Иммунобарназные конъюгаты для диагностики и терапии рака

Эдельвейс, Эвелина Федоровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Иммунобарназные конъюгаты для диагностики и терапии рака
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Иммунобарназные конъюгаты для диагностики и терапии рака"

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. АКАДЕМИКОВ М. М. ШЕМЯКИНА И Ю. А. ОВЧИННИКОВА РАН

На правах рукописи

Эдельвейс Эвелина Федоровна

ИММУНОБАРНАЗНЫЕ КОНЪЮГАТЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И ТЕРАПИИ РАКА

Специальность 03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2010

004605049

Работа выполнена в лаборатории молекулярной иммунологии

Института биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А.

Овчинникова РАН.

Научный руководитель: член-корреспондент РАН, профессор,

доктор биологических наук Деев Сергей Михайлович

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАН, профессор,

доктор химических наук Габибов Александр Габибович кандидат биологических наук Велибеков Рамис Махачевич

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии

им. В. А. Энгельгардта

Защита состоится « 9 » июня 2010 года в 10 часов на заседании Диссертационного совета Д.002.019.01 при Институте биооргаиической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, ГСП-7, Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, Москва. Автореферат разослан « '/ у> 2010 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор физико-математических

наук

В. А. Олейников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ежегодно в мире выявляется 10 млн. новых случаев онкологических заболеваний, являющихся причиной смерти 250 из 100000 человек. Это указывает на необходимость разработки новых и совершенствование существующих методов диагностики и лечения рака.

Метаболические пути опухолевых и нормальных клеток во многом совпадают, имея больше сходств, чем различий. Поэтому разработка средств, специфически удаляющих опухолевые клетки и не повреждающих нормальные клетки, является актуальной проблемой современной медицины. Реализация идеи направленной доставки лекарств к опухолям стала возможной благодаря идентификации опухолеассоциированных маркеров - антигенов, количество которых значительно больше в клетках опухоли по сравнению с клетками нормальных тканей, и развитию средств для избирательной доставки к ним цитотоксических агентов. Использование антител, специфически связывающихся с опухолевыми маркерами, и токсинов позволяет создавать иммуноконъюгаты, селективно убивающие опухолевые клетки. Однако сильные бактериальные и растительные токсины обладают гепатотоксичностью, а также вызывают у пациентов синдром повышенной проницаемости капилляров. Одним из возможных решений проблемы системной токсичности является использование в качестве токсина рибонуклеазы, которая не является мутагенной, не вызывает сильного побочного токсического действия и, проникнув в клетку, расщепляет РНК, приводя к гибели клетки. Было показано, что некоторые положительно заряженные РНКазы избирательно токсичны для опухолевых клеток. Иммуноконъюгат, сконструированный на основе антитела и рибонуклеазы, получил название иммуноРНКаза. Данная работа посвящена разработке и исследованию иммунобарназных конъюгатов - иммуноРНКаз, состоящих из мини-антител (антиген-связывающих одноцепочечных вариабельных фрагментов антител, scFv) и рибонуклеазы Bacillus amyloliquefaciens - барназы. В работе использованы мини-антитела к тирозинкиназному рецептору эпидермального фактора роста EGFR и его гомологу ERBB2, гиперэкспрессия которых наблюдается в клетках многих злокачественных опухолей эпителиального происхождения и является прогностическим фактором высокой степени рецидивов и низкой выживаемости пациентов с такими опухолями.

ИммуноРНКазы, направленные к опухолевым маркерам, представляют собой новое поколение противоопухолевых препаратов. Их разработка и использование, возможно, позволят преодолеть развитие вторичной устойчивости опухолей к антителам, обладающим цитостатическим действием, и решить проблемы острой системной токсичности препаратов.

Цели и задачи работы. Цель настоящей работы состояла в изучении действия рибонуклеазы барназы и иммунобарназных конъюгатов - слитых белков, состоящих из барназы и мини-антител к рецепторам EGFR и ERBB2, - на человеческие опухолевые клетки in vitro и in vivo, а также разработке подхода для детекции опухолевых клеток, основанного на взаимодействии барназы с ее природным ингибитором - барстаром.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

1. Оценить токсическое действие барназы и созданных на ее основе иммунобарназных конъюгатов (scFv 425-барназа и scFv 405-дибарназа) на мононуклеарные клетки периферической крови здоровых доноров и линии опухолевых клеток человека.

2. Определить механизмы цитотоксического действия барназы и иммунобарназного конъюгата scFv 405-дибарназа на человеческие опухолевые клетки.

3. Разработать подход для флуоресцентной детекции опухолевых клеток, гиперэкспрессирующих EGFR и ERBB2, с использованием иммунобарназных конъюгатов, содержащих мини-антитела scFv 425 и scFv 4D5, и барстара, слитого с зеленым флуоресцентным белком EGFP.

4. Создать генетическую конструкцию для эукариотической тетрациклин-контролируемой экспрессии иммунобарназного конъюгата scFv 4Б5-барназа.

5. Исследовать противоопухолевую активность и системную токсичность иммунобарназного конъюгата scFv 405-дибарназа в мышах.

Научная новизна полученных результатов. В настоящей работе впервые показано, что рибонуклеазная активность барназы не подавляется человеческим ингибитором рибонуклеаз, и барназа оказывает токсическое действие на человеческие опухолевые клетки, расщепляя клеточную РНК и индуцируя апоптоз. На основе барназы и мини-антител к опухолевым маркерам EGFR и ERBB2 были созданы иммуноРНКазы, которым мы дали название иммунобарназные конъюгаты. Иммунобарназные конъюгаты scFv 425-барназа и scFv 405-дибарназа специфически связывались, соответственно, с рецепторами EGFR или ERBB2 на поверхности опухолевых клеток, интернализовались рецептор-опосредованным эндоцитозом и убивали клетки, вызывая в них апоптоз, при концентрациях на три порядка меньших, чем барназа. Показано также, что scFv 405-дибарназа ингибировала в мышах BALB/c nude рост привитых человеческих опухолей молочной железы, гиперэкспрессирующих ERBB2, и не оказывала серьезных побочных токсических эффектов на мышей BDF1 и BALB/c nude.

Теоретическое и практическое значение работы. Оценено токсическое действие барназы на восемь линий опухолевых клеток человека разного тканевого происхождения и среди них выявлены две линии, обладающие высокой

чувствительностью к этой РНКазе. Показано, что барназа малотоксична для нормальных мононуклеаров периферической крови человека. Исследованы два иммунобарназных конъюгата, специфически связывающихся с рецепторами EGFR или ERBB2 - опухолеассоциированными антигенами человеческих карцином. Высокая эффективность рецептор-опосредованного действия на клетки человеческих карцином молочной железы, яичника, эпидермоидной карциномы in vitro и in vivo и отсутствие побочного токсического действия на мышей позволяет рассматривать эти иммунобарназные конъюгаты, в частности, scFv 405-дибарназу, как перспективные противоопухолевые средства для дальнейших доклинических исследований. Создана конструкция для тетрациклин-контролируемой экспрессии в клетках млекопитающих гена, кодирующего слитый белок scFv 4В5-барназа, состоящий из лидерного пептида, анти-ЕЯВВ2 мини-антитела и барназы. Трансфицированные этой конструкцией человеческие клетки эмбрионального почечного эпителия НЕК293 продуцировали белок scFv 405-барназа и секретировали его в культуральную среду. Показана возможность детекции in vitro опухолевых клеток, гиперэкспрессирующих рецепторы EGFR и ERBB2, на основе взаимодействия барназы с ее природным ингибитором барстаром. Публикации. По теме диссертации опубликована 21 печатная работа, из них 6 статей в журналах, рекомендованных ВАК, получено 2 патента РФ на изобретения. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Российских конференциях: Дни иммунологии в Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, 2001, 2004, 2005, 2006), XXI Российской конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, 2006), Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2005), VIII чтении, посвященном памяти академика Ю. А. Овчинникова (Москва, 2003), Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, 2007), зимних молодежных школах «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2007, 2008); на Международных конференциях: Familial Cancer Conference (Мадрид, 2006), 18-й и 19-й конференциях Европейской Ассоциации Исследований рака (Инсбрук, 2004; Будапешт, 2006).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на страницах

машинописного текста, иллюстративный материал содержит 61 рисунок и 6 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Анализ in vitro функциональной активности полученных в Е. coli барназы и

иммунобарназных конъюгатов 1.1. Рибонуклеазная активность барназы и scFv 405-дибарназы

Рибонуклеазную активность барназы и scFv 405-дибарназы определяли методом кислото-растворимого остатка: к раствору дрожжевой РНК добавляли барназу или scFv 405-дибарназу и инкубировали 15 мин при 37°С. Реакцию останавливали добавлением хлорной кислоты и реакционную смесь центрифугировали 10 мин при 16000xg. Количество гидролизованной РНК определяли, измеряя оптическое поглощение супернатанта при 260 нм. Полученные таким образом значения оптического поглощения характеризовали рибонуклеазную активность полученных препаратов рекомбинантной барназы и scFv 405-дибарназы.

Барназа в составе иммуноконъюгата scFv 405-дибарназа была способна эффективно расщеплять РНК (Рис. 1.1. а), и ее активность составляла 88% от нативной барназы.

РНКаза, проникнув в цитоплазму клетки, может не проявить своей рибонуклеазной активности, если она чувствительна к ингибитору рибонуклеаз, присутствующему в цитоплазме клеток млекопитающих. Поэтому, прежде чем тестировать токсический эффект барназы и иммунобарназных конъюгатов на клетках, мы оценили чувствительность барназы к человеческому ингибитору рибонуклеаз (hRI). Было установлено, что hRI в концентрации в 4 раза больше той, при которой он подавляет активность РНКазы А на 50%, не ингибирует барназу: 266 ед/мл hRI не подавляли активность 25 нМ барназы, в то время как 100 ед/мл hRI снижали активность 37 нМ (500 нг/мл) РНКазы А в 2 раза (Рис.1.1. б).

0.75

О 0.50

<N0.25 "ч:

0.00

Ж 5Г

гюо

Я.

о' л

S...Ü

/А

О барназа

о scFv 405-дибарназа

й J 75

о н е Ъ 2 2 50

я 3

О s ОС

vo н

сЗ

©ё—й—

□ барназа, 25 нМ © РНКаза А. 37 нМ

ж в х

8 л 75

0 н

1 о 50

X =0

•Л ■Л

V барназа, 25 нМ ^

й scFv 4Р5-дибарнаэа,12 5 иМ-^^й^

0.1 1 10 Концентрация барназы (нМ)

10 100 1 10 100 Концентрация hRI (ед/мл) Концентрация барстара (нМ)

Рисунок 1.1. Характеристика барназы и иммунобарназного конъюгата scFv 4Г)5-дибарна1а in vitro, (а) РНКазная активность барназы и scFv 405-дибарназы. Оптическое поглощение, соответствующее активности барназы (по данным Хартли, 1972), обозначено черным квадратом, (б) Влияние человеческого ингибитора рибонуклеаз на РНКазную активность барназы. (в) Рибонуклеазная активность барназы и scFv 405-дибарназы в эквивалентных концентрациях в присутствии барстара.

Для анализа способности барстара связываться с барназой в составе иммуноконьюгата scFv 405-дибарназы рибонуклеазную активность барназы и scFv

405-дибарназы определяли в его присутствии. Барназа и scFv 405-дибарназа демонстрировали сходную чувствительность к ингибированию барстаром (Рис. 1.1. в), то есть барназа в составе scFv 405-дибарназы сохранила способность связываться с барстаром.

1.2. Действие барназы на человеческие опухолевые и нормальные клетки

Чтобы определить токсическое действие рекомбинантной барназы на клетки, мы использовали человеческие мононуклеары периферической крови (hPBMCs) здоровых доноров и линии клеток человека разного тканевого происхождения: карцином молочной железы ВТ-474, MCF-7, яичника SKOV-3, эпидермоидной карциномы А-431, острой миелоидной лейкемии U-937, эритролейкоза К-562, промиелобластного лейкоза HL-60, эмбрионального почечного эпителия НЕК293. Клетки инкубировали с барназой (диапазон концентраций от 0,1 нМ до 113 мкМ) в течение 72 ч. Жизнеспособность клеток определяли с помощью МТТ-теста. (Рис. 1.2.).

Рисунок 1.2. Цитотоксическое действие барназы на человеческие опухолевые клетки и нормальные мононуклеары периферической крови. Барназу в различных концентрациях добавляли к клеткам, инкубировали 72 ч и определяли ее токсический эффект с помощью МТТ-теста. Жизнеспособность клеток выражена как доля метаболической активности клеток, обработанных барназой, от активности необработанных клеток, показанной перекрестьем на оси. Каждая кривая представляет минимум 3 независимых эксперимента. Величина стандартных ошибок определения жизнеспособности не превышала 10%.

10-2 10-' 10° 10' 102 Концентрация барназы (мкМ)

Было показано, что барназа высокотоксична для клеток ВТ-474 (1С5о = 0,21 мкМ) и и-937 (1С50 = 2,4 мкМ). Для клеток БКОУ-З, А-431, НЕК293, К-562 и МСР-7 барназа была среднетоксичной с ¡Сзо от 5 до 13 мкМ. Клетки НЬ-60 были наиболее устойчивыми к барназе (1С50 = 82 мкМ). Для нормальных человеческих ЬРВМСэ максимальный цитотоксический эффект (27%) был достигнут при концентрации барназы 110 мкМ, в то время как на клетки ВТ-474 барназа оказывала такой же эффект в концентрации 0,01 мкМ. Таким образом, для клеток карциномы молочной железы ВТ-474 барназа в 10000 раз токсичнее, чем для нормальных мононуклеарных клеток периферической крови человека. Высокая эффективность действия барназы на опухолевые клетки определяет целесообразность создания противоопухолевых средств на основе этой РНКазы.

1.3. Цитотоксическое действие иммунобарназных конъюгатов, направленных на опухолевые маркеры ЕКВВ2 и ЕвРЛ

Для направленной доставки барназы к опухолевым клеткам были сконструированы конъюгаты барназы с мини-антителом, специфически связывающимся с рецептором ЕЯВВ2, - бсБу 405-дибарпаза, и с мини-антителом, специфически связывающимся с рецептором ЕйРЯ, - веру 425-барназа, и оценено их влияние на жизнеспособность мононуклеарных клеток переферической крови здоровых доноров и линий опухолевых клеток человека.

Было установлено, что иммунобарназный конъюгат бсБу 405-дибарназа избирательно токсичен для Е1ШВ2-позитивных клеток человеческих карцином молочной железы ВТ-474 (1С50 = 2,4 нМ) и БКЕЯ-З (1С50 = 4,1 нМ), карциномы яичника БКОУ-З (1С5о =1,8 нМ); иммунобарназный конъюгат бсРу 425-барназа высокотоксичен для ЕСРЯ-позитивных клеток человеческой эпидермоидной карциномы А-431 (1С5о = 0,04 нМ), токсичен для клеток эритролейкоза К-562 (1С50 = 1,7 нМ) и мелкоклеточной карциномы легких 8\У2 (1С50 = 3,2 нМ). Токсичность иммунобарназных конъюгатов была на три порядка выше, чем барназы. Данные сравнения цитотоксического действия барназы, всБу 405-дибарназы и бсБу 425-барназы на разные клеточные линии представлены в таблице 1.

Таблица 1. Цитотоксическое действие барназы, $сГу 405-дибарназы и $сГу 425-барназы на

барназа, веру 4В5-дибарназа, эсру 425-барназа,

Клетки нМ нМ нМ

1С3„ 1С50 1С70 1С30 1С5„ гс70 !С3о 1С50 1С7„

ВТ-4742 10 210 2000 0,72 2,4 9,2 н/о н/о н/о

и-937 1100 2400 6200 >8100 - - н/о н/о н/о

5КОУ-32 1500 5000 18000 0,55 1,8 14 н/о н/о н/о

А-4313 2500 10000 63000 >740 - - 0,01 0,04 0,1

НЕК293 3000 10000 46000 74 490 1800 н/о н/о н/о

К-562 5800 12000 31000 140 460 1000 0,94 1,7 2,8

МСР-7 3100 13000 40000 >1500 - - 4,8 14 106

НЫЗО 36000 82000 >82000 >8100 - - н/о н/о н/о

5КВК32 н/о н/о н/о 9,0 4,1 2,2 121 >405 -

н/о н/о н/о н/о н/о н/о 1,7 3,2 5,8

ЬРВМСв4 >110000 - - >2600 - - н/о н/о н/о

белками в течение 72 ч при 37°С в среде Ю>М1, содержащей 10% фетальную сыворотку теленка (РСБ). 1СПП - концентрация белка, при которой он вызывал уменьшение жизнеспособности клеток на пп%

2 Клеточные линии, гиперэкспрессирующие Е1ШВ2

3 Клеточные линии, гиперэкспрессирующие БвРЯ

4 ЬРВМСв выделяли из периферической крови здоровых доноров и немедленно использовали для анализа цитотоксического действия белков

- при тестированных концентрациях уменьшение жизнеспособности клеток на пп% не было достигнуто; н/о, цитотоксичность не определяли

2. Механизмы цитотоксического действия барназы и иммунобарназных конъюгатов на человеческие раковые клетки

2.1. Связывание барназы и иммунобарназных конъюгатов с клетками

Связывание барназы и бсРу 405-дибарназы с клетками человеческой карциномы яичника БКОУ-З, гиперэкспрессирующими рецептор ЕЛВВ2, и клетками мышиной цитотоксической интерлейкин-2 зависимой линии СИХ-2, лишенными человеческого ЕКВВ2, а также связывание всБу 425-барназы с клетками эпидермоидной карциномы А-431, гиперэкспрессирующими рецептор ЕСРЛ, определяли с помощью флуоресцентной микроскопии (Рис. 2.1.). Клетки инкубировали с рекомбинантым белком (барназой или веру 405-дибарназой или веру 425-барназой), а затем с кроличьей анти-барназной сывороткой (ИАВБ) и козьими анти-кроличьими антителами, конъюгированными с техасским красным (ОАЯ-ТЯ). В случае обработки клеток 8КОУ-3 раствором барназы (20 мкМ) наблюдалась интенсивная флуоресценция клеток (Рис. 2.1. а), что свидетельствует о связывании барназы с клетками БКОУ-З. При инкубировании клеток с 20 нМ веру 405-дибарназой наблюдали флуоресценцию мембран Е11ВВ2-позитивных клеток БКОУ-З, но не ЕКВВ2-негативных клеток СПХ-2 (Рис. 2.1. в, д). Инкубирование клеток со смесью белков бсРу 4Б5 и ксБу 405-дибарназы приводило к заметному уменьшению флуоресценции мембран клеток 8КОУ-3 (Рис. 2.1. в, е). О специфичности связывания веру 405-дибарназы с рецептором ЕЛВВ2 свидетельствуют как уменьшение флуоресценции в результате добавления бсРу 405, так и отсутствие связывания бсРу 405-дибарназы с Е11ВВ2-негативными клетками. Связывание бсРу 425-барназы с ЕОРЛ-позитивными клетками А-431 детектировали также с помощью ИАВБ и САЛ-ТЯ (Рис. 2.1. и). В контролях при инкубировании клеток А-431 с растворами ЯАВЗ и САЯ-ТЯ (Рис. 2.1. л) и при инкубировании с всРу 425-барназой и вАА-ТЯ в отсутствие ЯАВЗ флуоресценция не обнаруживалась.

