Иммунофизиологический статус рыб - объектов аквакультуры

Вихман, Арнольд Анатольевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Иммунофизиологический статус рыб - объектов аквакультуры
ВАК РФ 03.00.10, Ихтиология

Автореферат диссертации по теме "Иммунофизиологический статус рыб - объектов аквакультуры"

КОМИТЕТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 110 РЫБОЛОВСТВУ Всероссийский научно-исследовательский институт прудового рыбного хозяйства (ВНИИНРХ)

г) г г- г. я

Г I О V .4

.. ...... . . На правах рдкописи

ВИХМАН АРНОЛЬД АНАТОЛЬЕВИЧ

УДК 612.017.1:597-12:639.3./6

ИММННОФИЗИОЛОГИЧЕСКИИ СТАТУС РЫБ — ОБЪЕКТОВ АКВЙКаЛЬТУРЫ

03.00.10. ихтиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание иченой степени доктора биологических наук

Москва, 1394

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте прудового рыбного хозяйства

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

В. Г. Галактионов

доктор ветеринарных наук, профессор В. И. Афанасьев

доктор биологических наук, профессор А. А. Яржонбек

Ведущее учреждение - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. я. Р.Коваленко

Зашита состоится 27 декабря 1994 г. на заседании Специализированного совета Д 117.04. 01 при Всероссийском научно-исследовательском институте прудового рыбного хозяйства 1ВНШШРХ) по адресу: 141821.Московская обл..Дмитровский район, пос. Рыбное

С диссертацией нохно ознакомиться в библиотеке ВНИИПРХ. Автореферат разослан 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

С. п. Трянкина

ОЬ'ЩЛЯ ХЛРЛКТКРИСТИКЛ РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Культивирование животных и функционирование природных популяций требует поддержания достаточно высокой резистентности к неблагоприятный промышленным и природно-климатическим Факторам воздействия (Шишков и др. > 1986; Кунаков и др.. 1990). При промышленном разведении животных контроль и регулирование резистентности приобрели значение одного из ведущих факторов получения товарной продукции (Коваленко. 1976; Болотников и др. , 1987; Коромыслов, 1988; Филиппов. 1989). Устойчивость животных к действию биологических, химических и механических Факторов обусловлена иммунной системой и связанных с ней других систем и была определена как "иммуноФизиологическая реактивность" (Корнева. 1979).

Повышению эффективности иммунофизиологических исследований при промышленном разведении животных способствовала разработка системного анализа иммунного (специфического) ответа у высших позвоночных (Купер, 1980; Галактионов. 1982, 1986; Петров, 1987; Фанталин. 1988; Пестова. Четвертных, 1990; Даугалиева. Филиппов, 1991). Установлена неоднородность морфологических и функциональных эленентов, реагирующих на антигены, различная роль этих элементов и последовательность их участия в образовании активных молекул и клеток. В значительно меньшей мере изучены с системных позюшй другие виды иммуноФизиологической реактивности, связанные с неспецифической инактивацией патогенов и защитными транспортными процессами.

Наряду с высшими позвоночными, получили развитие представления о системном принципе функционирования иммунной системы рыб (Good et al. , 1968; J^rgensen. 1989). Однако, эти исследования были мало связаны с актуальными вопросами промышленного выраши-вания рыб. Развитие аквакультуры, интенсификация рыбоводства, освоение новых объектов разведения требовали совершенствования оценки Физиологического статуса рыб (яржомбек, 1981. 1988; Ка-нидьев, 1984; Виноградов, 1985. 1991; Козлов. Абрамович, 1986; Гершанович и др. . 1987; Душкина. 1988. 1991; карпевич, 1988; Остроумова. 1988; Щербина и др. . 1989; Чихачев. 1991). это относилось и к иммуноФизиологической реактивности, включая общую методологию исследования и отдельные методы выявления реагирования на технологические Факторы в условиях современного производства (Нусселиус, 1976; канаев, 1984; Никряков. 1986; Афанасьев и др., 1989; Лукьяненко, 1989). Во всестороннем изучении нуждался ос-

новной объект рыбоводства страны - карп. Развитие системного анализа инмуноФизиологического статуса культивируемых рыб может способствовать, как и при разведении эндотермных животных, совершенствованию управления производства рыбы.

Цель и задачи работы. Целью исследования явилась разработка системного анализа имнуноФизиологического статуса рыб - объектов аквакультуры и принципов его применения для контроля состояния рыб при оптимизации процессов выращивания.

Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:

- обобщение современных сведений об организации иммунофизи-ологической реактивности рыб . свойствах отдельных функциональных элементов и их взаимосвязей;

- совершенствование количественного исследования гуморальных иммунофизиологических факторов и методов определения антибактериальных и антитоксических свойств органов и тканей;

- разработка комплекса показателей для оценки отдельных систем и иммуноФизиологической реактивности организма в целом;

- изучение распределения естественных гуморальных Факторов в органах карпа . толстолобика и веслоноса; сравнительная характеристика иммуноФизиологической активности покровов, лимфоидных органов и крови;

- оценка влияния на иммуноФизиологический статус рыб технологических стресс - Факторов и нетрадиционных кормовых компонентов;

- выявление изменений специфической и неспецифической реактивности карпа при некоторых заболеваниях и селекции на повышение рыбоводных качеств;

- обоснование системных принципов опенки инмуноФизиологического статуса рыб - объектов аквакультуры и их применения в условиях прмкппленного производства.

Научная новизна и теоретическая значимость. Впервые сформулировано и обосновано представление о системной природе иммуноФизиологической реактивности организма рыб как части резистентности, ответственной за защиту от биологических, химических и механических патогенов. Имнунофизиологическая реактивность обусловлена комплексом Функций, включая иммунный ответ, неспецифическую инактивашпо патогенов, транспорт патогенов и защитных образований. Каждая функция инеет собственную системную организацию, связанную с разнородностью и взаимозависимостью ее элементов. Системы объединены способностью непосредственного взаимодействия с патогенами, но отличаются механизмами зашиты, образованием им-муноФизиологических Факторов и внутрисистемной регуляцией.

Выдвинуто и развито положение о мембранной природе иммуно-Физиологической активности органов и тканей рыб. которые определены как "накромембраны". Макромембраны рыб являются образованиями, обладающими не только барьерной, но и продуцирующей способностью. Проницаемость макромембран отражает суммарное взаимодействие иммунофизиологических Факторов и патогенов. Установлена зависимость проницаемости кожного покрова карпа от дозы, времени воздействия , вида воздействующего вешества и состояния покрова.

Разработан новый методологический подход для количественной оценки содержания имнунофизиологических Факторов в органах и тканях. Установлено широкое распространение и неравномерное распределение естественных антител и яизопина в покровных образованиях и внутренних органах рыб. Обнаружены видовые различия в уровне имнунофизиологических Факторов при сравнении карпа, гибрида толстолобиков и веслоноса.

На единой методологической основе выявлен высокий уровень вариабельности иимунофизиологической реактивности при воздействии технологических и природных Факторов. Выделено три уровня изменчивости иммунофизиологического статуса, включая непосредственное реагирование на возбудители заболеваний и стресс-агенты, сезонные и годовые отличия реактивности. Специфический и неспе-аифический ответы характеризовались достаточно высокой автонон-ностью изменения отдельных систем и их имнунофизиологических Факторов. Для оценки изненения связей системных показателей разработана модификация многомерного статистического анализа, позволяющего выявлять новые стороны реагирования.

Практическая цеиность и реализация результатов работ. Разработаны основные принципы применения системной оценки иммунофизиологического статуса рыб - объектов аквакультуры. СФорнулиро-ваны задачи иммунофизиологического исследования, определен комплекс одно- и многосистемных показателей и охарактеризовано их значение, даны рекомендации по выбору показателей.

Предложен метод количественного анализа иммунофизиологичес-кой активности органов и тканей рыб и подготовлены "Методические указания по количественному анализу гуморальных факторов резистентности в органах и тканях рыб" (утверждены Нинистерствон рыбного хозяйства СССР 8.05.91. ).В производственных и экспериментальных условиях показана пригодность тест-системы, включающей гетерогемагглютинины и лизопим. для установления оценки иммунофизиологического статуса при воздействии природных Факторов, рыбоводных стресс-агентов и воспалительных процессов.

Разработаны методы проведения реакций непрямой гемагглюти-

нации и диффузной преципитации для определения антител к эндотоксину патогенных аэромонад (учебно-методический натериал "Методы иммунологического исследования рыб", ВДНХ. 1987). Показана применимость этих реакций для определения показателей реактивности рыб в условиях селекции на повышение устойчивости к заболеваниям и при контроле эпизоотической ситуации.

Подготовлена нетодика определения Фактора, подавляющего активность ФосФорорганических соединений, усовершенствован способ оценки обшей проницаемости кожи рыб (авт. св. 263698 от 2.11.87.).

Разработана компьютерная программа нногонерного статистического анализа, применяемого при оценке инмуноФизиологического статуса карпа (лицензия Н1368 от 25.06.89. на "ноу-хау" "Новый метод оценки иммунобиологического статуса рыб").

Учебные и методические материалы работы вошли в "Лабораторный справочник по болезняи рыб" (1983). сборник методов ихтио-токсикологических исследований (1987) и "Справочник по Физиологии рыб (1986). а также использованы на семинарах ихтиопатологов и других специалистов.

Апробация работы. Результаты исследований . содержащихся в диссертации обсуждались на семинарах и конференциях ВНШШРХ, а также на научных собраниях в нашей стране и за рубежом: 6 (Ленинград. 1974) и 8 (Ленинград,1979) Всесоюзных совещаниях по болезням и паразитам рыб. 3 (Рига.1976) и 4 (Киев,1981) съездах Всесоюзного гидробиологического общества, семинарах "О новых и передовых методах борьбы с болезнями рыб в рыбоводных хозяйствах Нинрыбхоза СССР (Москва,1977) и "Пути улучшения ветеринарно-са-нитарных мероприятий по профилактике и ликвидации болезней рыб" (Москва,1978), Всесоюзном совещании "Совершенствование биотехнологии прудового рыбоводства" (Рыбное,1981). 1 Всесоюзной шко-ле-сенинаре по экологической и эволюционной имнунологии (Борок. 1980), Международном семинаре "Fish, Pathogens and Environment in European Polyculture" (Сарваш, Венгрия, 1981). Всесоюзных конференциях по экологической Физиологии и биохимии рыб: 5(Киев. 1982). & (Паланга. 1985), 7 (Ярославль,1989). 8 (Петрозаводск. 1992). 1 Всесоюзном совещании по зоокультуре (Москва,1988). УП Всесоюзной симпозиуме по инфекционным болезням рыб (Носк-ва.1986). конференциях "Экологические механизмы преобразования популяций животных" (Свердловск.1986). 1 Всесоюзной съезде иммунологов (Сочи.1989). Международной симпозиуме по генетике карпа (Сарваш, Венгрия.1990), совещании "Экологические аспекты и природоохранные мероприятия при использовании теплых вод (Светло-дарское.1991). 2 Всесоюзной конференции по рыбохозяйственной

токсикологии (С. Петербург. 1991). 1 съезде иммунологон России (Новосибирск, 199.'?)

Публикации. Но материалам диссертации опубликовано свыше 60 работ, включая научные статьи. раздел в лабораторном практикуме по болезням рыб. учебные и методические материалы. Общий объем публикаций составил более 17 печатных листов.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 269 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (гл.1), раздела "Материал и методы исследования" (гл. 2). основного содержания работы (гл.3-7). заключения, выводов , практических рекомендаций и приложений 1-4. Список литературы включает 292 отечественных и 158 иностранных источников. В тексте имеются 46 таблиц и 30 рисунков.

ГЛАВА 1. ИММУН0ФИЗИ0Л0ГИЧЕСКАЯ РЕАКТИВНОСТЬ РЫБ,

ХАРАКТЕРИСТИКА ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ КОМПОНЕНТОВ И ИХ ВЗАИМОСВЯЗЕЙ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

Приводятся данные литературы об организации имнуноФизиологической реактивности рыб. Установлено, что не только иммунный ответ, но и неспецифическая инактивация патогенов имеют признаки системного проявления. Накапливаются сведения о системной организации защитных транспортных процессов, которые осуществляют доставку патогенов к активным органам и циркуляцию иммуноФизиологических Факторов. Проведенные исследования показали следующие системные признаки различных компонентов иммунофизиологической реактивности:

- инактивация патогенов связана с комплексным воздействием ассоциации иммунофизиологических Факторов в зависимости от вида патогена и уровня активности организма;

- защитные реакции осуществляются Факторами различной природы и механизмов действия, включая молекулярные и клеточные Факторы;

- в образовании иммунофизиологических Факторов участвуют различные клеточные элементы, взаимосвязанные происхождением и Функциональной активностью;

- Формирование иммунофизиологических факторов и их взаимодействие с патогенами осуществляется в различных органах и тканях. обладаюпих как собственной активностью, так и зависимостью от других образований.

ИммуноФизиологические системы объединены в функциональный конплекс. деятельность которого направлена на предупреждение и

снижение поражений, вызываемых патогенани (рис.1). Часть деятельности систем непосредственно не связана с воздействием на патогены и отражает обшее состояние реактивности. Регуляция им-иунофизиологической реактивности осуществляется как внутренними, так и внешними Факторами, которые оказывают прямое и косвенное (через обшие регуляторные системы) влияние (рис.1).

Рис. 1. Пути регуляции иммунофизиологической реактивности рыб.

Изучение регулирующей роли внешних воздействий на системном уровне касалось,и осношюм. климатических Факторов и загрязнений и не включило опенку влияния технологических факторов на основные объекты промышленного выращивания.

ГЛАВА 2. МЛ'ГЕРИЛ/1 И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основными объектами исследования явились внутривидовые группы карпа Cyprinus carpió L. , различающиеся по типу четуйного покрова и методам селекционирования. Обшее количество исследованных рыб составило свыше ¿000 экз. (табл. 1). Рыбу выращивали по технологии, описанной в "Сборнике нормативно-технологической документации по товарному рыбоводству" (1986).

Таблица 1.

Характеристика карпов, исследованных в экспериментальных и промышленных условиях.

Место и время исследо- Генетические • Возраст Количес- Средняя

вания ГРУППЫ рыб тво, экз. (масса, г 1

Центральная экспериментальная база вниипрх. 1973-1980 гг. Загорская база, 1977 г. Литва ("Арвидай"), 1979 Шатурская база,

1987-1988 гг. Ангелинский СПУ«:1979 г.

1987-1989 гг.

1988-1989 гг. Белоруссия ("Лахва")

1989-1991 гг. Белоруссия ("Тремля")

1989-1991 гг. Ангелинский СПУ 1993 г. 1993 г. Садковое хозяйство 1993 г.

Беспородный

Беспородный г. Беспородный Беспородный

Краснухоус-тойчивый

Лахвинский

Тремлянский

Краснухоус-тойчивый

Беспородный

0+ 1 +

О* 1 + 1+

1+ 1 + 1 + 0 + 1 + 0+ 1 +

2 + 3 + 2 + 1 +

240 526

111 60 130

20 270 180 120 116 90 87

59 59 18 13

14 190

15 180 286

225 600 80 91 620 28 332

320 900 2500 1700

Примечание:« - селекционно- племенной участок Ангелинского рыбхоза Краснодарского края. 9

Кроне карпа, опыты были проведены с гибридом белого (HYPOPhtalmichthrs molitrix Val. ) и пестрого (AristichtbYS mobilis Rich. ) толстолобиков и веслоносом (Polyodon spathula (Walbaum). Вырашивание веслоноса осуществляли в соответствии с "Технологией разведения веслоноса" (1991).

Экспериментальные исследования выполнены на центральной экспериментальной и загорской базах ВНШШРХ. Ангелинскон опытном участке и рыбоводном заводе "Горячий ключ". Производственные наблюдения проводили в рыбоводных хозяйствах Краснодарского края (Ангелинский"). Белоруссии ("Лахва", "Тренля") и Литвы ("Шальчи-нинкай"). Условия вырашивания рыб в различных климатических зонах и отдельных хозяйствах приведены в рыбоводных работах (Фе-дорченко и др., 1981; Иельченков, 1991; Таразевич. 1993).

Основные направления и содержание проведенных экспериментальных работ представлены на рис. Н

Клиническое и патологоанатомическое исследование рыб. извлечете органов и тканей и подготовку материала для исследования выполняли по принятым в ихтиопатологии методам (Amiacher,197г; Гончаров.1973).

фракционирование лимфоидных органов на клеточную и внеклеточную Фракции осуществляли методом гомогенизации. Выделение свободных клеток и оценку их жизнеспособности проводили по N. Jeme и A. Hordin (1963).

В качестве иммунофизиологических паказателей испльзовали следующие тесты:

- содержание специфических антител к эндотоксину и агглюти-ногену патогенных аэромонад;

- содержание естественных гетерогемагглютининов и лизонима, а также образование лизодима клетками почки;

- способность тканевых вешеств воздействовать на ФосФорор-ганические соединения;

- определение проницаемости кожи in vitro при воздействии фосфорорганических соединении.

Для определения противоаэромонадных антител использовали клеточный антиген в виде Формолвакцины и полисахаридный компонент эндотоксина, полученный-по методу Е. Neter (1956). Реакцию непрямой гемагглютинации проводили методом микротитрования. Реакцию диффузной преципитации в геле выполняли по о. Ouchterlony (1965) и G. Manemi (1964). культуры аэромонад предоставлены нам к. в. н. К. А. Лобунцовым и к. б. н. Л. Н. Юхименко. Кроме того, от К. А. лобунцова получены культуры псевдомонад и гипериимунные анти-аэромонадные сыворотки.

Рис. г. Обшая схема экспериментальных исследований

Гетерогемагглютинины определяли методом никротитрования. принимая за титр реакшго на **■. Антигенами служили эритроциты человека группы ВШ) или беспородных кроликов, фиксированные Формалинон (Никитин. 1977) . Инкубацию ингредиентов проводили при 18-го® С. Лизоцим определяли двумя методами: диФФУзно-гелевым

(Каграманова. Ермольева,1966) и серийных разведений (Генералова, ситнова. 1994). При первом методе концентрацию лизоцина выражали в нкг, при втором - в титрах.

При изучении влияния тканевых веществ на биологическую активность ФосФорорганических соединений (ФОС) использовали холи-нэстеразную реакцию, которую проводили по методам Н. Hlchel(1949) и А.А.Покровского и Л.Г.Пономаревой (1964).Анти-ФОС действие веществ кохи оценивали по разведению водного экстракта, при котором Л РН (сопоставление активности контрольного раствора бути-рилхолинэстеразы с активностью фермента в присутствии экстракта) не превышала о, 3. Для определения степени угнетения активности ФОС экстрактами применяли Формулу:

Д рН (ФОС + экстракт) - Д рН (экстракт)

D = 100 - -----------------------------------------х 100

_ РН (ФОС)

где: D - относительная анти-ФОС активность экстракта, /.

100 - относительная активность ФОС, г Л РН - максимальное различие величины рН при сопоставлении активности двух проб.

Обшую проницаемость кожи определяли по Н. С. Строганову и

А. П. Лашмановой (1968). Плошадь поверхности кожи, контактирующей г

с ФОС составила 3 см .

Развитие стресс-реакции выявляли по уровням сахара крови (реакция с пикриновой кислотой) и гликогена печени, определенного антроновын методом (Моргун. 1963). Индексы органов определяли в соответствии с рекомендациями ( Лиманский и др. , 1984). Уровень белка в сыворотке устанавливали с помощью рефрактометра.

Статистическая обработка результатов осуществлена по программам "STUD" (ВНИИПРХ) на ЭВМ "Минск- 32" и IBM PC/AT 286, а также разработок Л. А. Хивотовского (1979) по применению многомерной статистики в биометрии. Разделение выборок на классы по отдельным признакам проводили методом хи-квадрат (Глотов и др. , 1982). Достоверность различия выборок оценивали при 95/. уровне значимости. В качестве критических значений статистических показателей приняты следующие величины:

1. Параметрические показатели.

- t - критерий стыодента г, 10 (п - гл-гв) и 2.0о <n = SO).

- коэффициент корреляции г о, 4!'. (п 20) и о. 35 On - JO).

2. Непараметрические показатели.

- критерии Крускапа Уоллиса .<.■'$'( (п ,'0 -J0).

- критерии манна-Уитци Ь'.Г «:тin .'0!.

ь:

- коэффициент корреляции Спирмена D. То (гг ¿0) и О, Jb (rr ЗО)

- х- критерии 'i.H'j (п lb) и ч.зо (п=1Н).

Методические особенности отдельных экспериментов длин в соответствующих разделах и приложениях 1-4.

ГЛАВА 3. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГУМОРАЛЬНЫХ ИММУНОФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ И ИХ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ В ОРГАНАХ И ТКАНЯХ РЫБ В серологии широкое распространение получили методы, связанные с серийным разведением исследуемого материала и учетом результатов реакции с помощью титра. Однако, расхождение способов обработки материалов, отсутствие данных о его исходном количестве и вариирование соотношения ингредиентов затрудняло сравнение результатов. Разработанные методы количественного определения антител и неспецифических гуморальных Факторов достаточно трудоемки и требуют специального оборудования ( Герберт, 1974; АреФьев и др., 1977; Anderson et al. , 1979). Наши исследования были посвяшены совершенствованию количественного анализа гуморальной имиунофизиологической активности органов и тканей рыб и касались различных этапов исследования.

3. 1. количественный метод определения гуморальных Факторов Обязательным элементом количественной оценки активности материала является измерение его объема или массы. При исследовании материала большого объема измеряли его исходное количество и отбирали часть материала для проведения реакции.

При испытании различных способов экстрагирования наиболее пригодным оказалось предварительное замораживание проб и после размораживания проб извлечение гемагглютнинов и лизоцима дистиллированной водой рн 5.5-6,О. Оптимальное соотношение гомогената органа или ткани и экстрагента составило 1:1 - 1:1,5.

Для расчета активности материала необходимо представить конечный результат реакции в виде условных единиц активности или определенного количества активного вешества. При использовании серийных разведений об активности материала судят по величине титра, который соответствует степени разведения материала, или обратного титра, т. е. целого числа. В качестве единицы активности испытуемого натериала принята его способность вызывать отчетливую реакцию взаимодействия с соответствующим субстратом, которую считали равной 1 условной единице (усл. ед. ). После установления титра натериала для выражения его активности в условных единицах обратный титр умножали на 1 усл. ед. Следующим этапом

расчета явилось определение удельной активности, показывавшей количество иннуноФизиологического фактора в едишше объема исследуемого натериала. принятой за 1 ил. Удельная активность материала прямо пропорциональна обратному титру, выраженному в условных единицах, числу объемов реакционной смеси в 1 мл и обратно пропорциональна объему испытуемого материала в реакционной смеси:

1 мл

1 х - усл. ед. х-

ь ил

С уд. = -- ; - = усл. ед. /нл

а х к мл

где: с уд. - удельная активность материала, усл. ед. /мл,

г - величина обратного титра Фактора, усл. ед.

а - количество исследуемого материала в реакционной смеси, нл,

в - обшее количество реакционной смеси, нл,

1 - единица объема, ил,

К - коэффициент уменьшения удельной активности.

Для упрощения расчетов ввели коэффициент уменьшения К.

В наших исследованиях для применения единой методики расчета коэффициент уменьшения был принят равным 400 при определении генагглютининов и равным 25 при определении лизоцина.

Пример. При определении генагглютининов в экстракте органа были получены следующие результаты: обратный титр - 16 (соответствует 16 усл. уд. ). количество испытуемого материала - 0.025 мл, количество тест-субстрата (эритроцитов) - 0,025 мл. общий объем реакционной смеси - О, 05 мл, коэффициент уменьшения - 400.

Удельная активность экстракта равна:

16 х -

0,05

С уд. = - - 32 усл. ед. /мл

0.025 к 400

Если при титровании материал сравнивают с эталонным препа-ратом (калибровочный раствор определенной концентрации), то ого удельную активность выражают не н условных единицах, л и соот ветствуюших мерак активиостн: мкг/мл. мг/мм. ел. /мл и т. я.

Jlo iifJii(4HiidH удельной активности и объема экстракта из ис-следуемого материала (орган или проба ткани, эмбрионы или личинки ноликом), рассчитывали абсолютное содержание Фактора н исходной пробе:

С абс. - С уд. х V экс. где: С абс. - абсолютное содержание Фактора, усл. ед. . мкг.

С уп. - удельная активность материала, усл. ед. /мл, мкг/нл.

v экс. - объем полученного экстракта, мл.

Если исследовали часть органа (ткани), то полученную величину абсолютной активности умножали на число таких частей в органе.

По величинам абсолютной активности и общего объема исследуемого материала (пробы) до экстрагирования, находили относительное содержание Фактора :

V- 1 iI • — cjO^. . *v UPCwU

где: С отн. - относительное содержание Фактора, усл. ед. /мл. мкг/мл,

С абс. - абсолютное содержание Фактора, усл. ед. , мкг.

V пробы - объем исследуемой пробы, мл.

Материалы, общий объем которых не известен (сгусток и сыворотка крови, слизь кожи и пищеварительного тракта), характеризуют только по относительному показателю. В линфоидных органах и жабрах может быть определено как абсолютное, так и относительное содержание Факторов.

Общая схема индивидуальной оленки гуморального звена имму-ноФизиологической реактивности и соответствующие показатели представлены на рис. 3.

3. 2. Изучение распределения гемагглютининов и лизонина.

Неравномерность распределения иммуноФизиологических Факторов в органах и тканях рыб установлена в отношении гидролитических Ферментов и антител (Микряков, 1970; Лукьяненко. 1971. 1989; Fletcher. Write, 1973). Количественный метод открыл новые возможности для более точного изучения сравнительной активности органов и тканей. В наших исследованиях определяли два Фактора, характеризующие состояние иммунной системы - гетерогенагглютини-ны и системы веспепифической инактивации патогенов - лизошш.

сопоставление активности линфоидных органов и сыворотки у карпа показало, что наиболее высокое абсолютное содержание агглютининов и лизопима имеется в туловищной почке, меньшее количество - в головной почке и саное низкое - в селезенке (табл. 2).

определение удельного содержания Факторов в материале

Рис. 3. Схема количественного определения гуморальных «¡■акторов в органах и тканях.

Уровни относительного содержания разных видов гемагглютини-нов значительно отличались: агглютинины к эритроцитам человека (АЭЧ) в максимальном количестве выявили в туловишной и головной почках, а агглютинины к эритроцитам кролика (АГЖ) - в сыворотке крови. Самые низкие уровни АЭЧ и лизооима найдены в сыворотке и АЭК - в селезенке. Изучение достоверности различия между содержанием разных видов гемагглютининов показало, что лишь в сыво ротке крови достоверно преобладают АЭК (г.-критерии 'I. ъо).

) б

Таблица 2

Содержание гемагглютилинов и лизоцима и лимФоидных органах и сыворотке крови двухлетков чешуйчатого карпа (п = 20)

Вид гуморального Фактора Содержание гуморальных Факторов ( М + ш. С. V. )

туловищная почка селезенка головная почка сыворотка крови

Абсолютное содержание

АЭЧ, « усл. ед. АЭК. ** усл. ед.

лиэопим;

нкг

24. 60±3. 78

68, 7 33, 90 + 3. 18

70.0 50. Я4+.2, 33 20. 5

г. 28+0. 48

82. 5 3. 90±0, 84

90, 5 14, 90£2, 14 64, 4

б, 90+1. 50

77. 9 9. 66+1. 92

83, О 23, 29 + 1, 89 35, 5

Относительное содержание

АЭЧ, 29, 16+4, 62

усл. ед. /мл 71.2 АЭК, 23, 82+3, 42

усл. ед. /мл 65, 9 АЭК/АЭЧ 0,97+0.13 58. 8

лизоцим. 60, 74+2, 92 мкг/мл 21,5

5. 88±0. 96 68, 6 10. 26+2, 28 91.2 2, 46+0. 83 ,143.9 41. 27+5, 88 63.7

26. 76 + 3. 96

63. 2 30, 36+9, 04 70, 7 1. 19+0, 15

52. О 80. 53+9, 59

53, 2

О. 78+0. 36 206.0 93. 60+20. 40 94. 7

27.20+10,0 82, 14 4. 06+0. 73 81. О

Примечание:«АЭЧ - агглютинины к эритроцитам человека, **АЭК - агглютинины к эритроцитам кролика.

Коррелятивные связи содержания отдельных Факторов в органах и сыворотке оказались слабыни (г = 0,02-0,41). исключение составила пряная зависимость уровня АЭК в туловищной почке и селезенке (г = о.51). а также уровня лизоцииа в туловишной и головной почках (г - 0.56).

При сравнении разных компонентов линфоидных органов у двухлетков карпа более высокие уровни генагглютиюшов отмечали в клеточной Фракции почек и крови... Данные по суммарной активности фракций подтвердили, что по обоин видан гемагглютининов туловищная почка более активна, чел другие линфоидные органы. Определение лизоцина в различных Фракциях органов у сеголетков (41 экз.)

выявило более высокие показатели в неклеточной фракции туловищной и головной почек и-критерий = 2.69 -2.87). фракции селезенки по абсолютному показателю не различались, а по относительному показателю уровень лизоцина в клеточном экстракте был значительно выше (1-критерий = 4,67).

Изучение фракций крови у двухлетков карпа показало, что содержание агглютининов к эритроцитам человека и лизоцина в сгустке превосходило уровни Факторов в сыворотке (критерий Круска-ла-Уоллиса - 16.2-24.6). но обе фракции содержали равное количество АЭК. Корреляция между активностью сыворотки и сгустка отсутствовала (коэффициент Спирмена = 0,12-0.26).

В жабрах двухлетков чешуйчатого карпа (17 экз. ) относительное количество АЭЧ превышало их количество в сыворотке, но не отличалось от туловишной почки. Уровень АЭК превышал относительное содержание фактора в туловишной почке. Отнечено более низкое содержание лизоцина по сравнению с сывороткой. Корреляция между содержанием различных факторов в жабрах и между отдельными Факторами в жабрах и туловишной почке отсутствовала.

Естественные гетерогемагглютинины и лизоцим найдены в экстрактах и слизи кожи и в слизи кишечника. У сеголетков карпа относительный уровень АЭЧ в коже составил 2, 9±0. 4 у сл. ед. /мл. а АЭК - 4,6+0,4 усл. ед. /мл. В слизи кожи двухлетков уровень АЭК был ниже и содержание обоих видов агглютининов, в основном, было меньше по сравнению с другими образованиями. Корреляция между активностью слизи кожи и сыворотки оказалась слабой (коэффициент Спирмена = О, 30). Значительное количество Фермента обнаружено в слизи кишечника, составившее 74.0+11.0 икг/мл. Зависимость между содержанием лизоцина в кишечнике и других органах отсутствовала. Испытание лизошшпродуцируюшей способности 10 вирулентных и 10 слабовирулентных штаммов Аегопюпаэ Ьуагорпна и '( штаммов исев-домонад дало отрицательный результат.

Определение естественных гетерогемагглютининов в лимФоидных органах и крови гибридов белого и пестрого толстолобиков (40 экз. ) показало более высокое абсолютное содержание АЭЧ в туловишной почке по сравнению с селезенкой, и равномерное распределение АЭК. Относительное содержание АЭК было наименьшим в сыворотке. В селезенка выявлено превышение АЭК над АЭЧ. а в сыворотке и туловишной почке наблюдали обратное соотношение Факторов. В головной почке уровни гемагглютининов совпадали. Корреляция уровня гемагглютининов в различных лимФоидных органах обнаружена только и отношении АЭЧ туловишной почки и селезенки.

I! тотлльныч экстрактах кожи со слизистым слоем у толстоло

«икон агглютинины к эритроцитам человека и кролика составили со-отиогствешю О, biO, и 3.'li_0. ь усл. ел. /нл. По сравнению с жабрами у толстолобиков в коже содержалось меньше ЛУЧ и больше АЭК (t - критерии - 3.53-5.14).

Оценка иммуноФизиологического статуса сеголетков веслоноса (40 экз. ) показала, что гемагглютинины наиболее часто и в большем количестве содержат жабры (О,7-6,О усл. ед. /мл) и сыворотка крови (0-2,41 усл. ед. /мл) по сравнению с почкой и селезенкой. Наибольшее количество лизоцима, составившее 20, в-26.8 усл.ед./мл. установлено в лимфоидных органах, менее активны были жабры и сыворотка крови.

Распределение гемагглютининов и лизоцима у карпа характеризовалось широким охватом органно-тканевык образований. включая лимФоидные органы, кровь, жабры и покровы, и различным содержанием Факторов в органах и их фракциях. Установлена высокая активность туловишной почки по абсолютным показателям, различие образований по соотношению инмуноФизиологических Факторов и отсутствие стабильных корреляций между содержанием Факторов в некоторых органах. Гибрид толстолобиков отличался от карпа более низким уровнем гемагглютининов и более равномерным их распределением в лимфоидных органах, а также преобладанием в сыворотке крови агглютининов к эритроцитам человека по сравнению с агглютининами к эритроцитам кролика. Низкая гемагглютинирукшая активность отнечена в лимфоидных органах и жабрах веслоноса, но содержание лизоцима было значительным, соответствуя высокому уровню Фактора у других представителей осетровых (Лукьянен-ко. 1989). Полученные результаты изучения сравнительной активности органов и крови у рыб - объектов рыбоводства позволяет отбирать материал с различный содержанием Факторов для изучения как депрессивных, так и стимулирующих воздействий. Применение количественного анализа для оценки активности органов и тканей позволило расширить число показателей и способствовало повышению точности и чувствительности исследований.

ГЛАВА 4. ИНМУНОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ОРГАНОВ И ТКАНЕЙ РЫБ

ИммуноФизиологическая активность органов и тканей позвоночных определяется как собственной продуцирующей способностью, так и гуморальными и клеточными Факторами, поступившими по системам циркуляции (Фонталин. 1967; Купер. 1980; Сиротинин. 1981; Петров, 1987). Показана ведущая роль лимФошшой и лимфатической систем эндотермных позвоночных в иммуногенезе и инактивации возбу-

дителей заболеваний и токсинов. линФоиднне и линФатические образования. покровы, а также кровь обладали барьерныни свойствами, способствуя очищению внутренней среды организма. Закономерности функционирования иммунофизиологических систем высших позвоночных создали предпосылки для изучения защитного реагирования рыб.

4.1. Экспериментальное изучение иннунофизиологических свойств покровных образования и туловишной почки карпа.

В слизистых покровах рыб найдены естественные и изобретенные антитела, неспецифические гуморальные и клеточные защитные факторы ( лукьяненко. 19Т1: Harrell et al.. 1976; Лебедева. 1978; Вихнан, 1978. 1979; ourth. 1980; Лебедева. Головкина, 1987). Мало изучены защитные свойства покровов в отношении токсических веществ. В наших исследованиях оценивали антитоксическую функцию кожи по способности ее тканевых элементов подавлять активность фосфорорганических соединений (ФОС). Поскольку экстрагируемые компоненты кожи оказывали стабилизирующее влияние на рн реакционной смеси и препятствовали выявлению активности ФОС. то экстракты разводили в 4-8 раз для достижения Д рН О, 13-0,37. При испытании влияния 11 экстрактов из кожи двухлетков чешуйчатого карпа на этиловый. паранитроФениловый эфир этилфосФоновой кислоты (ЭПЭК) установлен широкий диапазон способности экстрактов подавлять активность ЭПЭК (D = 4-85Z). Половина проб имела актив» 9

ность 50"/. и выше. Изменение тенпературы от 37 до 6 С не приводило к существенному изменению подавляющей способности экстрактов.

Защитные функции покровов связаны с комплексным действием иммнофизиологических Факторов. Одним из методов оценки обшей способности тканей взаимодействовать с ксенобиотиками является определение проницаемости покровов, в частности, изолированных препаратов кожи m vitro (Строганов,лашманова, 1966). При воздействии 2. 59-5,18 нг хлорофоса на кожу чешуйчатых двухлетков и трехлетков карпа за 6 часов экспозиции проходило лишь О.4-0,9Z вещества от воздействующей концентрации. Полученные данные представлены на рис. 4.А.

С уменьшением концентрации хлорофоса до 1.30-1.89 мг доля прошедшего через кожу вешества составила О. 1-0, 5"/.. а при концентрации О. 18 нг и ниже препарат в Фильтрате не обнаружили. Появление хлорофоса в Фильтрате наблюдали через 1 час экспозиции и. как правило, через 3 часа отмечали нарастание проницаемости. Механическая обработка кожи (удаление слоя слизи и чешуи) приводила при концентрации хлорофоса 1,8 мг к увеличению проницаемости в 2.9 раз. Снижение количества воздействующего вешества

еше Ьолее усиливало степень его проникнонения и превосходило контроль п 18.1)- 28. Ъ раз.

Установлена зависимость количества ФОС. прошедшего через кожу, от его воздействующей концентрации. При испытании различных концентраций ЭЮК появление вешества в Фильтрате наблюдали при нанесении на кожу 1,7 мкг. Это количество ЭПЕК было в 40 раз меньше пороговой концентрации хлорофоса. Относительное количество прошедшего через кожу ЭПЕК при максимальной концентрации 2.9 мкг составило 3.5'/ (Рис. 4. Б>. При увеличении количества воздействующих вешеств, которые были выше пороговых величин, наблюдали прямую зависимость проницаемости от концентрации <юс (Рис. 4).

Как любые модели in vitro, опыты с изолированной кожей в большей мере выявляют закономерности взаимодействия ФОС с собственными структурами покровов и дополняют сведения о роли вида, концентрации и времени воздействия токсических веществ.

В организме рыб ведущее значение в иммуноФизиологичском ответе имеют почки (Лукьяненко. 1971; Вихман. 1976; микряков. Балабанова, 1979). Получены данные о содержании в почках лизоцина. но не выявлены активные продуцирующие структуры ( murrey. Fletcher, 1976). Проведенные нами эксперименты с переживающей культурой свободных клеток туловищной почки карпа показали, что лизопин постепенно накапливается в культуральной жидкости как при сохранении числа живых клеток, так и при значительной гибели клеток. Эти результаты свидетельствуют о связи накопления Фактора с выделением лизоцина из жизнеспособных и разрушенных клеток.

4.2. Основные иммуноФизиологические свойства органов и тканей рыб.

Участие иимуноФизиологических систем в очищении внутренней среды связано у костистых рыб с барьерной Функцией лимФоидных органов и печени. Поступление из кровеносного русла чужеродных агентов сопровождается различными процессами, включающими распознавание чужеродности, трансформацию и депонирование агентов, а также продуцированием защитных Факторов и их выделением в системы циркуляции (J^rgensen. 1989; Пестова. Четвертных, 1990; Никряков. 1991). Показано участие в поддержании химического го-меостаза различных выделительных органов (Лукьяненко. 1971; на-точин. 1964, 1987; Никряков. 1991).

О барьерных свойствах кровеносных сосудов рыб сведения незначительны. Установлена фагоцитарная способность эндотелия стенок сосудов и проницаемость эндотелиального слоя при развитии

воспаления (Заварзин. 1937. 1945; ChllroonczYK. Honge. 1980).

Различная динамика содержания активных нолекул и клеток в крови и околососудистых тканях также свидетельствует об избирательной проницаемости сосудистых стенок.

иммунофизиологические свойства органов и тканей наиболее полно объяснимы закономерностями Функционирования биомембран, с деятельностью которых связаны клеточные механизмы иммунологической Функции позвоночных (Петров. Атауллаханов, 1991). Мембранную природу имнуноФизиологической активности органов и тканей рыб подтверждают следующие данные:

- лимфоидные органы, покровы и кровеносная система содержат различные морфологические и Функциональные элементы: клетки, участвующие во взаимодействии с поступающими агентами, вспомогательно-опорные образования и межклеточное вещество (Лукьяненко, 1971: Anderson, 1974; Вихман, 1976; натей. Мальгина. 1979; Уго-лев. Кузьмина. 1992);

- органы и ткани осуществляют рецепцию поступающих агентов, их транспорт и выделение в системы циркуляции или из организма (Строганов. 1962; лукьяненко. 1971; Antipa. Amend, 1977; Нато-чин, 1979; Никряков. 1991);

- проникшие в органы и ткани агента подвергаются воздействию комплекса Факторов, которые вызывают Фиксацию агентов, их трансформацию и выделение дериватов (Hiñes. Spira. 1974; Harrell et al., 1976; лукьяненко. 1989; Микряков, 1991);

- проницаемость слизистых, жабр и выводящих путей зависит от вида воздействующего агента, его концентрации и характера взаимодействия с гуморальными и клеточными иммунофизиодогически-ми Факторами (Строганов, Лашманова, 1968; Шеханова, 1983; Вихман. Анкудинова. 1986; Наточин. 1987; Kawahara. Kusuda, 1988);

- органы и ткани. продуцирующие иммунофизиологические Факторы. изменяют свойства поступающей по системам циркуляции внутренней среды и обогащают кровь и лимфу новыми Факторами ( Van HuiswinKel. 1978; Вихман. 1978, 1979; rgensen, 1989).

В отличие от клеточных мембран тканевые образования, участвующие в иммуноФизиологической реактивности, нами названы "мак ромембранами", учитывая их более сложную структуру и активные клеточные и внеклеточные процессы взаимодействие с патогенами и собственными элементами организма (рис. 5. )

В соответствии с различными морфологическими и функциональными свойствами тканей защитные макромембраны могут быть разделены на несколько типов в зависимости от характера взаимодоис твия с внешней и внутренней средами (Рис. ti).

Рис. 4 . Зависимость проникновения хлорофоса ( А ) и ЭПЭК ( Б ) через кожу карпа от Еоздейсг-нунцей концентрации.

по оси абсцисс - количество прошедшего через кожу вещестЕа, по оси ординат - величина концентрации ноздействукщего вещества

I тип

Внешняя среда

Секреты Экскреты

Макромембрана

Кровь и лимФа

П тип

Притекающая кровь

Макромембрана

Оттекающие кровь и лимфа

Внутренняя среда

Накронем-брана

|| Прилежащие | ткани

Рис. 5. Основные типы иммуноФизиологическик макромембран.

К первому типу макромембран относятся наружные покровы,жабры. слизистая пищеварительного тракта. мочевыводятие и желчевы-водяшие образования. Второй тип включает лимфоидные органы и печень, участвующие в очищении внутренней среды и продуцировании защитных Факторов. Макромембранами третьего типа являются стенки сосудов, служащие барьером между тканями и внутренней средой.

На уровне макромембран реализуется защитная способность ИММУНО^МЗЙОЛОГИЧеСКИХ гнгтрм. ИХ ПРПЛУЛИРУЮШаЯ способность и взаимодействие с патогенами. Поэтому определение иммуно Физиологической активности макромембран позволяет оценить основные защитные свойства органов и тканей. Количественный анализ активности органов и тканей и соответствующий комплекс показателей наиболее полно отражает реактивность отдельных групп рыб и позволяет выявить их различия (Рис.7).

Разработзнный количественный подход для оценки иммуноФизио логического статуса рыб и предложенный комплекс показателей дал возможность оценить на единой методической основе изменение им мунофизиологического статуса рыб в условиях промышленного вира шивания.

Абсолютное и относительное содержание I инмуноФизиологических Факторов в op I ганах и тканях исследуемых групп рыб !

Показатели, характеризующие исследуемую группу рыб

Сравнение содержания отдельных Факторов в различных органах и тканях

Корреляция

иммунофизи-

ологической

активности

с другими

признаками

Показатели, характеризующие различия между группами г-ыб

Сравнение содержания факторов в одних и тех же органах и тканях

Сравнение соотношения актив ности органов и тканей

Рис.7. Сравнительный инмуноФизиологический анализ органов и тканей исследуемых групп рыб.

ГЛАВА 5. ОПЕРАТИВНАЯ ОЦЕНКА ИНИУНОФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО СТАТУСА РЫБ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ ВЫРАЩИВАНИЯ

Исследование рыб непосредственно после воздействия Факторов, способных нарушить Физиологический статус, носит оперативный характер и направлено на выявление раннего реагирования рыб. Установлено изменение специфической и неспецифической реактивности рыб при воздействии возбудителей. токсикантов и стресс-Факторов (Лебедева. 1976; Ellsaeser, Clem. 198b; SiwicKi. BuczeK, 1987; Исаева, Козиненко, 1992).

В наших исследованиях оценивали статус карпа и веслоноса в прудовых хозяйствах при воздействии некоторых Факторов вырашива-ния. Выявляли характер изменения иннунного ответа и неспецифической реактивности по уровню естественных гуморальных Факторов. В связи с многообразием определяемых показателей и их взаимосвязей сравнивали различные методы статистического анализа результатов.

5. 1. Влияние химических факторов на уровень естественных гемагглютининов и лизопима Для опенки влияния лечебно-профилактической обработки хлорной известью рыбоводных водоемов у двухлетков карпа (по НО экз. на каждом сроке исследования) определяли содержание гемагглютининов и развитие стрессгреакдии. после хлорирования через 512 сут отмечали снижение гликогена в печени на 47 у. и уменьшение индексов селезенки и головной почки соответственно на 30 и 20>с. Статистический анализ иммуноФизиологических данных показал следующее :

- с поношью трехфакторного дисперсионного анализа установлено значимое влияние срока исследования и вида исследуемого органа, отсутствие влияния вида гемагглютшшна при определении их абсолютного содержания; отмечено изненение уровня реактивности на 5 сутки после начала хлорирования, которое сохранялось до 20 суток; наиболее выраженные изменения наблюдали в туловищной почке и сыворотке по сравнению с головной почкой и селезенкой;

при изучении реагирования рыб по комплексу показателей с поношью предложенного нами варианта многомерного анализа (Вихман, Боршев, 1989) выявлено изненение содержания Факторов в туловиш-ной и головной почках и сыворотке на 5-12 сут после хлорирования (рис. 8); в ходе ответа наблюдали различное соотношение активности селезенки и головной почки, селезенки и сыворотки: наиболее глубокие различия отмечали в контрольной группе между содержанием Факторов в почках и сыворотке; после хлорирования различие между туловишной и головной почками увеличилось, а между головной почкой и сывороткой уменьшилось;

- при анализе изменения активности с помощью г-критерия отметили снижение с 5 сут после хлорирования абсолютного и относительного содержания Факторов в туловишной и головной почках, уменьшение агглютининов к эритроцитам кролика в сыворотке и отсутствие значимых изменений в селезенке: на 12 сут повысились агглютинины к эритроцитам кролика в туловишной почке и агглютинины к эритроцитам человека в сыворотке, а на 20 сут увеличились агглютинины к эритроцитам человека в туловишной почке (рис. 9);

- статистические данные, полученные с помошью г-критерия совпадали в целом с результатами непараметрического анализа по критерию Манна-Уитии;

- изучение соотношения активности разных образований на каждом сроке исследования по методам одномерной статистики выявило существенное отличие активности в зависимости от вида Фактора; в начале опыта агглютинины к эритроцитам человека преобладали и

ту.п<ч>ш!ш<'и 1!<">чкг- ии' и у. ii. 1ии1ч1 ьшрм ГОД<ч>ж;шии л сыворотке кропи, н.1 1 г 1-утки оиита .истинность лимфоидних органов и сыворотки стала одинаково«; наивысшим относительный уровень агглютининов к эритроцитам кролика на всех сроках обнаружен в сыворотке, с Ь сут опыта отмечено преобладание активности туловишной почки но сравнению с головной.

а. Изменение активности лимфошшых органов и сыворотки крови туловишная Головная Селезенка Сыворотка

почка почка

Б. Соотношение активности на разных сроках исследования

О сут

5 сут

12-го сут

г—Лй^ ' II 1 —,

сел! !сыв

Рис. 8. Многомерный анализ изменения относительного количества гемагглютининов у карпа после хлорирования пруда.

О , 5 ... - даты исследования, сут; достоверность различия признаков: ииеетсяяшн, отсутствуетс=»; тп - туловишная почка, гп - головная почка, сыв -сыворотка крови, сел - селезенка.

хлорирование пруда оказывало выраженное инмунодепрессивное действие преимущественно на 5-12 сутки после первого внесения хлорной извести, в последующем наблюдали частичное восстановление реактивности.

Туловищная Селезенка Головная Сыворотка

я 364

| 30

1 и 24 и а

65 §18 о

» Ч

Н О -ГО

0 й«

а>

1 6 Й

почка

Г*!

гЬ

почка

гЪ

0 51220 0 Г220 0 1220 0 5 1220 СУТ

и о

Рн 14 со

рч

ь о а>

4г 36302418 12 6 "

г*

гЬ

!й.

Он

(93,6+20,4

<-39,0£1?,4

0 5 1220 01220 0 1220 0 5 1220

сут

Рис.

9. Относительное содержание агглютининов к эритроцитам человека ( А ) или кролика ( Б ) у карпа после хлорирования пруда 29

Ь. 2. Изменение роактишюсти ш>и воздействии облова и пересадки рыбы

Развитие стресс реакции происходило ш>и облове и выдерживании в бассейне двухлетков карпа, у которых установлено временное снижение гликогена в печени на 60и содержания гетерогемагглю-тининов по сравнению с исходным уровнем. На 9 сут повысились агглютинины к эритроцитам кролика. Воздействие на рыб нового стресс-Фактора вызывало повышение в крови уровня сахара и содержания агглютининов к эритроцитам человека. Заражение ихтиофтири-усами рыб с повторным стрессом приводило к повышению в 3 раза интенсивности инвазии ихтиофтириусами по сравнению с группой рыб с однократным стрессом.

Воздействие на сеголетков карпа облова и пересадки в бассейны вызывало снижение гликогена в печени и индексов лимфоидных органов, со^е^жанке гуморальных ^акт^^ов изменялось "о-тиштот.. но. Отмечено снижение лизоцима в сыворотке через 1-2 сут и увеличение уровня агглютининов к эритроцитам кролика в туловишной почке.

5. 3. Изменение естественных гуморальных Факторов при некоторых заболеваниях прудовых рыб

При острой Форме воспаления плавательного пузыря и жабр отмечали повышение реактивности: увеличивался уровень сывороточных агглютининов к эритроцитам человека и повышалось число особей с более высоким содержанием лизоцима. V карпов с признаками некротических изменений жабр в клетках крови снижалось количество агглютининов к эритроцитам кролика и изменялось соотношение активности органов.

Опенка влияния рыбоводных Факторов на веслоноса показало, что при пересадке двухлетков в другой пруд наблюдали снижение уровня сывороточного лизоцима и увеличение содержания гемагглю-тининов. Воздействие водной среды с рН 12, О приводило к стабилизации лизоцимной активности, а динамика уровня гемагглютининов не отличалась от контрольной группы.

Изученные воздействия вызывали различную ответную реакцию организма рыб. При первичном стрессе карпа и веслоноса и некрозе жабр у карпа отмечали снижение некоторых показателей реактивности, а при острой Форме воспаления плавательного пузыря карпа -повышение содержания Факторов. Вторичный стресс не сопровождался выраженными изменениями статуса, но вызывал снижение противопа-разитарной резистентности. Следует отметить различное реагирование на стресс сеголетков и двухлетков карпа, которое проявлялось

в более стабильном статусе младшей возрастной группы. Различная направленность изменения статуса связана, возможно, с преобладанием различных механизмов регуляции имнуноФизиологической реактивности. Ведущую роль при стрессе играют горнональные регуляторы. а при заболеваниях происходит более широкая перестройка деятельности разных систем при воздействии патогена и патологически измененных тканей. Многообразие изменений имнуноФизиологической реактивности требует применения конплекса показателей, отражающих деятельность различных инмуноФизиологических систем и разностороннего статистического анализа, для рыбоводной практики важное значение инеет обнаружение подавления имнуноФизиологической реактивности в течение 2-3 недель после хлорирования пруда. Снижение уровня лизодима после облова также указывает на изменение содержания Факторов резистентности. Выявленные признаки им-мунодепрессии требуют усиления наблюдения за клиническим состоянием рыбы и устранения неблагоприятных факторов вырашивания.

ГЛАВА 6. ПРИМЕНЕНИЕ ИНМУНОФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИИ для ОЦЕНКИ НОВЫХ КОРКОВЫХ СРЕДСТВ И ПРИ ПРОМЫШЛЕННОЙ СЕЛЕКЦИИ КАРПА

При использовании новых приемов и методов в рыбоводстве требуется оценка Физиологического состояния рыб, которая включает выявление уровня резистентности и обшей активности инмуноФизиологических систем. Большое значение в современной рыбоводстве имеют разработка новых кормовых средств и селекционная работа (Остроумова и др. , 1973; Минц, Христенко, 1980; Кирпичников, 1987). В наших исследованиях проведена оценка иммунофизиологи-ческого статуса кариа при испльзовании нетрадиционных корневых компонентов и селекции на повышение устойчивости к заболеваниям.

б. 1. Изменение имнуноФизиологической реактивности карпа при введении в корм новых компонентов

Состояние двухлетков было оценено при добавлении в корм 7 /. белково-витаминного концентрата (ВВК). Проведение двух серий опытов показало, что опытные и контрольные группы рыб (п=15 в каждой группе) не различались по уровню в сыворотке крови ге-магглютининов. лизоцима и белка (^критерий - 0,7-1,5).

Влияние на рыб кормового компонента, приготовленного из торфа (ТКК), оценивали в производственных условиях. Определяли уровень естественных гемагглютининов в сыворотке и клетках кро-

.51

Ш1. В первой серии опытов (n= SO и каждой группе) установлено, что у опытных рыб, получавших корм с добавлением 25у. и 50* ТКК. отмечали снижение уровня геиагглютининов как в сыворотке, так и в гемоцитах. Различие между опытными группами было несущественным. Во второй серии опытов при введении в корм 25/. ткк не отмечено отличие по уровню гуноральных Факторов опытной группы от контрольной. Отсутствие существенных изменений иммноФизиологи-ческого статуса и физиолого-биохимических показателей свидетельствовало о возможности применения в производстве изученных кормовых средств (Нинп, Христенко, 1981; Сивердев, Марченко, 1982).

6. 2. Изучение иммунного ответа карпа при селекции на устойчивость к инфекционным заболеваниям

Промышленная селекция рыб на повышение резистентности включает создание генетических групп, устойчивых к заболеваниям инфекционной природы. Среди них важное значение имеет группа заболеваний. объединенных клиническим синдромом "краснуха", которая состоит из аэромоноза. псевдононоза и весенней вирусной виремии.

Целью наших исследований явилась оценка иммунного ответа на различные антигены патогенных аэрононад у карпа, селекционированного на устойчивость к краснухе ( Кирпичников, 1986; Илясов. 1989). Сравнительное изучение специфичности эндотоксинов различных серологических групп аэрононад показало, что сыворотка к аэромонадам первого типа не реагирует в реакции непрямой генагглю-тинации (РИГА) с антигеном второго типа, а сыворотка второго типа содержит небольшое количество антител к антигену первого серологического типа. Максимально определяемая концентрация антигена в реакции торможения непряной гемагглютинашш составила для аэрононад первого типа 50 мкг/нл и для второго - 1 мкг/мл.

Получение растворимых антигенов позволило определить антитела в реакции диффузной преципитации в геле (РДШ. С ионошью РДП по О. Оухтерлони при взаинодействии неразведенной имнунсыво-ротки к аэромонадан первого типа и соответствующего антигена выявлена одна полоса преципитации. При взаимодействии антигенов аэрононад второго типа и соответствующих антител наблюдали образование четырех полос преципитации, перекрестный анализ первой и второй систем показал наличие в иннунсыворотке второго типа небольшого количества антител к антигену штамна первого типа и отсутствие реагирования сыворотки первого типа с антигеном штамма второго типа. При нежвидовон анализе a. sobria и a. salmonlclda установлено различие эндотоксических антигенов и возможность дифференцировки антигенов гипериммунными видовыми сыворотками.

Использование антигена эндотоксина аэромонад позволило расширить иммунологические исследования при селекции краснодарского краснухоустойчивого карпа. Объектом исследования явились отводки украинско-ропшинская (УР), ропшинская (Р) и местная (И). Исследование селекционированных рыб показало, что сыворотки трехлетков и четырехлетков всех отводок содержат антитела как к клеточному антигену (5,05-9.20 усл. ед./мл), так и к эндотоксину Aeroroonas sobria (0.28-8,80 усл. ед./мл), отмечено совпадение уровня антител у здоровых рыб и у особей с синптомами краснухи. Достоверное превышение уровня бактериоагглютининов выявлено у трехлетков отводки Р по сравнению с четырехлетками. У здоровых и больных четырехлетков отводки Н содержание бактериоагглютининов было выше, чем у соответствующих групп отводки Р.

У переболевших гибридов, полученных при скрещивании различных отводок, содержание антител к эндотоксину Aeroroonas sobria в сыворотках составило 5.4-43.2 усл. ед./нл. У рыб в первой зоне рыбоводства аналогичные антитела обнаружены в количестве 02,7 усл. ед. /мл. статистические расчеты подтвердили достоверность различия показателей между селекционированными и неселекционированными карпами. Отмечено несовпадение обнаружения антител при применении различных серологических реакций.

Опенка взаимосвязи уровня антител к различным антигенам аэромонад, клинического состояния рыб и их генетической принадлежности свидетельствовала о сложной ответной реакции селекционированных рыб, которая была связана, вероятно, как с уровнем резистентности рыб. так и с возрастными изменениями реактивности. Отсутствие корреляции между содержанием антител к различным антигенам патогенных аэромонад было подтверждено при исследовании карпа в тепловодном садковон хозяйстве, неблагополучном по аэро-монозу. иммружение отдельных особей с высоким уровнем антител может быть использовано для Формирования группы рыб с повышенной реактивностью в качестве селекционного материала.

Ь.3. Иммунофизиологическая активность различных генетических групп карпа Помимо ответа на антигены аэромонад, опенка иммунофизиологи-ческого статуса селекционируемых рыб может быть расширена за счет использования показателей обшей активности иммунной системы и состояния иеспедиФической инактивации патогенов. С этой целью проведено определение естественных гуморальных Факторов в сыворотке различных породных групп карпа.

Результата определения динамики гемагглютининов у отводок

краснодарского краснухоустойчивого карпа на Лнгелинском опытном участке в течение сезонов 1987-1989 гг. были следующими:

- по данным многофакторного дисперсионного анализа установлено значимое влияние срока исследования и вида определяемого гемагглютинина при меньшем влиянии вида отводки;

- многомерный анализ по предложенной нами методике (Вихман, Боршев. 1989) выявил отсутствие различия между отводками в осенний период у генераций 1986 г. и существенные отличия у генераций 1987 г. (рис. 10); установлено достоверное отдичие уровня Факторов при сопоставлении разных генераций отводок; наиболее глубокие различия отмечали при сравнении генераций отводок Р и М;

- изменение соотношения активности отводок оценивали также по средним величинам с помощью 1-критерия; по уровню агглютининов к эритроцитам кролика осенью 1988 г. наблюдали равную активность отводок ур или более высокое содержание Фактора у отводки Р; весной следующего года наибольший уровень гемагглютшшнов выявили у отводки УР. а в летний период - у отводок УР и М.

Совпадаемость результатов определения достоверности различия групп по г-критерию и непараметрическому критерию Манна-Уит-ни составила 73-83'/. при объеме выборок 29-39 особей.

Соотношение активности отводок в разные годы

Сопоставление активности отдельных отводок в разные годы

1987

1988

н ы—и

1987 19&В

0—0

Рис. ю. Многомерный анализ различия уровня гемагглютининов у двухлетков в осенний период 1987-1988 гг. (достоверность различия: имеется —в™ , отсутствует ■ о

На одном из сроков исследования определили уровень лизоцина в сыворотке крови, который оказался одинаковым у отводок УР и Н

ние иммунного ответа и естественные иммунные процессы показывают активность данной системы и косвенно свидетельствуют о состоянии других Физиологических систем организма.

Основные направления использования показателей неспецифической инактивации патогенов связаны с диагностикой обшего Физиологического состояния и уровня защитной способности организма, обусловленной участием неспепиФических механизмов.

Исследование защитных циркуляционных процессов включает оп- - -ределение имнуноФизиологических Факторов в крови и лимфе, а также свободных и связанных с компонентами тканей патогенов.

При оценке состояния рыб целесообразно определять комплекс гуморальных и клеточных факторов, относящихся к различным имму-нофизиологическим системам (Зимин. 1981; Вихман. 1987; Лукьянен-ко. 1989). Активность систем при воздействии стресс-Факторов и возбудителей заболеваний может быть оценена с поношью высоко информативного комплекса показателей, включающего естественные ге-терогемагглютининн и лизоцим (Вихман. 1979. 1983).

Общая оценка статуса включает определение проницаемости органов и тканей и очищение организма от патогенов. Проницаемость жабр In vivo оценивали путем сопоставления веществ в крови из приносящих и выводящих сосудов (Ogata, Hurai, 1988). Разработаны методы определения проницаемости покровов in vitro (Строганов, Лашманова, 1968; Вихман, Анкудинова, 1985,1986). Динамику очищения организма рыб от патогенов устанавливают путем экстрагирования агентов из тканей или непосредственный определением агентов изотопным методом (Яржомбек и др., 1986; Микряков. 1991).

Различное проявление активности систем в онтогенезе определяет качественный состав показателей и их уровень на каждой стадии развития, на эмбриональной стадии развития применяли определение сорбционной и проникающей способности красителей (Ахмедов, Каримов, 1986; Жукинский. 1986). В развивающейся икре можно обнаружить материнские антитела (Мог, Avtalion. 1988), антителопо-добные вещества типа лектинов (Балахнин, 1989). гемагглютинины и лизоцим (Вихман и др. , 1992). В оболочке оплодотворенных оонитов обнаружены вещества, обладающие бактерицидным действием в отношении Vibrio anguiliarum (Kudo, Inoue, 1989).

Системные показатели, которые могут быть использованы для определения реактивности рыб в производственных условиях приведены в табл. 5.

Таблица 5

Системные показатели для оценки инмуноФизиологического статуса рыб при промышленном вырашивании

Уровень Определяемые показатели Стадии развития

исследования

Иммунная систе- Антитела Ооииты и эмбрио-

ма ны на ранних ста-

диях развития

Естественные антитела Все возрасты

Приобретенные антитела Сеголетки и более

старшие Еозрасты

Т- и В-подобные клетки Гиперчувствительность замедленного типа

Система неспе пифической инактивации патогенов

Лектины

Гуморальные Факторы: лизо-цим, комплемент и др. Фагоцитоз (без специфического усиления)

Эмбрионы Все возрасты

Системы: иммунная и неспецифической инактивации патогенов

Фагоцитоз с участием спепи- Сеголетки и более Фических антител старшие возрасты

Лизис патогенов с участием -"-

антител и неспецифических Факторов

Комплекс имму-нофизиологичес-ких систем

Поступление, взаимодействие с тканями и выведение чуже-родых агентов антигенной и неантигенной природы Сорбшюнная способность и проницаемость оболочек яиц

Все возрасты

Эмбрионы

Многообразие систем и их элементов требуют применения при анализе результатов различных статистических методов, учитывающих многосторонние связи изучаемых признаков. Для анализа комплекса признаков иммуногенеза и Фагоцитоза у рыб применен дискретно-динамический метод (Никряков и др. , 1992). разработана

модификация многомерного метода для опенки статуса карпа по комплексу гуморальных Факторов (Вихнан, Боршев. 1990).

Таким образом, при выборе показателей, необходимо, исходя из задачи исследования, решить вопрос о выявлении состояния отдельных систем или их комплекса. При определении состояния систем следует учитывать различную значимость показателей, качественная и количественная характеристика Факторов, взаимодействующих с патогенами, в большей мере отражает уровень защитной способности в момент исследования. Показатели, связанные с характеристикой всех промежуточных этапов образованием защитных Факторов. позволяют судить об обшей функциональной активности соответствующей системы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ данных литературы и собственные исследования показали. что иимунофизиологическая реактивность рыб имеет два уровня системной организации. Первый уровень связан с отдельными компонентами реактивности, каждый из которых обладает собственной системной организацией: иммунный ответ, неспепиФическая инактивация патогенов и транспортные процессы. Второй уровень связан с системным функционированием всего комплекса, так как его компоненты отличаются морфологическими и Функциональными особенностями. Части иммуноФизиологического комплекса объединены функциональной направленностью на снижение действия патогенов, но различаются степенью участия при разных адаптационных процессах.

Оценка иммуноФизиологического статуса рыб в значительной нере связана с методическим уровнем исследования. Предложенный способ количественного определения гуморальных Факторов в органах и тканях рыб позволил повысить точность и объективность исследования, расширил его возможности за счет новых показателей и более полного статистического анализа результатов.

Наряду с показателями, характеризующими отдельные Факторы систен, необходимо использовать методы оценки обшей активности органов и покровов. Совокупность всех иммуноФизиологических процессов, включая распознавание воздействующих агентов, их инактивацию и депонирование, а также транспорт в другие образования аналогична защитным свойствам клеточных нембран. В отличие от клеток иммуноФизиологически активные органы и ткани названы макромембранами (Вихман. 1989). Общую активность макромембран устанавливают по их проницаемости m vivo и m vitro.

Экспериментальные исследования выявили важные в практическом отношении результаты. Установлены неравномерность распреде-

'И

леиия и различное соотношение имнуноФипиологических факторов н органах и тканях карпа, веслоноса и толстолобиков. У всех исследованных видов, как правило, отсутствовала корреляция между активностью различных органов и тканей, а также между уровняни иммуноФизиологических. Факторов в одном и том же органе. Поэтому необходимо проведение достаточно широкого исследования с использованием комплекса показателей, отражающих различные свойства органов и тканей.

Изучение реагирования культивируемых рыб на различные Факторы варашивания показало зависимость изменения иммуноФизиологи-ческого статуса от вида воздействующего агента. Отмечены как одинаковые, так и отличавшиеся изменения статуса на различных уровнях системной организации иммунофизиологической реактивности. Выраженную иммунодепрессию с последующим частичным восстановлением реактивности вызвало воздействие на карпа технологических стресс-факторов. Стабильный статус отмечен при воздействии новых кормовых компонентов и некоторых патологических процессах.

значение результатов исследований для оптимизации вырашива-ния рыб связано с возможностью определения защитных Факторов и обшей адаптационной способности рыб. Уровень резистентности может быть установлен с помощью показателей, которые отражают защитную Функцию в отношении конкретного воздействия. Наиболее полно доказано участие в резистентности рыб Факторов, вызывающих прямую инактивацию патогенов: противотоксических и вируснейтра-лизуюпшх антител, антибактериальной активности гуморальных Факторов, Фагоцитоза. Для оценки резистентности могут быть использованы также показатели, характеризующие промежуточные этапы образования Факторов, реагирующих с патогенами. Значительно более широкий круг иммуноФизиологических признаков, включая все системы и их элементы, может быть использован для физиологической оценки технологических воздействий и их способности нарушать гомеостаз.

Системные представления при оценке инмуноФизиологического статуса рыб и использование количественного анализа признаков является существенным прогрессом в методологии исследования рыб. Они позволяют значительно расширить число применяемых методов, более полно и целеноправленно характеризовать изменение реактивности при воздействии технологических Факторов.

Принципы системного анализа иммунофизиологической реактивности рыб - представителей низших позвоночных соответствуют современной концепции иммуноФизиологических исследований, применяемых для управления промышленным разведением эндотермных животных.

чг

Поэтому системные иммуноФизиологические исследования являются обшей методологией оптимизации технологии разведения высших и низших позвоночных.

ВЫВОДЫ

1. Иннунофизиологический статус рыб обусловлен деятельностью комплекса Физиологических систем, включая имнунный ответ, неспецифическу» инактивацию патогенов и защитные транспортные процессы, они объединены обшей Функциональной направленностью, связанной с непосредственным воздействием на патогенные агенты, но отличаются механизмами зашиты и регуляции.

2. Оценка иинунофизиологического статуса проводится с помощью комплекса показателей, отражающих различные уровни организации иммунофизиологических систем и этапы образования Факторов резистентности. Комплекс используемых показателей включает одно-системные. двухсистенные и обшие тесты определения состояния ин-мунофизиологической реактивности. Интегральную оценку иммуноФи-зиологической активности органов и тканей определяют по их проницаемости в отношении ксенобиотиков и по очишению организма от чужеродных агентов.

3. Основными методологическими принципами проведения имму-нофизиологического анализа влияния технологических Факторов на объекты рыбоводства являются зависимость реагирования от вида воздействующего фактора, необходимость определения активности разных систем и показателей, характеризующих этапы их функционирования. установление активности различных органов и тканей, включая паренхиматозные органы, жабры, кровь и покровы.

1. Органы и ткани рыб. проявляющие иммунофизиологическую активность. Функционируют как биомембраны и обладают барьерной и продуцирующей способностью. Барьерная функция кожи карпа в отношении ФосФорорганических соединений по данным опытов m vitro зависела от вида вещества, его концентрации, времени воздействия и состояния кожного покрова. Одним из Факторов, регулирующих проницаемость, является растворимый компонент кожи карпа, подавляющий активность токсических ФосФорорганических соединений.

5. Применение количественного метода оценки гуморальной активности органов и тканей позволило определить абсолютное и относительное количество иммунофизиологических Факторов, выявить их распределение в организме рыб и взаимосвязь активности различных образований. Более высокие уровни гетерогемагглютининов найдены во внутренних органах, покровах и крови у карпа по срав-

'13

нению с гибридон белого и пестрого толстолобиков и веслоносом. Содержание лизоцина в органах и тканях веслоноса превышало уровень Фермента у карпа и толстолобика. Корреляция между различными видани генагглютининов и лизоцина в отдельных органах и между органами оказалась незначительной.

6. При оценке влияния на иммунофизиологический статус карпа стресс- агентов, заболеваний и кормовых компонентов установлена высокая изменчивость реагирования, которая проявлялась в неоднозначном отклонении значения показателей и различной их направленности. Развитие первичного стресса у карпа вызывало снижение уровня естественных антител с последующим их увеличением. При повторном стрессе уровень гетерогенагглютининов не изменялся, но отмечали увеличение инвазированности рыб паразитами. Развитие иммунодепрессии в течение двух-трех недель после первичного воздействия стресс-агентов сопровождалось снижением противопарази-тарной устойчивости.

7. При введении в традиционные корма для карпа новых компонентов - белково-витаминного концентрата и торфяной корновой добавки отмечена стабильность иммунофизиологического статуса. Отсутствие изменения уровня естественных антител и лизоцина, а также биохимических и рыбоводных показателей свидетельствовали о Физиологической безопасности этих компонентов.

8. У карпа в хозяйствах различных зон рыбоводства выявлены антитела к антигенной Фракции эндотоксина и к поверхностному антигену Aeromonas sobria. Уровень антител к клеточному бактериальному антигену был значительно выше, чем к эндотоксину, а корреляция между содержанием антител к разным антигенам отсутствовала. Определение антител к различным антигенам аэромонад увеличило возможности иммунологического исследования при опенке эпизоотической ситуации, позволило более полно характеризовать реагирование рыб на аэромонады и может быть применено для опенки обшей адаптационной способности организна,

9. Анализ динамики активности генетических групп карпа выявил различные уровни изменчивости инмунофизиологического статуса. Изменения реактивности после воздействия технологических Факторов (1-ый уровень) развивались на определенном Фоне активности иммунофизиологических систием, обусловленном сезонон (Н-ой уровень) и годом (3-ий уровень) исследований. Показана более высокая зависимость изменения статуса от сезона и года исследования по сравнению с генетической характеристикой группы,

10. Разработанная модификация многомерного статистического нетода позволила определить изменение инмунофизиологического

статуса по комплексу гуморальных показателей, расширила возможности статистического анализа результатов для выявления интегральной изменчивости признаков. Разработаны математические критерии разделения особей на классы активности, принципы анализа изменчивости признаков и сравнительной оценки различных групп рыб.

11. применение системного анализа для оценки иммуноФизиоло-гического статуса рыб - объектов аквакультуры позволяет более, эффективно использовать имнунофизиологические исследования для оптимизации вырашивания рыб и свидетельствует о единых методологических принципах оценки имнунофизиологического статуса культивируемых видов как эктотермных. так и эндотермных позвоночных.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Использование системного анализа для оценки имнунофизиологического статуса культивируемых рыб позволяет наиболее полно выявить у них признаки резистентности и обшей адаптационной способности в условиях производственного вырашивания. С помошью од-носистемных иммунологических показателей осуществляется этиологическая диагностика при воздействии агентов, обладающих антигенной способностью, контроль иммуномодуляшш и выявление специфической резистентности. Обшая оценка адаптации к новым факторам вырашивания проводится с помошию показателей активности систем специфической и неспецифической инактивации патогенов.

2. Количественный метод определения гуморальных иммунофизи-ологических Факторов в органах и тканях рыб позволяет повысить объективность исследований и эффективность их использования для оптимизации вырашивания рыб.

3. Для выявления изменений активности иммунофизиологических систем в условиях воздействия стресс - Факторов и при развитии заболеваний может быть применен комплекс показателей, включающий естественные гетерогемагглютинины и лизоцим.

4. При появлении признаков иммунодепрессии после стрессового воздействия необходимо в течение 2-3 недель проводить парази-тологический контроль рыб и их профилактическую обработку.

5. Использование в качестве кормовых добавок 7'/. белково-ви-таминного концентрата и 25-50'/- торфяного компонента является по данным иммунофизиологических исследований Физиологически безопасным.

6. Для выявления у рыб антител к эндотоксину аэромонад применимы реакции непрямой гемагглютинации и диффузной препипита-

'15

ции, в которых используют термостабильную антигенную Фракцию эндотоксина.

7. Определение в тканевых экстрактах вешеств. подавляющих активность токсических фосфорорганических соединений, проводят по изменению уровня антихолинэстеразаой активности ФосФороргани-ческих соединений в присутствии экстракта.

8. Для сравнительной оценки биологической активности Фос-Форорганических соединений может быть использован метод определения проницаемости кожи рыб in vitro. Нинимальная концентрация

хлорофоса, при которой он проникал через кожу, составила О,4-2.

-О, 6 мг на 1 см поверхности кожи, а этилового, паранитрофенило-вого эФира этилфосфоновой кислоты - в 40 раз ниже.

9. Статистическая обработка результатов иммуноФизиологичес-кого исследования рыб должна быть дополнена многомерным анализом. Применительно к оценке иммунофизиологического статуса карпа по уровню гетерогемагглютининов разработана методика выявления различия групп рыб с помощью компьютерной программы.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАВОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Вихман A.A. Система иммунитета рыб и ее противоинфекци-онная и противопаразитарная функции // Известия ГосНИОРХ/ Проблемы изучения паразитов и болезней рыб. -Л. : ГосНИОРХ, 1976, -т. 105, -с. 84-91.

2. Вихман А.А. О количественном определении лизоцима в слизи кожных покровов рыб с помошью турбидиметрического метода // Сб. научн. трудов ВНИИПРХ / Интенсификация прудового рыбоводства. -И. -1974, -вып. 11. -с. 306-313.

3. Вихман A.A. Изучение лизоцима наружных покровов рыб // Сб. научн. трудов ВНИИПРХ / Физиология прудовых рыб. -М. -1975,-вып. 12, -С. 97-104.

4. Вихман А. А. к изучению лизоцина карпа cyprinus carpió L. // Сб. трудов ВНИИПРХ / Паразита, болезни рыб и их профилактика. -1978. -Т. 27, -С. 48-58.

5. Вихман А. А. Иммунологические исследования в диагностике болезней рыб // тез. семинара "О новых и передовых методах борьбы с болезнями рыб", -и. -1977. -с. 24-28.

6. Вихман А. А. О количественной определении нормальных гем-агглютининов в органах и тканях карпа // Сб. научн. трудов ВНИИПРХ / Болезни рыб и борьба с ними.-и.-1979.-вып. 23,-с. 69-82.

7. Вихман А. А.. Поддубная А. В. . Авдеева Е. В. Об изменении гуморальных Факторов естественного иммунитета у карпа под влия-

нием некоторых заболеваний и условий выращивания // Тез. докл. VII Всесоюзн. совет, по болезням рыб. -Л. -1979, -с. 18-20.

8. вихман А.А., Поддубная А. В. О влиянии стресса на иммунологическую реактивность карпа. // Сб. научн.трудов / Вопросы интенсификации прудового рыбоводства. -И. -1981, -вып. 31. -с. 233-248.

9. Вихнан А. А. Экологическая иммунология рыб на современном этапе // Успехи совр. биологии. -1983. -вып. 1. -с. 130-137.

10. "Vichman A. A. Quantitative détermination of some humoral factors of lnHDunity in organs and tissues of carp // Fish, diseases and environment in european ачнасиИиге. - S2arvas. Hungary. -1981. -P. -425-438.

11. Нусселиус В. a., Ванятинский в. ф. . Вихнан а. а. и др. Лабораторный практикум по болезнян рыб. -М. -Легкая и пишевая промышленность, -1983, -295 с.

12. Вихнан А. А. Иммунопрофилактика болезней рыб // Биолог, ресурсы гидросферы и их использование. Биолог, основы рыбоводства: паразиты и болезни рыб. -Н. -1984, -с. 125-134.

13. Вихнан А. А., Анкудинова В. А. О барьерных свойствах кожи рыб // Тез. докл. Всесоюзн. совеш. "Профилактика, лечение и диагностика инфекционных болезней рыб". -М. -1986.-с.16-18.

14. Вихнан А. А. Иммунологический контроль состояния рыб // Рыбоводство. -1987, -Н 5, -с. 26-28.

15. Вихнан А.А. , Анкудинова В. А. Нетод определения в тканях рыб вешеств, воздействующих на ФосФорорганические соединения // Методы ихтиотоксикологических исследований.-Л. -1987.-с. 19-21.

16. Вихман А. А. . Лобунпов К. А. Методы иммунологического изучения рыб // Госагропром СССР, ВДНХ СССР. -Н.-1987.-7 с.

17. вихман А.А., Анкудинова в.А. Разработка модификации хо-линэстеразного метода для определения ФОС в тканях рыб // Сб. научн. трудов ВНИИПРХ / Болезни рыб и водная токсикология. -М. -1988, -вып. 50. -с. 160-166.

18. Вихман А. А. Макромембранная гипотеза происхождения и эволюции иммунной системы низших позвоночных // Тез.докл. 1 Всесоюзн. иммунологического съезда. -Н. -1989. -с. 26.

19. Вихман А. А. , Боршев В. Н. Новый метод оценки иммунобиологического статуса рыб (ноу-хау, лицензия N 1368 от 25 июня 1989 г. ) // Вестник с. -х. науки, -1990, -Н 2, -с. 159.

20. Вихман А. А. , шарт л. А.. Генералова л. п. о количественном анализе иммунологической реактивности отводок краснухоустой-чивого карпа П Сб. научн. трудов ВНИИПРХ / Вопросы селекции, генетики и плененного дела в рыбоводстве. -И. -1989, -вып. 58. -с. 98104.

¿1. Вихман Л. л. Макромембраиная концепция иммунобиологического контроля состояния рыб // Тез. докл. VII Всесоюзн. конФ. "Экологическая Физиология и биохимия рыб. -Ярославль. -1989. -т. 1. - с. Ti -75.

22. Вихман Л. А. . Генералова Л. 11. Методические указания по количественному анализу гуморальных Факторов резистентности в органах и тканях рыб. -М. :ВНИИПРХ, -1991. -20 с.

23. Вихман A.A.. Ситнова О. В. . Генералова Л. П. Изменение иммунологических показателей у веслоноса Polyodon spathula при некоторых химических воздействиях // Тез. докл. 2 всесоюзн. конФ. по рыбохозяйственной токсикологии. посвяшенной 100-летию проблемы качества воды в России (Санкт-Петербург, ноябрь 1991).-С.-Петербург. -1991. -т. 1. -с. 93-94.

24. Вихман A.A. Об основных направлениях развития иммунологического исследования рыб // Сб. научн. трудов ВНИИПРХ / Болезни рыб. -И. -1991, -вып. 63. -с. 16-22.

25. Вихман А. А. О системной природе иммунофизиологической реактивности рыб // Vffl научная конФ. по эколог. Физиологии и биохимии рыб. / Тез. докл. , Петрозаводск, -1992. -т. 1. -с. 55-56.

26. Вихман A.A. Температурная регуляция иммуно-физиологи-ческои реактивности рыб // Сб. докл. совещания "Экологические аспекты и природоохранные мероприятия при использовании теплых вод энергетических обьектов". - tí. - 1992. - с. 17-33.

27. KirpichniKov V. S. . Ilyasov You. I. . Shart L. A. . VicKman A.A. et al. Selection of Krasnodar common carp (Cypnnus carpic L) for resistance to dropsy:principal results and prospects // Aquaculture. -1993, -vol. ill. -p. 7-20.

28. вихман A. A. . Таразевич E. В. . Генералова /1. II. . Шарт Л. A. О сравнительной иммунофизиологической характеристике лахвинскогс и тремлянского карпов // Сб. научн. трудов ВНИИПРХ / Вопросы генетического и экологического мониторинга обьектов рыбоводства.-И. -1992. -вып. 68, -с. 39-48.

29. Вихман А. А.. Лобунцов К. А. . Генералова Л. П. Изучение антигенной Фракции эндотоксина аэромонад, выделенных от карпа * лососевых рыб // Сб. научн. трудов ВНИИПРХ / Вопросы генетического и экологического мониторинга обьектов рыбоводства. -М. -1993, -вып. 69. -с. 63-69.

Формат 60x90/8 Подписано к печати II.10.94г.

Тираж 100 экз. Объем 2,3 п.л., заказ № 50

Информация о работе

Вихман, Арнольд Анатольевич
доктора биологич. наук
Москва, 1994
ВАК 03.00.10

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Иммунофизиологический статус рыб - объектов аквакультуры ВАК РФ 03.00.10, Ихтиология

Автореферат диссертации по теме "Иммунофизиологический статус рыб - объектов аквакультуры"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Иммунофизиологический статус рыб - объектов аквакультуры
ВАК РФ 03.00.10, Ихтиология