Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммуногенетическое исследование экспрессии гамма-цепей иммуноглобулинов норки

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Иммуногенетическое исследование экспрессии гамма-цепей иммуноглобулинов норки"

рго од

!.",'Р о с:С И й С К А Я Л К Л Д Е М И Я НАУК ОРДЕНА ЛЕНкНА СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ Инсютуг щжншгпп и гэЕзттш

на правах рухошгеи ^ УДК 575.1:599.742.4

1ШЗТЙНЛ Лвдмяла Васяльэаза

1?5®Н0ГЕНЕТЙЧЕ£Ж0Е ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ Г-ИШЕИ ЮШтГЛОБУЛШЮВ КОРЕН

ГЕНЕТИКА - 03.00.15

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соясхашго ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 1993

Работа выполнена в Институте цаталогия и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Научный руководитель

Оф^ацналънае оппонента:

Ведущее учреждение

кандидат биологических наук А.В.Таранин

доктор биологических наук Е.И.Каракин,

Институт цитологии и генегесш СО РАН, г.Новосибирск

кандидат биологических наук С.П.Князев,

Новосибирский государственный аграрный университет, г.Новосибирск

Институт общей генетики РАН км. Н.И.Вавилова, г.!Аэсква

Защита диссертации состоится " л/" ^¿¿Щ_1993 г.

на ^ил^мЛ-СЦЬ^' заседании специализированного совета по Ьаците диссертации на соискание ученой степени доктора наук (Д - 002.11.01) при Институте цитрлогии и генетики СО РАН в конференц-залэ Института по адресу: 630090, г.Новосибирск-90, проспект академика Лаврентьева, 10

С диссертацией моено ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН

Автореферат разослан 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

л___^

"Т^«- -Й-.Д.Груздев

Актуальность ессхздозгззя. Зкспросскя гэноз нов (КГ) находится под контроле« слоеной chctqioi регуляция. Целнй ко:ллекс хшутрн- п кэгхлеточнкя факторов спредэллзт по-слэдоватэльность л Зфовепь экспрессии отдельных гонов зтого мультнгенвого секейства. Одка групп <з иехвшамов ответственно за актнващзэ всего локуса чаявши иди лапан цопзЗ как целого. Она оЗеспечЕвеэт усллзкнэ п тканесттецгфсгшость трзнияазщпл, полноценность 7-d-j-c перестроек, аллэдькоэ зскжяангэ я т.д. Другая груша кэхякззков определяет ДЕйфэрзЕЦйзльнуэ зксарзс-сна константных гзноз ИР. Экспрессия отдэльннх гэнов iff" на уровне целого оргЕпин.'а является рзг;/ль?гтсм деЗствзя тоо'Х совокупности рэгулягорннх факторов. В сапу слсжноста и !~сго-ступенчатости процзсса рэгуляцзк целкй ряд явлешЗ, связег~д с дифференциальной экспрессией константных генов ИГ, ио-првяпвиу эдет своего сОъяспег^л. К таг:ого рода явлэенгм отнести фэкокены латенгкоП эпснрвссш оплотапов 'Т. аллсет-Ш1Ч9сксй супрессия, поддерхшшо- стабильных количественных соотношений аллотшов/изотшгоз в нср:э и отклонена.! от ше а случае ::?сирэтелыггх дзфздатов. Отклонения з йзпотгяппескоа окспресан: генетических маркеров ИГ привлекают оссбсв зшкэ-ше: отрепая в больЕкнстве своем полжорЗази то рзгуляторкш гонеоячосгам фактора.!, рая гаэгут сыграть вагзув роль дата изучения г.'охёейзков регуляции экспрессии IS* на уровне целого организма.

Исследование закономерностей экспрессии ш*ов IT норе: бжэ начато в связи с тем» что полученные ранее в лаборатории кглу-когзнеткгш ИЦкГ СО РАН дакзне о генэтике ч-тягедзх цепей норта противоречили обивпразнякзнм представлояигм. Как извостеэ, у • человека и лабораторных гявотшгх гэен разл:-1чкых классов п подклассов тянолых цего! !2? тесно сцешкмш. Впервые этот факт блл установлен благодаря исследовании популяционкого пшеэгор&пйга ИГ, который обнаруживается ' в виде аляотЕггоз - внутривидовых внтигенно отличных генетических вариантов ¡молекул ИГ. Кодаруе-мые аллелями разных локусов, аллотгяш тяаэлых цепей человека, кролика, мнш наследуются в виде фиксированных комбинаций -аллогрупп. В противоречие с этой классической схемой у аллоти-пов константной области 7-цопей ИГ норки (С^-аллоткпов) не было обнаружено-ни тесного сцепления, ни аллелизма. Полученные

одновременно данные указавши на то, что одна из пргчш такого необычного повздешя аллотипов кэша1 заключаться в особенностях фенотшшческой экспрэссш аллотапов 7-цвяэа у этого вида. ■ Зга гипотеза определила постановку задач настоящей диссертации.

Цзль и задачи Есс£здог&ша. Даль данной работы заклэчалась в изучении з акононэ рно с те £ экспрессии генетических маркеров 7-цепеА на уровне организма и на уровне В-клэток.

Были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Используя тмунофершнтша анализ, охарактеризовать количественно экспрессии четырех аллотипов норки (НЗ, Н4, Н6 и Ш) в сыворотке крови.

2. Провести сравнительный анализ количества аллотип-сжнтезпрувдих клеток и содержания аллотипов в сыворотке крови норок с разным уровнем экспрессии аллотипов НЗ, Н4, НЗ и Ш.

Научная eoesses. Впервые в исследованиях млекопитающих о б-наруетн вид, обладащий ярко Еыраганкым популяционнш голнмор-фгздш количественной экспрессии аллотигов 7-цегое ИГ.

Выявлены щншцшиальные разлачня в характере популящюнного распределения сывороточных концентраций аллотапов Н6 и Н8, с одной стороны, п НЗ, Н4 - с другой. Аллотипы Н6 п Н8 вкспрес-сируются всегда на стабильно шсоком уровне. Уровень количественной экспрессии аллотипов Н6 и НВ в сыворотке крови подчиняется Бффэкту дозы гена, находится в тесном соответствии (для Н6) с содержанием аллотип-синтезируицих клеток, и обусловлен, главным образом, числом аллотипических структурных, генов.

Показано, что в отличие от Н6 и НВ, концентрации НЗ и Н4 в сыворотке крови варьируют в пределах трех порядков величины; как правило, не подчиняются э®экту дозы гена, и не соответствуют содержанию аллотип-синтезирувдих В-клеток.

Обнаружена и охарактеризована минорная экспрессия генетических маркеров ИГ. Она свойственна аллотипам НЗ и Н4, но не Н6 и НВ. Выявлена нестабильность минорной экспрессии аллотипа Н4: уровень минорного Н4 мокет повышаться аллотип-спецвфическш образом вплоть до нормального при гипериммунизации.

Установлено, что в большинстве исследованных случаев основной причиной минорной экспрессии аллотипов НЗ и Н4 является нарушение процесса секреции ИГ в аллотип-синтезирущих

илэтках. В Ooze а редких случаям к кгяорной окспрессии приводит перушок^з процэсса раз?.яой8Шгя соотзетстзукига В-клзток.

Тзсрэтичгскзл a Ерзятаггэсйея гласность ркбота. Прагеденнне исследования закономерностей колгтлствэнпой экспрессия алло-тштов IgO па уровне оргаЕНзпа п к s уровне В-клэток распярянт общва представлоэкя о фунжцясиЕрсвашш одного из наиболее слозныг пультгхзшшх CSKS2CTB генома эукариот, а такса вносят вклад в рэзЕИгне честной гэнвтшс гора. Выявленные особенности фзвотипнчвскоЗ Бяспрзссня едлотппов норки, представляя собой яаболеэ яр:схйх случай проявлэгзя noj^.:cpXz:c-;a рэгуллтор-ннх генов з ooasflctse KP, превреяаэт снстему алгоишсв этого взда з ценпуа глодэль для изуаднкя регуляцш* зкспрэссил генов Iff.

Адаптированию в процессе работа варианты тиунофэрментЕого метода для анализа аллопшов КГ порхп в снзоротко крови и для определения аллоткп-спкгозартЕцях В-клэток гдогут бить попользованы да изучения связи генетических маркеров КГ с естественной резистентностью esbotehz к разлзчшал инфекциопнЕм заболеваниям, а такта для разработа кзтодов дяагЕостЕна тагах заболевание.

¿прсбецзя работа. Матарзаш дассэргегин были прздетавлэз! па 5-я Всесоюзной гаяуствэргакэкжоа коЕ$зрэнцни "Биология клэ^ая" (Тбилиси, 1987), на V сьсзде ЕОГ;:С ("-осква, 1987), на тужСо-раторном С01дшзре Института цитолога в гекэтнки 00 РАН.

Струзптрз п обьеа ' рсбегн. Рукошгсь диссертации включает: введение, обзор лтаэратурн (глава I), опнеевне материала к с-'згодов (глава 2), .иаюгэшэ coöctbsehhx экешржика-лышх результатов (главк 3 и 4), обсуждение результатов (гяегз 5), кшэда и список лгтаратуры. с&ж- сбъзгл дассартЕгзи III страниц, включая 5 таблиц и 12 гасуэдов.

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Обзор литературы состоят , из S разделов. В первом раздела описаны структура к Функции мьмуноглобулшюв, во втором - приведены данные о молекулярной' генетике иммуноглобулинов. третий раздел посвящен аллотштаческоыу полиморфизму ИГ, четвертой т механизмам, регулирующим экспрессии генов ИГ. В пятом разделе описаны количественные отклонения в экспрессии генов ИГ, в шестом - приведены полученные в лаборатории иммуногенетики

1Щзг СО РАН результата изучения генетического контроля аллоти-пов ИГ американской норки и поставлена задачи исследования.

Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ Осноешм зоологнческиа объактозд исследования была американская норка (Шзtвla у1зоп), разводаыая в Экспериментальном хозяйстве СО РйН. Исследовали такгэ норок из популяции зверосовхоза "Подгороднввскай" (ДальниЗ Восток). Взятие крови, получение сывороток и их хранение осуществляли в соответствзл с общепринятыми рэкоыэндшда?-й1.

3 работе использовала афЕанную хроматограф!» для препаративного выделешя 1да н вялотш-спэцуфзчесгшх антител, ценгра-фугнрованш в градиенте платности - для Еыделешш лниЗодатов ез пвркфераческоЗ крови с слвдущав аналитические катода: двойную икаунодаШзию. радиальную шйуновдшзшь юиувофр-коЕ'сшй анализ на мшгроплатах, икмунофзршнтное окрашзвание клеток.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Глава 3. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ с^-дядотгаов В СЫВОРОТКАХ КРОБИ НОРОК ' Для характеристики фенотипической экспрессии аллотппов НЗ, Н4, Н6 и КВ анализировали распределение сывороточных концентраций этих аллотипов в популяции норок, эффект дозы гена в экспрессии аллотипов и, частично, наследование уроки экспрессии аллотипов. Концентрации аллотипов в сыворотках крови измеряла с помощью ИФА, содержание суммарного х^а - радиальной имунодкффузкей.

На Рис.1 представлены распределения концентраций четырех аллотипов в сыворотке крови разных норок Новосибирской и Дальневосточной популяций. Гистограмма концентраций аллотипа НЗ в обеих популяциях имеет три пика. Два пика находятся в области низких концентраций (до 300 мкг/мл) и один в области обычных для аллотипов концентраций - 1-Ю мг/мл. Аллотип НЗ с концентрацией в сыворотке крови ншке 300 мкг/мл не обнаруживается в стандартной реакции ДИД. Такие низкие концентрации мы • назвали минорными. Доля особей с минорной экспрессией аллотипа КЗ в Новосибирской популяции составляет 13%, в Дальневосточной - 24Ж. ,

Популяционное распределение индивидуальных сывороточных

I

Ol 1

число сывороток

НЗ

го_

-m-тнг

"ТТ

число сывороток

Н4

л

._. I i_j

j-1 I I t I I I I I I I t

o. ol 0.32 10.24 мг/мл o/m 0.123 . 4. 096 «t/^jl

(log ecала) (log шкапа)

г

число .. сывороток

HS

zel_

10_

<гисло сывороток

не

i i i i I i i M | i i "

1.6 9.6 17.6 мг/мл

-R-

I ГЧ I I I I I I I

1.«. 9.6 17.6 MT/MJI

Рис.1. Гистограммы сывороточных концентраций аллотипов НЗ, Н4, Н6 и НВ у норок Новосибирской (сплошная линия) я Дальневосточной (пунктирная линия) Еопулшций, полученные с помощью имаунсфэрментпого анализа.

концентраций вллотша Н4 отличается от распределения концент-рацвЗ НЗ. Но как и у аллопша НЗ, разброс в индивидуалышх концентрациях Н4 составляет тра порядка, т.е. для этого аллоиша такЕв сущэствует гсшорная экспрессия. Доля особей с минорной экспрессией Н4 составляет 82 для Новосибирской популяции и 133 для Дальневосточной.

Два другая алдотвпа, Кб к КЗ, по своим распределениям концентраций в популяцнн принципиально отличаются от аллотипов НЗ и Н4. Диапазон концентраций НЗ и Н8 в сыворотках крови разных порок составляет одан порядок величины, эти аллотипы экспрэс-сируктся всегда иа стабильно высоком уровне, ¡¿шорной экспрессии у них не обнаружено, за исклвченнац, одной норки с концентрацией аллотшга НВ - 0.13 нг/мл.

Исследования еффекга дозы гена в экспрессии аллотипов проводили, измеряя концэнтрацви аллотипов НЗ, Н4, НЗ и НЗ б сыворотках крови гош- и гетерозигоишх норок. Показателем эффекта дозы гена слукило отношение н/ь=2.о, где Н - средняя концентрация аллоиша в популяции го:.юзпгот, п.- средняя концентрация аллотша в популяция гэтерозигот.

Результаты исследования эффекта дозы гена в экспрессии С^-аллотппов норки приведены в Табл.1. Эффект дозы гена наблюдается в экспрессии двух аллотипов, Н6 и НВ. Соотношение НЛг равно или близко к 2, как для абсолютных, так и для относительных концентраций. Для НЗ и Н4 не установлено надежного эффекта дозы гена. Следовательно, индивидуальные отличия в концентрациях аллотипов Н6 и Н8 зависят, главным образом, от числа аллотипических структурных генов, что нельзя утверждать в отношении НЗ и Н4, экспрессию которых, по-видимому, определяют дополнительные фактор!.

Для выяснения антигенной идентичности минорных аллотипов НЗ и Н4 соответствующим аллотипам в нормальной концентрации использовали два метода. На Рис.2а представлены кривые ингибиро-вания, построенные по результатам №А для контрольного содержащего нормальный НЗ, и для сывороток с минорным НЗ. Одинаковый наклон кривых ингибирования свидетельствует об антигенной идентичности исследуемых образцов. На Рис.26 - результат реакции ДВД, поставленной в нестандартных условиях (лунка с антигеном сильно увеличена, образцы исследуемых сывороток

Таблица I

Средние концентрации аллотипов НЗ, Н4, НБ и Ш ь сыворотках крови гомо- и гетерозиготных норок и эффект дозы гена в экспрессии аллотипов

Выборка I Выборк^ 2

Н h Н h

П=5 п=8 П=18 П=17

НЗ 2.20±0.09 0.50±0.09 1.18±0.34 0.59*0.49

(0.81±0.11) (0.43±0.28)

Н/Ь=4.4 H/h=2.0 (1.88)

П=8 п=8 n=4 n=25

Н4 Т.85±бЛ5 6.32±8.8б 3.T1±3.55 0.52±0.6T

(0.52±0.38) (0.37±0.23)

H/h=1.24 (1.4) H/h=7.2

П=9 П=30 n=5 n=17

Нб 10.40±3.10 5.20±4.10 12.92±3.74 6.46±1.87

(1.0±0.18) (0.55±0.09)

ü/h=2.0 H/h=2.0 (1.82)

П=14 n=15 n=13 11=27

Н8 11.67tT.56 5.81±3.30 9.29±6.10 5.05±3.4

H/h=2.01 H/h=1.84

Н - средняя концентрация аллотипа в сизаротко крови у гомозигот, h - средняя концентрация аллотипа у гетерозигот, в скобках даны значения Н, h, H/h, получзЕкао для относительных концентраций аллотипов (относительно суммарного IgG в сыворотке крови)

сконцентрированы). Видно, что линии преципитации минорного НЗ и контрольного антигена, содерващего нормальный НЗ, полностью сливаются. Минорный аллопш Н4 в этих же реакциях ведет себя аналогично аллотипу НЗ. Это дает основание считать минорные и нормальные аллотипы норки антигенно идентичными.

1.0 -j о.в'-

* 00 e

о 0.4

0.2

1 1-1---1---1-•-1-'-1---1

10 8 6 4 2

logg разведения ингибитора

Рис. 2, Тест на антигенную идентичность минорного и нормального аллотила НЗ. а) Кривые ингибирования связывания анти-НЗ антител и НЗ-lgQ, меченого пэроксидазой.-о— стандартный препарат H3-IgG; -е- —л— - сыворотки с минорным НЗ. б) Реакция двойной иммукодаффузии антиснворотки аяти-НЗ (А), стандартного препарата НЗ-lgG (у.) и сывороток с минорным НЗ (1-4).

Используя ИФА, мы получили более детальные данные относительно изменений экспрессии минорного аллотипа Н4 в ходе опыта по гипериммунизации норок. Норки группы I и 2 были иммунизированы бычьим сывороточным альбумином и клетками диплококка, соответственно, в течение 7 месяцев. Норки группы 3, контроль. ной, иммунизации не подвергались.

Наблюдали два типа изменений концентрации Н4 в ходе иммунизации. Концентрация Н4 у двух норок из группы I и и группы 2 увеличилась, соответственно, в 10 и II раз, при этом концентрация суммарного igö изменилась значительно меньше - в 1.4 и 2.1 раз, соответственно (Рис.За). Г.о. изменение концентрации Н4 у этих животных не было следствием относительно небольшого увеличения концентрации суммарного IgG. у всех остальных экспериментальных и контрольных норок изменения уровня экспрессии

а)

б)

12

IS 19 надела

3 5

tкачало

илмунявациз

12 •

Рис. з. Изменение концентрации аллотша Н4 и с уте,ирного igO в процессе опыта по гитаришунизации у шрок а) 1053, б) 1063. I - концентрация Н4, 2 - концентрация igo.

Н4 балл незначительны и соответствовали пзмененшэ концентрации igo (Рис.Зб).

Увеличение концентрации Н4 в сыворотке не было вызвано таксе появлением специЗяческих к иклуногену антител. Титр анти-диплонокковых антител у норок группы 2 составил в среднем 1:8 - в сыворотках до иммунизации и 1:2048 - после нее. Но изменения титра антвдиплококковых антител и концентрации Н4 происходили независимо друг от друга: после того, как антитела, специфичные к диплококку, были удалены абсорбцией из шедшая сыворотки, значительных изменений в концентрации Н4 не произошло.

Таким образом, установлена нестабильность минорной экспрессии аллотша Н4, которая проявляется в аллотт-стацифическом, не зависящем от концентрации суммарного IgG, остальных алло-типов, титра специфических антител возрастании концентрации минорного аллотипа вплоть до нормальной.

Анализ родословных показал, что появление минорных аллоти-

16 19 неделя

6

Рис.4. Фрагмент родословной норки 1053 с минорной экспрессией аллотша Н4. §Щ - норки с нормальной экспрессией Н4, §Ц - с минорным К4, ^ - на тающие Н4.

пов КЗ и Н4 во всех исследованных случаях не запрещено прави-лвьш наследования: хотя оы один из родителей имеет исслвдув»лхй аллотип и, часто, в нормальной концентрации (Рис.4). Цикорная уровень экспрессии НЗ и Н4 носит наследственный характер. Ш-норная экспрессия связана с определенными родословными: частота минорного Н4 в родословной, представленной на Рис.4, в несколько раз выше по сравнению с популяционной. Следует отметить, что норка 1053, у которой в ходе гипериммушзацки концентрация Н4 увеличилась с минорного до нормального уровня, нэ передала своим потомкам способности к нормальной количественной экспрессии Н4.

Глава 4. СРАЕШЕГЕЯЪННЯ АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ Су-ЛЛЛОТСШОВ В СЫВОРОТКЕ 5СР0ЕМ И Ц£ГОПЛАЕИЕ B-IIÜET0K

Для проЕвдэнзя сравнительного анализа определяла относи, тельное содоряанпе незлого нз оллстнпов ÍG, Н4, КБ п К8 в обком пуле сывороточного igG я дола аляотзп-сгнтэзарущмх В-клеток, срэдн всех igG-csKTesapynca В-клэток у порок о различные гэрзанта'ш зкопрэссяи аллотипов. Подстэт аллотпп- я IgG-CEHTe3iípyE5HX клеток проведали на прзпзратах лимфоцитов после акмунсцнтохизггеского скрахшаняя па один из аллотипов зли на суммарной IgG. Дяя окрагяваЕМ использовали фпкезрован-пне прзпграты лэфоцитов кврз^эрнчесхоа крова, селезенки и г'эзезтернального лимфоузла.

Данию сравнительного сна,тага прнЕодэпы па Рис.5. Установлена тесная связь (коаффяцеент корреляция r=-o.ss, п=з, р<0.01) кеаду уровнем аллотипа HS я содержанием в крови аллотзш-сиптезнрущах меток. Уровень аллотипа Н6 в сыворотке крова пряко пропорционально зависит от количества аллотип-синтезируших клеток. Отсутствие аллотипа KS в сыворотке у 16 асследованных гзтотшх связано с отсутствием Н6+ геле ток.

Хотя из получении данных видно, что более высокому значении содержания КВ+ клеток часто соответствует более высокое содерканзе этого аллотипа в.сыворотке крова, нельзя утверадать при данном размере пыборкп, что эта связь не случайна (г=0.44, п=9. р>0.05). Все II исследованных норок, не Егвициг аллотипа 113 в сыворотке кроЕЯ, не имела Н3+ лимфоцитов в крови и/или в селезенке.

Нэ установлено соответствия кеаду содержанием аллотипа в сыворотке крови и содерзанием аллотип-синтезируодих клеток в группах норок с нормальной экспрессией аллотипов НЗ и Н4: коэффициент корреляции г=-0.095, п=1Т, р>0.05 - для НЗ и г=0.18, п=8, р>0.05 - для Н4.

В группе норок с минорной экспрессией ИЗ и Н4 содержание аллотипа в сыворотках на 2-3 порядка ниже, чем у норок с нормальной экспрессией аллотипа. Вместе с тем, обнаружено, что подавляющая часть норок, обладащих глинорным аллотипами (8 из 9 исследованных норок - для НЗ и 10 из 15 - для Н4), имеет количество аллотип-синтезирующих В-клеток близкое к

5 о.б

го

к

<и

я а

я *

0 4

0.2

00

% ©О - О _

®л ©

© о

у / I

е об §

+ •ч-

я 0.4

В. 0.2

и

I

о ооо 0 002 0.1 С 2 0.3 уровень НЗ в сыворотке

с 8 |-

О о

е 3 с

к я X о.

и

!

0.2

©

I®

о

0.0 0.4 0.8 1.2 уровень Н6 в сыворотке

Р© О

0.0 0.000 0.001

0.2 0.4 0.6 уровень Н4 в сыворотке

0.5

О 4

0.3

?

О 2

0.1

0.1 0.2 0 3 0.4 0.5 0 6 уровень Н8 в сыворотке

Рис.6. Уровень аллотша и содержание аллотш-синтезирущих В-клеток в крови отдельных норок, о - норки с шноряой экспрессией КЗ и И4, е - норки с нормальной экспрессией аллоти-па, & - норки с минорной экспрессией, у которых алло-

тип-синтезирувдие клетка зарегистрированы на препаратах спленоцатов.

нормальному. Остальная часть «ивотных из этой га группы имеет соответственное низкое содержание К3+ и Н4+ клеток.

Подавлявдая часть норок, не вдевших в сыворотке крови аллотипов НЗ ели Н4, не имела аллотип-синтезирущих клеток срздп лимфоцитов крови. Исключение составила норка, у которой Н4 в сыворотке крови не был обнаружен, но обнаружены единичные Н4+ клетки в крови, селезенке и лимфоузле.

+

о

Глава 5 ОБЩЕЕ ОБСУЖДЕНИЕ ИЗУ.ТЬТАТСЗ

Результаты пссяэдсвалзя фэнотзшпос-оЯ Експрессвя С^-зллотшов норки показывают, что каяпэствензов прсявдэняэ этих аллотшгов козвт суцэс-хввБио различаться как го уравнэ, так п по стабильности. Аллотзпы HS л ЕВ гкспрессзруатся всегда на стабильно. еысоком уровиэ. Средняя концзптрацпя ггяотаюз HS л НЗ у гомозигот пргггэрно в два раза игпэ, чем у гэтзрознгот, т.е. в жшгеестзэнноа з:гспрэссна eres аллотшсз' псблздается еФХэят дозы гена. йздивздуельннэ отлзчзя з кспцентрЕДхях злло-гяиов KS и 13 зависят, глевжгл оСрассу, о? чзсла адзотяпчзс-:сях структурных геноз. Ленные, пслучоптгл прл срэгазгши со-дераачия апдотЕа-сянтэзвругдаз: кяэтск а уровня ашютшга з 1фоы1, подтвэрздает этот результат..Для аллонжа НБ обааругэно тесное соответствие между уровней аллотапа а кровя л содержанием алшзтип-сштэзирущах В-кяоток. Концэнтрздяя HS в свго-ротке крови целиком заплсат от степени рзгкпогзшя К5+ клеток. Для другого стабильного аллэттша, 13, тшет следовало огядать пропорциональности кеяду садэрзекзэм в сыворотке я долей НВ+ клеток. ,Нвм удалось установить ¿izzb тендэпщэз связи гнезду эти-ая двумя пар&^этргма для аляотипа ЕЗ. Возможно, расаирэшгэ выборки, взятой для исследования, сделало ба эту сзязь достоверной.

Лллотипы НЗ п ГГ4 имеют шого общих черт фэпотипичесхой экспрессии, при этом они резко отличаются от аллотипов HS и НЗ. Концентрации аллотипов НЗ п Н4 в сыворотке крови варьируют в пределах трех порядкоз величины. Для аллотипов НЗ и Н4 не обнаруживается надежный ген-дозонгЭ эффект. Не обнаружено соответствия меяду урошем алло типа в крови и содержанием Н3+ и Н4+ клеток.

Отличительным свойством аллотипов НЗ и Н4 является наличие минорной (до 300 мкг/мл в сыворотке крови) экспрессия, ».йнор-ше НЗ и Н4 По своей антигенной структуре идентичны аллотнпам НЗ и Н4 с нормальной экспрессией в сыворотке крови. Минорный аллопш Н4 обладает свойством нестабильности экспрессии: уровень его Moser повышаться вплоть до нормального в результате гипериммунизации. При этом резкое повышение концентрации Н4 носит, алло тип-специфический характер: нэ зависит от динамики

обдэго других, аляотипсв, от гша используемого для км:лу-шэащЕ аптагона, но связано с хюкгЕэхшегд титра спзцДщчнех к антнгену антител. Пзрзлод с ¡захсрзого уровня экспрессии аллода» К4 на норггальный бал шзван, го-вадеашу, изьгзнешем б дзйстши алгхтш-спвц:а$ачбского шхашшаа ре-гуляцан эксаресггп ИГ.

Штерны!: уровень 8Ксщ»ссе2 аллопатов НЗ п Н4 нэонт Езолад-стбзненИ харьхтер. Это указывает иа то, ч*о кааораая экспрессия аллотппоз горки определяется нэкш: гвнэтичэскзаи факторами, а нз влиянием среда. Основной кзхапЕЗЫ, обуслааггзаицй; ыгкоршгй уровень экспрессш С^-ашютшов норкн, закличаетсй, по-вгдашу, в нарушения езкращгд ЕГ аллоиш-синтйзззрукцк?.^ вявткгхк, т.к. у большей чаегг норок с кшарнай экспресс;»® КЗ и Н4 обяаругенэ вг;сокое содэр^гшиэ аклотип-сгштозЕрукцЕХ клеток. В бола о редких случаях к шнорноЗ экспрессии приводят наруиензе размножения соответствуыцэго клона Б-клэто;;.

Дво основзае пргчша могут обуславливать ыишрнуп вксарэс-ешэ аллотшов Ш к Н4: нарушение лебо в структурно:.: гека аию-тша, либо в системе генов, регулируя®* экспрессия ИГ. Случаи усиления фенотшической экспрессии алкотша Н4 о ьзшорного уровня до нормального, а такгз ыгаигешая идентичность нормальных и минорных аллоишов норка делает маловероятный прэд-полозониэ о дефокте структурного' гена основной пр«чикс киноршй экспрессии НЗ к И. Поэтому, более вероятно/. щшаыо£ минорной экспрессии аялоошов порог является изиэыэпьа из ь структурных, а в регуляторах генаж, аллогш-сшцзфласк^: образои контролируй^ экспрессию 11Г» ' .- ■

АдгатЕП-специфяческая регуляция экспрессии констаьтшг. генов НГ осуществляется на позднах .этапах онтогенеза В-клеток, а именно на стадак их разкновотш псолэ кдесс-пероключенкя и на стадии ссзревакня в плазматические клетки. 1{редаолЕгаот, что в регуляции участвует продукта генов МКС, аутоантитела, Рс-р&цепгоры, Т-кленах и Т-клэточные факторы, спецк&яшв для аллотншчееккх детерминант. Однако мехаиизкн этих взаимодействий остаются во многом нэясньши. Одной из причин, затруднянцей исследование регуляции дифференциальной экспрессии генов ИГ, является отсутствие соответствующих генетических моделей.

Особенности ®зеотзпячэсйоП окспрэссаи С^-алготшкю, обнаруженные у поркя, по- сукгз свойств явлстгся уншсачьЕЕаи дгя мультзгениого семэЗства ИГ. ОгЕсашшв з настоял,<зй работа иа-2орнь*э аллотшг.я "ортст отличает высокая частота; сил пмзют достаточно высокую распространенность в популяции, встречается в разных популяциям з, по-бяд2пс;.г/, нэ езяашн с згбодсвзЕгхятл. Особенно сущемвеяЕнч .чвдяется то, что установлений ярко ви-рагэнныа популядаонЕна шлнтрфазм кошчостаенной окспрэссш! аллотипов является отражением, скорэв всего, полиг:ор1:1с?га генов, аллотз1п-спзцп|сч8С1С1 регулнрущпх экспрессия ИГ. Есэ это прэврнщээг систему аллогапнчэскнх маркеров 11Г порта в ценнуэ модель для лзучеЕзя регуляторных гэпов ИГ и мохаштзггав этой регуляции.

выводы

1. С помощью шмзнофэрдантпого метода проведен скрининг популяций порет по количественному содержанию аллотипов 7-цепей иммуноглобулинов (113, Н4, НЗ и Ю) в сыворотке хсровл. 'Выявлены принципиальнее различия в характере распределения в популяции ггндавядуалкг-а сывороточных концентраций аллотипов Нб'п НВ, с одной стороны, и НЗ, Н4 - с другой.

2. Аллотзлн Кб п НВ эхспрэссируэтся всегда на стабильно высоком уровне. Концентрации Нб и НЗ в сыворотке варьируют от особи к особн.в пределах одного порядка величины, подчиняются эффзкту дозы гэпа и соответствуют (для Кб) содэрааншо аллотш-синтезярущих клеток.

3. Концентрации аллотлпов НЗ я Н4 в сыворотке крови норок варьируют в пределах трех порядков величины. Отличительны!* свойством аллогапов ЕЗ и Ш является минорная экспрессия, которая обнаруавна у 10-153 особей в популяции. Выявлена нестабильность минорной экспрессии аллотша Н4: уровень минорного Н4 мояет повышаться аллотш-специфачегасии образом вплоть до нормального. при гшгериммунизации.

4. Основная причина минорной экспрессии аллотипов НЗ и Н4 заключается, го-видимому, в наруиении секреции аллотип-синтезирупцими клетками, т.к. обнаружено, что норки с минорной экспрессией аллотипов имеют, как правило, высокое содержание аллотип-синтезирувдих клеток. В более редких случаях минорная экспрессия определяется нарушением размножения аллотип-

сштевирущи: клэгок.

5. Установление свойства шнорш. аллотипов корки, в ток число наследуемость ыиноршго уровня si'спрос gee, позволяй? предполагать, что шнорыая вксцрассия аллотипов КЗ н 114 определяется ш дефектами es струкггурнкз: генов, е таяззгорйгагегл гэвов, ответственных за аплотш-спэцйзчвскуг) рвгуляцяэ экспрессии шддаоглобулЕнов.

6. Совокупность представленных в диссертации результатов ' позволяет зеккинть, что обваруЕэннай у шргя ср:» шрЕ^ЭЕйй популяцЕогшай полЕгорфсзм колечэстввиесй акспрэсскп оллотепсв 7-цэзэй ЕйауноглобулпноБ является уЕскашлал для гшекохшташ-цзз. Так®.! оброзоы, описанная састека ахлотепт&скпх ыаркерсв

Ш88Т СЛУЕЙТЬ ц6еной ИОДвЛЬЮ ДЛЯ ЕЗУЧЭЕПЯ рЭГУЛЯЦКП SKCHpQCCIH

генов кггдуиоглэбулиноЕ.

СПИСОК ТРУДОВ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДЮСЕРТАЦКК

1. Баранов O.K., Беляев Д.К., Волкова О.Ю., Мэчэтша Л.В., Тарант A.B., Фогжчэва И.И. Кауыоганег^ка ик.-;укоглобуллзов американской норки. Сообщение 7. Нэ стабильность экспрессии к проблема генетического контроля С -аллотипов // Генетика. -1286. - Т. 2.2, К 8. - С. 2167-2178.

2. Беляев Д.К., Таранин A.B., Шчеткаа vi.В., Волкова О.Ю., Фо;^ичева И.И., Баранов O.K. О нестабильности экспрессии и латс-атЕссти С„-авлоташов иммуноглобулинов" бмэриканскса норки // Докл. АН СССР. - 1885. - Т. 283, К 3.- С. 722-725.

3. Taranin A.Y., Hoohetina L.Y., Volkors. O.Vu., Foniohava I.I., Bartnov O.K., Belyasv U.K. Genatio polymorphism oí Igíi in mink. III. Instability of expression and tho probloa oí tiie genetio control of C„-allotypas // Espl; Clin.Iraunogcüst. -1987. - V. 4, H 2. - P. 73-80.

4. Meohetina L.V., Pomlchers I.I., а'глтап1п A.V. Qenetio polymorphism oí IgG in mink. VIII. A quantitative study ci th.e expression of C^-allotypes (H3, H4, H6, H3) in eera // Expl. Clin. Inarunogenet. - 1992. - V. 9, К 1. - P. 24-32.

5. ©эиичева И.И., Волкова О.Ю., Шчетина Л.В., Наякшин A.B. Иммуноглобулины американской норки: генетика, экспрессия, эволюция. - Н.: Наука, 1992. - ISO С.