , 1975), Однаво данные метода не позволяют получать катигя1В очэдешше мембраны в количествах, кеоб-ходэдшс для црепаративяых целей»

При выборе способа холеная очищенных оболочеа. леято-огшр мы исходила аз того, что паллучшям из применяемых до. настоящего времена методов является лизоцодаая обработка.мая-.. робаых ялзтов в I М растаоре Haci (Станиславона2 Б.С.,1971).

Выделение мембранных структур лептоспар проЕодала по схеме, указанной на pao.2,

Нам удалось установить, что оферопластн лептоопар образуется дисврзтко на Еоен про wane над шзробной влетва. Это. mosst быть связано презде всего о ысрЬологаеЗ лептоспар. Ававян с соавт. (1972) прл элев тронной мдвросвошн на ледтосяирозных злетаах обнаружили поперечные перешла, расположенные без . . видимой зааономерносм. Воуюгяо, именно она являются прачдкоЗ сагментного образования из цельной клетка отдельных сгерачес-вах фор«.

После разделения ooajáa 5 (pao. 2) центрифугированием в ступенчатом градиенте пдотнсста сахарозы было получено пять фракций., Согласно дааяна элевгронной ыавросвошш фравдия I . представляла бесформенные структуры, погорче относятся, помадимому, в остатнам плеточного детрита. Во фракция II. были . выявлены я основном осеЕкс нага лептоспар., ©ракцш III-У представляла собой компоненты мембранной прарода, правтаческа лишенные других алементоа плеточных отрунтур.

Более детальное элевтроаноииаросвошгаеавое изучение сча-щеяннх мембраа проводила с допояьзогангеы ультратонвях срезоЕ. В мембранах лептоспар прсоыагрягалаоь глдачная 3~х сложная струя тура.

Данакз электронной ыдвросвопия езменых мембран л ах -ультра тоннах срезов, а тавяе активность танах дембраясвязая-нкх ферментоа, наг НЩ?)В-окседазы подтвердила, что в результате этих аооледоваяиЗ бета получена суммарная фракция очищенных баологачесвв. агтанних мембранных отрувтур лептоспар.

Хдыачзсяай состав мембран но многом определяет ах амыуно-хшичеоаяе а биологические свойства. Результаты химического анализа свидетельствуют, что.неубранные с тру б туры лептоспар содергат в основном компоненты лидндной прлроды и незначительное количество белков, Еапа результаты оогласувгся с дашыня Sa^agihara о соанг. ( ranagibara t.et al., ISS4), которые

Концентрированная бяокаооа

^удзляНоя) деягрийугярогаш^ при

Осадод - I л инкубирование 16 f tmt 37 UC в 0,015 И fflJB. рН - 7,2, оодерзацеы I Ы 500 нхт/нх .лгзогшма д 0,01 M ЗД'1й '_

центрифугат (удаляегоя)

Роанок - 2 (сферодя^стн)

Ш5уияр5в8яие*в 20 % водном раотворе оадарози 18 ч ч4 "О

центрафугат диализ против даот. ВД 24-4S ч поя +4

дентриФугяроЕаняе ' л 15000 g, 0,5 ч, +4 °С

Ооадон - 3

ресуопендарованае в даст. 3-х кратное замораживание s кядком esоге (-196 ос) о

последите оттаиванием

'4-5 раа

франция "ц&шзо2п цитодяазыы

Асадов 4 (мембраны-о клеючнны

„ детритом) отмывание 3-4-яра твое в дао г. ЕьО дантряфугарощржи 15000 g, ,по .0,5 ...з, ч4.и0........' .

дентрифу-гат \уда-ляегоя)

вранздя Е лв точного!

детрята , ;

коалой - 5

ГшЙ^шГо остаткам гл. детрита) центрифугирование в ступенчатом градиенте плотности сахарозы _ Щ»60.%) "при £000 в, 2 ч, +4

йракция осевых нитей

Сумм арная фракция | клеточных мембран|

Fao. 5. Охена ЕЗДелевия.очиценкоИ суммарной фракции мембран лептоапар

установила, что фракция мембранных струзтур лептоошр содержит очень тонвяа белаоннй олоЗ. За счет этого оболочва спирохет менее кеотвая чеу у большинства грамогрицательвых-банте-рий, и обладает значительной гибкостью. Авторы считают, что' медду тавии'хшачеоЯЕМ составом мембран лэптоогир я их подвижностью существует прямая овязз. •

Более детальный анализ бедаового спевтра проводили методом блочного вертдвальяого элевтрофореза в полиа'аркламядном геле в присутствии додецялоульфата натрия. В результате элентрофоретачеозого аяалазд а разделяющем геле в мембранах ^патогенного штамма лептоапир выявлено И, а у сапрофитного - .

13 белвовых фракций, зоторке имела молепулярккэ параметры от

14 до 97 аД. Сравнительный анализ болювых профилей повазал . наличие, ваз общи медду гщтагзянщ л сапрофитном штаммами

белвовых зон, таз и фравдай"харазтеряых для ваздого вида.

Полученные дана результате согласуются с.данными Хисамо-ва и соавт. (Хисамоа Ес3», Еолхоез HJL} IS89) и xio lei о ооавт. et al, , 3989), яогорыз 3<3 в ШАГ установили

отлична белвогкх осзатроэ аярудзнгнгх а явируленкзых лепго-сгшр.

В доступной литературе нам не удалось обваругять работы, пооаящеяиые сравнительному 'изучению ашшозислотного состава мембранных белков патогенных и сапрофитных штаммов лептоопяр. По результатам наших .наследований ашцшислогвнЯ оостав. мембран l.interrogsna и i.biflexa вз имеет сушеомекаых различай. В мембранах вирулентной вультуры в незначительном воличестве обнаружен'иетяоняя, тогда кап в сапрофите екязить его не удалось. В оболочках патогенных лептооппр заметно не- • которое преобладание аргинина, а а мембранных белвах сапрофитного штамма гиотвдяяа.

Изучение лигшдшго состага оболочек лептоопир методом тошоолойной хроматографии показало наличие в них s оояояноа фосфоляшдяоа фргядил» Это еще раз подтверждает мембранную природу выделенных нами зле точных структур. Следует отметить, что оболочви оапрофагного штамма содержали фооФолипидов не-свольво больше чем мембраны патогенных лептодпар, менду тем. кая количество аопоацплглацервдов, стервоз, дпапгшттце рядов, незсгергфацароваашх аярик у, не гот. траацилглппэрчдов и

оудаарнкх нейтральных лахшдов feo зше у вирулентной культуры.

Проведение аоследованая ео изучена» соагава мембран показала, чзо осяоянык воапоненгоы оболочек лептоспир яеяявтоя ладиды при относительно кизвоц содержании белка. Такие факты как более высокое процентное отлоаешге фракции общих липидов в ¿te;; Зрака. патогенного шгаша по оравяениа о сапрофитным, а lasse их различие в белвовнх электрофоре тичеоних профилях, ио-гут играть существенную роль в антягеяности и патогекности лептоопяр.

И.Уыуяооси.'Ечеоксе osofoTsa ыанбхвя лепуоопир и их а ятяге ков

До настоящего времени многие авторы изучала антигенную

структуру целыШХ КЛеТОЛ ЛеПТООШф ( Yaflagihara Y. et el. , . 1984 j Chapjaan a.J. et аЛ.,, Ï987; îlaeuz&wa î. et al., 1989), но для разработки hoskx цротнволепгоопирозяых иммунобиологических препаратов необходимо точно знать кесто локализации bomcokéhtob, определяющих осноншз якиуногенннг и протевтав-ные свойства. Б литературе имеются ладь косвенные данные о го;;, что она раоаолагаютея га поверхности клетки (Кивгенво B.C. и др., ÎS74; Zolglar J.Â. Van Eaoltlne VT.E. , 1975; Adsciti Y. , Yaaagawa й. , 1977).

Проведенные нами шшунохм.шческяе исследования, мембран патогенного а сапрофитного птаншн, с использованием реакции а".мукодиффузйаяной преципитации а и«муноблотанга, выявила общие и специфпчэсвие для иаядого вида лептоспир антигены. Абсорбция антяаывсрогки s оболочка« патогенного шгзима мекбрана-ка сапрофитных лептоспир о последующей постановкой РИАЛ со . втаамамл оерогрупш actsrobsunorrbaeiae , доказала наличие в структурах кеабран х.interrogans Крыса 2 грушоспэцкфичео-кого антигена о возшкнш содержанием тяпсспецифячесаих детерминант.

Для более детального шиуяохтлмчеоното анализа оболочек патогенного отаима лепгосшр представляло интерес выделение аз них спецификесшк антигенов. С этой целью был применен метод воднс§енолью£ экстращая о последующей очисткой выделенное ЕоцсоЕ-ентов гелъфальтрацией ш сефадексах.

В результате проведанных исследований, при гель-хромате-

графая водной фазн Срло. 3) бала ввделена фраяцяя I, содержащая антиген спецдфячннй для I».interrogans . Иг осадга фе-яольяой фазы хроматографией яа аефздевсе с-50 (р/о. 4) был виде лея родоспецифачесапй антител .

?до. 3. Хро«атограща <о-75 ) водной фазы водно-фенолвного эвстраага мембран I-.interrogans Крыса 2

Примечание: ®равция I (заштрихована) дала зону преципитация со спецпфачесвой анти-СНВОРОТВОЙ против L.interrogans

Результат хяшчесного аяаляза свидетельствуют, что спеая-фачеанай для патогенного итамка антдген. шее г глинолиподроте-идную пряроду, родоопецдфячеавай антиген в основном представлен глдволапвдоы,

Нами была проведена иммунизадяя золотиста* хомяков ¿ыде-ленньш авгите на .ад. Полученные сыворотвл анадлзировала в KIIE оо шгашаая серогрупды ioterobaeaorrhagiao , прягадаекащаяй У oepoiapaa Copenhagen (M-2Q) я ieteroiiReniorrhagiaQ (RgA). Сыворотка в специфическому антигеду.реагировали вая со шгаодш Ы-20, так л о HgA , что свидетельствовало о группссябцдгачес-вой црпяадлезкости выделенного а я таге на. Сывсрогва я обцеродо-

- 1В -

в ому антигену в реавцаа агглютинация одаяннки птаыиама не реагировала.

?яо. 4. Хроиагограша ( 0-50} солюбилдзага осадяа фэкольнаИ фазн водно-фенольшго экстракта ЫЗМбран Ь.1пгегг0Еапз Кркса 2.

Примечание: Франция П (заатряховага) давала зону преципитации о аатшпЕорогваьш. протяЕ патогенного м оапросЬятяого' штаммов лептоогшр.

Биодогичеоние свойотва мембран лептодпир.

Полное представление о овойзтвах мембранннх антигенов яе вознозшо без азучешя их антигенЕоота и ациуноген.нооти. Согласно подугешьк дандаы, клеточные оболочни. лепгоодир. обладали ешовемй. антигенными оЕойотвама. Средний геомегричесвий титр'пооле 2-вратной иммунизации вролинов для ьДпгеггоеапв Крыса 2 составил в ЕШ1 1:692, а в Ш. 1:3527, для Ь.ВШвха 1 1:766 и 1:8318 соответственно. Кл200Е£два?доз антител

поел«.

ш Еласоаы иммуноглобулинов показала, что двукратной.якнуназа-ции вреллзов мембракз.'.'Я патогеяянх я сапрофетных лепгоспир в оыаоротяе преобладала в основном иммуноглобулины вдаосе а.

Антигенную автивносгь оболочек патогенных лептоспир. тавае выявила Bey о соавт.-С Bey а.в. , Johnsoa B.c. 1982) и HaBuzawa о соаат. ( Masuzawa.T.et al., 1989).

В перевреотных реакциях МИД и VM нами было устаяозле-Ео, что серологическая активность в ВИД. обусловлена антителами в специфическим антигенам лептоошр, а в ИФА. в общеро-довыы.

Протективные свойотва оболочек лептоопир изучала б тесте активной завдган на золотистых хомяках. Иммуногешшыи свойствами обладали мембранычлагогешых лептоопар, у оболочек сапрофитного штамма прогевтяЕяая активность не наблюдалась (таблица 2).

Таблица 2

Про тев тяг на я »дфевтдааость мембран лептоошр

j

й» ¡ • Наименование ■ препарата

а/а

iКоличество ■ j заржавших доз

BD50 (мл) |лептоспир

•(b.iaterroEaca

¡Крыоа 2

1. Меыбракы i.laîerrogaDa Крноа 2

2. Мембрана b.Biílaxa Pat00 1

3. Вакцина, концентрированная ив те роге-моррагяче^вая

4. Вакцина поливалентная воммерчеояая

0,01 +0,004

1,8 + 0,01

122

122

0,042 + 0,005 122

Z22

О

Примечание: KD50 - минимальная защитная доза, зашщащая 50 % кивогннх. id50 - рагна 20 ООО вл./мл

Эта данные овидетельотлугг о том, что напряженный иммунитет вырабатывают специфические антигены, локализованные, яа поверхности мембранных структур патогенных лептоспир. Общеродовой антиген, входящие в структуру мембран, такой активность» не обладал.

- ib -

Полученные результата соглаоувтоя о доннныи' anr&n ( a-u-, гас Н.2, et al» , 1972), Bey í Bey. E.B. , Johnson R.C. , I9S2), Hasaaswa { Maauzavra "E. el cX.# 1939), во горне танке вклеили высокие цротезтявные овоёззва оболочек патогенных отаыцов лептоошр.

"Мембраны лестоопир не обладала токсичностью я слабо реа-гдроваяи * реакции гиперчулохвительносаи замедленного тиса, что свидетельствовало о слабой их реалтогенноати.

Влияние ыенбрая l.intezrogaaa Крыса 2 на ^национальную активность веЕтрофалов проел человека изучали иетодои хеывлшднеоцещия. Введение яаишшх оболочев приводило в торы ose ни© зиыозая обусловленной хеыидшияеоценции не&грофилов крови человека С рис, 5), что говорит об их антионсидантной актив нооти и, по-вдвдоыу, является фактором защити, обеопечи-вающаы вагаваяие лептооиир цри воздействии аа них активных форг кислорода фагоцитарной оиотеки маярооргаяязыа, Из ободочек Ь.interrogaría Врыаа 2 было выделено вещество долисахарид-яо2 природы, которое ваг и ыелбранн блокировало хекялшинесцея-цшэ яейгрофалог крови челогева (рис. 5).

ДальнйЙвше исследования а этой направлении могут дать более полное представление о цеханизме патогенного дейотгая лец-тоошр и samara их мембран от перекионой деструкции.

Таким образец, полученные данные свидетельствуют о существенной рола яеыбраяшс структур в антагешрети, вииуноген-ноотн и оатогеннооги лептосшр, что делает перспективным их аз пользование в качества основа для е ояе груированяя новых яжунобиологяческях препаратов.

. ?£0. 5, Влияние езтзвных аеыбран b-interrogans

Крнса 2 я лопополасахарада на зииозан обуслоз-ленную хешишанеоценцию нейтрофилов вроЕа человева

i-' - спентр хемилвнияесцекцая при введении

яативякх нет/Сран лептосдар.

■----' ~ спентр хешишанесценцаа при введении

липополисахарида,.наделенного аз ' «екбран лептоспяр.

ВЫВОДЫ

1, Разработана ыеибраяная ^ехнологля дояцентряронаяая бяойаоон лепгосгнр ультрафалы-рецией на долых полиамидных волокнах. Материалы восла в норма швно-техяичеовуа документацию на лепгоопирозяу» вавцяяу« .

2, Разработана методам получения очи'хекяюс неубранных структур дэ сфероплаотэв лептоодир. Установлено, что образование сфероплаогоа у лептоопир аде и- длсврггно на всем протяяедйд ялетвя.

3, Установлены особенности хйклчесвоге состава «акбран-шсс структур лепгосшр, Основная касса в ле точке: оболэчев

представлена лашдамя с преобладанием фосфолишдной фравцаи. Мембраны патогенного штамма оодергат болшз стеринов5 неэсте-рифицкрованаа аирных влолот а на&гралъннх дипадоз. Количество бзлвов е мембранах патогенлкх а оацрофатдах лептоапар не преЕыаает Ю-13 %. ,

. 4. Методами иммунохимичесвого анализа повазана неодно-, родность антигенного состава мембран леетосоир. Установлено, что оболочви патогенного и сапрофитного ытаьков ввдючаю? в себя вав специфические, тав в оберродовые антигены.

5. Даш хямпчесвая я щщунологячеовая хараятериотиаа грушюспецифичесвого я родоспецафичесвого антигенов, выделенных аз очищенных мембранных отрувтур лептоспяр.

6. Установлена актиоковдааткал аяивноегь нативных мембран патогенного птаыма лептоогшр и выделено вещеотво полно а-харадяой природа, ответственное за »то действие.

7. Изучены баологичесвиэ овойоква мембран лептоопир. Установлена ваоовая поомгтиЕность и ангягешооть мембранных отрувзур при яизвой степени их реавтогеняооги. Иммуяогеннооть кембран леотосшр обусловлена сдецифичеовик для патогенного штамма антигеном, ловализоваяяым на поверхности лептоопироз-ной влетви.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБШОВАННЫХ ПО ШБ ДИССЕРТАЦИИ

I. Выделение очищенной суммарной Фракции мембран лепто-опир//Воео. вонф. Эпидемиология, мивробжология а иммунология бавтеряальшх я вирусных нн?)егцйй:Тез. докл. - Роотов-на-Дону, 1939. - С.15.

2^ Бвделенве я харантерастина мембран лептоспяр(Э.А Лгов-вин, Н.И.1останз, СД.Колпавов, А.Л.Кизильштей^Ь/Веотнив Веео. миаробйол. об-за: Ростогогое отделение, 1989. - # I. - С. 98104.

3. Совершенствование имму койио логгчео к их противалептаспя-розкак препаратов. Сообщ, 1, Эвоперинентальное изучение новой вакцины яротяЕ ивтерогеыоррагичеового лепгослироза для.иммунизации ладей(з.А»Яго2яая, Н.II.Кос тина, Т.П.Ромавдова, В.Ф.Конд-рэтешю, й.К.Буяаи, Ю.В.Ананьшф$:уря. нияробвол. - 1990. -Я 2. - С.47-51.

4, Биологичеовпе оеойстеэ очлщенних мембран лептосшр

(э .А.Ягоенин, НЛ.Ъоат^гфГЛ Воес, съезд нороблологоз, .эпидемиологов и паразитологов: Тез. довл. Т.2, -П., 1991. -С, 166-167.

5, О перспентиве приенепая влеточных мембран.е качестве антигена в ИЗД(Э.А.Ягогван, Й.И.КоотанаЬ^ед. FS, - 1991. -Л 4-6. - Публ. Ш7. Д - 21474.

6, Ицмунохимичеаяие и биологичесвде свойзтва мембран лептоопир(ЭДЛго2ЕйР^Йурн. ыявробиол. - IS92. - Й 11-12. -С.26-29.

7, Получение антигенов нз оболочев лептоспир(Э.А.ЯгоЕ-вин, И.ЛД)рьеЕ£й-/Всес. вон®. Антуальные проблемы икфевцяоняой патология: Тез. довл. - С'.Петербург, 1993. - С,56.

8, approoheo to'Vaccination against ictarohaetaor-riiagiaa leptCGpirosiai2.A.l"agovldLa, N.I.Kostir.£?b^Icriiflotha-rcpautic prospects of ixtfectioua. diseases. Sprot^er - Verlg. Berlin ь- Eeidelbeg, 1930. -i.48-50,

Э. Irssonobiological properties of new о vaccines agaiii3t icterohaemorrbagiae leptospiroais for humane(E.A.YaEuvkin, ff.I.Kostina, O.V.KalGSEijcvaJb'/VII European and IX USSR leptospiroais research coi-fexenca. Xeptoapirosio. - Mescovi, 1391. - 74-75.

Подписано к печати -f0.09.d$t.

i-сршт бумаги 60 х 84. I/I6; Бумага офзетггая. Печать ofcanmn. Печ. лист - /

Заказ - /W6' тирзя - fQO тип. родам