2.2. Интернализация веру 405-дибарназы Е1ШВ2-позитивными раковыми клетками

Чтобы изучить интернализацию и внутриклеточную локализацию бсРу 405-дибарназы, мы использовали методы электронной микроскопии. Было показано, что комплексы белка бсРу 405-дибарназы с золотом (бсРу 405-дибарназа-Аи) связывались с клетками БКОУ-З (Рис. 2.2.) прйС4и ЗТ. При связывании комплексов с поверхностью клеток 8КОУ-3 частицы золота располагались на выростах и на гладких участках клеточной мембраны (Рис. 2.2. а-г).

а ШШ Ч N шшшшшшшшш в я

Д О ж 3 i ШВШШШ ШШ

и » ST А^ ¿Л '->' ¿¿Г' CJT , | 1 _ ' c§r. л ЩЩ'Ж ИИ

Рисунок 2.1. Связывание рекомбинантных белков с клетками SKOV-3, CTLL-2 и А-431.

Живые клетки SKOV-3 (а-г, ж, з), CTLL-2 (д, е), А-431 (и-м) инкубировали 1 ч при 4°С с 20 мкМ барназой (а, б); 20 нМ scFv 4Б5-дибарназой (в-е); 20 нМ scFv 405-дибарназой и 20 нМ scFv 4D5 (ж, з); с 20 нМ scFv 425-барназой (и, к) или фосфатно-солевым буфером PBS (л, м). Несвязавшиеся белки отмывали, клетки инкубировали с RABS и GAR-TR и анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа. В случае барназы, клетки фиксировали перед процедурой инкубирования с растворами RABS и GAR-TR (а, б). Клетки фотографировали в проходящем белом свете (б, г, е, з, к, м - поля зрения, соответствующие а, в, д, ж, и, л).

i Проникновение scFv 4Б5-дибарназы-Аи внутрь клеток SKOV-3 было

I обнаружено при 37С, и не обнаружено при 4°С, то есть проникновение scFv 4D5-

дибарназы-Au в клетки SKOV-3 зависело от температуры. Интернализация scFv i 405-дибарназы-Аи проходила с образованием окаймленных ямок (Рис. 2.2. в), 1

1 которые отпочковывались от клеточной мембраны и формировали окаймленные

везикулы (Рис. 2.2. д). Внутри клетки большая часть иммунобарназного конъюгата i была локализована в эндосомах (Рис. 2.2. е, ж), а некоторая часть молекул 1 находилась в цитоплазме вблизи эндосом (Рис. 2.2. е, показано стрелками). Такое наблюдение означает, что scFv 4Б5-дибарназа может высвобождаться из эндосом в цитоплазму. scFv 405-дибарназа-Аи была обнаружена в мультивезикулярных тельцах (Рис. 2.2. е), и не обнаружена в ядре (Рис. 2.2. д). Наличие scFv 4D5-дибарназы в окаймленных ямках, окаймленных везикулах и эндосомах указывает на то, что эта иммуноРНКаза проникает внутрь Е11ВВ2-позитивных клеток SKOV-3 путем эндоцитоза.

I 1

-с

МВТ »

км

ов

яя

V *

'.А

Рисунок 2.2. Иммунобарназный коньюгат веру 405-дибарназа связывается и проникает в ЕЯВВ2-позитивные клетки 8КО \-3 посредством эндоцитоза. Клетки ЭКОУ-З инкубировали с 20 нМ эсру 405-дибарназой-Аи в течение 1 ч при 4°С (а) или 37°С (6-е, ж - увеличение е). Клеточная мембрана (км); выросты (обозначены звездочками); окаймленная ямка (оя); окаймленная везикула (ов); эндосома (э); цитоплазма (ц); золотые частицы, расположенные в цитоплазме, показаны треугольными стрелками; мультивезикулярные тельца (МВТ); ядро (я). Масштабная линейка равна 200 нм.

ов

Ь МВТ " !

s-' *

2.3. Деградация РНК в клетках, обработанных барназой или scFv 4D5-дибарназой

Анализ клеточной РНК, выделенной из клеток SKOV-3, позволил выявить деградацию РНК в клетках, обработанных барназой или scFv 405-дибарназой (Рис. 2.3.). Существенная деградация РНК наблюдалась через 24 ч инкубирования клеток с барназой (Рис. 2.3. дорожка 3). Через 48 ч такой обработки клеточная РНК была полностью деградирована (Рис. 2.3. дорожка 4). РНК с низким молекулярным весом, а имен но тРНК и 5.8S рРНК, но не 5S рРНК, была наиболее чувствительной к действию барназы. РНК с высоким молекулярным весом, в частности, 18S рРНК, была преимущественно расщеплена после обработки клеток scFv 4D5-дибарназой (Рис. 2.3. дорожка 7).

Денситометрический анализ изображения геля, представленного на рисунке 2.3., показал, что относительное содержание тРНК и 5.8S рРНК в клетках, обработанных барназой, было уменьшено, соответственно, на 30% и 16%, тогда как 5S, 18S и 28S рРНК - на 60%, 43% и 54% относительно необработанных клеток (контроля). Относительное содержание 18S рРНК в клетках, обработанных scFv 405-дибарназой, было уменьшено на 30% по сравнению с контролем, в то время как содержание других видов РНК почти не изменилось.

Рисунок 2.3. Расщепление клеточной РНК барназой и всГУ 405-дибарназой.

Тотальную РНК выделяли из клеток БКОУ-З, обработанных 50 мкМ барназой 24 ч (дорожка 3) или 48 ч (дорожка 4); 50 нМ веру 405-дибарназой 72 ч (дорожка 7); из клеток БКОУ-З, культивируемых без рекомбинантных белков 24 ч (дорожка 2) или 72 ч (дорожка 6) и | анализировали в 9% полиакриламидном | геле, содержащем 7,5 М мочевину. В каждую дорожку наносили РНК, выделенную из 2x105 клеток, обработанных (+) или необработанных (-) белком. М - РНК-маркер молекулярного веса (дорожки 1, 5). Наиболее яркие полосы РНК, отсутствующие в необработанных белком клетках и возникшие в результате расщепления клеточной РНК барназой или зсИу 405-дибарназой, показаны звездочками.

2.4. Морфологические изменения клеток под действием барназы и всРу 405-дибарназы

Для анализа морфологических изменений под действием барназы и бсБу 4Б5-дибарназы клетки БКОУ-З инкубировали 72 ч в среде без рекомбинантных белков (Рис.2.4. а, г), с бсРу 4Б5-дибарназой (б, д, е) или барназой (в). Необработанные белками клетки были распластаны и прикреплены ко дну планшета. Инкубирование с барназой или бсРу 4Э5-дибарназой вызывало открепление клеток от подложки, блеббинг клеточных мембран. В клетках, обработанных веру 4Б5-дибарназой, наблюдали пикнозис ядер и ядерную фрагментацию (д, е).

Рисунок 2.4. Морфологические изменения клеток под действием барназы и всРу 405-дибарназы.

Клетки 5КОУ-3 инкубировали 72 ч в среде без рекомбинантных белков (а, г), с 50 нМ эсру 405-дибарназой (б, д, е) или 50 мкМ барназой (в). Клетки анализировали в проходящем белом свете (а-в) или окрашивали акридиновым оранжевым и анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа (г-е). Разрушенные клетки показаны стрелкой (в), блеббинг клеточных мембран показан звездочками (б, в). В клетках, обработанных веру 405-дибарназой, наблюдали пикнозис ядер и ядерную фрагментацию (д, 1 е -увеличение д).

барназа М - 24ч48ч

285 рРНК 183 рРНК 1770-'

530 400-

эсгу 4Р5-дибарназа М - +

5.85 рРНК 5Б рРНК

I- тРНК

12 3 4

28Б рРНК 188 рРНК

- 5.88 рРНК

- 58 рРНК

- тРНК

5 6 7

2.5. Анализ повреждения геномной ДНК в клетках, обработанных барназой и иммунобарказным конъюгатом «сРу 4Р5-дибарназа

Обработка клеток БКОУ-З барназой или веру 405-дибарназой приводила к расщеплению геномной ДНК типичным для апоптоза способом - межнуклеосомным расщеплением хроматина (Рис. 2.5. дорожки 2, 6), отличным от нерегулярного расщепления ДНК в клетках 5КОУ-3, культивированных в среде без сыворотки (Рис. 2.5. дорожка 7).

барназа ясру 405-дибарназа Рисунок 2.5. Межнуклеосомное расщепление

хроматина в клетках вКОУ-З, обработанных барназой и «сКу 405-дибарназой. Геномную ДНК выделяли из клеток, инкубированных 72 ч с 50 мкМ барназой (+, дорожка 2) или 50 нМ бсРу 4Э5-I 1 . ^м^^В №1 дибарназой (+, дорожка 6); из клеток, не

I и I I обработанных рекомбинантными белками (-,

дорожки 3 5); клеток БКОУ-З,

' ' ^^Э^р^^Н I культивированных 7 суток в среде без сыворотки (-

ИСБ. дорожка 7), и анализировали неденатурирующем 1,5 % агарозном геле. М - маркер молекулярного веса (т.п.н., дорожки 1, 4).

2.6. Детекция фосфатидилсерина и активации каспазы-3 в клетках 8КОУ-3, обработанных барназой или всРу 405-дибарназой

Чтобы обнаружить маркер апоптоза фосфатидилсерин на внешней стороне плазматической мембраны, клетки БКОУ-З инкубировали с 50 мкМ барназой или 50 нМ бсРу 405-дибарназой, окрашивали Аппехт-У-Р1ТС и пропидий иодидом (Р1) и анализировали методом проточной цитометрии (Рис. 2.6. а). Было показано, что 21,7% клеток в случае барназы и 32,7% клеток в случае зсРу 405-дибарназы было окрашено Аппехт-У-Р1ТС, что свидетельствовало о появлении фосфотидилсерина на поверхности клеток, а значит о гибели этих клеток путем апоптоза. При этом лишь незначительная часть клеток (2,5% и 3,0%, соответственно для барназы и веру 405-дибарназы) окрашивалась Р1 и Аппехт-У-Р1ТС, то есть подвергалась некрозу. Эти результаты указывают, что тип клеточной смерти, индуцируемой как барназой, так и веру 405-дибарназой, - апоптоз.

Измерение активности специфичной для апоптоза каспазы-3 в анализе протеолитического расщепления специфического субстрата РЫРЫЬих-ОЮ2 (Рис. 2.6. б) показало, что активность каспазы-3 была увеличена на 13,1% для клеток 5КОУ-3, обработанных барназой, и на 11,6% для клеток БКОУ-З, обработанных веру 405-дибарназой, по сравнению с необработанным контролем.

_30

о4

о 20 Н

0> §

«10

Annexin-V-FITC/PI Anne*in-V-FITC

21.6i

1.5 * 0.49 '

2.53 i

32.74

3.09!

о4

к 2

S Ю

ж §

f=t

19.8

контроль барназа ^glpS

6.7

контроль

i 18.4

барназа

Рисунок 2.6. Активация каспазы-3 и появление фосфатидилсерина на внешней стороне клеточной мембраны опухолевых клеток, обработанных барназой или чс405-ди барназой.

(а) Клетки БКОУ-З инкубировали 72 ч в среде, содержащей 50 мкМ барназу или 50 нМ бсРу 405-дибарназу, или в среде, не содержащей рекомбинантные белки, затем окрашивали Аппехт-У-Р1ТС и Р1. (б) Каспаза-3-подобная ферментативная активность клеток ЭКОУ-З, инкубированных с 50 мкМ барназой или 50 иМ эсру 405-дибарназу, оценена в анализе расщепления флуорогенного субстрата РЫРЫЬих-О^г.

Таким образом, было показано, что и барназа, и всБу 4Б5-дибарназа вызывали гибель опухолевых клеток путем апоптоза, о чем свидетельствовали мембранный блеббинг, появление фосфатидилсерина на внешней стороне плазматической мембраны, межнуклеосомная фрагментация хроматина, активация каспазы-3. Важно отметить, что благодаря специфическому взаимодействию с рецептором, иммунобарназный конъюгат индуцировал в опухолевых клетках апоптоз при концентрации в 1000 раз меньшей, чем барназа.

3. Детекция человеческих опухолевых клеток с помощью иммуноРНКаз scFv 405-дибарназа, scFv 4Э5-барназа, scFv 425-барназа и белка EGFP-барстар

На основе иммунобарназных конъюгатов был разработан подход для флуоресцентной иммунодетекции человеческих опухолевых клеток, основанный на взаимодействии барназы и барстара. Для этого был сконструирован слитый белок, состоящий из барстара и зеленого флуоресцентного белка EGFP. Инкубирование клеток с белками scFv 405-барназа (или scFv 405-дибарназа) и EGFP-барстар позволяло специфически детектировать in vitro опухолевые клетки, экспрессирующие рецептор ERBB2. При этом scFv 4Б5-барназа и EGFP-барстар не связывались с клетами CTLL-2, не экспрессирующими ERBB2. Клетки А-431, гиперэкспрессирующие рецептор EGFR, детектировали с помощью иммунобарназного конъюгата scFv 425-барназа и белка EGFP-барстар. Когда клетки SKOV-3 или А-431 инкубировали только с EGFP-барстаром, флуоресценции клеток не наблюдалось (Рис. 3).

а ' * ' 4■ '•' ' Гч Y ' ЛЙ >. ■ в "

д мвшжк! с Г ' V4 * ' * . t\ ж Л ' л ^

и t o'v,. ® гщ ■0 л ■ % ' ° ЯК

Рисунок 3. Детекция раковых клеток с помощью scFv 405-дибарназы, scFv 405-барназы, scFv 425-барназы и EGFP-барстара. Клетки SKOV-3 (a-e), CTLL-2 (ж, з), А-431 (и-м) инкубировали 1 ч при -fC с 20 нМ scFv 405-барназой (а, б, ж, з), 20 нМ scFv 405-дибарназой (в, г), 20 нМ scFv 425-барназой (и, к) или раствором PBS (д, е, л, м), затем отмывали и инкубировали с 20 нМ EGFP-барстаром.

4. Создание конструкции для эукариотической экспрессии гена иммунобарназного конъюгата scFv 4Э5-барназа

Для тетрациклин-контролируемой экспрессии иммунобарназного конъюгата scFv 405-барназа в клетках млекопитающих мы сконструировали вектор pBS-tTA-Mlp-4D5-Bn-Bs, содержащий ген слитого белка scFv 405-барназа, состоящего из N-концевого лидерного пептида легкой к-цепи иммуноглобулина мыши (М1р), анти-ЕКВВ2-мини-антитела scFv 4D5, барназы и пяти С-концевых гистидинов (Рис. 4.1.). Ген белка scFv 405-барназа находится под контролем минимального промотера тетрациклин-зависимого элемента (TRE). TRE состоит из последовательностей тетрациклиного оператора, соединенных с минимальным промотером человеческого цитомегаловируса (CMV), и регулируется трансактиваторным белком (tTA), находящимся под контролем независимого промотера CMV. В присутствии тетрациклина в культуральной среде белок tTA не может связываться с TRE, и ген scFv 405-барназы не экспрессируется, тогда как в отсутствие тетрациклина, tTA связывается с TRE и активирует транскрипцию гена scFv 405-барназы. Лидерный пептид обеспечивает секрецию в культуральную среду белка scFv 405-барназа,

токсичного для клеток-хозяев. Рибонуклеазная активность эсБу 405-барназы внутри клеток-продуцентов подавляется барстаром, ген которого в созданной конструкции находится под независимым промотером СМУ.

Рисунок 4.1. Схема вектора для эукариотической тетрациклин-контролируемой экспрессии гена белка ясКу 405-барназа. ТКЕ - тетрациклин-зависимый элемент, СМУ - минимальный промотер человеческого цитомегаловируса, М1р - генная последовательность лидерного пептида легкой -цепи иммуноглобулина мыши, 405УЬ и 405УН - гены вариабельного фрагмента легкой и тяжелой цепей анти-ЕЯВВ2-антитела 405, барназа - ген барназы, барстар -ген барстара, 1ТА - ген трансактиваторного белка ЛА..

Клетки человеческого эмбрионального почечного эпителия НЕК293 котрансфицировали плазмидами pBS-tTA-Mlp-4D5-Bn-Bs и pEGFP-Nl. Плазмиду pEGFP-Nl (Clontech), кодирующую ген зеленого флуоресцентного белка EGFP, использовали, чтобы оценить эффективность трансфекции. Вестерн-блот анализ (Рис. 4.2.) показал наличие белка scFv 4В5-барназа как внутри клеток НЕК293, трансфицированных вектором pBS-tTA-Mlp-4D5-Bn-Bs, так и в культуральной среде, в которую белок секретировался благодаря наличию лидерного пептида.

кДаРисунок 4.2. Продукция белка scFv 405-барназа в

83-клетках НЕК293 в отсутствие тетрациклина в

62"культуральной среде. Неочищенный лизат (дорожка

1), лизат, очищенный на Ni-NTA сефарозе (дорожка

2), кондиционированная среда (дорожка 3) клеток 32-НЕК 293, котрансфицированных pBs-tTAMlp-4D5-Bn-25-Bs и pEGFP-Nl. В качестве контроля использовали

неочищенный лизат (дорожка 4), лизат, очищенный на 16~Ni-NTA сефарозе (дорожка 5), кондиционированную

среду (дорожка 6) клеток НЕК 293, трансфицированных pEGFP-Nl. М - маркер молекулярного веса; scFv 405-барназа, полученная в Е.соИ и очищенная на Ni-NTA сефарозе, 42 кДа (дорожка 7). Вестерн-блот анализ был выполнен с кроличьей анти-барназной сывороткой, козьими анти-кроличьими антителами, конъюгированными со щелочной фосфатазой, и субстратом CSPD/TROPIX.

5. Оценка токсического действия scFv 4Б5-дибарназы на мышей BDF1 и

BALB/c nude

Для оценки токсического действия иммуноРНКазы scFv 405-дибарназа in vivo мышам BDF1 и BALB/c nude вводили внутривенно 7 мг/кг этого белка в растворе PBS. Установлено, что scFv 405-дибарназа не вызывала гибели мышей, потери веса,

4D5VH

TRE-CMV

Xbal

4D5VL

Xba 1 CMV-tTA

а также изменений их состояния и поведения в течение 7 дней наблюдений. Вес печени, сердца, селезенки, почек, легких, вилочковой и щитовидных желез, который определяли через 1 и 7 дней после инъекций, не отличался у мышей BDF1 в опытных и контрольных (мыши, получавшие раствор PBS) группах. Биохимический анализ крови мышей BDF1, который проводили на 7 день после введения scFv 4D5-дибарназы, не выявил значительных различий биохимических показателей крови у животных опытной и контрольной групп. В частности, не было достоверных различий (Р < 0,05) активности аланин-аминотрансферазы и аспартат-аминотрансферазы в плазме крови мышей, которым вводили scFv 4Э5-дибарназу и раствор PBS, что указывает на отсутствие повреждения печени.

Гематологический анализ крови показал (Рис. 5.1.), что scFv 4Э5-дибарназа

Рисунок 5.1.

Гематологический анализ крови мышей BDF1 и BALB/c nude на 1 и 7 дни после введения scFv 4D5-дибарназы. Среднее значение количества лейкоцитов

(тыс./мм3) в каждой группе мышей равно высоте столбцов гистограммы: лимфоциты (голубые сегменты);

сегментоядерные нейтрофилы (с/я, розовые сегменты); палочкоядерные нейтрофилы (п/я), эозинофилы, моноциты, базофилы (белые сегменты). Соотношение различных видов лейкоцитов определено при подсчёте их в окрашенном по Май-Грюнвальду мазке крови под микроскопом и выражено в%.

на 7 день после введения вызывала лимфоцитопению у иммунокомпетентных мышей BDF1, но не у иммунодефицитных мышей BALB/c nude. При этом количество лимфоцитов у мышей BDF1 снижалось в 3 раза по сравнению с контролем. Количество лейкоцитов у мышей BDF1 снижалось на 40% и составляло 6,7 тыс. клеток/мм3, что ниже физиологической нормы (7-11 тыс. клеток/мм3).

Кроме того, scFv 4В5-дибарназа вызывала полнокровие сосудов в корковом и мозговом слое почек у 2 из 5 мышей (Рис. 5.2.) на 1 день после введения, однако полнокровие было обратимым и уменьшалось на 7 день.

scFv 405-днбарназа. мг/кг

Лейкоциты,%

I день

7 день

i±

I II III IV

Группы мышей BDF1

V VI VII Группы мышей Balb/e nude

п/я нейтрофилы 2.200.4 1.8Ю.4 2.0Ю.6 2.6±0.8 2.011.2 1.811.2 310.8

с/я нейтрофилы 35.0+3.0 37.613.6 36.8+5.7 61.4±10.4 32.013.8 40.8±8.3 38.815.3

эозинофилы 1.8+0.8 2.2±0.4 2.0+0.6 2.411.6 2.0Ю.6 2.0±1.0 1.7±1.1

моноциты 1.8Ю.8 1.8Ю.4 2.0±0.9 2.010.9 3.811.1 3.711.1 5.210.7

базофилы 0.210.4 0 0 0.2М.4 0 0 0

лимфоциты 56.613.0 56.613.6 57.216.2 31.4110.5 60.214.9 51.7±8.9 51.315.3

а 1 день б 1 день В 7 день

Рисунок 5.2. Гистологические срезы почек мышей BDF1. Срезы приготовлены на 1 или 7 дни

после внутривенного введения мышам 7 мг/кг scFv 405-дибарназы (б, в) или раствора PBS (а). Микрофотографии срезов коркового (к) и мозгового (м) слоев почек, окрашенных гематоксилином и эозином. Увеличение 200 х (для панели а, верхних панелей б, в) и 70 х (для нижних панелей б, в).

Серьезного повреждения почек после введения scFv 405-дибарназы не наблюдалось, также как и повреждения других органов (сердца, печени, селезенки, мозга). Таким образом, иммунобарназный конъюгат scFv 405-дибарназа не вызывал острой системной токсичности у мышей BDF1 и BALB/c nude.

6. Определение противоопухолевой активности scFv 405-дибарназы в мышах

BALB/c nude

Бестимусным мышам BALB/c nude вводили подкожно ERBB2-гиперэкспрессирующие клетки человеческой карциномы молочной железы SKBR-3, чтобы вызвать у них развитие опухолей. Белок scFv 405-дибарназу вводили три раза внутривенно (в/в), а затем внутрибрюшинно (в/б) в количестве 0,7 мг/кг (Рис. 6). Опухоли измеряли, начиная с 9 дня после введения клеток, когда их средний объем был примерно 30 мм3, и продолжали измерения до 42 дня, пока опухоль одного из мышей не достигла 2000 мм3, после чего животных умерщвляли. Установлено, что иммуноконъюгат scFv 405-дибарназа вызывал достоверное подавление опухолей, при этом на 42 день после введения клеток ингибирующий эффект scFv 405-дибарназы на рост опухолей составил 76%.

2000 -,

Рисунок 6. Противоопухолевый эффект scFv 4I)5-juif>apii:ui,i в мышах BALB/c nude, иссушил человсчсскнс опухоли молочной железы SKBR-3. Мышам (2 группы по 5 животных) вводили подкожно 1,5х 106 клеток SKBR-3. Начиная с 5-го дня после введения клеток мышам опытной группы вводили scFv 405-дибарназу (•) в количестве 0,7 мг/кг, мышам контрольной группы вводили раствор PBS (■) на 5, 7, 9 (в/в) и на 10, 12, 14, 16, 19, 21, 23 (в/б) дни (Т). Средний объем опухолей представлен с указанием стандартных ошибок.

—•— PBS

" 500 -

0 7 14 21 28 35 42 Время (дни)

Противоопухолевая активность и низкая системная токсичность иммуноРНКазы бсРу 405-дибарназа позволяет рассматривать барназу в качестве агента для создания на ее основе противоопухолевых соединений. Результаты, полученные в данном исследовании, свидетельствуют об эффективности и перспективности дальнейших испытаний иммунобарназных конъюгатов с целью их использования в качестве противоопухолевых препаратов.

выводы

1. Установлено, что бактериальная рибонуклеаза барназа токсична (IC50 от 0,21 до 82 мкМ) для линий человеческих опухолевых клеток и малотоксична для мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров.

2. Показано, что иммунобарназные конъюгаты - слитые белки, состоящие из барназы и мини-антител к EGFR или ERBB2, - избирательно токсичны (1С50 от 0,04 до 4,1 нМ) для человеческих опухолевых клеток, гиперэкспрессирующих рецепторы EGFR и/или ERBB2, причем их токсичность на три порядка выше, чем барназы.

3. Продемонстрировано, что барназа и иммунобарназный конъюгат scFv 4D5-дибарназа связываются с опухолевыми клетками, проникают в них, расщепляют клеточную РНК и вызывают гибель клеток по механизму апоптоза, сопровождающегося мембранным блеббингом, межнуклеосомным расщеплением ДНК, появлением фосфатидилсерина на внешней стороне мембраны и активацией каспазы-3.

4. Разработан подход для флуоресцентной детекции опухолевых клеток, гиперэкспрессирующих EGFR и ERBB2, с использованием иммунобарназных конъюгатов, содержащих мини-антитела scFv 425 и scFv 4D5, и белка EGFP-барстар.

5. Создан вектор для эукариотической тетрациклин-контролируемой экспрессии иммунобарназного конъюгата scFv 4Э5-барназа, состоящего из анти-ЕЯВВ2-мини-антитела и барназы.

6. Показано, что иммунобарназный конъюгат scFv 405-дибарназа не обладает системной токсичностью в мышах BDF1, подавляет рост привитых человеческих опухолей молочной железы SKBR-3 в бестимусных мышах BALB/c nude и может быть рекомендован для дальнейших доклинических исследований.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Balandin Т G, Edelweiss Е, Andronova N V, Treshalina Е М, Sapozhnikov А М, Deyev S М. Antitumor activity and toxicity of anti-HER2 immunoRNase scFv 4D5-dibarnase in mice bearing human breast cancer xenografts //Invest New Dnigs, - 2009. -Sep 30. - DOI 10.1007/s 10637-009-9329-2.

2. Edelweiss E., Balandin T. G., Ivanova J. L., Lutsenko G. V., Leonova O. G., Popenko V. I., Sapozhnikov A. M., Deyev S. M. Barnase as a new therapeutic agent triggering apoptosis in human cancer cells f/PLoS One. - 2008. - V. 18, - P. e2434.

3. Semenyuk E. G., Stremovskiy O. A., Edelweiss E. F., Shirshikova О. V., Balandin T. G., Buryanov Y. I., Deyev S. M. Expression of single-chain antibody-barstar fusion in plants II Biochimie. - 2007. - V. 89. - P. 31-38.

4. Лебеденко E. H., Баландин Т. Г., Эдельвейс Э. Ф., Георгиев О., Моисеева Е. С., Петров Р. В., Деев С. М. Визуализация раковых клеток с помощью флуоресцентного белка EGFP-барназа IIДокл. РАН. - 2007. - Т. 414. - С. 120-123.

5. Глинка Е. М., Эдельвейс Э. Ф., Деев С. М. Эукариотические экспрессирующие векторы и иммуноконъюгаты для терапии рака И Биохимия. - 2006. - Т. 71..- С. 597606.

6. Glinka Е. М., Edelweiss Е. F., Sapozhnikov А. М., Deyev S. М. A new vector for controllable expression of an anti-ERBB2/neu mini-antibody-barnase fusion protein in НЕК 293T cells I I Gene. - 2006. - V. 366. - P. 97-103.

Патенты:

1. Деев С. M., Эдельвейс Э. Ф., Баландин Т. Г., Стремовский О. А., Урусов А. Е., Ермоленко Д. Н., Жердев А. В., Дзантиев Б. Б. Способ иммунофлуоресцентного определения локализации антигенов //Патент RU 2350959 С2. - № 9. - 2009.

2. Дзантиев Б. Б., Ермоленко Д. Н., Урусов А. Е., Жердев А. В., Баландин Т. Г., Эдельвейс Э. Ф., Стремовский О. А., Деев С. М. Способ иммуноферментного определения антигенов //Патент RU 2303783 С1. -№21. -2007.

Тезисы конференций:

1. Гук К. Д., Лысенко А. А., Стремовский О. А., Эдельвейс Э. Ф., Баландин Т. Г., Сапожников А. М., Деев С. М. Направленная доставка БТШ70 на поверхность опухолевых клеток с использованием системы барназа-барстар. XX зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 11-15 февраля, 2008), Тезисы докладов и стендовых сообщений. С. 115.

2. Деев С. М., Баландин Т. Г., Эдельвейс Э. Ф., Стремовский О. А., Акципетрова Е. О., Здобнова Т. А., Лебеденко Е. Н., Лукаш С. В. Генно-инженерные антитела для

диагностики и терапии рака. III Российский симпозиум "Белки и пептиды", (Пущино, 16-21 сентября, 2007), Сборник тезисов, С. 46.

3. Deyev S. M., Aktsipetrova E. О., Balandin T. G., Edelweiss E. F., Lebedenko E. N„ Moiseeva E., Semenyuk E. G., Stremovskiy O. A., Zdobnova T. A. Fluorescent visualization of tumor cells. International Symposium "Topical Problem of Biophotonics -2007", (Nizhny Novgorod, August 4-11,2007), Proceeding. P. 75-76.

4. Гук К. Д., Лысенко А. А., Стремовский О. А., Эдельвейс Э. Ф., Баландин Т. Г., Сапожников А. М., Деев С. М. Разработка нового подхода к противоопухолевой иммунотерапии. XIX зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», (Москва, 7-9 февраля, 2007), Тезисы докладов и стендовых сообщений, С. 60.

5. Edelweiss Е., Balandin Т., Moiseeva Е., Deyev S.M. Complex immunotoxin based on barnase-barstar connectivity selectively cytotoxic to ERBB2-positive human breast and ovarian cancer cells. Familial Cancer Conference, (Madrid, Spain, June 15-16, 2006), Abstracts, P. 55.

6. Эдельвейс Э. Ф., Баландин Т. Г., Луценко Г. В., Сапожников А. М., Деев С. М. Барназа - новый агент для эффективной селективной супрессии человеческих раковых клеток. X Всероссийский Форум с международным участием им. академика В. И. Иоффе "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге", (Санкт-Петербург, 29 мая-1 июня, 2006), Медицинская иммунология, 2006, 8: 359-360.

7. Деев С. М., Эдельвейс Э. Ф., Баландин Т. Г., Лебеденко E. Н., Каменский В. А., Турчин И. В., Плеханов В., Балалаева И. В., Орлова А. Г., Шахова H. М. Новый комбинированный подход к диагностике рака молочной железы. «Фундаментальные науки - медицине», (Москва, 27-29 ноября, 2006), Сборник тезисов, с. 54-55.

8. Balandin T. G., Edelweiss E. F,, Ivanova lu. L., Deyev S. M. A new immunoRNase 4D5 scFv-dibarnase-His5 is selectively cytotoxic for HER2/neu-overexpressing cells of human breast carcinomas. 19th Meeting of European Association for Cancer Research, (Budapest, Hungary, July 1-4, 2006), Proceedings of 19th Meeting of European Association for Cancer Research, p. 118.

9. Иванова Ю. Л., Леонова О. Г., Эдельвейс Э. Ф., Баландин Т. Г., Попенко В. И., Деев С. М. Электронномикроскопическое выявление Р185 her2 антигена с помощью комплекса barnase-barstar-коллоидное золото. XXI Российская конференция по электронной микроскопии, (Черноголовка, 5-10 июня, 2006), Сборник тезисов, С. 230.

10. Эдельвейс Э. Ф., Баландин Т. Г., Лебеденко E. Н., Лукаш С. В., Луценко Г. В., Сапожников А. М., Деев С. М. ИммуноРНКаза 4D5 scFv-fln6apHa3a-His5 избирательно токсична для клеток человеческой аденокарциномы яичника SKOV3. IX Всероссийский научный Форум с международным участием им. академика В. И.

Иоффе "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге", (Санкт-Петербург, 23-26 мая, 2005), Медицинская Иммунология, 2005, Т.7, №2-3, С. 128-129.

11. Трещалина Е. М., Андронова Н. В., Степанова Е. В., Филоненко Д. В., Барышников А. Ю., Деев С. М., Эдельвейс Э. Ф. Адаптация клеточных линий рака яичника SKOV3 и рака молочной железы человека SKBR3 с гиперэкспрессией Нег-2/neu к росту у nude мышей. IV Всероссийская научно-практическая конференция «Отечественные противоопухолевые препараты», (Москва, 16-18 марта, 2005), Российский биотерапевтический журнал, 2005, №1., С. 91.

12. Edelweiss Е. F., Glinka Е. M., Deyev S. M. The changing of internalization ability of anti-ERBB2/neu antibody by using protein transduction domain. 18th meeting of the European Association for Cancer Research, (Innsbruck, Austria, July 3-6, 2004), Abstract. P. 316.

13. Эдельвейс Э. Ф., Баландин T. Г., Кузнецова E. M., Степанова E. В., Барышников A. Ю., Деев С. M. Оценка HER2/neu статуса опухолей у больных раком молочной железы с использованием aHTii-HER2/neu-MHHH-aHTm^a. VIII Всероссийский научный Форум с международным участием им. академика В. И. Иоффе "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге", (Санкт-Петербург, 27-30 сентября, 2004), Медицинская Иммунология, 2004, Т.6, №3-5, С. 263.

