Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммуноглобулины класса А из молока человека катализируют фосфорилирование белков

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Иммуноглобулины класса А из молока человека катализируют фосфорилирование белков"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ НОВОСИБИРСК!® ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОИ ХИМИИ

На правах рукописи

ИММУНОГЛОБУЛИНЫ КЛАССА А ИЗ МОЛОКА ЧЕЛОВЕКА КАТАЛИЗИРУЮТ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 1996

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН.

Научный руководитель - доктор химических наук, профессор

Невинский Г.А.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Фаворова О.О.

кандидат биологических наук Беклемишев А.Б.

Ведущая организация: Институт молекулярнй биологии РАН

/ Л/Г Защита состоится ' (х./^ ¿ЛЛ. 1996 г. в у часов на

заседании Диссертационного совета К 003.52.01 при Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии СО РАН.

Автореферат разослан 1996 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук

О.С. Федорова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

актуальность проблемы. В настоящее время кажется вполне закономерным, когда новые экспериментальные данные не укладываются в уже устоявшиеся представления об особенностях функционирования тех или иных систем организма и, тем самым, служат отправной точкой для развития новых научных направлений, что, в конечном итоге приводит к появлению новых, более полных знаний. Особенно важно, когда эти данные являются экспериментальным воплощением идеи, возникшей на основании достижений различных научных направлений. Одним из наиболее ярких примеров вышеизложенного может служить открытие абзимов - антител, обладающих каталитической активностью. Предпосылкой для получения абзимов послужила идея В.Дженкса о возможной каталитической активности антител, сформированная на основании достижений иммунологии и биокатализа. Первые абзимы были получены А.Трамонтано и Дж.Полаком при иммунизации животных стабильными аналогами переходных состояний химических реакций, что дало толчок для интенсивного развития этого научного направления. Развиваясь как один из методов молекулярного дизайна (получение антител с заданной каталитической активностью), наука об абзимах получила существенное дополнение в связи с открытием природных каталитическиактивных аутоантител у людей. Первые такие антитела были обнаружены в крови больных астмой и системной красной волчанкой группами С.Паула и А.Габибова и обладали пептид- и ДНК- гидро-лизующей активностями. Следует особо отметить, что появление природных абзимов у человека связано с наличием выраженной аутоиммунной патологии. Способность таких абзимов гидролизовать физиологически важные биомолекулы (нейропептид, ДНК, РНК, тиреоглобулин) дает основание предполагать, что абзимы могут каким-то образом принимать непосредственное участие в развитии заболевания. В настоящее время остается открытым вопрос о существовании абзимов у людей без выраженных аутоимунных патологий. Поскольку аутоантитела (в частности и антиидиотилические антитела) обнаружены как у больных, так и у здоровых людей, по-видимому, есть некоторые основания предполагать, что абзимы могут присутствовать и у здоровых людей.

ЦЕЛЬ работы. Проведенные ранее исследования показали, что инкубация препарата обработанного формалином S.aureus с молоком человека приводит к истощению последнего по протеинкинаэной активности. Поскольку использованный препарат стафилококка обладает способностью связывать иммуноглобулины, то было сделано предположение о возможном участии антител в фосфорилировании белков молока. Целью данной работы было изучение протеинкинаэной активности иммуноглобулинов молока и их роли в фосфорилировании белков молока человека.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Впервые показано, что секреторные иммуноглобулины класса А (slgA) могут обладать ферментативной активностью. slgA из человеческого молока, катализирующие в присутствии АТР фосфорилирование казеина, являются первым примером природных абзимов, присутствующих в организмах без аутоиммунной патологии и катализирующих фос-фотрансферазную реакцию. Нами показано, что обнаруженные абзимы могут принимать участие в фосфорилировании белков молока. В настоящее время известно, что женское молоко является для ребенка не только источником питательных веществ, но и оказывает на него иммунное и даже психотропное влияние. Такое разнообразие природных функций молока предполагает наличие в нем определенных регулятор-ных систем. Поскольку роль фосфорилирования белков в регуляции их биологической активности общеизвестна, то не исключено, что обнаруженные абзимы могут принимать участие в регуляции физиологической активности молока. Таким образом, полученные результаты могут служить отправной точкой для исследования особенностей протекания антитела-зависимых реакции в норме и при патологиях, что, в конечном итоге, может иметь определенную диагностическую ценность.

Было обнаружено, что каталитически активный slgA различается по сродству как к АТР, так и к казеину. Такая гетерогеннось исследуемых антител указывает на их поликлональное происхождение. Следует отметить, что факт сродства slgA к казеину и АТР позволяет отнести его к определенному типу антител. Известно, что существуют так называемые полиреактивные антитела, характерной особенностью которых является способность взаимодействовать с несколькими неродственными антигенами. В частности, описаны антифосфолипидные

антитела, обладающие способностью взаимодействовать кроме фосфоли-пидов с такими антигенами, как ДНК, АТР и казеин. Таким образом, выделенные антитела, по-видимому, можно отнести к классу полиреактивных антифосфолипидных антител.

Было обнаружено, что в крови доноров разного пола присутствуют иммуноглобулины класса G, обладающие сродством к каталитически активным slgA из молока человека. Добавление к молоку таких анти-з1дА-антител приводит к избирательному ингибированию фосфори-лирования его белков.Полученный результат указывает на то, что выделенные из молока slgA могут присутствовать как в молоке, так и в крови здоровых людей. По-видимому, наличие sIgA-абзимов не связано с процессом лактации, как и репродукции в целом, а является нормальной функциональной составляющей секреторной иммунной системы человека.

структура и овьем работы. Диссертация опубликована на 94 страницах, включая 16 рисунков, 2 таблицы и список цитированной литературы (108 ссылок). Работа состоит из следующих разделов: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы исследования, Результаты и их обсуждение, Заключение, Выводы, Список литературы.

публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 3 печатных работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. Выделение иммуноглобулинов молока и исследование их

пр0теинкиназн0й активности.

32

Было обнаружено, что инкубация молока с [у- PJATP приводит к фосфорилированию его белков (Рис.1). Исследование протеин-киназной активности молока показало, что предварительная его инкубация с препаратом S. aureus, обработанным формалином, приводит к существенному уменьшению фосфорилирования белков молока (истощению по протеинкиназной активности). Данный препарат обладает способностью связывать иммуноглобулины млекопитающих за счет наличия в бактериальной стенке белка А и широко применяется в иммунологической практике.

Рис.1. Фосфорилирование белков молока

человека после инкубации с различными

концентрациями стафилококкового

32

препарата в присутствии [у- Р]АТР. А - гель, окрашенный Соотазэте; В - радиоавтограф геля; 1) цельное молоко, 2) 0,3 мл молока + 20 мг препарата, 3) 0,3 мл молока + 40 мг препарата.

Предполагалось, что иммуноглобулины молока могут участвовать в фосфорилировании его белков: а) за счет собственной протеинки-наэной активности; б) входить в состав комплексов с протеинкиназа-ми. Для решения поставленной задачи была разработана следующая схема получения антител:

СХЕМА ВЫДЕЛЕНИЯ бЮА ИЗ МОЛОКА ЧЕЛОВЕКА

МОЛОКО V

белок А-сефароза

v-v—

гель-фильтрация сефароза 4В

-7--~v-

анти-1сА(Н)-1сС- РЕАЕ-Г1?астосе1, > рН-шок

-сефароза V

V АТР-сефароза

V

б1сА казеин-сефароза -v-

б1СА

Поскольку носитель протеинкиназной активности сорбировался на стафилококковом препарате, первой стадией очистки была выбрана аффинная хроматография белков молока на колонке с белок А-сефарозой. Молоко центрифугировали для удаления липидов и наносили на колонку с протеин А-сефарозой. Для удаления белков с низким сродством к сорбенту колонку промывали буфером, содержащим 1% Тритон Х-100, 0,3 М N801. Антитела элюировали 0,1 М глицин-НС1 буфером, рН 2,3. Было обнаружено, что около 80 % протеинкиназной активности молока сорбировалось на данном сорбенте. Рехромагография молока на протеин А-сефарозе приводила к его практически полному истощению по фракции белков, обладающих сродством к белку А. Методом двойной иммунодиффузии по Ухтерлони было установлено, что выделенная фракция белков состоит преимущественно из э1дА ( с примесью Iдв-антител).

Для разделения э1дА и 1дв препарат антител, выделенных на протеин А-сефарозе, подвергали гель-фильтрации (рис.2) с последующей хроматографией з1дА на колонке, содержащей иммобилизованные моноспецифические антитела к тяжелым (н)-цепям человека. Выделенный белок исследовали на протеинкиназную активность.

Было обнаружено (рис.3), что спектр полипептидов выделенной

фракции соответствует секреторному иммуноглобулину класса А , где

БС - секреторный компонент, Н - тяжелая цепь 1дА, Ь+и - легкая и

соединительная цепочка з1дА, которые обладают одинаковой электро-

форетической подвижностью в условиях БОБ-электрофореза. Электрофо-

ретический анализ показал, что выделенный белок является высоко-

очищенным препаратом э1дА. Данный препарат не обладал способностью

к аутофосфорилированию, но в его присутствии происходило включение

32

радиоактивного фосфата [у- Р]АТР в казеин молока человека. Таким

образом, было установлено, что з1дА из молока человека обладает

сродством к белок А-сефарозе, что не характерно для мономерных

сывороточных 1дА. Электрофоретически чистый препарат з1дА в при-32

сутствии [у- Р]АТР катализирует фосфорилирование казеина женского молока.

280 1

.1_Е

2 3 4

1 1 I

-т-г

100 120 140 160 1М

Рис.2. Гель-фильтрация белков молока (выделенных на протеин А-сефарозе) на колонке с Тоуореаг! 60 Р в ТВБ-буфере.

Фракцию 2 использовали для последующей очистки э1дА. Белки с известными молекулярными массами:1). ферритин, 450 кДа;

2). каталаза бычья, 240 кДа;

3). альдолаза кролика, 160 кДа;

4). бычий альбумин, 67 кДа.

х---

н-

I_« а ■

-С!

-а

-со

— -18.5

Рис.3. Фосфорилирование аффинно-очищенной фракции э1дА из молока в присутствии казеина и без него. А - гель, окрашенный Соота5э1е; В - радиоавтограф геля: 1) эГдА, 2) э1дА + казеин, 3) казеин.

Тем не менее, была предпринята попытка получить дополнительные аргументы в пользу того, что каталитической активностью обладают собственно молекулы з1дА. Учитывая высокую чувствительность радиоизотопного метода детекции протеинкиназной активности, нельзя было исключить,что даже небольшие количества иммунокомплексов в очищенном препарате з1дА могут определять ферментативную активность последнего. В связи с этим, нами была разработана схема поиска носителя протеинкиназной активности, основанная на сродстве ферментов к субстратам, катализируемых ими реакций. Поскольку предполагалось использовать аффинные сорбенты на основе сефарозы, которая может сорбировать декстран-специфические антитела, то, во избежание артефактов, фракцию белков, выделенную на протеин А-сефарозе, предварительно пропускали через колонку, содержащую се-фарозу 4В в ТВЭ-буфере. Было отмечено, что более 90% белка не свя-

зывалось с сефарозой. Следующим этапом, э1дА и 1дС разделяли хроматографией на колонке с Ргас1оде1 РЕАЕ 650 (М) в 5 мМ калий- фосфатном буфере рН, 7,5. Связавшиеся с сорбентом белки элюировали с помощью градиента концентрации ЫаС1. Определение протеинкиназной активности фракций позволило получить э1дА, обладающий максимальной активностью (рис.4).

2. Изучение сродства каталитически активной фракции белков молока к АТР-сефарозе и казеин-сефарозе.

Поскольку белки с протеинкиназной активностью должны обладать сродством к субстратам реакции: АТР и казеину, фракцию белков, полученную хроматографией на DEAE-сорбенте и обладающую высокой казеинкиназной активностью, подвергали разделению на АТР- (иммобилизован (8-аминооктил )-у-амид АТР) и казеин-сефарозе. На колонку, содержащую АТР-сефарозу, наносили фракцию slgA с максимальной казеинкиназной активностью в буфере, содержащем 10 мМ трис-НС1, рН 7.0, 3 мМ MgClg- Белки элюировали ступенчатым градиентом солей с последующим определением протеинкиназной активности полученных фракций (Рис.5). Было обнаружено, что около 60-80% белка (в зависимости от донора молока) исследуемой фракции обладало способностью связываться с сорбентом. Элюированные фракции белков отличались по сродству к АТР-сефарозе и обладали протеинкиназной активностью, за исключением фракции, у которой такое сродство отсутствовало. Электрофоретическим анализом было установлено, что полученные белковые фракции соответствуют slgA. Следует отметить, что некоторые из выделенных фракций slgA обладают высоким

0.03

0.1

-, ■ - |-1-1 " I

10 20 30 40 50 60 70

Рис.4. Разделение фракции белков молока на сорбенте Ргас1оде1 ТЭК 0ЕАЕ - 650 (М). - - поглощение при 280 нм, • - относительная казеинкиназная активность фракций.

объем элюата, мл

сродством к сорбенту и элюируются при условиях, характерных для диссоциации комплексов антиген - атитело (3 М ЫаС1; 3,5 М МдС^).

з1дА, соответствующие пикам 2-5 элюата с АТР-сефароэы, были подвергнуты хроматографии на казеин-сефарозе (рис.6). Было обнаружено, что около 20% белка не связывается с сорбентом. При элюции белков с колонки градиентом концентраций ИаС1 установлено, что изучаемая фракция э1дА гетерогенна по сродству к казеин- сефа-розе. Фракции э1дА с разным сродством к казеину различаются и по казеинкиназной активности.

Рис.5. Разделение э1дА на колонке с АТР-сефарозой. - - поглощение при 280 нм, 9 - относительная казеинкиназная активность фракций. На вставке приведены данные ЗОЭ-электрофореза белков фракций э1дА, где номера дорожек соответствуют номерам белковых пиков.

Рис.6. Хроматография slgA на

казеин-сефарозе.

- - поглощение при 280 нм,

• - относительная

протеинкиназная активность

фракций.

О 5 Ю

объем элюата, мл

Таким образом, было установлено, что белки молока, выделенные хроматографией на протеин А-сефарозе и обладающие казеинкиназной активностью представляют собой slgA, гетерогенные по сродству к АТР и казеину (т.е, к субстратам протеинкиназной реакции).

3. рН-шок и аминокислотная специфичность фосфорилирования.

Дополнительным подтверждением участия в каэеинкиназной реакции непосредственно молекул эГдА, а не примеси какой-либо протеин-киназы, послужили результаты гель-фильтрации препарата э1дА в условиях диссоциации иммунных комплексов (рН-шок). В описанных выше и данных экспериментах были использованы оптимальные условия протекания каэеинкиназной реакции с участием з!дА: 10 мМ трис-НС1 буфер, рн 6,8, 100 мМ ЫаС1, 1 мМ МдС12. Препарат з1дА инкубировали 1ч. при 20°С в трис-глициновом буфере, рН 2,3, а затем подвергали гель-фильтрации (рис.7). Профили элюции белка и казеинкиназной активности фракций практически совпадали. Поскольку было показано (Рис.5), что исследуемый белковый препарат соответствует вГдА, то следует полагать, что и казеинкиназная активность препарата является собственным свойством з1дА.

05 А»

Рис.7. Определение протеинкиназной активности во фракциях, полученных после гель-фильтрации препарата э1дА в буфере с рН 2.3 (рН-шок). - - поглощение при 280 нм, • - относительная казеинкиназная активность фракций.

021

I I I

4 6 I 10 N

Важной характеристикой любой протеинкиназы является определение специфичности ковалентного присоединения фосфата к аминокислотам молекулы субстрата. Поэтому была определена аминокислотная специфичность фосфорилирования казеина в присутствии з1дА. После проведения реакции фосфорилирования казеин гидролизовали 6 М НС1 с последующим разделением аминокислот электрофорезом в тонком слое целлюлозы в системе уксусная кислота : пиридин : вода (87:2:911) -в первом направлении; тонкослойной хроматографией в системе н-бутанол : муравьиная кислота : вода (4:1:1) - во втором направлении. Было установлено (Рис.8), что в реакционной среде, содержащей 32

з1дА, казеин и [у- Р]АТР, включение радиоактивного фосфата происходит по остаткам серина молекулы казеина.

4

Рис.8. Анализ Р-меченных аминокислот гидролизата казеина электрофорезом в тонком слое целлюлозы (1-е направление), с последующей хроматографией (2-е направление).1) фосфат, 2) фосфосерин, 3) фосфотреонин, 4) фосфотирозин, С) место нанесения образца.

4. Локализация АТР-связывакхцего участка на молекуле sIgA.

Следующим этапом работы было исследование участия полипептидов молекулы slgA в формировании его АТР-связывающего участка.

В первом случае (Рис.9), препарат slgA инкубировали в 10 мМ трис-HCl буфере рН 7,0, 3 мМ MgClg, содержащем 0,1 M DTT и 4 M мочевину, для разрушения дисульфидных связей и диссоциации полипептидов молекулы. Затем белок хроматографировали на колонке с АТР-сефарозой. Была получена фракция белков, которая по данным SDS-электрофореза соответствовала по молекулярной массе L- и J-цепям slgA (дорожка 3).

Рис.9. Профиль элюции slgA на АТР-сефарозе после инкубации slgA в буфере, содержащем 4M мочевину и 0,1 M DTT. На вставке приведены данные SDS-электрофореза выделенных фракций: 1) slgA до разделения, 2) белки, не связабшиеся с сорбентом, 4) белки фракции 2.

А. ,

мл

W-V»

» О)»»

Во втором случае (Рис.10), препарат э1дА инкубировали с

32

2',3'-диальдегидным производным [а- Р]АТР (оАТР) с последующим восстановлением основания Шиффа раствором боргидрида. Электрофоре-тическим анализом реакционной смеси было установлено, что включение радиоактивного фосфата происходит в белок, соответствующий по молекулярнной массе 1_- и и- компонентам вГдА.

12 3 4 Рис.10. Электрофорез продуктов реакции

з1дА с 2',3'-диальдегидным производным

-9С [а-32р]АТР (радиоавтограф).

"й 1) э1дА + [а-32Р]АТР, до инкубации

смеси; 2) то же после ее инкубации в

течение 1 ч.; 3) дА +

2' , 3 '-диал ьдегидное производное 32

^ [а- Р]АТР до инкубации смеси;

4) то же после инкубации в течение 1ч.

Чтобы установить, какая из цепей (L- или J-цепь) обладает сродством к АТР, была исследована стехиометрия ковалентного присоединения оАТР к молекуле slgA. Ковалентное присоединение оценивали по разнице радиоактивности в пиках белка, подвергнутого гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-25, до и после его инкубации

3

с 0,1 мМ [ Н]оАТР. Стехиометрия связывания была определена равной 2-3 моля реагента на моль slgA. Учитывая то, что молекула slgA состоит из 4-х L-цепей и одной J-цепочки, полученный результат указываем на то, что модификации подвергается легкая цепь иммуноглобулина. Поскольку L-цепь формирует структуру нуклеотид- связывающего участка slgA, то следует полагать, что каталитическая активность антител, по-видимому, обусловлена собственно молекулой IgA, а не ковалентно связанными с ней структурными компонентами (SC и J-цепь).

5. ФОСФОРШШРОВАНИЕ БЕЛКОВ МОЛОКА В ПРИСУТСТВИИ SlcA.

Следующим этапом работы было исследование возможного участия выделенных иммуноглобулинов в фосфорилировании белков молока. С этой целью молоко, истощенное по протеинкиназной активности, фос-форилировали в присутствии фракций slgA, обладающих различным сродством к АТР-сефарозе (рис.5). Было обнаружено, что в присутствии фракции slgA, не обладающей выраженным сродством к АТР, существенного изменения спектра фосфорилированны« белков не происходит (рис.11, дорожка 4). В то же время, при добавлении к молоку s IgA фракций, обладающих сродством к АТР, наблюдается заметное

возрастание уровня фосфорилирования белков (дорожки 5-8). Максимальное увеличение уровня фосфорилирования белков молока происходило при добавлении фракции slgA, обладающей наивысшим сродством к АТР (т.е., элюирующейся с АТР-сефарозы с помощью 3,5 М МдС^). В этом случае отмечается "всплеск" протеинкиназной активности исследуемого молока, которая существенно выше, чем в цельном молоке (дорожка 8). Особенно заметно появление низкомолекулярных радиоактивно меченных фосфопептидов, которых нет как при фосфорилирова-нии цельного молока, так и молока предварительно истощенного по протеинкиназной активности.

А 12345678 Рис.11. Фосфорилирование казеина

— и белков молока в присутствии

— МЛ фракций slgA, отличающихся по сродству к АТР-сефарозе. (радиоавтограф геля). ^ А- фосфорилирование белков молока: —14^4 1 - цельное молоко, 2 - молоко, истощенное по протеинкиназной активности (МИП),

о. 3 4 5 6 7 8

— — 3 - МИП +■ элюат с протеин А-

сефарозы, 4 - 8 - МИП + фракции slgA, элюированные с АТР-сефарозы (рис.6) ( 4 - slgA не связавшиеся с сорбентом, 5 - 8 - slgA, элюированные 50 мМ NaCl, 150 мМ NaCl, 3 М NaCl, 3 М МдС10). В - фосфорилирование казеина: 3 - элюат с протеин А-сефароэы. 4 - slgA, не связавшиеся с АТР-сефарозой. 5 - 8 - фракции slgA, элюированные с АТР-сефарозьь.

Дополнительно было исследовано влияние белков фракций, соответствующих разделению э1дА в условиях рН-шока (рис.7), на фосфорилирование белков истощенного по протеинкиназной активности, молока (МИП). Установлено, что в присутствии белков фракций, соот-ветсвующих э1дА (рис.12А), происходит увеличение фосфорилирования белков молока. Максимальная протеинкиназная активность МИП наблюдается в присутствии фракции с наиболее высокой концентрацией э1дА (рис.12В).

А:

Рис.12. Фосфорилирование белков молока, истощенного по протеинкиназной активности (МИП) в присутствии э1дА, фракционированного при низких значения рН (рН-шок). А - гель, окрашенный Сотазэте; В - радиоавтограф геля. 1) - 8) электрофорез белковых фракций элюата (Рис.10), 9) МИП, 10) - 17) МИП + белки фракций элюата.

Таким образом, было установлено, что в молоке человека каталитически активные антитела могут фосфорилировать ряд белков и, тем самым, по-видимому, участвовать в регуляции их функциональной активности.

6. анти-б^а антитела плазмы здоровых людей ингибируют

фосфорилирование белков молока.

Особенности функционирования секреторной иммунной системы предполагают наличие секреторных иммуноглобулинов как в молоке (Е1дА), так и в крови (в виде димера IдА) доноров. Соответственно, может происходить наработка аутоантител к этим иммуноглобулинам (в частности и антиидиотипических антител). В принципе, если появление обнаруженных з1дА-а6зимов не связано с процессом лактации, то можно предположить, что такие аутоантитела могут присутствовать не только у рожениц, но и у других людей. Чтобы проверить данное предположение, очищенную фракцию Б1дА иммобилизовали на сефарозе и использовали для изучения связывания белков плазмы крови здоровых доноров с эIдА-сорбентом. Обнаружено, что в крови людей присутствуют белки, обладающие различным сродством к исследуемому б I дА. Из рисунка 13 видно, что молекулярные массы выделенных белков соответствуют альбумину и 1дй плазмы крови человека. Наличие 1дС в выделенной фракции было установлено методом двойной иммунодиффузии по Ухтерлони. Следовательно, в крови людей различного пола присут-

ствует фракция Гдй, обладающая высоким сродством к з1дА из женского молока. Поскольку в выделенной фракции 1дЭ могли присутствовать и антиидиотипические антитела к э1дА, то в дальнейшем было изучено влияние 1дС на протеинкиназную активность молока. Было установлено, что добавление к молоку антител с высоким сродством к з1дА приводит к существенному подавлению его протеинкиназной активности (рис.14). В настоящее время нельзя с уверенностью сказать, что выделенные сывороточные 1дй являются антиидиотипическими антителами к з1дА. Однако, обнаруженный феномен указывает на то, что данные Б1дА могут присутствовать как в молоке рожениц, так и в крови других людей. Данное предположение косвенно подтверждает и тот факт, что наличие иммуноглобулиновой фракции з1дА с каталитической активностью не зависит от времени начала лактации, хотя ее активность существенно различается у разных доноров. 0.1 а

• I I I 4 ■

Рис.13 Разделение белков плазмы крови человека на колонке с

дА-сефарозой. На вставке представлены данные БОБ-электрофореза фракций:

1) стандартный 1дС человека,

2) белки, элюирующиеся 0,3 М ИаС1, 3) белки, элюирующиеся 0,6 Н ЫаС1, 4) белки, элюирующиеся 0,1 М глицин-НС1, рН 2.6, 5) плазма крови человека.

Рис.14 Фосфорилирование белков молока в присутствии фракции 1дй из плазмы крови человека, обладающей сродством к з1дА. А - гель, окрашенный Соотавэте, В - радиоавтограф геля. 1) молоко, 2) молоко + ¡дй.

выводы.

1. Впервые показано, что секреторные иммуноглобулины класса А могут обладать ферментативной активностью: электрофоретически гомогенный slgA, выделенный из человеческого молока с помощью нескольких аффинных сорбентов, катализирует в присутствии АТР фосфорили-рование казеина по остаткам серина. Активность антител сохраняется после pH-шока. АТФ-связывающий участок slgA локализован на легкой цепи: в условиях диссоциации slgA легкие цепи избирательно связываются с АТР-сефарозой, а реакционноспособное производное АТР избирательно модифицирует легкие цепи антител (2-3 моля реагента на моль белка). slgA является первым примером природных абзимов у организмов без аутоимунных патологий.

2. Впервые поликлональные slgA разделены на несколько фракций, обладающих различным сродством к АТР. Показано, что добавление к молоку, истощенному по протеинкиназам, различных фракций антител приводит к фосфорилированию антителами казеина и ряда других белков с разными молекулярными массами. Повышение уровня фосфорилиро-вания белков коррелирует с увеличением их сродства к АТР.

3. Впервые с помощью хроматографии белков плазмы крови на сорбенте с иммобилизованной sIgA-киназой получена фракция сывороточного IgG, обладающего способностью ингибировать фосфорилирование белков молока. Сделано предположение о том, что в крови человека могут присутствовать аутоантитела к slgA.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах: 1. Щербаков Д.Ю., Кит Ю.Я., Колдашова З.Т., Сидоров В.Н. Фосфорилирование белков на поверхности клеток слюнных желез личинок Dro-sophila Melanogaster.// Биохимия. 1987. T.52, Вып. 10. С. 1608 -1613.

2 .✓'Ki t Yu.Ya, Kim A.A., Sidorov V.N. Affinity-purified secretory immunoglobulin A possesses the ability to phosphory1 ate human milk casein.// Biomed. Sei. 1991. V. 2. P. 201 - 204.

3. Кит Ю.Я., Семенов Д.H., Невинский Г.A. Существуют ли каталитически активные антитела у здоровых людей? (Протеинкиназная активность slgA из молока человека).// Молекулярная биология. 1995. Т.29, Вып.4. С. 893 - 905.