Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Липид- и полисахаридкиназная активности антител молока человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Липид- и полисахаридкиназная активности антител молока человека"

На правах рукописи

0030БВ364

КАРАТАЕВА НАТАЛИЯ АЛЕКСЕЕВНА

ЛИПИД- И ПОЛИСАХАРИДКИНАЗНАЯ АКТИВНОСТИ АНТИТЕЛ МОЛОКА ЧЕЛОВЕКА

03 00 04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 2007 г

003058364

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Научный руководитель

д х н профессор Невинский Георгий Александрович

Официальные оппоненты

д б н Хлебодарова Тамара Михайловна

к б н Кулигина Елена Владимировна

Ведущая организация

Институт клинической иммунологии СО РАМН

Защита состоится -¿Я/ » 2007 г в

на заседании диссертационного совета Д 003 045 01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу 630090, г Новосибирск, пр Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автореферат разослан » 2007 г

Ученый секретарь

диссертационного совета д х н ¿тр? -^/¿Ьб-^ГТ, О С Федорова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Процессы фосфорилирования играют важную роль в регуляции жизнедеятельности различных организмов, фосфорилирование может существенно менять химические свойства и биологические функции белков, липидов и углеводов Существуют ферменты - киназы, которые катализируют реакцию переноса фосфатной группы от АТР или других NTP к различным соединениям, в том числе и к специфическим аминокислотным остаткам белков (протеиикиназы), либо к ОН-группе липидов (липидкиназы) Известно, что фосфорилирование киназами некоторых субстратов, включая липиды, необходимо для проведения различных сигнальных путей в клетке

В последнее время круг традиционных биологических катализаторов расширился, благодаря открытию каталитически активных антител, или абзимов (см обзоры Nevinsky et al, 2000-2005), которые были обнаружены в крови больных с аутоиммунными патологиями (АИП) Ввиду отсутствия явных факторов иммунизации, возможность существования природных абзимов у здоровых людей без каких-либо патологических нарушений иммунного статуса долгое время считалась невозможной Однако было показано, что в период беременности и лактации в женском организме протекают иммунные процессы, сходные с таковыми у пациентов с АИП (см обзоры Nevinsky et al, 2000-2005, и ссылки в обзорах) В молоке здоровых рожениц были обнаружены slgA, катализирующие фосфорилирование около 15 белков молока, а так же липиды В литературе описаны различные моно- и поликлональные АТ, гидролизующие белки, ДНК, РНК, нуклеотиды и целый ряд других субстратов (Nevinsky et al, 2000-2005) Уникальность антител (АТ) с фосфорилирующими активностями заключается в способности катализировать реакцию синтеза, а не деградации, причем двухсубстратную В молоке человека были найдены абзимы с ДНКазной, РНКазной, АТРазной, фосфатазной активностями, биологические функции которых пока еще не установлены Особенностью этих абзимов является более высокая каталитическая активность по сравнению с активностью АТ из крови больных различными АИП Поскольку защитные механизмы детей в первые месяцы жизни, в основном, обеспечиваются компонентами материнского молока, в первую очередь иммуноглобулинами, представлялось целесообразным провести более детальное исследование каталитических активностей этих АТ

Цель настоящей работы заключалась в исследовании фосфорилирующих активностей slgA и IgG из молока человека В ходе исследования необходимо было решить следующие задачи

• Исследовать активность IgG в реакции фосфорилирования прочно связанных с ними липидов Доказать, что липидкиназная активность является собственным свойством IgG и slgA

• Исследовать полисахаридкиназную активность slgA и IgG Сравнить структуру эндогенных олиго- и полисахаридов, прочно связанных с slgA и IgG Доказать, что данная активность является собственным свойством этих антител

• Изучить субстратную специфичность абзимов в реакции фосфорилирования липидов, олиго- и полисахаридов

• Определить кинетические параметры реакций фосфорилирования, катализируемых slgA и IgG

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые показано, что поликлональные AT молока здоровых по медицинским показаниям рожениц содержат небольшую субфракцию IgG, обладающих способностью фосфорилировать прочно связанные с ними липиды Впервые показано, что AT молока также содержат небольшие субфракции slgA и IgG с полисахаридкиназной активностью Доказано, что липид- и полисахаридкиназная активности являются собственным свойством IgG и slgA Установлено, что липиды, олиго- и полисахариды образуют достаточно прочные комплексы с AT и обладают необычной структурой Показано, что, в отличие от всех известных киназ, slgA и IgG, обладающие липид- и полисахаридкиназной активностями, используют в качестве донора фосфатной группы не только различные NTP и dNTP, но и о/;тофосфат

Дальнейшее исследование абзимов у доноров без каких-либо иммунных отклонений позволит определить возможные функции AT в организмах матери и ребенка и возможную роль абзимов в патогенезе АИП Изучение абзимов молока также представляет интерес для получения биокатализаторов с новыми субстратными специфичностями, не обнаруженными у канонических ферментов

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работы Результаты работы были представлены на международной конференции — The International Conference "Chemical&Biological Problems of Proteomics", 2004, Novosibirsk, Russia

Структура и объем работы. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Экспериментальной части, Результатов и их обсуждения, Выводов и Списка цитированной литературы Работа изложена на 119 страницах, содержит 34 рисунка и 9 таблиц Библиография включает 187 литературных источников

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Выделение и в^А из молока человека

АТ выделяли из молока 30 здоровых рожениц Электрофоретически и иммунологически гомогенные препараты АТ были получены по следующей схеме (а) центрифугирование молока - для удаления липидной фракции и клеток, (б) аффинная хроматография на протеин в-сефарозе -для выделения препаратов (рис. 1, а), (в) аффинная хроматография на протеин А-сефарозе — для получения препаратов б^А (рис. 1, в), (г) гель-фильтрация полученных препаратов и б^А на сорбенте Бирегскх 200 НИ. 10/30 в кислых условиях, для дополнительной очистки АТ от теоретически возможных примесей ферментов

Аффинная хроматография молочной плазмы на протеин в-сефарозе приводила к практически полной адсорбции ^О, а на протеин А-сефарозе - б^А Стадии (б)-(в), проведенные с использованием буферов, разрушающих неспецифические взаимодействия (1% Тритон Х-100, 0 3 М ЫаС1), позволяли получать электрофоретически гомогенные препараты АТ, которые обладали высоким уровнем активности в реакциях фосфорилирования липидов и сахаридов (рис. 1, б, г) Тем не менее, все полученные препараты АТ подвергали дополнительной очистке от возможных белковых примесей с помощью высокоэффективной гель-фильтрации (стадия г)

'Чво

ОЛ, % к-Д.1 ,2

205— m 170— 116— 73—

100

50

51-

15 20 Объем, м т

кДн 3J

97— 66— iSz 21— 14 4—

Aia

OA, %

5 кДа 6

Рис.1. Профиль аффинной хроматографии белков молока человека на протеин G-сефарозе (а) -н-цспь и фракции, не обладающей L-испь сродством к нему

(пик I) на протеин А-сефарозе (в) (б) Электрофоретический анализ препаратов IgG (б) и slgA (г) в 5-16% SDS-ПААГ (дор 2 и 5) и в 12% SDS-ПААГ в присутствии п исп"0""" меРкаптоэтанола (дор 4 и 6), дор 1 и 3 - маркерные белки, -L-ucub+ окраска серебром л-компонснт(_) _ поглощение белка при 280 нм, (■) - липидкиназная активность, (о) - олигосахаридкиназная активность, OA - относительная активность 1 - нанесение белков молока, 2 - элюция буфером, содержащим 1% Тритон Х-100, 3 - элюция абзимов с сорбента 0 1 М Глицин-HCl, рН 2 6

15 20 Объем, мл

-

—92 —

—67 — •Z

—42 —

— 30 —

—20 —

_ _

Анализ липид- и полисахаридкиназных активностей во фракциях, элюируемых с последовательно-соединенных колонок, показал, что белки молока, не взаимодействующие с данными сорбентами (например, рис. 1, а, пики I и II), не обладают липид-, олиго- и полисахаридкиназной активностями. Это свидетельствовало в пользу того, что молоко человека не содержит каких-либо ферментов, кроме антител, способных фосфорилировать липиды и сахариды в присутствии [32Р]ортофосфата.

Исследование липидкиназной активности препаратов АТ

Ранее была обнаружена липидкиназная активность slgA из молока человека. В данной работе впервые показано, что IgG молока также способны фосфорилировать прочно связанные с ними липиды. Для исследования липидкиназной активности АТ 32Р-меченные липиды экстрагировали из комплекса с антителами смесью хлороформ: метанол (2:1, гю объему), и посяе упаривания полученные фракции анализировали методом ТСХ в системе хлороформ; метанол: вода (!4:6:1, по объему). Радиоавтография пластинок показала, что образуется несколько !3Р-меченных продуктов фосфор Ил ирования, среди которых выделяются два мажорных липида, отличающиеся друг от друга хроматографической подвижностью, и они были условно обозначены Л1 и Л2 (рис. 2, а).

Рис. 2. Анализ продуктов фосфорилирования липидов, прочно связанных с АТ, в присутствии [у-иР]АТР (а) и [32Р]о/-"пофосфата (б) с помощью ТСХ в системе хлороформ: метанол: вода (14:6:1, по объему). Радиоавтограф пластины. 1 - нативные IgG; 2 - [лР]о/даофосфат без IgG; 3 - IgG после термоактивации; 4 - смесь эндогенных липидов, экстрагированных из IgG и инкубированных с f 2Р]сртофосфатом в отсутствие АТ.

Установлено, что липиды, связанные с IgG и slgA, в основном идентичны и представляют собой исключительно минорную фракцию липидов молока человека. Особенностью данных липидов является необычное поведение при одно- и двумерной ТСХ в различных

** *? " о "12 3 4

¡ Л1-* ;

Л1-* • • Л2-+- *

Л2-* t г

Старт~». * • • ■ Стар

стандартных системах для анализа липидов и глицерофосфолипидов Так два минорных липида Л1 и Л2 в системе хлороформ метанол вода (14 6 1, по объему) обладают весьма высокими одинаковыми значениями коэффициента Я; , равными 0 62 и 0 5 для и 51§А, что сопоставимо с ганглиозидами (/?/ = 0 4 и 0 6) Таким образом, по-видимому, данные липиды можно отнести к ганглиозидам

Относительная удельная активность АТ в реакциях кинирования липидов в значительной степени варьирует в зависимости от донора молока Тем не менее, все препараты АТ, выделенные из молока более чем 30 доноров, обладали заметными фосфорилирующими активностями

Показано, что инкубация [у-32Р]АТР в отсутствие каких-либо дополнительных компонентов, кроме буфера, с экстрагированными липидами и/или с антителами после их инактивации при высокой температуре не приводит к появлению 32Р-меченных липидов Это свидетельствовало о том, что включение радиоактивной метки в липиды является функцией нативных АТ (рис. 2, б)

Исследование полисахаридкиназной активности препаратов АТ

После осаждения белков с помощью 10% ТХУ и экстракции липидов смесью хлороформ- метанол (2 1, по объему) часть продуктов фосфорилирования остается в растворе Ранее было обнаружено, что при электрофоретическом анализе фосфорилирования белков часть этих продуктов двигалась с фронтом, в то время как другие образовывали несколько дискретных полос в области положения в геле белков с мол массами порядка 4—12 кДа Это свидетельствовало о полимерной и олигомерной природе данных продуктов фосфорилирования, которые позже были идентифицированы как олиго- и полисахариды Показано, что эти 32Р-меченные олигомеры и полимеры не расщепляются протеазами, ДНКазами или РНКазами, но подвергаются гидролизу некоторыми полисахарид-гидролизующими ферментами (см ниже)

Анализ продуктов фосфорилирования 32Р-меченных полисахаридов показал, что все исследованные препараты б^А и 1§С, выделенные из молока разных доноров, фосфорилируют по меньшей мере три полимерных продукта (рис. 3)

Для анализа продуктов фосфорилирования 32Р-меченных олигосахаридов были подобраны условия ТСХ Как и в случае эндогенных липидов, относительное количество 32Р-меченных олигомерных продуктов, прочно связанных как с б^А (рнс. 4, я), так и с (рис. 4, б) сильно зависело от

донора молока. Тем не менее, все исследованные препараты й^А и 1дО ф ос фо р и л и решал и до четырех-пяти различных олигосахаридов, отличающихся по хроматографической подвижности.

12 3 4

Рис. 3. ЭлектрофоретичеСкйй анализ продуктов фосфорилмрования

полисахаридов (водная фракция после Полисахариды осаждсиия белков с помощью 10% ТХУ и экстракции лип идо в смесью хлороформ-метанол), прочно связанных с б^А (дор. I и 2) и (дор. 3 и 4),

выделенных из молока разных доноров, в Оянгосамриды присутствии [ 2Р]орМОфосфата в 20% ЗОЭ-ПААГ (радиоавтограф геля).

* -

1 *

II! Т

I г 3 4 5

Ш

Ж.

М СЧ и 11Г11.Н'

11141 • » • »

С'ХЯрмдЫ

Старт | _____ (ПК

Рис. 4. Анализ фосфорилирования олигосахаридов, прочно связанных с з1цА (я) и (й), с помощью ТСХ й системе диоксан: аммиак: вода

(5:1:4, по объему). Радиоавтограф пластины, 1-4 - 132Р]ор»шфосфат + антитела, выделенные из молока четырех разных доноров; 5 - [згР]ор»юфосфат.

Подобно минорным липвдам, олисо- и полисахариды также образуют достаточно устойчивые комплексы с б^А- и 1§С-абзимами. Показано, что комплексы АТ с полисахаридами полностью разрушаются только в процессе электрофореза в ПААГ в присутствии 0.1 % ЗБЙ. Для исследования стабильности комплекса олигосахаридов с АТ была проанализирована возможность замещения олигосахаридов, связанных с к^А и на различные природные канонические полисахариды.

Показано, что в случае з^А, значительное ннгибирование фосфорилирования олигосахаридов наблюдалось после длительной инкубации АТ с [}-глюка ном, ксиланом, инулином и арабиногаластаном (рис. 5, а). Аналогичные эксперименты для препаратов показали, что ни один из экзогенных полисахаридов не ингибирует в заметной степени 1цО-зависимое фосфорилирование олигосахаридов даже после 24 ч пр еды н куб а ци и комплексов АТ с эндогенными олиго- и полисахаридами с различными экзогенными полисахаридами (рис. 5, 0). Более того, в случае

маннана и лихенана наблюдалась заметная и воспроизводимая активация фосфорилирования прочно связанных олигосахаридов.

a 123456789 " 1 J4 j Í t S 1

Рис. 5. Анализ влияния различных полисахаридов на уровень фосфорилирования олигосахаридов, катализируемого sigA (в) и fgG (б), с помощью ТСХ в системе диоксан: аммиак: вода (5:1:4, по объему). Радиоавтограф пластины. Использованы следующие полисахариды: р-гдюкан (1), пуллулан (2), ксилан (3), инулин (4), маннан (5), лихенан (6), арабпно! аластан (7). 8 - АТ без добавления полисахаридов; 9 - [32Р]0ртофосФат без АТ и полисахаридов.

Наблюдаем Cíe различие в эффекторном действии полисахаридов на sígA-и IgG-зависимое фосфоршшрование прочно связанных олигосахаридов может быть следствием нескольких причин. Во-первых, не исключено, что IgG образуют более прочные комплексы с олиго- и полисахаридами, чем sigA. Во вторых, как будет показано ниже, сахар иды, связанные с sigA и IgG, по-разному расщепляются различными полисахарид-гидролизу ющим и ферментами, отличающимися по своей субстратной специфичности, что свидетельствует о существенном отличии их структуры. Таким образом, совокупность данных но гадролнзу олиго- н полисахаридов различными гликозидазами и по ингибированию реакции фосфорилирования прочно связанных олигосахаридов свидетельствует в пользу того, что sigA и IgG могут взаимодействовать с различными олигосахаридными последовательностями в составе сахаридов.

Анализ структуры эндогенных олиго- и полисахаридов

Для исследования возможной структуры олиго- н полисахаридов, прочно связанных с sigA и IgG, были использованы различные гликозидазы (см. табл. 1 и 2). Эффективность гидролиза 3 Р-меченных полисахаридов sigA и IgG была проанализирована электрофорезом в 20% SDS-ПААГ, а ,2Р-меченных олигосахаридов методом ТСХ.

Таблица 1 Относительная эффективность гидролиза Р-меченных олиго- и полисахаридов, выделенных из препаратов в^А, различными гликозидазами

Фермент/ источник Ферменты и тип гидролизуемои связи 1 п пр "1 1оме олос одук 1И э/( ? л та Ь* Номер полосы продукта при ТСХ*

1 2 3 I II III IV

Р-Гликозидаза Р-1,6-гликозидаза, КФ3 2 1 21 - - - - - - -

Целлобиогидро-лаза из Сео1псНит сап(1и1ит 1,4-р-О-глюкан-целлобиогидролаза, КФ 3 2 1 91 + + +

Глюкоамилаза из Азре^Шия акатоп 1,4-а- О-глюкан-глюканогидролаза, КФ 3 2 1 3 ++ + + ++ ++

а-Галактозидаза из Тпс1го(1егта геезе1 а-О-галактозид-гапактогидролаза, меллибиаза, КФ 3 2 1 22 + + + +

Лихеназа из ВасШиз исИет/огти 1,3,1,4-Р-О-глюкан-4-глкжаногидролаза КФ 3 2 1 73 ++ + + +

а-Маннозидаза из Оепкоуш ¡р а-О-манпозид-манногидролаза, КФ 3 2 1 24 ++ +++ +++ +++ +++

Экзо-1,3-Р-глюконаза из Тпско(1егта \iiride 1,3-Р-О-глюкан-глюканогидролаза, КФ 3 2 I 58 + ++ + +++ +++

а-Амилаза из рапсгсаз 1,4-а-О-глюкап глюканогилролаза КФ 3 2 1 1 + + ++ + ++

Эндо Р из СИгузеоЬааегшт тетп^ерПсит Эндо-Р-Л/-ацетил-глюкозамидаза Р, КФ 3 2 1 96 + +

Хитиназа из Беггаиа тагсасепя а-(1,4-р-[2-ацето-амидо-2-дсзокси-0-гликозид])глюкано-гидролаза, КФ 3 2 1 14 + + +

а-Ь-Фукозидаза из ТНегтаз зр а-Ь-фукозид-фукогидролаза, КФ3 2 1 51 ++ + + + + ++

* Данные соответствуют усредненной картине из трех экспериментов

Таблица 2 Относительная эффективность гидролиза Р-меченных олиго- и полисахаридов, выделенных из препаратов различными гликозидазами

Фермент/ источник Ферменты и тип гидролизуемой связи Номер полосы продукта при электрофорезе* Номер полосы продукта при ТСХ *

2 3 4 5 I II

Р-Гликозидаза р-1,6-гликозидаза, КФ 3 2 1 21 — +++ +++ ++ +++ +

Целлобиогидро-лаза из СеотсИит саги1и!ит 1,4-Р-О-глюкан-цсллобиогидролаза, КФ3 2 1 91 +++ ++ + + +

Глюкоамилаза из АхрегцШиз аюатоп 1,4-а- О-глюкан-глюканогидролаза, КФ 3 2 1 3 +

а-Галактозидаза из Тпскойегта гееэы а-О- галактозидгалакто-гидролаза, меллибиаза, КФ 3 2 1 22 + +++ ++ ++ + +++

Р -1,3-Глюконаза, дрожжи 1,3-Р-глюконаза, КФ 3 2 1 39 — — + + — —

Лихеназа из БасМю НсНет/огти 1,3-1,4-Р-О-глюкан 4-глюканогидролаза, КФ 3 2 1 73 ++ +++ + + + +

а-Маннозидаза из Oerskovш ¡р а-Э- маннозидманногид- ролаза, КФ 3 2 1 24 ++ + + + +

ЭКЗО-1.3-Р-глюканаза из ТпсЬо11егта \4ride 1,3-р-О- глюканглюканогидро-лаза, КФ 3 2 1 58 ++ + +

а-Амилаза из рапсгеав 1,4-а-Р- глюканглкжаногидро-лаза, КФ 3 2 1 I ++ + + + +

Эндо И из СкгухеоЬаМепит тет^зерйсит эндо-р-М-ацетил-гдюкозамидаза И, КФ 3 2 1 96 ++ +++

* Данные соответствуют усредненной картине из трех экспериментов +++соответствуют максимальному уровню гидролиза в анализируемой полосе олиго- или полисахарида

При электрофоретическом анализе гидролиза 32Р-меченных полисахаридов, экстрагированных из в^А, было получено три, а из -пять продуктов фосфорилирования Эти продукты обнаружены во всех трех исследованных препаратах в^А и ^О, однако, уровень включения 3 Р-метки в данные полисахариды заметно варьирует от донора к донору Полисахариды, выделенные из по своей электрофоретической

подвижности и соотношению 32Р-метки в полосах основных полимеров, похожи, но все же отличаются от трех основных полисахаридов, выделенных из препаратов б^А Единственным ферментом, который наиболее эффективно расщепляет полисахариды, связанные как с в^А, так и 1^0, является а-маннозидаза Как видно из данных табл 1 и 2, наиболее эффективно под действием гликозидаз расщепляются полисахариды с номерами 1 и 3 (в^А) и практически все полисахариды, полученные из кроме продукта с номером 2, а наименьшая степень гидролиза наблюдается в случае полисахаридов с номером 2 как для в^А, так и ^О

Подобного рода избирательность наблюдалась в расщеплении полисахаридов, выделенных из всех трех исследованных препаратов б^А и ДО

Таким образом, полученные данные свидетельствуют в пользу того, что олиго- и полисахариды, прочно связанные и фосфорилируемые с помощью ^О и б^А, могут заметно отличаться по своей структуре Следуют подчеркнуть, что все использованные гликозидазы сильно отличаются по эффективности гидролиза олиго- и полисахаридов, полученных из препаратов АТ, и ни один из ферментов не гидролизует олиго- и полисахариды полностью Эти данные свидетельствуют в пользу того, что олиго- и полисахариды, прочно связанные с б^А и 1§0, являются не гомо-, а скорее всего, разветвленными гетероолигомерами.

Доказательства наличия каталитической активности у препаратов АТ

Использованная схема выделения АТ из молока одновременно являлась проверкой одного из принятых критериев отнесения ферментативных активностей препаратам э^А и ^О Тем не менее, для доказательства принадлежности ферментативных активностей антителам, а не возможным примесям совыделяющихся с ними ферментов, было проверено несколько дополнительных жестких критериев

1 Инкубация АТ в буфере с низким значением рН (2 6) с последующей высокоэффективной гель-фильтрацией в тех же условиях приводила к элюции единственного белкового пика, соответствующего АТ, при

этом профили липид- и олигосахаридкиназной активностей совпадали с профилем оптической плотности, соответствующим гомогенным АТ

2 Инкубация АТ с иммобилизованными протеин А, протеин в, анти-

анти-^А антителами приводила к полному связыванию АТ с сорбентами и исчезновению ферментативных активностей из раствора Связанные АТ элюировались с аффинных сорбентов только кислым буфером (рН 2 6) При этом профили оптической плотности, соответствующие антителам, и профили киназных активностей совпадали

3 Выделенные РаЬ-фрагменты иммуноглобулинов проявляли каталитическую активность

4 Ферментативная активность антител выявлялась после электрофореза в БОБ-ПААТ (анализ активности т апи) (рис. 6), в условиях разрушения любых нековалентных комплексов Каталитическая активность проявлялась только на месте положения белковых полос, соответствующих в^А и

Эти данные подтвердили, что исследуемые липид- и полисахаридкиназные функции АТ являются собственным свойством б^А и ^О молока человека

б Рис. 6, а Электрофоретический

анализ ш м/и липидкиназной , активности смеси в^А и

5 (недиссоциирующие условия) в

;; 3-16% ЭОЗ-ПААГ Гель

^ инкубировали в буфере, содержащем

100 нМ [7-32Р]АТР, гель окрашен °о 2 4 Длина геля кумасси И-250 (1,3,4), радиоавтограф ^ геля после инкубации с [у-32Р]АТР

—\- (2), б Анализ олигосахаридкиназной

!' > _ активности после электрофореза

ЛИ Д в 4-15% ЭЭЗ-ПААГ (фрагменты геля

длиной 2-3 мм инкубировали [32Р]орлюфосфатом), 3 - маркерные белки

Исследование субстратной специфичности антител

Показано, что в отличие от известных ферментов-киназ, б^А и ^О из молока человека обладают уникальной субстратной специфичностью Данные АТ способны использовать в качестве донора фосфатной группы

а

к-Да 1 2

220 — •о

150 — *3) -

92 —-

67 —

42 —

30 —

20 — _

-Я

кДа

не только ATP (100%), но и другие богатые энергией NTP и dNTP (dATP (40%), GTP и dGTP (3-8%), UTP и dTTP (50-60%)), а так же непосредственно [,2Р]о;шофосфат (60-80%) (рис. 7).

Рис. 7. Анализ субстратной специфичности Л] препарата IgG в реакции фосфорилирования эндогенных липидов с помощью ТСХ на пластинах Kieselgel в системе хлороформ: ,12 метанол: 7 М NH4OH (60:35:5, по объему); 1 - [у-32Р]АТР, 2 - [y-3zP]dATP, 3 - [у-32Р]ТТР, 4 - [y-32P]GTP, 5 - [33Р]ор/лофосфат. Радиоавтограф пластины.

Сравнение эффективности фосфорилирования олиго- и полисахаридов, прочно связанных с slgA (рис. 8, а) и IgG (рис. 8, б) показало, что в случае всех использованных препаратов AT о/з/м о фосфат был в 2-7 раз лучшим субстратом, чем АТР. При этом продукты AT-за вис им о го фосфорилирования олигосахаридов с 2Р] орт офо с фат ом и [у-згР]АТР не отличались друг от друга.

f 2 з 4 5

## ♦ ш

• * ш *

I

Г-меченныс| (1.1 ню-сн\дридьг

Сгар I

Рис. 8. Сравнительный анализ относительного уровня фосфорилирования эндогенных олигосахаридов препаратами (а) и ^О (б) от двух доноров с помощью ТСХ на пластинах К^зе^е] в системе диоксан: аммиак: !ЬО (5:1:4, по объему) в присутствии [32Р]срдяофосфата (дор. 1) и [у-32Р1АТР (дор. 2).

Каталитическая активность Fab-фрагментов иммуноглобулинов

РаЬ-фрагменты ^О получали с помощью мягкого протеолитического расщепления ^ цистеиновой протеиназой - папаином. РаЬ-фрагменты $1§А были получены с помощью специфической ^А-протеазы, Показано, что РаЬ-фрагменты (рис. 9) и 5^А (рис. 10) также обладают липид- и о л и госаха р и дк и н аз н о й активностями, но по сравнению с интактными молекулами АТ их активность была ниже.

Снижение липид-, и ол и госах ар идк и назно й активностей у РаЬ-фрагментов и ь1еД по сравнению с интактными молекулами можно объяснить следующими причинами. Так, абзимы с фосфорилирующими

активностями являются уникальными и катализируют реакцию синтеза с участием двух субстратов, один из которых прочно связан с AT.

Рис. 9. Сравнительный анализ фосфорилиронания липидов (я) и олигосахаридов \ff) IgG и их Fab-фрагментами в присутствии

[Р]ор/яофосфата:

1 - [3"Р]орлюфосфат,

2 - интактный препарат IgG,

3 - Fab-[фрагменты IgG.

Рис, 10. Сравнительный анализ фосфорилиронания липидов (я) и олигосахаридов (б) slgA и их Fab-фрагментами в присутствии

t Р]цр/пофосфата:

1 - интактный препарат stgA,

2 - РаЬ-фрагменты slgA,

3 - [ 32Р ] ортоф о сф ат.

Удаление большой части молекулы АТ при получении НаЬ-фрагментов может вести к снижению эффективности связывания вариабельных участков этих фрагментов с липидами и сахаридами. Кроме того, не исключено, что удаление части белковой молекулы приводит к изменению структуры активных центров РаЬ-фрагменте в по сравнению с интактными АТ и, как следствие, к понижению сродства ко второму субстрату (АТР или ор/ио фосфату) и/или скорости реакции фосфорилирования липидов и сахаридов. Тем не менее, фосфорилирование липидов и сахаридов БаЬ-фрагментами свидетельствует об АТ-зависимом фосфорилировании прочно связанных липидов и сахаридов.

Кинетические параметры реакции фосфорилирования липидов и олигосахаридов

Ранее было показано, что пул пол икл опальных к^А-абзимов с протеинкиназой активностью состоит из нескольких фракций моноклональных АТ, отличающихся сродством к АТР, Такая же картина наблюдается в случае з^А и ^О с липид- и олигосахаридкиназной

я 1 2 з б 12 3

л1н л2н

* *

Р-меченпые

001И10-

сахарнды *— Старт

а о

12 3 12 3

№

•4*

Р-мечен ныв

ОЛИ го-

СШрвДы 4_Старт

: *

П!

активностями, которые при хроматографии на АТР-сефарозе разделяются на несколько фракций и демонстрируют, как минимум, два разных значения величин Км и Упшх Как видно из данных, представленных на рис. 11, все фракции АТ активны в реакции фосфорилирования прочно связанных липидов и олигосахаридов, что свидетельствует о каталитической гетерогенности данных абзимов

"" Л ^ " М /Г о £ О С

"1 о 15 <2 2

- г и и I

Ш !Л--

ОА, % -100

Рис 11 Профиль аффинной

хроматографии препарата (а) и

б^А (б) на АТР-сефарозе

( — ) — поглощение белка при 280 им,

(□) - липидкиназная активность в

присутствии [у-32Р]АТР,

({¡¡) - липидкиназная активность в

присутствии [32Р]оршофосфата

За 100% принята активность фракции

с максимальным уровнем активности в

случае [у-32Р]АТР

20 25 Обьем, ип

Гетерогенность поликлональных абзимов по сродству к АТР и орягофосфату также была подтверждена с помощью анализа кинетических параметров реакций, катализируемых этими АТ Так как для абзимов с липид- и олигосахаридкиназной активностями о/тиофосфат является уникальным субстратом, взаимодействие АТ с данным субстратом было изучено подробно Установлено, что зависимость скорости реакции фосфорилирования от концентрации [32Р]ортеофосфата для семи исследованных препаратов и э^А не соответствовали классической гиперболической кривой Михаэлиса-Ментен Зависимость накопления [32Р]липидов от концентрации [32Р]о/7/и<эфосфата характеризуется одним или двумя промежуточными плато (рис. 12) Это свидетельствует о том, что поликлональные препараты и б^А содержат, как минимум, по два типа моноклональных АТ, которые характеризуются разными величинами

КМ И Утах для [32Р]ор/пофосфата в реакции фосфорилирования эндогенных липидов

["Р-меченные липнды]х10имп/мин

50 т

, 3

Рис. 12 Зависимость начальной скорости реакции фосфорилирования липидов, катализируемого ^02 (1) и 1аСЗ (2) и в^А (3), от концентрации [ Р] орт о ф о сф ата

¿5*-

[ ["Р]е>/7лшфосфат]х10\ М

Величины Км и Утах для препаратов и б^А приведены в табл. 3 Видно, что практически все поликлональные препараты АТ от разных доноров характеризуются разными наборами моноклональных АТ, обладающих различным сродством к [32Р]ортофосфату (в терминах кажущихся величин Км) Так, для всех исследованных препаратов и в^А первое значение Км( 1) для [32Р]срти<эфосфата лежало в пределах 0 3-5 6 мкМ в зависимости от типа абзима и донора молока Увеличение концентрации [32Р]о/>/иофосфата приводит к выявлению второго значения Кц{2) в пределах 3 5-42 0 мкМ

Таблица 3 Кинетические параметры реакции фосфорилирования эндогенных липидов, прочно связанных с антителами, с помощью ортофосфата*

АТ ««(1), мкМ 2), мкМ Ы1УЫ2) ¿ии(1). МИН 1 км(2), мин 1 кся(\у кса(2)

4 0±2 0 14 5±1 0 36 0 22±0 04 0 38±0 07 1 73

81§А1 5 6±1 8 32 0±3 9 57 162±0 4 2 1+0 4 1 3

1§С2 3 1±1 4 20 0+5 0 65 0 23±0 05 0 46±0 1 20

51ЯА2 2 4+0 8 12 0±2 0 50 013±0 02 0 22+0 04 1 7

ДОЗ 1 9±0 8 42 0±13 0 22 0 014+0 03 0 5±0 1 36

я^АЗ 1 6+0 1 3 5±1 9 22 0 034±0 01 0 041+0 01 1 2

■"Приведены усредненные данные трех экспериментов

Таким образом, полученные кажущиеся величины Км{\) и Км(2) значительно варьируют, но в то же время сопоставимы между собой для всех исследованных препаратов IgG- и sIgA-абзимов Похожая ситуация наблюдалась и в случае кажущихся значений kcal для препаратов IgG и slgA Величины kca,{ 1) для IgG лежали в пределах 0 14-0 23 мин'1, а для slgA - 0 034-1 64 мин'1 Величины кса,(2) были равными 0 38-0 5 мин"1 для IgG и 0 041-2 1 мин"1 для slgA и для всех препаратов абзимов превышали ^cai(l) в 1.2-3 6 раз (табл. 3) Самое высокое (2 1 мин"1) и самое низкое (О 041 мин'1) значения кса, были обнаружены для sIgA-абзимов, они отличались в 50 раз

В табл. 4 приведены величины Км и kcat для АТР, найденные для двух препаратов IgGl и IgG2 в реакции фосфорилирования прочно связанных олигосахаридов Значения Км для [3 Р]ортофосфата, найденные для этих же препаратов IgG, были близкими к таковым в случае АТР, а значения kcaI для оротофосфата были заметно выше, чем для АТР В реакции фосфорилирования олигосахаридов тремя препаратами slgA обнаружено по два-три значения Км для АТР и оротофосфата, которые соответствуют 9 7-60 0 мкМ и 9 0-710 мкМ Таким образом, сродство к АТР и о/яиофосфату фракций поликлональных IgG и slgA молока, катализирующих фосфоршшрование олигосахаридов, достаточно высокое и сопоставимо друг с другом

Таблица 4 Кинетические параметры реакции фосфорилирования прочно связанных эндогенных олигосахаридов антителами*

AT субстрат 1), мкМ Км(2), мкМ аду Kd. 2) kQM(l), мин" 1 ксл{2), мин"1 1)/ кы(2)

IgGl Pi 9 0±3 0 43 0±15 0 48 017±0 07 1 0+0 3 59

АТР 9 7+2 5 29 0±10 0 32 0 19±0 07 0 47±0 01 25

IgG2 Pi 34 0+12 0 71 0±25 0, 2 1 0 8±0 2 7 5±0 06 94

АТР 21 0±8 0 60 0±10 0 29 0 12+0 03 0 62±0 25 52

*Приведены усредненные данные трех экспериментов

Установлено, что в зависимости от донора молока, различные препараты и э^А (если исходить из фосфорилирования одной молекулы липида, связанной с одной молекулой АТ) содержат около 2-7% абзимов, прочно связанных с минорными липидами Если предположить, что в каждой олигомерной молекуле или Б^А-абзимов может фосфорилироваться две или четыре молекулы липидов, соответственно, то количество

связанных с олиго- и полисахаридами и способных фосфорилировать эти лиганды, в общем пуле поликлональных АТ не превышает 3% В случае количество таких АТ, способных фосфорилировать полисахариды, также было оценено близким 1-3 %

ВЫВОДЫ

1 Впервые показано, что иммуноглобулины класса G молока человека образуют прочные нековалентные комплексы с минорными липидами необычной структуры, которые фосфорилируются под действием этих антител в присутствии нуклеотидов Доказано, что липидкиназная активность IgG и обнаруженное ранее sIgA-зависимое фосфорилирование липидов являются собственным свойством этих иммуноглобулинов

2 Впервые показано, что небольшие фракции иммуноглобулинов класса А и G из молока человека обладают способностью фосфорилировать прочно связанные с ними олиго- и полисахариды необычной структуры, при этом киназная активность является собственным свойством slgA и IgG Показано, что фосфорилированные олиго- и полисахариды слабо гидролизуются известными гликозидазами, что свидетельствует о том, что они являются разветвленными гетеросахаридами, мономеры которых связаны между собой гликозидными связями разного типа

3 Показано, что slgA и IgG могут использовать в реакциях фосфорилирования липидов, олиго- и полисахаридов в качестве донора фосфата не только АТР, но и другие рибонуклеозид- и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, а также уникальный субстрат -ор/яофосфат При этом, в присутствии оротофосфата фосфорилирование часто протекает более эффективно, чем в случае АТР

4 Показано, что антитела молока человека характеризуются несколькими значениями Км в реакциях фосфорилирования липидов и олигосахаридов, что подтверждает их каталитическую гетерогенность Каталитические активности slgA и IgG в реакциях фосфорилирования и их сродство к оротофосфату и АТР сильно варьируют в зависимости от донора молока.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1 Gorbunov D V , Karataeva N А , Buneva V.N , Nevinsky G A Lipid kinase activity of antibodies from milk of clinically healthy human mothers Biochim Biophys Acta 2005 V 1735 (3) P 153-166

2 Karataeva N A , Gorbunov D V , Prokudin IV , Buneva V N , Kulminskaya A A , Neustroev К N , and Nevinsky G A Human milk antibodies with polysaccharide kinase activity Immunol Lett 2006 V 103(1) P 58-67.

3 Каратаева H A, Бунева В H, Невинский Г А Полисахаридкиназная активность IgG из молока человека Биохимия 2006 Т 71 (И) С 1488-1504.

4 Каратаева Н А , Невинский Г А Ферменты, фосфорилирующие липиды и полисахариды Биохимия 2007 Т 72 (4) С 457-472

Изд лиц ИД № 04060 от 20 02 2001 Подписано к печати и в свет 19 04 07 Формат бумаги 60 х 84/16 Бумага № 1 Гарнитура "Times New Roman" Печать офсетная Печ л 1,1 Уч -изд л 1,0 Тираж 100 экз Заказ №38 Институт неорганической химии им А В Николаева СО РАН Просп Акад Лаврентьева, 3, Новосибирск, 630090

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Каратаева, Наталия Алексеевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Киназы глицерофосфолипидов.

1.1.1. Фосфатидилинозитол 3-киназы.

1.1.2. Фосфатидилинозитол 4-киназы.

1.1.3. Фосфатидилинозитол-4-фосфат 5-киназы.

1.2. Киназы сфинголипидов.

1.3. Каталитически активные антитела.

1.3.1. Моноклональные абзимы с синтетическими свойствами.

1.3.2. Механизмы генерации каталитически активных антител.

1.3.3. Природные абзимы при аутоиммунных заболеваниях.

1.3.4. Природные абзимы молока человека.

1.3.4.1. Абзимы с протеинкиназной активностью.

1.3.4.2. Иммуноглобулины класса А с липидкиназной активностью.

1.3.4.3. Абзимы с другими типами активностей.

1.4. Защитные факторы молока человека.

1.4.1. Иммуноглобулины.

1.4.2. Липиды.

1.4.3. Олиго- и полисахариды.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Реактивы и материалы.

2.2. Методы.

2.2.1. Выделение иммуноглобулинов из молока человека.

2.2.2. "Кислый шок" препаратов антител.

2.2.3. Концентрирование препаратов антител.

2.2.4. Определение концентрации белка.

2.2.5. Электрофоретический анализ белка.

2.2.6. Определение липидкиназной активности препаратов антител.

2.2.7. Опредение полисахаридкиназной активности препаратов антител.

2.2.8. Анализ стабильности комплекса олигосахаридов с антителами.

2.2.9. Гидролиз 32Р-меченных олиго- и полисахаридов.

2.2.10. Определение протеинкиназной активности препаратов антител.

2.2.11. Гидрофобная хроматография антител на фенил-сефарозе SL-B6.

2.2.12. Исследование взаимодействия антител с аффинными сорбентами.

2.2.13. Аффинная хроматография иммуноглобулинов на сорбентах с иммобилизованными анти Ig-антителами.

2.2.14. Аффинная хроматография иммуноглобулинов на сорбентах с иммобилизованными антителами против легких цепей.

2.2.15. Тестирование липидкиназной активности антител in situ.

2.2.16. Тестирование полисахаридкиназной активности антител in situ.

2.2.17. Получение и очистка Fab-фрагментов иммуноглобулинов класса А.

2.2.18. Получение и очистка Fab-фрэгментов имуноглобулинов класса G.

2.2.19. Определение кинетических параметров реакции фосфорилирования.

2.2.20. Аффинная хроматография препаратов антител на АТР-сефарозе.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Выделение иммуноглобулинов из молока.

3.2. Исследование антител с липидкиназной активностью.

3.2.1. Стабильность комплексов антитела - липиды.

3.2.2. Анализ структуры эндогенных липидов.

3.3. Исследование антител с полисахаридкиназной активностью.

3.3.1. Стабильность комплексов антитела - сахариды.

3.3.2. Анализ структуры эндогенных олиго- и полисахаридов.

3.4. Доказательства принадлежности каталитической активности антителам.

3.4.1. «Кислый шок» препаратов антител.

3.4.2. Взаимодействие антител с аффинными сорбентами.

3.4.3. Тестирование препаратов антител in situ.

3.5. Субстратная специфичность антител.

3.5.1. Липидкиназная активность антител.

3.5.2. Олигосахаридкиназная активность антител.

3.6. Локализация активных центров антител.

3.6.1. Каталитическая активность Fab-фрагментов иммуноглобулинов.

3.7. Кинетические параметры реакции фосфорилирования липидов.

3.8. Кинетические параметры реакции фосфорилирования олигосахаридов.

3.9. Возможная биологическая роль абзимов с киназными активностями.

1. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Липид- и полисахаридкиназная активности антител молока человека"

Процессы фосфорилирования играют важную роль в регуляции жизнедеятельности организма; фосфорилирование существенно меняет химические свойства белков, липидов и углеводов. Реакции переноса фосфатной группы от АТР или других NTP катализируют ферменты - киназы, например, протеинкиназы фосфорилируют аминокислотные остатки, липидкиназы - ОН-группы липидов. Известно, что киназы принимают активное участие в процессах клеточного роста, деления и апоптоза.

В Лаборатории ферментов репарации ИХБФМ были впервые получены данные о том, что помимо канонических липидкиназ, способностью фосфорилировать липиды могут обладать антитела (AT), выделенные из молока здоровых рожениц. Каталитически активные антитела (КААТ), или абзимы, были найдены в крови больных астмой, аутоиммунными патологиями (СКВ, аутоиммунный тиреоидит, полиартрит, рассеянный склероз), некоторыми вирусными (СПИД, вирусный гепатит), раковыми и лимфопролиферативными заболеваниями [1 - 5]. Показано, что природные абзимы возникают при развитии аутоиммунных заболеваниях (АИЗ), а также в период беременности и лактации у здоровых рожениц и способны ускорять реакции гидролиза белков, ДНК, РНК, полисахаридов, АТР, фосфорилирования белков и некоторые другие реакции. Абзимы из крови здоровых людей катализируют ряд окислительно-восстановительных реакций [5]. Как и иммуноглобулины, генерируемые при обычном иммунном ответе, абзимы поликлональны по своей природе, т.е. представляют собой широкий набор моноклональных AT, различных по сродству к субстратам и обладающих разными каталитическими активностями.

Первыми абзимами, обнаруженными у здоровых по медицинским показателям людей, были slgA молока здоровых рожениц, катализирующие фосфорилирование около 15 белков молока. Молоко рожениц оказалось уникальным источником большого числа различных абзимов, биологические функции которых еще не до конца выяснены. Особенностью этих абзимов является более высокая каталитическая активность, по сравнению с активностью AT из крови больных с различными АИЗ.

Наряду с другими компонентами молока, антитела обеспечивают его защитные функции и ответственны за создание пассивного иммунитета ребенка в первые месяцы его жизни. В связи с этим, можно предположить, что антитела могут не только связывать компоненты патогенных вирусов или бактерий, но и при наличии у них каталитических активностей, также гидролизовать белки, нуклеиновые кислоты и полисахариды вирусов и бактерий, усиливая защитное действие AT молока [1-5]. Кроме того, выдвинута гипотеза о том, что в каталитических активностях абзимов могут быть запрограммированы дополнительные ферментативные функции белков организма, проявления которых наблюдается только в особых условиях, например при беременности и АИЗ. При этом до сих остается открытым вопрос, являются ли абзимы дополнительной, резервной системой ферментов млекопитающих, которая работает в экстремальных ситуациях и обеспечивает такие активности, которых нет у обычных ферментов, или абзимы - это все-таки побочный результат функционирования иммунной системы. Кроме того, нельзя исключить, что абзимы могут иметь пока не известную специфическую биологическую функцию в организме млекопитающих. Поэтому, исследование и сравнение абзимов у доноров без каких-либо патологических иммунных отклонений (КААТ молока здоровых рожениц), а также у больных с различными АИЗ, позволит понять возможные биологические функции абзимов и внести ясность в понимание механизмов патогенеза аутоиммунных заболеваний, которые до сих пор в большинстве случаев неизлечимы.

Основной фракцией AT молока являются секреторные иммуноглобулины класса А (slgA), продуцируемые В-клетками молочной железы. Суммарный пул иммуноглобулинов класса G (IgG) молока формируется не только в результате секреции В-лимфоцитами молочной железы, но и за счет транспорта AT из кровотока. Более того, в отличие от slgA, IgG способны проникают в кровь младенцев через эпителий кишечника [6]. Недавно было обнаружено, что slgA молока прочно связаны с липидами, которые фосфорилируются под действием этих AT. Учитывая различное происхождение и разницу в биологических функциях slgA и IgG молока, сравнение ферментативных функций этих антител представляет особый интерес.

Цель данной работы заключалась в исследовании фосфорилирующих активностей slgA и IgG молока человека. В ходе исследования необходимо было решить следующие задачи:

• Исследовать активность IgG в реакции фосфорилирования прочно связанных с ними липидов. Доказать, что липидкиназная активность является собственным свойством IgG и slgA;

• Исследовать полисахаридкиназную активность slgA и IgG. Сравнить структуру эндогенных олиго- и полисахаридов, прочно связанных с slgA и IgG. Доказать, что данная активность является собственным свойством этих антител;

• Изучить субстратную специфичность абзимов в реакции фосфорилирования липидов, олиго- и полисахаридов;

• Определить кинетические параметры реакций фосфорилирования, катализируемых slgA и IgG.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Фосфорилирование липидов in vivo впервые было обнаружено в 1953 году [7]. В процессе стимуляции клеток печени ацетилхолином происходило включение меченого фосфата в один из минорных клеточных липидов поджелудочной железы. В дальнейшем было показано, что фосфорилированию подвергается фосфатидилинозитол. В настоящее время известно, что фосфорилирование фосфатидилинозитола, а также ещё одного глицеролипида - диацилглицерола, происходит в процессе внутриклеточной передачи сигнала (сигнальной трансдукции) и является одним из её ключевых моментов [7].

Другими известными процессами фосфорилирования липидов являются фосфорилирование долихола в процессе N-гликозилирования белков в эндоплазматическом регикулуме [8] и фосфорилирование церамида в эндоплазматическом ретикулуме и в синаптосомальных пузырьках [9, 10]. Наиболее изученными каноническими липидкиназами млекопитающих являются киназы глицерофосфолипидов и сфинголипидов, которые будут рассмотрены в данном обзоре.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Каратаева, Наталия Алексеевна

4. ВЫВОДЫ

1. Впервые показано, что иммуноглобулины класса G молока человека образуют прочные нековалентные комплексы с минорными липидами необычной структуры, которые фосфорилируются под действием этих антител в присутствии нуклеотидов. Доказано, что липидкиназная активность IgG и обнаруженное ранее sIgA-зависимое фосфорилирование липидов являются собственным свойством этих иммуноглобулинов.

2. Впервые показано, что небольшие фракции иммуноглобулинов класса А и G из молока человека обладают способностью фосфорилировать прочно связанные с ними олиго- и полисахариды необычной структуры, при этом киназная активность является собственным свойством slgA и IgG. Показано, что фосфорилированные олиго- и полисахариды слабо гидролизуются известными гликозидазами, что свидетельствует о том, что они являются разветвленными гетеросахаридами, мономеры которых связаны между собой гликозидными связями разного типа.

3. Показано, что slgA и IgG могут использовать в реакциях фосфорилирования липидов, олиго- и полисахаридов в качестве донора фосфата не только АТР, но и другие рибонуклеозид- и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, а также уникальный субстрат - ор/яофосфат. При этом, в присутствии ор/иофосфата фосфорилирование часто протекает более эффективно, чем в случае АТР.

4. Показано, что антитела молока человека характеризуются несколькими значениями Км в реакциях фосфорилирования липидов и олигосахаридов, что подтверждает их каталитическую гетерогенность. Каталитические активности slgA и IgG в реакциях фосфорилирования и их сродство к ор/иофосфату и АТР сильно варьируют в зависимости от донора молока.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Каратаева, Наталия Алексеевна, Новосибирск

1. Невинский Г.А., Канышкова Т.Г., Бунева В.Н. Природные каталитически активные антитела (абзимы) в норме и при патологии. Биохимия. 2000. Т. 65. С. 1473-1478.

2. Барановский А.Г., Матюшин В.Г., Власов А.В., Забара В.Г., Наумов В.А., Жьеже Р., Бунева В.Н., Невинский Г.А. ДНК- и РНК-гидролизующие антитела из крови больных различными формами вирусного гепатита. Биохимия. 1997. Т. 62. С. 1590-1599.

3. Nevinsky, G.A., Favorova, О.О., Buneva, B.N. Protein-protein interactions. A molecular cloning manual (Ed. Golemis, E.). New York.: Cold Spring Harbor Lab. Press. 2002. P. 523-534.

4. Nevinsky G.A., Buneva V.N. Catalytic antibodies in healthy humans and patients with autoimmune and viral diseases. J. Cell. Mol. Med. 2003. V. 7 (3). P. 265-276.

5. Nevinsky, G.A., Buneva, V.N. Natural catalytic antibodies abzymes. In: Catalytic antibodies (E. Keinan, Eds). Germany: VCH-Wiley press. 2004. P. 503-567.

6. Канышкова Т.Г., Бунева B.H., Невинский Г.А. Биологические функции молока человека и его компонентов. Успехи совр. биол. 2002. Т. 122 (3). С. 235-271.

7. Ткачук В.А. Фосфоинозитидный обмен и регуляция ионов Са2+. Биохимия. 1998. Т. 63. С. 47-56.

8. Burton W.A., Scher M.G., Waechetere C.J. Enzymatic phosphorylation of dolichol in central nervous tissue. Jour. Biol. Chem. 1979. V. 254. P. 7129-7136.

9. Bajjalieh S.M., Martin T.F., Floor E. Synaptic vesicle ceramide kinase. A calcium-stimulated lipid kinase that co-purifies with brain synaptic vesicles. Jour. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 14354-14360.

10. Kolesnick R.N., Hemer M.R. Characterization of a ceramide kinase activity from human leukemia (HL-60) cells. Separation from diacylglycerol kinase activity. Jour. Biol. Chem. 1990. V. 265. P. 18803-18808.

11. Kapeller R., Cantley L.C. Phosphatidylinositol 3-kinase. BioEssays. 1994. V. 16 (8). P. 565576.

12. Hamburger A.W., Yoo Y. Phosphatidylinositol 3-kinase mediates heregulin-induced growth inhibition in human epithelial cells. Anticancer Res. 1997. V. 17 (3C). P. 2197-2000.

13. Fry M.J. Phosphoinositide 3-kinase signalling in breast cancer: how big a role might it play? Breast Cancer Res. 2001. V. 3 (5). P. 304-312.

14. Whitman M., Downes C.P., Keeler M., Keller Т., Cantley L. Type I phosphatidylinositol kinase makes a novel inositol phospholipid, phosphatidylinositol-3-phosphate. Nature. 1988. V. 332(6165). P. 644-646.

15. Fry M.J., Waterfield M.D. Structure and function of phosphatidylinositol 3-kinase: a potential second messenger system involved in grows control. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 1993. V. 340 (1293). P. 337-344.

16. Anderson K.E., Jackson S.P. Class I phosphoinositide 3-kinases. Int. J. Biochem. Cell Biol. 2003. V. 35 (7). P. 1028-1033.

17. Stein RC. Prospects for phosphoinositide 3-kinase inhibition as a cancer treatment. (2001) Endocr. Relat. Cancer, 8 (3), 237-248.

18. Cantrell D.A. Phosphoinositide 3-kinase signalling pathways. J. Cell Sci. 2001. V. 114 (8). P. 1439-1445.

19. Domin J., Waterfield M.D. Using structure to define the function of phosphoinositide 3-kinase family members. FEBS Letters. 1997. V. 410 (1). P. 91-95.

20. De Matteis M.A., Di Campli A., Godi A. The role of the phosphoinositides at the Golgi complex. Biochim. Biophys. Acta. 2005. V. 1744 (3). P. 396-405.

21. Gerhmann Т., Heilmeyer L. Phosphatidylinositol 4-kinases. Eur. J. Biochem. 1998. V. 253. P. 357-370.

22. Loijens J.C., Anderson R.A. Type I phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinases are distinct members of this novel lipid kinase family. J. Biol. Chem. 1996. V. 271 (51). P. 329-243.

23. Дятловицкая Э.В. Зависимость биоэффекторных свойств сфинголипидов от строения их гидрофобного фрагмента. Биохимия. 1998. V. 63 (1). Р. 67-74.

24. Baumruker Т., Bornancin F., Billich A. The role of sphingosine and ceramide kinases in inflammatory responses. Immunol. Lett. 2005. V. 96 (2). P. 175-185.

25. Mitsutake S., Kim T.J., Inagaki Y., Kato M., Yamashita Т., Igarashi Y. Ceramide kinase is a mediator of calcium-dependent degranulation in mast cells. J. Biol. Chem. 2004. V. 279 (17). P. 17570-17577.

26. Шпигель С., Кувилье О., Эдзаль JL, Кохама Т., Мензелеев Р., Оливера А., Томас Д., Ту 3., Дж. ван Бруклин, Ф. Ванг. Роль сфингозин 1-фосфата в росте, дифференцировке и смерти клеток. Биохимия. 1998. Т. 63 (1). С. 83-88.

27. Olivera A., Spiegel S. Sphingosine kinase: a mediator of vital cellular functions. Prostaglandins. 2001. V. 64 (1-4). P. 123-134.

28. Liu H., Chakravarty D., Maceyka M., Milstien S., Spiegel S. Sphingosine kinases: a novel family of lipid kinases. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 2002. V. 71. P. 493-511.

29. Bajjalieh S.M., Martin T.F., Floor E. Synaptic vesicle ceramide kinase. A calcium-stimulated lipid kinase that co-purifies with brain synaptic vesicles. J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 1435414360.

30. Sugiura M., Kono K., Liu H., Shimizugawa Т., Minekura H., Spiegel S., et al. Ceramide kinase, a novel lipid kinase. Molecular cloning and functional characterization. J. Biol. Chem.2002. V. 277. P. 23294-23300.

31. Billich A., Bornancin F., Devay P., Mechtcheriakova D., Urtz N., Baumruker T. Phosphorylation of the imunomodulatory drug FTY720 by sphingosine kinases. J. Biol. Chem.2003. V. 278. P. 47408-47415.

32. Pyne S., Pyne N.J. Sphingosine 1-phosphate signalling in mammalian cells. Biochem. J. 2000. V. 349 (2). P. 385-402.

33. Gorbunov D.V., Semenov D.V., Shipitsin M.V., Kit Yu.Yu., Kanyshkova T.G., Buneva V.N., Nevinsky G.A. Phosphorylation of Minor Lipids of Human Milk Tightly Bound to Secretory Immunoglobulin A. Rus. J. Immunol. 2000. V. 5. P. 267-278.

34. Деев, C.M. Иммуноглобулины. Белки и пептиды. М.: Наука. 1995. С. 319-329.

35. Webster D.M., Henry А.Н., Rees A.R. Antibody-antigen interactions. Curr. Opinion in Structural Biology. 1994. V. 4. P. 123-129.

36. Davies D.R., Cohen G.H. Interactions of protein antigens with antibodies. PNAS. USA. 1996. V. 93. P. 7-12.

37. Padlan E.A. On the nature of antibody combining sites: unusual structural features that may confer on these sites an enhanced capacity for binding ligands. Proteins. 1990. V. 7. P. 112-124.

38. Epp 0., Lattman E.E., Schiffer M., Huber R., Palm W. The molecular structure of a dimer composed of the variable portions of the Bence-Jones protein REI refined at 2.0-A resolution. Biochem. 1975. V. 14. P. 4943-4952.

39. Golinelli-Pimpaneau В., Gigant В., Bizebard Т., Navaza J., Saludjian P., Zemel R., Tawfik D.S., Eshhar Z., Green B.S., Knossow M. Crystal structure of a catalytic antibody Fab with esterase-like activity. Structure. 1994. V. 2. P. 175-183.

40. Smith T.J., Chase E.S., Schmidt T.J., Olson N.H., Baker T.S. Neutralizing antibody to human rhinovirus 14 penetrates the receptor-binding canyon. Nature. 1996. V. 383. P. 350-354.

41. Braden B.C., Fields B.A., Poljak R.J. Conservation of water molecules in an antibody-antigen interaction. J. Mol. Recognit. 1995. V. 8. P. 317-325

42. Генералов И.И., Новиков Д.К. Поликлональные каталитические антитела и их возможное биологическое значение. Успехи современной биологии. 1998. Т. 118 (2). С. 179-192.

43. Pauling L. Molecular basis of biological specificity. Am. Scientist. 1948. V. 36. P. 51-59.

44. Jencks, W. Catalysis in chemistry and enzymology. N.Y.: McGraw-Hill. 1969.

45. Raso V., Stollar B.D. The antibody-enzyme analogy. Comparison of enzymes and antibodies specific for phosphopyridoxyltyrosine. Biochemistry. 1975. V. 14 (3). P. 591-599.

46. Raso V., Stollar B.D. The antibody-enzyme analogy. Characterization of antibodies to phosphopyridoxyltyrosine derivatives. Biochemistry. 1975. V. 14 (3). P. 584-591.

47. Tramontano A., Janda K.D., Lerner R.A. Catalytic antibodies. Science. 1986. V. 234 (4783). P. 1566-1570.

48. Pollack S.J., Jacobs J.W., Schultz P.G. Selective chemical catalysis by an antibody. Science. 1986. V. 234 (4783). P. 1570-1573.

49. Шустер A.M., Гололобов Г.В., Квашук О.А., Габибов А.Г. Антиидиотипические и природные каталитически активные антитела. Мол. биол. 1991. Т. 25. С. 593-602.

50. Schultz P.G., Lerner R.A. From molecular diversity to catalysis: lessons from the immune system. Science. 1995. V. 269. P. 1835-1842.

51. Thomas N.R. Hapten design for the Generation of catalytic antibodies. Appl. Biochem. Biotechnol. 1994. V. 47. P. 345-372.

52. Невинский Г.А., Семенов Д.В., Бунева B.H. Каталитически активные антитела (абзимы), индуцированные химически стабильными аналогами переходных состояний. Биохимия. 2000. Т. 65 (И). С. 1459-1472.

53. Диксон, М., Уэбб, Э. Ферменты, т. 1-3. М.: Мир. 1982.

54. Фершт А. Структура и механизм действия ферментов. М.: Мир. 1980. С. 191-210.

55. Tramontano A., Janda K.D., Lerner R.A. Chemical reactivity at an antibody binding site elicited by mechanistic design of a synthetic antigen. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83 (18). P. 6736-6740.

56. Na J., Houk K. N., Hilvert D. Transition State of the Base-Promoted Ring-Opening of Isoxazoles. Theoretical Prediction of Catalytic Functionalities and Design of Haptens for Antibody Production. J. Am. Chem. Soc. 1996. V. 118. P. 6462-6471.

57. Tantillo D.J., Leach A.C., Zhang X., Houk K.N. Theoretical Studies of Antibody catalysis. In: Catalytic antibodies (E. Keinan, Eds). Germany, VCH-Wiley press, 72-117.

58. Chen J., Deng Q., Wang R., Houk K., Hilvert D. Shape complementarity, binding-site dynamics, and transition state stabilization: a theoretical study of Diels-Alder catalysis by antibody 1E9. Chembiochem. 2000. V. 1 (4). P. 255-261.

59. Gouvemeur V.E., Houk K.N., de Pascual-Teresa B„ Beno В., Janda K.D., Lerner R. Control of the exo and endo pathways of the Diels-Alder reaction by antibody catalysis. Science. 1993. V. 262. P. 204-208.

60. Heine A., Stura E.A., Yli-Kauhaluoma J.T., Gao C., Deng Q., Beno B.R., Houk K.N., Janda K.D., Wilson I.A. An antibody exo Diels-Alderase inhibitor complex at 1.95 angstrom resolution. Science. 1998. V. 279 (5358). P. 1934-1940.

61. Wagner J., Lerner R.A., Barbas C.F. 3rd. Efficient aldolase catalytic antibodies that use the enamine mechanism of natural enzymes. Science. 1995. V. 270 (5243). P. 1797-1800.

62. Janda K.D., Lo L.C., Lo C.H.L., Sim M.M., Wang R., Wong C.H., Lerner R. Chemical selection for catalysis in combinatorial antibody libraries. Science. 1997. V. 275. P. 945-948.

63. Наградова H.K. Каталитические антитела. Соросовский образовательный журнал. 1996. Т. 8. С. 23-31.

64. Lerner R.A., Tramontano A. Catalytic antibodies. Sci. Am. 1988. V. 258 (3). P. 58-60.

65. Blackburn G.M., Kang A.S., Kingsbury G.A., Burton D.R. Catalytic antibodies. Biochem. J. 1989. V. 262 (2). P. 381-390.

66. Shokat K.M., Schultz P.G. Catalytic antibodies. Annu. Rev. Immunol. 1990. V. 8. P. 335-363.

67. Lerner R.A., Benkovic S.J., Schultz P.G. At the crossroads of chemistry and immunology: catalytic antibodies. Science. 1991. V. 252 (5006). P. 659-667.

68. Benkovic S.J. Catalytic antibodies. Annu. Rev. Biochem. 1992. V. 61. P. 29-54.

69. Hanson C.V., Nishiyama Y., Paul S. Catalytic antibodies and their applications. Curr. Opin. Biotechnol. 2005. V. 16 (6). P. 631-636.

70. Sastry L., Mubaraki M., Janda K.D., Benkovic S.J., Lerner R.A. Screening combinatorial antibody libraries for catalytic acyl transfer reactions. Ciba Found. Symp. 1991. V. 159. P. 145151.

71. Roberts V.A., Stewart J., Benkovic S.J., Getzoff E.D. Catalytic antibody model and mutagenesis implicate arginine in transition-state stabilization. J. Mol. Biol. 1994. V. 235 (3). P. 1098-1116.

72. Stewart J.D., Krebs J.F., Siuzdak G., Berdis A.J., Smithrud D.B., Benkovic S.J. Dissection of an antibody-catalyzed reaction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91 (16). P. 7404-7409.

73. Guo J., Huang W„ Zhou G.W., Eetterick R.J., Scanlan T.S. Mechanistically different catalytic antibodies obtained from immunization with a single transition-state analog. Proc. Natl.Acad. Sci. USA. 1995. V. 92 (5). P. 1694-1698.

74. Miller G.P., Posner B.A., Benkovic S.J. Expanding the 43C9 class of catalytic antibodies using a chain-shuffling approach. Bioorg. Med. Chem. 1997. V. 5 (3). P. 581-590.

75. Shabat D., Itzhaky H., Reymond J.L., Keinan E. Antibody catalysis of a reaction otherwise strongly disfavoured in water. Nature. 1995. V. 374 (6518). P. 143-146.

76. Brik A., Keinan E. Catalytic antibodies in natural products synthesis. Theoretical Studies of Antibody catalysis. In: Catalytic antibodies (E. Keinan, Eds). Germany: VCH-Wiley press. 2004. P. 132-151.

77. Sinha S.C., Barbas C.F. 3rd, Lerner R.A. The antibody catalysis route to the total synthesis of epothilones. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95 (25). P. 14603-14608.

78. Jerne N.K. Towards a network theory of the immune system. Ann. Immunol. 1974. V. 125. P. 373-398.

79. Shuster A.M., Gololobov G.V., Kvashuk O.A., Bogomolova A.E., Smimov I.V., Gabibov A.G. DNA hydrolyzing autoantibodies. Science. 1992. V. 256. P. 665-667.

80. Puzzetti A., Madaio M.P., Bellese G., Migliorini P. Anti-DNA antibodies bind to DNase I. J. Exp. Med. 1995. V. 181. P. 1797-1804.

81. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология. М.: Медицина. 2000.

82. Paul S., Voile D.J., Beach С.М., Johnson D.R., Powell M.J., Massey R.J. Catalytic hydrolysis of vasoactive intestinal peptide by human autoantibody. Science. 1989. V. 244 (4909). P. 11581162.

83. Slobin L.I. Preparation and some properties of antibodies with specificity toward p-nitrophenyl esters. Biochemistry. 1966. V. 5. P. 2836-2841.

84. Кульберг А., Дочева В., Тарханова И.А., Спивак В.А. О протеолитической активности в препаратах очищенного иммуноглобулина G и антител кролика. Биохимия. 1969. Т. 34. С. 1178-1183.

85. Shuster A.M., Gololobov G.V., Kvashuk O.A., Bogomolova A.E., Smimov I.V., Gabibov

86. A.G. DNA hydrolyzing autoantibodies. Science. 1992. V. 256 (5057). P. 665-667.

87. Бунева B.H., Андриевская O.A., Романникова И.В., Гололобов Г.В., Ядав Р.П., Ямковой

88. B.И., Невинский Г.А. Взаимодействие каталитически активных антител с олигорибонуклеотидами. Молекуляр. биология. 1994. Т. 28. С. 738-743.

89. Li L., Paul S., Tyutyulkova S., Kazatchkine M.D., Kaveri S. Catalytic activity of anti-thyroglobulin antibodies. J. Immunol. 1995. V. 154 (7). P. 3328-3332.

90. Kalaga R., Li L., O'Dell J.R., Paul S. Unexpected presence of polyreactive catalytic antibodies in IgG from unimmunized donors and decreased levels in rheumatoid arthritis. J. Immunol. 1995. V. 155 (5). P. 2695-26702.

91. Savel'ev A.N., Eneyskaya E.V., Shabalin K.A., Filatov M.V., Neustroev K.N. Antibodies with amylolytic activity. Protein Peptide Lett. 1999. V. 6. P. 179-184.

92. Vlassov A., Florentz C., Helm M., Naumov V., Buneva V., Nevinsky G., Giege R. Characterization and selectivity of catalytic antibodies from human serum with RNase activity. Nucleic Acids Res. 1998. V. 26 (23). P. 5243-5250.

93. Gololobov G.V., Mikhalap S.V., Starov A.V., Kolesnikov A.F., Gabibov A.G. DNA-protein complexes. Natural targets for DNA-hydrolyzing antibodies. Appl. Biochem. Biotechnol. 1994. V. 47 (2). P. 305-314.

94. Бунева B.H., Кудрявцева A.H., Гальвита A.B., Дубровская В.В., Хохлова О.В., Калинина И.А., Галенок В.А., Невинский Г.А. Динамика уровня нуклеазной активности антител крови женщины во время беременности и лактации. Биохимия. 2003. Т. 68. С. 1088-1100.

95. Kit Y.Y., Kim А.А., Sidorov V.N. Affinity-purified secretory immunoglobulin A possesses the ability to phosphorylate human milk casein. Biomed. Sci. 1991. V. 2. P. 201-204.

96. Кит Ю.Я., Семенов Д.В., Невинский Г.А. Существуют ли каталитически активные антитела у здоровых людей? Молекуляр. биология. 1995. Т. 29. С. 519-526.

97. Buneva V.N., Kanyshkova T.G., Vlassov A.V., Semenov D.V, Khlimankov D.Yu., Breusova L.R., Nevinsky G.A. Catalytic DNA- and RNA-hydrolyzing antibodies from milk of healthy human mothers. Appl. Biochem. Biotechnol. 1998. V. 75 (1). P. 63-76.

98. Savel'ev A.N., Kanyshkova T.G., Kulminskaya A.A., Buneva V.N., Eneyskaya E.V., Filatov M.V., Nevinsky G.A., Neustroev K.N. Amylolytic activity of IgG and slgA immunoglobulins from human milk. Clin. Chim. Acta. 2001. V. 314 (1-2). P. 141-152.

99. Mohan C., Adams S., Stanik V., Datta S.K. Nucleosome: a major immunogen for pathogenic autoantibody-inducing T cells of lupus. J. Exp. Med. 1993. V. 177 (5). P. 1367-1381.

100. Amino N., Tada H., Hidaka Y. Postpartum autoimmune thyroid syndrome: a model of aggravation of autoimmune disease. Thyroid. 1999. V. 9 (7). P. 705-713.

101. Tanaka A., Lindor K., Ansari A., Gershwin M.E. Fetal microchimerisms in the mother: immunologic implications. Liver Transpl. 2000. V. 6 (2). P. 138-143.

102. Freeman R., Rosen H., Thysen B. Incidence of thyroid dysfunction in an unselected postpartum population. Arch. Intern. Med. 1986. V. 146 (7). P. 1361-1364.

103. Nevinsky G.A., Kit Y.Ya., Semenov D.V., Khlimankov D.Yu., Buneva V.N. Secretory immunoglobulin A from human milk catalyzes milk protein phosphorylation. Appl. Biochem. Biotechnol. 1998. V. 75 (1). P. 77-91.

104. Kit Y.Y., Semenov D.V., Nevinsky GA. Phosphorylation of different human milk proteins by human catalytic secretory immunoglobulin A. Biochem. Mol. Biol. Intern. 1996. V. 39. P. 521-527.

105. Gorbunov D.A., Semenov D.V., Shipitsin M.V., Nevinsky G.A. Unusual phospholipids of human breast milk. Dokl. Biochem. Biophys. 2001. V. 377. P. 62-64.

106. Kanyshkova T.G., Semenov D.V., Khlimankov D.Yu., Buneva V.N., Nevinsky G.A. DNA-hydrolyzing activity of the light chain of IgG antibodies from milk of healthy human mothers. FEBS Lett. 1997. V. 416 (1). P. 23-26.

107. Nevinsky G.A., Kanyshkova T.G., Semenov D.V., Vlassov A.V., Gal'vita A.V., Buneva V.N. Secretory immunoglobulin A from healthy human mothers' milk catalyzes nucleic acid hydrolysis. Appl. Biochem. Biotechnol. 2000. V. 83 (1-3). P. 115-129.

108. Nevinsky, G.A., Buneva, V.N. Human catalytic RNA- and DNA-hydrolyzing antibodies. J. Immunol. Methods. 2002. V. 269. P. 235-245.

109. Savel'ev A.N., Eneyskaya E.V., Shabalin K.A. Autoantibodies with amylolytic activity. Prot. Pept. Lett. 1999. V. 6. P. 179-184.

110. Stewart J.D., Bencovic S.J. Catalytic antibodies: mechanistic and practical considerations. Chem. Soc. Rev. 1993. V. 22. P. 213-219.

111. Kalaga R., James L.L., O'Dell J.R., Paul S. Unexpected presence of polyreactive catalytic antibodies in IgG from unimmunized donors and decreased levels in rheumatoid arthritis. J. Immunol. 1995. V. 155. P. 2695-2702.

112. Xanthou M. Immune protection of human milk. Biol. Neonate. 1998. V. 74. P. 121-133.

113. Mestecky J., Russell M.W., Jackson S., Brown T.A. The human IgA system: a reassessment. Clin. Immunol. Immunopathol. 1986. V. 40 (1). P. 105-114.

114. Mazanec M.B., Nedrud J.G., Kaetzel C.S., Lamm M.E. A three-tiered view of the role of IgG in mucosal defense. Immunol. Today. 1993. V. 14. P. 430-435.

115. Gregory R.L., Kindle J.C., Hobbs L.C., Filler S.J., Malmstrom H.S. Function of anti-Streptococcus mutans antibodies: inhibition of virulence factors and enzyme neutralization. Oral Microbiol. Immunol. 1990. V. 5 (4). P. 181-188.

116. Kim K., Keller M. A., Heiner D.C. Immunoglobulin G subclasses in human colostrum, milk and saliva. Acta Paediatr. 1992. V. 91. P. 113-118.

117. Bahna S. I., Keller M. A., Heiner D. C. IgE and IgD in human colostrum and plasma. Pediatr. Res. 1962. V. 20. P. 604-607.

118. Литмен Г., Гуд P. Иммуноглобулины. M.: Мир. 1981. С. 104-111.

119. Говалло В.И. Иммунология репродукции. М.: Медицина. 1987. С. 304.

120. Zaman S., Carlsson В., Morikawa A., Jeansson S., Narayanan I., Thiringer K., Jalil F., Hanson L.A. Poliovirus antibody titres, relative affinity, and neutralising capacity in maternal milk. Arch. Dis. Child. 1993. V. 68 (2). P. 198-201.

121. Hjelt K., Grauballe P.C., Nielsen O.H., Schiotz P.O., Krasilnikoff P.A. Rotavirus antibodies in the mother and her breast-fed infant. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 1985. V. 4 (3). P. 414420.

122. Jensen R.G., Ann M.F., Carol J.L-K. Lipids of human milk and infant formulas. Annu. Rev. Nutr. 1992. V. 12. P. 417-441.

123. Sauerwald T.U., Demmelmair H., Koletzko B. Polyunsaturated fatty acid supply with human milk. Lipids. 2001. V. 36 (9). P. 991-6.

124. Koletzko В., Rodriguez-Palmero M., Demmelmair H., Fidler N., Jensen R., Sauerwald T. Physiological aspects of human milk lipids. Early Hum. Dev. 2001. V. 65. P. 3-18.

125. Koletzko В., Rodriguez-Palmero M. Polyunsaturated fatty acids in human milk and their role in early infant development. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 1999. V. 4 (3). P. 269-284.

126. Rueda R., Maldonado J., Narbona E., Gil A. Neonatal dietary gangliosides. Early Hum. Dev. 1998.V. 53. P. 135-147.

127. Nakano Т., Sugawara M., Kawakami H. Sialic acid in human milk: composition and functions. Acta Paediatr. Taiwan. 2001. V. 42 (1). P. 11-17.

128. Thormar H., Isaacs C.E., Brown H.R., Barshatzky M.R., Pessolano T. Inactivation of enveloped viruses and killing of cells by fatty acids and monoglycerides. Antimicrob. Agents Chemother. 1987. V. 31 (1). P. 27-31.

129. Hernell O., Ward H., Blackberg L., Pereira M.E. Killing of Giardia lamblia by human milk lipases: an effect mediated by lipolysis of milk lipids. J. Infect. Dis. 1986. V. 153 (4). P. 715720.

130. Newburg D.S. Oligosaccharides and glycoconjugates in human milk: their role in host defense. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 1996. V. 1 (3). P. 271-283.

131. Viverge D., Grimmonprez L., Cassanas G., Bardet L., Solere M. Variations in oligosaccharides and lactose in human milk during the first week of lactation. J. Pediatr. Gastroenterol Nutr. 1990. V. 11 (3). P. 361-364.

132. Newburg D.S. Do the binding properties of oligosaccharides in milk protect human infants from gastrointestinal bacteria? J. Nutr. 1997. V. 127 (5). P. 980-984.

133. Coppa G.V., Bruni S., Morelli L., Soldi S., Gabrielli O. The first prebiotics in humans: human milk oligosaccharides. J. Clin. Gastroenterol. 2004. V. 38 (6). P. 80-83.

134. Newburg D.S., Ruiz-Palacios G.M., Morrow A.L. Human milk glycans protect infants against enteric pathogens. Annu. Rev. Nutr. 2005. V. 25. P. 37-58.

135. Coppa G.V., Gabrielli 0., Giorgi P., Catassi C., Montanari M.P., Varaldo P.E., Nichols B.L. Preliminary study of breastfeeding and bacterial adhesion to uroepithelial cells. Lancet. 1990. V. 335(8689). P. 569-571.

136. Martin-Sosa S., Martin M.J., Hueso P. The sialylated fraction of milk oligosaccharides is partially responsible for binding to enterotoxigenic and uropathogenic Escherichia coli human strains. J. Nutr. 2002. V. 132 (10). P. 3067-3072.

137. Andersson В., Porras O., Hanson L.A., Lagergard Т., Svanborg-Eden C. Inhibition of attachment of Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenzae by human milk and receptor oligosaccharides. J. Infect. Dis. 1986. V. 153 (2). P. 232-237.

138. Peterson J.A., Patton S., Hamosh M. Glycoproteins of the human milk fat globule in the protection of the breast-fed infant against infections. Biol. Neonate. 1998. V. 74 (2). P. 143-162.

139. Newburg D.S., Linhardt R.J., Ampofo S.A., Yolken R.H. Human milk glycosaminoglycans inhibit HIV glycoprotein gpl20 binding to its host cell CD4 receptor. J. Nutr. 1995. V. 125 (3). P. 419-424.

140. Фриммель, Г. Иммунологические методы. М.: Медицина. 1987.

141. Ghosh S., Gepstein S., Heikkila J.J., Dumbroff E.B. Use of a scanning densitometer or an ELISA plate reader for measurement of nanogram amounts of protein in crude extracts from biological tissues. Anal. Biochem. 1988. V. 169 (2). P. 227-33.

142. Остерман, JI.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и центрифугирование. М.: Наука. 1981. С. 70-71.

143. Merril C.R., Goldman D., van Keuren M.L. Gel protein stains: silver stain. Methods Enzymol. 1984. V. 104. P. 441-447.

144. Suelter C.H. A particial guide to enzymology. Biochemistry: A series of monographs. 1985. P. 164-166.

145. Towbin H., Staehelin Т., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1976. V. 9. P. 4350-4356.

146. Harlow, E., Lane, D. Antibodies: A laboratory manual. Cold Spring Harbor, N. Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1988. P. 630-631.

147. Туркова, Я. Аффинная хроматография. М.: Мир. 1980. С. 190-191.

148. Канышкова Т.Г. Нуклеазные активности антител и лактоферрина молока человека. Диссертация на соискание уч. степени канд. хим. наук. Новосибирск. 1999.

149. Семенов Д.В. Нуклеотид-гидролизующая активность иммуноглобулинов и лактоферрина молока человека. Диссертация на соискание уч. степени канд. хим. наук. Новосибирск. 1998.

150. Akerstrom В., Bjorck L. A physicochemical study of protein G, a molecule with unique immunoglobulin G-binding properties. J. Biol. Chem. 1986. V. 261 (22). P. 10240-10247.

151. Барановский А.Г. Нуклеазные активности антител при рассеянном склерозе. Диссертация на соискание уч. степени канд. хим. наук. Новосибирск. 2004.

152. Jensen, R.G. The lipid of human milk. Boca Raton, R: CRC Press. 1989. P. 65-92.

153. Wiegant, H. Glycolipids. Amsterdam.: Elsevier. 1985.

154. Meyer zu, Heringdorf D., van Koppen C.J., Jakobs K.H. Molecular diversity of sphingolipid signalling. FEBS Lett. 1997. V. 410 (1). P. 34-38.

155. Kates, M. Techniques of lipidology. New York.: Elsevier. 1972.

156. Pan X.L., Izumi T. Variation of the ganglioside compositions of human milk, cow's milk and infant formulas. Early Hum. Dev. 2000. V. 57 (1). P. 25-31.

157. Pan X.L., Hua Т., Wu Y. Detection of gangliosides in human milk with a high performance thin layer chromatography (HPTLC). Zhonghua Yu Fang Yi Xue Za Zhi. 2001. V. 35 (2). P. 111-113.

158. Хьюз P. Гликопротеины: Пер. с англ. М.: Мир. 1985. С. 140.

159. Андриевская О.А. РНК-гидролизующие антитела из сыворотки крови больных системной красной волчанкой. Диссертация на соискание уч. степени канд. хим. наук. Новосибирск. 1998.

160. Kasho V.N., Baykov А.А. Two pathways for phosphate/water oxygen exchange by yeast inorganic pyrophosphatase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989. V. 161 (2). P. 475-480.

161. Smirnova I.N., Shestakov A.S., Dubnova E.B., Baykov A.A. Spectral and kinetic studies of phosphate and magnesium ion binding to yeast inorganic pyrophosphatase. Eur. J. Biochem. 1989. V. 182 (2). P. 451-456.

162. Shestakov A.A., Baykov A.A., Avaeva S.M. Tightly bound pyrophosphate in Escherichia coli inorganic pyrophosphatase. FEBS Lett. 1990. V. 262 (2). P. 194-196.

163. Simpson D.A., Hausinger R.P., Mulks M.H. Purification, characterization, and comparison of the immunoglobulin A1 proteases of Neisseria gonorrhoeae. J. Bacteriol. 1988. V. 170 (4). P. 1866-1873.

164. Nevinsky G.A., Buneva V.N. Human catalytic RNA- and DNA-hydrolyzing antibodies. J. Immunol. Methods. 2002. V. 269 (1-2). P. 235-249.

165. Mei S., Mody В., Eklund S.H., Paul S. Vasoactive intestinal peptide hydrolysis by antibody light chains. J. Biol. Chem. 1991. V. 266 (24). P. 15571-15574.

166. Щуров Д.В. Каталитические антитела. Молекулярная биология. 1997. Т. 31 (1). С. 515.