14. Баландин Т. Г., Эдельвейс Э. Ф., Моисеева Е. С., Лебеденко E. Н., Сапожников А. М., Деев С. М. Флуоресцентная визуализация раковых клеток с помощью анти-HER2/neu мини-антител и модуля барназа*барстар. VIII Всероссийский научный Форум с международным участием им. академика В. И. Иоффе "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге", (Санкт-Петербург, 27-30 сентября, 2004), Медицинская Иммунология, 2004, Т.6, №3-5, С. 220.

15. Эдельвейс Э. Ф., Баландин Т. Г., Лебеденко Е. И., Лукаш С. В., Луценко Г. В., Сапожников А. М., Стремовский О. А., Деев С. М. Иммуноконъюгат анти-HER-2/пеи-мини-антитело-барназа избирательно токсичен для клеток человеческой аденокарциномы яичника SKOV-3. VI чтения, посвященные памяти академика Ю. А. Овчинникова, (Москва-Пущино, Россия, 25 ноября - 2 декабря, 2002), Тезисы докладов. С. 33.

Заказ № 15-а/05/10 Подписано в печать 05.05.2010 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1

ООО "Цифровичок", тед. (495) 649-83-30 I,(www.cfr.ru ; е-таИ:'иф)@с/г.П1

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Эдельвейс, Эвелина Федоровна

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 разработка терапевтических средств, направленных на тирозинкиназные рецепторы EGFR и ERBB

1.1.1 Общие сведения о тирозинкиназных рецепторах д

1.1.2 Разработка антител, направленных на EGFR и ERBB

1.2 Антитела для направленной доставки токсинов к 32 опухолям

1.3 Использование рибонуклеаз для создания 41 противоопухолевых средств

1.3.1 Рибонуклеазы как противоопухолевые агенты

1.3.2 Механизмы цитотоксического действия рибонуклеаз

1.3.3 Причины избирательного действия рибонуклеаз на 49 опухолевые клетки

1.3.4 Рибонуклеазы, чувствительные к ингибитору рибонуклеаз

1.3.4.1 Бычья панкреатическая РНКаза А

1.3.4.2 Человеческие рибонуклеазы

1.3.5 Рибонуклеазы, нечувствительные к ингибитору рибонуклеаз

1.3.5.1 Рибонуклеазы земноводных

1.3.5.2 РНКаза из семенннков быка

1.3.5.3 Бактериальные рибонуклеазы

2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Получение барназы и иммунобарназных конъюгатов и 88 их анализ in vitro

3.1.1 Получение рекомбинантных белков в E.coli

3.1.2 Рибонуклеазная активность барназы и иммунобарназных 91 конъюгатов

3.2 Взаимодействие барназы с клетками

3.2.1 Связывание барназы с клетками

3.2.2 Интернализация барназы клетками

3.3 Взаимодействие иммунобарназных конъюгатов с 96 клетками

3.3.1 Иммуноцитохимический анализ уровня рецептора ERBB2 на 96 клетках

3.3.2 Связывание иммунобарназных конъюгатов с клетками 96 (флуоресцентная микроскопия и проточная цитометрия)

3.3.3 Взаимодействие scFv 4Б5-дибарназы с клетками 99 (конфокальная микроскопия)

3.3.4 Интернализация scFv 405-дибарназы ЕЫВВ2-позитивными ЮО опухолевыми клетками (электронная микроскопия)

3.4 Детекция человеческих опухолевых клеток с помощью юз иммунорнказ scfv 4б5-дибарназа, scfv 4d5-bapha3a, scFv 425-барназа и белка EGFP-барстар

3.4.1 Конструирование слитого белка EGFP-барстар и ЮЗ определение его функциональной активности

3.4.2 Детекция опухолевых клеток на основе взаимодействия Ю6 барназы и барстара методом проточной цитометрии

3.4.3 Детекция опухолевых клеток на основе взаимодействия Ю7 барназы и барстара методом флуоресцентной микроскопии

3.4.4 Возможность изучения интернализации иммуноРНКазы 113 scFv 4Б5-дибарназа с помощью белка EGFP-барстар

3.5 цитотоксическое действие рекомбинантных белков на 115 опухолевые и нормальные клетки

3.5.1 Цитотоксическое действие барназы на человеческие 115 опухолевые клетки и нормальные мононуклеарные клетки периферической крови

3.5.2 Нацеливание барназы на опухолевые маркеры ERBB2 и 118 EGFR с помощью специфических антител

3.5.3 Сравнительный анализ влияния барназы и scFv 4D5- 119 дибарназы на жизнеспособность клеток

3.5.4 Доказательства специфичности действия scFv 4D5- 120 дибарназы на ЕКВВ2-гиперэкспрессирующие клетки

3.5.4.1 Зависимость цитотоксического действия scFv 4D5- 120 дибарназы от количества рецепторов ERBB2 на поверхности человеческих клеток

3.5.4.2 Конкурентное ингибирование токсического действия 121 scFv 405-дибарназы мини-антителом scFv 4D

3.5.4.3 Цитотоксичностъ scFv 405-дибарназы обусловлена 123 РНКазной активностью барназы

3.5.5 Зависимость токсического эффекта scFv 4Б5-дибарназы на 124 ЕКВВ2-гиперэкспрессирующие клетки от времени воздействия

3.5.6 Цитотоксическое действие scFv 425-барназы на 128 человеческие опухолевые клетки

3.6 Механизмы токсического действия барназы и 129 иммуноРНКазы scFv 4Б5-дибарназа на раковые клетки

3.6.1 Деградация РНК в клетках, обработанных барназой или scFvi29 405-дибарназой

3.6.2 Морфологические изменения клеток под действием барназы 131 и scFv 405-дибарназы

3.6.3 Цитометрический анализ повреяедения ДНК в клетках, 132 обработанных барназой или scFv 4Б5-дибарназой

3.6.4 Анализ геномной ДНК клеток, обработанных барназой или 135 scFv 4Б5-дибарназой

3.6.5 Пикнозис ядер в клетках, обработанных scFv 4D5- 137 дибарназой

3.6.6 Детекция фосфатидилсерина и активации каспазы-3 в 138 клетках, обработанных барназой или scFv 4Б5-дибарназой

3.6.7 Схема взаимодействия барназы и иммунобарназных 139 конъюгатов с опухолевой клеткой

3.7 Создание генетической конструкции для i эукариотической тетрациклин-контролируемой экспрессии иммунобарназного конъюгата scfv 4D5барназа

3.7.1 Субклонирование гена иммуноРНКазы scFv 4Б5-барназа в 143 плазмиду для эукариотической экспрессии

3.7.2 Влияние тетрациклина на интенсивность флуоресценции 145 клеток, котрансфицированных плазмидами, кодирующими гены белков scFv 4Б5-барназа и EGFP

3.7.3 Оценка интенсивности флуоресценции белка EGFP в 147 трансфицированных клетках НЕК293 методом проточной цитометрии

3.7.4 Очистка белка scFv 4Б5-барназа из трансфицированных 148 клеток НЕК293 и культуральной среды

3.7.5 Жизнеспособность трансфицированных клеток НЕК293 150 определяли в тесте с трипановым синим

3.8 Определение системной токсичности белка scFv 4D5дибарназа на мышах BDF1 и ВALB/c NUDE

3.8.1 Биохимический анализ крови мышей BDF

3.8.2 Определение содержания форменных элементов крови у 154 мышей

3.8.3 Гистологическое исследование действия иммуноРНКазы 154 scFv 4Б5-дибарназа на внутренние органы мышей

3.9 Определение противоопухолевой активности scFv 4D5дибарназы в мышах BALB/c NUDE

3.9.1 Определение уровня экспрессии ERBB2 в перевиваемых 159 человеческих опухолях молочной железы

3.9.2 Противоопухолевый эффект scFv 4Б5-дибарназы в мышах 160 BALB/c nude, несущих человеческие опухоли молочной железы SKBR

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Иммунобарназные конъюгаты для диагностики и терапии рака"

Ежегодно в мире выявляется 10 млн. новых случаев онкологических заболеваний, являющихся причиной смерти 250 из 100000 человек [1]. Более чем у половины больных злокачественные опухоли удается обнаружить на поздних стадиях развития, когда общепринятые методы лечения оказываются уже неэффективными. Эти факты обусловливают актуальность разработки новых и совершенствование существующих методов диагностики и лечения рака. Онкологические заболевания остаются острой проблемой современной медицины и биологии, и для их лечения в настоящее время применяются различные методы: хирургический, лучевой, химиотерапевтический, гормональный, иммунологический. В данной работе будут рассмотрены лишь некоторые подходы, касающиеся разработки средств для специфической терапии опухолей.

Идею о специфическом нацеливании терапевтических агентов на больные клетки впервые сформулировал Пауль Эрлих - основоположник химиотерапии, иммунолог, лауреат Нобелевской премии в области физиологии и медицины 1908 года. Эрлих объяснил возможность специфического нацеливания тем фактом, что некоторые красители обладают разным сродством к опухолевым и нормальным клеткам [2]. Однако метаболические пути опухолевых и нормальных клеток во многом совпадают, имея больше сходств, чем различий. Поэтому разработка средств, специфически удаляющих опухолевые клетки и не повреждающих нормальные клетки, остается актуальной проблемой современной медицины. Едва различимая разница между опухолевыми и нормальными клетками в использовании урацила для поддержания своего роста привела к открытию противоопухолевого средства флуороурацила [3]. Флуороурацил является антиметаболитом урацила, конкурирует с ним за тимидилатсинтетазу, блокирует синтез ДНК, вызывает образование структурно несовершенной РНК путем внедрения в ее синтез. Тимидилатсинтетаза экспрессируется больше в опухолевых, чем в нормальных клетках. Как результат, нормальные клетки, в целом, менее чувствительны к цитотоксическим эффектам флуороурацила [4, 5], чем опухолевые. Также было замечено, что опухолевые клетки, в отличие от нормальных клеток, находятся в большей зависимости от метаболизма глюкозы, а не от цикла лимонной кислоты, для образования аденозин трифосфата [6]. Сахар, манноза-6-фосфат, был присоединен к сильному растительному токсину рицину [7]. Таким образом, рицин специфически был доставлен к клеткам, несущим рецептор, связывающий манноза-6-фосфат, и селективно убивал эти клетки. Разработка и использование флуороурацила и конъюгата сахара с токсином - одни из ранних примеров реализации идеи "магической пули". Термин "магическая пуля" был использован Эрлихом в 1908 году в "Нобелевской лекции" [8]. И сегодня, спустя 100 лет, не утихают споры, какой именно смысл ученый вкладывал в этот термин. В словах Эрлиха, «анти-токсины и анти-бактериальные субстанции являются, так сказать, магическими пулями, которые ударяют только по тем объектам, для разрушения которых они были продуцированы данным организмом» одни исследователи находят указание на иммунотоксины, в то время как другие настаивают, что термин "магическая пуля" обозначает только антитела [9]. Ключевыми событиями, повлиявшими на развитие специфической терапии, явились идентификация опухолеассоциированных антигенов, а также открытие способа получения моноклональных антител Жоржем Кёлером и Сезаром Мильштейном в 1975 году [10]. Эти события быстро привлекли внимание ученых, занимающихся разработкой противоопухолевых препаратов, к антителам для нацеливания токсинов на опухолевые клетки, и в 1980 году были одновременно опубликованы две работы о создании токсинов, связанных с антителами [11, 12]. Неологизм "иммунотоксин" появился несколькими годами позже [13]. Открытие вирусных онкогенов, кодирующих тирозинкиназы, и последующее обнаружение того, что мутации в некоторых нормальных генах тирозинкиназ могут трансформировать их в онкогены и вызывать клеточную трансформацию (иммортализацию, субстрат-независимый рост, способность формировать опухоли в иммунодефицитных мышах), предоставили основу для использования антител, направленных на человеческие рецепторы эпидермального фактора роста [14, 15]. Открытия и фармакологические исследования, которые привели к разработке антител, направленных на тирозинкиназные рецепторы EGFR и ERBB2, и к разрешению использовать в клинике Герцептин -гуманизированное моноклональное антитело, направленное на внеклеточный домен рецептора ERBB2, описаны в первом разделе обзора литературы данного исследования.

Герцептин - одно из наиболее успешных антител, использующихся в настоящее время в клинической практике. Результаты его клинического применения демонстрируют терапевтическую значимость нацеливания на тирозинкиназы для лечения рака. В то же время использование Герцептина в клиниках указало на ряд проблем, решение которых требует новых подходов к разработке противоопухолевых средств. В частности, чтобы избежать развития вторичной устойчивости опухолей к обработке моноклональными антителами, обладающими цитостатическим действием, необходимо нацеливать на опухоли токсины. Однако сильные бактериальные и растительные токсины и созданные на их основе противоопухолевые средства при введении пациентам вызывают у них гепатотоксичность, а также синдром повышенной проницаемости капилляров. Описанию способов оптимизации антител для нацеливания на опухолевые клетки токсических агентов посвящен второй раздел обзора литературы.

Одним из возможных решений проблемы системной токсичности является использование в качестве токсина рибонуклеазы, которая не является мутагенной, не вызывает сильного побочного токсического действия и, проникнув в опухолевую клетку, расщепляет РНК, приводя к гибели клетки. Иммуноконъюгат, сконструированный на основе антитела и рибонуклеазы, получил название иммуноРНКаза. Стратегия использования РНКаз в качестве токсинов, а также созданные на сегодняшний день иммуноРНКазы, специфически направленные и селективно токсичные для различных видов опухолей, рассмотрены в третьем разделе обзора литературы.

Данная работа посвящена разработке и исследованию иммуноРНКаз, состоящих из мини-антител — одноцепочечных антиген-связываюгцих фрагментов антител (scFv) и рибонуклеазы Bacillus amyloliquefaciens — барназы. В работе использованы мини-антитела к тирозинкиназному рецептору эпидермального фактора роста EGFR и его гомологу ERBB2. ИммуноРНКазы, направленные на опухолевые маркеры, представляют собой новое поколение противоопухолевых препаратов, разработка и использование которых, возможно, позволят решить проблемы острой системной токсичности противоопухолевых лекарств.

Цель настоящей работы состояла в изучении действия рибонуклеазы барназы и иммунобарназных конъюгатов — слитых белков, состоящих из барназы и мини-антител к рецепторам EGFR и ERBB2, на человеческие опухолевые клетки in vitro и in vivo, а также в разработке подхода для детекции опухолевых клеток, основанного на взаимодействии барназы с ее природным ингибитором — барстаром.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

4. Создать генетическую конструкцию для эукариотической тетрациклин-контролируемой экспрессии иммунобарназного конъюгата scFv 4D5-барназа.

В настоящей работе впервые показано, что рибонуклеазная активность барназы не подавляется человеческим ингибитором рибонуклеаз, и барназа оказывает токсическое действие на человеческие опухолевые клетки, проникая в них, расщепляя клеточную РНК и индуцируя апоптоз. На основе барназы и мини-антител к опухолевым маркерам EGFR и ERBB2 были созданы иммуноРНКазы, которым мы дали название иммунобарназные конъюгаты. Иммунобарназные конъюгаты scFv 425-барназа и scFv 4Б5-дибарназа специфически связывались, соответственно, с рецепторами EGFR или ERBB2 на поверхности опухолевых клеток, интернализовались рецептор-опосредованным эндоцитозом и убивали клетки, вызывая в них апоптоз.

Создана конструкция для тетрациклин-контролируемой экспрессии в клетках млекопитающих гена, кодирующего слитый белок scFv 4D5-6apHa3a, состоящий из лидерного пептида, aнти-ERBB2-мини-aнтитeлa и барназы. Трансфицированные этой конструкцией человеческие клетки эмбрионального почечного эпителия НЕК293 продуцировали белок scFv 4Э5-барназа и секретировали его в культуральную среду. Показана возможность детекции in vitro опухолевых клеток, гиперэкспрессирующих рецептор ERBB2, на основе взаимодействия барназы с ее природным ингибитором барстаром.

Показано также, что scFv 405-дибарназа ингибировала в мышах BALB/c nude рост привитых человеческих опухолей молочной железы, гиперэкспрессирующих ERBB2, и не оказывала серьезных побочных токсических эффектов на мышей BDF1 и BALB/c nude. Высокая эффективность рецептор-опосредованного действия на клетки человеческих карцином молочной железы, яичника, эпидермоидной карциномы in vitro и in vivo и отсутствие побочного токсического действия на мышей позволяет рассматривать иммунобарназные конъюгаты, в частности, scFv 405-дибарназу, как перспективные противоопухолевые средства для дальнейших доклинических исследований.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Эдельвейс, Эвелина Федоровна

выводы

2. Показано, что иммунобарназные конъюгаты - слитые белки, состоящие из барназы и мини-антител к EGFR или ERBB2, — избирательно токсичны (1С5о от 0,04 до 4,1 нМ) для человеческих опухолевых клеток, гиперэкспрессирующих рецепторы EGFR и/или ERBB2, причем их токсичность на три порядка выше, чем барназы.

5. Создан вектор для эукариотической тетрациклин-контролируемой экспрессии иммунобарназного конъюгата scFv 405-барназа, состоящего из анти-Е1ШВ2-мини-антитела и барназы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Эдельвейс, Эвелина Федоровна, Москва

1. World Cancer Research Fund International //World Cancer Research Fund. 2010. URL: http://www.wcrf.org/ (дата обращения: 01.02.2010)

2. Witkop В. Paul Ehrlich and his Magic bullets-revisited UProc. Am. Philos. Soc.- 1999.-V. 143.-P. 540-557.

3. Heidelberger C., Chaudhuri N.K., Danneberg P., Mooren D., Griesbach L., Duschinsky R., Schnitzer R.J., Pleven E., Scheiner J. Fluorinated pyrimidines, a new class of tumour-inhibitory compounds //Nature. 1957. - V. 179. - P. 663— 666.

4. Li Q., Boyer C., Lee J.Y., Shepard H.M. A novel approach to thymidylate synthase as a target for cancer chemotherapy HMol. Pharmacol. — 2001. — V. 59.- P. 446-452.

5. Ashrafian H. Cancer's sweet tooth: the Janus effect of glucose metabolism in tumorigenesis //Lancet. 2006. - V. 367. - P. 618-621.

6. Youle R.J., Murray G.J., Neville D.M. Jr. Ricin linked to monophosphopentamannose binds to fibroblast lysosomal hydrolase receptors, resulting in a cell-type-specific toxin l/Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - V. 76.-P. 5559-5562.

7. Ehrlich, P. First Harben Lecture: Experimental researches on Specific therapy. -London: Pergamon Press, 1960.

8. De Lorenzo C., D'Alessio G. From immunotoxins to immunoRNases HCurr. Pharm. Biotechnol. 2008. - V. 9. - P. 210-214.

9. Kohler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity //Nature. 1975. - V. 256. - P. 495-491

10. Krolick K.A., Villemez C., Isakson P., Uhr J.W., Vitetta E.S. Selective killing of normal or neoplastic В cells by antibodies coupled to the A chain of ricin UProc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. -V. 77. - P. 5419-5423.

11. Youle R.J., Neville D.M. Jr. Anti-Thy 1.2 monoclonal antibody linked to ricin is a potent cell-type-specific toxin UProc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. - V. 77. -P. 5483-5486.

12. Vitetta E.S., Krolick K.A., Miyama-Inaba M., Cushley W., Uhr J.W. Immunotoxins: a new approach to cancer therapy //Science. — 1983. V. 219.1. P. 644-650.

13. Bishop J.M. Nobel Prize Lecture: Retroviruses and Oncogenes II. In: Lindsten J., ed. Nobel lectures in physiology or medicine 1981 1990. Singapore: Continental Press Pte. - 1993. - P. 530- 548.

14. Varmus H.E. Nobel Prize Lecture: Retroviruses and Oncogenes I. In: Lindsten J., ed. Nobel lectures in physiology or medicine 1981 1990. Singapore: Continental Press Pte. - 1993. - P. 504- 522.

15. Stout T.J., Foster P.G., Matthews D.J. High-throughput structural biology in drug discovery: protein kinases HCurr. Pharm. Des. — 2004. — V. 10. — P. 10691082.

16. Muller W.E., Kruse M., Blumbach В., Skorokhod A., Muller I.M. Gene structure and function of tyrosine kinases in the marine sponge Geodia cydonium: autapomorphic characters in Metazoa I/Gene. 1999. - V. 238. - P. 179-193.

17. Miller M.A., Malik I.A., Shenk M.A., Steele R.E. The protein tyrosine kinase family of the human genome //Oncogene. 2000. - V. 19. - P. 3925-3930.

18. Rikke B.A., Murakami S., Johnson Т.Е. Paralogy and orthology of tyrosine kinases that can extend the life span of Caenorhabditis elegans IIMol. Biol. Evol. -2000. V. 17.-P. 671-683.

19. Lucini C., Castaldo L., Lamanna C., Maruccio L., Vega J.A., Gargiulo G. Neuronal and non-neuronal trk neurotrophin receptor-like proteins in Eisenia foetida (Annelida Oligochaeta) IINeurosci. Lett. 1999. - V. 261. - P. 163-166.

20. Sakuma M., Onodera H., Suyemitsu Т., Yamasu K. The protein tyrosine kinases of the sea urchin Anthocidaris crassispina HZoolog. Sci. 1997. - V. 14. - P. 941-946.

21. Hanks S.K., Quinn A.M. //Methods Enzymol. 1991. - V. 200. - P. 38-62.

22. Types of cells and cancer //Cancer Research UK 2010. URL: http://www.cancerhelp.org.uk/about-cancer/what-is-cancer/cells/types-of-cells-and-cancer (дата обращения: 04.05.2010)

23. Robinson D.R., Wu Y.M., Lin S.F. The protein tyrosine kinase family of the human genome //Oncogene. 2000. - V. 19. - P. 5548-5557.

24. Yarden Y., Sliwkowski M.X. Untangling the ErbB signalling network //Nat. Rev. Mol. Cell Biol. — 2001. — V. 2. P. 127-137.

25. Maglott D.R., Katz K.S., Sicotte H., Pruitt K.D. NCBI's LocusLink and RefSeq //Nucleic Acids Res. 2000. - V. 28. - P. 126-128.

26. Pruitt K.D., Katz K.S., Sicotte H., Maglott D.R. Introducing RefSeq and LocusLink: curated human genome resources at the NCBI //Trends Genet. -2000.-V. 16.-P. 44-47.

27. Harari D., Yarden Y. Molecular mechanisms underlying ErbB2/HER2 action in breast cancer //Oncogene. 2000. - V. 19. - P. 6102-6014.

28. Hanahan D., Weinberg R.A. The hallmarks of cancer //Cell. 2001. - V. 100. -P. 57-70.

29. Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза //Биохимия. — 2000. -Т. 65.-С. 5-33.

30. Olayioye М., Neve R., Lane Н., Hynes N.E. The ErbB signaling network: receptor heterodimerization in development and cancer HEMBO J. 2000; V. 19.-P. 3159-3167.

31. Hackel P.O. Epidermal growth factor receptors: critical mediators of multiple receptor pathways HCurr. Opin. Cell Biol. 1999. -V. 11. - P. 184-189.

32. Salomon D.S., Brandt R., Ciardiello F., Normanno N. Epidermal growth factor-related peptides and their receptors in human malignancies HCrit. Rev. Oncol. Hematol. 1995. - V. 19. - P. 183-232.

33. Wakeling A.E., Guy S.P., Woodburn J.R., Ashton S.E., Curry В J., Barker A.J.,

34. Gibson K.H. ZD1839 (Iressa): an orally active inhibitor of epidermal growth factor signaling with potential for cancer therapy //Cancer Res. — 2002. V. 62. -P. 5749-5754.

35. Yu D., Hung M.C. Overexpression of ErbB2 in cancer and ErbB2-targeting strategies 11 Oncogene. 2000. - V. 19. - P. 6115-6121.

36. Sithanandam G., Anderson L.M. The ERBB3 receptor in cancer and cancer gene therapy 11 Cancer Gene Ther. 2008. - V. 15. - P. 413-448.

37. Junttila T.T., Sundvall M., Lundin M., Lundin J., Tanner M., Harkonen P., Joensuu H., Isola J., Elenius K. Cleavable ErbB4 isoform in estrogen receptor-regulated growth of breast cancer cells IICancer Res. — 2005. — V. 65. P. 1384-1393.

38. Schechter A.L., Stern D.F., Vaidyanathan L., Decker S.J., Drebin J.A., Greene M.I., Weinberg R.A. The neu oncogene: an erb-B-related gene encoding a185,000-Mr tumour antigen I/Nature. 1984. -V. 312. - P. 513-516.

39. Shih C., Padhy L.C., Murray M., Weinberg R.A. Transforming genes of carcinomas and neuroblastomas introduced into mouse fibroblasts //Nature. -1981.-V. 290.-P. 261-264.

40. Sporn M.B., Todaro G.J. Autocrine secretion and malignant transformation of cell UN. Engl. J. Med. 1980. - V. 303. - P. 878-880.

41. Urban J.L., Shepard H.M., Rothstein J.L., Sugarman В J., Schreiber H. Tumor necrotic factor: a potent effector molecule for tumor cell killing by activated macrophages UProc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. - V. 83. - P. 5233-5237.

42. Lewis G.D., Aggarwal B.B., Eessalu Т.Е., Sugarman B.J., Shepard H.M. Modulation of the growth of transformed cells by human tumor necrosis factor-alpha and interferon-gamma //Cancer Res. 1987. - V. 47. - P. 5382-5385.

43. Giordano S., Ponzetto C., Di Renzo M.R., Cooper C.S., Comoglio P.M. Tyrosine kinase receptor indistinguishable from the c-met protein //Nature. -1989.-V. 339.-P. 155-156.

44. Hudziak R.M., Lewis G.D., Winget M., Fendly B.M., Shepard H.M., Ullrich A. pl85HER2 monoclonal antibody has antiproliferative effects in vitro andsensitizes human breast tumor cells to tumor necrosis factor IIMol. Cell Biol. -1989.-V. 9.-P. 1165-1172.

45. Sugarman B.J., Lewis G.D., Eessalu Т.Е., Aggarwal B.B., Shepard K.M. Effects of growth factors on the antiproliferative activity of tumor necrosis factors

46. I Cancer Res. 1987. - V. 47. - P. 780-786.

47. Yarden Y., Ullrich A. Growth factor receptor tyrosine kinases HAnnu. Rev. Biochem. 1988. - V. 57. - P. 443-478.

48. Weiner D.B., Liu J., Cohen J.A., Williams W.V., Greene M.I. A point mutation in the neu oncogene mimics ligand induction of receptor aggregation //Nature. — 1989.-V. 339.-P. 230-231.

49. Hudziak R.M., Schlessinger J., Ullrich A. Increased expression of the putative growth factor receptor p 185HER2 causes transformation and tumorigenesis of NIH3T3 cells UProc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. -V. 84. - P. 7159-7163.

50. Slamon D.J., Clark G.M., Wong S.G., Levin W.J., Ullrich A., McGuire W.L. Human breast cancer correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene //Science. - 1987. - V. 235. - P. 177-182.

51. Slamon D.J., Godolphin W., Jones L.A., Holt J.A., Wong S.G., Keith D.E., Levin W.J., Stuart S.G., Udove J., Ullrich A. Studies of the HER-2/neu protooncogene in human breast and ovarian cancer //Science. 1989. - V. 244. -P. 707-712.

52. Muller W.J., Sinn E., Pattengaie P.K., Wallace R., Leder P. Single-step induction of mammary adenocarcinoma in transgenic mice bearing the activated c-neu oncogene //Cell 1988. - V. 54. - P. 105-115.

53. Hynes N.E., Lane H.A. ERBB receptors and cancer: the complexity of targeted inhibitors //Nat. Rev. Cancer. 2005. - V. 5. - P. 341-354.

54. Drebin J.A., Link V.C., Stern D.F., Weinberg R.A., Greene M.I. Downmodulation of an oncogene protein product and reversion of the transformed phenotype by monoclonal antibodies 11 Cell. 1985. - V. 41. - P. 697-706.

55. Lewis G.D., Figari I., Fendly В., Wong W.L., Carter P., Gorman C., Shepard H.M. Differential responses of human tumor cell lines to anti-pl85HER2 monoclonal antibodies I I Cancer Immunol. Immunother. — 1993. — V. 37. — P. 255-263.

56. Park J.W., Stagg R., Lewis G.D., Carter P., Maneval D., Slamon D.J., Jaffe H., Shepard H.M. Anti-pl85HER2 monoclonal antibodies: biological properties and potential for immunonotherapy I I Cancer Treat. Res. — 1992. V. 61. - P. 193— 211.

57. Shepard H.M., Jin P., Slamon D.J., Pirot Z., Maneval D.C. Herceptin HHandb. Exp. Pharmacol.- 2008. -V. 181.-P. 183-219.

58. Sergina N.V., Rausch M., Wang D., Blair J. Hann В., Shokat K.M., Moasser M.M. Escape from HER-family tyrosine kinase inhibitor therapy by the kinase-inactive HER3 //Nature. 2007. - V. 445. - P. 437-^41.

59. Murthy U., Basu A., Rodeck U., Herlyn M., Ross A.H., Das M. Binding of an antagonistic monoclonal antibody to an intact and fragmented EGF-receptor polypeptide IIArch. Biochem. Biophys. 1987. -V. 252. - P. 549-60.

60. Blumenthal R.D., Sharkey R.M., Goldenberg D.M. Current perspectives and challenges in the use of monoclonal antibodies as imaging and theraputic agents 11 Advanced Drug Deliveiy Reviews. 1990. V. 4. - P. 279-318.

61. Goldenberg D.M. Challenges to the therapy of cancer with monoclonal antibodies IIJ. Nad. Cancer Inst. 1991. - V. 83. - P. 78-79.

62. Chazin V.R., Kaleko M., Miller A.D., Slamon D J. Transformation mediated by the human HER-2 gene independent of the epidermal growth factor receptor

63. I Oncogene. 1992. -V. 7. - P. 1859-1866.

64. Pietras R.J., Fendly B.M., Chazin V.R., Pegram M.D., Howell S.B., Slamon D.J. Antibody to HER-2/neu receptor blocks DNA repair after cisplatin in human breast and ovarian cancer cells 11 Oncogene. 1994. - V. 9. - P. 1829-1838.

65. De Santes K., Slamon D., Anderson S.K., Shepard M., Fendly В., Maneval D., Press O. Radiolabeled antibody targeting of the HER-2/neu oncoprotein //Cancer Res. 1992. -V. 52. - P. 1916-1923.

66. Maneval D.C., Thomas D., Mordenti J., Green J. Utilization of interspecies scaling techniques to support dose selection in the development of a monoclonal antibody in GN 1445 //The Toxicologist. 1991. - V. 11. - P. 235.

67. Carter P., Fendly B.M., Lewis G.D., Sliwkowski M.X. Development of herceptin ИBreast Dis. 2000. - V. 11. - P. 103-111.

68. Carter P., Presta L., Gorman C.M., Ridgway J.B., Henner D., Wong W.L., Rowland A.M., Kotls C., Carver M.E., Shepard H.M. Humanization of an anti-pi 85HER2 antibody for human cancer therapy UProc. Natl. Acad. Sci. USA. -1992. V. 89. - P. 4285-4289.

69. Pietras R.J., Pegram M.D., Finn R.S., Maneval D.A., Slamon D.J. Remission of human breast cancer xenografts on therapy with humanized monoclonalantibody to HER-2 receptor and DNA-reactive drags I I Oncogene. 1998. - V. 17.-P. 2235-2249.

70. Tokuda Y., Ohnishi Y., Shimamura K., Iwasawa M., Yoshimura M., Ueyama Y., Tamaoki N., Tajima Т., Mitomi T. In vitro and in vivo anti-tumour effects of a humanised monoclonal antibody against c-erbB-2 product //Br. J. Cancer. -1996.-V. 73.-P. 1362-1365.

71. Aboud-Pirak E., Hurwitz E., Pirak M.E., Bellot F., Schlessinger J., Sela M. Efficacy of antibodies to epidermal growth factor receptor against KB carcinoma in vitro and in nude mice HJ. Natl. Cancer Inst. 1988. — V. 80. - P. 1605-1611.

72. Pegram M.D., Finn R.S., Arzoo K., Beryt M., Pietras R.J., Slamon D.J. The effect of HER-2/neu overexpression on chemotherapeutic drug sensitivity in human breast and ovarian cancer cells //Oncogene. 1997. - V. 15.-P. 537— 547.

73. Pegram M.D., Konecny G.E., O'Callaghan C., Beryt M., Pietras R., Slamon D.J. Rational combinations of trastuzumab with chemotherapeutic drags used in the treatment of breast cancer HJ. Natl. Cancer. Inst. 2004. - V. 96. - P. 739-749.

74. Maple L., Lathrop R., Bozich S., Harman W., Tacey R., Kelley M., Danilkovitch-Miagkova A. Development and validation of ELISA for herceptin detection in human serum HJ. Immunol. Methods. 2004. - V. 295. - P. 169— 182.

75. Shak S. Overview of the trastuzumab (Herceptin) anti-HER2 monoclonal antibody clinical program in HER2-overexpressing metastatic breast cancer. Herceptin Multinational Investiga-tor Study Group USemin. Oncol. 1999. - V.26.-P. 71-77.

76. Baselga J. Clinical trials of Herceptin(R) (trastuzumab) IIEur. J. Cancer. — 2001. -V. 37.-P. 18-24.

77. Leyland-Jones B. Dose scheduling-Herceptin //Oncology. 2001. - V. 61. — P. 31-36.

78. Yeon C.H., Pegram M.D. Anti-erbB-2 antibody trastuzumab in the treatment of HER2-amplified breast cancer //Invest. New Drugs. 2005. - V. 23. - P. 391409.

79. Baselga J., Perez E.A., Pfenkowski Т., Bell R. Adjuvant trastuzumab: a milestone in the treatment of HER-2-positivc early breast cancer //Oncologist. — 2006.-V. 11.-P. 4-12.

80. Slamon D., Pegram M. Rationale for trastuzumab (Herceptin) in adjuvant breast cancer trials USemin. Oncol. 2001. - V. 28. - P. 13-19.

81. Marty M., Cognetti F., Maraninchi D., Snyder R., Mauriac L., Tubiana-Hulin M., Chan S., Grimes D., Anton A., Lluch A., Kennedy J., O'Byrne K., Conte P.,

82. Meeks T.W., Ropacki S.A., Jeste D.V. The neurobiology of neuropsychiatry syndromes in dementia HCurr. Opin. Psychiat. 2006. - V. 19. - P. 581-586.

83. Rohrbach S., Niemann В., Silber R.E., Holtz J. Neuregulin receptors erbB2 and erbB4 in failing human myocardium depressed expression and attendedactivation IIBasic Res. Cardiol. 2005. - V. 100. - P. 240-249.

84. Vidal G.A., Naresh A., Marrero L., Jones F.E. Presenilin-dependent gamma-secretase processing regulates multiple ERBB4/HER4 activities UJ. Biol. Chem. 2005. - V. 280. - P. 19777-19783.

85. Nahta R., Yu D., Hung M.C., Hortobagyi G.N., Esteva F.J. Mechanisms of Disease: understanding resistance to HER2-targeted therapy in human breast cancer IINat. Clin. Pract. Oncol. 2006. - V. 3. - P. 269-280.

86. Ghatak S., Misra S., Toole B.P. Hyaluronan constitulively regulates ErbB2 phosphorylation and signaling complex formation in carcinoma cells IIJ. Biol. Chem. 2005. - V. 280. - P. 8875-8883.

87. Hommelgaard A.M., Lerdrup M., van Deurs B. Association with membrane protrusions makes ErbB2 an internalization-resistant receptor IIMol. Biol. Cell.2004.-V. 15.-P. 1557-1567.

88. Robinson A.G., Turbin D., Thomson Т., Yorida E., Ellard S., Bajdik C., Huntsman D., Gelmon K. Molecular predictive factors in patients receiving trastuzumab-based chemotherapy for metastatic disease I I Clin. Breast Cancer. —2006.-V. 7.-P. 254-261.

89. ChowN.H., Chan S.H., Tzai T.S., Ho C.L., Liu H.S. Expression profiles of ErbB family receptors and prognosis in primary transitional cell carcinoma of the urinary bladder HClin. Cancer Res. 2001. - V. 7. - P. 1957-1962.

90. Ito Y., Takeda Т., Sakon M., Tsujimoto M., Higashiyama S., Noda K., Miyoshi E., Monden M., MatsuuraN. Expression and clinical significance of erb-B receptor family in hepato-cellular carcinoma HBr. J. Cancer. 2001. - V. 84. -P. 1377-1383.

91. Wang Y., Kristensen G.B., Helland A., Nesland J.M., Borrescn-Dale A.L., Holm R. Protein expression and prognostic value of genes in the erb-b signaling pathway in advanced ovarian carcinomas 11 Am. J. Clin. Pathol. 2005. - V. 124.-P. 392-401.

92. LeSauteur L., Cheung N.K., Lisbona R., Saragovi H.U. Small molecule nerve growth factor analogs image receptors in vivo //Nat. Biotechnol. — 1996. V. 14.-P. 1120-1122.

93. Chang R.L., Ueki I.F., Troy J.L., Deen W.M., Robertson C.R., Brenner B.M. UBiophys. J. 1975. - V. 15. - P. 887-906.

94. Maack Т., Johnson V., Kau S.T., Figueiredo J., Sigulem D. Renal filtration, transport, and metabolism of low-molecular-weight proteins: a review //Kidney Int. 1979. -V. 16.-P. 251-270.

95. Batra S.K., Jain M., Wittel U.A., Chauhan S.C., Colcher D. Pharmacokinetics and biodistribution of genetically engineered antibodies HCurr. Opin. Biotechnol. 2002. - V. 13. - P. 603-608.

96. Ross J.S., Gray K., Gray G.S., Worland P.J., Rolfe M. Anticancer antibodies

97. I Am. J. Clin. Pathol. 2003. - V. 119. - P. 472-485.

98. Ge L., Knappik A., Pack P., Freund C., Pluckthun A. Expressing antibodies in Escherichia coli //Antibody Engineering. — С.A.K. Borrebaeck, Ed. — Oxford University Press, Inc. New York. 1995. - P. 229-266.

99. Glockshuber R., Malia M., Pfitzinger I., Pluckthun A. A comparison of strategies to stabilize immunoglobulin Fv-fragments //Biochemistry. — 1990. — V. 29.-P. 1362-1367.

100. Bird R.E., Hardman K.D., Jacobson J.W., Johnson S., Kaufman B.M., Lee S.M., Lee Т., Pope S.H., Riordan G.S., Whitlow M. Single-chain antigen-binding proteins //Science. 1988. - V. 242. - P. 423-426.

101. Huston J.S., Mudgett-Hunter M., Tai M.S., McCartney J., Warren F., Haber E., Oppermann H. Protein engineering of single-chain Fv analogs and fusion proteins //Methods Enzymol. 1991. - V. 203. - P. 46-88.

102. Freund C., Ross A., Guth В., Pluckthun A., Holak T.A. Characterization of the linker peptide of the single-chain Fv fragment of an antibody by NMR spectroscopy HFEBSLett. 1993. - V. 320. - P. 97-100.

103. Knappik A., Krebber C., Pluckthun A. The effect of folding catalysts on the in vivo folding process of different antibody fragments expressed in Escherichia coli ИBiotechnology (NY). 1993. - V. 11. - P. 77-83.

104. Pantoliano M.W., Bird R.E., Johnson S., Asel E.D., Dodd S.W., Wood J.F., Hardman K.D. Conformational stability, folding, and ligand-binding affinity of single-chain Fv immunoglobulin fragments expressed in Escherichia coli

105. Biochemistry. 1991. - V. 30. - P. 10117-10125.

106. Shin S.U., Wright A., Bonagura V., Morrison S.L. Genetically-engineered antibodies: tools for the study of diverse properties of the antibody molecule //Immunol. Rev. 1992. - V. 130. - P. 87-107.

107. Smith-Jones P.M., Solit D.B., Akhurst Т., Afroze F., Rosen N., Larson S.M. Imaging the pharmacodynamics of HER2 degradation in response to Hsp90 inhibitors //Nat. Biotechnol. 2004. - V. 22. - P. 701-706.

108. Jung S., Pluckthun A. Improving in vivo folding and stability of a single-chain Fv antibody fragment by loop grafting //Protein Eng. — 1997. V. 10. - P. 959966.

109. Park J.W., Hong K., Carter P., A'sgari H., Guo L.Y., Keller G.A., Wirth C., Shalaby R., Kotts C., Wood W.I. Development of anti-pl85HER2 immunoliposomes for cancer therapy UProc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1995. — V. 92.-P. 1327-1331.

110. Knappik A., Pluckthun A. Engineered turns of a recombinant antibody improve its in vivo folding //Protein Eng. 1995. - V. 8. - P. 81-89.

111. Serebrovskaya E.O., Edelweiss E.F., Stremovskiy O.A., Lukyanov K.A., Chudakov D.M., Deyev S.M. Targeting cancer cells by using an antireceptor antibody-photosensitizer fusion protein UProc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009. -V. 106.-P. 9221-9225.

112. Kubetzko S., Balic E., Waibel R., Zangemeister-Wittke U., Pluckthun A. PEGylation and multimerization of the antipl85HER-2 single chain Fv fragment4D5: effects on tumor targeting IIJ. Biol. Chem. 2006. - V. 281. - P. 3518635201.

113. Yanisch-Perron C., Vieira J., Messing J. Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors IIGene. 1985. -V. 33. - P. 103-119.

114. Lin-Chao S., Chen W.T., Wong T.T. High copy number of the pUC plasmid results from a Rom/Rop-suppressible point mutation in RNAII IIMol. Microbiol. 1992. - V. 6. - P. 3385-3393.

115. Hoogenboom H.R., Marks J.D., Griffiths A.D., Winter G. Building antibodies from their genes Hlmmunol Rev. 1992. - V. 130. - P. 41-68.

116. Pluckthun A., Skerra A. Expression of functional antibody Fv and Fab fragments in Escherichia coli I I Methods Enzymol. 1989. - V. 178. - P. 497515.

117. Pack P., Kujau M., Schroeckh V., Knupfer U., Wenderoth R., Riesenberg D., Pluckthun A. Improved bivalent miniantibodies, with identical avidity as whole antibodies, produced by high cell density fermentation of Escherichia coli

118. I Biotechnology (NY). 1993. -V. 11. - P. 1271-1277.

119. Kleckner N., Bender J., Gottesman S. Uses of transposons with emphasis on TnlO IIMethods Enzymol. 1991. - V. 204. - P. 139-180.

120. Skerra A., Pluckthun A. Assembly of a functional immunoglobulin Fv fragment in Escherichia coli I I Science. 1988. - V. 240. - P. 1038-1041.

121. Skerra A., Pfitzinger I., Pluckthun A. The functional expression of antibody Fv fragments in Escherichia coli: improved vectors and a generally applicable purification technique 11 Biotechnology (NY). 1991. -V. 9. - P. 273-278.

122. Pack P., Pluckthun A. Miniantibodies: use of amphipathic helices to produce functional, flexibly linked dimeric FV fragments with high avidity in Escherichia coli I I Biochemistry. 1992. - V. 31. - P. 1579-1584.

123. Johannes L., Decaudin D. Protein toxins: intracellular trafficking for targeted therapy I/Gene. Ther. 2005. - V. 12. - P. 1360-1368.

124. Thrush G.R., Lark L.R., Clinchy B.C., Vitetta E.S. Immunotoxins: an update HAnnu. Rev. Immunol. 1996. - V. 14. - P. 49-71.

125. Rybak S.M., Newton D.L. Natural and engineered cytotoxic ribonucleases: therapeutic potential l/Exp. Cell Res. 1999. - V. 253. - P. 325-335.

126. Batey R.T., Doudna J. A. Structural and energetic analysis of metal ions essential to SRP signal recognition domain assembly 11 Biochemistry. — 2002. V. 41. - P. 11703-11710.

127. McManus M.T. MicroRNAs and cancer HSemin. Cancer Biol. 2003. - V. 13. -P. 253-258.

128. Couzin J. Breakthrough of the year. Small RNAs make big splash I I Science. -2002. V. 298. - P. 2296-2297.

129. Leland P.A., Raines R.T. Cancer chemotherapy—ribonucleases to the rescue I I Chem. Biol. 2001. - V. 8. - P. 405-413.

130. Ильинская O.H., Макаров А.А. Почему рибонуклеазы вызывают гибель раковых клеток IIМолекулярная биология. 2005. - Т. 39. — С. 1—11.

131. Benito A., Ribor М., Vilanova М. On the track of antitumour ribonucleases IIMol. Biosyst. 2005. - V. 1. - P. 294-302.

132. Harder J., Schroder J.M. RNase 7, a novel innate immune defense antimicrobial protein of healthy human skin IIJ. Biol. Chem. 2002. - V. 277. - P. 4677946784.

133. Rosenberg H.F., Domachowske J.B. Eosinophils, eosinophil ribonucleases, and their role in host defense against respiratory virus pathogens IIJ. Leukoc. Biol. — 2001.-V. 70.-P. 691-698.

134. Matousek J. Ribonucleases and their antitumor activity 11Сотр. Biochem. Physiol. С Toxicol. Pharmacol. 2001. - V. 129. - P. 175-191.

135. Newton D.L., Hansen H.J., Liu H., Ruby D., Iordanov M.S., Magun B.E., Goldenberg D.M., Rybak S.M. Specifically targeting the CD22 receptor of human B-cell lymphomas with RNA damaging agents l/Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2001. - V. 39. - P. 79-86.

136. Gho Y.S., Yoon W.H., Chae C.B. Antiplasmin activity of a peptide that binds to the receptor-binding site of angiogenin IIJ. Biol. Chem. — 2002. V. 211. — P. 9690-9694.

137. Youle R.J., D'Alessio G. Antitumor RNases. In: D'Alessio G., Riordan J.F., eds. Ribonucleases: Structures and Functions. NY: Academic Press, 1997. P. 491514.

138. Leamon C.P., Low P.S. Membrane folate-binding proteins are responsible for folate-protein conjugate endocytosis into cultured cells IIBiochem. J. — 1993. -V. 291.-P. 855-860.

139. Haigis M.C., Raines R.T. Secretory ribonucleases are internalized by a dynamin-independent endocytic pathway IIJ. Cell Sci. 2003. - V. 116. - P. 313-324.

140. Futami J., Nukui E., Maeda Т., Kosaka M., Tada H., Seno M., Yamada H. Optimum modification for the highest cytotoxicity of cationized ribonuclease IIJ.

141. Biochem. 2002. - 132. - P. 223-228.

142. Olmo N., Turnay J., Gonzalez de Butitrago G., Lopez de Silanes I., Gavilanes J.G., Lizarbe M.A. Cytotoxic mechanism of the ribotoxin alphasarcin. Induction of cell death via apoptosis IIEur. J. Biochem. 2001. - V. 268. - P. 2113-2123.

143. Bracale A., Spalletti-Cernia D., Mastronicola M., Castaldi F., Mannucci R., Nitsch L., D'Alessio G. Essential stations in the intracellular pathway of cytotoxic bovine seminal ribonuclease //Biochem. J. — 2002. V. 362. - P. 553560.

144. Egorov S.Yu., Dmitriev I.I., Naumova E.S., Kupriyanova- Ashina F.G. An immunochemical study of Bacillus intermedius ribonuclease entry into Candida tropicalis cells and effects of the enzyme on yeast growth IITsitologiya. 1996.- V. 38. P. 66-69.

145. Rosenberg H.F. Recombinant human eosinophil cationic protein. Ribonuclease activity is not essential for cytotoxicity HJ. Biol. Chem. 1995. - V. 270. - P. 7876-7881.

146. Kurinenko B.M., Bulgakova R.Sh., Davydov R.E. Effect of ribonuclease from Bacillus intermedius on human blood lymphocytes UFEMS Immunol Med Microbiol. 1998. - V. 21. - P. 117-122.

147. Sorrentino S., Naddeo M., Russo A., D'Alessio G. Degradation of double-stranded RNA by human pancreatic ribonuclease: crucial role of noncatalytic basic amino acid residues //Biochemistry. 2003. - V. 42. - P. 10182-10190.

148. Blaszczyk J., Gan J., Tropea J.E., Court D.L., Waugh D.S., Ji X. Noncatalytic assembly of ribonuclease III with double-stranded RNA //Structure. 2004. -V. 12.-P. 457^166.

149. Leland P.A., Schultz L.W., Kim B.M., Raines R.T. Ribonuclease A variants with potent cytotoxic activity UProc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - V. 95. - P. 10407-10412.

150. Smith M.R., Newton D.L., Mikulski S.M., Rybak S.M. Cell cycle-related differences in susceptibility of NIH/3T3 cells to ribonucleases //Exp. Cell. Res.1999. V. 247. - P. 220-232.

151. Lee J.E., Raines R.T. Contribution of active-site residues to the function of onconase, a ribonuclease with antitumoral activity //Biochemistry. — 2003. — V. 42.-P. 11443-11450.

152. Ilinskaya O.N., Karamova N.S., Ivanchenko O.B., Kipenskaya L.V. SOS-inducing ability of native and mutant microbial ribonucleases HMutat. Res. -1996. V. 354. - P. 203-209.

153. Ilinskaya O.N., Ivanchenko O.B., Karamova N.S. Bacterial ribonuclease: mutagenic effect in microbial test-systems //Mutagenesis. 1995. - V. 10. - P. 165-170.

154. Ilinskaya O.N., Vamvakas S. Nephrotoxic effects of bacterial ribonucleases in the isolated perfused rat kidney //Toxicology. 1997. - 120. - P. 55-63.

155. Ильинская O.H., Фрай X. Генотоксичные эффекты рибонуклеазы in vivo //Биополимеры и клетка. — 2000. — Т. 16. С. 270—274.

156. Arnold U., Schulenburg С., Schmidt D., Ulbrich-Hofmann R. Contribution of structural peculiarities of onconase to its high stability and folding kinetics

157. Biochemistry. 2006. - V. 45. - P. 3580-3587.

158. Klink T.A., Raines R.T. Conformational stability is a determinant of ribonuclease A cytotoxicity HJ. Biol. Chem. 2000. - V. 275. - P. 1746317467.

159. Bosch M., Benito A., Riby M., Puig Т., Beaumelle В., Vilanova M. A nuclear localization sequence endows human pancreatic ribonuclease with cytotoxic activity //Biochemistry. 2004. - V. 43. - P. 2167-2177.

160. Halicka D.H., Pozarowski P., Ita M., Ardelt W.J., Mikulski S.M., Shogen K., Darzynkiewicz Z. Enhancement of activation-induced apoptosis of lymphocytes by the cytotoxic ribonuclease onconase (Ranpirnase) Hint. J. Oncol. 2002. - V. 21.-P. 1245-1250.

161. Lee F.S., Vallee B.L. Structure and action of mammalian ribonuclease (angiogenin) inhibitor //Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 1993. - V. 44. - P. 1-30.

162. Hofsteenge J. Ribonuclease inhibitor. In: D'Alessio G., Riordan J.F., eds. Ribonucleases: Structures and Functions. NY: Academic Press, 1997. P. 621— 658.

163. Arnold U., Ulbrich-Hofmann R. Natural and engineered ribonucleases as potential cancer therapeutics I IBiotechnol. Lett. — 2006. -V. 28. P. 1615-1622.

164. Utsugi Т., Schroit A.J., Connor J., Bucana C.D., Fidler I.J. Elevated expression of phosphatidylserine in the outer membrane leaflet of human tumor cells and recognition by activated human blood monocytes IICancer Res. — 1991. — V. 51. -P. 3062-3066.

165. Fukumoto H., Nishio K., Ohta S., Hanai N„ Fukuoka K., Ohe Y., Sugihara K., Kodama Т., Saijo N. Effect of a chimeric anti-ganglioside GM2 antibody on ganglioside GM2-expressing human solid tumors in vivo Hint. J. Cancer. -1999.-V. 82. -P. 759-764.

166. Ragupathi G. Carbohydrate antigens as targets for active specific immunotherapy I I Cancer Immunol. Immunother. 1996. - V. 43. - P. 152—157.

167. Ran S., Thorpe P.E. Phosphatidylserine is a marker of tumor vasculature and a potential target for cancer imaging and therapy Hint. J. Radiat. Oncol. Biol. J Phys. 2002. - V. 54. - P. 1479-1484.

168. Зеленихин П.В., Колпаков А.И., Черепнев Г.В., Ильинская О.Н. Индукция апоптоза опухолевых клеток биназой ПМолекулярная биология. 2005. - Т. 39.-С. 457-463.

169. Makarov A.A., Ilinskaya O.N. Cytotoxic ribonucleases: molecular weapons and their targets l/FEBS Lett. 2003. - V. 540. - P. 15-20.

170. Ilinskaya O., Decker K., Koschinski A., Dreyer F., Repp H. Bacillus intermedius ribonuclease as inhibitor of cell proliferation and membrane current //Toxicology. -2001. -V. 156.-P. 101-107.

171. Barnard E.A. Biological function of pancreatic ribonuclease //Nature. 1969.1. V.221.-P. 340-344.

172. Raines R.T. Ribonuclease AI I Chem. Rev. 1998. - V. 98. - P. 1045-1065.

173. Ledoux L., Baltus E. The effects of ribonuclease on cells of Ehrlich carcinoma IIExperientia. 1954. - V. 10. - P. 500-501.

174. Ledoux L. Action of ribonuclease on certain ascites tumours I/Nature. 1955. — V. 175.-P. 258-259.

175. Ledoux L. Action of ribonuclease on two solid tumours in vivo //Nature. — 1955. -V. 176.-P. 36-37.

176. De Lamirande G. Action of deoxyribonuclease and ribonuclease on the growth of Ehrlich ascites carcinoma in mice //Nature. 1961. - V. 192. - P. 52-54.

177. Tarnowski G.S., Kassel R.L., Mountain I.M., Blackburn P., Wilson G., Wang D. Comparison of antitumor activities of pancreatic ribonuclease and its cross-linked dimer //Cancer Res. 1976. - V. 36. - P. 4074-4078.

178. Glukhov B.N., Jerusalimsky A.P., Canter V.M., Salganik R.I. Ribonuclease treatment of tick-borne encephalitis //Arch. Neurol. — 1976. — V. 33. — P. 598603.

179. Fisher B.M., Ha J.H., Raines R.T. Coulombic forces in protein-RNA interactions: binding and cleavage by ribonuclease A and variants at Lys7, ArglO, and Lys66 //Biochemistry. 1998. V. 37. - P. 12121-12132.

180. Haigis M.C., Kurten E.L., Raines R.T. Ribonuclease inhibitor as an intracellular sentry //Nucleic Acids Res. 2003. - V. 31. - P. 1024-1032.

181. Lee F.S., Shapiro R., Vallee B.L. Tight-binding inhibition of angiogenin and ribonuclease A by placental ribonuclease inhibitor //Biochemistry. 1989. - V. 28.-P. 225-230.

182. Suzuki M., Saxena S.K., Boix E., Prill R.J., Vasandani V.M., Ladner J.E., Sung C., Youle R.J. Engineering receptor-mediated cytotoxicity into human ribonucleases by steric blockade of inhibitor interaction //Nat. Biotechnol. — 1999.-V. 17.-P. 265-270.

183. Gao X., Xu Z. Mechanisms of action of angiogenin //Acta. Biochim. Biophys. Sin. (Shanghai). 2008. - V. 40. - P. 619-624.

184. Song J., Wang J., Yang J., Jiang C., Shen W., Wang L. Influence of angiogenin on the growth of A375 human melanoma cells and the expression of basic fibroblast growth factor //Melanoma Res. 2006. - V. 16. - P. 119-126.

185. Darzynkiewicz Z., Carter S.P., Mikulski S.M., Ardelt W.J., Shogen K. Cytostatic and cytotoxic effects of Pannon (P-30 Protein), a novel anticancer agent //Cell Tissue Kinet. 1988. - V. 21. - P. 169-182.

186. Vasandani V.M., Wu Y.-N., Mikulski S.M., Youle R.J. and Sung C. Molecular determinants in the plasma clearance and tissue distribution of ribonucleases ofthe ribonuclease A superfamily //Cancer Res. 1996. - V. 56. - P. 4180-4186.

187. Ardelt W., Mikulski S.M., Shogen K. Amino acid sequence of an anti-tumor protein from Ranapipiens oocytes and early embryos HJ. Biol. Chem. — 1991. -V. 266.-P. 245-251.

188. Turcotte R.F., Raines R.T. Interaction of onconase with the human ribonuclease inhibitor protein HBiochem. Biophys. Res. Commun. 2008. - V. 377. — P. 512— 514.

189. Kelemen B.R., Klink T.A., Behlke M.A., Eubanks S.R., Leland P.A., Raines R.T. Hypersensitive substrate for ribonucleases //Nucleic Acids Res. 1999. -V. 27.-P. 3696-3701.

190. Leland P.A., Staniszewski K.E., Kim В., Raines R.T. A synapomorphic disulfide bond is critical for the conformational stability and cytotoxicity of an amphibian ribonuclease //FEBS Lett. 2000. - V. All. - P. 203-207.

191. Wu Y., Mikulski S.M., Ardelt W., Rybak S.M., Youle R.J. A cytotoxic ribonuclease HJ. Biol. Chem. 1993. - V. 268. - P. 10686-10693.

192. Ardelt В., Ardelt W., Darzynkiewicz Z. Cytotoxic ribonucleases and RNA interference (RNAi) //Cell Cycle. 2003. - V. 2. - P. A10-F12.

193. Saxena A., Saxena S.K., Shogen K. Effect of Onconase on double-stranded RNA in vitro HAnticancer Res. 2009. - V. 29. - P. 1067-1071.

194. Zhao H., Ardelt В., Ardelt W., Shogen K., Darzynkiewicz Z. The cytotoxic ribonuclease onconase targets RNA interference (siRNA) //Cell Cycle. 2008. -V. 7.-P. 3258-3261.

195. Kasibhatla S., Brunner Т., Genestier L., Echeverri F., Mahboubi A., Green D. DNA damaging agents induce expression of Fas ligand and subsequent apoptosis in T lymphocytes via the activation of NF-B and АР-1 IIMol. Cell -1998.-V. l.-P. 574-577.

196. Benhattar J., Cerottini J.P., Saraga E., Metthez G., Givel J.C. p53 mutations as a possible predictor of response to chemotherapy in metastatic colorectal carcinomas Hint. J. Cancer. 1996. - V. 69. - P. 190-192.

197. Iwadate Y., Fujimoto S., Tagawa M., Namba H., Sueyoshi K., Hirose M., Sakiyama S. Association of p53 gene mutation with decreased chemosensitivity in human malignant gliomas Hint. J. Cancer. 1996. - V. 69. - P. 234-236.

198. Mikulski S.M., Ardelt W., Shogen K., Bernstein E.H., Menduke H. Striking increase of survival of mice bearing Ml 09 Madison carcinoma treated with a novel protein from amphibian embryos HJ. Natl. Cancer Inst. — 1990. V. 82. — P. 151-153.

199. Pavlakis N., Vogelzang N.J. Ranpirnase-an antitumour ribonuclease: its potential role in malignant mesothelioma I/Expert Opin. Biol. Ther. 2006. - V. 6.-P. 391-399.

200. Matousek J., Soucek J., Slavik Т., Tomanek M., Lee J.E., Raines R.T. Comprehensive comparison of the cytotoxic activities of onconase and bovine seminal ribonuclease //Сотр. Biochem. Physiol. С Toxicol. Pharmacol. 2003. -V. 136.-P. 343-356.

201. Halicka D.H., Pozarowski P., Ita M., Ardelt W.J., Mikulski S.M., Shogen K., Darzynkiewicz Z. Enhancement of activation-induced apoptosis of lymphocytes by the cytotoxic ribonuclease onconase (Ranpirnase) Hint. J. Oncol. 2002. - V. 21.-P. 1245-1250.

202. Ranpirnase: Amphibian Ribonuclease A, P-30 Protein Alfacell. Adis Int. //Drugs in R&D. - V. 8. - P. 120-124.

203. Huang H.-C., Wang S.-C., Leu Y.-J., Lu S.-C., Lioa Y.-D. The Rana catesbeiana rcr gene encoding a cytotoxic ribonuclease HJ. Biol. Chem. — 1998. -V. 273.-P. 6395-6401.

204. Notomista E., Cafaro V., Fusiello R., Bracale A., D'Alessio G., Di Donato A. Effective expression and purification of recombinant onconase, an antitumor protein HFEBS Lett. 1999. - V. 463. - P. 211-215.

205. Newton D.L., Boque L., Wlodawer A., Huang C.Y., Rybak S.M. Single amino acid substitutions at the N-terminus of a recombinant cytotoxic ribonuclease markedly influence biochemical and biological properties HBiochemistry. -1998.-V. 37.-P. 5173-5183.

206. Chen S., Le S.Y., Newton D.L., Maizel J.V. Jr., Rybak S.M. A gender-specific mRNA encoding a cytotoxic ribonuclease contains a 3' UTR of unusual length and structure //Nucleic Acids Res. 2000. - V. 28. - P. 2375-2382.

207. Newton D.L., Xue Y., Boque L., Wlodawer A., Kung H.F.,Rybak S.M. Expression and characterization of a cytotoxic human-frog chimeric ribonuclease: potential for cancer therapy HProtein Eng. 1997. — V. 10. - P. 463-470.

208. Matousek J. The effect of bovine seminal ribonuclease (AS RNase) on cells of

209. Crocker tumour in mice HExperientia. 1973. - V. 29. - P. 858-859.

210. Dostal J., Matousek J. Purification of aspermatogenic substance in bull seminal vesicle fluid HJ. Reprod. Fertil. 1972. - V. 31. - P. 273-274.

211. Matousek J. Aspermatogenic effect of the bull seminal ribonuclease (BS RNase) in the presence of anti-BS RNase antibodies in mice IIAnim. Genet. 1994. - V. 25.-P. 45-50.

212. Slavik Т., Matousek J., Fulka J., Raines R.T. Effect of bovine seminal ribonuclease and bovine pancreatic ribonuclease A on bovine oocyte maturation И J. Exp. Zool. 2000. - V. 287. - P. 394-399.

213. Matousek J. Embryotoxic effect of bull seminal ribonuclease and tissue absorption studies in rats HJ. Reprod. Fertil. 1975. - V. 43. - P. 171-174.

214. Murthy B.S., De Lorenzo C., Piccoli R., D'Alessio G., Sirdeshmukh R. Effects of protein RNase inhibitor and substrate on the quaternary structures of bovine seminal RNase /Biochemistry. 1996. - V. 35. - P. 3880-3885.

215. Belyaeva M.I., Kyune M.F., Nuzhina A.M. Effect of bacterial deoxyribonuclease on Ehrlich's ascites carcinoma cells in vitro 11 Fed. Proc. Transl. Suppl. 1964. - V. 23. - P. 345-348.

216. Sevcik J., Urbanikova L., Leland P.A., Raines R.T. X-Ray structure of two crystalline forms of a streptomycete ribonuclease with cytotoxic activit HJ. Biol. Chem. 2002. - V. 277. - P. 47325-47330.

217. Cho S., Joshi J.G. Ribonuclease inhibitor from pig brain: Purification, characterization, and direct spectrophotometric assay 11 Anal. Biochem. 1989. -V. 176.-P. 175-179.

218. Ilinskaya O.N., Koschinski A., Mitkevich V.A., Repp H., Dreyer F., Pace C.N., Makarov A.A. Cytotoxicity of RNases is increased by cationization and counteracted by KCa channels //Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. - V. 314.-P. 550-554.

219. Abraham A.T., Lin J., Newton D.L., Rybak S., Hecht S. RNA cleavage and inhibition of protein synthesis by bleomycin IIChem. Biol. 2003. - V. 10. - P. 45-52.

220. Зеленихин П.В., Черепнев Г.В., Керн Ф., Ильинская О.Н. Биназа не индуцирует поликлональный Т-клеточный ответ //Доклады Академии наук. 2006. - Т. 407. - С. 414-416.

221. Ильинская О.Н., Крылова Н.И. Действие экзогенной РНКазы на клеткинизших эукариот //Прикладная биохимия и микробиология. — 1993. — Т. 29. С. 280-285.

222. Колпаков А.И., Куприянова-Ашина Ф.Г., Лещинская И.Б. Зависимость влияния РНКазы Bacillus intermedius на рост пекарских дрожжей от концентрации экзогенного фермента НМикробиология. — 2000. — Т. 69. С. 478.

223. Куриненко Б.М., Сергеева Е.В., Собчук Л.И., Булгакова Р.Ш., Хайбуллина С.А. Изучение токсичности РНКазы Bacillus intermedius in vitro и in vivo

224. НАнтибиотики и химиотерапия. — 1989. — Т. 34. — С. 266.

225. Nishimura S., Nomura M. Ribonuclease of Bacillus subtilis HBiochim. Biophys. Acta. 1958. - V. 30. - P. 430-431.

226. Makarov A.A., Kolchinsky A., Ilinskaya O.N. Binase and other microbial RNases as potential anticancer agents HBioessays. — 2008. V. 30. - P. 781— 790.

227. Hartley R. W., Barker E.A. Amino-acid sequence of extracellular ribonuclease (barnase) of Bacillus amyloliquefaciens //Nat. New Biol. 1972. - V. 235. - P. 15-16.

228. Hartley R.W. A reversible thermal transition of the extracellular ribonuclease of Bacillus amyloliquefaciens //Biochemistry. 1968. - V. 7. - P. 2401-2408.

229. Hartley R.W. Some environmental effects on the thermal transition of Bacillus amyloliquefaciens ribonuclease (barnase) //Biochemistry. 1969. - V. 8. — P. 2929-2932.

230. Hartley R.W. A two-state conformational transition of the extracellular ribonuclease of Bacillus amyloliquefaciens (barnase) induced by sodium dodecyl sulfate //Biochemistry. 1975. - V. 14. - P. 2367-2370.

231. Mauguen Y., Hartley R.W., Dodson E.J., Dodson G.G., Bricogne G., Chothia C., Jack A. Molecular structure of a new family of ribonucleases //Nature. — 1982.-V. 297.-P. 162-164.

232. Sevcik J., Sanishvili R.G., Pavlovsky A.G., Polyakov K.M. Comparison of active sites of some microbial ribonucleases: structural basis for guanylic specificity //Trends Biochem. Sci. 1990. - V. 15. - P. 158-162.

233. Hartley R.W. Barnase and barstar: two small proteins to fold and fit together //Trends Biochem. Sci. 1989. - V. 14. - P. 450-454.

234. Hartley R.W. Barnase and barstar. Expression of its cloned inhibitor permits expression of a cloned ribonuclease HJ. Mol. Biol. 1988. - V. 202. — P. 913— 915.

235. Kellis J.T. Jr., Nyberg K., Sali D., Fersht A.R. Contribution of hydrophobic interactions to protein stability //Nature. 1988. - V. 333. - P. 784-786.

236. Smeaton J.R., Elliott W.H. Isolation and properties of a specific bacterialribonuclease inhibitor IIBiochim. Biophys. Acta. 1967. - V. 145. - P. 547-560.

237. Hartley R.W., Both V., Hebert E J., Homerova D., Jucovic M., Nazarov V.,

238. Rybajlak I., Sevcik J. Barstar inhibits extracellular ribonucleases of Streptomyces and allows their production fromrecombinant genes //Protein Pept. Lett. — 1996. -V. 3.-P. 225-231.

239. Paddon С .J., Hartley R. W. Cloning, sequencing and transcription of an inactivated copy of Bacillus amyloliquefaciens extracellular ribonuclease (barnase) //Gene. 1985. - V. 40. - P. 231-239.

240. Paddon C.J., Hartley R.W. Expression of Bacillus amyloliquefaciens extracellular ribonuclease (bamase) in Escherichia coli following an inactivating mutation //Gene. 1987. - V. 53. - P. 11-19.

241. Mossakowska D.E., Nyberg K., Fersht A.R. Kinetic characterization of the recombinant ribonuclease from Bacillus amyloliquefaciens (barnase) and investigation of key residues in catalysis by site-directed mutagenesis

242. Biochemistry. 1989. - V. 28. - P. 3843-3850.

243. Mariani C., De Beuckeleer M., Truettner J., Leemans J., Goldberg R.B. Induction of male sterility in plants by a chimaeric ribonuclease gene //Nature. — 1990. V. 347. - P. 73 7-741.

244. Mariani C., Gossele V., Beuckeleer M., Block M., Goldberg R., Greef W., Leemans J. A chimaeric ribonuclease-inhibitor gene restores fertility to male sterile plants //Nature. 1992. - V. 357. - P. 384-387.

245. Goldman M.H., Goldberg R.B., Mariani C. Female sterile tobacco plants are produced by stigma-specific cell ablation HEMBO J. 1994. - V. 13. - P. 29762984.

246. Beals T.P., Goldberg R.B. A novel cell ablation strategy blocks tobacco anther dehiscence //Plant Cell 1997. - V. 9. - P. 1527-1545.

247. Colombo L., Franken J., Van der Krol A.R., Wittich P.E., Dons H.J., Angenent G.C. Downregulation of ovule-specific MADS box genes from petunia results in maternally controlled defects in seed development //Plant Cell. 1997. - V. 9. -P. 703-715.

248. Custers J.B., Oldenhof M.T., Schrauwen J.A., Cordewener J.H., Wullems G.J., van Lookeren Campagne M. M. Analysis of microspore-specific promoters in transgenic tobacco //Plant. Mol. Biol. 1997. - V. 35. - P. 689-699.

249. Lannenpaa M., Hassinen M., Ranki A., Holtta-Vuori M., Lemmetyinen J., Keinonen K., Sopanen T. Prevention of flower development in birch and other plants using a BpFULL 1::BARNASE construct //Plant Cell Rep. 2005. - V. 24.-P. 69-78.

250. Hanson В., Engler D., Moy Y., Newman В., Ralston E., Gutterson N. A simple method to enrich an Agrobacterium-transformed population for plants containing only T-DNA sequences //Plant J. 1999. - V. 19. - P. 727-734.

251. Deyev S.M., Yazynin S.A., Kuznetsov D.A., Jukovich M., Hartley R.W. Ribonuclease-charged vector for facile direct cloning with positive selection HMol. Gen. Genet. 1998. - V. 259. - P. 379-382.

252. Yazynin S., Lange H., Mokros Т., Deyev S., Lemke H. A new phagemid vector for positive selection of recombinants based on a conditionally lethal barnase gene HFEBSLett. V. 452. - P. 351-354.

253. Qin Q., Liu Y.L., Zhu Y., Li S.Y., Qi Y.P. Construction of a transposonmediated baculovirus vector Hanpvid and a new cell line for expressing barnase HJ. Biochem. Mol. Biol. 2005. - V. 38. - P. 41^18.

254. Van Poucke K., Karimi M., Gheysen G. Analysis of nematode-responsive promoters in sugar beet hairy roots HMeded. Rijksuniv. Gent. Fak. Landbouwkd. Toegep. Biol. Wet. 2001. - V. 66. - P. 591-598.

255. Bi Y.-M., Rothstein S.J.,Wildeman A.G. A novel strategy for regulated expression of a cytotoxic gene //Gene. 2001. - V. 279. - P. 175-179.

256. Leuchtenberger S., Perz A., Gatz C., Bartsch J.W. Conditional cell ablation by stringent tetracycline-dependent regulation of barnase in mammalian cells

257. Nucleic Acids Res. 2001. - V. 29. - P. E76.

258. Yazynin S.A., Deyev S.M. Recombinant barnase as a label in ELISA HFEBS Lett. 1996. - V. 388. - P. 99-102.

259. Prior T.I., FitzGerald D.J., Pastan I. Translocation mediated by domain II of Pseudomonas exotoxin A: transport of barnase into the cytosol //Biochemistry. — 1992. V. 31. - P. 3555-3559.

260. Prior T.I., Kunwar S., Pastan I. Studies on the activity of barnase toxins in vitro and in vivo UBioconjug. Chem. — 1996. V. 7. - P. 23-29.

261. Krauss J., Arndt M.A., Dubel S., Rybak S.M. Antibody-targeted RNase fusion proteins (immunoRNases) for cancer therapy HCurr. Pharm. Biotechnol. — 2008. -V. 9.-P. 231-234.

262. Zewe M., Rybak S.M., Dubel S., Coy J.F., Welschof M., Newton D.L., Little M. Cloning and cytotoxicity of a human pancreatic RNase immunofusion Hlmmunotechnology. — 1997. V. 3. - P. 127—136.

263. Newton D.L., Xue Y., Olson K.A., Fett J.W., Rybak S.M. Angiogenin single-chain immunofusions: influence of peptide linkers and spacers between fusion protein domains //Biochemistry. 1996. - V. 35. - P. 545-553.

264. Rybak S.M., Newton D. Immunoenzymes. In: Chamow S.M., Ashkenazi A., eds. Antibody Fusion Proteins. NY: John Wiley and Sons, 1999. P. 53-109.

265. Rybak S.M., Hoogenboom H.R., Meade H.M., Raus J.C., Schwartz D., Youle R.J. Humanization of immunotoxins UProc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. - V. 89.-P. 3165-3169.

266. Newton D.L., Nicholls P.J., Rybak S.M., Youle R.J. Expression and characterization of recombinant human eosinophil-derived neurotoxin and eosinophil-derived neurotoxin-anti-transferrin receptor sFv HJ. Biol. Chem. — 1994. V. 269. - P. 26739-26745.

267. Deonarain M.P., Epenetos A.A. Design, characterization and anti-tumour cytotoxicity of a panel of recombinant, mammalian ribonuclease-based immunotoxins //Br. J. Cancer. 1998. - V. 77. - P. 537-546.

268. De Lorenzo C., Arciello A., Cozzolino R., Palmer D.B., Laccetti P., Piccoli R., D'Alessio G. A fully human antitumor immunoRNase selective for ErbB-2-positive carcinomas HCancer Res. 2004. - V. 64. - P. 4870-4874.

269. Krauss J., Arndt M.A., Vu B.K., Newton D.L., Seeber S., Rybak S.M. Efficient killing of CD22+ tumor cells by a humanized diabody-RNase fusion protein HBiochem. Biophys. Res. Commun. 2005. - V. 331. - P. 595-602.

270. Arndt M.A., Krauss J., Vu B.K., Newton D.L., Rybak S.M. A dimeric angiogenin immunofusion protein mediates selective toxicity toward CD22+ tumor cells HJ. Immunother. 2005. - V. 28. - P. 245-251.

271. Krauss J., Arndt M.A., Vu B.K., Newton D.L., Rybak S.M. Targeting malignant B-cell lymphoma with a humanized anti-CD22 scFv-angiogenin immunoenzyme HBr J Haematol. 2005. - V. 128. - P. 602-609.

272. Stocker M., Tur M.K., Sasse S., Krussmann A., Barth S., Engert A. Secretion of functional anti-CD30-angiogenin immunotoxins into the supernatant of transfected 293T-cells //Protein Expr. Purif. 2003. - V. 28. - P. 211-219.

273. Menzel C., Schirrmann Т., Konthur Z., Jostock Т., Dubel S. Human antibody RNase fusion protein targeting CD30+ lymphomas //Blood. 2008. - V. 111.-P. 3830-3837.

274. De Lorenzo C., Di Malta С., Са1м G., Troise F., Nitsch L., D'Alessio G. Intracellular route and mechanism of action of ERB-hRNase, a human anti-ErbB2 anticancer immunoagent HFEBS Lett. 2007. - V. 581. - P. 296-300.

275. Braschoss S., Hirsch В., Dubel S., Stein H., Durkop H. New anti-CD30 human pancreatic ribonuclease-based immunotoxin reveals strong and specificcytotoxicity in vivo HLeuk. Lymphoma. 2007. - V. 48. - P. 1179-1186.

276. Hoogenboom H.R., Raus J.C., Volckaert G. Cloning and expression of a chimeric antibody directed against the human transferrin receptor HJ. Immunol. 1990. - V. 144. - P. 3211-3217.

277. D'Alessio G., Di Donato A., Parente A., Piccoli R. Seminal RNase: a unique member of the ribonuclease superfamily /'/Trends Biochem. Sci. — 1991. — V. 16. -P. 104-106.

278. Presta L.G., Shields R.L., Namenuk A.K., Hong K., Meng Y.G. Engineering therapeutic antibodies for improved function //Biochem. Soc. Trans. — 2002 V. 30.-P. 487^90.

279. Newton D.L., Hansen H.J., Mikulski S.M., Goldenberg D.M., Rybak S.M. Potent and specific antitumor effects of an anti-CD22-targeted cytotoxic ribonuclease: potential for the treatment of non-Hodgkin lymphoma //Blood. -2001.-V. 97.-P. 528-535.

280. Hursey M., Newton D.L., Hansen H.J., Ruby D., Goldenberg D.M., Rybak S.M. Specifically targeting the CD22 receptor of human B-cell lymphomas with RNA damaging agents: a new generation of therapeutics HLeuk. Lymphoma. — 2002. — V. 43. P. 953-959.

281. Arndt M.A., Krauss J., Schwarzenbacher R., Vu B.K., Greene S., Rybak S.M. Generation of a highly stable, internalizing anti-CD22 single-chain Fv fragment for targeting non-Hodgkin's lymphoma Hint. J. Cancer. 2003. - V. 107. - P. 822-829.

282. Deyev S.M., Waibel R., Lebedenko E.N., Schubiger A.P., Pluckthun A. Design of multivalent complexes using the barnase*barstar module //Nat. Biotechnol. — 2003.-V. 21.-P. 1486-1492.

283. Hartley R.W., Rogerson D.L. Jr. Production and purification of the extracellular ribonuclease of Bacillus amyloliquefaciens (barnase) and its intracellular inhibitor (barstar). I. Barnase HPrep. Biochem. 1972. - V. 2. - P. 229-242.

284. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. - V. 5259. - P. 680-685.

285. Rushizky G.W., Greco A.E., Hartley R.W. Jr., Sober H.A. Studies on B.subtilis ribonuclease I. Characterization of enzymatic specificity //Biochemistry. — 1963. -V. 2.-P. 787-793.

286. Mossmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays HJ. Immunol. Methods. — 1983.-V. 65.-P. 55-63.

287. Becerril В., Poul M.A., Marks J.D. Toward selection of internalizing antibodies from phage libraries //Biochem. Biophys. Res. Commun. — 1999. — V. 255. — P. 386-393.

288. Frens G. Preparation of gold dispertions of varying particle size: Controlled nucleation for regulation of particle-size in monodisperse Gold suspensions //Nature: Physical Science. 1973. - V. 241. - P. 20-22.

289. Slot J.W., Geuze H.J. A new method of preparing gold probes for multiplelabeling cytochemistry //Eur. J. Cell Biol. 1985. - V. 38. - P. 87-93.

290. Slot J.W., Geuze H.J. Sizing of protein A-colloidal gold probes for immunoelectron microscopy HJ. Cell Biol. 1981. - V. 90. - P. 533-536.

291. Boenisch T. Immunochemical Staining Methods Handbook. //Boenisch, Т., ed., 3rd Ed. California, U.S.A. Dako Corporation Carpinteria.,2001.

292. Blin N., Stafford D.W. A general method for isolation of high molecular weight DNA from eukaryotes //Nucleic Acids Res. 1976. - V. 3. - P. 2303-2308.

293. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction //Anal. Biochem. 1987. -V. 162. - P. 156-159.

294. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA//Nucleic Acids Res. 1979. -V. 7.-P. 1513-1523.

295. Muller K.M., Arndt K.M., Pluckthun A. A dimeric bispecific miniantibody combines two specificities with avidity HFEBS Lett. 1998. - V. 432. - P. 4549.

296. Prior T.I., FitzGerald D.J., Pastan I. Barnase toxin: a new chimeric toxincomposed of pseudomonas exotoxin A and barnase I I Cell. — 1991. V. 64. - P. 1017-1023.

297. Prochiantz A. Messenger proteins: homeoproteins, TAT and others HCurr. Opin. Cell. Biol. 2000. - V. 12. - P. 400-406.

298. Везикулярный перенос: эндоцитоз и экзоцитоз //Биология NeoBio класс биологии. 2010. URL: http://neobio.ru/content/view/81/20/ (дата обращения: 01.05.2010)

299. Kraus M.H., Popescu N.C., Amsbaugh S.C., King C.R. Overexpression of the EGF receptor-related proto-oncogene erbB-2 in human mammary tumor cell lines by different molecular mechanisms HEMBO J. — 1987. V. 6. - P. 605610.

300. Castiglioni F., Tagliabue E., Campiglio M., Pupa S.M., Balsari A., Menard S. Role of exon-16-deleted HER2 in breast carcinomas HEndocr. Relat. Cancer. -2006.-V. 13.-P. 221-232.

301. Methods and agents for screening for compounds capable of modulating HER2 expression: United States patent US2007072186 A1 / Mehta A., Trotta C.R. (inventors); PCT Therapeutics Inc., (assignee); filled 20.12.2006; publ. 21.07.2007.

302. Waterman H., Yarden Y. Molecular mechanisms underlying endocytosis and sorting of ErbB receptor tyrosine kinases IIFEBS Lett. 2001. - V. 490. - P. 142-152.

303. Neve R.M., Nielsen U.B., Kirpotin D.B., Poul M.A., Marks J.D., Benz C.C. Biological effects of anti-ErbB2 single chain antibodies selected for internalizing function IIBiochem. Biophys. Res. Commun. 2001. - V. 280. - P. 274-279.

304. Tavare J.M., Fletcher L.M., Welsh G.I. Using green fluorescent protein to study intracellular signalling HJ. Endocrinol. 2001. - V. 170. - P. 297-306.

305. Living colors User Manual PT2040-1 //Clontech Laboratories, Inc. 2001. - P. 2-10. URL: http://www.clontech.com/images/pt/PT2040-l.pdf (дата обращения: 29.04.2005)

306. Patterson G., Day R.N., Piston D. Fluorescent protein spectra HJ. Cell Sci. -2001.-V. 114.-P. 837-838.

307. Cormack B.P., Valdivia R.H., Falkow S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP) //Gene. 1996. - V. 173. - P. 33-38.

308. Patterson G.H., Knobel S.M., Sharif W.D., Kain S.R., Piston D.W. Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy HBiophys. J. 1997. - V. 73. - P. 2782-2790.

309. Jucovic M., Hartley R.W. Protein-protein interaction: a genetic selection for compensating mutations at the barnase-barstar interface l/Proc. Nad. Acad. Sci. USA. 1996. - V. 93.-P. 2343-2347.

310. Guesdon J.L., Ternynck Т., Avrameas S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques HJ. Histochem. Cytochem. — 1979. V. 27. - P. 1131-1151.

311. Hsu S.M., Raine L., Fanger H. Use of avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures HJ. Histochem. Cytochem. 1981. - V. 29. - P. 577585.

312. Naish, S.J., Boenisch, Т., Farmilo, A.J. and Stead, R.H. Handbook: Immunochemical Staining Methods. Carpinteria, CA: DAKO Corp. 1989. - P. 120

313. Лебеденко E.H., Баландин Т.Г., Эдельвейс Э.Ф., Георгиев О., Моисеева Е.С., Петров Р.В., Деев С.М. Визуализация раковых клеток с помощью флуоресцентного белка EGFP-барназа //Докл. РАН. 2007. - Т. 414. - С. 120-123.

314. Andersson L.C., Nilsson К., Gahmberg C.G. К562 — a human erythroleukemic cell line Hint. J. Cancer. 1979. -V. 23. - P. 143-147.

315. Robertson K.A., Mueller L., Collins S.J. Retinoic acid receptors in myeloid leukemia: characterization of receptors in retinoic acid-resistant K-562 cells //Blood. 1991. - V. 77. - P. 340-347.

316. Collins S.J., Robertson K.A., Mueller L. Retinoic acid-induced granulocytic differentiation of HL-60 myeloid leukemia cells is mediated directly through the retinoic acid receptor (RAR-alpha) IIMol. Cell. Biol. 1990. - V. 10. - P. 21542163.

317. Erickson H.A., Jund M.D., Pennell C.A. Cytotoxicity of human RNase-based immunotoxins requires cytosolic access and resistance to ribonuclease inhibition //Protein Eng. Des. Sel. 2006. - V. 19. - P. 37-45.

318. Wu Y., Saxena S.K., Ardelt W., Gadina M., Mikulski S.M., De Lorenzo C., D'Alessio G., Youle R.J. A study of the intracellular routing of cytotoxic ribonucleases HJ. Biol. Chem. 1995. -V. 270. - P. 17476-17481.

319. Walter P., Blobel G. Signal recognition particle contains a 7S RNA essential for protein translocation across the endoplasmic reticulum //Nature. — 1982. — V. 299.-P. 691-698.

320. Egea P.F., Stroud R.M., Walter P. Targeting proteins to membranes: structure of the signal recognition particle l/Curr. Opin. Struct. Biol. — 2005. V. 15. - P. 213-220.

321. Ardelt В., Ardelt W., Darzynkiewicz Z. Cytotoxic ribonucleases and RNA interference (RNAi) //Cell Cycle. 2003. - V. 2. - P. 22-24.

322. Edelweiss E., Balandin T.G., Ivanova J.L., Lutsenko G.V., Leonova O.G., Popenko V.I., Sapozhnikov A.M., Deyev S.M. Barnase as a new therapeutic agent triggering apoptosis in human cancer cells IIPLoS One. 2008. - V. 3. - P. e2434.

323. Braselmann P., Graninger M., Busslinger A. A selective transcriptional induction system for mammalian cells based on Gal4-esrogene receptor fusion proteins HProc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - V. 90. - P. 1657-1661.

324. Mayo K.E., Warren R., Palmiter R.D. The mouse metallothionein-I gene is transcriptionally regulated by cadmium following transfection into human or mouse cells I I Cell- 1982. -V. 29. P. 99-108.

325. Gossen M., Bujard H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters UProc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1992. V. 89. -P. 5547-5551.

326. Mizuguchi H., Hayakawa T. Characteristics of adenovirus-mediated tetracycline-controllable expression system IIBiochim. Biophys. Acta. — 2001. V. 1568. - P. 21-29.

327. Lin C.C., Chou C.W., Shiau A.L., Tu C.F., Ко T.M., Chen Y.L., Yang B.C., Tao M.H., Lai M.D. Therapeutic HER2/Neu DNA vaccine inhibits mouse tumor naturally overexpressing endogenous neu IIMolec. Ther. — 2004. — V. 10. — P. 290-301.

328. Nakai K., Horton P. PSORT: a program for detecting sorting signals in proteins and predicting their subcellular localization I/Trends. Biochem. Sci. — 1999. — V. 24.-P. 34-36.

329. Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. In: Walker J.M., ed. The Proteomics Protocols Handbook. Totowa, NJ: Humana Press, 2005.-P. 571-607.

330. Glick B.R., Whitney G.K. Factors affecting the expression of foreign proteins in Escherichia coli HJ. Ind. Microbiol. 1987. - V. 1. - P. 277-282.

331. Wilcox G., Studnicka G.M. Expression of foreign proteins in microorganisms HBiotechnol. Appl. Biochem. 1988. - V. 10. - P. 500-509.

332. Wild K., Rosendal K.R. Sinning I. A structural step into the SRP cycle HMol. Microbiol. 2004. - V. 53. - P. 357-363.f)

333. Murphy F J., Hayes M.P., Burd P.R. Disparate intracellular processing of human IL-12 preprotein subunits: atypical processing of the P35 signal peptide И J. Immunol. 2000. - V. 164. - P. 839-847.

334. Glinka E.M., Edelweiss E.F., Sapozhnikov A.M., Deyev S.M. A new vector for controllable expression of an anti-HER2/neu mini-antibody-barnase fusion protein in НЕК 293T cells I I Gene. 2006. - V. 366. - P. 97-103.

335. Press M.F., Cordon-Cardo С., Slamon D.J. Expression of the HER-2/neu proto-oncogene in normal human adult and fetal tissues 11 Oncogene. — 1990. V. 5. -P. 953-962.

Информация о работе

Эдельвейс, Эвелина Федоровна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.03

Диссертация

Иммунобарназные конъюгаты для диагностики и терапии рака - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы