Иммуногенные конструкции на основе фрагментов оболочечного белка E2 вируса гепатита C

Мойса, Александр Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Иммуногенные конструкции на основе фрагментов оболочечного белка E2 вируса гепатита C
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Иммуногенные конструкции на основе фрагментов оболочечного белка E2 вируса гепатита C"

уп

На правах рукописи

Мойса Александр Александрович

ИММУНОГЕННЫЕ КОНСТРУКЦИИ НА ОСНОВЕ ФРАГМЕНТОВ ОБОЛОЧЕЧНОГО БЕЖА Е2 ВИРУСА ГЕПАТИТА С

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2011

11 :.:АР 2011

4840672

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте биомедицинской химии имении В.Н. Ореховича РАМН (ИБМХ РАМН)

Научный руководитель доктор биологических наук,

профессор

Колесанова Екатерина Федоровна

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор

Москалева Елизавета Юрьевна

доктор биологических наук Ипатова Ольга Михайловна

Ведущая организация ФГУ Научно-исследовательский

институт физико-химической медицины ФМБА России

Защита состоится 7 апреля в 12:30 часов на заседании диссертационного совета Д.001.010.01 при ИБМХ РАМН по адресу: 119121, Москва, ул. Погодинская, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБМХ РАМН по адресу: 119121, Москва, ул. Погодинская, 10.

Автореферат разослан «/_» ¿¿¿ЛГК'И 2011г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук

Е.А. Карпова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В настоящее время по приводимым в литературе данным около 3% мирового населения (около 200 миллионов) хронически инфицированы вирусом гепатита С (ВГС) и дополнительно от 3 до 4 миллионов новых инфицирований происходит каждый год (Schlaphoff, et al., 2007). Иммунная система большинства больных гепатитом С не способна самостоятельно справиться с вирусом, что позволяет ВГС длительно реплицироваться в гепатоцитах и ряде других клеток (Ludwig et al., 2004). У 3-10% инфицированных в течение примерно 20 лет развивается цирроз печени с последующим риском возникновения гепатоцеллюлярной карциномы (Seeff et al., 2002).

Лечение гепатита С значительно улучшилось в течение последних лет, но общедоступной специфичной терапии всё ещё нет. Современная терапия комбинированием а-интерферона и рибавирина является достаточно дорогой и сопровождается побочными эффектами (Schlaphoff, et al., 2007). Кроме того, она имеет довольно низкую эффективность, особенно в отношении ВГС субтипа lb (чувствительными к терапии оказываются менее 30% пациентов), наиболее часто встречающегося в России.

Разрабатываемые в настоящее время новые лекарственные средства для борьбы с вирусом гепатита С, нацеленные на ингибирование вирусных протеаз и РНК-зависимой РНК-полимеразы, ещё не прошли клинических испытаний (Webster et al., 2009). Кроме того, существует риск появления устойчивых к ним мутантных форм ВГС (Foster et al., 2004; Webster et al., 2009). Насущной необходимостью остаётся создание вакцин против ВГС, которые бы предотвращали распространение этой инфекции в человеческой популяции независимо от субтипа и/или мутантной формы вируса, или по крайней мере были бы способны защитить пациента от эволюции острого гепатита С в хронический (Lauer et al., 2004; Elmowalid et al., 2007). Несмотря на интенсивные исследования в этом направлении и разработку ряда кандидатных вакцин, дошедших до стадии

клинических испытаний (Barrett, 2007), эффективного вакцинного препарата против гепатита С пока нет.

Первыми компонентами ВГС, распознаваемыми иммунной системой человека как чужеродные, являются оболочечные белки El и Е2. Эти белки ответственны за взаимодействие с рецепторами клеток-мишеней и проникновение вируса внутрь клеток. Соответственно, антитела против оболочечных белков ВГС могут проявлять и по данным ряда исследователей действительно проявляют вируснейтрализующее и протективное действие (Fare! et al., 1994; Zibert et al., 1997). Однако оболочечные белки отличаются наибольшим генетическим разнообразием в зависимости от субтипа ВГС и наибольшей изменчивостью аминокислотных последовательностей в ходе многократных репликаций вируса в организме-хозяине. Это является одной из основных причин ухода ВГС от иммунного ответа организма-хозяина. Важная роль на начальных стадиях инфицирования делает оболочечные белки привлекательными объектами вакцинологии, но высокая вариабельность их структуры ставит задачу поиска консервативных антигенных детерминант в этих белках и конструирование на основе этих детерминант искусственных иммуногенных конструкций, способных вызывать вируснейтрализующий и протективный иммунный ответ широкой специфичности в отношении различных изолятов ВГС.

Цель и задачи исследования

Целью работы является разработка синтетических пептидных иммуногенных конструкций на основе фрагментов оболочечного белка Е2 ВГС.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи

1. Выбор Т- и В-эпитопов в составе консервативных участков аминокислотной последовательности оболочечного белка Е2 ВГС. Дизайн предполагаемых иммуногенных конструкций на основе выбранных эпитопов.

2. Синтез и очистка пептидов, представляющих собой составные иммуногенные конструкции.

3. Исследование синтезированных пептидов и их смесей на наличие иммуногенности на лабораторных животных и на способность вызывать

образование антител, взаимодействующих с целым оболочечным белком Е2 и гетеродимером Е1Е2 ВГС. 4. Исследование взаимодействия антител, полученных в результате иммунизации лабораторных животных, с вирусными частицами из плазмы крови больных гепатитом С.

Научная новизна. В работе впервые:

• получены новые синтетические Т-В-эпитопные пептидные конструкции, содержащие в своем составе высококонсервативные фрагменты оболочечного белка Е2 ВГС;

• продемонстрирована высокая иммуногенность полученных Т-В-эпитопных пептидных конструкций в опытах на лабораторных животных;

• показана способность полученных синтетических Т-В-эпитопных пептидных конструкций' вызывать образование антител, взаимодействующих с полноразмерным оболочечным белком Е2 и гетеродимером Е1Е2 ВГС и связывающих вирусные частицы из плазмы крови больных гепатитом С;

• для синтеза пептидов длиной свыше 20 аминокислотных остатков применен новый регламент пептидного синтеза с использованием 4-метилпиперидина для удаления защитных Fmoc-групп с альфа-аминогрупп растущей пептидной цепи.

Практическая значимость исследования

Исследованные в данной работе синтетические иммуногенные конструкции, составленные из высококонсервативных фрагментов оболочечного белка Е2, могут быть использованы в разработке препарата вакцины против ВГС. Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были доложены на: VIII Российской научно-практической конференции «Вирусные гепатиты: эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика» (Москва, 2009), 12-м семинаре Научно-консультативного комитета МНТЦ «Борьба с глобальными

инфекциями» («Combating Global Infections»; Листвянка - Иркутск, 2009), V Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009), VI научно-практической конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2009), совместной конференции НИАИЗ(США)-МНТЦ «Биоинформатические подходы и методы для исследования аллергических и инфекционных заболеваний» (Москва, 2010), 5-м Международном пептидном симпозиуме (Киото, 2010). Материалы диссертации представлены в 2 статьях и в 4 публикациях в материалах сборников научных конференций.

Структура и объём диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы и приложения. Работа содержит 160 страниц машинописного текста, 14 таблиц и 16 рисунков включая приложение. Список литературы включает 264 источника.

Материалы и методы исследований

Лизаты клеток, содержащие полноразмерные оболочечные белки ВГС из изолята Н77 (субтип 1а), любезно предоставлены доктором J. Dubuisson, Институт Биологии/Институт Пастера, Лилль, Франция.

Препараты плазмы крови больных гепатитом С получены от д.м.н. О.Б.Ковалёва, научного сотрудника кафедры детских инфекций РГМУ на базе Детской Городской Клинической Больницы №9 им. Г.Н. Сперанского (инфекционный корпус); возраст больных 7-14 лет.

Т-хелперные эпитопные мотивы выявляли с помощью программного обеспечения SYFPEITHI (http://www.svfpeithi.deA. При этом использовали как полную консенсусную аминокислотную последовательность оболочечного белка Е2 ВГС, так и отдельные полноразмерные последовательности этого белка из различных изолятов ВГС, имеющиеся в базах SWISS-PROT и UniProt.

Составленные нами из фрагментов оболочечного белка Е2 В-Т- и Т-В-эпитопные конструкции получали с помощью твердофазного автоматического пептидного синтеза на пептидном синтезаторе 433А ("Applied Biosystems", США)

исходя из 9-флуоренилметилоксикарбонил(Ртос)-защищенных по си-аминогруппам производных аминокислот. Пептиды очищали препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) на обращённой фазе и характеризовали с помощью масс-спектрометрического анализа (MALDI-TOF MS, ESI ORBITRAP MS и MS/MS). Степень чистоты определяли с помощью аналитической ВЭЖХ.

Получение сывороток и препаратов иммуноглобулинов класса G (IgG) от иммунизированных животных.

Крыс-самцов массой 200-250 г иммунизировали путем 4-кратного подкожного введения растворов пептидов с интервалом в 2 недели между инъекциями. Часть животных иммунизировали пептидами с адъювантом, а часть теми же пептидами без адъюванта. В случае иммунизации с адъювантом первую иммунизацию проводили смесью раствора пептида(ов) в фосфатно-солевом буфере с полным адъювантом Фрейнда, все последующие - смесью раствора пептида(ов) с неполным адъювантом Фрейнда. Адъювант Фрейнда добавляли в соотношении 1:1 (объём/объём) к растворам пептидов и смешивали до получения стойкой молочно-белой эмульсии. Вводимые дозы антигенов — 100 мкг пептида на 1 инъекцию одной крысе. Забор крови для получения антисывороток проводили через 1 неделю после последней иммунизации. В качестве контроля использовали сыворотки крови или выделенные из них IgG, полученные от тех же животных до начала иммунизации. Препараты иммуноглобулинов получали из сыворотки крови высаливанием насыщенным раствором сульфата натрия. Очистку препаратов IgG проводили с помощью аффинной хроматографии на колонке с 3 мл Affi-Gel®Protein А агарозы «Bio-Rad».

Тестирование сывороток на наличие антипептидных антител и антител, взаимодействующих с оболочечным белком Е2 и гетеродимером Е1Е2, проводили методом иммуноферментного анализа. При этом в зависимости от эксперимента на поверхность лунок планшета сорбировали либо препараты пептидов, либо полноразмерный оболочечный белок Е2 или гетеродимер Е1Е2 ВГС, которые адсорбировали на лектин подснежника.

Взаимодействие препаратов 1§0 с нативными вирусными частицами оценивали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для этого препараты сорбировали на поверхности микропробирок, куда добавляли образцы плазмы крови (100 мкл) хронически инфицированных ВГС больных, у которых предварительно с помощью ПЦР было установлено наличие РНК ВГС. Связывание вирусных частиц с определяли путём выявления РНК ВГС методом обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией с электрофоретической детекцией («АмплиСенс® НСУ-ЕРЬ») и флуоресцентной детекцией в реальном времени («АмплиСенс® НСУ-Монитор-РЯТ»).

Результаты и обсуждение

Получение синтетических пептидных Т-В эпнтопных конструкции на основе высококонсервативных фрагментов оболочечных белков ВГС

Критерием отбора В-эпитопиой части пептидной конструкции служили: содержание высоконсервативных аминокислотных остатков (с частотой встречаемости в данной позиции в последовательностях полипротеина различных изолятов ВГС не ниже 95%) не менее 50% и гидрофильных аминокислотных остатков не менее 40% (таблица 1), а также функциональная значимость участка последовательности белка Е2 ВГС.

Таблица 1. Консервативные участки оболочечных белков El и Е2

Белок Позиция1 Участок2 Последовательность3 Консервативность/ Гидрофильность

El 315-324 CR1 GHRMAWDMMM 94%/60%

Е2 418-432 GLR GSWHINRTALNCNDS 52%/73%

Е2 481-491 PRR1 DORPYCWHYPP 66%/64%

Е2 502-521 CR2 VCGPVYCFTPSPVVVGTTDR 86%/55%

Е2 549-556 PRR2 WFGCTWMN 88%/50%

Е2 581-590 CR3 CPTDCFRKHP 92%/70%

Е2 610-622 CR4 DYPYRLWHYPCTV 75%/62%

Е2 654-663 CHR LEDRDRSELS 49%/80%

Е2 682-704 CR5 LPALSTGLIHLHONIVDVOYLYG 59%/52%

1 - первая и последняя позиции указаны в соответствии нумерацией аминокислотных остатков в последовательности полипротеина ВГС изолята Н77 (генотип 1а);

2 - участки обозначены в соответствии с (Sobolev et al., 2000);

3 - аминокислотные остатки, встречающиеся в данной позиции полипротеина

в 95% и более изолятов ВГС, подчеркнуты.

Участок CR3 обладает высокой гидрофильностью, то есть с высокой вероятностью локализуется на поверхности молекулы Е2, и отвечает за взаимодействие белка Е2 с гликозаминогликанами (Barth et al., 2006; Olenina et al., 2005). PRR1 обладает умеренной гидрофильностью и отвечает за взаимодействие белка Е2 (в том числе в составе вирусоподобных частиц) с рецептором ВГС CD81.

Кроме того, ранее у больных гепатитом С обнаруживали антитела к 8-членным пептидам в составе этих фрагментов белка Е2 (СИешпа й а!., 2002). Фрагмент СНЯ, обладающий высокой гидрофильностью и входящий в сайт связывания белка Е2 с гликозаминогликаном, ранее был включён в различные синтетические конструкции, а также конъюгаты с бычьим сывороточным альбумином. Эти конструкции и конъюгаты обладали высокой иммуногенностью для мышей и вызывали образование антител, специфично взаимодействовавших с целым белком Е2 ВГС (Фарафонова 2005; Кигаеуа е1 а1, 2005). Таким образом, имевшиеся в литературе данные позволяли полагать, что выбранные нами в качестве В-эпитопов высоконсервативные фрагменты могут быть экспонированы на поверхности вирусной частицы и могут участвовать в её взаимодействии с молекулами - предполагаемыми рецепторами ВГС. Антитела против таких фрагментов могут обладать изолят-независимым протективным действием.

В результате поиска ТЬ-эпитопов с помощью программы 8УРРЕ1ТН1 были получены таблицы всех вероятных ТЬ-мотивов протяжённостью 15 аминокислотных остатков, специфичных для аллельных вариантов главного комплекса гистосовместимости II класса. Предсказанные ТЬ-эпитопные мотивы консенсусной аминокислотной последовательности Е2 и аминокислотных последовательностей Е2 отдельных изолятов практически совпадали, поэтому в дальнейшем использовали таблицу возможных ТЬ-мотивов консенсусной аминокислотной последовательности Е2. В качестве ТЬ-мотивов, которые могут быть использованы в иммуногенных конструкциях, отбирали мотивы с вероятностью соответствия ТЬ-эпитопу больше 15, при этом данные мотивы должны были содержать высоконсервативные фрагменты (ВКФ) оболочечного белка Е2, включающие не менее трёх важных для взаимодействия с МНС II аминокислотных остатка В результате в качестве источников ТЬ-эпитопов были выбраны ВКФ СИ2 и С115 как содержащие наибольшее число перекрывающихся ТЬ-эпитопных мотивов, охватывающих практически все варианты специфичности по отношению к различным аллельным вариантам МНС II (таблица 2). Эти

фрагменты и были включены в искусственные иммуногенные пептидные конструкции как возможные источники ТЬ-эпитопов.

Таблица 2. ТЬ-эпитопные мотивы ВКФ С112 и С115 белка Е2 ВГС и их

ВКФ Аллели МНС II Количество найденных Т-хелперных эпитопных мотивов

Н2-Ек 1

НЬА-011В1*0101 4

СЯ2 НЬА-ОЯВ1*0301 (1Ж17) 1

Ш-А-ОЯВ 1*0401 (0Я40\у4) 2

НЬА-ШФ 1*0701 5

НЬА-01Ш1*1501 (ОЯ2Ь) 2

Н2-Ек 3

Н2-Ак 1

НЬА-ОЯВ1*0101 5

СЯ5 НЬА-011В1*0301 (01Ш) 3

НЬА-ОШЗ 1*0401 (DR4Dw4) 3

НЬЛ-ОИВ 1*0701 5

НЬА-01Ш1*1101 2

Ш^МЖВ 1*1501 (ОЯ2Ь) 3

Фрагмент СЯ2 - наиболее протяженный ВКФ в составе оболочечного белка Е2 ВГС, содержит большое количество перекрывающихся ТЬ-эпитопных мотивов. Его функциональная роль точно неизвестна, однако предполагается, что в этом участке находится «пептид слияния» оболочечного белка Е2 с мембраной эндосомы клетки-мишени (Вишневская и др., 2008; Кгеу е1 а1., 2010). Фрагменты белка Е2, используемые в качестве В-эпитопов в составе создаваемых иммуногенных конструкций, также содержали предсказываемые ТЬ-эпитопные мотивы, но специфичные для меньшего числа аллелей МНС II.

Для обеспечения свободного вращения В- и Т-хелперной эпитопных частей друг относительно друга в предполагаемых пептидных иммуногенных конструкциях между этими частями вводили короткий гибкий линкер. Так как заранее невозможно предсказать, какой порядок расположения В- и Т-эпитопов в

конструкции будет предпочтителен с точки зрения наибольшей эффективности иммунного ответа, для каждой пары В-эпитоп — Т-эпитоп использовали два варианта расположения в молекуле: В-Т и Т-В (рис. 1).

Составленные из фрагментов белка Е2 и тестированные нами предполагаемые иммуногенные конструкции приведены в таблице 3. Конструкции 7 и 8 были составлены ранее и тестированы на иммуногенность на мышах (Фарафонова, 2007).

Таблица 3. Иммуногенные конструкции

№ Ст-ра конструкции Аминокислотная последовательность конструкции

1 CR2-GG-CR3 AC-VCGPVYCFTPSPVVVGTTDGGCPTDCFRKHPE-CONH2

2 CR3-GG-CR2 AC-CPTDCFRKHPEGGVCGPVYCFTPSPVVVGTTD-CONH2

3 PRR1-GG-CR2 AC-DQRPYCWHYPPKPCGGVCGPVYCFTPSPVVVGT-CONH2

4 CR2-GG-PRR1 AC-VCGPVYCFTPSPVVVGTGGDQRPYCWHYPPKPCG-CONH2

5 CR5-GG-PRR1 AC-STGLIHLHQNIVDVQYLYGGDQRPYCWHYPPKPCG-CONH2

6 PRR1-GG-CR5 Ac-DQRPYCWHYPPKPCGGSTGLIHLHQNIVDVQYLYG-CONH2

7 CHR-GG-CR2 AC-DLEDRDRSELGGVCGPVYCFTPSPVVVGTTD-CONH2

8 CR2-GG-CHR nh2-vcgpvycftpspvvvgttdggdledrdrsel-conh2

Линкер

Рис 1. Строение Т-В / В-Т-эпитопных конструкций

Синтез иммуногенных конструкций

Разработка нового регламента твердофазного пептидного синтеза исходя из Fmoc-аминокислот.

Стандартная методика синтеза пептидов из Fmoc-аминокислот включает

удаление защитных Fmoc-групп со смолы и с растущей пептидной цепи пиперидином (PIP) в виде 20%-ного раствора в ЫЛ^-диметилформамиде (DMF).

Однако в настоящее время PIP входит в список прекурсоров, и его свободное использование и приобретение в России запрещено.

На примере синтеза модельного пептида 5RHDSGY10-aMima, фрагмента бета-амилоида, был разработан новый регламент твердофазного пептидного синтеза путём введения модификации в стадию удаления защитной Fmoc-группы с а-амино-группы растущей пептидной цепи. В качестве предлагаемых на замену PIP реагентов были тестированы пирролидин (PYR) и 4-метилпиперидин (4MPIP). Как видно из таблицы 4, использование обоих тестированных реагентов привело к получению препарата пептида с более высоким абсолютным и относительным содержанием целевого вещества; в частности, значительно снизились рацемизация и модификация остатка Asp. Однако использование 4MPIP вместо PIP оказалось предпочтительным из-за значительно более высокой стабильности растворов 4MPIP по сравнению с растворами PYR. 4MPIP обладает сходными с PIP физическими свойствами, в частности, плотностью и температурой кипения, что облегчает настройку дозирующего устройства автоматического синтезатора при замене одного реагента на другой.

Таблица 4. Результаты синтеза и характеристика препаратов фрагмента амилоида 5RHDSGY10

Реагент для удаления Fmoc-группы* Выход неочищенного пептида, мг Эпимеризация Asp/iso-Asp Аспартимид Содержание целевого продукта в неочищенном препарате, %

20%Р1Р 6,5 Да <1% 27

20% PYR 7,4 Нет <1% 54

20% 4MPIP 9,3 Нет <1% 51

*- реагент для удаления Fmoc-группы растворяли в DMF, содержание в % по объему.

В-Т- и Т-В-эпитопные пептидные конструкции (таблица 3) синтезировали методом автоматического твердофазного пептидного синтеза с использованием

20%-ного раствора 4МР1Р в ОМР для удаления Ртос-групп с растущей пептидной цепи. Пептиды имели циклическую (а некоторые - бициклическую) структуру за счёт дисульфидных связей между остатками цистеина. Выбор такой структуры основан на том, что по данным литературы в оболочечных белках ВГС все остатки цистеина образуют внутримолекулярные дисульфидные связи, и используемые нами в качестве В-эпитопов участки оболочечного белка Е2 могут находиться в петлях, образованных за счёт Б-в-мостиков. Конформация циклического пептида может с большей точностью повторять конформацию петлеобразного участка последовательности оболочечного белка Е2 ВГС, что будет способствовать выработке высокоаффиных антипептидных антител к белку.

Правильность синтеза пептидов контролировали масс-спектрометрическим анализом, степень чистоты определяли с помощью аналитической ВЭЖХ. В таблице 5 приведены результаты синтеза и характеристики полученных пептидов.

Таблица 5. Характеристики препаратов синтезированных пептидных конструкций

№ пептида Молекулярная масса Выход пептида (мг) Степень чистоты (%) по данным ВЭЖХ

1 3406,9 7,0 >90

2 3406,9 15,4 >90

3 3763,4 24,9 >90

4 3705,3 25,3 >90

5 4095,7 18,7 >90

6 4095,7 22,7 >90

7 3323,7 19,5 >80

8 3166,6 22,4 >80

Образование специфических антител в ответ на иммунизацию крыс Т-В-эпитопными конструкциями

Изучение иммуногенности пептидных конструкций

При иммунизации крыс пептидами без АФ антипептидные антитела (здесь и далее антипептидными названы антитела к целой синтетической конструкции) были обнаружены только у одного животного из группы, иммунизированной пептидом 1. При иммунизации композицией каждой из синтетических пептидных

конструкций №№ 1-4, 7, 8 с АФ антипептидные антитела были обнаружены в сыворотках крови 22 из 29 животных в достаточно высоких титрах (табл. 6). Иммуногенными оказались как конструкции с условно «прямым» порядком расположения Т- и В-эпитопов (Т-линкер-В, конструкции №№ 1, 4, 8), так и с условно «обратным» порядком расположения (В-линкер-Т, конструкции №№2, 3, 7), хотя из сопоставления титров антипепгидных антител против конструкций 1 и 2, 3 и 4 можно заключить, что конструкции вида Т-линкер-В в этом случае обладают более высокой иммуногенностью. Наиболее высокая иммуногенность была выявлена у конструкции № 1. Пептидные конструкции № 5 и 6 не вызвали образования специфических антител, возможно, из-за плохой растворимости в водных растворах и, как следствие, низкой биодоступности. Проявление пептидами №№ 1-4, 7 и 8 достаточно высокой иммуногенности при введении крысам может свидетельствовать о том, что включённый в данные конструкции фрагмент белка Е2, СИ2, с предсказанными Т-хелперным эпитопными мотивами проявил способность стимулировать Т-хелперные лимфоциты 2 типа к активации превращения В-лимфоцитов в антителопродуцирующие плазматические клетки.

Таблица 6. Титры антипептидных антител к иммуногенным конструкциям использованным с АФ

№ группы Кол-во животных в группе Иммуногенная конструкция Среднее геометрическое значение титров в группе

1 5 012-00-0*3 1:31981

2 5 013-00-012 1:8100

3 5 ряш-оо-ои 1:900

4 5 С112-00-РШ11 1:9152

5 5 СЯ5-00-РШ11 .>1:100

6 5 РКЯ1-00-015 >1:100

7 5 СНЯ-00-012 1:5616

8 5 СЯ2-00-СНЯ 1:2700

Взаимодействие антител против пептидных иммуногенных конструкций с препаратами оболочечных белков ВГС

Тестирование содержащих антипептидные антитела сывороток крови крыс на наличие антител, способных взаимодействовать с полноразмерными оболочечными белками ВГС, показало, что из 23 сывороток 7 (1,3; 1,4; 1,5; 2,1; 2,3; 2,4; 8,1; первая цифра - номер группы, вторая - номер животного) содержат антитела, взаимодействующие с белком Е2, и 8 (1,3; 1,4; 1,5; 2,1; 2,3; 2,4; 7,1; 8,1) - антитела, взаимодействующие с гетеродимером Е1Е2 (рис.2). Наиболее эффективно взаимодействовали с оболочечными белками ВГС антитела из антисывороток, полученных при гипериммунизации пептидами 1 и 2. В антисыворотках 1а,3; 1,1; 2,2; 2,5; 3,3; 3,4; 4,1; 4,2; 4,4; 7,1; 8,4 антитела к полноразмерному оболочечному белку Е2 и гетеродимеру Е1Е2, возможно, присутствуют, но в малых количествах либо с низкой аффинностью (значения оптической плотности при взаимодействии сывороток с Е2 и Е1Е2 незначительно превышали значения оптической плотности контрольных проб).

Рис. 2. Взаимодействие антител из сывороток крыс, иммунизированных Т-В-эпитопными конструкциями, с оболочечными белками ВГС (в разведении 1:50). Эксперимент ставили в 3 параллелях. * - р<0,5 по сравнению с контролем (преимунная сыворотка животных).

Действительно, выделенные и сконцентрированные препараты из

антисывороток 1,1; 1,3; 1,4; 1,5; 4,1; 2,2; 2,3; 2,4; 3,3; 3,4; 4,1; 4,2; 4,4; 7,1; 7,1; 7,4 более эффективно связывали Е2 и Е1Е2 (рис. 3). Невысокую эффективность взаимодействия антител против конструкций №№ 1-4 с оболочечными белками Е2 и Е1Е2 изолята Н(1а) ВГС можно по крайней мере частично объяснить тем, что В-эпитопные части полученных нами конструкций имеют отличия в аминокислотной последовательности от аналогичных фрагментов оболочечных белков изолята Н(1а). Так, использованный нами фрагмент СЯЗ отличается на 1 аминокислотный остаток (Мб—>Туг) от соответствующего фрагмента изолята Н(1а), а фрагмент РЫЮ отличается на два аминокислотных остатка от соответствующего участка в изоляте Н(1а): Бег—>Абр и Дер—>01и. Фрагмент же СНЛ, использованный нами в пептидных конструкциях №7 и 8, не отличается по аминокислотной последовательности от соответствующего фрагмента в белке Е2 изолята Н(1а) ВГС. Низкая эффективность связывания белков Е2 и Е1Е2 антителами, полученными против конструкций №7 и 8, может объясняться либо низкой концентрацией антител против В-эпитопной части этих конструкций (то есть фрагмента СН11), либо не вполне адекватным моделированием фрагментом СНЯ конформации данного участка в молекуле белка Е2.

«.................Т.............

1,1 1,3 1.4 1,5 2,1 2.2 2,3 2,4 4,1 4,2 4,4 3,3 3,4 7,1 8,1 8,4 ■ Е2 ■ Контроль Е2 ПЕ1Е2 □ Контроль Е1Е2

Рис 3. Взаимодействие препаратов из сывороток крови крыс,

иммунизированных Т-В-эпитопными конструкциями, с оболочечными белками ВГС (разведение сывороток 1:50). * - р<0,5 по сравнению с контролем (преимунная сыворотка животных).

Тем не менее, полученные результаты демонстрируют принципиальную возможность индукции иммунного ответа с образованием антител, специфично взаимодействующих с оболочечными белками ВГС, в результате иммунизации синтетическими пептидными Т-В-эпитопными конструкциями, разработанными т эШсо.

Исследование иммуногенности смеси пептидных Т-В-эпитопных конструкций

Крыс (4 особи) иммунизировали смесью иммуногенных конструкций №№ 1-4, 7 и 8 с АФ в режиме гипериммунизации. Данные пептидные конструкции смешивали в равных долях (по массе): в 100 мкг смеси содержалось по 16,6 мг каждого пептида. Иммунизацию и получение сыворотки проводили так же, как и в случае отдельно взятых пептидных конструкций. В таблице 7 приведены результаты определения титров антител в сыворотках крови крыс, иммунизированных смесью конструкций, против каждой отдельно взятой конструкции.

Таблица 7. Титры антипептидных антител к иммуногенным конструкциям

при иммунизации смесью конструкций с АФ.

№ группы Кол-во животных в группе Иммуногенная конструкция Среднее геометрическое значение титров в группе к конструкции

9 4 сяг-оо-ст 1:8100

СН11-00-012 1:3894

013-00-012 1:24300

012-00-013 1:24300

РКЛ1-00-СЯ2 1:2700

С112-00-РШ11 1:1872

У трех животных после иммунизации смесью конструкций появились антитела против всех конструкций, входивших в состав смеси. У одного животного антипептидных антител ни к одной конструкции не обнаружено. Величины титров антител свидетельствуют о том, что иммунизация смесью конструкций вызывает столь же эффективную продукцию специфических антител

к каждой из конструкций, что и иммунизация каждой конструкцией в отдельности в 6 раз более высокой дозе.

■ Взаимодействие с Е2

Ш Е2 контроль

□ Взаимодействие с Е1Е2

ИЕ1Е2 контроль

@ В за пмодействие

препарата 1§Сг с Е2 ЕИ^Ст с Е2 контроль

0 Взаимодействие

препарата 1§0 с Е1Е2 Е150 с Е1Е2 контроль

Рис. 4. Взаимодействие антисывороток и препаратов из сывороток крыс, иммунизированных Т-В-эпитопными конструкциями, с оболочечными белками ВГС (разведение сывороток 1:50). * - р<0,5, ** - р<0,1 по сравнению с контролем (преимунная сыворотка).

Тестирование антисывороток и препаратов полученных против смеси иммуногенных конструкций, на взаимодействие с оболочечным белком Е2 и гетеродимером Е1Е2, показало, что в сыворотках всех трёх животных, развивших В-клеточный иммунный ответ против смеси иммуногенных конструкций, присутствуют антитела, взаимодействующие с оболочечными белками ВГС (рис. 4). Более высокую иммуногенность смеси конструкций по сравнению с каждой конструкцией в отдельности можно объяснить присутствием дополнительных ТЬ-эпитопов в других конструкциях, а более высокую связывающую активность по отношению к оболочечным белкам ВГС - наличием более широкого спектра антител к большему количеству участков оболочечного белка Е2. Следует отметить, что наиболее иммуногенными в составе смеси оказались, как и при иммунизации отдельными конструкциями, пептиды 1 и 2. Возможно, в данных

конструкциях удалось наиболее точно смоделировать фрагмент оболочечного белка Е2 ВГС.

Взаимодействие препаратов полученных против пептидных

иммуногенных конструкций, с нативными вирусными частицами

Для данного эксперимента препараты от разных животных внутри

одной группы объединяли в единые образцы: 1 (1,3; 1,4; 1,5), 2 (2,1; 2,3; 2,4), 3 (3,3; 3,4), 4 (4,1; 4,2; 4,4), 7 (7,1), 8 (8,1; 8,4), 9 (9,1; 9,2; 9,4). На первом этапе исследования был проведен качественный анализ взаимодействия сорбированных на поверхности микропробирок с нативными вирусными частицами, при этом связывание иммуноглобулинами вирусных частиц регистрировали с помощью электрофоретической детекции продуктов ПЦР после реакции обратной транскрипции. В данном исследовании использовали плазму крови пациента №1 с хроническим гепатитом С. Как видно на электрофореграмме (рис.5.), lgG из образцов 1, 2, 3, 4, 9 эффективно связывали вирусные частицы из плазмы крови, поскольку в соответствующих дорожках присутствуют специфические светящиеся полосы на уровне 240 п.н. Препараты из образцов 7 и 8 достаточно слабо взаимодействовали с вирусными частицами либо содержали значительно меньшее количество специфических антител, Из полученных результатов можно сделать вывод, что большая часть препаратов антипептидных антител к иммуногенным конструкциям содержит молекулы иммуноглобулинов, способные специфично связывать нативные вирусные частицы.

Ж ЖО

Рис. 5. Электрофореграмма продуктов амплификации: а) РНК ВГС из вирусных частиц, связанных из гипериммунных сывороток, б) контроль ^О из преиммунных сывороток.

Для сравнительной количественной оценки эффективности связывания частиц ВГС из крови больных антипептидными 1§0 из сывороток крови гипериммунизированных животных использовали реакцию обратной транскрипции РНК ВГС и ПЦР-амплификацию кДНК ВГС с гибридизационно-

флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». В этом исследовании также использовали объединённые препараты (1, 2, 3, 4, 7, 8, 9) от разных животных из одной группы. Для того чтобы оценить эффективность связывания вирусных частиц различными препаратами сравнивали количество вирусных частиц, присутствующих в образцах плазмы, с количеством вирусных частиц, связанных Образцы плазмы пациентов подвергали такой же обработке в тех же условиях. Количество вирусных частиц, связавшихся с 1§С, равнялось количеству копий обнаруженной РНК ВГС в микропробирках с сорбированными на их внутренней поверхности Это количество копий РНК рассчитывали по калибровочным графикам, построенным при использовании ДНК-калибраторов, амплификация которых проходила в тех же условиях. Значения концентраций вирусных частиц, сорбированных препаратами приведены в таблице 8.

По результатам проведенного эксперимента, представленным в таблице 8, видно, что наибольшее количество вирусных частиц связывают ^О из антисывороток, полученных после гипериммунизации животных пептидами 1 и 2, а также смесью иммуногенных конструкций. Препарат полученный после иммунизации смесью пептидных конструкций содержит большее количество антител, специфически взаимодействующих с оболочечными белками ВГС и потому более эффективно связывает и вирусные частицы. Иммуногенные конструкции 1 и 2 содержат в качестве В-эпитопной части фрагмент С113, имеющий наиболее консервативную аминокислотную последовательность из всех трёх В-эпитопных фрагментов, использованных в иммуногенных конструкциях 1 -4, 7 и 8, и потому препараты содержащие антитела против данного

фрагмента, весьма эффективно связывают вирусные частицы, принадлежащие к разным изолятам ВГС. В то же время В-эпитопные фрагменты конструкций 3 и 4, 7 и 8 обладают меньшей консервативностью первичной структуры, и потому полученные против этих конструкций антитела с различной эффективностью связывают вирусные частицы, принадлежащие к разным изолятам ВГС. Таким образом, антитела, вырабатываемые против участка СЮ, по всей видимости,

будут обладать широкой специфичностью по отношению к различным изолятам ВГС.

Таблица 8. Количество РНК в препаратах вирусных частиц, полученных

после сорбции на антипептидных антителах.

Обозначение образца Количество (ME) РНК ВГС, связанной препаратами IgG Концентрация РНК в образце плазмы / концентрация РНК из связанных вирусных частиц

ДО гр.1+№1 258 38

ДО гр.9+№1 126 78

ДО гр.2+№1 399 25

ДО гр.З+№1 149 66

ДО гр.4+№1 771 127

ДО гр.8+№1 294 33

ДО гр.7+№1 91,9 107

ДО гр.1+№5 377 72

ДО гр.9+№5 1460 19

ДО гр.2+№5 160 169

ДО гр.З+№5 163 166

ДО гр.4+№5 91 295

ДО гр.1+№7 820 110

гр.9+№7 3770 24

ДО гр.2+№7 1880 48

ДО гр.З+№7 50 1799

ДО гр4+№7 135 667

1ёС гр.1+№9 526 7

ДО гр.9+№9 99 38

ДО гр.2+№9 119 32

ДО гр.З+№9 215 18

ДО гр.4+№9 103 37

ДО гр.1+№11 600 8

ДО гр.9+№11 526 9

гр.2+№11 160 31

ДО гр.З+№11 14 355

ДО гр.4+№11 108 46

Размер частиц в растворах иммупогенных конструкций

Для пептидов длиной менее 50 аминокислотных остатков столь высокая

иммуногенность полученных нами синтетических пептидных конструкций

необычна. Такая иммуногенность характерна для полипептидов с молекулярной

массой не менее 10 кДа. Поскольку полученные нами пептидные конструкции

имеют в своём составе более гидрофильную В-эпитопную часть и более

гидрофобную Т-эпитопную часть, и таким образом представляют собой

амфифильные молекулы. Логично предположить, что в растворе эти молекулы могут собираться в мицеллоподобные мультимеры, на поверхности которых экспонируется гидрофильные группы, формирующие В-эпитопы иммуногенных конструкций. Образование таких надмолекулярных комплексов может способствовать повышению иммуногенности конструкций за счёт многоточечного взаимодействия с иммунокомпетентными клетками, опсонизации этих комплексов антителами и, как следствие, увеличения эффективности презентации пептидных антигенов, а также повышения устойчивости пептидов к действию ферментов в ходе иммунизации. Для подтверждения данного предположения были определены диаметры частиц иммуногенных конструкций в водном растворе с использованием субмикронного анализатора диаметров частиц N5 компании Beckman Coulter. Результаты представлены в таблице 9.

Таблица 10. Размеры частиц в растворах иммуногенных конструкций

№ пептида Средняя величина d, нм Содержание частиц в растворе %

1 8 90

2 8 90

3 9 85

4 9 80

7 9 95

8 9 90

Из приведённых результатов видно, что пептидные конструкции в растворе образуют мультимеры с диаметром частиц от 6 до 22 нм, в среднем 8-9 нм. Частицы такого диаметра соответствуют молекулам глобулярных белков с молекулярной массой от 40 до свыше 1000 кДа (Соколов и др., 2009) и, следовательно, могут содержать от 10 до нескольких сотен молекул пептидов. Такая мультимеризация может быть по крайней мере одной из причин высокой иммуногенности составленных нами из высококонсервативных фрагментов белка Е2 синтетических пептидных конструкций.

Заключение

Разработанные и исследованные в данной работе синтетические пептидные конструкции могут служить практической и теоретической основой для разработки пептидной вакцины против гепатита С. Под практической основой понимается использование данных пептидных конструкций как готовых иммуногенов вакцины, под теоретической - применение их в качестве шаблона для разработки новых подобных конструкций, обладающих иной В- и Т-эпитопной специфичностью. Поскольку, как показали результаты данной работы, смесь пептидных конструкций, содержащих разные В- и Т-эпитопы, более эффективна как иммуноген, способный вызывать образование белок- и вирус-специфичных антител и стимулировать Т-лимфоциты, включение дополнительных В-Т-эпитопных пептидных конструкций может повысить иммуногенность композиции и способность вызывать антитела, специфически взаимодействующие с различными изолятами ВГС. При этом, возможно, какие-то наименее эффективные конструкции из числа разработанных будут исключены.

Выводы

1. Из предполагаемых В-эпитопов и предсказанных Т-эпитопов, являющихся высококонсервативными фрагментами оболочечного белка Е2 вируса гепатита С, сконструированы и получены в виде синтетических препаратов 6 новых потенциально антигенных пептидных конструкций.

2. Внесена модификация в методику и разработан новый регламент твердофазного пептидного синтеза с использованием 4-метилпиперидина вместо пиперидина для удаления защитных групп с альфа-аминогрупп растущей пептидной цепи.

3. Показана высокая иммуногенность шести из 8 исследованных синтетических пептидных конструкций в опытах по иммунизации крыс. Показано, что данные синтетические пептидные конструкции в водных растворах могут существовать в форме олигомеров.

4. Показано, что при иммунизации пептидными конструкциями CR2-GG-CR3, CR3-GG-CR2, CHR-GG-CR2, CR2-GG-CHR, CR2-GG-PRR1, PRR1-GG-CR2 образуются антитела, взаимодействующие с оболочечным белком Е2 ВГС и гетеродимером Е1Е2 ВГС.

5. Полученные в результате иммунизации антипептидные антитела связывали нативные вирусные частицы из плазмы больных ВГС.

Список сокращений

АФ - адъювант Фрейнда ВГС - вирус гепатита С

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота РНК - рибонулкеиновая кислота ПЦР - полимеразная цепная реакция

MALDI-TOF - matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight времяпролетная [масс-спектрометрия] с лазерной десорбцией-ионизацией с помощью матрицы

ESI ORBITRAP MS и MS/MS - масс-спектрометрия (простая и тандемная) с ионизацией электрораспылением и детекцией с помощью орбитальной ионной ловушки.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Мойса А.А., Фарафонова Т.Е., Колесанова Е.Ф. Перспективы использования высококонсервативных фрагментов оболочечных белков вируса гепатита С в синтетических пептидных вакцинах // «Мир вирусных гепатитов». 2009. №2. 4.2. С.70.

2. Колесанова Е.Ф., Фарафонова Т.Е., Мойса А.А. Пептидные иммуногены и вакцины: принципы разработки // Материалы IV Российского симпозиума "Белки и пептиды». 2009. С.105.

3. Moisa A.A., Farafonova Т.Е., Kolesanova E.F. Prospects for the use of hepatitis С virus envelope protein highly conserved sites in peptide vaccines // Materials of The 12th SAC Seminar «Combating Global Infections». 2009. P. 39.

4. Арчаков A.M., Сторожаков Г.И., Колесанова Е.Ф., Фарафонова Т.Е., Мойса А.А. Вакцина против гепатита С // Сборник докладов VI Международная конференции "Молекулярная медицина и биобезопасность». Москва. 2009. С. 37 -38.

5. Алешина Е.Ю., Пындык Н.В., Мойса А.А., Санжаков М.А., Харыбин О.Н., Николаев Е.Н., Колесанова Е.Ф. Синтез фрагмента р-амилоида 5RHDSGY10 и его изомеров // Биомедицинская химия. 2008. Т.54, №2. С. 154 - 166.

6. A. A. Moisa and Е. F. Kolesanova. Synthetic peptide vaccines. // Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry. 2010. V. 4, № 4. P. 321-332.

Подписано в печать:

28.02.2011

Заказ № 5064 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мойса, Александр Александрович

1 Введение.

2 Обзор литературы.

2.1 Строение генома и организация вирусной частицы гепатита С.

2.2 Жизненный цикл вируса гепатита С.

2.2.1 Рецепция ВГС клетками печени.

2.2.2 Проникновение ВГС в клетку-мишень и высвобождение в цитоплазму генетического материала.

2.2.3 Трансляция РНК и пост-трансляционный процессинг полипротеина

2.2.4 Репликативный комплекс ВГС, механизм репликации.

2.2.5 Сборка вириона ВГС.

2.3 Иммунный ответ на ВГС.

2.3.1 Взаимодействие ВГС с молекулярными компонентами неспецифического антивирусного ответа (иммунитета).

2.3.2 Взаимодействие ВГС с клеточными компонентами неспецифического иммунитета.

2.3.3 Специфический противовирусный иммунитет при ВГС инфекции.

2.4 Экспериментальные модели ВГС-инфекции.

2.4.1 Репликация ВГС в клеточных линиях.:.

2.4.2 Модели ВГС-инфекции на животных.

2.5 Вакцины против гепатита С.

2.5.1 Что такое пептидные вакцины и в чём их преимущества?.

2.5.2 Этапы создания синтетической пептидной вакцины.

2.5.3 Выбор антигенных детерминант для иммуногенной конструкции.

2.5.4 Конструирование пептидного иммуногена.

2.5.5 Синтез иммуногена.

2.5.6 Адъюванты для пептидных вакцин.

2.5.7 Оценка эффективности и протективности иммунного ответа на синтетические пептидные иммуногены.

2.5.8 Синтетические пептидные вакцины против гепатита С.

3 Материалы и методы.

3.1 Химические реагенты и биологические препараты.

3.2 Растворители.

3.3 Оборудование и программное обеспечение.

3.4 Автоматический синтез пептидов-иммуногенных конструкций на твердофазном носителе.

3.5 Ручной синтез модельных пептидов на иглах.

3.6 Образование дисульфидных связей в пептидах.

3.7 Характеристика и очистка пептидов.

3.8 Масс-спектрометрический анализ.

3.9 Определение диаметра частиц иммуногенных конструкций.

3.10 Ультрафильтрация.

3.11 Получение сывороток крови от иммунизированных животных.

3.12 Получение препаратов из антисывороток животных.

3.13 Тестирование сывороток методом иммуноферментного анализа.

3.13.1 ИФА с использованием в качестве антигена синтетических пептидов.

3.13.2 ИФА с использованием в качестве антигена синтетических биотинилир о ванных пептидов.

3.13.3 ИФА с использованием в качестве антигена оболочечного белка Е2 или гетеродимера Е1Е2.

3.14 Тестирование препаратов на способность взаимодействия с вирусными частицами из плазмы крови больных гепатитом С.

3.14.1 Выделение тотальной РНК.

3.14.2 Проведение реакции обратной транскрипции.

3.14.3 Проведение полимеразной цепной реакции.

3.14.4 Детекция продуктов ПЦР-амплификации в агарозном геле.

3.14.5 Проведение реакции обратной транскрипции РНК и ПЦР-амплификации кДНК вируса гепатита С с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».

4 Результаты и их обсуждение.

4.1 Получение синтетических пептидных Т-В эпитопных конструкции на основе высококонсервативных фрагментов оболочечных белков ВГС.

4.1.1 Дизайн Т-В эпитопных конструкций.

4.1.2 Разработка нового регламента твердофазного пептидного синтеза исходя из Бтос-аминокислот.

4.1.3 Синтез иммуногенных конструкций.

4.2 Образование специфических антител в ответ на иммунизацию крыс Т-В-эпитопными конструкциями.

4.2.1 Изучение иммуногенности пептидных конструкций.

4.2.2 Картирование В-эпитопов антител из сывороток крови крыс, иммунизированных Т-В-эпитопными конструкциями.

4.3 Размер частиц в растворах иммуногенных конструкций.

4.4 Взаимодействие антител против пептидных иммуногенных конструкций с препаратами оболочечных белков ВГС.

4.5 Исследование иммуногенности смеси пептидных Т-В-эпитопных конструкций.

4.6 Взаимодействие препаратов полученных против пептидных иммуногенных конструкций, с нативными вирусными частицами.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Иммуногенные конструкции на основе фрагментов оболочечного белка E2 вируса гепатита C"

Актуальность проблемы

В настоящее время по приводимым в литературе данным около 3% мирового населения (170 миллионов) хронически инфицированы вирусом гепатита С (ВГС) и дополнительно от 3 до 4 миллионов новых инфицирований, по-видимому, случается каждый год [Schlaphoff, et al., 2007]. Иммунная система большинства больных гепатитом С не способна самостоятельно справиться с вирусом, что позволяет ВГС длительно реплицироваться в гепатоцитах и ряде других клеток [Ludwig et al., 2004]. У 3-10% инфицированных в течение примерно 20 лет развивается цирроз печени с возможным последующим риском развития гепатоцеллюлярной карциномы [Seeff et al., 2002].

Лечение инфекции гепатита С значительно улучшилось в течение последних лет, но общедоступной специфичной терапии всё ещё нет. Современная терапия комбинированием а-интерферона и рибавирина является достаточно дорогой и сопровождается побочными эффектами [Schlaphoff, et al., 2007]. Так же следует отметить довольно низкую эффективность такой терапии, особенно в отношении вируса первого генотипа (чувствительными к терапии оказываются менее 30% пациентов).

Разрабатываемые в настоящее время новые лекарственные средства для борьбы с вирусом гепатита С, нацеленные на ингибирование вирусных протеаз и РНК-зависимой РНК-полимеразы, ещё не прошли клинических испытаний [Webster et al., 2009]. Учитывая затраты на длительные исследования таких средств, можно полагать, что они будут дорогостоящими, кроме того, существует риск появления устойчивых к ним мутантных форм ВГС [Webster et al., 2009; Foster et al., 2004]. Таким образом, насущной необходимостью остаётся создание вакцин против ВГС, которые бы предотвращали распространение этой инфекции в человеческой популяции независимо от субтипа и/или мутантной формы вируса, или по крайней мере были бы способны защитить пациента от эволюции острого гепатита С в хронический [Elmowalid et al., 2007; Lauer et al., 2004].

Однако создание вакцины против ВГС осложняется высокой генетической изменчивостью ВГС, особенно белков его оболочки, ответственных за проникновение вируса в клетку-мишень, недостаточной информацией о рецепторах ВГС и взаимодействии вируса с иммунной системой организма-хозяина, чрезвычайной сложностью культивирования вируса в лабораторных условиях и отсутствием лабораторных моделей ВГС-инфекции на мелких животных.

По этим же причинам использование классических подходов к разработке вакцины, основанных на получении ослабленного или инактивированного штамма вируса, в случае ВГС малоэффективно и на данный момент невозможно. B-клеточный иммунный ответ на такую вакцину будет замедленным, слабым и в лучшем случае будет протективным в отношении того штамма вируса, который был использован для создания вакцины. Аттенуирование или инактивация вируса предполагает значительное торможение (вплоть до полного отсутствия) его репликации, что означает отсутствие стимуляции цитотоксического иммунного ответа при введении такой вакцины. Также следует учесть, что ещё не создано систем эффективной репликации ВГС in vitro, позволяющих нарабатывать вирус в препаративных количествах. Существующие за рубежом подходы к решению проблемы вакцинопрофилактики и вакцинотерапии гепатита С состоят в создании: 1) рекомбинантных вакцин, направленных на выработку специфических антител к оболочечным белкам вируса, и 2) ДНК-вакцин и пептидных цитотоксических Т-эпитопных вакцин, приводящих к пролиферации цитотоксических Т-лимфоцитов, специфично разрушающих клетки, инфицированные ВГС [Barrett, D.T., et al. 2009]. В первом случае из-за высокого генетического полиморфизма и генетической изменчивости вируса не удается вызвать образования антител, которые бы эффективно защищали организм от проникновения иного, чем использованный для получения вакцины, изолята ВГС. Во втором случае разработка эффективных вакцин сдерживается отсутствием надежных и эффективных систем доставки вакцин к лимфоидным органам. Решением данных проблем является разработка вакцин на основе принципиально новых искусственных синтетических и рекомбинантных иммуногенных конструкций, составленных с использованием методов биоинформатики и способных вызывать эффективный, стабильный и широкоспецифичный иммунный ответ против такого генетически изменчивого возбудителя, как ВГС.

Первыми компонентами вируса, распознаваемыми иммунной системой человека как чужеродные, являются его оболочечные белки El и Е2. Одновременно эти белки ответственны и за взаимодействие с рецепторами клеток-мишеней, и за проникновение в них вируса. Соответственно, антитела против оболочечных белков ВГС могут проявлять и по данным ряда исследователей действительно проявляют вируснейтрализующее и протективное действие [Farci et al., 1994; Zibert et al., 1997]. Однако оболочечные белки отличаются наибольшим генетическим разнообразием в зависимости от субтипа ВГС и наибольшей изменчивостью аминокислотных последовательностей в ходе многократных репликаций вируса в организме-хозяине [Ogata et al., 1991; Rispeter et al., 2000]. Это является одной из основных причин избегания ВГС иммунного ответа организма-хозяина. Большинство антител, полученных против целых оболочечных белков ВГС, вирионов или вирусоподобных частиц проявляют вируснейтрализующую и протективную активность в отношении только того генетического варианта ВГС, против которого выработаны эти антитела [Farci et al., 1994; Choo et al., 1994; Netski et al., 2005]. Тем не менее, оболочечные белки ВГС остаются объектом пристального внимания иммунохимиков и вирусологов, поскольку иммунный ответ на данные белки и на их отдельные фрагменты исследован недостаточно, особенно в условиях искусственной иммунизации. Важная роль на начальных стадиях инфицирования делает оболочечные белки привлекательными объектами вакцинологии, но высокая вариабельность их структуры ставит задачу поиска консервативных антигенных детерминант в этих белках и конструирование на основе этих детерминант искусственных иммуногенных конструкций, способных вызывать вируснейтрализующий и протективный иммунный ответ широкой специфичности в отношении различных изолятов ВГС.

Цель работы - разработка синтетических пептидных иммуногенных конструкций на основе фрагментов оболочечного белка Е2 ВГС.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи.

2. Синтез и очистка пептидов, представляющих собой составленные иммуногенные конструкции.

3. Исследование иммуногенности синтезированных пептидов и их смесей на лабораторных животных и способности вызывать образование антител, взаимодействующих с целым оболочечным белком Е2 и гетеродимером Е1Е2 ВГС.

4. Исследование взаимодействия антител, полученных в результате иммунизации лабораторных животных, с вирусными частицами из плазмы крови больных гепатитом С.

Научная новизна.

В работе впервые:

• получены новые синтетические Т-В и В-Т-эпитопные пептидные конструкции, содержащие в своем составе высококонсервативные фрагменты оболочечного белка Е2 ВГС;

• показана способность полученных синтетических Т-В-эпитопных пептидных конструкций вызывать образование антител, взаимодействующих с полноразмерным оболочечным белком Е2 и гетеродимером Е1Е2 ВГС;

• показана способность полученных синтетических Т-В-эпитопных пептидных конструкций вызывать образование антител, взаимодействующих с вирусными частицами из плазмы крови больных гепатитом С;

• впервые для синтеза пептидов длиной свыше 20 аминокислотных остатков применен новый регламент пептидного синтеза с использованием 4-метилпиперидина для удаления защитных Бтос-групп с альфа-аминогрупп растущей пептидной цепи.

Практическая значимость исследования

1. Созданные т бШсо и полученные путём химического синтеза в препаративных количествах шесть Т-В и В-Т-эпитопных пептидных конструкций, обладают высокой иммуногенностью у лабораторных животных и способны индуцировать образование антител взаимодействующих с полноразмерным белком Е2 и гетеродимером Е1Е2 ВГС. Использование смеси пептидных конструкций вместо отдельных пептидов повышает вероятность образования антител, взаимодействующих с оболочечными белками ВГС.

2. Антитела, полученные в ответ на синтетические иммуногенные конструкции, связывают нативный вирус из плазмы больных хронически инфицированных ВГС.

3. В водных растворах полученные пептидные иммуногенные конструкции образуют мультимерные частицы размером 6-22 нм, что, возможно, способствует стабилизации пептидов и является одной из причин их высокой иммуногенности.

4. Высокая иммуногенность Т-В и В-Т-эпитопных конструкций демонстрирует принципиальную возможность разработки кандидатной вакцины против гепатита С из набора искусственно сконструированных пептидов, состоящих из высококонсервативных фрагментов оболочечных белков ВГС, одни из которых обладают Т-эпитопной активностью, а другие представляют собой В-эпитопные мотивы. Апробация работы

Основные положения диссертации были представлены на VIII Российской научно-практической конференции «Вирусные гепатиты: эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика» (Москва, 2009 г.), 12th SAC Seminar «Combating Global Infections» (Листвянка - Иркутск, 2009), V Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития». (Москва, 2009). t

2 Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Мойса, Александр Александрович

6 Выводы

1 Из предполагаемых В-эпптопов и предсказанных Т-эпитопов, являющихся высококонсервативными фрагментами оболочечного белка Е2 вируса гепатита С, сконструированы и получены в виде синтетических препаратов 6 новых потенциально антигенных пептидных конструкций.

2 Внесена модификация в методику твердофазного пептидного синтеза и разработан новый регламент твердофазного пептидного синтеза с использованием 4-метилпиперидина вместо пиперидина для удаления защитных групп с альфа-аминогрупп растущей пептидной цепи.

3 Показана высокая иммуногенность шести из 8 исследованных синтетических пептидных конструкций в опытах по иммунизации крыс. Показано, что данные синтетические пептидные конструкции в водных растворах могут существовать в форме олигомеров.

4 Показано, что при иммунизации пептидными конструкциями СК^-Ов-СИЗ, СКЗ-СО-СЯ2, СНЯ-ОС-СГ^, СЬ^-СО-СНЯ, СК2-00-РКЮ, РБЖ1-СО-СК2 образуются антитела, взаимодействующие с оболочечным белком Е2 ВГС и гетеродимером Е1Е2 ВГС.

5 Полученные в результате иммунизации антипептпдные антитела связывали нативные вирусные частицы из плазмы больных ВГС.

5 Заключение

В данной работе экспериментально подтверждена принципиальная возможность создания полностью синтетических пептидных иммуногенных конструкций из отдельных фрагментов оболочечных белков ВГС. Впервые удалось получить высокоиммуногенные пептидные конструкции, составленные из высококонсервативных фрагментов оболочечного белка Е2, способные вызывать образование специфических антител, взаимодействующих не только с самими конструкциями и их В-эпитопными частями, но и связывающих оболочечные белки и вирусные частицы разных изолятов ВГС. Эти конструкции являются оригинальной разработкой, основанной на выполненных ранее исследованиях по структурно-функциональному картированию оболочечных белков ВГС в лаборатории белковой инженерии ИБМХ РАМН [Sobolev et al., 2000; Olenina et al., 2002, 2005; Кузьмина и др., 2009]. Тот факт, что данные конструкции проявили высокую иммуногенность при введении не только разным особям, но и видам животных (мышам [Фарафонова, 2005] и крысам), позволяет заключить, что использованный в конструкциях высококонсервативный фрагмент CR2, содержащий несколько предсказанных с помощью программного продукта SYFPEITH1 Т-хелперных эпитопных мотивов, можно поставить в один ряд с такими широкоспецифичными (promiscuous) Т-хелперными эпитопами, как фрагмент столбнячного токсина QYIKANSKFIGITE, два фрагмента белка Мсе2 Mycobacterium tuberculosis и некоторыми другими [Соболев и др., 2003, Sobolev et al., 2005]. Можно полагать, что при соединении фрагмента CR2 белка Е2 ВГС с другими потенциальными В-эпитопами будут получаться новые высокоиммуногенные конструкции. Следует отметить, что хотя различия в иммуногенности Т-В и ВТ конструкций относительно невелики, для каждой пары В- и Т-эпитопов необходимо экспериментально подбирать оптимальный порядок расположения эпитопов друг относительно друга.

Не исключено наличие Т-хелперной эпитопной активности и у фрагмента CR5, в котором также были предсказаны несколько Т-хелперных эпитопных мотивов. Однако, как показал неудачный эксперимент с конструкциями РКЕЛ-СЯ5, С115-РККЛ, при составлении подобных конструкций следует учитывать возможность агрегации умеренно гидрофобных пептидов, особенно содержащих довольно много остатков ароматических аминокислот, и вводить между В- и Т-эпитопной частями линкеры, препятствующие образованию агрегатов. В то же время умеренная мультимеризация пептидных конструкций в водном растворе, возможно, является одной из причин их высокой иммуногенности; не исключено, что она может послужить критерием отбора потенциально высокоиммуногенных конструкций.

Способность антител, полученных против синтетических пептидных конструкций, взаимодействовать с полноразмерными обол очечными белками ВГС и связывать вирусные частицы из плазмы крови больных, подтверждает возможность моделировать потенциальные линейные В-эпитопы белка Е2 ВГС с помощью синтетических пептидных конструкций, а не только пептидно-белковых конъюгатов, как было показано ранее [Оленина и др., 2003; Фарафонова, 2005].

Таким образом, разработанные и исследованные в данной работе синтетические пептидные конструкции могут служить практической и теоретической основой для разработки пептидной вакцины против гепатита С. Под практической основой понимается использование данных пептидных конструкций как готовых иммуногенов вакцины, под теоретической -применение их в качестве шаблона для разработки новых подобных конструкций, обладающих иной В- и Т-эпитопной специфичностью. Поскольку, как показали результаты данной работы, смесь пептидных конструкций, содержащих разные В- и Т-эпитопы, более эффективна как иммуноген, способный вызывать образование белок- и вирус-специфичных антител и стимулировать Т-лимфоциты, включение дополнительных В-Т-эпитопных пептидных конструкций может повысить иммуногенность композиции и способность вызывать антитела, специфически взаимодействующие с различными изолятами ВГС. При этом, возможно, какие-то наименее эффективные конструкции из числа разработанных будут исключены.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мойса, Александр Александрович, Москва

1. Вишневская, Т.В. Выявление маркеров репликации вируса гепатита с в мононуклеарных клетках периферической крови больных хроническим гепатитом С / Т.В. Вишневская и др. // Медицинская Иммунология 2008, Т. 10. №4. С. 397-404.

2. Ройт, А. / Иммунология / А. Ройт, Дж. Мейл Д. Бростофф. Пер. с англ. М. : Мир, 2000. С. 551.

3. Каплун, А.П. Липосомы и другие вещества / А.П. Каплун, Ле Банг Шон, Ю.М. Краснопольский, В.И. Швец // Вопросы медицинской химии. 1999. № 1. С. 3-12.

4. Колесанова, Е.Ф. Антигенная активность консервативных областей оболочечных белков вируса гепатита С / Е. Ф. Колесанова и др. // Аллергия, астма и клиническая иммунология. 2001. Том 5. № 1. С. 31-33.

5. Кузьмина, Т.И. Антигенность и В-эпитопное картирование оболочечного белка Е2 вируса гепатита С / Т.И. Кузьмина и др. // Биомедицинская. Химия. 2009. т.55. № 1. С. 32-40.

6. Куприянова, М.А. Синтетические пептидные конструкции на основе иммуноактивных фрагментов белка VPi вируса ящура штамма А22 / М.А. Куприянова и др. // Биоорганическая химия. 2000. Vol. 26. № 12. Р. 926932.

7. Соболев, Б.Н. Компьютерное конструирование вакцин / Б.Н. Соболев и др. // Биомедицинская химия. 2003. Том 49 № 4. С.309-332.

8. Соколов, А.В. Исследование взаимодействия церулоплазмина, лактоферрина и миелопероксидазы методом фотонной корреляционной спектроскопии / А.В. Соколов, В.Н. Прозоровский, В.Б. Васильев // Биохимия 2009 Т. 74. С. 1506-1509.

9. СП 3.3.2.561-96, утвержденные постановлением Госкомсанэпиднадзора России от 31.10.96. М. Информационно-издательский центр Минздрава России, 1998.

10. МУК 4.1/4.2.588-96. М. Информационно-издательский центр Минздрава России, 1998.

11. Учайкин, В.Ф. Вакцинопрофилактика / В.Ф. Учайкин, О.В. Шамшева. М. : Гэотар-Мед, 2001.

12. Фарафонова. Т.Е. Структурно-функциональная и антигенная характеристика высококонсервативных фрагментов оболочечных белков Е1 и Е2 вируса гепатита С. канд. биол. наук: 03.00.04 / Фарафонова, Т.Е. М., 2007.

13. Хаитов, P.M. Иммуномодуляторы: механизм действия и клиническое применение / P.M. Хаитов, Б.В. Пинегин // Иммунология. 2003. № 4. С. 196-202.

14. Ярилин, А.А. Основы иммунологии /А.А. Ярилин. М. : Медицина, 1999.

15. Abe, Т. Hepatitis С virus nonstructural protein 5А modulates the toll-like receptor-MyD88-dependent signaling pathway in macrophage cell lines / T. Abe et al. // Journal of Virology. 2007. Vol. 81. № 17. P. 8953-8966.

16. Aguilar, J.C. Vaccine adjuvants revisited / J.C. Aguilar, E.G. Rodriguez // Vaccine. 2007. Vol. 25. № 19. P. 3752-3762.

17. Ahmad. A. Role of NK and NKT cells in the immunopathogenesis of HCV-induced hepatitis / A. Ahmad, F. Alvarez // Journal of Leukocyte Biology. 2004. № 4. P. 743-59.

18. Amacker, M. Peptide-loaded chimeric influenza virosomes for efficient in vivo induction of cytotoxic T cells / M. Amacker et al. // International Immunology. 2005. Vol. 17. № 6. P. 695-704.

19. Alvarez-Lajonchere, L. Immunogenicity of CIGB-230 a therapeutic DNA vaccine prepaatiion, in HCV-chronically infected individuals in a Phase I clinical trial / L. Alvarez-Lajonchere et al. // Journal of Viral Hepatitis. 2009. Vol.16. №3. p. 156-167.

20. Barrett, D.T. Vaccines for biodefense and emerging and neglected diseases / D.T. Barrett, L.R. Stanberry. Elsevier Inc., 2009. 1450 P.

21. Alisi, A. Physical and functional interaction between HCV core protein and the different p73 isoforms / A. Alisi et al. // Oncogene 2003. № 22. P. 2573-2580.

22. Alter, M.J. The prevalence of hepatitis C virus infection in the United States, 1988 through 1994 / M.J. Alter et al. // The New England Journal of Medicine. 1999. Vol. 341. № 8. P. 556-562.

23. Anderson, J. Viral protease inhibitors / J. Anderson, C. Schiffer, S.K. Lee, R. Swanstrom // Handbook of Experimental Pharmacology. 2009. № 189. P. 85110.

24. Andre, P. Characterization of low- and very-low-density hepatitis C virus RNA-containing particles / P. Andre et al. // Journal of Virology. 2002. Vol. 76. № 14. P. 6919-6928.

25. Baril, M. Translation of the F protein of hepatitis C virus is initiated at a non-AUG codon in a +1 reading frame relative to the polyprotein / M. Baril, L. Brakier-Gingras //Nucleic Acids Research. 2005. № 33. P. 1474-1486.

26. Bartenschlager, R. Kinetic and structural analyses of hepatitis C virus polyprotein processing / R. Bartenschlager, L. Ahlborn-Laake, J. Mous, H. Jacobsen // Journal of Virology. 1994. Vol. 68. № 8. P. 5045-5055.

27. Barth, H: Cellular binding of hepatitis C virus envelope glycoprotein E2 requires cell surface heparan sulfate / H. Barth et al. // Journal of Biological Chemistry. 2003. Vol. 278. № 42. P. 41003-41012.

28. Barth, H. Viral and cellular determinants of the hepatitis C virus envelope-heparan sulfate interaction / H. Barth et al. // Journal of Virology. 2006., Vol. 80. №21. P. 10579-10590.

29. Ben-Yedidia, T. Design of peptide and polypeptide vaccines / T. Ben-Yedidia, R. Arnon // Current Opinion in Biotechnology. 1997. Vol. 8. № 4. P. 442-448.

30. Berg, C.P. Hepatitis C virus core protein induces apoptosis-like caspase independent cell death / C.P. Berg et al. // Virology Journal. 2009. № 6. P. 213-226.

31. Berland, K.M. Scanning two-photon fluctuation correlation spectroscopy: particle counting measurements for detection of molecular aggregation / K.M. Berland et al. //Biophysical Journal. 1996. Vol. 71. № 1. P. 410-420.

32. Bode, J.G. IFN-alpha antagonistic activity of HCV core protein involves induction of suppressor of cytokine signaling-3 / J.G. Bode et al. // FASEB Journal. 2003. Vol. 17. № 3. P. 488-490.

33. Bowen, D.G. Mutational escape from CD81 T cell immunity: HCV evolution from chimpanzees to man / D.G. Bowen, C.M. Walker // Journal of Experimental Medicine. 2005. № 201. P. 1709-1714.

34. Bowen, D.G. Variable patterns of programmed death-1 expression on fully functional memory T cells after spontaneous resolution of hepatitis C virus infection / D.G. Bowen et al. // Journal of Virology. 2008. Vol.82. № 10. P. 5109-5114.

35. Braun, J.R. The major subunit of the asialoglycoprotein receptor is expressed on the hepatocellular surface in mice lacking the minor receptor subunit / J.R. Braun et al. // Journal of Biological Chemistry. 1996. Vol. 271. № 35. P. 21160-21166.

36. Brazzoli, M. Folding and dimerization of hepatitis C virus El and E2 glycoproteins in stably transfected CHO cells / M. Brazzoli et al. // Virology. 2005. №332. P. 438-453.

37. Breiman, A. Inhibition of RIG-I-dependent signaling to the interferon pathway during hepatitis C virus expression and restoration of signaling by IKKepsilon / A. Breiman et al. // Journal of Virology. 2005. Vol. 79. № 7. P. 3969-3978.

38. Brown, E.A. Secondary structure of the 5' nontranslated regions of hepatitis C virus and pestivirus genomic RNAs / E.A. Brown, H. Zhang, L.H. Ping, S.M. Lemon // Nucleic Acids Research. 1992. № 20. P. 5041-5045.

39. Bruckdorfer, T. From production of peptides in milligram amounts for research to multi-tons quantities for drugs of the future / T. Bruckdorfer, O. Marder, F. Albericio // Current Pharmaceutical Biotechnology. 2004. Vol. 5. № 1. P. 29-43.

40. Bruni, R. A computational approach identifies two regions of Hepatitis C Virus El protein as interacting domains involved in viral fusion process / R.A. Bruni et al. // BMC Structural Biology. 2009. № 9. P. 48.

41. Budkowska, A. Mechanism of cell infection with hepatitis C virus (HCV)-a new paradigm in virus-cell interaction. /A. Budkowska // Polish Journal of Microbiology. 2009. Vol. 58. № 2. P. 93-98.

42. Burlone, M.E. Hepatitis C virus cell entry: role of lipoproteins and cellular receptors / M.E. Burlone, A. Budkowska // Journal of General Virology. 2009. № 90. P.1055-1070.

43. Callens, N. Basic residues in hypervariable region 1 of hepatitis C virus envelope glycoprotein E2 contribute to virus entry / N. Callens et al. // Journal of Virology. 2005. Vol. 79. №24. P. 15331-15341.

44. Guevin, C. Novel HCV replication mouse model using human hepatocellular carcinoma xenografts / C. Guevin, A. Lamarre, P. Labonte // Antiviral Research. 2009. Vol. 84. № 1. P. 14-22.

45. Cebrian, J. Synthesis of peptide sequences related to thrombospondin: factors affecting aspartimide by-product formation / J. Cebrian, V. Domingo, F. Reig // Journal of Peptide Research. 2003. № 62. P. 238-244.

46. Chang, K. Human apolipoproteine is required for infectivity and production of hepatitis C virus in cell culture / K. Chang et al. // Journal of Virology. 2007. Vol. 81. № 24. P. 13783-13793.

47. Chen, C.M. Direct interaction of hepatitis C virus core protein with the cellular lymphotoxin-beta receptor modulates the signal pathway of the lymphotoxin-beta receptor / C.M. Chen et al. // Journal of Virology. 1997. Vol. 71. № 12. P. 9417-9426.

48. Chen, Y. Characterization of aurintricarboxylic acid as a potent hepatitis C virus replicase inhibitor / Y. Chen et al. // Antiviral Chemistry & Chemotherapy. 2009. Vol. 20. № l.P. 19-36.

49. Choo, Q.L. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome / Q.L. Choo et al. // Science. 1989. № 244. P.359-362.

50. Choo, Q.L. Vaccination of chimpanzees against infection by hepatitis C virus / Choo et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1994. Vol. 91. № 4. P. 1294-1298.

51. Choukhi, A. Characterization of aggregates of hepatitis C virus glycoproteins / A. Choukhi et al. // Journal of General Virology. 1999. № 80. P. 3099-3107.

52. Chua, B.Y. A self-adjuvanting lipopeptide-based vaccine candidate for the treatment of hepatitis C virus infection / B.Y. Chua et al. // Vaccine. 2008. Vol. 26. № 37. P. 4866-4875.

53. Ciczora, Y. Transmembrane domains of hepatitis C virus envelope glycoproteins: residues involved in E1E2 heterodimerization and involvement of these domains in virus entry / Y. Ciczora et al. // Journal of Virology. 2007. Vol. 81. №5. P. 2372-2381.

54. Clayton, R.F. Analysis of antigenicity and topology of E2 glycoprotein present on recombinant hepatitis C virus-like particles / R.F. Clayton et al. // Journal of Virology. 2002. Vol. 76. № 15. P. 7672-7682.

55. Cocquerel, L. Topological changes in the transmembrane domains of hepatitis C virus envelope glycoproteins / L. Cocquerel et al. // EMBO Journal. 2002. № 21. P. 2893-2902.

56. Colin, C. Sensitivity and specificity of third-generation hepatitis C virus antibody detection assays: an analysis of the literature / C. Colin et al. // Journal of Viral Hepatitis. 2001. Vol. 8. № 2. P. 87-95.

57. Cormier, E.G. L-SIGN (CD209L) and DC-SIGN (CD209) mediate transinfection of liver cells by hepatitis C virus / E.G. Cormier et al. //

58. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 2004. Vol. 101. № 39 P. 14067-14072.

59. Cox, A.L. Cellular immune selection with hepatitis C virus persistence in humans / A.L. Cox et al. // Journal of Experimental Medicine. 2005. № 201. P. 1741-1752.

60. Cuevas, J.M. The role of positive selection in hepatitis C virus / J.M. Cuevas et al. // Infection, Genetics and Evolution. 2009. Vol. 9. № 5. P. 860-866.

61. Davis, G.L. A randomized, open-label study to evaluate the safety and pharmacokinetics of human hepatitis C immune globulin (Civacir) in liver transplant recipients / G.L. Davis et al. // Liver Transplantation. 2005. Vol. 11. № 8. P. 941-949.

62. Drummer, H.E. A conserved Gly436-Trp-Leu-Ala-Gly-Leu-Phe-Tyr motif in Hepatitis C virus glycoprotein E2 is a determinant of CD81 binding and viral entry / H.E. Drummer et al. // Journal of Virology. 2006. Vol. 80. № 16. P. 7844-7853.

63. D'Souza, E.D. Analysis of NS3-mediated processing of the hepatitis C virus non-structural region in vitro / E.D. D'Souza et al. // Journal of General Virology. 1994. № 75. P. 3469-3476.

64. Duesberg, U. Cell activation by synthetic lipopeptides of the hepatitis C virus (HCV)-core protein is mediated by toll like receptors (TLRs) 2 and 4 / U. Duesberg et al. // Immunology Letters. 2002. Vol. 84. № 2. P. 89-95.

65. Dubuisson, J. Folding, assembly and subcellular localization of HCV glycoproteins. / J. Dubuisson // Current Topics in Microbiology and Immunology. 2000. № 242. P. 135-148.

66. Egger, D. Expression of hepatitis C virus proteins induces distinct membrane alterations including a candidate viral replication complex / D. Egger et al. // Journal of Virology. 2002. Vol. 76. № 12. P. 5974-5984.

67. Eisenbarth, S.C. Innate instruction of adaptive immunity revisited: the inflammasome / S.C. Eisenbarth, R.A. Flavell // EMBO Molecular Medicine. 2009. Vol. 1. № 2. P. 92-98.

68. El-Awady, M.K. Antibody to El peptide of hepatitis C virus genotype 4 inhibits virus binding and entry to HepG2 cells in vitro / M.K. El-Awady et al. // World Journal of Gastroenterology. 2006. Vol. 12. № 16. P. 2530-2535.

69. El-Awady, M.K. Conserved peptides within the E2 region of Hepatitis C virus induce humoral and cellular responses in goats / M.K. El-Awady et al. // Virology Journal. 2009. № 6. P. 66-76.

70. Elmowalid, G.A. Immunization with hepatitis C virus-like particles results in control of hepatitis C virus infection in chimpanzees / G.A. Elmowalid et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 2007. Vol. 104. № 20. P.8427-8432.

71. Engler, O.B. A liposomal peptide vaccine inducing CD8+ T cells in HLA-A2.1 transgenic mice, which recognise human cells encoding hepatitis С virus (HCV) proteins / O.B. Engler et al. // Vaccine. 2004. Vol. 23. № 1. P. 58-68.

72. Evans, M.J. Claudin-1 is a hepatitis С virus co-receptor required for a late step in entry / M.J. Evans et al. // Nature. 2007. № 446. P. 801-805.

73. Farci, P. Lack of protective immunity against reinfection with hepatitis С vims / P. Farci et al. // Science. 1992. № 258. P. 135-140.

74. Farci, P. Prevention of hepatitis С virus infection in chimpanzees alter antibody-mediated in vitro neutralization / P. Farci et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 1994. Vol. 91. № 16. P. 7792-7796.

75. Farci, P. The outcome of acute hepatitis С predicted by the evolution of the viral quasispecies / P. Farci et al. // Science. 2000. Vol. 288. № 5464. P. 339-344.

76. Farrell, P.J. Interferon action: two distinct pathways for inhibition of protein synthesis by double-stranded RNA / P.J. Farrell et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 1978. Vol. 75. № 12. P. 5893-5897.

77. Firbas, C. Immunogenicity and safety of a novel therapeutic hepatitis С virus (HCV) peptide vaccine: a randomized, placebo controlled trial for dose optimization in 128 healthy subjects / C. Firbas et al. // Vaccine. 2006. Vol. 24. №20. P. 4343-4353.

78. Flint, M. The role of the hepatitis С virus glycoproteins in infection / M. Flint, J.A. McKeating // Reviews in Medical Virology. 2000. № 10. P. 101 -117.

79. Franciscus, A. Hepatitis С Treatments in Current Clinical Development. 2011. URL: http://www.hcvadvocate.org/hepatitis/hepC/HCVDrugs.html (дата обращения 09.03.2011).

80. Franck, N. Hepatitis C virus NS2 protein is phosphorylated by the protein kinase CK2 and targeted for degradation to the proteasome / N. Franck et al. // Journal of Virology. 2005. Vol. 79. № 5. P. 2700-2708.

81. Freund, J. / J. Freund // The mode of action immunological adjuvants. Adv Tuberc Res. 1956. Vol. 7. P. 50-55.

82. Friebe, P. Sequences in the 5' nontranslated region of hepatitis C virus required for RNA replication / P. Friebe et al. // Journal of Virology. 2001. Vol. 75. №24. P. 12047-12057.

83. Gale, M. Jr. Evasion of intracellular host defence by hepatitis C virus / M. Jr Gale, E.M. Foy //Nature. 2005. Vol. 436. №7053. P. 939-945.

84. Gao, L. Interactions between viral nonstructural proteins and host protein hVAP-33 mediate the formation of hepatitis C virus RNA replication complex on lipid raft / L. Gao et al. // Journal of Virology. 2004. Vol. 78. № 7. P. 34803488.

85. Gardner, J.P. L-SIGN (CD 209L) is a liver-specific capture receptor for hepatitis C virus / J.P Gardner et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 2003. Vol. 100. № 8. P. 4498-4503.

86. Gerlach, J.T. Minimal T-cell-stimulatory sequences and spectrum of HLA restriction of immunodominant CD4+ T-cell epitopes within hepatitis C virus NS3 and NS4 proteins / J.T. Gerlach et al. // Journal of Virology. 2005. Vol. 79. № 19. P. 12425-12433.

87. Goffard, A. Glycosylation of hepatitis C virus envelope proteins / A. Goffard, J. Dubuisson//Biochimie. 2003. Vol. 85. № (3-4). P. 295-301.

88. Goffard, A. Role of N-linked glycans in the functions of hepatitis C virus envelope glycoproteins / A. Goffard et al. // Journal of Virology. 2005. Vol. 79. № 13. P. 8400-8409.

89. Gonzalez, L.J. Differentiating alpha- and beta-aspartic acids by electrospray ionization and low-energy tandem mass spectrometry / L.J. Gonzalez et al. //

90. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2000. Vol. 14. № 22. P. 20922102.

91. Grakoui, A. Expression and identification of hepatitis C virus polyprotein cleavage products /A. Grakoui et al. // Journal of Virology. 1993. Vol. 67. № 3.P. 1385-1395.

92. Grakoui, A. HCV persistence and immune evasion in the absence of memory T cell help / A. Grakoui et al. // Science. 2003. Vol. 302. № 5645. P. 659-662.

93. Grove, J. Scavenger Receptor BI and BII Expression Levels Modulate Hepatitis C Virus Infectivity / J. Grove et al. // Journal of Virology. 2007. Vol. 81. № 7. P. 3162-3169.

94. Hadlock, K.G. Human monoclonal antibodies that inhibit binding of hepatitis C virus E2 protein to CD81 and recognize conserved conformational epitopes / K.G. Hadlock et al. // Journal of Virology. 2000. Vol. 74. № 22. P.10407-10416.

95. Helle, F. The neutralizing activity of anti-hepatitis C virus antibodies is modulated by specific glycans on the E2 envelope protein / F. Helle et al. // Journal of Virology. 2007. Vol. 81. № 15. P. 8101-8111.

96. Higginbottom, A. Identification of amino acid residues in CD81 critical for interaction with hepatitis C virus envelope glycoprotein E2 / A. Higginbottom et al. // Journal of Virology. 2000. Vol. 74. № 8. P. 3642-3649.

97. Hirowatari, Y. Two proteinase activities in HCV polypeptide expressed in insect cells using baculovirus vector / Y. Hirowatari et al. // Archives of Virology. 1993. Vol. 133. № (3-4). P. 349-356.

98. Houghton, M. Prospects for a vaccine against the hepatitis C virus / M. Houghton, Abrignani S. //Nature. 2005. Vol. 436. № 7053. P. 961-966.

99. Hsieh, T.Y. Hepatitis C virus core protein interacts with heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K / T.Y. Hsieh et al. // Journal of Biological Chemistry. 1998. Vol. 273. № 28. P. 17651-17659.

100. Hsu. M. Hepatitis C virus glycoproteins mediate pH-dependent cell entry of pseudotyped retroviral particles / M. Hsu et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences USA. -2003. Vol. 100. № 12. P. 7271-7276.

101. Ilan, E. The hepatitis C virus (HCV)-Trimera mouse: a model for evaluation of agents against HCV / E. Ilan et al. // Journal of Infectious Diseases. 2002. Vol. 185. №2. P. 153-161.

102. Ishii, K. High titers of antibodies inhibiting the binding of envelope to human cells correlate with natural resolution of chronic hepatitis C / K. Ishii et al. // Hepatology. 1998. Vol. 28. № 4. P. 1117-1120.

103. Jackson, D.C. The central role played by peptides in the immune response and the design of peptide-based vaccines against infectious diseases and cancer / D.C. Jackson et al. // Curr Drug Targets. 2002. Vol. 3. № 2. P. 175-196.

104. Kabelitz, D. Innate immunity cross-talk with adaptive immunity through pattern recognition receptors and cytokines / D. Kabelitz, R. Medzhitov // Current Opinion in Immunology. 2007. Vol. 19. № l.P. 1-3.

105. Kaito, M. Hepatitis C virus particle detected by immunoelectron microscopic study / M. Kaito et al. // Journal of General Virology. 1994. Vol. 75. № 7. P. 1755-1760.

106. Kalyuzhny, A.E. Handbook of ELISPOT. Methods and Protocols / A.E. Kalyuzhny. Ed. Humana Press, 2005.

107. Kanto, T. Virus associated innate immunity in liver / T. Kanto et al. // Frontiers in Bioscience. 2008. № 13. P. 6183-6192.

108. Kato, T. Sequence analysis of hepatitis C virus isolated from a fulminant hepatitis patient / T. Kato et al. // Journal of Medical Virology. 2001. Vol. 64. № 3. P. 334-339.

109. Kawai, T. TLR signaling / T. Kawai, S. Akira // Cell Death & Differentiation. -2007. Vol. 19. № l.P. 24-32.

110. Keck, Z.Y. Hepatitis C virus E2 has three immunogenic domains containing conformational epitopes with distinct properties and biological functions / Z.Y. Keck et al. // Journal of Virology. 2004. Vol. 78. № 17. P. 9224-92232.

111. Keck, Z.Y. Human monoclonal antibody to hepatitis C virus El glycoprotein that blocks virus attachment and viral infectivity / Z.Y. Keck et al. // Journal of Virology. 2004. Vol. 78. № 13. P.7257-7263.

112. Kerr, I.M. pppA2'p5'A2'p5'A: an inhibitor of protein synthesis synthesized with an enzyme fraction from interferon-treated cells / I.M. Kerr, R.E. Brown // Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1978. Vol. 75. № 1. P. 256-260.

113. Kim, D.W. C-terminal domain of the hepatitis C virus NS3 protein contains an RNA helicase activity / D.W. Kim, Y. Gwack, J.H. Han, J. Choe // Biochemical and Biophysical Research Communications. 1995. Vol. 215. № l.P. 160-166.

114. Kim, J.L. Crystal structure of the hepatitis C virus NS3 protease domain complexed with a synthetic NS4A cofactor peptide / J.L. Kim et al. // Cell. -1996. Vol. 87. № 2. P. 343-355.

115. Klade, C.S. Hepatitis C virus-specific T cell responses against conserved regions in recovered patients / C.S. Klade et al. // Vaccine. 2009. Vol. 27. № 23. P. 3099-3108.

116. Klein, K.C. Identification of residues in the hepatitis C virus core protein that are critical for capsid assembly in a cell-free system / K.C. Klein, S.R. Dellos, J.R. Lingappa// Journal of Virology. 2005. Vol. 79. № 11. P. 6814-6826.

117. Krey, T. The disulfide bonds in glycoprotein E2 of hepatitis C virus reveal the tertiary organization of the molecule / T. Krey et al. // PLoS Pathogens. 2010. Vol. 6. Issue 2. el000762.

118. Kriegs, M. The hepatitis C virus non-structural NS5A protein impairs both the innate and adaptive hepatic immune response in vivo / M. Kriegs et al. // Journal of Biological Chemistry. 2009. Vol. 284. № 41. P. 28343-28351.

119. Kuntzen, T. Viral sequence evolution in acute hepatitis C virus infection / T. Kuntzen et al. // Journal of Virology. 2007. Vol. 81. № 21. P. 11658-11668.

120. Kuraeva, T.E. Immunogenicity of highly conserved fragments of hepatitis C virus envelope proteins El and E2 / T.E. Kuraeva et al. // Peptides Bridges between Disciplines. 2005. P. 178-179.

121. Lauer, G.M. High resolution analysis of cellular immune responses in resolved and persistent hepatitis C virus infection / G.M. Lauer et al. // Gastroenterology. 2004. Vol. 127. № 3. P. 924-936.

122. Li, K. Immune evasion by hepatitis C virus NS3/4A protease-mediated cleavage of the Toll-like receptor 3 adaptor protein TRIF / K. Li et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 2005. Vol. 102. № 8. P. 2992-2997.

123. Lin, C. In vitro studies of cross-resistance mutations against two hepatitis C virus serine protease inhibitors, VX-950 and BILN 2061 / C. Lin et al. // Journal of Biological Chemistry. 2005. Vol. 280. № 44. P. 36784-36791.

124. Lindenbach, B.D. Complete replication of Hepatitis C virus in cell culture / B.D. Lindenbach et al. // Science. 2005. Vol.309. № 5734. P. 623-626.

125. Liu, S. Tight junction proteins Claudin-1 and occludin control hepatitis C virus entry and are downregulated during infection to prevent superinfection / S. Liu et al. // Journal of Virology. 2009. Vol. 83. № 4. P. 2011-2014.

126. Lloyd-Williams P. Chemical approaches to the synthesis of peptides and proteins / P. Lloyd-Williams, F. Albericio, E. Giralt. New York. : CRC Press LLC, 1997.

127. Lohmann, V. Processing pathways of the hepatitis C virus proteins / V. Lohmann, J.O. Koch, R. Bartenschlager // Journal of Hepatology. 1996. Vol. 24. №2. P. 11-19.

128. Lohmann, V. Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line / V. Lohmann et al. // Science. 1999. Vol. 285. № 5424. P. 110-113.

129. Longman, R.S. Normal functional capacity in circulating myeloid and plasmacytoid dendritic cells in patients with chronic hepatitis C / R.S. Longman et al. // Journal of Infectious Diseases. 2005. Vol. 192.№ 3 P. 497-503.

130. Love, R.A. The crystal structure of hepatitis C virus NS3 proteinase reveals a trypsin-like fold and a structural zinc binding site / R.A. Love et al. // Cell. 1996. Vol. 87. №2. P. 331-342.

131. Lozach, P.Y. C-type lectins L-SIGN and DC-SIGN capture and transmit infectious hepatitis C virus pseudotype particles / P.Y. Lozach et al. // Journal of Biological Chemistry. 2004. Vol. 279. № 31. P. 32035-32045.

132. Lu, X. Linear epitope mapping by native mass spectrometry / X. Lu, M.R. DeFelippis, L. Huang // Analytical Biochemistry. 2009. Vol. 395. № 1. P. 100107.

133. Ludwig, I.S. Hepatitis C virus targets DC-SIGN and L-SIGN to escape lysosomal degradation / I.S. Ludwig et al. // Journal of Virology. 2004. Vol. 78. № 15. P. 8322-8332

134. Lyko, F. Signal sequence processing in rough microsomes / F. Lyko et al. // Journal of Biological Chemistry. 1995. Vol. 270. № 34. P. 19873-19878.

135. Lytle, J.R. Domains on the hepatitis C virus internal ribosome entry site for 40s subunit binding / J.R. Lytle, L. Wu, H.D. Robertson // RNA. 2002. Vol. 8. № 8. P. 1045-1055.

136. Machiels, J.P. Peptide-based cancer vaccines. / J.P. Machiels, N. van Baren, M. Marchand // Seminars in Oncology. 2002. Vol. 29. № 5. P. 494-502.

137. Majewska, M. The role of Toll-like receptors (TLR) in innate and adaptive immune responses and their function in immune response regulation / V. Majewska, M. Szczepanik // Postepy Higieny i Medycyny Doswiadczalnej. 2006. №60. P. 52-63.

138. Mamiya, N. C virus core protein binds to a DEAD box RNA helicase Hepatitis / N. Mamiya, H.J. Worman // Journal of Biological Chemistry. 1999. Vol. 274. № 22. P. 15751-15756.

139. Manns, M.P. Treating viral hepatitis C: efficacy, side effects, and complications / M.P. Manns, H. Wedemeyer, M. Cornberg // Gut. 2006. Vol. 55. № 9. P. 13501359.

140. Martire, G. Hepatitis C virus structural proteins reside in the endoplasmic reticulum as well as in the intermediate compartment/cis-Golgi complex region of stably transfected cells / G. Martire et al. // Virology. 2001. 280. P. 176-182.

141. Masciopinto, F. Expression of human CD81 in transgenic mice does not confer susceptibility to hepatitis C virus infection / F. Masciopinto et al. // Virology. 2002. Vol. 304. №2. P. 187-196.

142. McCaffrey, K. The variable regions of Hepatitis C Virus glycoprotein E2 have an essential structural role in glycoprotein assembly and virion infectivity / K. McCaffrey et al. // Journal of General Virology. 2011. Vol. 92. № 1. P. 112121.

143. Miyanari, Y. The lipid droplet is an important organelle for hepatitis C virus production / Y. Miyanari et al. // Nature Cell Biology. 2007. Vol. 9. № 9. P. 1089-1097.

144. Meertens, L. The tight junction proteins claudin-1, -6, and -9 are entry cofactors for hepatitis C virus / L. Meertens et al. // J Virol. 2008. 82. P. 3555-3560.

145. Meola, A. Binding of hepatitis C virus E2 glycoprotein to CD81 does not correlate with species permissiveness to infection / A. Meola et al. // Journal of Virology. 2000. Vol. 74. № 13. P. 5933-5938.

146. Mergler, M. The aspartimide problem in Fmoc-based SPPS / M. Mergler et al. //Journal of Peptide Science. 2003. Vol. 9. № 1. P. 36-46.

147. Molina, S. The low-density lipoprotein receptor plays a role in the infection of primary human hepatocytes by hepatitis C virus / S. Molina et al. // Journal of Hepatology. 2007. Vol. 46. № 3. P. 411-419.

148. Moss, C.X. Reconstruction of a pathway of antigen processing and class II MHC peptide capture / C.X. Moss, T.I. Tree, C. Watts // EMBO Journal. -2007. Vol. 26. № 8. P. 2137-2147.

149. Multipin peptide synthesis software manual. Cleavable Peptides Manual 1997 Australia

150. Steinman, R.M. Dendritic cells: Translating innate to adaptive immunity / R.M. Steinman, H. Hemmi // Current Topics in Microbiology and Immunology. 2006. Vol. 311. P. 17-58.

151. Nasser, S. CD4+ T cell responses in hepatitis C virus infection / S. Nasser, K. Paul // World Journal of Gastroenterology. 2007. Vol. 13. № 36. P. 4831-4838.

152. Negro, F. Hepatitis C virus, steatosis and lipid abnormalities: clinical and pathogenic data / F. Negro, A.J. Sanyal" // Liver International. 2009. Vol. 29. Suppl. 2. P. 26-37.

153. Netski D.M. Humoral immune response in acute hepatitis C virus infection / D.M Netski et al. // Clinical Infectious Diseases. 2005. Vol. 41. № 5. P. 667675.

154. Nevens, F. A pilot study of therapeutic vaccination with envelope protein El in 35 patients with chronic hepatitis C. /F. Nevens et al. // Hepatology. 2003. Vol. 38. №5. P. 1289-1296.

155. Nikolaeva, L.I. Virus-specific antibody titres in different phases of hepatitis C virus infection / L.I. Nikolaeva et al. // Journal of Viral Hepatitis. 2002. Vol. 9. № 6. P. 429-437.

156. Ogata, N. Nucleotide sequence and mutation rate of the H strain of hepatitis C virus / N. Ogata et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1991. Vol. 88. № 8. P. 3392-3396.

157. Olenina, L.V. Mapping and characterization of B cell linear epitopes in the conservative regions of hepatitis C virus envelope glycoproteins / L.V. Olenina et al. // Journal of Viral Hepatitis. 2002. Vol. 9. № 3. P. 174-182.

158. Olenina, L.V. Identification of glycosaminoglycan-binding sites within hepatitis C virus envelope glycoprotein E2 / L.V. Olenina et al. // Journal of Viral Hepatitis. 2005. Vol. 12. № 6. P. 584-593.

159. Op De Beeck, A. The transmembrane domains of hepatitis C virus envelope glycoproteins El and E2 play a major role in heterodimerization /A. Op De

160. Beeck et al. // Journal of Biological Chemistry. 2000. Vol. 275. № 40. P. 31428-31437.

161. Op De Beeck, A. Biogenesis of hepatitis C virus envelope glycoproteins / A. Op De Beeck, L. Cocquerel, J. Dubuisson // Journal of General Virology. 2001. Vol. 82. Pt. 11 2589-2595.

162. Otsuka, M. Interaction between the HCV NS3 protein and the host TBK1 protein leads to inhibition of cellular antiviral responses / M. Otsuka et al. // Hepatology. 2005. Vol. 41. № 5. p. 1004-1012.

163. Owsianka, A. Functional analysis of hepatitis C virus E2 glycoproteins and virus-like particles reveals structural dissimilarities between different forms of E2 / A.M. Owsianka et al. // Journal of General Virology. 2001. Vol. 82. Pt 8. P. 1877-1883.

164. Owsianka, A.M. Hepatitis C virus core protein interacts with a human DEAD box protein DDX3 /A.M. Owsianka, A.H. Patel // Virology. 1999. Vol. 257. № 2. P. 330-340.

165. Owsianka, A.M. Identification of conserved residues in the E2 envelope glycoprotein of the hepatitis C virus that are critical for CD81 binding / A.M. Owsianka et al. // Journal of General Virology. -2006. Vol. 80. № 17. P. 86958704.

166. Panina-Bordignon, P. Universally immunogenic T cell epitopes: promiscuous binding to human MHC class II and promiscuous recognition by T cells / P. Panina-Bordignon et al. // European Journal of Immunology. 1989. Vol. 19. № 12. P. 2237-2242.

167. Pasquinelli, C. Hepatitis C virus core and E2 protein expression in transgenic mice / C. Pasquinelli et al. // Hepatology. 1997. Vol. 25. № 3. P. 719-727.

168. Pawlotsky, J.M. Therapy of hepatitis C: from empiricism to cure / J.M. Pawlotsky//Hepatology. 2006. Vol. 43. Suppl. 1. P. 207-220.

169. Penin, F. Structural biology of hepatitis C virus / F. Penin et al. // Hepatology. 2004. Vol. 39. №1. P. 5-19.

170. Perotti, M. Identification of a broadly cross-reacting and neutralizing human monoclonal antibody directed against the hepatitis C virus E2 protein / M. Perotti et al. // Journal of Virology. 2008. Vol. 82. № 2. P. 1047-1052.

171. Perry, L.C. New approaches to prediction of immune responses to therapeutic proteins during preclinical development / L.C Perry, T.D. Jones, M.P. Baker // Drugs in R&D. 2008. Vol. 9. № 6. P. 385-396.

172. Pestova, T.V. The joining of ribosomal subunits in eukaryotes requires eIF5B / T.V. Pestova et al. //Nature. 2000. Vol. 403. № 6767. P. 332-335.

173. Pietschmann, T. Persistent and transient replication of full-length hepatitis C virus genomes in cell culture / T. Pietschmann et al. // Journal of Virology. 2002. Vol. 76. № 8. P. 4008-4021.

174. Pileri, P. Binding of hepatitis C virus to CD81 / P. Pileri et al. // Science. 1998. Vol.282. P. 938-941.

175. Ploss, A. Human occludin is a hepatitis C virus entry factor required for infection of mouse cells / A. Ploss et al. // Nature. 2009. Vol. 457. № 7231. P. 882-886.

176. Polakos, N.K. Characterization of hepatitis C virus core-specific immune responses primed in rhesus macaques by a nonclassical ISCOM vaccine / N.K. Polakos et al. // Journal of Immunology. 2001. Vol. 166. № 5. P. 3589-3598.

177. Rabenstein, D.L. Heparin and heparan sulfate: structure and function / D.L. Rabenstein // Natural Product Reports Articles. 2002. Vol. 19. № 3. P. 312-331.

178. Rappuoli, R. Reverse vaccinology, a genome-based approach to vaccine development / R. Rappuoli // Vaccine. 2001. Vol. 19. № (17-19). P. 2688-2691.

179. Reed, K.E. Overview of hepatitis C virus genome structure, polyprotein processing, and protein properties / K.E. Reed, C.M. Rice // Current Topics in Microbiology and Immunology. 2000. Vol. 242. P. 55-84.

180. Reynolds, G.M. Hepatitis C virus receptor expression in normal and diseased liver tissue / G.M. Reynolds et al. // Hepatology. 2008. Vol. 47. № 2. P. 418427.

181. Rispeter, K. Hepatitis C Virus Variability: Sequence Analysis of an Isolate after 10 Years of Chronic Infection / K. Rispeter et al. // Virus Genes. 2000. -Vol. 21. №3. P. 179-188.

182. Roggen, E.L. Recent developments with B-cell epitope identification for predictive studies / E.L. Roggen // Journal of Immunotoxicology. 2006. Vol. 3. №3. P. 137-149.

183. Roestenberg, M. Safety and Immunogenicity of a Recombinant Plasmodium falciparum AMA1 Malaria Vaccine Adjuvanted with Alhydrogel™, Montanide ISA 720 or AS02 / M. Roestenberg et al. // PLoS One. 2008. Vol. 3. Issue 12. e3960. 1-12.

184. Rosenberg S. Recent advances in the molecular biology of hepatitis C virus / S. Rosenberg // Journal of molecular biology. 2001. Vol. 313. P. 451 -464.198.

185. Russ, W.P. The GxxxG motif: a framework for transmembrane helix-helix association / W.P. Russ, D.M. Engelman // Journal of Molecular Biology. 2000. Vol. 296. №3. P. 911-919.

186. Sansonno, D. Hepatitis C virus infection involves CD34(+) hematopoietic progenitor cells in hepatitis C virus chronic carriers / D. Sansonno et al. // Blood. 1998. Vol. 92. № 9. P. 3328-3337.

187. Saunier, B. Role of the asialoglycoprotein receptor in binding and entry of hepatitis C virus structural proteins in cultured human hepatocytes / B. Saunier et al. // Journal of Virology. 2003. Vol. 77. № 1. P. 546-559.

188. Schinazi, R.F. HCV drug discovery aimed at viral eradication / R.F. Schinazi, L. Bassit, C. Gavegnano // Journal of Viral Hepatitis. 2010. Vol. 17. № 2. P. 77-90.

189. Schiano, T.D. Monoclonal antibody HCV-AbXTL68 in patients undergoing liver transplantation for HCV: results of a phase 2 randomized study / T.D. Schiano et al. // Liver Transplantation. 2006. Vol. 12. № 9. P. 1381-1389.

190. Schlaphoff, V. Functional and phenotypic characterization of peptide-vaccine-induced HCV-specific CD8+ T cells in healthy individuals and chronic hepatitis C patients / V. Schlaphoff et al. // Vaccine. 2007. Vol. 25. № (37-38). P. 67936806.

191. Schuler, M.M. SYFPEITHI: database for searching and T-cell epitope prediction / M.M. Schuler, M.D. Nastke, S. Stevanovikc // Methods in Molecular Biology. 2007. Vol. 409. P. 75-93.

192. Seeff, L. The National Institutes of Health Consensus Development Conference Management of Hepatitis C / L. Seeff, J.H. Hoofnagle // Appendix. Clinics In Liver Disease. 2002. № 7. P. 261-287.

193. Sesardic, D. Synthetic peptide vaccines / D. Sesardic // Journal of Medical Microbiology. 1993. Vol. 39. P. 241-242.

194. Shata, M.T. Characterization of the immune response against hepatitis C infection in recovered, and chronically infected chimpanzees / M.T. Shata et al. // Journal of Viral Hepatitis. 2002. Vol. 9. № 6. P. 400-410.

195. Shim, J.H. Selection of 3'-template bases and initiating nucleotides by hepatitis C virus NS5B RNA-dependent RNA polymerase / J.H. Shim et al. // Journal of Virology. 2002. Vol. 76. № 14. P. 7030-7039.

196. Shimizu, Y.K. Hepatitis C Virus: Detection of intracellular virus particles by electron microscopy / Y.K. Shimizu et al. // Hepatology. 1996. Vol. 23. № 2. P. 205-209.

197. Shimoike, T. Interaction of hepatitis C virus core protein with viral sense RNA and suppression of its translation / T. Shimoike et al. // Journal of Virology. 1999. Vol. 73. № 12. P. 9718-9725.

198. Shoji, I. Internal processing of hepatitis C virus NS3 protein /1. Shoji et al. // Virology. 1999. Vol. 254. №2. P. 315-323.

199. Shoukry, N.H. Memory CD8+ T cells are required for protection from persistent hepatitis C virus infection / N.H. Shoukry et al. // Journal of Experimental Medicine. 2003. Vol. 197. № 12. P. 1645-1655.

200. Shukla D.D., Hoyne P.A., Ward C.W. Evaluation of complete genome sequences and sequences of individual gene products for the classification of hepatitis C viruses // Archives of virology. 1995. Vol. 140. № 10. P. 1747-1761.

201. Sieker, F. Predicting affinity and specificity of antigenic peptide binding to major histocompatibility class I molecules / F. Sieker, A. May, M. Zacharias // Current protein and peptide science. 2009. Vol. 10. № 3. P. 286-296.

202. Silberstein, S. Biochemistry, molecular biology, and genetics of the oligosaccharyltransferase / S. Silberstein, R. Gilmore // FASEB Journal. 1996. Vol. 10. №8. P. 849-858.

203. Smyk-Pearson, S. Spontaneous recovery in acute human hepatitis C virus infection: functional T-cell thresholds and relative importance of CD4 help / S. Smyk-Pearson et al. // Journal of Virology. 2008. Vol. 82. № 4. P. 1827-1837.

204. Sobolev B.N. Computer Design of Vaccines: Approaches, Software Tools and Informational Resources /B.N. Sobolev et al. // Current Computer-Aided Drug Design. 2005. Vol. 1. № 2. P. 207-222.

205. Steinmann, D. Inhibition of hepatitis C virus-like particle binding to target cells by antiviral antibodies in acute and chronic hepatitis C I D. Steinmann et al. // Journal of Virology. 2004. Vol. 78. № 17. P. 9030-9040.

206. Su, A.I. Genomic analysis of the host response to hepatitis C virus infection /A.I. Su et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 2002. Vol. 99. № 24. P. 15669-15674.

207. Sugimoto, K. Suppression of HCV-specific T cells without differential hierarchy demonstrated ex vivo in persistent HCV infection / K. Sugimoto et al. // Hepatology. 2003. Vol. 38. №6. P. 1437-1448.

208. Takaki, A.M. Cellular immune responses persist and humoral responses decrease two decades after recovery from a single-source outbreak of hepatitis C / A.M. Takaki et al. // Nature Medicine. 2000. Vol. 6. № 5. P. 578-582.

209. Tam, J. P. Peptide antigens. Immunization with peptide carrier complexes: traditional and multiple antigen peptide system / J.P. Tam New York. : G. B. Wisdom. Oxford University Press, 1994 P. 83-115.

210. Tam, J.P. Synthetic peptide vaccine design: synthesis and properties of a high-density multiple antigenic peptide system / J.P. Tam // Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1988. Vol. 85. № 15. P. 5409-5413.

211. Taylor, D.R. Inhibition of the interferon-inducible protein kinase PKR by HCV E2 protein / D.R. Taylor et al. // Science. 1999. Vol. 285. № 5424. P. 107-110.

212. Taylor, D.R. New antiviral pathway that mediates hepatitis C virus replicon interferon sensitivity through ADAR1 / D.R. Taylor et al. // Journal of Virology. 2005. Vol. 79. № 10. P. 6291-6298.

213. Taylor, A. Conservation of hydrophobicity within viral envelope glycoproteins reveals a putative hepatitis C virus fusion peptide / A. Taylor et al. // Protein and Peptide Letters. 2009. Vol. 16. № 7. P. 815-822.

214. Terenzi, F. Induction and mode of action of the viral stress-inducible murine proteins, P56 and P54 / F. Terenzi, S. Pal, G.C. Sen // Virology. 2005. Vol. 340. № 1. P.l 16-124.

215. Tester, I. Immune evasion versus recovery after acute hepatitis C virus infection from a shared source / I. Tester et al. // Journal of Experimental Medicine. -2005. Vol. 201. № 11. P. 1725-1731.

216. Teixeira, A. The use of Dodt as a Non-Malodorous Scavenger in Fmoc-Based Peptide Synthesis / A. Teixeira et al. // Protein and Peptide Letters. 2002 Vol. 9. №5. P. 379-385.

217. Thimme, R. Determinants of viral clearance and persistence during acute hepatitis C virus infection / R. Thimme et al. // Journal of Experimental Medicine. 2001. Vol. 194. № 10. P. 1395-1406.

218. Thomssen, R. Association of hepatitis C virus in human sera with beta-lipoprotein / R. Thomssen et al. // Medical Microbiology and Immunology. 1992. Vol.181. № 5. P. 293-300.

219. Tickler, A.K. Improved preparation of amyloid-beta peptides using DBU as Nalpha-Fmoc deprotection reagent / A.K. Tickler, C.J. Barrow, J.D. Wade // Journal of Peptide Science. 2001. Vol. 7. № 9. P. 488-494.

220. Tong, X. Identification and analysis of fitness of resistance mutations against the HCV protease inhibitor SCH 503034 /X. Tong et al. // Antiviral Research. 2006. Vol. 70. № 2. P. 28-38.

221. Tribbick, G. Multipin peptide libraries for antibody and receptor epitope screening and characterization / G.Tribbick et al. // Journal of Immunological Methods. 2002. Vol. 267. № 1. P. 27-35.

222. Troesch, M. Study of a novel hypervariable region in hepatitis C virus (HCV) E2 envelope glycoprotein / M. Troesch et al. // Virology. 2006. Vol. 352. № 2. P. 357-367.

223. Valladeau, J. Immature human dendritic cells express asialoglycoprotein receptor isoforms for efficient receptor-mediated endocytosis / J. Valladeau et al. // Journal of Immunology. 2001. Vol. 167. № 10. P. 5767-5774.

224. Van Der Burg, S.H. Improved peptide vaccine strategies, creating synthetic artificial infections to maximize immune efficacy / S.H. van der Burg et al. // Advanced Drug Delivery Reviews. 2006. Vol. 58. № 8. P. 916-930.

225. Van Regenmortel, M.H. Synthetic peptides as antigens /M.H. Van Regenmortel, S. Muller. Amsterdam. : Elsevier Science, 1999.

226. Vanwolleghem, T. Polyclonal immunoglobulins from a chronic hepatitis C virus patient protect human liver-chimeric mice from infection with a homologous hepatitis C virus strain / T. Vanwolleghem et al. // Hepatology. 2008. - Vol. 47.-№6.-P. 1846-1855.

227. Vogel, F.R. Progress in immunologic adjuvant development: 1982 2002 / F.R. Vogel, C.R. Alving // The Jordan Report, 20th Anniversary. Accelerated Development of Vaccines. 2002. P. 47-51.

228. Wade, J.D. Base-induced side reactions in Fmoc-solid phase peptide synthesis: Minimization by use of piperazine as Na-deprotectionreagent / J.D. Wade et al. // Letters in Peptide Science. 2000. Vol. 7. № 2. P. 107-112.

229. Wagoner, J. Regulation of CXCL-8 (interleukin-8) induction by double-stranded RNA signaling pathways during hepatitis C virus infection / J. Wagoner et al. //Journal of Virology. 2007. Vol. 81. № 1. P. 309-318.

230. Wakita, T. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome / T. Wakita et al. // Nature Medicine. 2005. Vol. 11. № 7. P. 791-796.

231. Walewski, J.L. Evidence for a new hepatitis C virus antigen encoded in an overlapping reading frame / J.L. Walewski et al. // RNA. 2001. Vol. 7. № 5. P. 710-721.

232. Wang, C. Alpha interferon induces distinct translational control programs to suppress hepatitis C virus RNA replication / C. Wang et al. // Journal of Virology. 2003. Vol. 77. № 7. P. 3898-3912.

233. Webster, D.P. Development of novel treatments for hepatitis C /D.P. Webster, P. Klenerman, J. Collier, K.J. Jeffery // Lancet Infectious Diseases. 2009. Vol. 9. №2. P. 108-117.

234. Woollard, D.J. Characterization of HCV specific Patr class II restricted CD4 + T cell responses in an acutely infected chimpanzee / D.J. Woollard et al. // Hepatology. 2003. Vol. 38. № 5. P. 1297-1306.

235. Yanagi, M. Transcripts of a chimeric cDNA clone of hepatitis C virus genotype lb are infectious in vivo / M. Yanagi et al. // Virology. 1998. Vol. 244. № 1. P. 161-172.

236. Yu, M.Y. Neutralizing antibodies to hepatitis C virus (HCV) in immune globulins derived from anti-HCV-positive plasma / M.Y. Yu et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 2004. Vol. 101. № 20. P. 7705-7710.

237. Zeng, W. Highly immunogenic and totally synthetic lipopeptides as self-adjuvanting immunocontraceptive vaccines / W. Zeng et al. // Journal of Immunology. 2002. Vol. 169. № 9. P. 4905-4912.

238. Zhang, J. Autogenous translational inhibition of core protein: implication for switch from translation to RNA replication in hepatitis C virus / J. Zhang et al. // Virology. 2002. Vol. 293. № 1. P. 141-150.

239. Zhang, M. Tracking global patterns of N-linked glycosylation site variation in highly variable viral glycoproteins: HIV, SIV, and HCV envelopes and influenza hemagglutinin / M. Zhang et al. // Glycobiology. 2004. Vol. 14. № 12. P. 1229-1246

240. Zhang, P. Hepatitis C virus epitope-specific neutralizing antibodies in Igs prepared from human plasma / P. Zhang et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 2007. Vol. 104. № 20. P. 8449-8454.

241. Zheng, A. Claudin-6 and Claudin-9 function as additional coreceptors for hepatitis C virus / A. Zheng et al. // Journal of Virology. 2007. Vol. 81. № 22. P. 12465-12471.

242. Zhong, J. Robust hepatitis C virus infection in vitro / J. Zhong et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 2005. Vol. 102. № 26. P. 9294-9299.

243. Zhu, N. Hepatitis C virus core protein enhances FADD-mediated apoptosis and suppresses TRADD signaling of tumor necrosis factor receptor / N. Zhu, C.F. Ware, M.M. Lai // Virology. 2001. Vol. 283. № 2. P. 178-187.

244. Zibert, A. Epitope mapping of antibodies directed against hypervariable region 1 in acute self-limiting and chronic infections due to hepatitis C virus / A. Zibert et al. // Journal of Virology. 1997. Vol. 71. № 5. P. 4123-4127.

Информация о работе

Мойса, Александр Александрович
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.04

Диссертация

Иммуногенные конструкции на основе фрагментов оболочечного белка E2 вируса гепатита C - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы