Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Нуклеотид-гидролизизующая активность иммуноглобулинов и лактоферрина молока человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Нуклеотид-гидролизизующая активность иммуноглобулинов и лактоферрина молока человека"

На правах рукописи

СЕМЕНОВ ДМИТРИЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

НУКЛЕОТИД-ГИДРОЛИЗУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ И ЛАКТОФЕРРИНА МОЛОКА ЧЕЛОВЕКА

03.00.04 - БИОХИМИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск - 1998

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической химии

СО РАН.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Невпнскии Г.А.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Дымшиц Г.М. доктор биологических наук Каракин Е. П.

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Зашита состоится " ^ "1998 г. в

/6

часов на заседании Диссертационного совета" К 003.52.01 в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект Лаврентьева, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биооргапической химии СО РАН.

Автореферат разослан " МгЯХ^/ 1998 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор химических наук * . О.С. Федорова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

1Доведенные и последнее десятилетие исследования показали, что антитела (ЛТ) способны не только связывать антигены, но и катализировать широкий спектр различных химических превращений. Установлена возможность появления каталитических антител (абзимов) при иммунизации животных ['аптеками -аналогами переходных состояний химических реакций. Подбирая структуру гаптеиа можно получать моноклональмые абзимм. осуществляющие катализ реакций, субстраты и продукты которых пе имеют аналогов в живой природе, а кроме того превращения, механизм которых не реализуется природными биокатализаторами. Основные усилия в области исследования моноклональных абзимов сосредоточены на выяснении механизмов катализа антителами, а также на возможности реализации антигенсвязываюпшм центром иммуноглобулинов структурно-функциональных -элементов активных центров ферментов.

Природные (иоликлональные) абзимм впервые были обнаружены в крови людей, страдающих астмой: они расщепляли кишечный вазоактивньш пептид. Затем были обнаружены ДНК- и РНК-гндро.тиз\ юшие АТ в крови больных системной красной волчанкой. Дальнейшие исследования показали, что абзимы образуются и при друшх патологиях: ревматоидном артрите и склеродермии, аутоиммунном тиреоидите. полиартрите, рассеянном склерозе, а также при различных формах вирусного гепатита и при СПИДе - заболеваниях, протекающих с нарушением иммунного стату са пациента. Обнаруженные абзимы гидролизовали белки или ДНК. либо наряду с ДНКазной облачали еще и РНК-гидролизуюгцей активностью. Несмотря на значительный прогресс в этой области, механизмы индукции, каталитический потенциал и роль природных абзимов в организме до настоящего времени остаются не выясненными.

Недавно было показано, что б^А здоровых по медицинским показаниям рожениц фосфорилируют ряд белков молока: в^А- и 1§0-абзимы молока катализируют гидролиз ДНК и РНК. Следовательно, наработка абзимов секреторной иммунной системой молочной железы возможна и в отсутствие аутоиммунных процессов. В ходе исследования каталитических свойств иммуноглобулинов человеческого молока было отмечено, что пул и з^А обладает не только протеинкиназной и нуклеазной активностями, но и гидролизует АТР до АГЭР и ортофосфата. В связи с тем, что феномен гидролиза природными АТ низкомолекулярных гаптенов (в частности АТР), очевидно, выходит за рамки взаимодействия антиген-антитело, АТР-гидролизующие свойства ^ можно рассматривать как новую, еще не охарактеризованную функцию антител. Исследования в этой области важны как для установления роли

антител в 'защитных п регуляторных процессах организма. так и для понимания механизма реализации каталитического потенциала белковых структур.

Цель работы.

Целыо настоящей работы является исследование пуклеотид-гидролизующей активности антител молока человека, установление субстратной специфичности таких абзимов, определение роли отдельных субъединиц олигомеров иммуноглобулинов в связывании и гидролизе нуклеотидов. а также выявление и исследование других белков молока с аналогичной ферментативной ак-iивностыо.

Научная новизна и практическая ценность.

В работе впервые показано, что иммуноглобулины класса G и секреторные иммуноглобулины класса Л человеческого молока обладают щклеотид-гидролизующей активностью. Показано, что активность является собственным свойством антител. Выявлена роль отдельных субьединиц в формировании АТР-связывакнцих/ЛТР-гидролизующих активных центров антител. Результаты исследования свидетельствуют о том. что гидролиз нуклеотидов абзимами имеет неспецифический характер. При исследовании пуклеотид-гидролизующей активности белков молока было обнаружено, что лактоферрин (ЛФ) обладает способностью связывать и гидролизовать АУР. С помощью различных подходов показано, чю связывание A'1'P приводит к конформационпым перестройкам лактоферрипа. Показано. что АТР-связываюншй/гидролизующий центр расположен в С-концевом ломене молекулы ЛФ. Связывание ATI' приводит к диссоциации тетрамерпых форм белка до мономеров и изменению характера взаимодействия ЛФ с олигонуклеотидами. полисахаридами и некоторыми белками.

Полученные данные представляют интерес при анализе механизмов функционирования секреторной иммунной системы человека.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования, их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 115 страницах, содержит 33 рисунка и 2 таблицы. Список цитированной литературы включает 170 работ.

Публикация и апробация работы.

Материалы диссертации опубликованы в 8 статьях и 5 тезисах докладов. Результаты работы были представлены на: The 2-nd International Conference "Catalytic antibodies and Antibody Engineering". 1996. Chantillly. France: The 3rd

International Engelhardt Conference on MoIet;iih>i Hiologv 1997. Moscow; Научно-практических конференциях врачей. 1996. 1997 и 1998 п.. Новосибирск.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Выделение пуклеотид-гидролизуюшнх лнтнгел из молока человека

В холе исследования протеипкииашой и нуклеазной активностей антиген молока было отмечено, что пул IgG и slgA обладает способностью гидролиювать ЛТР до AD1' и ортофосфата. Полученные данные указывали на наличие у А Г собственной А ГР-гидролизующей активности.

Для доказательства того, что активность проявляют иммуноглобулины, а не совыделяюшиеся с ними белки, была разработана схема выделения гомогенных препаратов AT in молока, включающая аффинную хроматографию молочной плазмы па протеин А-сефарозе. ионообменную хроматографию препарата суммарных AT на ДЭАЭ-целлюлозе, аффинную хроматографию IgG и slgA на сорбентах с иммобилизованными антителами против иммуноглобулинов класса G и А. соответственно, гель-фильтрацию AI в условиях разрушения иммунных комплексов. Методом иммунодиффузии но Оухтерлопи с использованием специфических антисывороток против иммуноглобулинов человека было показано, что препараты AT на стадии выделения аффинной хроматографией на протеин А-сорбспте содержат IgG и slgA. Разделение ионообменной хроматографией приводило к получению злекгрофоретически гомогенных препаратов IgG и slgA (рис. 1). IgG большинства доноров обладали большей удельной АТРазной активностью, чем slgA (рис. 1. пики 1 и 2. соответственно).

При дополнительной очистке slgA и IgG на сорбентах с иммобилизованными антителами против иммуноглобулинов человека белковый материал и АТРазпая активность полностью связывались с сорбентом и их злюировали буфером с кислым значением pH. Полученные препараты антител молока являлись электрофоретически чистыми по окраске белков серебром и, как видно из рис. 2. содержали в случае IgG тяжелую и легкую цепи, а в случае slgA -дополнительно секреторный компонент. Согласно литературным данным, при SDS электрофорезе (ЭФ) в полиакриламидном геле (Г1ААГ) J-цепь slgA обладает подвижностью близкой к таковой для легкой цепи Ig. Это объясняет отсутствие полосы, соответствующей J-цепи, которая по данным гель-фильтрации и ультрацентрифугирования имеет Мм 14 кДа.

j

Фракции

Рис. 2. 5П5-электрофорегичеекнй анализ гомогенности препаратов АТ: а) в невосстанавливающнх условиях; б) в присутствии 2-меркаптоэтанола; 1 суммарный препарат в^А и (после аффинной хроматографии на протеин А-сефарозс): 2- белковый материал пика 1 (^0); 3 - белковый материал пика 2 (5^А, рис. 1). Окраска белков серебром.

Рис. 1. Профиль ионообменной хроматографии суммарного

препарата АТ молока на ДЭАЭ-целлюлозе. (-) - Оптическое поглощение при 280 им. (•) -относительная АТРазная

активность фракций.

а б

«Да 12 3

20 -14,4 ►

кДа 1 2 3

150 94 -67 42 30 20

slgA

IgG

При гель-фильтрации в условиях разрушения иммунных комплексов (в буфере с кислым значением рН или в присутствии хаотроппых агентов: мочевины, изотиоцианата или гуамидин хлорида) как в случае slgA. так и в случае IgG. хроматографические профили ферментативной активности совпадали с профилями оптического поглощения белкового материала антител (рис. 3).

Одним из самых прямых и надежных подходов доказательства ферментативной функции белка является выявление активности в геле после электрофоретического разделения белков в присутствии SDS. Ранее для зимографического выявления АТРаз в геле после нативного электрофореза был предложен метод, основанный па осаждении фосфата свинца. Этот метод был адаптирован нами для выявления АТРазной активности в препаратах антител, подвергнутых денатурирующему электрофорезу в присутствии SDS. С использованием контрольных препаратов фосфатаз, а также ряда нерасщепляюгцих АТР белков, были подобраны условия, в которых не происходит неспецифической адсорбции ионов свинца белками, и в то же время из геля не

А

0,1 -|

0,05-

360 150 67 30 14 кДа

I {III

~280 0,1 -

0,05-

т

6 8 10 Объем, мл

67 30 14 кДа

I I I

Рис. 3. Профиль гель-фпльтрашш препаратов IgG (а) и slgA (б) на Toyopearl HW-55, уравновешенной кислым буфером рН 2.6, содержащим 0.5 M NaCI Перед гель-фильтрацией AT предынкубировати в том же буфере.

(-) - Оптическое поглощения бетка при 280 им. (•) - относительная А1 Разная активность.

О 2 4 6 8 10 Объем, мл

удаляется осадок' фосфата свинца, образовавшийся в ходе ферментативного гидролиза АТР. Из рис. 4 видно, что после удаления ЯОБ и ренатурации белков в геле ЛТРазную активность выявляли в белковых полосах, соответствующих антителам. Таким образом, совокупность полученных данных свидетельствовала о том. что АТРазная активность является собственным свойством антител, и ее нельзя объяснить совыделением ферментов молока с иммуноглобулинами.

1 2

kDa -150

-94 -67 -42

-30 -20

Рис. 4. Анализ АТР-гидролизующей активности в геле после разделения препаратов slgA (I) и IgG (2) ЭФ в присутствии SDS. Положение каталитически активных полипептидов в геле выявляли по окраске продукта расщепления АТР - ортофосфата.

Локализация АТР-связывающего/АТР-гидролпзующего центра иммуноглобулинов молока человека

Для локализации АТР-связываютцего центра применяли метод аффинной модификации антител аналогами АТР. Было обнаружено, что 2'-3'-диальдегидное производное АТР (оАТР) модифицирует только легкие цепи slgA, а иммуноглобулины G модификации этим аналогом не подвергаются. Однако, взаимодействие IgG с алкилирующим аналогом АТР - 4-(М-2-хлорэтил-М-метиламипо) бензиламидом ATP (RCI-ATP) приводило к селективной модификации легкой цепи иммуноглобулина (рис. 5). Полученные данные указывают на важную роль легкой цени антител молока в формировании АТР-связывающего центра. Для локализации АТР-тидролизующего центра были исследованы каталитические свойства протсолитичсских фрагментов антител.

Г идролиз АТР катализировали только Fab-. но не Fc- фрагменты Ig. Кроме того, было установлено, что РаЬ-фрагмепты антител, содержащие легкую цепь аз-тина. обладали большей удельной активностью, чем Г'аЬ-фрагменты с /.-легкой цепыо. Ранее было показано, что изолированные ;iei кие цепи аз-типа обладаю! ДНК- и РНК-гидролизующей активностью в случае IgG-абзимов из крови больных рассеянным склерозом, а шкже способны гидролизовать олигопептидпый иейрогормои при бронхиальной астме. В связи с ним можно было предположить, что легкие цепи антител человеческого молока также могут обладать АТР-гидролизующей активностью. Однако при анализе АТРазной активности отдельных субъедипиц о.нпомеров антител после разделения ЭФ в геле в присутствии SDS было установлено, что изолированные легкие и тяжелые цепи не гидролизуют АТР (рис. 6). В то же время, продукты частичного восстановления lg обладают АТРазной активностью. Эти данные в совокупности указывают на то. что в формировании АТР-гидролизующего центра принимают участие как легкие, так и тяжелые цепи иммуноглобулинов.

Субстратная специфичность slgA и IgG человеческого молока в реакции гидролиза нуклеотпдов

Гидролиз АТР. катализируемый AT или их Fab-фрагментами. протекал с образованием ADP. AMP и оргофосфата. При временах инкубации порядка 2 ч основными продуктами гидролиза АТР были ADP и неорганический ортофосфат. Относительные удельные активности IgG и slgA менялись в широком диапазоне в зависимости от донора молока. Однако в большинстве случаев величины ка1. характеризующие активность IgG. варьировали в диапазоне от 0.1 до 0.8 мин"'. Относительная удельная активность IgG была обычно примерно в 3-4 выше, чем для slgA. В отличие от специфических АТРаз. AT гпдролизоиалп не только АТР. но и ряд других NTP или dNTP с сопоставимой -эффективностью. Кинетика

кДа 94 ч 67 Ч 42 И

30-1 20-» 14,4->

2 3

кДа

94 ->. 67 ■> 42 ->

30 -> 20 -*• 14,4 ->

б

1 2 3

Рис. 5. а) .ЧОЯ ЭФ анализ аффинного мечсиия [а-'2Р|оАТР. 1 - окраска белков кумасси; 2 . 3 -радиоавтограф геля после разделения субъединнц 8|§А аффинно меченных |«-'"1']оАТР в отсутствие и в присутствии 0.5 мМ АТР. соответственно б) ЭОХ ЭФ анализ аффинного мечения субъединиц 1^0 апкилпруюишм производным |у-,2['1АТР (КС1-АТР): дорожка 3 -радиоавтограф дорожки 2,

соответствующей окраске кумасси. Дорожка 1 - белки с известной молекулярной массой.

Рис. 6. Анализ АТР-гидролизующеП активности в теле после разделения препарата fgG ЭФ в присутствии SDS. Положение каталитически активных форм lgG в юле выявляли по окраске продукта расщепления АТР - оргофосфата. I-нрепарат lgG. необработанный 2-мсркаптоэтано.гоч: 2 - lgG после 20 мин инкубации при 45"С в Трнс-НС'1 буфере, pli 6 8. содержащем 1 мМ 2-меркапто:шшол, 3 - Ig(} после 20 мин инкубации при 45°С в том же буфере в присутствии 120 чМ 2-меркатоттапола Положение тяжелых (II) и легких (L) цепей указано стрелками

12 3

lgG

н

■1

> '-м

гидролиза NTP до NDP и ортофосфата подчинялась уравнению Михаэлиса-Ментен. Данные, полученные с использованием одного из препаратов IgG с умеренной АТРазной активностью, суммированы в таблице I.

Субстратная специфичность sIgA-абзимов в реакции гидролиза нуклеотидов несущественно отличалась от специфичности IgG. Как и в случае IgG. зависимость начальной скорости гидролиза пуклеозидтрифосфатов рибо- и дезокси- рядов от концентрации субстрата подчинялась уравнению Михаэлиса-Ментен. Оцененные значения величин Кт для различных NTP укладывались в диапазон от 13 до 80 мкМ. Необходимо отметить, что значения Кт реакции гидролиза рибо-пуклеозидтрифосфатов sIgA-абзимами были несколько ниже, чем для IgG. Так например, величина Кт реакции гидролиза АТР, катализируемой IgG. составляла 45 мкМ. в то время как для sIgA-абзимов того же донора - 23 мкМ.

Таблица 1. Кинетические параметры, характеризующие гидролиз нуклеотидов ^С антителами человеческого молока

Субстрат Кт, мкМ ' max* мкМ/мин ¿cat. МИН"' ¿cal^m - мкМ"' «мин"1

АТР 44 0.58 0.26 5.9.10'3

GTP 53 0.93 0.43 8. МО"3

СТР 70 1.1 0.50 7.1»Ю'3

dATP 62 0.57 0.26 4.2.10"3

dGTP 53 0.75 0.34 6.4» КГ

dCTP 79 0.98 0.45 5.7.10'3

оАТР 120 0.14 0.064 5.3»10"4

Ошибка в определении величин не превышала 10 - 20%. Приведенные данные являются средним значением трех независимых экспериментов.

Наиболее заметные различия в субстратной специфичности slgA- и IgG-абзимов были выявлены при анализе субстратных свойств у-фосфамидпых производных АТР. Было показано, что в отличие от IgG. slgA обладаю! повышенным сродством к АТР. иммобилизованному па ссфарозе в виде 6-ахишогексил-у-амида Л'ГР. Различия в связывании N-фосфамидных производных АТР slgA и IgG были выявлены также при исследовании активных центров AT аффинной модификацией аналогами АТР (ем. выше). В связи с этим были проведены эксперименты по определению субстратных свойств у y-N-метилфосфамида АТР в реакции гидролиза slgA- и IgG-абзимами. Полученные данные свидетельствовали, что тогда как IgG не гидролизуют аналог АТР. slgA расщепляли его с образованием N-метил фосфамида ортофосфата и ADP. Оцененные значения величин Кт = 37 мкМ и ' max = 0-6S мкМ.мип"1 для реакции гидролиза y-N-метил фосфамида АТР. катализируемой slgA, в сравнении с величинами Кт = 53 мкМ и Гтах = 0.76 МКМ'МИН"1 гидролиза АТР указывали па то. что наличие заместителя в у-фосфатной группе трифосфата иесущественно влияет на субстратные свойства АТР.

Известно, что фосфатазы катализируют отщепление фосфата не только в случае NMP и dNMP. но и у-фосфатной группы NTP и dNTP. Отсутствие выраженной избирательности IgG и slgA в реакции гидролиза различных NTP и dNTP указывало в пользу большего сходства абзимов с неспецифическими фосфагазами. чем с АТРазами. Учитывая эти данные, была исследована

возможность гидролиза АТ иуклеозидо'-монофосфатов. Показано, что АТ способны гидролизовать NN4? с образованием нуклеозидов и неорганического ортофосфата. Однако, в огличие от неспецифических фосфатаз, они не гидролизуют типичных для фосфатаз субстратов: п-нитрофенилфосфата и а-нафтолфосфата. Таким образом, специфичность нуклеотид-гидролизующих абзимов существенно отличается как от специфичности известных АТРаз, гак и фосфатаз.

Исследование кинетики ^О-зависимого гидролиза NN1? выявило некоторые особенности этого процесса. Зависимости начальной скорости гидролиза от концентрации NN1? (Г от Г.'РММР]) не подчинялись уравнению Михаэлиса-Ментен и в отличие от аналогичных зависимостей для 1ЧТР носили нелинейный характер. Представление данных в координатах Эйзенталя и Корниш-Боуден позволяет оценить диапазон изменения величин Кт для АМР в случае одного из препаратов от 75 до 300 мкМ (рис. 7).

Можно предположить, что препараты АТ содержат несколько типов абзимов, имеющих различное сродство к КМР. Дополнительные аргументы в пользу поликлональности нуклеотид-гидролизующих АТ были получены при анализе сродства б^А человеческого молока к АТР-сефарозе. Было показано, что в^А гетерогенны по сродству к АТР-сорбенту. В состав препаратов поликлональных б^А входят такие АТ, комплекс которых с сорбентом устойчив в условиях элюции буфером с высокой ионной силой (3 М ЫаС1) и разрушается только буфером с высокой концентрацией хаотропных агентов или 3 М Р^С12. Сравнительный анализ сродства б^А к АТР-сефарозе свидетельствовал о том, что относительное содержание белка и удельная А ГР-гидролизующая активность АТ во фракциях с различным сродством к сорбенту варьирует от донора к донору, практически у всех

0,5

Рис. 7. Зависимости начальной скорости реакции гидролиза AMP IgG-абшмами от концентрации субстрата в координатах "Эйзенталя и Корниш-Боуден

300 200 100

-100 -200 -300 [АМР], мкМ

(из 22 тестированных) допоров было выявлено наличие значительного количества sIgA-антитсл. прочно связывающихся с АТР-сефарозой. удельная АIP-гидролизуюшая активность slgA во фракциях с повышенным сродством к сорбенту обычно в 2-4 раза выше, чем в низкоаффинных фракциях.

Аналогичная ситуация обнаружена ранее при исследовании абзимов из крови пациентов с аутоиммунными заболеваниями: у отдельных больных может формироваться как относительно узкий, так и исключительно обширный пул поликлоиальиых абзимов. которые содержат легкие цени как as-. так и к- типа, проявляют максимальную активность при различных pH. имеют различный суммарный заряд и характеризуются различной зависимостью активности от ионов двухвалентных металлов. Величины Кт для субстрата в зависимости от заболевания и конкретного пациента также могут иметь вполне определенную величину или изменяться в широком диапазоне значений. В связи с згим следует отметить, что данные, полученные ранее при исследовании ДНК- и РНК-гидролизующих абзимов молока, свидетельствуют в пользу возможности появления у некоторых доноров абзимов с каталитической активностью, подобной активности фосфодиэстсраз. Ввиду близости физико-химических характеристик AT с различными каталитическими активностями их разделение чрезвычайно затруднено, и в большинстве случаев препараты АТР-гидролизующих абзимов содержат IIK-гидролизуюшие абзимы в заметных количествах. Проведенное нами на ряде таких препаратов AT сопоставление оптимальных условий, начальных скоростей реакций г идролиза N IT. NMP и о.тигонуклеотидов различного состава показало, что относительные уровни ДНК-. РНК-. АТР-. АМР- гидродизуюших активностей AT не коррелируют между собой и значительно изменяются от донора к донору. Это может свидетельствовать, с одной стороны, в пользу индукции синтеза AT с различной каталитической активностью у разных доноров молока, а с другой - синтеза таких AT различными клонами В-лимфоцитов.

Взаимодействие нуклеотид-гидролизующих антител с белками E.coli

Проявление антителами человеческого молока собственной нуклеотид-гидролизуюшей активности еще раз подтверждает тот факт, что секреторная иммунная система матери в период беременности способна генерировать каталитически активные антитела без иммунизации гаптеиами - аналогами переходных состояний химических реакций, и в отсутствие аутоиммунной патологии. С другой стороны, эта активность может служить естественным ферментативным маркером антител для выяснения их антигенной специфичности.

Известно, что человеческое молоко содержит антитела к широкому спектру бактериальных и вирусных антигенов. Для определения антигсн-связывающих свойств АТР-абзимов молока в качестве антигенного материала был выбран грубый экстракт суммарных белков Е. coli.

Выявление антигенов суммарных А'1 молода проводили с помощью двух подходов: иммуноферментного анализа с использованием коньюгаюв slgA -щелочная фоефатаи. а также с помощью аффинной хроматографии белков Е. coli на сорбенте с иммобилизованными slgA. Как в первом, так и во втором случае было обнаружено, что антитела молока способны взаимодействовать с широким набором белков кишечной палочки. Как видно из рис. 8. спектры полипептидов Е. coli - потенциальных антигенов для slgA молока, полученные с помощью двух независимых подходов, хотя и не идентичны, однако сог ласуются между собой.

Для выявления и общем наборе белковых антигенов только тех. с которыми взаимодействую!' АТР-абзимы, нитроцеллюдозную реплику SDS ОФ белков Е. coli обрабатывали AT человеческого молока и выявляли собственную АТРазную активность комплексов антиген-АТ in situ (осаждением фосфата свинца). В качестве контроля использовали реплику белков /:.. coli, необработанную А Г. Сравнение дорожек 5 и 4 (рис. 8) позволяет предположить, что полипептиды с Мм -70 и -46 кДа являются антигенами для АТР-абшмов молока одного из доноров. АТР-абзимы другого донора (дорожка 6. рис. 8) взаимодействовали преимущест венно е ио.шнептидом Е. coli с Мм - 23 кДа.

Спектр белковых антигенов Е coli, ушаваемых АТР-гидролизуюишми А'1 молока, варьирует от донора к донору. ')ю свидеге ibciByei в пользу otcvicibhh выраженной копсерват ивпости антиген-евмзмвающих регионов A I Р-абзимоп.

Принимая во внимание нолиреакп tibikici ь. присущую ÄT молока, пе.тмя однозначно утверждал., что белковые шлпгены Е. coli являются цдпнсшенным стимулом для генерации АТР-абзимов. Однако каже!ся оправданным

Рис. 8. Анализ взаимодействия AT человеческою молока с белками Е coli. 1. 2. 4-6 - нитроце.тл1оло!1ше реплики SDS ">Ф в ИААГ.

1 - окраска белков Е coli коллоидным серебром.

2 - выявление антигенов Вестерн-блотингоч с помощью конькиата slgA-шелочная фосфатаза

3 - SDS ')Ф в ПААГ белков E.coli. выделенных аффинной хроматографией на колонке с иммобилиюванпыми slgA (окраска кумасси) 4 -выявление собственной А'1 Разной активности белков E.coli. 5. 6 - выявление антигенов Е. coli для АТР-абзимов молока двух различных доноров Вестерн-блотиитом с помощью окрашивания на собственную АТРазную активность А'Г (осаждением фосфата свинца).

«Да 1 2 3 456

94 i I' I

67

42

30

20 •' '' г\ • »

14 яя

I I

предположение об участии бактериальных компонентов кишечной флоры в индукции нуклеотид-гидролизующей активности у антител человеческого молока.

Для получения дополнительных аргументов, в пользу того, что нуклеотид-гидролизующая активность является собственным свойством AT молока, а также для выяснения роли АТР-абзимов. с нашей точки зрения, представлялось актуальным выявление других белков молока, способных связывать и гидролизовать АТР.

Анализ нуклеотид-гидролизующей активности белков молока

Обнаружение АТРаз человеческого молока проводили с помощью описанного выше метода тестирования активности в геле после SDS ЭФ молочной плазмы в ПААГ. Из рис. 9 видно, что АТРазпую активность проявляли кроме slgA белки с Мм 130 и 76 кДа. Необходимо отмстить, что так как IgG является минорным компонентом молока, его АТРазная активность без дополнительного обогащения данным методом не выявляется. Было показано, что полипептид Мм 76 кДа является лактоферрином (ЛФ) молока человека.

Лактоферрин присутствует в высокой концентрации (~ 1-2 мг/мл) в молоке, других эпителиальных секретах. Он обнаружен также в гранулах нейтрофилов и плазме крови. ЛФ человека обладает большим числом уникальных свойств и известен как одни из наиболее важных факторов неспецифической защиты клеток от бактерий, вирусов и раковой трансформации. Он также является важным компонентом системы, ответственной за пассивный иммунитет новорожденных.

Выявление АТРазной активности в полосе ЛФ позволило предположить, что ЛФ может обладать АТР-гидролизующей активностью. Для подтверждения этого предположения было проведено выделение ЛФ из молока и исследовано его взаимодействие с нуклеотидами.

Выделение ЛФ из человеческого молока и анализ его взаимодействия с

АТР

ЛФ выделяли из молока человека по следующей схеме: аффинная хроматография на гепарин-сефарозе. аффинная хроматография на голубой сефарозе и аффинная хроматография на колонке с иммобилизованными антителами против ЛФ человека. Препараты ЛФ уже после аффинной хроматографии на голубой сефарозе были гомогенными по данным ЭФ в ПААГ (рис. 10). Соответствие полученного белка лактоферрину было показано иммунодиффузией по Оухтерлони с антителами против ЛФ человека.

кДа 150 -*-94

67-> 42->

30->

20-> 14->

• э1дА

■ ЛФ

• альбумин

■ р-казеин

■ а-лактальбумин

Рис. 9. Анализ АТР-гидро.тнзуюшей активности белков молока после разделения в ПААГ. 1 - окраска белков кумасси. 2 - белки окрашены на проявление АТР-1 идролизуютцей активности (осаждением продукта реакции фосфа!а свинца)

ЛФ сохранял способность пиро ш «пинь А1Р на всех стадиях выделения. Тог факт, что активность является собственным свойством ЛФ. был по ивержден с помощью тестирования АТРазнон активное!и в 1 еле белка, очищенного, как описано выше.

Гидролиз пуклеозидтрифосфатов и присутствии ЛФ носил специфичный по отношению к АТР характер. В отличие 01 атигел молока скоросп. гидролиза с1А'ГР и рибопуклеозидтрифосфатов пиримичинового ряда была на порядок ниже, чем скорост I. гидролиза АТР.

Согласно литературным данным. ЛФ еосюш из одной субье.чипицы ((173 А1< остатков), содержащей два саГпа гликозилировання. Молекула ЛФ образует два гомологичных домена, содержащих по одному жедезо-связииакицему центру. Связывание железа с ЛФ приводит к одновременной фиксации молекулы бикарбоната. Сродство атомов железа к ЛФ чрезвычайно высоко (М 1 нМ). При

12 3 4 кДа

Рис. Ю. SDS -члектрофоретический анализ тмотпюсти препаратов ЛФ на различных стадиях выделения (окраска белков серебром): суммарный препарат белков молока (1): препараты ЛФ после хроматографии на гепарин-сефарозе (2), голубой сефарозе (3). анти-ЛФ сефароче (4).