Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммунофлуоресцентная локализация транскрипционно активных районов в политенных хромосомах DROSOPHILA MELANOGASTER

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Иммунофлуоресцентная локализация транскрипционно активных районов в политенных хромосомах DROSOPHILA MELANOGASTER"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ Институт цитологии генетики

На правах рукописи

УМБЕТОВА Галима Хажкеновна

УДК 575.113:576.312.32

. ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ ТРАНСКРИПЦИОННО АКТИВНЫХ РАЙОНОВ В ПОЛИТЕННЫХ ХРОМОСОМАХ ЮНС60РН1ЬА МЕЬАНСЮАЗТЕН

Генетика - 03.00.15.

<оУ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 1991

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики

СО АН СССР, г.Новосибирск

Научный руководитель - доктор биологических наук,

старший научный сотрудник И.Ф.ЖИМУЛЕВ

Институт цитологии и генетики СО АН СССР, г.Новосибирск

Официальные оппоненты: - доктор биологических наук,

профессор В.Н.Стегний, НИИ биологии и биофизики при Томском государственном университете , г.Томск

- кандидат биологических наук, доцент Л.В.Высоцкая Новосибирский государственный университет

Ведущее учреждение - - Институт биологии развития,

г.Москва

Защита состоится '¿О 1991г.на

заседании специализированного совета Д-002.11.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте цитологии и генетики СО АН СССР в конференц-зале Института по адресу: 630090, г.Новосибирск, пр.Лаврентьева, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО АН ССС£^

Автореферат разослан '{^Г (Щ^УлЬ^ 1991г.

Ученый секретарь специализированного совета

доктор биологических наук " А.Д.Груздев

•Актуальность проблемы. Изучение процессов транскрипции в отдельных районах хромосом - один из важнейших аспектов общей проблемы экспрессии генетического материала. Удобной моделью для исследования структурно-функциональной организации интерфазных хромосом эукариот являются политенные хромосомы личиночных тканей Díptera, морфологическая дифференциация которых отражает различное функциональное состояние хромосомных локу-сов. Центральное место в етой проблеме занимает вопрос о взаимосвязи процессов деконденсации и транскрипции. Применение различных подходов в исследовании транскрипционной активности политенных хромосом двукрылых показало, что в синтезе РНК участвуют районы, деконденсированные в различной мере. Преимущественное положение среди методов изучения занимает метод иммунофдуоре сцентной локализации гибридов ДНК-РНК, основанный на выявлении гибридных молекул мэзду хромосомной ДНК и эндогенными молекулами РНК, находящимися в локусе их синтеза. Такие молекулы обнаруживаются с помощью специфической антисыворотки против синтетических .ибридов po\y(A)xpoly{dT) (stol-1аг, 1970, 1975; Colby et ai.. 1971: Kitagawa, Stollar, 1982; Roap et al., 1984). Применение поли- и моноклональных антисывороток на гибриды ДНК-РНК показало, что гибриды присутствуют на фиксированных препаратах политенных хромосом Díptera и их распределение носит стадиеспецифический характер, коррелируя с изменениями в пуфовой картине (Rudkin, Stollar, 1977; Aleover et al., 1982; Büsen et al., 1982; Lezzl et al., 1989). В своих исследованиях авторы в основном анализировали районы крупных пуфов. Что касается Drosophlla melanogaater. которая является наиболее исследованным на молекулярно-цитологи-ческом уровне модельным объектом, то в литературе практически отсутствуют данные о закономерностях распределения гибридов ДНК-РНК в различных районах политенных хромосом в сравнении с другими характеристиками транскрипционной активности. Кроме того не изучены картины стадиеспецифического распределения гибридов ДНК-РНК в период смены генетических программ под действием гормона экдистерона. В этом плане возникает необходимость исследования стадиеспецифического распределения гибридов ДНК-РНК в нормальном развитии дрозофилы и у мутантов с различными гормональными нарушениями. Так, у мутантов

1(1 Н435 утрачена чувствительность клеток к гормону и транс-крипционно активные районы в основном представлены малыми пуфами (районами, деконденсация которых не увеличивает диаметра хромосомы). У экдистерон-недостаточных мутантов 1(3 Ш с "удлиненной" личиночной жизнью, политенные хромосомы сокращаются по длине и разрыхляются, теряя дисковый рисунок. Исследование иммунофлуоре сцентной локализации гибридов ДНК-РНК в нормальных и мутантных хромосомах дрозофилы приближает нас к пониманию механизмов экспрессии генетического материала на транскрипционном уровне.

Цели и задачи исследования. Основной целью настоящего исследования является выявление корреляции между степенью деконденсации хромосомного материала и количеством гибридов ДНК-РНК, характеризующих его транскрипционные свойства. Для этого поставлены следующие конкретные задачи:

1. Провести серию контрольных экспериментов по выявлению специфичности реакции обнаружения гибридов ДНК-РНК на цитологических препаратах политенных хромосом РговорЬИа те1агкжаБ-tвr.

2. Определить закономерности распределения гибридов ДНК-РНК в различных по морфологии районах политенных хромосом дрозофилы на одной фиксированной стадии развития и сравнить их с данными авторадиографического анализа по включению меченого уриди-на, полученными ранее.

3. Определить онтогенетический спектр изменений распределения гибридов ДНК-РНК в различных по морфологии районах гк. хромосомы РгоаорЬИа melanogaзteг.

4. Выявить влияние мутаций с гормональными нарушениями на характер распределения гибридов ДНК-РНК в политенных хромосомах мутантов 1(1 ^435 и. 1(ЗШ.

Научная новизна работы. Впервые проведено детальное картирование гибридов ДНК-РНК в различных по морфологии районах хромосом дрозофилы в сравнении, с авторадиографическими методами включения 3Н-уридина. Гибриды ДНК-РНК обнаруживаются в деконденсированных районах , и отсутствуют в черных плотных дисках. При этом интенсивность флуоресценции гибридов ДНК-РНК не всегда коррелирует со степенью деконденсации хромосомного материала и включением 3Н-уридина. Около 90% флуоресцентных

I - 2 -

полос и 50% радиоактивности приходится на малые пуфы. Несмотря на постоянство морфологии малых пуфов в половине этих районов свечение гибридов ДНК-РНК меняется в зависимости от титра экдистерона и онтогенетического возраста. В хромосомах мутантов с гормональными нарушениями обнаружены крупные пуфы, в которых отсутствует свечение гибридов ДНК-РНК.

Практическая ценность. Определена локализация транскрип-ционно активных районов политенных хромосом Droaophlla mela-nogaster на стадии 0-часовой предкуколки по данным иммунофлу-оресцентной локализации гибридов ДНК-РНК. Предложен способ идентификации хромосом с измененной морфологией с помощью гибридизации in aitu специфических клонов и продемонстрированы морфологические типы хромосом мутантов 1(3)tl. Для получения хромосом с четким дисковым рисунком рекомендовано выращивать культуры мутантов l(3)tl при 18°С.

Апробация работы. Материалы исследований доложены на 5-ом (г.Москва, 1983) и 7-ом (г.Москва, 1987) Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов"; 8-ом (г.Пущино, 1984) и 10-ом (г.Гродно, 1990) Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра"; 9-ой (Венгрия, 1985) Европейской конференции по генетике дрозофилы; 5-ом (г.Львов, 1987) Всесоюзном рабочем совещании по генетике дрозофилы.

Объем и структура работы. Работа изложена на 172 страницах, содержит 7 таблиц и 35 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка датируемой литературы, включающей 257 ссылки.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

В работе исследовали политенные хромосомы слшных желез Droaophlla melanogaater линий giant, Batumi L. 1(1 )t435 и

411Ш-

Личинок дрозофил выращивали при 18°С. Стадии развития личинок (PS-puif stage) идентифицировали по морфологии протока слюнной железы (Zhimulev et al., 1981). Морфологический анализ оценки степени деконденсации районов на исследуемых стадиях развития проведен Беляезой Е.С. (1982). Интенсивность

о

включения Н-уридина усредненно оценивали, используя данные,

опубликованные ранее (Belyaeva, Zhímulev, 1975а; ZMmuleY, Belyaeva, 1976). Выявление иммунофлуоресцентного распределения гибридов ДНК-РНК проводили по методу Алысовера с соавторами (Alcover et al., 1982). Антигибридная сыворотка получена и предоставлена Столларом (Kitagawa, Stollar, 1982). Интенсивность флуоресценции гибридов ДНК-РНК оценивали по произвольной шкале визуально как яркое, умеренное, слабое и отсутствие свечения на основании анализа в среднем 7 фотографий.

Для идентификации хромосом мутантов 1(3)ti использовали геномные клоны, описанные в работах (Кокоза и др., 1991; Ве-lyaeva et al., 1986» Corees et al., 1980! Maniatia et al., 1978). Гибридизацию in altu проводили по методу Галла и Пар-дью (Gall, Pardue, 1971).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1.Выявление специфичности иммунологической реакции обнаружения гибридов ДНК-РНК на цитологических препаратах политенных хромосом дрозофилы.

Для доказательства специфичности иммунологической реакции обнаружения гибридов ДНК-РНК мы провели серию контрольных экспериментов. Контрольные эксперименты проводили путем последовательного удаления одного из этапов процедуры выявления гибридов ДНК-РНК и РНК-азными обработками цитологических препаратов. Результаты приведены в табл.1. Проведенные контрольные эксперименты говорят о специфичности антисыворотки на гибриды ДНК-РНК. Наиболее убедительным доказательством служит факт, что флуоресценция гибридов чувствительна к действию рибонуклеаэы HI, которая деградирует РНК, только связанную с ДНК в гибридах. Кроме того специфичность антигибридной сыворотки подтверждается воспроизводимостью флуоресцентного свечения хромосом. Хотя имеется некоторая вариабельность в люминесценции отдельных районов, общая картина хорошо воспроизводится. Таким образом, вышеизложенные результаты исключают возможность случайной адсорбции антител на хромосомах.

2.Локализация транскрипционно активных районов политенных хромосом 0-часовой предкуколки Dro3ophila melanogaater .

Анализ распределения гибридов ДНК-РНК во всех политенных хромосомах (за исключением 4 хромосомы) Drosophila melanogas-

Таблица 1 .Демонстрация специфичности иммунофлуоресцентной реакции обнаружения гибридов ДНК-РНК.

» Обработки Флуоресценция хромосом

1. Денатурация в 0.1х&5С,20сек.при 95°С;реассоциация 1час в 50% формамиде:3xSSC; инкубация 1 час с козьей антиснворт-кой(1) к гибридам ДНК-РНК (разведение 1:20), промывка в PBS и инкубация с меченой флуоресцеином кроличьей антисы-вороткойШ) (разведение 1:40) четкое, яркое свечение

2. Как 1, но без антисыворотки (I) нет свечения

3. Как 1, но без антисыворотки (II) нет свечения

4. Как 1, но без антисывороток (I) и (II) нет свечения

5. Как 1, но без денатурации нет свечения

6. Заменили процедуру реассоциации в 5.0} формамиде «sxssc в течении 1часа промывкой в РВЭ,5мин. четкое, яркое свечение

7. Обработка панкреатической РНК-азой А (100мкг/мл,2часа)пе-ред денатурацией, остальное как 1. нет свечения

8. Обработка панкреатической РНК-азой А (100мкг/мл,2часа)пос-ле денатурации и реассоциации, остальное как 1. четкое, яркое свечение

9. Обработка РНК-азой HI из тимуса теленка (инкубационная среда с Mg2+, 1-гед. активности фермента 1час)после денатурации и реассоциации. остальное как 1. нет свечения

10. Как 9, но без РНК-азы Hi(контроль на инкубационную среду фермента) четкое, яркое свечение

ter на стадии О-часовой предкуколки показал, что флуоресцируют все районы локальной деконденсации хромосомного материала. Свечение отсутствует в черных дисках. Однако, прямая корреляция между степенью деконденсации хромосомного материала и интенсивностью флуоресценции осуществляется не всегда. Не всегда соблюдается и корреляция между включением 3Н-уридина и свечением гибридов. На рис.1 представлены сравнительные данные морфологии, иммунофлуоресценции и импульсного мечения уридина районов политенных хромосом.

28 у.

76/.

Яркое свечение

Слабое свечение

-крупные н средние пу$ы, включение уридина сильное к среднее;

-малые пуды, включение уридина сильное и среднее; -малые пу®ы, включение уриднна слабое млн

-крупные и средние пу<ры, включение уридина сильное и среднее;

0 -малые пуды, включение уридина сильное и среднее;

В -малые пу<гы, включение уриднна слабое или отсутствует;

отсутствует;

Рис Л.Сравнительный данные морфологии, иммунофлуоресценции гибридов ДНК-РНК и импульсного включения меченого уридина районов политенных хромосом дрозофилы на стадии Очасовой предкуколки. ,

Яркое свечение обнаружено в районах крупных и малых пуфов, интенсивно включающих радиоактивность. Однако, значительная часть яркой флуоресценции приходится.на районы малых пуфов,- хотя интенсивность включения, меченого уридина в них низка. Вероятно, в данном случае в гибридизацию вступает'РНК, "задержавшаяся" на хромосомах и упакованная с белками. Трудно

объяснимы факты слабого свечения крупных пуфов с высоким уровнем включения уридина Í29F1-2, 61АВ, 71СЕ, 82F и др.),' они составляют от всех районов со слабой флуоресценцией. Можно предположить, что в этих районах РНК быстро деградирует или образует очень нестабильные гибриды, которые за период реас-социации распадаются до устойчивых ДНК-ДНК дуплексов.

Обращает на себя внимание яркое свечение прицентромерно-го гетерохроматина всех хромосом, которое обусловлено высокой транскрипционной активностью последовательностей Р-гетэрохроматина.

Из 350 исследованных районов 90« полос флуоресценции и 5035 радиоактивности приходится на районы малых пуфов, которые согласно визуальным онтогенетическим исследованиям Беляевой Е.С. (1S82) имеют постоянную морфологию, что преполагает постоянство их функционирования в онтогенезе слюнной железы дрозофилы.

3.06 относительном постоянстве функционирования малых пуфов в нормальном онтогенезе дрозофилы.

Постоянство функционирования пуфирупаих районов исследовали в 2R хромосоме на 4 стадиях развития, охватыващих 12 часов (PS1, PS8-9, PS10-11, PS14-16). Для этого использовали сравнение морфологических и имммунофлуоресцентных характеристик оценки транскрипционной активности. Для удобства анализа все районы 2R хромосомы разделили на 2 класса: в первый вошли районы, в которых на определенных стадиях развития формируются крупные пуфы (от 4 до 6 баллов) и во второй - районы, морфология которых постоянна или меняется незначительно. Отсутствие корреляции между уровнем упаковки хромосомного материала и его иммунофлуоресцией обнаруживается прежде всего в районах формирования крупных пуфов. Особенно это заметно, когда яркое свечение гибридов ДНК-РНК сохраняется при переходе крупного пуфа в малый пуф. Вероятно, размеры пуфов отражают не только интенсивность транскрипционных процессов , но и длину транскрибируемой последовательности. Из 30 таких районов прямая корреляция соблюдается только в 1/3 случаев. В табл.2 представлена классификация районов 2R хромосомы по данным иммуно-флуоресцентной локализации гибридов ДНК-РНК. Анализируя све-

Табл.2 КЛАССИФИКАЦИЯ РАЙОНОВ 2Е ХРОМОСОШ ПО ДАННЫМ ИММУНО-еЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ ГИБРИДОВ ДНК-РНК.

Морфология

Характеристика иммунофлуоресцентного свечения гибридов ДНК-РНК

Районы

I.Районы,значи тольно меняшие степень декон-денсации на оп рэделенных РБ (степень декон-дэнсации от 4 до 6 баллов)

II.Районы,в которых деконден-сация постоянна или меняется незначительно (от 1 до 3 баллов)

1.Уровень постоянный, яркое свечение

2.Уровень непостоянный:

а)экдистерон-стимули-руемые, яркое свечение на РБ8-9 и Рвю-11

яркое свечение на Р58-9,10-11 и 14-16

б)8кдистерон-репресси-руемые, яркое свечение на Рв1

1.Уровень постоянный: яркое свечение

слабое свечение

8.Уровень непостоянный!

а)экдистерон-стимули-руемые, яркое свечение на РБ8-9 и РБ10-11

яркое свечение на PS8-9, 10-11 и 14-16

б )экдистерон-реггрес-сируемые, яркое свечение на PS1

46r,47A,47D,50C5-11, 50С17-23.50В5-7.52С, 56Е1-2,59F

44B,48B,4BC,52D,55D, 55E,57В,57F,58C

47В,55C1-5.58В

43E.50A.50F.58E

42С,42D,45С,45Е,45F, 4бС, 47С, 49А , 51В, 52А, 56С,56D13-15,571>, 57£. 60E3-4.60D

43А,43F,44F,45В,4бВ, 48D,48Е,50В,52Е,54С, 54D,54Е,54F,55А,55В, 56А,56D3-12,56F,57А, 58А,59А,60АЗ-13

43D,44А,45А,45D,48А, 49В,49Е,49F.51D,51Е, 52F,5ЭА,53Е,59В, 59Е, 60А14-16.60В

44C.44D, 46A.53F.58t', 58F.59D

46D,48F,49C,50E,51A, 51С,54А.54В1-7, 56ЕЗ-6.60Е7-12

чение в отдельных районах 2Р. хромосомы на 4 стадиях развития, мы выделили районы в которых количество гибридов постоянно к меняется в связи с онтогенетическим возрастом. Наибольший интерес вызывают районы, относящиеся к малым пуфвм с постоянной морфологией. Около 50% таких районов флуоресцирует на постоянном уровне: одни - с высокой интенсивностью, другие -с низкой. На фоне постоянной активности этих районов происходят изменения активности в другой половина районов малых пуфов. Ранее были определены только крупные экдистерон-зависи-мые крупные пуфы, значительно меняпцие свою активность в период онтогенеза при переходе от личинки к куколке в соответствии с титром экдистерона. Нами обнаружены экдистерон-зави-симые малые пуЗы, в которых при изменении титра гормона изменяется флуоресценция гибридов ДНК-РНК.

Особое полокение в классе малых пуфов занимают мевдиски. Еопрос о транскрипционной активности кеглисков обсуядается давно. О том, что эти районы участвуют в синтезе РНК, говорят

о

факты включения Н-уридина (5етез111п е! а1., 1979;). локализации РНП гранул (Бкаег, 1977; Мои, Hi.ll, 1986), гибридизации к-ДНК (Кгеаз е1; а1., 1985), иммунофлуоресцентного окраши-Еания на РНК-полимеразу II и различные фракции негистоновых белков (КаМзсЬ, Bautz, 1983: Г1в1асЬтшш et а1., 1989 и мно-гиэ др.). В нашей работе показана флуоресценция гибридов ДНК-РНК в районе крупного меясдиска 100ВЗ/Ю0В4-5 ЗВ хромосомы, который включает меченый уридин (БешезШп et а1., 1979) и в меидиске 1Е1-2/1ЕЗ-4 X хромосомы. Свечение в этих районах присутствует на всем исследуемом отрезке онтогенеза.

Онтогенетический анализ распределения гибридов ДНК-РНК в 2Я хромосоме РгозорЫ.1а гое1апо#аз1;ег показал несоответствие морфологических и иммунофлуоресцентных критериев оценки транскрипционной активности районов политенных хромосом. Продемонстрировано относительное постоянство функционирования малых пуфов в нормальном онтогенезе хромосом слюнных келез Рго-аорЬПа шelanogaзter.

4.Влияние мутаций гормональных нарушений на транскрипционную активность районов политенных хромосом.

Ранее было показано, что мутации 1(1 ) 1:435 и 112111 нару-

шают развитие екдастерон-зависимого пуфинга (Belyaeva et al., 1984; Zhimulev et al.,1976). Эти мутации приводят к тому, что в политенных хромосомах мутантов отсутствуют крупные пуфы (за небольшим исключением) и транскрипционно активные районы в основном представлены малыми пуфами.

Мутация l(1)t435 затрагивает локус есз (ecdysterone-seg-sitivity), локализованный в раннем экдистерон-стимулируемом пуфе 2ВЗ-5 и определяющий чувствительность клеток к гормону (Belyaeva et al., 1981). Иммунофлуоресцентные данные показывают, что пуф 2ВЗ-5 транскрибируется на всех исследуемых стадиях развития кроме О-часовой предкуколки. При этом степень деконденсации хромосомного материала не всегда коррелирует с интенсивностью свечения гибридов ДНК-РНК. Так, на стадии PS1 при низком титре гормона малый пуф 2ВЗ-5 умеренно флуоресцирует. При повышении титра гормона перед окукливанием на PS8-9 и к концу предкуколочной стадии развития на PS20 район максимально деконденсирован и ярко флуоресцирует на PS8-9 , однако на PS20 свечение гибридов умеренное. На стадии 4-6-часовой предкуколки район выглядит как малый пуф с яркой флуоресценцией, хотя титр гормона низкий. Анализ большого экспериментального материала по структуре и функционированию этого района позволил высказать предположение, что ген ecs кодирует белковые факторы транскрипции с тканеспецифическим проявлением, которые взаимодействуя с регуляторными зонами структурных генов экдистерон-зависимых районов, влияют на их транскрипционную активность (Дубровский и др., 1990; DiBello et а]., 1991).

Иммунофлуоресцентная локализация гибридов ДНК-РНК в политенных хромосомах мутантов ld)t435 240-264 часов развития при 18°С показывает картину распределения транскрипционно активных районов, больше похожую на psi. Часть хромосом имеет меандрическое строение и тенденцию сжатия по длине. При этом сжатие хромосом происходит неравномерно, в некоторых районах морфология остается нормальной, в других - изменяется. Как показывают результаты, ярко флуоресцируют все акдистерои-репрессируемые районы крупных и малых пуфов, а также некоторые районы, флуоресцирующие на высоком уровне в нормальном онтогенезе. Экдистерон-стимулируемые районы и районы с низкой

транскрипционной активностью в нормальном онтогенезе флуоресцируют слабо. Интересно, что пуф 2ВЗ-5 имеет крупные размеры и ярко флуоресцирует, в то время как другие ранние экдисте-рон-стимулируемые районы 74EF и 75В минимально деконденсиро-ваны и слабо светятся. Видимо, мутация 1(1)t435 не затрагивает функции связывания с гормоном, а повреждает структуру, ответственную за синтез продуктов, влиятаих на транскрипционную активность других локусов. Низкий уровень флуоресценции отмечается в крупном экдистерон-репрессируемом пуфе 68С, что указывает на то, что расположенные в нем Бда-гены, транскрибируются на низком уровне. Подобный феномен был обнаружен у другого мутанта-аллеля гена еса - 1(1)прг1, у которого пуф бес не регрессирует и в нем не обнаружены продукты синтеза РНК.

У экдистерон-недостаточных мутантов l(3)tl (lethal tumorous larvae) процессы сокращения хромосом и превращения их в меандры Выражены гораздо сильнее. Гомозиготные личинки живут без окукливания до 30 дней, а затем гибнут. Личинки в возрасте 144 часов развития при 25°С имеют хромосомы с пуфовым набором, соотвествупцим доэкдистероновым стадиям развития (Zhimulev et ai., 1976). Дальнейшее развитие приводит к тому, что они начинают укорачиваться и расширяться, приобретет вид "помпоноподобных" структур с разрыхленным дисковым рисунком (Kobel, Breugel, 1968). Наибольшим изменениям подвержена X хромосома самцов l(3)tl. которая полностью деконденсируется и практически теряет дисковый рисунок. Как показывают наши результаты уровень свечения гибридов ДНК-РНК в хромосомах такого рода не выше, чем в аутосомах с дисковым рисунком. Следовательно, усиление степени деконденсации хромосомного материала не приводит к увеличению количества гибридов ДНК-РНК, что подтверждает данные ав'торадиографического включения меченого уридина (zhimulev et al., 1976). Эксперименты по гибридизации in situ клонов с известной локализацией показали, что гтри формировании "помпонов" не происходит смешивания хро юсомных нитей и поддерживается их продольный порядок. Нами предложена схема структурно-функциональной организации "помпоноподобных" хромосом мутантов (рис.2). Высокая степень деконденсации хромосомного материала обусловлена нарушением конъюгационных

взаимодействий между отдельными хроматидами без изменения их транскрипционной активности. В результате целая хромосома превращается в сеть с частично коныэгирупцими хромомерами, расширяется и сокращается в длину.

мутантов влияет на степень выраженности дискового рисунка (табл.3). Низкая температура увеличивает число хромосом с четким дисковым рисунком, а картина свечения гибридов ДНК-РНК становится более выраженной и специфичной.

Табл.3.Влияние температуры на частоту появления различных типов хромосом мутантов 1(ЗИ1.

время развития в часах исследовано хромосом укороченные хромосомы 1* 2** короткие хромосомы 1 2 сверхсжатые хромосомы 1 2

25 400432 886 0 16 (1.8%) 80 765 (9%) (86.3%) 5 20 (0,56%) (2,3%)

18 552576 803 ■ 82 (10,2%) 121 (15%) 280 302 4 14 (34,9%)(37,6%)(0,5%)(1,74%)

* - число хромосом с дисковым рисунком ** - число хромосом без дискового рисунка

Укорочение хромосом обгоняется не только нарушениями в конъюгации, но и инактивацией синтеза РНК в районах крупных и малых пуфов и слияния их в блоки неактивного хроматина, как продемонстрировано ранее в авторадиографических исследованиях районов с известной морфологией (Zhimulev et al., 1976) и по изменению положения сайта гибридизации специфических клонов по мере изменения дискового рисунка. Увеличение числа хромосом с четким дисковым рисунком дало возможность идентификации хромосом с помощью гибридизации In situ клонами из разных хромосом. Нами продемонстрированы различные морфологические типы хромосом I(3)tl 552-576 часов развития при 18°С и изучено распределение гибридов ДНК-РНК. Показано, что иммунофлуо-ресцентное свечение не коррелирует со степенью упаковки ДНК. Гибриды ДНК-РНК обнаруживаются чаще в блоках рыхлого хроматина и отсутствуют не только в плотных крупных дисках, но и в части деконденсированных районов. Процессы сокращения хромосом по мере развития личинок приводят к уменьшению общего числа флуоресцентных полос, что говорит о затухании транскрипционной активности политенннх хромосом мутантов. Если нормальная 2R хромосома имеет от 100 до 110 полос флуоресценции различной интенсивности, то на укороченных и коротких хромосомах насчитывается от 40 до 60 полос. На фоне уменьшения числа функциональных районов у личинок этого возраста появляются пуфы теплового шока, в которых обнаруживаются гибриды ДНК-РНК,. Некоторые пуфы, такие как бзвс и 70А в 3L хромосоме и 87ас в 3R хромосоме, имеют крупные размеры, однако не показывают специфического свечения гибридов.

Таким образом, мутации, нарушающие гормональную регуляцию Droaophila melanogaater, приводят к инактивации синтеза РНК в экдистерон-стимулируемых районах крупных и малых пуфов. Постепенное затухание функционирования активных районов и ослабление конызгационных связей между отдельными хромати-дами приводят к укорочению и расширению хромосом, изменяя их морфологию и картину дискового рисуЕПса. Степень проявления дискового рисунка зависит от температуры выращивания культур мутантов. Обнаружение в настоящей работе случаев слабого свечения гибридез ДНК-РНК или полного отсутствия их в районах крупных пуфов может обсуждаться с точки зрения противоречия

классическим представлениям о том, что пуф! - морфологическое проявление локальной транскрипционной активности (Beermann, 1952). В литературных источниках уже описаны 3 группы фактов, свидетельствующих о разобщении процессов транскрипции и деконденсации. Крупные пуфы без признаков транскрипционной активности обнаружены при воздействии ингибиторов синтеза РНК (Beermann, 1965« Кикнадзе, 1965! Holt, Kuijpera, 1972; Baret-tino et al., 1982). Описаны экдистерон-репрессируемые пуфы без продуктов синтеза РНК у мутантов 1(1)su(f)ta67g (Hanssou et al., 1981; Hansson, Lamberteaon, 1983) и l(1)npr-1 (Crow-ley et al., 1984). И наконец получены линии мух, трансформированных с помощью Р-фактора, в которых в сайтах интеграции Sgs-генов отсутствовала корреляция между уровнем транскрипции и степенью деконденсации хромосомного материала (Rieharda et al., 1983; Crosby. Meyerowitz, 1986; Korge et al., 1990). В этих экспериментах показано существование отдельных молекулярных последовательностей, ответственных за процессы пуфооб-разования и транскрипции. В нормальном развитии эти процессы сопряжены и взаимосвязаны, регуляция их определяется взаимодействием транс-активирупцих факторов с промоторными областями генов. .Нарушение различных частей промоторных областей (действие различных ингибиторов синтеза РНК или мутаций) вызывает разобщение процессов синтеза РНК и формирования пуфов.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о неоднозначности морфологических критериев оценки транскрипционной активности в политенных хромосомах дрозофилы.

ВЫВОДЫ.

1.Продемонстрирована специфичность иммунофлуоресцентной реакции обнаружения гибридов ДНК-РНК на стандартно фиксированных препаратах политенных хромосом слшных желез Droaophila roeia-nogaster. Показана воспроизводимость и высокая разрешающая способность на уровне световой микроскопии метода иммунофлуоресцентной локализации гибридов ДНК-РНК.

2.Проведен сравнительный анализ транскрипционных характеристик 350 районов политенных хромосом Prosophila roelanogaster линии giant на стадии 0-часовой предкуколки. Показано, что прямая корреляция между интенсивностью свечения гибридов ДНК-РНК, степенью деконденсации хромосомного материала и уровнем

включения 3Н-уридина обнаруживается не всегда. Около 90% флуоресценции и 5056 радиоактивности приходится на районы малых пуфов, которые имеют постоянную морфологию.

3.Впервые показано относительное постоянство транскрипционной активности малых пуфов в онтогенезе Drosophila melanogaster. Около 50$ этих районов флуоресцирует на постоянном уровне, в другой половине флуоресценция меняется в зависимости от титра экдистерона и онтогенетического возраста.

4.Показано постоянство свечения гибридов ДНК-РНК в междисках 1Е1-2/1ЕЗ-4 Х-хромосомы и 100ВЗ/100В4-5 3R хромосомы Ргоао-phlla melanogaster.

5.Мутации, нарушапцие различные этапы гормональной регуляции Drosophila meianogaater, приводят к инактивации синтеза РНК в экдистерон-стимулируемых районах крупных и малых пуфов. Постепенное затухание функционирования активных районов вызывает сжатие хромосом и ослабление конъюгациошшх сил между отдельными гомологами, что приводит к изменению морфологии хромосом и потере дискового рисунка. Впервые методом гибридизации in situ проведена идентификация хромосом мутантов l(3)ti и предложен подход картирования хромосом с измененной морфологией. Степень проявления дискового рисунка зависит от температуры выращивания культур мутантов.

6.Показано отсутствие гибридов ДНК-РНК в районах крупных пуфов мутантов i(i)t435 и l(3)tl, что говорит о несоответствии морфологических критериев оценки транскрипционной активности политенных хромосом и данных иммунофлуоресценции гибридов ДНК-РНК.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1.Власова И.Е., Умбетова Г.Х. Иммунофлуоресцентная локализация гибридов ДНК-РНК в политенных хромосомах Drosophila meianogaater // V Всесоюзный симпозиум "Молекулярные механизмы генетических процессов", 1983, С.14-15.

2.Власова И.Е., Умбетова Г.Х., Циммерманн В.Г., Алонсо К., Беляева Е.С., Жимулев И.,Ф. Иммунофлуоресцентная локализация гибридов ДНК-РНК в политенных хромосомах Drosophila meianogaater // Докл. АН СССР, 1984, С.189-192.

3.Vlassova I.E., Umbetova G.H., Zimmermann V.H., Alonso С., Belyaeva E.S., Zhimulev I.F. Immunofluorescence localization

oi DNA-RNA hybrids in Droaophila melanogaster polytene chromosomes // Chromosoma, 1985. V.91. p.251-258.

4. Власова И.Б., Умбетова Г.Х., Беляева Е.С., Жимулев И.Ф. Выявление транскрипционно активных районов в политенных хромосомах Droaophila melanogaster методом иммунофлуоресцентной локализации гибридов ДНК-РНК // Генетика, 1985, т.21, ЖЗ, С.424-432.

5. Vlaasova I.E., Umbetova G.H., Semeahin V.F., Belyaeva E.S., Zhimulev 3.P. localization and characterization of the transcriptionally active sites in Droaophila melanogaster polytene chromosomes by means of immunofluorescent antibodies against DNA-RNA hybrids // Abstract Book of 9th European Dro-sophila Research Conference, Hungary, 1985, p.144.

6.Власова И.Е., Умбетова Г.Х. Характеристика участков транскрипционной активности в политенных хромосомах Droaophila melanogaster // VII Всесоюзный симпозиум "Молекулярные механизмы генетических процессов", 1987, С.13.

7.Umbetova G.H., Zhimulev I.F. Structure and transcriptional activity of the pompon—like X chromosomes of l(3)tl mutant of Drosophila melanogaster // Dros. Inform. Serv. 1987, V.66, p. 143-145.

8.Умбетова Г.Х., Власова И.Е. Иммунофлуоресцентная локализация гибридов ДНК-РНК в пуфирупцих районах политенных хромосом Droaophila melanogaster // X Всесоюзный симпозиум "Структура и функции клеточного ядра", 1990, С.124.