Структурно-функциональная и антигенная характеристика высококонсервативных фрагментов оболочечных белков Е1 и Е2 вируса гепатита С

Фарафонова, Татьяна Евгеньевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурно-функциональная и антигенная характеристика высококонсервативных фрагментов оболочечных белков Е1 и Е2 вируса гепатита С
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональная и антигенная характеристика высококонсервативных фрагментов оболочечных белков Е1 и Е2 вируса гепатита С"

На правах рукописи

Фарафонова Татьяна Евгеньевна

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ И АНТИГЕННАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВЫСОКОКОНСЕРВАТИВНЫХ ФРАГМЕНТОВ ОБОЛОЧЕЧНЫХ БЕЛКОВ Е1 И Е2 ВИРУСА

ГЕПАТИТА С

03 00 04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2007

003060756

Работа выполнена в Государственном Учреждении Научно-исследовательском институте биомедицинской химии имени В Н Ореховича Российской академии

медицинских наук

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор Колесанова Екатерина Федоровна

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, Шумянцева Виктория Васильевна

кандидат биологических наук, доцент Ильина Елена Николаевна

Ведущая организация. Центр «Биоинженерия» РАН

Защита диссертации состоится «28» июня 2007 года в 12 30 часов на заседании Диссертационного совета Д 001.010 01 при ГУ НИИ биомедицинской химии им В.Н Ореховича РАМН по адресу. 119121, Москва, ул Погодинская, 10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ биомедицинской химии им ВН Ореховича РАМН по адресу 119121, Москва, ул Погодинская, 10

Автореферат разослан vZSy> мая 2007 г

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат химических наук ЕА Карпова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Вирус гепатита С (ВГС) является основной причиной парентерального (трансфузионного) гепатита, ранее называвшегося гепатитом ни А ни В У большинства инфицированных (80%) гепатит С протекает в хронической форме и может вызывать цирроз и первичный рак печени В настоящее время вакцина, предотвращающая заражение вирусом гепатита С, не разработана, а лечение а-интерфероном (в комбинации с рибавирином или без него) эффективно только лишь для ~40% больных хроническим гепатитом С и имеет в большинстве случаев серьезные побочные эффекты [Bartenschlager et al, 2000]

Оболочечные белки ВГС играют важную роль на ранних стадиях жизненного цикла вируса Эти белки отвечают за взаимодействие с рецепторами и участвуют в процессах слияния вирусной оболочки и клеточной мембраны, сборки вирусной частицы в клетке и высвобождения из клетки Несмотря на накопленные сведения о свойствах и функциях оболочечных белков и возможных рецепторах для ВГС, механизмы связывания вируса с поверхностью клетки, проникновения вирусной частицы в клетку-хозяина, а также сборки и высвобождения вирусной частицы из клетки все еще не установлены Имеется крайне мало информации об участках оболочечных белков ВГС, ответственных за эти процессы По этой причине изучение структуры и функций оболочечных белков ВГС и их фрагментов остается актуальной проблемой

Особенностью ВГС является чрезвычайно высокая вариабельность его оболочечных белков Выделяют два гипервариабельных участка оболочечного белка Е2 (HVR1 и HVR2), которые являются иммунодоминантными, антитела против них способны нейтрализовать проникновение вируса в клетку Однако эти антитела специфичны лишь к одному или нескольким квазивидам вируса и не обеспечивают защиту организма от иных генетических вариантов ВГС Существование эпитопов вируснейтрализующих антител вне гипервариабельных участков подтверждают многочисленные экспериментальные данные [Farci et al, 1996, Shimizu et al, 1994, Мало et al, 1996, Rodda et al, 1996], однако ни в одной

работе структуры таких эпитопов не были определены По этой причине необходим поиск эпитопов оболочечных белков ВГС вне гипервариабельных участков

Наибольший интерес представляют участки оболочечных белков, являющиеся консервативными для большинства квазивидов вируса Такие участки могут быть ответственными за взаимодействие вируса с клеточными рецепторами и проникновение вируса внутрь клетки, и потому могут вызвать выработку вируснейтрализующих антител для различных генетических вариантов ВГС

Таким образом, структурно-функциональная и антигенная характеристика высококонсервативных фрагментов оболочечных белков ВГС является актуальной задачей Информация о функционально значимых и антигенно активных фрагментах оболочечных белков ВГС необходима для разработки иммуногенных конструкций, способных вызывать выработку вируснейтрализующих антител

Цель работы - структурная характеристика функционально значимых участков оболочечных белков ВГС и определение антигенности высококонсервативных участков этих белков в составе искусственных конструкций

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1 провести поиск и анализ описанных в литературе функционально значимых участков оболочечных белков и составить структурно-функциональную карту оболочечных белков ВГС,

2 выявить высококонсервативные фрагменты оболочечных белков ВГС, способные взаимодействовать с гепарином - предполагаемым рецептором ВГС,

3 синтезировать пептиды, соответствующие высококонсервативным участкам оболочечных белков ВГС, и получить пептидные иммуногенные конструкции,

4 получить антипептидные антитела и тестировать их на взаимодействие с оболочечным белком Е2 и гетеродимером Е1Е2

Научная новизна. В работе впервые

• проведен поиск и анализ структурно- и функционально значимых аминокислотных остатков и целых фрагментов оболочечных белков ВГС и составлена структурно-функциональная карта оболочечных белков ВГС,

• картированы сайты специфического взаимодействия с гепарином в составе четырех высококонсервативных участков оболочечного белка Е2 ВГС,

• показана антигенность четырех (CRI, CR4, CR5 и CHR) высококонсервативных фрагментов оболочечных белков ВГС в составе конъюгатов с белками-носителями и одного фрагмента (CR5), конъюгированного с полимером - по-лиосидонием, получены гипериммунные сыворотки, содержащие антипептидные антитела против этих фрагментов,

• показана способность антипептидных антител, специфичных к фрагментам CHR и CR5, взаимодействовать с оболочечным белком Е2 и гетеродимером Е1Е2 ВГС,

• получены высокоантигенные синтетические Т-В-эпитопные пептидные конструкции, содержащие в своем составе высококонсервативные фрагменты оболочечного белка Е2 ВГС и способные вызывать образование антител, взаимодействующих с полноразмерным оболочечным белком Е2 и гетеродимером Е1Е2ВГС

Практическая значимость исследования

Составленная структурно-функциональная карта может быть использована при изучении структурно-функциональных взаимоотношений оболочечных белков ВГС, взаимодействия оболочечных белков с молекулами поверхности клетки, эпитопном картировании, конструировании синтетических вакцинных конструкций Карта позволяет установить функциональную значимость того или иного фрагмента или аминокислотного остатка (а к.о ) для жизнедеятельности ВГС, его консервативность, возможные аминокислотные замены в пределах данного фрагмента (позиции), а также функции и консервативность близлежащих а к о или участков оболочечных белков

Картированные в оболочечных белках ВГС участки взаимодействия с гепарином могут быть использованы для поиска лигандов, блокирующих взаимодействие вирусной частицы ВГС с клеткой-хозяином, и разработки терапевтических средств против ВГС

гате с полиоксидонием свидетельствует о возможности применения синтетических фрагментов оболочечного белка ВГС и полиоксидония (в качестве эффективного адъюванта) в разработке вакцины против ВГС Апробация работы.

Основные результаты диссертационной работы были доложены на следующих симпозиумах и конференциях 5-ой научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001» (Санкт-Петербург, 2001), 6-ой Пущияской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2002), 3rd International and 28th European Peptide Symposium «Bridges Between Disciplines» (Prague, 2004), International Conference "Genomics, Proteomics and Biomformatics for Medicine" (Moscow, 2004) Апробация диссертации состоялась на межлабораторном семинаре ГУ НИИ БМХ РАМН 5 апреля 2007года Публикации

Материалы диссертационной работы опубликованы в 4 статьях и 6 публикациях сборников докладов научных конференций Структура и объем диссертации

Материалы диссертации изложены на 178 страницах машинописного текста Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результагов, их обсуждения, выводов, списка цитированной литературы, включающего 272 источника, приложения Работа иллюстрирована 5 таблицами и 15 рисунками. Основные положения, выносимые на защиту

1) Составлена структурно-функциональная карта обол очечных белков ВГС, которая может быть использована в дальнейшем изучении этих белков

2) ВКФ CR3, CR4, PRR1 и CHR оболочечного белка Е2 могут быть ответственными за взаимодействие с гепарином - представителем гликозаминоглика-нов (ГАГ) - одним из предполагаемых рецепторов ВГС

3) ВКФ в составе синтетических конструкций способны стимулировать образование антител, взаимодействующих с оболочечным белком Е2 и гетеро-димером Е1Е2

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Пептиды с последовательностями NH2-CPTDCFRKH-CONH2 и NH2-LPALSTGLIHLHQNIVDVQ-CONH2 были синтезированы в лаборатории химии пептидов Института биоорганической химии им M M Шемякина и Ю А Овчинникова) РАН Конъюгат пептида NH2-LPALSTGLIHLHQOTVDVQ-CONH2 с полиоксидонием получен и любезно предоставлен ведущим научным сотрудником ГНЦ РФ Института иммунологии ФМБА С А Медведевым Препараты оболочечных белков Е1Е2 и Е2 любезно предоставлены доктором J Dubuisson, Институт Биологии, Лилль, Франция

Программное обеспечение. Профили физико-химических и антигенных свойств оболочечного белка Е2 ВГС строили при помощи программного пакета ANTHERPROT 2000 V5 2 (http //antheprot-pbil ibep fr/ Documentation antheprot html) Т-хелперные эпитопные мотивы выявляли с использованием обновленного программного обеспечения SYFPEITHI (http //svfpeithi bmiheidelberg com/Scnpts/MHCServer dll/-EpitopePredictioti htm) Обработку данных проводили с помощью программного продукта «Microsoft Excel 2003»

Для иммуноферментного анализа (ИФА) использовали полистирольные 96-луночные планшеты с плоским дном с высокой сорбционной емкостью фирмы «Costar» (США) и типа Covahnk фирмы «Nunk» (Дания)

Синтез пептидов проводили твердофазным методом в ручном варианте путем наращивания цепи с С-конца В качестве носителя использовали насадки для игл типа DKP (емкостью 1 мкмоль) с Lys-Рго-спейсером для синтеза биоти-нилированных пептидов и насадки типа D-senes Lantern Rmk-amide (емкостью 8 мкмоль) фирмы "Mimotopes" (Австралия) В качестве конденсирующего реагента использовали либо динзопропилкарбодиимид в присутствии 1-оксибензотриазола, либо, на некоторых стадиях, соли фосфония или мочевины в присутствии 1-оксибензотриазола и диизопропилэтиламина Реакции присоединения аминокислот проводили по стандартным протоколам [Atherton and Sheppard, 1989]

Выявление сайтов связывания гепарина в составе ВКФ оболочечных белков ВГС проводили методом пептидного сканирования с лиганд-ферментным анализом с использованием биотинилированных октапептидных, а

также более длинных фрагментов ВКФ Пептиды тестировали на взаимодействие с гепарином, присоединенным к поверхности лунок планшетов «Covalink-NH» с помощью 1-этил-3'(3'-диметиламинопропил)карбодиимида (КД) и N-гидроксисукцинимида (NHS) Реакцию проводили в PBST (0,01 М фосфат натрия, 0,8% хлорид натрия, 0,02% хлорид калия, 0,05% Tween 20, pH 7,2-7,4), неспецифическое взаимодействие блокировали добавлением в реакционную смесь 50% (по объему) молока 0,5%-ной жирности Взаимодействующие с гепарином биотинилированные пептиды детектировали по связыванию их с конъюгатом стрептавидина и пероксидазы и образования окрашенного продукта пероксидазной реакции из косубстрата 2,2'-азино-бис(3-этилбензиазолин-6-сульфоната аммония (ABTS) Оптическую плотность измеряли при длине 405 нм на многоканальном фотометре Multiscan Plus ("Labsystems", Финляндия)

Конъюгацию пептидов с бычьим сыворог очным альбумином (БСА), оваль-бумином (ОВА) и миоглобином (МГ) проводили с использованием глутарового альдегида (ГА), N- гидроксисукцинимидного эфира 3-малеимидобензойной кислоты (МБС), диметилсуберимидата (ДМС) и КД по стандартным методикам [Van Re-genmortel and Muller, 1999] Электрофорез конъюгатов в полиакриламидном геле проводили по методу Laemmli (1970) Количество остатков пептидов в молекулах конъюгатов определяли методом SELDI-масс-спектрометрии

Получение сывороток и препаратов иммуноглобулинов класса G (IgG) от иммунизированных животных. Кроликов (типа шиншилла, самцов в возрасте от 4 до 5 месяцев) иммунизировали путем 4х-кратного подкожного введения 0,8 мг конъюгата в смеси с полным (ПАФ) или неполным (НАФ) адъ-ювантом Фрейнда (АФ) с интервалом в 2 недели между инъекциями Повторный курс иммунизации проводили путем двукратного подкожного введения конъюгата с интервалом в 2 недели первая иммунизация смесью 1 мг конъюгата в PBS (0,01 М фосфат натрия, 0,8% хлорид натрия, 0,02% хлорид калия, pH 7,2-7,4) с ПАФ, вторая - 0,5 мг конъюгата в PBS с НАФ Забор крови проводили через две недели после последней иммунизации Препарат IgG получали из сыворотки крови высаливанием насыщенным раствором сульфата аммония

Осадок растворяли и диализовали в течение 48 часов против 4 смен раствора 0,15 MNaCl(pH 8,0)

Мышей (белых беспородных самцов в возрасте от 12 до 18 недель) иммунизировали путем 4-кратного внутрибрюшинного введения 20 мкг конъюгата или свободного пептида в смеси с ПАФ или НАФ с интервалом в 2 недели между инъекциями Забор крови проводили методом декапитации через 14 дней после последней иммунизации

Сыворотку крови кроликов и мышей хранили в виде аликвот при -20°С Тестирование сывороток крови и препаратов IgG на наличие спе-циифических антител проводили методом ИФА Для проведения анализов использовали полистирольные 96-луночные планшеты для ИФА с плоским дном с высокой сорбционной емкостью ("Costar", США), облученные УФ-светом, и планшеты типа "Covalmk-NH" со свободными NH-группами для ковалентного связывания антигенов ("Nunc", Дания)

Для неспецифической адсорбции антигена в лунки планшета для ИФА вносили по 100 мкл раствора антигена (20мкг/мл) в 0,05М карбонат-бикарбонатном буфере (КББ) (рН 8,4 - 8,5) Инкубировали в течение ночи при комнатной температуре

Для адсорбции биотинилированных пептидов в лунках планшета для ИФА предварительно сорбировали стрептавидин ("ICN", США, 1мкг/лунку) из КББ, затем вносили вносили 100 мкл раствора биотинилированных пептидов (10мкг/мл) в PBST, и после З-ч инкубации при 37° С промывали 3 раза PBST

Для ковалентной пришивки антигена за счет аминогруппы пептида NH-группы лунок планшета Covalmk-NH модифицировали цианур-хлоридом (вЮО мкл раствора (1 мг/мл) в 0,1М Na-фосфатном буфере инкубация 5 мин при комнатной температуре) После отмывки PBS в лунки планшета вносили 100 мкл раствора пептида (25 мг/мл), инкубировали ночь при комнатной температуре и промывали лунки 0,1М Na-фосфатным буфером с добавлением 1% MgS04

Для ковалентного присоединения за счет карбоксильной группы пептида в лунки планшета Covalmk-NH вносили 100 мкл смеси, содержащей водный раствор пептида, преинкубированный 5 мин при комнатной температуре с рав-

ным объемом раствора КД и NHS в КББ (молярное соотношение КД NHS пептид 10 10 1, конечная концентрация пептида 25 мг/мл) и инкубировали ночь при комнатной температуре, далее отмывали PBST

Для адсорбции оболочечного белка Е2 и гетеродимера Е1Е2 ВГС в лунках планшета для ИФА предварительно сорбировали лектин подснежника (1мкг/лунку), затем вносили раствор препаратов оболочечного белка Е2 или гетеродимера Е1Е2 (9-10 мкг/лунку) в PBST, неспецифическое взаимодействие блокировали добавлением в реакционную смесь 50% (по объему) молока 0,5%-ной жирности Планшеты инкубировали 2 ч при температуре 37°С при перемешивании, промывали PBST

В лунки планшета, сенсибилизированные антигеном, вносили по 150 мкл блокирующего буфера (PBS с 50% (по объему) молока 0,5%-ной жирности) и инкубировали 1 ч при комнатной температуре при перемешивании В лунки вносили 100 мкл раствора сыворотки с различным разведением блокирующим буфером с 0,5% Tween 20 и инкубировали 1,5 ч при 37°С при перемешивании Планшет промывали PBST 3 раза и добавляли конъюгат перокзидазы хрена с антителами козы против IgG кролика или мыши в разведении 1 2000 для антикроличьего и 1 10000 для антимышиного конъюгата в буфере для разведения сывороток, инкубировали 1 час при 37°С, промывали планшет PBST 3 раза Регистрацию взаимодействия антител с антигенами проводили при помощи цветной реакции, как описано выше Оптическую плотность при 405 нм измеряли на многоканальном спектрофотометре Spectroscan ("Tftermolabsystems", Финляндия-США)

Концентрацию белка определяли методом Лоури [Lowiy et al, 1951] РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Структурно-функциональная карта оболочечных белков ВГС

Структурно-функциональная карта оболочечных белков ВГС была получена путем наложения известных из литературы к началу 2007г и выявленных нами функционально важных участков и а к о на составленную ранее [Sobolev et al., 2000] консенсусную последовательность оболочечных белков ВГС Данная карта представляет собой таблицу, где каждая строка соответствует одному

аминокислотному остатку (а к о) консенсусной последовательности 1-й столбец таблицы содержит номер позиции а к о в консенсусной последовательности, 2-й столбец - номер позиции а к о в полипротеине ВГС изолята Н77 генотипа 1а (общепринятая международная нумерация и используемая в данной работе, если не указано особо), 3-й столбец - а к о , чаще всего встречающийся в данной позиции (доминирующий) В 4-м столбце в соответствующих строках перечислены а к о , встречающиеся в данной позиции помимо доминирующего а к о Частота встречаемости каждого а к о показана верхним индексом А к о , встречающиеся менее чем в 5% последовательностей, обозначены строчными буквами Ячейки, соответствующие позициям с частотой встречаемости доминирующих а к о более 95%, закрашены ВВВДД цветом рвЩхя^ёрШ1 цветом закрашены ячейки, соответствующие позициям, в которых а к о заменяется на остаток со сходными физико-химическими свойствами [Henikoff and Hemkoff, 1992], и встречаемость этих остатков в сумме составляет 95% и более В 5-й столбец таблицы в соответствующие строки и группы строк внесены данные о функциональной значимости отдельных ако и целых фрагментов В этом столбце также отмечены протяженные высококонсервативные и гипервариабельные фрагменты оболочечных белков ВГС В таблице 1 показаны два фрагмента струткурно-функциональной карты, соответствующих двум участкам белка Е2 Помимо двух известных гипервариабельных фрагментов HVR.1 и HVR2, в оболочечных белках ВГС были выявлены еще 5 вариабельных фрагментов (VR - variable region, выделены синим шрифтом) Два из них (VR3 и VR4) расположены в белке Е1 (248-258 и 290-303, соответственно), два других (VR5 и VR6) - в белке Е2 (570-580 и 706-713) и один в белке р7 (VR7, 765-774)

Данная карта позволяет установить функциональную значимость того или иного фрагмента или ако для жизнедеятельности ВГС, его консервативность, возможные аминокислотные замены в пределах данного фрагмента (позиции), а также функции и консервативность близлежащих ако или участков оболочечных белков Карта является эффективным инструментом при изучении структурно-функциональных свойств оболочечных белков ВГС, взаимодейст-

вия оболочечных белков с молекулами поверхности клетки, эпитопном картировании, конструировании синтетических вакцинных конструкций. Таблица 1. Фрагмент структурно-функциональной карты оболочечного белка Е2

¡№гЪэ^ДАмкнокислотныи сстаток ¡ал о.)"

й Фун+щИР э.к о. и фрагментов полипротеика

сакпттикозипирманмя, гпнкы№т1раеан1теа.к.о. модулирует" гтр^никно-йен» вирус* ой частицы ч клетку. но не ел идет тетеро-

^ивра ЕЗбЗДСсЙав) Ыои2С05;

гндГнажцыЙ. для яиимс.-лм'сгвия сСРЭ1 ¡Ом'аапкя с-1 а| у;061

I»

а 1

гаг

;сайт гликоэилирования, тикозипировакие а-К.о. важно для лронл^О-вения вирусной частицы п клетку, но не влияет на образование гетеро-димерз Е1Е2 (Оо1Твт<3 е1 а!.. 2005) _

сайт гпикозилирования (СоАагс! е1 а!. 2005)

ii ||

3 ж

в*

Участок взаимодействия с СС>с1 {Огимтег в! а , £006}

сайг ггикнилироваьия. гликсзилировэние з • о ке влияет нао&оззОвечиегете-рвдиыераЕ*Ё2. поважнс для проникновения вирусной частицы в клетку ^о^ага

аЛЛЯйн---------------

ш ш. * я_ ;с"

[6 1 V г I е з ШкП. |Т° 8' а щП 1т___

'479 47? Т

Н с1 I с. V Е г я р п "е" Т" У3'! й □ ^ п к у I с

'(У^пгаке! а!.. 20001

сайт гл и <озили рев а н ия. гликоэнлировэние а к.о. модулирует. проникновение вирусной частицы в йлетку, но не влияет на образование гетеродин эра Е1Ё2 ¡СоНзгб е! а!.. 2005)

Участок, важный для взаимо пейстеия с С081" (Сйуип е[ Ц, 200?; Щи е( Эк. 2 МО: Сыяапка е! 2001}

Поиск гепарнн-связы вяюищх участков в высоко консервативных фрагментах оболочечных белков ВГС

Гепарин является представителем гликозаминогли капов (ГАГ), которые могут участвовать в проникновения ВГС н клетку в качестве рецепторов [Yagnik ее а1., 2000, Так]ка\\'а е! аЦ 2000]. Мы предположили, что сайты взаимодействия с ГАГ н оболочечных белках ВГС должны быть консервативными, чтобы обеспечить из о лят-п е си е ц и ф и ческ о е взаимодействие вируса с рецептором. Поскольку в оболочечных белках Е1 и Е2 не было выявлено стандартных мотивов связывания с гепарином, поиск гепарин-связывающих участков был проведен в высококонсервативыых фрагментах (ВКФ), выбранных из консен-сусной аминокислотной (а.к.) последовательности полипротеина ВГС и содержащих не менее 2 положительно заряженных а.к.о (в табл. 2 закрашены), с использованием би оти н и лиро ванных октан с пти до в, перекрывающих ВКФ.

Белок Позиция' Регион3 Последовательность"5 Кои серпа-ТИВНОСТЬ № соответствующих пептидов'

El 315-324 cri gisümawdmmm 94% АЗ-А5

E2 E2 418-430 484-490" glr prr1 GSWgTNgTALNCNDS 52% A6-AI2

PYCWHYAP 66% -

E2 502-521 CR2 VCGPVYCFTPSP V V VOTE!®! 86% -

E2 549-556 prr2 WFGCTWMN 88% -

E2 581-590 СЮ сртпсгШЯр 92% А28-А30

E2 611-622 C:R4 ypyëlwsypô'v 75% Л31-А35

E2 654-663 CHR LEDgDgSELS 49% А5Г

E2 682-704 |CR5 lpalst(îllft[,iHûNlVDVOYLYG 59% Л36-Л50

изолята Н77 генотипа 1а;

1 — регионы обозначены в соответствии с Sobolev et al., 2000; J - a.к.о., встречающиеся в 95% н более последовательностей, подчеркнуты, положительно заряженные а.к.о закрашены серым цветом; 4 - номера перекрывающихся октапептидов, соответствующих ВКФ; 3 - пептид А51 содержал 10 а,к.о,

В качестве положительного контроля: (С1-С6) использовали пептиды, представляющие собой известные сайты взаимодействия с ГАГ из других белков [Drake et al., 1993; Cardin et al., 1986; Lawïer et al,, 1991; Knaus et al., 1990].

Результаты тестирования пептидов (рис. 1) показали слабое взаимодействие с гепарином пептида из фрагмента СЮ (АЗО) и более сильное взаимодействие с гепарином пептидов из участка СК4 (АЗ 1 -35).

^ Л!

3,5

3 5 7 9 II ]|) 1! II X П I; К С 2 С 4 С 6

н»1р пептидов Контрольные

пептиды

Рис. 1. Взаимодействие пептидов с гепарином.

Мы обратили внимание, что участок 610-620 (рис. 2), включающий ВКФ СЯ4 белка Е2, пептиды ш которого взаимодействовали с гепарином (выделен жирным шрифтом), имеет сходство с 11-членным фрагментом этого же белка, содержащим участок РКП! (9 из 11 а.к.о. общие для обоих фрагментов, причем 7 иг них (отмечены звездочкой *) располагаются в одинаковой последовательности). Структурно-функциональная карта показала, что фрагменту РКГ<1 в последовательности белка с Х—конца предшествует положительно заряженный остаток аргинина, который встречается в 84% последовательностей или заменяется в 14% последовательностей на остаток лизина. Это позволило нам предположить, что фрагмент РККI, более протяженный с Ы-конца (4 й' I) Г)ЯР У С \\'Н V АР4 90), может взаимодействовать с гепарином.

СЯ4

810

ОУРУГ{Ь\УНУ РС

620

ркк: ,,я|о(?кру с xv н у а р™

Рис. 2.Гомология фрагментов ся4 и ррл\ 1 белка Е2.

Кроме того, участку СНЕ. с 14-конца также предшествуют высококонсер-ватйвные остатки аргинина (консервативность этих остатков составляет 9899%), а в целом фрагмент ^'ЬЮЕЯСОЬЕБЮЖ характеризуется наличием консервативных гидрофильных а.к.о. Мы предположили, что фрагмент 648-659 также может взаимодействовать с гепарином. Для подтверждения этих предпо-

ложений были синтезированы три биотинилированных пептида с последовательностями МЧЭУРТКЬ\ШУРС, №-ОС®РУС\¥НУАР, НЗ-КОЕКСОЬЕОКШ, все они проявили гепарин-связывающую активность, сравнимую с таковой пептидов положительного контроля (рис 3)

3,5

пептиды

N1 - DYPYRLWHYPC, N2 - DQRPYCWHYAP, N3 - RGERCDLEDRDR А20 - отрицательный С 1 и С 4 - положительный контроль

N2 N3 А20 C1 номер пептидов

Рис З.Взаимодействие пептидов N1, N2 и N3 с гепарином

Изучение антигенных свойств ВКФ оболочечных белков El и Е2 ВГС.

Выбор ВКФ и синтез соответствующих им пептидов ' Для изучения антигенности в составе синтетических конструкций были выбраны пять ВКФ (CRI, CR3, CR4, CR5 и CHR), которые могут участвовать в процессе проникновения ВГС в клетку-мишень и которые, соответственно, могли бы вызвать образование к себе вируснейтрализующих антител CR3, CR4 и CHR были выявлены как участки связывания гепарина (антигенность участка, соответствующего удлиненному с N-конца PRR1, в составе конъюгата с оваль-бумином была изучена ранее [Оленина, 2002]) В участке CR5 предполагается локализация «пептид слияния» оболочечного белка Е2 с мембраной эндосомы клетки-мишени [Drummer and Poumbourios, 2004] Кроме того, в этом участке предсказываются Т-хелперные эпитопные мотивы Участок CR1 белка El представлял интерес как обладающий антигенной активностью в составе целого ге-теродимера Е1Е2 и индуцирующий образование антител у лиц, инфицированных ВГС [Zibert et al, 1999, Olenma et al, 2002]

Были синтезированы 9 пептидов, а к последовательности которых содержат пять выбранных ВКФ (табл 2) В состав указанных пептидов, помимо собственно ВКФ, были включены дополнительные а к о. Cys, Lys или Ser (показаны обычным шрифтом), обеспечивающие присоединение к белку-носителю

и/или имеющие функцию мостика между пептидом и белком-носителем, либо обеспечивающие циклизацию пептида путем образования Б-З-мостика (два остатка Суэ на 14- и С-концах пептида) Для лучшего моделирования структуры фрагмента в составе молекулы белка а-карбоксильные группы пептидов ами-дировали, а а-амино-группы, если они не использовались для конъюгации с носителем, ацетилировали Правильность синтеза пептидов подтверждена методом МА1ДЭТ-ТОБ масс-спектрометрии.

Таблица 2 Пептиды, содержащие ВКФ оболочечных белков Е1 и Е2 ВГС,

и их характеристика

№ пе-пти да А к последовательность1 ВКФ к2. % Мол масса пептида расчетная, Да Масса молекулярных ионов на спектрограмме

П1 nh2-cptdcfrkh-conh2 CR3 97 1202,5 1205,1

П2 №tu>aiälxaihmqsivdvqylygoonli CR5 59 2564,0 2559,0 2579(4№.'ь)

ПЗ nh2-cdledrdrselc-conh2 CHR 38 1424,8 1424,5 1422,5(окисл )

П4 nh2-pyrlwhypct-conh2 CR4 94 1334,5 1334,9

П7 nh2-cdledrdrselconh2 CHR 38 1349,5 1331,74(-Н20) 1349,77 1371,75(+Ка+)

П8 nh2-dledrdrselk-CONH2 CHR 38 1374,5 1356 7(-Н20) 1374 72 1396 бЭС+Ка4)

П9 nffi-spalstglihlhqmvd-conh2 CR5 63 1814,1 1813,8 1835,8(+№+) 1851,8(+К4)

П10 Ac-spalstglihlhqmvd-CONffi CR5 63 1856,1 1855,5

П13 ac-GHRMAWDMC-CONH2 CR1 96 1234,6 1250,9/1266,9 1234,4/1250,43

1 - последовательность, соответствующая консенсусной последовательности включенного в пептид ВКФ, выделена жирным шрифтом,

2 - консервативность последовательности ВКФ, включенной в состав пептида,

3 - массы молекулярных ионов после обработки пептида 2-меркаптоэтанолом.

Получение синтетических конструкций, включающих ВКФ

Синтезированные пептиды были включены в состав конструкций (табл 3), содержащих в качестве источника Т-хелперных эпитопов различные белки-носители [Van Regenmortel and Muller, 1999] В качестве одного из носителей пептида П2 использовали полиоксидоний (ПО), синтетический полимер, обла-

дающий выраженной иммуномодуляторной активностью и успешно применяемый в качестве адъюванта в субъединичных вакцинах [Петров Р В и др , 1999] Количество остатков пептида в одной молекуле конъюгата определяли с помощью БЕНЯ-масс-спектрометрического анализа и аминокислогного анализа для конъюгата П2-ПО

Таблица 3.Синтетические конструкции и их характеристика

№ животного (группы)1 Синтетическая конструкция ВКФ Мол масса Конъюгата2

1-1 П1-ДМС-БСА СВ.З 67549 0,7

1-И П1-ГА-БСА 88493,5 17,3

2-1 2-11 П2-ГА-БСА СЯ5 79870,5 5,0

3-1 ПЗ-ГА-БСА ст 81231,1 9,8

З-П ПЗ-ГА-ОВА - -

4-1 П4-ДМС-БСА С1*4 67195,6- 0,4

4-П П4-ГА-БСА 83574,1 12,1

5 П7-МБС-БСА 79161 7 8 1

6 П7-МБС-МГ 20075,0 43455,3 65900,7 (2,1/1) 2,8(6,1/2) (9,5/3)

7 П8-ГА-БСА сна 79081 8 8,6

8 П8-ГА-МГ 20506,9 26341,4 37866.1 53739,0 77489.2 (2,5/1) (6,6/1) 2,5 (3,2/2) (2,1/3) (6,8/4)

9 П9-ГА-БСА 78530,0 63

10 П10-КД-БСА СЯ5 73196,6 36

11 П2-ПО - 1,0"

13 ШЗ-МБС-БСА СЯ1 73106,1 4,5

- 1-1 -4-П - номера иммунизированных кроликов (римская цифра указывает цикл иммунизации), 5-13 - номера групп иммунизированных мышей,

2 - усредненная молекулярная масса конъюгата по данным БЕЫЛ-МБ (Да),

3 - N - среднее количество молекул пептида на 1 молекулу белка в конъюгате,

4 - данные определены методом аминокислотного анализа

Получение антипептидных антител к фрагментам СЮ. С114. СЛ5 и СНЕ, у

кроликов

Основной задачей данного этапа работы являлось определение способности ВКФ оболочечных белков ВГС в составе искусственных конструкций вы-

зывать образование антител специфичных к целым белкам Для этого необходимо было получить достаточное количество антипептидных антител для анализа их специфичности. Поэтому в качестве подопытных животных были выбраны кролики для получения антител против конъюгатов П1-ДМС-БСА, П2-ГА-БСА, ПЗ-ГА-БСА, П4-ГА-БСА Из сывороток крови иммунизированных кроликов выделяли 1§0 и тестировали их на способность к специфическому взаимодействию с соответствующими пептидами методом ИФА Анализ проводили с использованием пептидов, ковалентно связанных с поверхностью лунок планшетов После первого цикла иммунизации антипептидные антитела во фракциях 1§0, полученных из сывороток крови иммунизированных кроликов, не были обнаружены

Был проведен повторный цикл иммунизации Поскольку одной из причин отсутствия антител к П1 и П4 может быть малое количество молекул пептида, связавшееся с одной молекулой белка-носителя в конъюгатах П1-ДМС-БСА и П4-ДМС-БСА (табл 3), для повторного цикла иммунизаций использовали конъюгаты этих же пептидов с БСА, полученные с помощью ГА, с большим содержанием остатков пептида (табл 3) В конъюгате ПЗ-ГА-БСА содержание остатков пептида оптимально Отсутствие иммунного ответа на пептид ПЗ может быть результатом электростатического взаимодействия пептида с поверхностью молекулы белка-носителя, прилегающей к месту пришивки пептида [ВаЬгаош е1 а1, 1986] Поэтому для второго курса иммунизации использовали конъюгат пептида ПЗ с ОВА Из-за сложности работы с пептидом П2 (низкая растворимость в водных растворах самого пептида и его конъюгатов) для повторного цикла иммунизации была использована та же конструкция ПЗ-ГА-БСА

После второго курса иммунизации нам удалось получить антитела к фрагменту СЯ4; титр антипептидных антител в препарате из сыворотки кролика 4-П составлял 1 2700 Однако полученные антипептидные антитела не взаимодействовали ни с оболочечным белком Е2, ни с гетеродимером Е1Е2 Следовательно, в составе оболочечного белка Е2 данные фрагменты имеют иную конформацию, чем в составе конъюгата с БСА

К фрагментам СЮ, CHR и CR5 антипептидные антитела у кроликов получить не удалось даже после второго цикла иммунизации Вероятно, для получения антипептидных антител против фрагментов CR3 и CR4, способных специфично взаимодействовать с белком Е2, необходима разработка принципиально иных иммуногенных конструкций CR3 и CR4 содержат в своем составе много а к о, имеющих боковые функциональные группы, обычно используемые для конъюгации с носителями (Asp, Lys, Cys), которые не должны быть затронуты при конъюгации , так как они, располагаясь в середине или почти в середине фрагментов, могут быть важны для взаимодействия с антителами Возможной причиной неудачи в получении антител к участку CR5 может быть высокая гидрофобность содержащего этот фрагмент пептида П2 Более короткие и менее гидрофобные пептиды, содержащие часть фрагмента CR5, образовывали растворимые конъюгаты Другой причиной как в случае CR5, так и в случае CHR, где замена носителя в конъюгате с ПЗ не привела к выработке специфических антител, может быть индивидуальная толерантность животного В этом случае необходимо исследовать иммунный ответ в группах животных Для таких масштабных исследований в качестве подопытных животных были выбраны мыши

Получение антипептидных антител к фрагментам CR h CR5 и CHR у мышей

Для иммунизации мышей были использованы конъюгаты пептидов, содержащих фрагменты CHR, укороченный CR5 и CR1 (табл 3, группы 5-13) Четыре группы мышей были использованы для проверки антигенности П2 (содержащего полноразмерный CR5) в составе конъюгата П2 с полиоксидонием (П2-ПО) Первая группа (табл 4, группа №11) была иммунизирована П2-ПО с АФ, вторая (группа №11а) - П2-ПО без АФ Две контрольные группы были иммунизированы соответственно пептидом П2 в смеси с ПО и пептидом П2 с АФ

Значения титров антител к различным фрагментам для каждой антисыворотки и среднее геометрическое значение тиров антител в группе приведены в таблице 4

Таблица 4 Титры антипептидных антител в сыворотках мышей

№ группы Иммуногенная конструкция ВКФ Титры антипептидных антител

1 2 3 4 5 Т 1 1 CD

5 П7-МБС-БСА CHR 900 8100 <100 300 - 216

6 Д7-МБС-МГ <100 <100 <100 <100 <100 -

7 П8-ГА-БСА 300 <100 <100 900 300 38

8 П8-ГА-МГ 2700 I <100 <100 <100 "1 900 1 19

9 П9-ГА-БСА CR5 <100 <100 <100 <100 <100 -

10 ПЮ-КД-БСА 900 300 100 <100 300 96

11 П2-ПО+АФ >450 <50 150 >450 >450 165

11а П2-ПО 50 450 150 IÏ50 >450 187

13 П13-МБС-БСА CR1 24300 218700 8100 24300 - 31980

Тср- среднее геометрическое значений титров в группе

Из полученных данных следует, что включение ВКФ CHR, CR1 и CR5 в конъюгаты с белками-носителями позволяет получить антипептидные антитела к указанным фрагментам Однако иммунный ответ зависит от ориентации пептида, структуры носителя и сшивающего реагента и от индивидуальных особенностей функционирования иммунной системы иммунизируемого животного Из исследованных фрагментов наиболее иммуногенным оказался CR1, который проявлял наибольшую иммуногенность среди ВКФ и в составе ВГС у больных гепатитом С [Zibert et al, 1997, Olemna et al., 2002] Наиболее эффективными носителями для получения иммуногенных конструкций с использованием исследованных пептидов оказались БСА и ПО, а сшивающими реагента-ми-МБСиКД

Определение специфичности антипептидных антител к препаратам оболочечных белков ВГС

Сыворотки крови мышей, содержащие антипептидные антитела, были анализированы методом твердофазного ИФА на способность взаимодействовать с полноразмерным оболочечным белком Е2 или гетеродимером Е1Е2 Оболочечные белки инкубировали с сыворотками (в разведении 1 50), содержащими антипептидные антитела Из рис 4 видно, что из 25 антисывороток пять содержали антитела, взаимодействующие с полноразмерным белком Е2 и с гетеродимером Е1Е2 Это антисыворотки, полученные против конъюгатов пептидов, соответствующих фрагментам CHR и CR5

А4Й»

1а Ей !□ Е1Е2

I I

I .

I 1

: А л Л,. ¿й. йь г Ё.

номер сыэо ротки

Рис. 4. Взаимодействие антител из сывороток мышей групп 5,7,8,10,11а, 11 и 13 с обо л очечным и белками ВГС Таким образом, конъюгация пептидов, соответствующих слабо или практически не иммуногенным в составе целых оболочечных белков ВГС ВКФ, с белками-носителями позволяет получить иммуногенные конструкции, способные вызывать выработку организмом специфических антипептидных антител. Пептид, содержащий предсказываемые Т-хелперные эпитопные мотивы, вызывал образование специфических антител и в виде конъюгата с полимерным адъговантом полиоксидонием. Это указывает на принципиальную возможность разработки конструкций для кандидаткой вакцины против гепатита С на основе отдельных синтетических фрагментов оболочечных белков ВГС.

Получение синтетических пептидных Т-В эпитопных конструкции на основе ВКФ оболочечных белков ВГС

Синтез Т-В эпитопных конструкций Анализ обо л очечного белка Е2 с использованием обновленного программного обеспечения 5УРРЕ1ТШ позволил выявить консервативный фрагмент оболочечного белка Е2, содержащий Т-хелперные мотивы. Было высказано предположение, что этот фрагмент может быть использован как источник Т-хелперных эпитонов в искусственной иммуногенной пептидной конструкции. Данный фрагмент был включен в состав двух пептидных конструкций {пептид

14 и пептид16), где в качестве В-эпитопа выступает другой ВКФ оболочечного белка Е2 ВГС (рис 5а), а также были получены конъюгаты этих пептидов с БСА с использованием ГА (рис. 56)

_ линкео

а) Пептид 14

В-эпитоп —О—

Пептид16

В-эпитоп

б) Пептид 14-ГА-БСА

_линкер

V Р В-эпитоп —

Пептид 16-ГА-БСА

В-эпитоп

кэ

Рис 5.Т-В эпитопные конструкции а) пептидной природы, б) конъюги-рованные с БСА

Получение антител к Т-В-эпитопным конструкциям и определение их

специфичности

Иммунизация мышей Т-В-эпитопными конструкциями проводилась в двух вариантах с добавлением АФ и без него Нумерация групп мышей в соответствии с материалом для иммунизации приведена в таблице 5 Результаты тестирования антисывороток мышей этих 6 групп (табл 5) показали, что в результате иммунизации все мыши (за исключением мыши №3 в группе 16а) с разной эффективностью развили иммунный ответ к целой соответствующей конструкции (в таблице значения титров выделены жирным шрифтом) Показано, что обе пептидные конструкции способны в свободном виде, без конъюгации с белком-носителем и даже без адъюванта индуцировать образование специфических антипептидных антител Тестирование антисывороток на специфичность к Т- и В-эпитопным фрагментам показало, что эффективность образования антител к отдельным фрагментам зависела от использования адъюванта при иммунизации В целом конструкция 14 оказалась более иммуноген-

ной, чем конструкция, представленная пептидом 16 Эффективность образования антител к соответствующему антигену убывает в ряду групп 14-15-16-14а-17-16а Однако в случае иммунизации конструкциями, содержащими пептид 16, выше эффективность образования антител к В-эпитопу

Таблица 5.Титры антипептидных антител в сыворотках мышей иммунизированных Т-В-эпитопными конструкциями_

№ Препарат для Титры антител и их среднее геометрическое в группе

имму ни-зации к пептиду 14 к пептиду 16 к пептиду Ь

1 900 <100 300

14а 2 3 Пептид 14 без АФ 24300 72900 10090 <100 <100 - <100 <100 -

4 2700 <100 <100

5 24300 <100 <100

1 256000 <100 900

14 2 3 Пептид 14 + АФ 256000 256000 256000 2700 100 185 100 <30 75

4 256000 900 30

5 256000 900 900

1 32000 30 <100

15 2 3 П14-ГА-БСА + АФ 64000 32000 48503 300 900 366 <100 100 -

4 64000 2700 <100

5 64000 300 <100

1 900 8100 24300

16а 2 3 4 5 Пептид 16 без АФ <30 <30 <100 <30 4 100 <30 900 100 149 <100 100 <100 39

1 2700 32000 900

16 2 3 Пептид 16 + АФ 900 2700 1397 16000 32000 21000 8100 8100 2700

4 900 32000 2700

5 900 8000 900

17 1 2 П16-ГА-БСА + АФ 16000 <100 25 64000 1000 2639 24300 -

3 <100 2000 -

Взаимодействие анти-Т-В-эпитопных антител с препаратами оболочечных белков ВГС Тестирование сывороток крови методом ИФА на наличие антител, способных взаимодействовать с полноразмерным белком, показало, что из 27 сывороток четыре (14-5, 15-3, 15-5 и 17-1) содержат антитела, взаимодействующие с белком Е2, и три (14-5, 15-3 и 16-5) - антитела, взаимодействующие с ге-

теродимером Е1Е2 ВГС (рис 7) С белком реагировали антитела только из тех

сывороток крови, которые были получены после иммунизации конструкциями с АФ Ни в одной из сывороток, полученных после иммунизации без использования АФ, антител против оболочечных белков не выявлено

А450

О б

О 4

0,3

о г

О 1

о о

Рис 7. Взаимодействие антител из сывороток мышей, иммунизированных Т-В-эпитопными конструкциями, с оболочечными белками ВГС

Высокая иммуногенность синтетических пептидных конструкций даже в отсутствие адъюванта подтверждает наличие Т-хелперной эпитопной активности у включенного в состав этой конструкции предсказанного Т-эпитопного мотива Иммунный ответ с образованием специфических антипептидных антител наблюдался практически у всех иммунизированных животных, что свидетельствует о широкой специфичности данного Т-эпитопного мотива по отношению к МНС II Важно отметить, что показана специфичность антипептидных антител из четырех сывороток к полноразмерному оболочечному белку Е2 и трех к гетеродимеру Е1Е2 ВГС Подобные конструкции из фрагментов оболочечных белков ВГС были получены впервые В дальнейшем такие конструкции могут быть модифицированы и улучшены с целью получения антител с большей связывающей активностью в отношении полноразмерных оболочечных белков ВГС

■ Е2 ШЕ1Е2

[ 1 1

¡1 ш ! « т! Л т! т Тт тТ 3 1т т 1 Тх 4т I I „

^ 4 чЬ Агаяго

номер сыворотки

выводы

1 Составлена структурно-функциональная карта оболочечных белков вируса гепатита С

2 Определены четыре линейных фрагмента оболочечного белка Е2, взаимодействующие с гепарином - возможным рецептором ВГС

3 Показано, что высококонсервативные фрагменты оболочечных белков ВГС, включенные в состав искусственных иммуногенных конструкций, проявляют антигенные свойства и способны вызывать образование специфических антител, взаимодействующих с оболочечным белком Е2 и гетеродимером Е1Е2,

4 Получены высокоантигенные синтетические Т-В-эпитопные пептидные конструкции, содержащие в своем составе высококонсервативные фрагменты оболочечного белка Е2 ВГС и способные вызывать образование антител, взаимодействующих с полноразмерным оболочечным белком Е2 и гетеродимером Е1Е2 ВГС

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Olenma L.V, Kuzmina ТI, Sobolev В N, Kuraeva Т Е , Kolesanova Е F, Аг-chakov AI Identification of glycosaminoglycan-bmding sites within hepatitis С virus envelope glycoprotein E2 // Journal of Viral Hepatitis - 2005 - V 12 №6 -P 584-593

2 Оленина Л В , Кузьмина Т И, Соболев Б Н, Кураева Т Е , Колесанова Е Ф , Арчаков А И Разработка лабораторно-экспериментальных образцов искусственной вакцины против вируса гепатита С Иммуногенность высококонсервативных участков оболочечного белка Е2 в составе синтетических конструкций // Аллергия, астма и клиническая иммунология - 2003 - Т 9, №7 - С 51-53

3 Kuraeva Т.Е Olenina L V, Kuzmma ТI, Alyoshma Е Yu, Kolesanova Е F , Archakov A I. Immunogemcity of highly conserved fragments of hepatitis С virus envelope protems El and E2 // In Peptides - Bridges Between Disciplines, Proceedings of the Third International and Twenty-Eight European Peptide symposium Flegel, M, Fndkm,M , Gilon, С and Slanmova J (Eds) - 2005 -P 172-173

4 Sobolev B.N, Kolesanova E F , Olenma L V , Kuraeva T E , Rudik A V, Por-oikov V V, Archakov AI Hepatitis С virus functional mapping database an instrument in subunit vaccine design // In Peptides - Bridges Between Disciplines, Proceedings of the Third International and Twenty-Eight European Pep-

tide symposium. Flegel, M , Fridkin,M , Gilon, С and Slamnova J (Eds ) -2005 - P 213-214

5 Кураева T E , Соболев Б H, Алешина Е Ю , Кузьмина Т И, Колесанова ЕФ Антигенная характеристика высококонсервативных участков оболо-чечных белков вируса гепатита С // Медицинская иммунология Сборник докл. пятой научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001» - Санкт-Петербург, 2001 - Том 3, №2 - С 231

6 Кураева Т Е, Оленина Л В Получение антипептидных антител против консервативного участка оболочечного белка вируса гепатита СII Сборник докл конф Биология наука XXI века 6-ая Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 20-24 мая 2002 г) - Пущино, 2002 - Т 1. - С 270

7. Olenina L V, Kuzmma ТI, Sobolev В N, Ivanov Yu D, Gnedenko О V , Ni-kolaeva L I., Kuraeva T E., Kolesanova E F, Archakov A.I. Highly conservative sites of HCV envelope proteins Possible functional role and immunogenic properties // In Int Conference "Genomics, Proteionucs and Bioinformatics for Medicine" Book of Abstracts. - Moscow, 2002 - P 94

8 Kuraeva T E Olenina L V, Kuzmma TI, Alyoshma E Yu , Kolesanova E F, Archacov A,I Immunogemcity of highly conserved fragments of hepatitis С virus envelope proteins El and E2 // Материалы Междунар симп «3rd International and 28th European Peptide Symposium» - Prague, 2004. - V 10. №8 - P 94.

9 Sobolev В N, Kolesanova E F, Olenina L.V, Kuraeva T E, Rudik A V, Por-oikov V V, Archakov AI Hepatitis С virus functional mapping database, an instrument m subumt vaccme design Материалы Междунар симп «3rd International and 28th European Peptide Symposium» - Prague, 2004. - V 10 , №8 -P. 112.

10 Sobolev В N, Kuraeva T E, Olemna L.V , Kolesanova E F, Rudik A V, Por-oikov V V, Archakov AI Hepatitis с virus epitope mapping database (HCVMAP) an instrument m subumt vaccine design // In. Int. Conference "Genomics, Proteionucs and Bioinformatics for Medicine" Book of Abstracts -Moscow, 2004 - P 5.13

Список сокращений

а к о - аминокислотный остаток

АФ - адъювант Фрейнда

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВГС - вирус гепатита С

ВКФ - высококонсервативный фрагмент

ГА - глутаровый альдегид

ГАГ - гликозаминогликаны

ДМС - диметилсуберимидат

ИФА - иммуноферментный анализ

КД - 1-этил-3'(3'-диметиламинопропил)карбодиимид

МБС - N- гидроксисукцинимидный эфир 3-малеимидобензойной кислоты

МГ - миоглобин лошади

ОВА - овальбумин

ПО - полиоксидоний

DKP - Lys-Рго-дикетопиперазин

HVR - гипервариабельный участок (hypervanable region)

IgG - иммуноглобулины класса G, IgA - иммуноглобулины класса А

MALDI-TOF - matrix-assisted laser desorption-iomzation time-of-flight вре-

мяпролетная [масс-спектрометрия] с лазерной десорбцией-ионизацией с

помощью матрицы

NHS - N-гидроксисукцинимид

PBS - фосфатно-солевой буфер

PBST - фосфатно-солевой буфер с твином

SELDI - (surface-enhanced laser desorption-iomzation) усиленная поверхностная лазерная десорбция-ионизация (в масс-спектрометрии белков)

Подписано в печать 24 05 2007 г Исполнено 25 05 2007 г Печать трафаретная

Заказ № 534 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Фарафонова, Татьяна Евгеньевна

1 Введение.

2 Оболочечные белки вируса гепатита С и перспективы создания вакцины

2.1 .Строение генома и организация вирусной частицы гепатита С.

2.2.Экспериментальные модели для изучения вируса гепатита С.

2.3.Молекулы на поверхности клетки-хозяина - предполагаемые рецепторы для вируса гепатита С.

2.3.1. Липопротеины низкой и очень низкой плотности и их рецепторы.

2.3.2. SR-B1 и CD81 в качестве рецепторов для вируса гепатита С.

2.3.3. Асиалогликопротеиновый рецептор.

2.3.4. Лектины DC-SIGN и L-SIGN.

2.3.5. Гликозаминогликаны.

2.4.Структура и функции оболочечных белков Е1 и Е2 вируса гепатита С

2.4.1. Общая характеристика структуры оболочечных белков.

2.4.2. Вариабельность оболочечных белков.

2.4.3. Структура и функции трансмембранных доменов оболочечных белков Е1 и Е2.

2.4.4. Образование дисульфидных связей и фолдинг оболочечных белков Е1 и Е2.

2.4.5. Влияние гликозилирования оболочечных белков на их структуру и функции.

2.4.6. Гетеродимер Е1Е2.

2.4.7. Образование вириона и высвобождение вирусной частицы во внеклеточное пространство.

2.4.8. Участки оболочечных белков, ответственные за распознавание возможных рецепторов вируса гепатита С.

2.4.9. Влияние оболочечных белков на регуляцию биосинтеза белков клетки-хозяина.

2.5.Антигенные свойства оболочечных белков вируса гепатита С.

2.6.Перспективы создания вакцины против вируса гепатита С.

2.7.3аключение.

3 Материалы и методы.

3.1 Химические реагенты и биологические препараты.

3.2 Растворители.

3.3 Оборудование и программное обеспечение

3.4 Методы.

3.4.1 Синтез пептидов.

3.4.1.1 Снятие Fmoc-защиты с N-концевой аминогруппы.

3.4.1.2 Присоединение Fmoc-защищенных аминокислот к свободным аминогруппам на иглах.

3.4.1.3 Ацетилирование N-концевых а-аминогрупп пептидов.

3.4.1.4 Биотинилирование N-концевых а-аминогрупп пептидов.

3.4.1.5 Снятие защит с боковых групп аминокислотных остатков пептида и снятие пептида в раствор пептидов с полимерного носителя.

3.4.1.6 Восстановление сульфоксидных групп пептида.

3.4.2 Тестирование биотинилированных пептидов на взаимодействие с гепарином

3.4.3 Конъюгация пептидов с белками-носителями.

3.4.3.1 Получение конъюгата пептида с белком-носителем с использованием глутарового альдегида.

3.4.3.2 Получение конъюгата пептида с белком-носителем с использованием N- гидроксисукцинимидного эфира 3-малеимидобензойной кислоты

3.4.3.3 Получение конъюгата пептида с белком-носителем с использованием диметилсуберимидата.

3.4.3.4 Получение конъюгата пептида с белком-носителем с использованием 1-этил-3'(3'-диметиламинопропил)карбодиимид.

3.4.3.5 Качественная и количественная характеристика конъюгатов.

3.4.4 Получение сывороток и препаратов иммуноглобулинов от иммунизированных животных.

3.4.5 Тестирование сывороток методом иммуноферментного анализа

3.4.5.1 ИФА с использованием в качестве антигена на поверхности планшета синтетических пептидов или конъюгатов пептидов.

3.4.5.2 ИФА с использованием на поверхности планшета в качестве антигена синтетических биотинилированных пептидов.

3.4.5.3 ИФА с использованием в качестве антигена пептида, ковалентно связанного с поверхностью планшет.

3.4.5.4 ИФА с использованием в качестве антигена на поверхности планшета оболочечного белка Е2 и гетеродимера Е1Е2.

3.4.5.5 Конкурентный иммуноферментный анализ.

4 Результаты и их обсуждение.

4.1 Составление структурно-функциональной карты оболочечных белков

4.2 Поиск гликозаминогликан-связывающих участков в высококонсервативных фрагментах оболочечных белков ВГС.

4.3 Изучение антигенных свойств высококонсервативных фрагментов оболочечных белков ВГС.

4.3.1 Выбор высококонсервативных фрагментов оболочечных белков ВГС для изучения антигенной активности и синтез соответствующих им пептидов.

4.3.2 Получение синтетических конструкций, включающих ВКФ для иммунизации животных.

4.3.3 Получение антипептидных антител к фрагментам CR3, CR4, CR5 и CHR у кроликов.

4.3.4 Получение антипептидных антител к фрагментам CR1, CR5 и CHR у мышей.

4.3.5 Определение специфичности антипептидных антител к препаратам оболочечных белков ВГС.

4.4 Получение синтетических пептидных Т-В эпитопных конструкции на основе высококонсервативных фрагментов оболочечных белков ВГС.

4.4.1. Синтез Т-В эпитопных конструкций.

4.4.2. Получение антител к Т-В-эпитопным конструкциям и определение их специфичности.

4.4.3. Взаимодействие анти Т-В-эпитопных антител с препаратами оболочечных белков ВГС.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональная и антигенная характеристика высококонсервативных фрагментов оболочечных белков Е1 и Е2 вируса гепатита С"

Актуальность проблемы

Вирус гепатита С (ВГС) является основной причиной парентерального (трансфузионного) гепатита, ранее называвшегося гепатитом ни А ни В. У большинства инфицированных (80%) гепатит С протекает в хронической форме и может вызывать цирроз и первичный рак печени. В настоящее время вакцина, предотвращающая заражение вирусом гепатита С, не разработана, а лечение а-интерфероном (в комбинации с рибавирином или без него) эффективно только лишь для ~40% больных хроническим гепатитом С и имеет в большинстве случаев серьезные побочные эффекты (Bartenschlager et al., 2000).

Оболочечные белки ВГС играют важную роль на ранних стадиях жизненного цикла вируса. Эти белки отвечают за взаимодействие с рецепторами, они участвуют в слиянии вирусной оболочки и клеточной мембраны, в сборке вирусной частицы в клетке и высвобождении из клетки. Несмотря на накопленные сведения об оболочечных белках и возможных рецепторах для ВГС, механизмы связывания вируса с поверхностью клеток, проникновения вирусной частицы в клетку-хозяина, а также сборки и высвобождения вирусной частицы из клетки все еще не установлены, точно не определены и участки оболочечных белков ВГС, ответственных за эти процессы. По этой причине изучение функциональных свойств оболочечных белков ВГС остается актуальной проблемой.

Оболочечные белки ВГС играют важную роль на ранних стадиях жизненного цикла вируса. Эти белки отвечают за взаимодействие с рецепторами и участвуют в процессах слияния вирусной оболочки и клеточной мембраны, сборки вирусной частицы в клетке и высвобождения из клетки. Несмотря на накопленные сведения о свойствах и функциях оболочечных белков и возможных рецепторах для ВГС, механизмы связывания вируса с поверхностью клетки, проникновения вирусной частицы в клетку-хозяина, а также сборки и высвобождения вирусной частицы из клетки все еще не установлены. Имеется крайне мало информации об участках оболочечных белков ВГС, ответственных за эти процессы. По этой причине изучение структуры и функций оболочечных белков ВГС и их фрагментов остается актуальной проблемой.

Особенностью ВГС является чрезвычайно высокая вариабельность его оболочечных белков. Выделяют два гипервариабельных участка обо-лочечного белка Е2, которые являются иммунодоминантными; антитела против них способны нейтрализовать проникновение вируса в клетку. Однако эти антитела специфичны лишь к одному или нескольким квазивидам вируса и не обеспечивают защиту организма от иных генетических вариантов ВГС. Существование эпитопов вируснейтрализующих антител вне гипервариабельных участков подтверждают многочисленные экспериментальные данные (Farci et al., 1996; Shimizu et al., 1994; Mario et al., 1996; Rodda et al., 1996), однако ни в одной работе структуры таких эпитопов не были определены. По этой причине необходим поиск эпитопов оболочечных белков ВГС вне гипервариабельных участков.

Наибольший интерес представляют участки оболочечных белков, являющиеся консервативными для большинства квазивидов вируса. Такие участки могут быть ответственными за взаимодействие вируса с клеточными рецепторами и проникновение вируса внутрь клетки, и потому могут вызвать выработку вируснейтрализующих антител для различных генетических вариантов ВГС.

Таким образом, структурно-функциональная и антигенная характеристика высококонсервативных фрагментов оболочечных белков ВГС является актуальной задачей. Информация о функционально значимых и антигенно активных фрагментах оболочечных белков ВГС необходима для разработки иммуногенных конструкций, способных вызывать выработку вируснейтра-лизующих антител.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. провести поиск и анализ описанных в литературе функционально значимых участков оболочечных белков и составить структурно-функциональную карту оболочечных белков ВГС;

2. выявить высококонсервативные фрагменты оболочечных белков ВГС, способные взаимодействовать с гепарином - предполагаемым рецептором ВГС;

3. синтезировать пептиды, соответствующие высококонсервативным участкам оболочечных белков ВГС, и получить пептидные иммуногенные конструкции;

4. получить антипептидные антитела и тестировать их на взаимодействие с обол очечным белком Е2 и гетеродимером Е1Е2.

Научная новизна. В работе впервые:

• картированы сайты специфического взаимодействия с гепарином в составе четырех высококонсервативных участков оболочечного белка Е2 ВГС;

• показана антигенность четырех (CR1, CR4, CR5 и CHR) высококонсервативных фрагментов оболочечных белков ВГС в составе конъюгатов с белками-носителями и одного фрагмента (CR5), конъюгированного с полимером - полиосидонием, получены гипериммунные сыворотки, содержащие антипептидные антитела против этих фрагментов;

• показана способность антипептидных антител, специфичных к фрагментам CHR и CR5, взаимодействовать с обол очечным белком Е2 и гетеродимером Е1Е2 ВГС;

Практическая значимость исследования

Составленная структурно-функциональная карта может быть использована при изучении структурно-функциональных взаимоотношений оболочечных белков ВГС, взаимодействия оболочечных белков с молекулами поверхности клетки, эпитопном картировании, конструировании синтетических вакцинных конструкций. Карта позволяет установить функциональную значимость того или иного фрагмента или аминокислотного остатка (а.к.о.) для жизнедеятельности ВГС, его консервативность, возможные аминокислотные замены в пределах данного фрагмента (позиции), а также функции и консервативность близлежащих а.к.о. или участков оболочечных белков.

Обладающие антигенностью высококонсервативные фрагменты (ВКФ) оболочечных белков, исследованные в данной работе, могут быть использованы в разработке синтетической пептидной конструкции для кандидатной вакцины против ВГС. Проявление антигенных свойств у фрагмента CR5 в конъюгате с полиоксидонием свидетельствует о возможности применения синтетических фрагментов оболочечного белка ВГС и полиоксидония (в качестве эффективного адъюванта) в разработке вакцины против ВГС.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были доложены на следующих симпозиумах и конференциях: 5-ой научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001» (Санкт-Петербург, 2001), 6-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2002), 3rd International and 28th European Peptide Symposium «Bridges Between Disciplines» (Prague, 2004), International Conference "Genomics, Proteomics and Bioinformatics for Medicine" (Moscow, 2004). Апробация диссертации состоялась на межлабораторном семинаре ГУ НИИ БМХ РАМН 5 апреля 2007 года.

Публикации

Материалы диссертационной работы опубликованы в 4 статьях и 6 публикациях сборников докладов научных конференций.

Структура и объем диссертации

Материалы диссертации изложены на 178 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов, их обсуждения, выводов, списка цитированной литературы, включающего 272 источника, приложения. Работа иллюстрирована 5 таблицами и 15 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Фарафонова, Татьяна Евгеньевна

5 Выводы

1. Составлена структурно-функциональная карта оболочечных белков вируса гепатита С.

2. Определены четыре линейные высококонсервативные фрагменты оболочечного белка Е2, ответственные за его взаимодействие с гепарином - возможным рецептором ВГС.

3. Показано, что высококонсервативные фрагменты оболочечных белков ВГС, включенные в состав искусственных иммуногенных конструкций, проявляют антигенные свойства и способны вызывать образование специфических антител, взаимодействующих с оболочечным белком Е2 и гетеродимером Е1Е2 ВГС.

4. Получены высокоантигенные синтетические Т-В-эпитопные пептидные конструкции, содержащие в своем составе высококонсервативные фрагменты оболочечного белка Е2 ВГС и способные вызывать образование антител, взаимодействующих с полноразмерным оболочечным белком Е2 и гетеродимером Е1Е2 ВГС.

4.5 Заключение

Составленная нами структурно-функциональная карта оболочечных белков El, Е2 и р7 ВГС содержит обобщенную информацию об аминокислотных последовательностях этих белков и их вариациях в разных генетических вариантах вируса, а также об известных из публикаций функционально важных участках. Данная карта позволяет установить функциональную значимость того или иного фрагмента или а.к.о. для жизнедеятельности ВГС, его консервативность, возможные аминокислотные замены в пределах данного фрагмента (позиции) а также функции и консервативность близлежащих а.к.о. или участков оболочечных белков. Нами, в частности, были выявлены новые вариабельные участки в составе этих белков и были отмечены некоторые особенности первичной структуры в областях неконсервативных сайтов гликозилирования, которые, возможно, заинтересуют исследователей, изучающих структурно-функциональные взаимоотношения в оболочечных белках ВГС с использованием метода точечного мутагенеза. Карта всегда может быть дополнена новыми данными, а также усовершенствована путем разграничения структурных и функциональных особенностей различных генотипов. Для этого необходим более тщательный анализ литературных данных и составление консенсусных последовательностей для каждого генотипа в отдельности. Карта может быть полезна при изучении структурно-функциональных свойств оболочечных белков ВГС, взаимодействия оболочечных белков с молекулами поверхности клетки, эпитопном картировании, конструировании синтетических вакцинных конструкций.

Впервые были картированы сайты специфического взаимодействия с гепарином в составе четырех высококонсервативных участков белка Е2 ВГС. Структуры этих сайтов отличаются от паттернов, соответствующих известным из литературы гепарин-связывающим мотивам белков, однако имеют с ними некоторые общие свойства: обогащенность положительно заряженными а.к.о. и присутствие в двух гепарин-связывающих сайтах белка Е2 ВГС более одного остатка Туг. Нами было высказано предположение о том, что выявленные нами участки взаимодействия с гепарином образуют в результате пространственной укладки полипептидной цепи белка Е2 единый сайт, который может быть ответственным за специфическое связывание ВГС с корецептором - гепарансульфатом клеточной мембраны гепатоцитов. Это предположение косвенно подтверждается в работе Barth et al. (2006), авторы которой показали, что в формировании сайта взаимодействия с гепарансульфатами могут участвовать различные сегменты а.к. последовательности белка Е2.

К сожалению, не удалось получить антипептидных антител к одному из участков связывания гепарина, CR3. Антитела же к наиболее активно взаимодействовавшему с гепарином участку CR4 не связывались с оболо-чечным белком Е2 и гетеродимером Е1Е2. Также не взаимодействовали с гетеродимером Е1Е2 и антитела к ВКФ белка Е1. По-видимому, использованные конъюгаты пептидов не являлись адекватными моделями соответствующих фрагментов в составе оболочечных белков ВГС. Однако из-за присутствия в этих фрагментах довольно большого количества а.к.о. с боковыми функциональными группами подобрать подходящий способ конъюгации было весьма сложно. В то же время среди полученных нами антисывороток к конъюгатам фрагмента CHR и N-концевой части CR5 с белком-носителем, а также к конъюгату CR5 с полиоксидонием оказались такие, которые содержали антитела, взаимодействовавшие с оболочечны-ми белками ВГС. Это говорит о принципиальной возможности использования синтетических фрагментов оболочечных белков ВГС, конъюгиро-ванных с носителями, обладающими Т-эпитопной активностью либо иммуностимулирующими свойствами, вызывать В-клеточный иммунный ответ против оболочечных белков ВГС, а, значит, и против самого вируса. Экспериментально подтверждена и принципиальная возможность создания полностью синтетических пептидных антигенных конструкций из отдельных фрагментов оболочечных белков ВГС. Полученные конструкции, содержали в своем составе предполагаемый В-эпитоп и предсказанный нами Т-хелперный эпитоп с широкой специфичностью в отношении различных аллельных вариантов МНС II. Эти конструкции обладали высокой имму-ногенностью в отсутствие белкового носителя, и что более важно, были способны вызывать образование антител специфичных к полноразмерным белкам ВГС. Использование консервативных фрагментов оболочечных белков в составе этих пептидных конструкций и в составе конъюгатов пептидов с белками позволяет полагать, что антитела вырабатываемые в ответ на них антитела будут взаимодействовать с самыми различными изолята-ми ВГС.

Полученные в работе данные могут послужить основой для разработки иммуногенных конструкций для синтетических и рекомбинантных искусственных вакцин против гепатита С, а также для поиска терапевтических средств, направленных на блокирование взаимодействия ВГС с рецепторами клеток-мишеней.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фарафонова, Татьяна Евгеньевна, Москва

1. Вольпина О.М., Титова М.А., Жмак М.Н. и др. Предсказание структуры пептидов, способных индуцировать образование антител у мышей // Биоорганическая химия. 2002. - Т. 28. - С 387-395.

2. Куприянова М.А., Жмак М.Н., Короев Д.О. и др. Синтетические пептидные конструкции на основе иммуноактивных фрагментов белка VPJ1} вируса ящура штамма А{22} // Биоорган, хим. 2000. - Т. 12. - С. 926-933.

3. Николаева Л.И., Оленина Л.В., Колесанова Е.Ф. Иммунитет при разных формах гепатита С // Russian J. of immunology. 1999. - Т. 4. № 2. - С. 91112.

4. Рамзаев В.П. Электронно-микроскопическое исследование процесса поглощения липопротеидов низкой плотности перикардиальными макрофагами больных атеросклерозом // Бюлл. эксп. биол. мед. 1982. - Т. 93. №3.-С. 113-115.

5. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. Пер. с англ. М.: Мир. -2000.-С. 551.

6. Соболев Б.Н., Поройков В.В., Оленина Л.В., Колесанова Е.Ф., Арчаков А.И. Анализ белков вируса гепатита С на основе аминокислотных последовательностей и литературных данных // Биофизика. 2002. - Т. 47. № 2.-С. 204-210.

7. Хаитов Р. М., Пинегин Б. В. Иммуномодуляторы: механизм действия и клиническое применение // Иммунология. 2003. №3. - С. 196-202.

8. Ahn K., Szczesna-Skorupa E., Kemper B. The amino-terminal 29 amino acids of cytochrome P450 2C1 are sufficient for retention in the endoplasmic reticulum // The Journal of biological chemistry. 1993. - V. 268. № 25. - P. 18726-18733.

9. Akula S.M., Pramod N.P., Wang F.Z., Chandran B. Human herpesvirus 8 envelope-associated glycoprotein В interacts with heparin sulfate-like moieties // Virology. 2001. V. 284. №2. - P. 235-249.

10. Allander Т., Forns X., Emerson S.U., Purcell R.H., Bukh J. Hepatitis С virus envelope protein E2 binds to CD81 of tamarins // Virology. 2000. - V. 277. №2.- P. 358-367.

11. Alvarez C.P., Lasala F., Carrillo J., Muniz O., Corbi A.L., Delgado R. C-type lectins DC-SIGN and L-SIGN mediate cellular entry by Ebola virus in cis and in trans // Journal of Virology. 2002. - Vol. 76. P. 6841-6844.

12. Atherton E., Sheppard R.C. Solid phase peptide synthesis: a practical approach. // Oxford-New York-Tokyo: IRL Press. Oxford University Press -1989.

13. Bahraoui E.M., Granier C., Van Rietschoten J., Rochat H., el Ayeb M. Specificity and neutralizing capacity of antibodies elicited by a synthetic peptide of scorpion toxin// J. Immunol. 1986. -V. 136. №9. - P. 3371-3377.

14. Bartenschlager R., Ahlborn-Laake L., Mous J., Jacobsen H. Kinetic and structural analyses of hepatitis С virus polyprotein processing // Journal of Virology. 1994. - Vol. 68. - P. 5045-5055.

15. Bartenschlager R., Lohmann V. Novel cell culture systems for the hepatitis С virus // Antiviral Research. 2001. - Vol. 52. - P. 1-17.

16. Bartosch В., Dubuisson J., Cosse, F.-L. Infectious hepatitis С virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes // Journal of Experimental Medicine. 2003a. - Vol. 197. - P. 633-642.

17. Behrens S.E., Tomei L., De Francesco R. Identification and properties of the RNA-dependent RNA polymerase of hepatitis С virus // The EMBO journal. -1996.-Vol. 15. № l.-P. 12-22.

18. Blanchard E., Brand D., Trassard S., Goudeau A., Roingeard P. Hepatitis С virus-like particle morphogenesis // Journal of Virology. 2002. - Vol. 76. - P. 4073-4079.

19. Blight K.J., McKeating J.A., Marcotrigiano J., Rice C.M. Efficient replication of hepatitis С virus genotype la RNAs in cell culture // Journal of Virology. -2003. Vol. 77. № 5. p. 3181-3190.

20. BLOSUM Matrices, Henikoff S., Henikoff J.G. Amino acid substitution matrices from protein blocks // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1992.-V. 89. №22.-P. 10915-10919.

21. Branch A.D. Replication of Hepatitis С Virus: Catching It in the Act // Hepatology, 1996. - Vol. 23. № 2. - P. 372-375.

22. Brazzoli M., Helenius A., Foung S.K., Houghton M., Abrignani S., Merola M. Folding and dimerization of hepatitis С virus El and E2 glycoproteins in stably transfected CHO cells // Virology. 2005. - Vol. 332. № 1. - P. 438-453.

23. Cardin A.D., Hirose N., Blankenship D.T. et al. Binding of high reactive heparin to human apolipoprotein E: identification of two heparin-binding domains // Biochem Biophys Res Com. 1986. - V. 134. - P. 783-789.

24. Cardin A.D., Weintraub H.J. Molecular modeling of protein-glycosaminoglycan interactions // Arteriosclerosis. 1989. - V. 9. №1. - P. 21-32.

25. Carrere-Kremer S., Montpellier-Pala C., Cocquerel L., Wychowski C., Penin F., Dubuisson J. Subcellular localization and topology of the p7 polypeptide of hepatitis С virus // Journal of Virology. 2002. - Vol. 76. № 8. - P. 3720-3730.

26. Castet V., Moradpour D. A model for the study of hepatitis С virus entry // Hepatology. 2003. - Vol. 38. № 3. - P. 771-774.

27. Chan S.W., Egan P.A. Hepatitis С virus envelope proteins regulate CHOP via induction of the unfolded protein response // FASEB J. 2005. - V. 19. №11.- P. 1510-1512.

28. Chang K.-M., Rehermann В., McHutchison J., et al. Immunological significance of cytotoxic T lymphocyte epitope variants in patients chronically infected by the hepatitis С virus // J. Clin. Invest. 1997. - V. 100. - P. 23762385.

29. Chen Y., Maguire Т., Hileman R.E., Fromm J.R., Esko J.D., Linhardt R.J., Marks R.M. Dengue virus infectivity depends on envelope protein binding to target cell heparan sulfate // Nat Med. 1997. - V.3. №8. - P. 866-871.

30. Choo Q.-L., Kuo G., Weiner A.J., Overby L.R., Bradley D.W., Houghton M. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome // Science. 1989. - Vol. 244. - P. 359-362.

31. Choukhi A., Pillez A., Drobecq H., Sergheraert C., Wychowski C., Dubuisson J. Characterization of aggregates of hepatitis С virus glycoproteins // Journal of General Virology . 1999. - V. 80. №Pt 12. - P. 3099-30107.

32. Choukhi A., Ung S., Wychowski C., Dubuisson J. Involvement of endoplasmic reticulum chaperones in the folding of hepatitis С virus glycoproteins // Journal of Virology. 1998. - Vol. 72. № 5. - P. 3851-3858.

33. Clarke B. Molecular virology of hepatitis С virus // Journal of General Virology . 1997. - V. 78. - P. 2397-2410.

34. Clayton R.F., Owsianka A., Aitken J., Graham S., Bhella D., Patel A.H. Analysis of antigenicity and topolgy of E2 glycoprotein present on recombinant hepatitis С virus-like particles // Journal of Virology. 2002. - Vol. 76. № 15. - P. 7672-7682.

35. Cormier E. G., Tsamis F., Kajumo F., Durso R. J., Gardner J. P., Dragic T. CD81 is an entry coreceptor for hepatitis С virus // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2004a - Vol. 101. - P. 7270-7274.

36. Dash S., Halim A.B., Tsuji H., Hiramatsu N., Gerber M.A. Transfection of HepG2 cells with infectious hepatitis С virus genome // American journal of pathology. 1997. - Vol. 151. - P. 363-373.

37. De Francesco R., Steinkuhler C. Structure and function of the hepatitis С virus NS3-NS4A serine proteinase // Current topics in microbiology and immunology. 2000. - Vol. 42. - P. 149-169.

38. Deleersnyder V., Pillez A., Wychowski C., Blight K., Xu J.,Hahn Y.S., Rice C.M., Dubuisson J. Formation of native hepatitis С virus glycoprotein complexes // Journal of Virology. 1997. - Vol. 71. - P. 697-704.

39. Drummer H.E., Boo I., Maerz A.L., Poumbourios P. A conserved Gly436-Trp-Leu-Ala-Gly-Leu-Phe-Tyr motif in hepatitis С virus glycoprotein E2 is a determinant of CD81 binding and viral entry // J Virol. 2006. - V. 80. №16. - P. 7844-7853.

40. Dubuisson J., Penin F., Moradpour D. Interaction of hepatitis С virus proteins with host cell membranes and lipids // Trends in cell biology. -2002. Vol. 12. № 11.-P. 517-523.

41. Dubuisson J., Rice C.M. Hepatitis С virus glycoprotein folding: disulfide bond formation and association with calnexin // Journal of Virology. 1996. -Vol. 70. №2.-P. 778-786.

42. Eren R., Landstein D., Terkieltaub D., Nussbaum O., Zauberman A., Ben-Porath J., Gopher J., Buchnick R., Kovjazin R., Rosenthal-Galili Z., Aviel S., Ilan

43. Fearon DT, Carter RH. The CD 19/CR2/TAPA-1 complex of В lymphocytes: linking natural to acquired immunity. Annu Rev Immunol. 1995. - V. 13. -P.127-149.

44. Feinberg H., Mitchell D.A., Drickamer K., Weis W.I. Structural basis for selective recognition of oligosaccharides by DC-SIGN and DC-SIGNR // Science. 2001. - Vol. 294. №5549. - P. 2163-2166.

45. Feitelson M.A. Hepatitis С virus: From laboratory to clinic. Cambridge, UK: Cambridge University Press, 2002. - P. 3-11.

46. Feitelson M.A., Larkin J.D. New animal models of hepatitis В and С // Institute of Laboratory Animal Resources journal. 2001. - Vol. 42. № 2. - P. 127-138.

47. Flint M., Dubuisson J., Maidens C., Harrop R., Guile G.R., Borrow P., McKeating J.A. Functional characterization of intracellular and secreted forms of a truncated hepatitis С virus E2 glycoprotein // J Virol. 2000. - V. 74. №2. -P.702-709.

48. Flint M., McKeating J.A. The C-terminal region of the hepatitis С virus El glycoprotein confers localization within the endoplasmic reticulum // Journal of General Virology. 1999. - Vol. 80. - P. 1943-1947.

49. Flint M., von Hahn Т., Zhang J., Farquhar M., Jones C.T., Balfe P., Rice C.M., McKeating J.A. Diverse CD81 proteins support hepatitis С virus infection // Journal of Virology. 2006. - V. 80. №22. - P. 11331-11342.

50. Forns X., Purcell R.H., Bukh J. Quasispecies in viral persistence and pathogenesis of hepatitis С virus // Trends Microbiol. 1999. - V. 7. - P. 402-410.

51. Friebe P., Bartenschlager R. Genetic analysis of sequences in the 3' nontranslated region of hepatitis С virus that are important for RNA replication // Journal of Virology. 2002. - Vol. 76. - P. 5326-5338.

52. Friebe P., Lohmann V.F., Krieger N.F., Bartenschlager R. Sequences in the 5' nontranslated region of hepatitis С virus required for RNA replication // Journal of Virology. 2001. - Vol. 75. - P. 12047-12057.

53. Garson J.A., Lubach D., Passas J., Whitby K., Grant PR. Suramin blocks hepatitis С binding to human hepatoma cells in vitro // Journal of medical virology. 1999. - V. 57. №3. - P. 238-242.

54. Gaudy C., Lambele M., Moreau A., Veillon P., Lunel F., Goudeau A. Mutations within the hepatitis С virus genotype lb E2-PePHD domain do not correlate with treatment outcome // Journal of clinical microbiology. 2005. - V. 43.№2.-P. 750-754.

55. Gavel Y., von Heijne G. Sequence differences between glycosylated and non-glycosylated Asn-X-Thr/Ser acceptor sites: implications for protein engineering // Protein Eng. 1990. - V. 3. №5. - P.433-442.

56. Georgopoulou U., Caravokiri K., Mavromara P. Suppression of the ERK1/2 signaling pathway from HCV NS5A protein expressed by herpes simplex recombinant viruses //Archives of virology. 2003. - Vol. 148. № 2. - P. 237-251.

57. Ghosh A.K., Majumder M., Steele R., Meyer K., Ray R., Ray R.B. Hepatitis С virus NS5A protein protects against TNF-alpha mediated apoptotic cell death // Virus research. 2000. - Vol. 67.-P. 173-178.

58. Ghosh A.K., Steele R., Meyer K., Ray R., Ray R.B. Hepatitis С virus NS5A protein modulates cell cycle regulatory genes and promotes cell growth // The Journal of General virology. 1999.-Vol. 80.-P. 1179-1183.

59. Goffard A., Callens N., Bartosch В., Wychowski C., Cosset FL., Montpellier C, Dubuisson J. Role of N-linked glycans in the functions of hepatitis С virus envelope glycoproteins // J Virol. 2005. - V. 79. №3. - P. 8400-8409.

60. Goffard A., Dubuisson J. Glycosylation of hepatitis С virus envelope proteins // Biochimie. 2003. - V. 85. №3-4. - P.295-301.

61. Grakoui A., Wychowski C., Lin C., Feinstone S.M., Rice C.M. Expression and identification of hepatitis С virus polyprotein cleavage products // J Virol. -1993. V. 67. №3. - P. 1385-1395.

62. Harada Т., Tautz N., Thiel H.J. E2-p7 region of the bovine viral diarrhea virus polyprotein: processing and functional studies // Journal of Virology. 2000. -Vol. 74. № 20. - P. 9498-9506.

63. Heo Т.Н., Lee S.M., Bartosch В., Cosset F.L., Kang C.Y. Hepatitis С virus E2 links soluble human CD81 and SR-B1 protein // Virus Res. 2006. - V. 121. №1.-P. 58-64.

64. HijikataM., Kato N., Ootsuyama Y., Nakagawa M., Ohkoshi S., Shimotohno K. Hypervariable regions in the putative glycoprotein of hepatitis С virus // Biochem Biophys Res Commun. 1991. - V. 175. №1. - P. 220-228.

65. Hijikata M., Shimizu Y.K., Kato H., Iwamoto A., Shih J.W., Alter H.J., Purcell R.H., Yoshikura H. Equilibrium centrifugation studies of hepatitis С virus: evidence for circulating immune complexes // Journal of Virology. 1993. - Vol. 67.-P. 1953-1958.

66. Hilgard P., Stockert R. Heparan sulfate proteoglycans initiate dengue virus infection of hepatocytes // Hepatology. 2000. - V. 32. №5. - P. 1069-1077.

67. Hofmann W.P., Zeuzem S., Sarrazin C. Hepatitis С virus-related resistance mechanisms to interferon alpha-based antiviral therapy // Journal of clinical virology. 2005. - V. 32. №2. - P. 86-91.

68. Hugle Т., Fehrmann F., Bieck E., Kohara M., Krausslich H.G., Rice C.M., Blum H.E., Moradpour D. The hepatitis С virus nonstructural protein 4B is an integral endoplasmic reticulum membrane protein // Virology. 2001. - V. 284. №1. - P. 70-81.

69. Jin L., Peterson D.L. Expression, isolation, and characterization of the hepatitis С virus ATPase/RNA helicase // Archives of biochemistry and biophysics. 1995. - Vol. 323. - P. 47-53.

70. Kalkeri G, Khalap N, Garry RF, Fermin CD, Dash S. Hepatitis С virus protein expression induces apoptosis in HepG2 cells // Virology. 2001. - V. 282. №1. - P. 26-37.

71. Kao C.C., Yang X., Kline A., Wang Q.M., Barket D., Heinz B.A. Template requirements for RNA synthesis by a recombinant hepatitis С virus RNA-dependent RNA polymerase // Journal of Virology. 2000. - V. 74. №23. - P. 11121-11128.

72. Kato N., Ootsuyama J., Sekiya H., Ohkoshi S., Nakazawa Т., Hijikata M., Shimotohno K. Genetic drift in hypervariable region 1 of the viral genome in persistent hepatitis С virus infection // Journal of Virology. 1994. - Vol. 68. - P. 4776-4784.

73. Kato N., Shimotohno K. Systems to culture hepatitis С virus // Current topics in microbiology and immunology. 2000. - Vol. 242. - P. 261-278. 2000a.

74. Keck Z.Y., Xia J., Cai Z., Li Т.К., Owsianka A.M., Patel A.H., Luo G., Foung S.K. Immunogenic and functional organization of hepatitis С virus (HCV) glycoprotein E2 on infectious HCV virions // Journal of Virology. 2007. - V. 81. №2.-P. 1043-1047.

75. Kim D.W., Gwack Y., Han J.H., Choe J. C-terminal domain of the hepatitis С virus NS3 protein contains an RNA helicase activity // Biochemical and biophysical research communications. 1995.-Vol. 215.-P. 160-166.

76. Knaus H.G., Scheffauer F., Romanin C., Schindler H.G., Glossmann H. Heparin binds with high affinity to voltagedependent L-type Ca2+ channels // The Journal of biological chemistry. 1990. - V. 265. - P. 11156-11166.

77. Koike K., Moriya K., Ishibashi K., Matsuura Y., Suzuki Т., Saito I., lino S., Kurokawa K., Miyamura T. Expression of hepatitis С virus envelope proteins in transgenic mice // Journal of General Virology. 1995. - V. 76. № Pt 12. - P. 3031-3038.

78. Kolykhalov A.A., Agapov E.V., Blight K.J., Mihalik K., Feinstone S.M., Rice C.M. Transmission of hepatitis С by intrahepatic inoculation with transcribed RNA // Science. 1997. - Vol. 277. - P. 570-574.

79. Kornfeld R., Kornfeld S. Assembly of asparagine-linked oligosaccharides // Annual review of biochemistry. 1985. - V. 54. - P. 631-664.

80. Koutsoudakis G., Herrmann E., Kallis S., Bartenschlager R., Pietschmann T. The level of CD81 cell surface expression is a key determinant for productiveentry of hepatitis С virus into host cells // Journal of Virology. 2007. - V. 81. №2.-P. 588-598.

81. Kroschewski H, Allison SL, Heinz FX, Mandl CW. Role of heparan sulfate for attachment and entry of tick-borne encephalitis virus // Virology. 2003. - V. 308. №1.- P. 92-100.

82. Hl.Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. - V. 15. №227(259). - P. 680-685.

83. Lan K.H., Sheu M.L., Hwang S.J., Yen S.H, Chen S.Y, Wu J.C., Wang Y.J., Kato N., Omata M., Chang F. Y., Lee S.D. HCV NS5A interacts with p53 and inhibits p53-mediated apoptosis // Oncogene. 2002. - Vol. 21. - P. 4801-4811.

84. Lawal Z., Petrik J., Wong V.S., Alexander G.J., Allain J.P. Hepatitis С virus genomic variability in untreated and immunosuppressed patients // Virology. -1997. Vol. 228. № 1. - P. 107-111.

85. Lawler J., Duquette M., Ferro P. Cloning and sequencing of chicken trombospondin // The Journal of biological chemistry. 1991. - V. 266. - P. 8039— 8043.

86. Lechman M., Murata K., Satoi J., Vergalla J., Baumert T.F., Liang T.J. Hepatitis С virus-like particles induce virus-specific humoral and cellular immune response in mice // Hepatology. 2001. - Vol. 34. - P. 417^123.

87. Lesk A. Introduction to protein architecture, 1/Ed. Oxford University Press. -New York. 2001.

88. Levy S, Shoham T. The tetraspanin web modulates immune-signalling complexes // Nat Rev Immunol. 2005. - V. 5. №2. - P. 136-148.

89. Levy S., Todd S.C., Maecker H.T. CD81 (TAPA-1): a molecule involved in signal transduction and cell adhesion in the immune system // Annual review of immunology. 1998.-Vol. 16.-P. 89-109.

90. Liberman E., Fong Y.L., Selby M.J., Choo Q.L., Cousens L., Houghton M, Yen T.S. Activation of the grp78 and grp94 promoters by hepatitis С virus E2 envelope protein//Journal of Virology 1999.-V. 73. №5.-P. 3718-3722.

91. Lin G., Simmons G., Pohlmann S., Baribaud F., Ni H., Leslie G.J., Haggarty

92. Lindenbach B.D., Evans M.J., Syder A.J., Wolk В., Tellinghuisen T.L., Liu

93. C.C., Maruyama Т., Hynes R.O, Burton D.R., McKeating J.A., Rice C.M. Complete replication of hepatitis С virus in cell culture // Science. 2005. - Vol. 309. №5734.-P. 623-626.

94. Linhardt R.J., Toida T. Characterization of glycosaminoglycans by capillary electrophoresis // Methods Mol Biol. 2003. - V. 213. - P. 131-144.

95. Lo S., Lin H.H. Variations within hepatitis С virus E2 protein and response to interferon treatment // Virus Res. 2001. - V. 75. №2. - P. 107-112.

96. Lo S.Y., Selby M.J. Ou J.H. Interaction between Hepatitis С Virus Core Protein and El Envelope Protein // Journal of Virology. 1996. - Vol. 70. № 8. -P. 5177-5182.

97. Lowry O.H, Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 1951. - V. 193. №1. - P. 265-275.

98. Ludwig I.S., Lekkerkerker A.N., Depla E., Bosman F., Musters R.J., Depraetere S., van Kooyk Y., Geij'tenbeek T.B. Hepatitis С virus targets DC-SIGN and L-SIGN to escape lysosomal degradation // Journal of Virology. 2004. - V. 78. №15.-P. 8322-8332.

99. Lundin M., Monne M., Widell A., Von Heijne G., Persson M.A. Topology of the membrane-associated hepatitis С virus protein NS4B // Journal of Virology. -2003. Vol. 77. № 9. - P. 5428-5438.

100. Luo G., Hamatake R.K., Mathis D.M., Racela J., Rigat K.L., Lemm J., Colonno R.J. De novo initiation of RNA synthesis by the RNA-dependent RNA polymerase (NS5B) of hepatitis С virus // Journal of Virology. 2000. - Vol. 74. №2.-P. 851-863.

101. Lyon M, Deakin JA, Gallagher JT. Liver heparan sulfate structure. A novel molecular design // The Journal of biological chemistry. 1994. - V. 269. №15. -P. 11208-11215.

102. Mackenzie J.M., Westway E.G. Assembly and maturation of the Flavivirus Kunjiin virus appear to the rough endoplasmic reticulum and along the secretory pathway, respectively // Journal of Virology. 2001. - Vol. 71. - P. 697-704.

103. Majumder M., Ghosh A.K., Steele R., Ray R., Ray, R.B. Hepatitis С virus NS5A physically associates with p53 and regulates p21/wafl gene expression in a p53-dependent manner//Journal of Virology.- 2001. -Vol. 75.-P. 1401-1407.

104. Majumder M., Ghosh A.K., Steele R., Zhou X.Y., Phillips N.J., Ray R., Ray, R. B. Hepatitis С virus NS5A protein impairs TNF-mediated hepatic apoptosis, but not by an anti-FAS antibody, in transgenic mice // Virology. 2002. - Vol. 294. -P. 94-105.

105. Margalit H., Fischer N., Ben-Sasson S.A. Comparative analysis of structurally defined heparin binding sequences reveals a distinct spatial distribution of basic residues // J Biol Chem. 1993. - V. 268. №>26. - P. 19228-19231.

106. Meier M., Bider M.D., Malashkevich V.N., Spiess M., Burkhard P. Crystal structure of the carbohydrate recognition domain of the HI subunit of the asialoglycoprotein receptor // J Mol Biol. 2000. - V. 300. №4. - P. 857-865.

107. Merola M., Brazzoli M., Cocchiarella F., Heile J.M., Helenius A., Weiner A.J., Houghton M., Abrignani S. Folding of hepatitis С virus El glycoprotein in a cell-free system //Journal of Virology.- 2001. Vol. 75. № 22. - P. 11205-11217.

108. Meurs E., Chong K., Galabru J., Thomas N.S., Kerr I.M., Williams B.R., Hovanessian A.G. Molecular cloning and characterization of the human double-stranded RNA-activated protein kinase induced by interferon // Cell. 1990. - V. 62. №2. -P.379-390.

109. Michalak J.P., Wychowski C., Choukhi A., Meunier J.C., Ung S., Rice C.M., Dubuisson J. Characterization of truncated forms of hepatitis С virus glycoproteins // Journal of General Virology. 1997. - Vol. 78. -P. 2299-2306.

110. Mink M.A, Benichou S., Madaule P., Tiollais P., Prince A.M., Inchauspe G. Characterization and mapping of a B-cell immunogenic domain in hepatitis С virus E2 glycoprotein using a yeast peptide library // Virology. 1994. - V. 200. №1. -.P.246-255.

111. Muller S., Plaue S., Couppez M., Van Regenmortel M.H. Comparison of different methods for localizing antigenic regions in histone H2A // Mol Immunol. 1986. - V. 23. №6. - P. 593-601.

112. Netski D.M., Mosbruger Т., Depla E., Maertens G., Ray S.C., Hamilton R.G., Roundtree S., Thomas D.L., McKeating J., Cox A. Humoral immune response inacute hepatitis С virus infection // Clin Infect Dis. 2005. - V. 41. №5. - P. 667675.

113. O'Farrell D., Trowbridge R., Rowlands D., Jager J. Substrate complexes of hepatitis С virus RNA polymerase (HC-J4): structural evidence for nucleotide import and de-novo initiation // J Mol Biol. 2003. - V. 326. №4. - P. 1025-1035.

114. Op De Beeck A., Cocquerel L., Dubuisson J. Biogenesis of hepatitis С virus envelope glycoproteins // Journal of General Virology. 2001. Vol. 82. - P. 25892595.

115. Pavio N., Lai M.M. The hepatitis С virus persistence: how to evade the immune system? // J Biosci. 2003. - V. 28. №3. - P. 287-304.

116. Pavlovic D., Neville D.C.A., Argaud O., Blumberg В., Dwek R.A., Fischer W.B., Zitzmann N. The hepatitis С virus p7 protein forms an ion channel that is inhibited by long-alkyl-chain iminosugar derivatives // Proceedings of the National

117. Academy of Sciences of the United States of America. 2003. - Vol. 100. № 10. -P. 6104-6108.

118. Pawlotsky J.M. Hepatitis С virus genetic variability: pathogenic and clinical implications // Clin Liver Dis. 2003. - V. 7. №1. - P. 45-66.

119. Penin F., Dubuisson J., Rey F.A., Moradpour D., Pawlotsky J.M. Structural Biology of Hepatitis С Virus // Hepatology. 2004. - Vol. 39. № 1. - P. 5-19.

120. Pileri P., Uematsu Y., Campagnoli S., Galli G., Falugi F., Petracca R., Weiner A.J., Houghton M., Rosa D., Grandi G., Abrignani S. Binding of hepatitis С virus to CD 81 // Science. 1998. - Vol. 282. - P. 938-941.

121. Pohlmann S., Zhang J., Baribaud F., Chen Z., Leslie G.J., Lin G., Granelli-Piperno A., Doms R.W., Rice C.M., McKeating J.A. Hepatitis С virus glycoproteins interact with DC-SIGN and DC-SIGNR // Journal of Virology. -2003. -V. 77. №7. P. 4070-4080.

122. Prince A.M., Huima-Byron Т., Parker T.S., Levine D.M. Visualization of hepatitis С virions and putative defective interfering particles isolated from low-density lipoproteins // Journal of viral hepatitis. 1996. - Vol. 3. № 1. - P. 11-7.

123. Rey F.A., Heinz F.X., Mandl C., Kunz C., Harrison S.C. The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution // Nature. 1995. -V. 375. №6529.-P.291-298.

124. Roingeard F., Hourioux C., Blanchard E., Brand D., Ait-Goughoulte M. Hepatitis С virus ultrastructure and morphogenesis // Biology of the Cell. 2004. -Vol. 96.-P. 103-108.

125. Rosenberg S. Recent advances in the molecular biology of hepatitis С virus // Journal of molecular biology. 2001. - Vol. 313. - P. 451-464.

126. Santolini E., Migliaccio G., La Monica N. Biosynthesis and biochemical properties of the hepatitis С virus core protein // Journal of Virology. 1994. Vol. 68. №6.-P. 3631-3641.

127. Sato Т., Sakaguchi M., Mihara K., Omura T. The amino-terminal structures that determine topological orientation of cytochrome P-450 in microsomal membrane // EMBO J. - 1990. - V.9. - P.2391-2397.

128. Scarselli M., Facchiano G., Russo A., Molinari H., Ragona L., Zetta L., Niccolai N. The design of a specific ligand of HIV gpl20 // J. of Peptide Science. 1997. - V. 3. №5. P.383-390.

129. Schulz-Utermoehl Т., Edwards R.J., Boobis A.R. Affinity and potency of proinhibitory antipeptide antibodies against CYP2D6 is enhanced using cyclicpeptides as immunogens // Drug.Metab. Dispos. 2000. - V. 28. №5. - P. 544551.

130. Selby M.J., Glazer E., Masiarz F., Houghton M. Complex processing and protein:protein interactions in the E2:NS2 region of HCV // Virology. 1994.-Vol. 204.-P. 114-122.

131. Shi L., Liu S., Fan G.X., Sheng L., Ren H.X., Yuan Y.K. Effective induction of type 1 cytotoxic T cell responses in mice with DNA vaccine encoding two hepatitis С virus cytotoxic T lymphocyte epitopes // Viral Immunol. 2006. - V. 19. №4.-P. 702-711.

132. Shimizu Y.K., Feinstone S.M., Kohara M., Purcell R.H., Yoshikura H. Hepatitis С Virus: Detection of intracellular virus particles by electron microscopy // Hepatology. 1996. - Vol. 23. № 2. - P. 205-209.

133. Shukla D., Spear P.G. Herpesviruses and heparan sulfate: an intimate relationship in aid of viral entry // J Clin Invest. 2001. - V. 108. №4. - P. 503510.

134. Shukla D.D., Hoyne P.A., Ward C.W. Evaluation of complete genome sequences and sequences of individual gene products for the classification of hepatitis С viruses // Archives of virology. 1995. -Vol. 140. №» 10. - P. 17471761.

135. Silberstein S., Gilmore R. Biochemistry, molecular biology, and genetics of the oligosaccharyltransferase // The FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 1996. - Vol. 10. № 8.-P. 849-858.

136. Simmonds P. Genetic diversity and evolution of hepatitis С virus-15 years on // Journal of General Virology. 2004. - V. 85. № 11. - P. 3173-3188.

137. Sobel M., Soler D.F., Kermode J.C., Harris R.B. Localization and characterization of a heparin binding domain peptide of human von Willebrand factor // J Biol Chem. 1992. - V. 267. №13. - P. 8857-8862.

138. Soilleux E.J., Morris L.S., Lee В., Pohlmann S., Trowsdale J., Doms R.W., Coleman N. Placental expression of DC-SIGN may mediate intrauterine vertical transmission of HIV // The Journal of pathology. 2001. - Vol. 195. № 5. - P. 586-592.

139. Stockert R.J. The asialoglycoprotein receptor: relationships between structure, function, and expression // Physiol Rev. 1995. - V. 75. №3. - P. 591-609.

140. Strickland D.K., Gonias S.L., Argraves W.S. Diverse roles for the LDL receptor family // Trends Endocrinol Metab. 2002. - V. 13. №2. - P. 66-74.

141. Sun X.L., Johnson R.B., Hockman M.A., Wang Q.M. De novo RNA synthesis catalyzed by HCV RNA-dependent RNA polymerase // Biochem Biophys Res Commun. 2000. - V. 268. №3. - P. 798-803.

142. Tailleux L., Schwartz O., Herrmann J.L., Pivert E., Jackson M., Amara A., Legres L., Dreher D., Nicod L.P., Gluckman J.C., Lagrange P.H., Gicquel В.,

143. Neyrolles О. DC-SIGN is the major Mycobacterium tuberculosis receptor on human dendritic cells // The Journal of experimental medicine. 2003. - Vol. 197. №1. - P. 121-127.

144. Takikawa S., Ishii K., Aizaki H., Suzuki Т., Asakura H., Matsuura Y., Miyamura T. Cell fusion activity of hepatitis С virus envelope proteins // Journal of Virology. 2000. - V. 74. №11. - P. 5066-5074.

145. Tam J.P. Immunization with peptide-carrier complexes: traditional and multiple-antigen peptide systems // In: Peptide antigen: a practical approach. IRL Press, Oxford. 1994. - P. 83-115.

146. Taylor D.R., Shi S.T., Romano P.R., Barber G.N., Lai M.M.C. Inhibition of the interferon-inducible protein kinase PKR by HCV E2 protein // Science. 1999. -Vol. 285.-P. 107-110.

147. Thomssen R., Bonk S., Propfe C., Heermann K.H., Kochel H.G., Uy A. Association of hepatitis С virus in human sera with beta-lipoprotein // Medical microbiology and immunology. 1992. - Vol. 181. - P. 293-300.

148. Thomssen R., Bonk S., Thiele A. Density heterogeneities of hepatitis С virus in human sera due to the binding of beta-lipoproteins and immunoglobulins // Medical microbiology and immunology. 1993. - Vol. 182. № 6. - P. 329-334.

149. Turnbull J., Powell A., Guimond S. Heparan sulfate: decoding a dynamic multifunctional cell regulator // Trends Cell Biol. 2001. - V. 11. №2. - P. 75-82.

150. Van Doom L.J. Molecular biology of the hepatitis С virus // Journal of medical virology. 1994. - V. 43. - P. 345-356

151. Van Regenmortel M.H. and Muller S. Synthetic peptides as antigens. -Amsterdam: Elsevier Science. 1999. - 382 p.

152. Viral hepatitis: diagnosis, therapy and prevention / Edited by Specter S. -Totowa N.J, Humana Press Inc., 1999. 402 p.

153. Vives R.R., Imberty A., Sattentau Q.J., Lortat-Jacob H. Heparan sulfate targets the HIV-1 envelope glycoprotein gpl20 coreceptorbinding site // The Journal of biological chemistry. 2005. - V. 280. №22. - P. 21353-21357.

154. Vyas J., Elia A., Clemens M.J. Inhibition of the protein kinase PKR by the internal ribosome entry site of hepatitis С virus genomic RNA // RNA. 2003. -V. 9.-P. 858-870.

155. Wellnitz S., Klumpp В., Barth H., Ito S, Depla E, Dubuisson J, Blum HE, Baumert TF. Binding of hepatitis С virus-like particles derived from infectious clone H77C to defined human cell lines // Journal of Virology. 2002. - V. 76. -P. 1181-1193.

156. Xie Z.C., Riezu-Boj J.I., Lasarte J.J., Guillen J., Su J.H., Civeira M.P., Prieto J. Transmission of hepatitis С virus infection to tree shrews // Virology. 1998. -Vol.244.-P. 513-520.

157. Yagnik A.T., Lahm A., Meola A., Roccasecca R.M., Ercole B.B., Nicosia A., Tramontana A. A model for the hepatitis С virus envelope glycoprotein E2 // Proteins: Structure, Function, and Genetics. 2000. - Vol. 40. - P. 355-366.

158. Yang S.S., Lai M.Y., Chen D.S., Chen G.H., Kao J.H. Mutations in the NS5A and E2-PePHD regions of hepatitis С virus genotype lb and response to combination therapy of interferon plus ribavirin // Liver Int. 2003. V. 23. №6. -P.426-433.

159. Yasui K., Wakita Т., Tsukiyama-Kohara K., Funahashi S.I., Ichikawa M., Kajita Т., Moradpour D., Wands J.R., Kohara M. The native form and maturationprocess of hepatitis С virus core protein // Journal of Virology. 1998. - Vol. 72. -P. 6048-6055.

160. Zhang J., Randall G., Higginbottom A., Monk P., Rice С. M., McKeating J. A. CD81 is required for hepatitis С virus glycoprotein-mediated viral infection // Journal of Virology. 2004. - V. 78. - P. 1448-1455.

161. Zhang Z.X., Sonnenborg A. and Sallberg M. Antigenic structure of the hepatitis С virus envelope 2 protein // Clin. Exp. Immunol. 1994. - V. 98. - P. 382-387

162. Zhao W., Liao G.Y., Jiang Y.J., Jiang S.D. Expression and self-assembly of HCV structural proteins into virus-like particles and their immunogenicity // Chinese medical journal.-2004.-Vol. 117 №8. -P. 1217-1222.

163. Zhong W., Uss A.S., Ferrari E., Lau J.Y., Hong Z. De novo initiation of RNA synthesis by hepatitis С virus nonstructural protein 5B polymerase // Journal of Virology. 2000. - Vol. 74. № 4. - P. 2017-2022.

164. Zhu L.X., Liu J., Li Y.C., Kong Y.Y., Staib C., Sutter G., Wang Y., Li G.D. Full-length core sequence dependent complex-type glycosylation of hepatitis С virus E2 glycoprotein // World J Gastroenterol. 2002. - V. 8. №3. - P. 499-504.

165. Zibert A, Kraas W, Ross RS, Meisel H, Lechner S, Jung G, Roggendorf M Immunodominant B-cell domains of hepatitis С virus envelope proteins El and E2 identified during early and late time points of infection // J Hepatol. 1999. - V. 30. №2.-P. 177-184.

166. Zibert A., Schreier E., Roggendorf M. Antibodies in human sera specific to hypervariable region 1 of hepatitis С virus can block viral attachment // Virology. 1995. -V. 208. - P. 653-661.t

Информация о работе

Фарафонова, Татьяна Евгеньевна
кандидата биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.04

Диссертация

Структурно-функциональная и антигенная характеристика высококонсервативных фрагментов оболочечных белков Е1 и Е2 вируса гепатита С - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы