Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммунный статус черноморской афалины (Tursiops Truncatus Ponticus Barabash, 1940) в период адаптации к условиям жизни в неволе

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Иммунный статус черноморской афалины (Tursiops Truncatus Ponticus Barabash, 1940) в период адаптации к условиям жизни в неволе"

На правах рукописи

СОКОЛОВА Ольга Владимировна

иммунный статус черноморской афалины (тикяюря тижатиь

рокттсия ваиававн, 1940) в период адаптации к условиям жизни в

неволе.

03.00.16. - Экология

16.00.03. - Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2006 г.

Работа выполнена в Институте проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова Российской Академии Наук

Научные руководители:

профессор,

доктор биологических наук Е.В. Романенко

Заслуженный деятель науки РФ, профессор,

доктор медицинских наук Т.Н. Булычева

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, К.А. Роговин

Заслуженный деятель науки РФ, профессор,

доктор медицинских наук, А.А. Ярилин

Ведущее учреждение: кафедра зоологии позвоночных биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится

2006 г, в

"/ ' часов

на заседании диссершционного совета Д 002 213.01по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук в Институте проблем экологии и эволюции им. А. Н Северцова РАН по адресу. 119071, Москва В-71, Ленинский проспект, 33; Тел./факс: (495) 952 - 35 - 84

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Отделения биологических наук РАИ Ашореферат разослан "Л"

2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических на;

Т. П. Крапивко

i<X?3>

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. За последние годы становится все более актуальной проблема сохранения видового разнообразия на нашей планете В связи с этим проводятся мероприятиятия по охране и всестороннему изучению редких и исчезающих видов животных Одним из возможных направлений для решения поставленной задачи является адаптация представителей уникальных видов к условиям жизни в неволе с последующим изучением, разведением и возможным восстановлением их численности в природных популяциях.

При адаптации диких животных из естественной среды обитания к среде, искусственно созданной человеком или условиям неволи, возникает ряд трудностей, связанных с изменением воздействия абиотических и биотических факторов на организм животного в качественно новых условиях

Как известно, иммунная система млекопитающих представляет собой физиологический механизм, который наиболее быстро и тонко реагирует на любые изменения общего состояния организма (Ройт А и др., 2000), а также на любые колебания биотических и абиотических факторов среды (Шубик В М., 1976, Хаитов Р. М с соавт, 1995). В связи с этим изучение динамики показателей иммунного статуса животных является перспективным подходом для оценки способности организма приспосабливаться к изменению условий обитания

В настоящей работе объектом исследования является представитель отряда китообразных - черноморская афалина (Cetacea' Odontoceti - Tursiops truncatus ponticus Barabash, 1940), вид уникальный и экологически очень уязвимый.

Черноморская афалина занесена в Красную книгу России (категория 3 - "редкие таксоны и популяции") По мнению некоторых исследователей (Соколов В Е, 1986, Соколов В Е. и др , 1990, Яскин В.А , Юхов В.Л , 1997) этот подвид морских млекопитающих в недалеком будущем может оказаться на грани полного исчезновения Поэтому, для спасения этих уникальных представителей морской фауны становится очевидной необходимость их содержания и разведения в условиях неволи.

Некоторыми исследователями (Greenwood A.G , Taylor D.C., 1977, 1978, 1979; Cordes D.O., 1982) было показано, что ифекционные заболевания являются основной причиной развития патологических процессов в органах и системах, которые становятся основной причиной гибели афалин, содержащихся в неволе

Согласно другим данным, причиной гибели афалины в период адаптации к условиям жизни в неволе являются инфекционные заболевания генерализованного типа, вызванные патогенами, которые часто присутствуют в ноогенной, т е. созданной человеком, среде обитания (Сыкало А.И., 1982, Романов ВВ., 1991b). В связи с этим можно предположить, что основным лимитирующим биотическим фактором среды, который определяет выживаемость дельфинов в процессе адаптации к условиям жизни в неволе, является бактериальная микрофлора ноогенного происхождения, с которой афалины не сталкивались в естественной среде обитания В 80% случаев бактериальные инфекции у афалины в условиях неволи вызывают Грамположительные кокки (стафилококки и стрептококки)(Колесса О.В , 1986, Varaldo Р.Е et а)., 1988). Обычно, исход течения инфекционного процесса у афалины зависит от уровня иммунной реактивности макроорганизма - "хозяина" в период адаптации, а также от степени вирулентности патогенных микроорганизмов - "паразитов"

Нарушение иммунных механизмов на уровне организма существенно снижает его приспособляемость, повышает вероятность его гибели, и сказывается на

популяционных процессах ___

гТоГ~Г\;1 -у и V: .и V! с, '¡,.)! i к \

1 _оо

В связи с этим в экологическом плане интерес представляет исследование параметров иммунного статуса у диких животных в природных условиях, как критериев оценки степени влияния факторов среды, в т ч антропогенных, на организм животных в данном биогеоценозе.

Следует отметить, что иммунный статус морских млекопитающих, по сравнению со многими наземными млекопитающими (человек, лабораторные, домашние и дикие животные), мало изучен Основная причина заключается в большой трудоемкости взятия прижизненного морфологического материала: крови, лимфоузлов, пунктата костного мозга, что становится возможным в условиях неволи.

Цель и задами исследования. Целью настоящей работы было изучение показателей иммунного статуса у черноморской афалины на разных сроках адаптации к условиям неволи при воздействии биотического фактора среды Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить количественный и видовой состав Грамположительной (Гр "+") кокковой микрофлоры верхних дыхательных путей (ВДП) у афалины на разных сроках адаптации к неволе, в качестве возможного биотического фактора среды

2. Исследовать гематологические показатели у афалины на разных сроках адаптации

3. Изучить клеточные и гуморальные показатели иммунного статуса у афалины на разных сроках адаптации к условиям жизни в неволе

4. Провести сравнительный анализ между динамикой показателей Гр "+" кокковой микрофлоры ВДП и показателями иммунного статуса у афалины на разных сроках адаптации.

5. Разработать методические подходы к прижизненной комплексной оценке степени адаптированности морских млекопитающих, на примере черноморской афалины.

Научная новизна работы. Данная работа является первым комплексным эколого-иммунологическим исследованием адаптационных возможностей иммунной системы черноморской афалины при её содержании в измененных условиях обитания Получены комплексные данные иммунологических показателей у клинически здоровых, адаптированных к условиям неволи афалин Выявлены изменения показателей иммунного статуса у афалины в период адаптации к жизни в неволе, обнаружена связь между иммунологическими показателями и Гр"+" кокковой микрофлорой ВДП у афалины. Впервые показаны некоторые адаптационные физиологические особенности у этого вида китообразных 1) появление в периферической крови форм моноцитов, переходных к тканевой форме и активное участие этих клеток в процессе фагоцитоза, 2) активное участие эозинофилов в процессе фагоцитоза, наряду с нейтрофилами и моноцитами Установлено, что на ранних сроках адаптации (1-2 мес ) происходит подавление Т- клеточного, и, особенно, В- клеточного звеньев иммунитета у афалины. Фагоцитарная активность лейкоцитов в этот период также значительно понижена Результаты проведенного исследования показали, что для адаптации к условиям жизни в неволе афалине требуется не менее четырех месяцев.

Показано, что показатели иммунного статуса в комплексе с гематологическими и микробиологическими показателями могут применяться для комплексной оценки приспособительных возможностей афалины к условиям неволи

Разработан методический подход для прижизненной комплексной оценки степени адаптированности организма морских млекопитающих к изменению биотических факторов среды, на примере Т {гипсаШ

Положения, выносимые на защиту.

1 Комплексная оценка физиологического состояния афалины в период адаптации к условиям жизни в неволе должна включать исследование иммунологических, микробиологических и гематологических показателей.

2 На ранних сроках адаптации к неволе (1-2 мес.) у афалины происходит подавление иммунной реактивности организма.

3 У афалины на разных сроках адаптации к условиям неволи изменение показателей клеточного и гуморального иммунитета связано с изменением количественного и видового состава Гр "+" кокковой микрофлоры ВДП.

4 Данные о состоянии иммунного статуса у афалины на разных сроках адаптации к неволе отражают степень приспособленности особей этого вида к изменению условий обитания

Теоретическое и практическое значение работы. Материалы диссергации представляют интерес в плане изучения адаптационных возможностей иммунной системы морских млекопитающих. В результате проведенной работы расширены научные представления об иммунологических и микробиологических аспектах адаптации

Предложенный эколого-иммунологический подход к оценке физиологического состояния организма может быть применен для определения степени адаптированности не только у представителей сем Delphinidae, но и у других видов млекопитающих в связи с изменением состояния среды в природных условиях.

Результаты настоящего исследования могут оказаться полезными для разработки комплексных экологических программ по спасению, как афалины, так и других редких и исчезающих видов животных, что будет способствовать сохранению видового разнообразия

Апробация работы Материалы диссертации были доложены и представлены на методической и научной конференции в Московской Государственной Академии Ветеринарной Медицины и Биотехнологии им К И. Скрябина (Москва, 2001), на второй международной конференции "Морские млекопитающие Голарктики" (Байкал, Россия, 2002), на Международном совещании "Териофауна России и сопредельных территорий" (ИПЭЭ им А.Н. Северцова РАН, Москва, 2003), на 17th Annual International Conference of the European Cetacean Society (Las Palmas de Gran Canana, Spain, 2003), на 31st Annual International Symposium of European Association for Aquatic Mammals (Tenerife, Spain, 2003), на XV Biennial International Conference on the Biology of Marine Mammals (Greensboro, NC, USA, 2003), на 18,h Annual International Conference of the European Cetacean Society (Kolmarden, Sweden, 2004), на Конференции молодых сотрудников и аспирантов Института проблем экологии и эволюции им А H Северцова (Москва, 2004), на IM-ей международной конференции "Морские млекопитающие Голарктики" (Коктебель, Крым, Украина, 2004), на 19th Annual International Conference of the European Cetacean Society (La Rochelle, France, 2005), на IX International Mammalogical Congress (Sapporo, Hokkaido, Japan, 2005), на 20th Annual International Conference of the European Cetacean Society (Gdynia, Poland, 2006)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том числе 2 статьи и 14 докладов, принята к публикации еще 1 статья

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на /^/страницах машинописного текста, иллюстрирована /^таблицами, ^'рисунками

Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, рекомендаций по практическому применению. Указатель цитируемой литературы включает/^источников, в том числе ^иностранных авторов

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материал исследования

Экспериментальная часть работы была выполнена на базе Утришской морской станции (научн куратор станции к б н Л М Мухаметов) ИПЭЭ им А Н. Северцова РАН, а также в филиалах ООО «Утришский дельфинарий» (ген дир к б н Л М Мухаметов) в период с июня 2001 г. по октябрь 2005 г Иммунологические, микробиологические и гематологические исследования проводились в лаборатории Утришской морской станции ИПЭЭ им АН Северцова РАН, в лабораториях клинической иммунологии (зав лаб - Заел деят. науки РФ, профессор, д.м н. Т И. Булычева), клинико-диагностической (зав лаб. - Заел врач РФ Л Ю Тихонова), гуморального иммунитета (зав лаб - к м н ЕЮ Варламова) ГУ ГНЦ РАМН (г Москва), а также, в лаборатории иммунологии ВИЭВ им Я Р Коваленко (г. Москва), совместно с вед н.сотр, к б н И Ю Ездаковой

Микробиологические исследования проводились совместно с доцентом кафедры микробиологии МГАВМ и Б им. К И. Скрябина к.б н Т Е. Денисенко, согласно схеме лабораторной диагностики бактериальных инфекций у афалины, предложенной Т.Е. Денисенко (2003).

Объектом данного исследования была черноморская афалина (Титорз ¡гипсам ропИсиэ ВагаЬазИ, 1940).

Были проведены прижизненные обследования у 55 взрослых особей афалин (24 самцов и 31 самок) в возрасте, приблизительно, от 1-го до 12 лет Некоторых животных в разных группах исследовали повторно. Всего проведено 80 исследований В связи с тем, что животные находились на разных стадиях адаптации к условиям неволи, для удобства исследования дельфины были условно разделены на несколько групп (Табл. 1). Таблица 1. Распределение афалин по группам.

Группы афалин Сроки адаптации* Количество животных

№1 0 (отлов афалин) 3

№2 2-3 недели 13

№3 5-7 недель 13

№4 8-9 недель 8

№5 10-12 недель 7

№6 13-14 недель 7

№7 более года в неволе 15

№8 контрольная группа** 14

* длительность пребывания в неволе;

** в эту группу вошли взрослые, адаптированные к условиям неволи афалины, которые были рождены в неволе или находились в условиях неволи длительное время. На момент их обследования эти особи не имели клинических симптомов заболевания, а также отклонений от физиологической нормы по гематологическим показателям (в соответствии с данными А.Г. Мисюры и Л Н Богдановой (1997)).

Физиологическое состояние животных оценивали по показателям, которые были предложены А.З Колчинской и А Г Мисюра (1978) поведение, двигательная и пищевая активность, частота дыхания, состояние кожных покровов и слизистых оболочек, наличие и характер выделений из ВДП.

Для гематологических и иммунологических исследований использовали венозную периферическую цельную кровь. Пробы цельной крови отбирали у афалины из хвостовой вены в стерильные вакуумные пробирки ("VACUETTE", Austria)' 1ую - с консервантом КЗЕ EDTA КЗ, 2ую- с активатором сгустка (Z Serum Clot Activator). Пробы крови транспортировали в лабораторию в охлажденном виде в термосумках с замороженными "аккумуляторами холода" и исследовали в течение суток после взятия материала.

Мазки из ВДП отбирали стерильными тампонами из дакрона и хлопка, помещали в коллекторы с транспортными средами (EUROTUBO, Spain) для транспортировки в лабораторию

2.2. Методы исследования

Микробиологические исследования проводились по стандартным методикам (Мюррей Р , Робиноу К, 1983 а,Ь,с, Кох А , 1984, Криг Н , 1984; Сидоров М.А. и др., 1995), совместно с доцентом кафедры микробиологии МГАВМ и Б им. К И Скрябина к.б.н. Т.Е Денисенко, согласно схеме лабораторной диагностики бактериальных инфекций у афалины, предложенной Т Е Денисенко (2003) и заключались в изучении видового и количественного состава Гр "+" кокковой микрофлоры ВДП на разных сроках адаптации к условиям неволи. 1) индикация микроорганизмов в патологическом материале путем первичной микроскопии, посевы бактериологического материала на питательные среды, постановка биопробы; 2) изучение биологических свойств выделенных микроорганизмов (морфологии, тинкториальных, культуральных, биохимических, факторов патогенности и вирулентности), 3) идентификация выделенных микроорганизмов.

Исследование гематологических показателей включало определение, абсолютного количества эритроцитов, лейкоцитов и лимфоцитов в 1 мкл. цельной периферической крови (ПК), скорости оседания эритроцитов (СОЭ), уровня гемоглобина, лейкоцитарной формулы крови. Определение гематологических показателей проводили в соответствии со стандартными методиками (Меньшиков В В. и др , 1987; Симонян Г.А., Хисамутдинов Ф.Ф., 1995).

Оценка иммунного статуса афалины проводилась в соответствии с иммунологическими тестами 1-го уровня, применяемыми при исследовании иммунного статуса человека (Петров Р.В и др., 1983; Ковальчук Л.В., Чередеев АН , 1990). К тестам 1-го уровня относятся: 1) определение относительного и абсолютного числа лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови, 2) определение относительного и абсолютного числа Т- и В- популяций лимфоцитов; 3) определение фагоцитарной активности лейкоцитов, 4) определение концентрации сывороточных иммуноглобулинов основных классов (IgM, IgG.lgA).

Определение относительного и абсолютного числа лейкоцитов и лимфоцитов проводили в соответствии со стандартными методиками (Меньшиков В.В. и др., 1987; Симонян Г.А, Хисамутдинов Ф.Ф., 1995). Фракцию лимфоцитов получали методом разделения форменных элементов на градиенте плотности фиколл-гипака (Histopague "Sigma", США). Перед использованием суспензии лимфоцитов определяли их жизнеспособность по окраске суправитальными красителями (трипан-эозин) В реакциях использовали суспензию лимфоцитов с процентом погибших клеток не более 3% (Меньшиков В В и др , 1987).

Для определения относительного и абсолютного количества Т- и В- популяии^ лимфоцитов применили два метода'

1) разделение лимфоцитов на поверхности пластика, нагруженного антителами к иммуноглобулинам ("пэннинг");

2) иммунологическое фенотипирование популяций лимфоцитов с помощью панели моноклональных антител к дифференцировочным антигенам клеток в реакции непрямой иммунофлуоресценции (нРИФ)

В основу метода "пэннинг" положена способность поверхности полистирола адсорбировать белки, в частности, антитела с частичным сохранением антигенсвязывающей активности (Мейсон Д и др , 1990).

Фракционирование лимфоцитов проводили в соответствии с методическими рекомендациями Эрнст Л.К. с соавт. (1998) следующим образом: стерильные пластиковые чашки Петри диаметром 40 мм заполняли на 1/3 объема раствором специфических антисывороток к иммуноглобулинам (IgM, IgG) крупного рогатого скота (производство ВИЭВ им Я Р. Коваленко) После инкубации в течение 1 часа при комнатной температуре излишки антисыворотки удаляли, а чашки Петри осторожно промывали фосфатно-солевым раствором (ФСР) pH 7,4 Для снижения неспецифической адгезии клеток, в каждую чашку вносили по 5 мл ФСР с 0,2% бычьим сывороточным альбумином (БСА) и оставляли на 30 мин. при комнатной температуре В подготовленные чашки Петри наслаивали суспензию лимфоцитов, полученную из 1 мл крови в объеме, равном ранее внесенной антисыворотки против иммуноглобулинов. Инкубировали при комнатной температуре в течении 1часа, осторожно покачивая чашки через каждые 15 мин "Неприлипшие" к поверхности чашки клетки осторожно смывали ФСР в центрифужные пробирки (отрицательная селекция) Подсчет клеток осуществлялся на световом микроскопе. "Прилипшие" к пластику клетки, трижды промывали охлажденным ФСР с 0,2% БСА Для уменьшения прочности связывания анти-lg с Ig клеточной поверхности, в каждую чашку добавляли по 4 мл. 10% нормальной сыворотки афалины в ФСР и инкубировали в течение 30 мин при t 37 С Антиген-позитивные к Ig клетки, зафиксированные на поверхности чашек Петри, смывали энергичным пипетированием с ФСР и собирали в центрифужные пробирки Чистоту снятия фиксированных клеток с поверхности чашек контролировали под микроскопом (об. 8Х, 20Х; ок 7Х). Подсчитывали количество снятых клеток с помощью камеры Горяева в 100 малых квадратах. Определение относительного количества антиген-негативных клеток ("Ar "№"), состоящих преимущественно из Т+0 к/шток и антиген-позитивных клеток ("Аг+кл") или Вклеток проводили по формулам (Эрнст Л К. и др., 1998).

Иммунофенотипирование клеток в реакции непрямой иммунофлуоресценции (нРИФ) осуществлялось с помощью моноклональных антител (МКА) направленных к некоторым дифференцировочным антигенам лимфоцитов афалин: к зрелым клеткам Т- лимфоидного ряда: UCD-F21C (предполагаемый гомолог CD2 человека), TR 1-204.. 33 (предполагаемый гомолог CD4/Txennepbl человека) и зрелым клеткам В- лимфоидного ряда UCD::F21F.3Sup (предполагаемый гомолог CD21 человека) (МКА были любезно предоставлены Dr Jeffrey L Stott (University of California, Davis, USA), а также Dr Tracy A Romano (The Scripp research Institute La Jolla, California, USA).

Поверхностные антигены клеток исследовали в микролуночной модификации (Новикова М.С., 1990) следующим образом:

на 8ми - луночных стеклянных слайдах "Flow" (USA), после их обработки р-ром поли-Ьлизина, вносили в микролунки суспензию отмытых клеток по 20 мкл (4-5 х 108 кл/мл), после чего инкубировали в увлажненной камере в течение 30 мин для прочного связывания клеток с поверхностью микролунки Затем в каждую лунку

вносили по 20 мкл МКА, разведенных в ФСР с добавлением 10% сыворотки эмбрионов телят, 1% бычьего сывороточного альбумина и 0,2% №N3. Реакцию ставили на льду. Через 30 мин после 2-х кратного отмывания клеток, в лунки добавляли по 20мкл анти-мышиных ФИТЦ-меченых антител ("Сорбент", Россия) в разведении 1 80 с последующей 30-минутной экспозицией Учет реакции проводили на люминесцентном микроскопе с фазово-контрастным конденсором.

Определение показателей фагоцитарной активности лейкоцитов проводили в соответствии с методическими указаниями (Емельяненко П.А. и др., 1980, Симонян ГА , Хисамутдинов Ф Ф. 1995; Потемкина Е.Е и др , 2003; Furth R. Van et al, 1978) К 1 мл цельной периферической крови с антикоагулянтом КЗЕ EDTA КЗ добавляли 0,5 мл взвеси суточной агаровой культуры "тест-микроба", содержащей 1 млрд. микробных тел в 1 мл стерильного 0,9% -ного р-ра хлорида натрия (NaCI) В качестве "тест-микроба" использовали суточную агаровую культуру стафилококка из американской коллекции бактериологических штаммов (American Typical Cultural Collection - АТСС) - Staphylococcus aureus № 25923 ("Diccenson", USA) Инкубировали в термостате при температуре 37,0оС в течение 30 мин Для улучшения условий контакта бактерий с лейкоцитами, через каждые 10 мин содержимое пробирок аккуратно перемешивали После завершения инкубации содержимое пробирки перемешивали, после чего готовили мазки Высушенные мазки фиксировали метанолом в течение 20 мин. и окрашивали по Романовскому-Гимза, для учета поглотительной (захватывающей) способности фагоцитирующих лейкоцитов. Для учета переваривающей способности лейкоцитов, к содержимому пробирок добавляли 4 мл стерильного, охлажденного 0,9% р-ра NaCI После перемешивания содержимое пробирки центрифугировали в течение 5-10 мин при 1500 об/мин и образовавшийся осадок отмывали еще дважды. Поверхностный лейкоцитарный слой отмытого осадка переносили на чашки Петри с мясо-пептонным агаром (МПА), предварительно подсушенным в течение 2 ч. в термостате, и в стерильных условиях шпателем Дригальского размазывали лейкоцитарный слой по поверхности агара Сразу после диффундирования жидкости в агар, чашки Петри помещали в термостат и инкубировали при 37,0°с в течение 1,5 часов Готовили мазки-отпечатки, прикасаясь к нанесенным на агар лейкоцитам слабо подогретым предметным стеклом. Высушенные мазки-отпечатки фиксировали метанолом в течение 20 мин и окрашивали по Романовскому-Гимза Микроскопия проводилась с использованием иммерсионной системы при увеличении (об 90Х, ок. 15Х) В мазках подсчитывали 100 нейтрофилов, 50 эозинофилов и 25 моноцитов, а также количество захваченных ими бактерий с одновременным учетом числа содержащихся в каждом живых и переваренных тест-микробов.

Захватывающую способность фагоцитирующих лейкоцитов периферической крови у афалины выражали двумя показателями' процентом фагоцитоза (ПФ) (процентное отношение лейкоцитов, захвативших "тест-микроб" к общему числу подсчитанных фагоцитов) и фагоцитарным индексом (ФИ) (среднее количество бактерий, захваченных одним лейкоцитом (с учетом "нулевых клеток", т е не захвативших "тест-микроб")) Переваривающую способность лейкоцитов выражали индексом завершенности фагоцитоза, т е показателем отношения числа переваривающихся микробов к числу всех фагоцитированных Расчет всех показателей фагоцитарной активности лейкоцитов проводили в соответствии с методическими указаниями Емельяненко П А с соавт (1980) Определение относительного содержания сывороточных иммуноглобулинов, классов G и М В связи с отсутствием коммерческих специфических гипериммунных антисывороток к иммуноглобулинам афалины, мы были вынуждены применить коммерческие антисыворотки к иммуноглобулинам

человека для того, чтобы исследовать содержание сывороточных иммуноглобулинов у обследуемых афалин Возможность применения антисывороток к иммуноглобулинам человека для исследования содержания сывороточных иммуноглобулинов у других видов млекопитающих была доказана ранее (Чернохвостова ЕВ и др , 1978; Купер ЭЛ, 1980; Люблинская M. М, Алешкин В А., 1984). Иммуноглобулины классов G, M и А изучали методами иммуноэлектрофореза (ИЭФ) и радиальной иммунодиффузии в геле (РИД) с помощью соответствующих специфических антисывороток и поливалентной антисыворотки ко всем классам сывороточных иммуноглобулинов человека

Иммуноэлектрофорез сывороток афалин с антисыворотками к IgG(y), IgM(p) и IgA(a) человека (производство "ИмБио" г Нижний Новгород) проводили в соответствии с методическими указаниями Е В Чернохвостовой и Г П Германа (1984) Результаты реакции показали, что только антисыворотки к IgG(y) и lgM((j) человека давали линии преципитации с исследуемыми сыворотками Поэтому, в РИД были использованы только антисыворотки к IgG(y) и IgM(p) человека (без IgA(a)).

Относительное содержание сывороточных иммуноглобулинов, классов G и М, определяли с помощью метода радиальной иммунодиффузии в геле по Манчини (РИД) в соответствии с методическими рекомендациями Е В Чернохвостовой и Г.П. Германа (1984). Для определения иммуноглобулинов готовили смесь, которая включала, антисыворотку к IgG (у) или IgM(p) человека (производство "ИмБио" г Нижний Новгород), веронал-мединаловый буфер, а также расплавленную и охлажденную до t 56оС 2% агарозу Смесь быстро выливали в пространство между двумя стеклами размерами 9x12 см и закрепляли пластины зажимами После застывания геля снимали зажимы, рамку, "гидрофобную" пластину, после чего в геле пробивали 48 лунок диаметром до 3 мм Из контрольного "пула"(смесь сывороток от 10 афалин из 12 в контрольной группе №8) готовили три разведения (1:2, 1'4, 1:8) для построения калибровочной кривой В качестве контрольного "пула" или рабочего стандарта использовали смесь равных объемов цельных сывороток, полученных от десяти клинически здоровых, адаптированных к неволе афалин (из контрольной группы 8) Все образцы испытуемых сывороток микрошприцем в объеме 1 мкл вносили в лунки остальных рядов Далее пластины помещали во влажную камеру и инкубировали одни сутки для IgG и двое суток для IgM После инкубации гель отмывали от несвязавшихся белков гипертоническим раствором хлорида натрия, после чего окрашивали, помещая пластину на 30-40 мин в 0,1% раствор амидо-черного В дальнейшем пластину отмывали 7% - ным раствором уксусной кислоты с целью удаления несвязавшегося красителя для последующего ее высушивания На окрашенных и высушенных пластинах измеряли диаметр колец преципитации с помощью линейки Behring-Werke, после чего сравнивали диаметры колец преципитации, полученные для испытуемых образцов с диаметрами колец преципитации, полученными для разной концентрации контрольного "пула" Вычисляли относительное содержание сывороточных иммуноглобулинов классов G и M у афалины по отношению к размерам колец преципитации контрольного "пула" в %

Статистическая обработка данных Для расчета статистической значимости различий между группами были применены параметрический критерий Стьюдента и непараметрический U - критерий Вилкоксона - Манна - Уитш для несвязанных величин (Гублер Е В , 1978). Статистическая обработка данных и построение диаграмм проводились с помощью программы Microsoft Excel (Сергиенко В.И , Бондарева ИБ, 2001), а также статистического пакета "Статистика" Статистический анализ данных был проведен совместно со ст н с Э Г Гемджяном, лаб. биостатистики ГУ ГНЦ РАМН.

2.3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.3.1. Количественный и видовой состав Гр "+" кокковой микрофлоры ВДП у афалины на разных сроках адаптации к неволе

Рядом исследователей (Колесса О.В , 1986; Романов В В , 1991Ь; Сыкало А И., 1982) было показано, что в 50 % случаев основной причиной гибели афалин при адаптации к условиям неволи являются инфекционные заболевания бактериальной этиологии Эти наблюдения дают основание предполагать, что одним из основных лимитирующих факторов ноогенной среды обитания, определяющим выживание афалины в условиях неволи, является патогенная бактериальная микрофлора В 80% случаев бактериальные инфекции у афалин в условиях неволи вызывают Гр "+" кокки (стафилококки и стрептококки)( Колесса О.В , 1986; УагаИо Р. Е. е( а!., 1988). Поэтому в данной работе было исследовано количественное и видовое соотношение ВДП именно этих микроорганизмов Результаты микробиологических исследований представлены на Рис 1

Группы афалин по срокам адаптации

■ Грам "+" кокковая микрофлора ВДП, в % (за 100% взята вся выделенная от афалин микрофлора)

Рисунок 1 Относительное количество Гр "+" кокковой микрофлоры ВДП у черноморской афалины на разных сроках адаптации к условиям неволи.

При бактериологическом исследовании материала из ВДП у афалин был выделен довольно широкий спектр микроорганизмов, принадлежащих к разным семействам, родам и видам Выделенная Гр"+" кокковая микрофлора была представлена следующими видами: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophytics, Streptococcus pneumoniae и Streptococcus pyogenes Отмечено, что видовой и количественный состав микробных ассоциаций верхних дыхательных путей у афалин различался на разных сроках адаптации к условиям неволи (Рис 1).

В результате проведенных исследований было установлено, что на разных сроках адаптации у афалин в опытных группах: 2, 3, 4, 5, 6 состав микрофлоры статистически значимо (при р < 0,05) отличался по количественным характеристикам как по сравнению с контрольной группой №8, так и по сравнению с группой №1 (период отлова) При сравнении параметров количественного состава Гр"+" кокковой микрофлоры у афалин, полученных в период отлова (группа №1) по сравнению с контрольной группой №8 статистически значимь/ отличий выявлено не было (Рис 1)

Грамположительная кокковая микрофлора ВДП у диких афалин во время отлова (группа 1) была представлена в основном Staphylococcus epidermidis (96,36 + 0, 51%), а также Staphylococcus saprophytics (3,64 + 0,51%). На ранних сроках

адаптации от 2 до 7 недель (группы 2 и 3) доминировал Staphylococcus aureus. Все выделенные изоляты золотистого стафилококка обладали гемолитическими свойствами (ß-гемолиз), отмечалось наличие ферментов плазмокоагулазы и лецитиназы, что является факторами их пагогенности, а также указывает на способность этих бактерий вызывать инфекционные заболевания у адаптирующихся афалин Начиная с 8 недели (группа 4) снижалось общее количество золотистых стафилококков, в то время как количество Staphylococcus epidermidis постепенно возрастало К 10-12 неделям адаптации (группа 5) количество Staphylococcus epidermidis увеличилось до 49,27 %. В группе № 7 (более года адаптации к условиям неволи) Гр "+" кокковая флора была представлена только Staphylococcus epidermidis. Следует отметить, что Staphylococcus epidermidis, изолированные от животных из групп №2 - №6 проявляли гемолитические свойства по отношению к эритроцитам барана (ß-гемолиз), в то время как тот же вид стафилококка, но выделенные от афалин из групп № 1, № 7 и № 8 не обладали гемолитической активностью.

Бактерии рода Streptococcus были представлены видами Streptococcus pyogenes и Streptococcus pneumoniae От афалин группы № 4 патогенные стрептококки выделяли в 37,71% случаев Выделенные от афалин во всех опытных группах бактерии рода Streptococcus обладали гемолитическими свойствами и вирулентностью для белых мышей, что может указывать на способность этих бактерий вызывать инфекционные заболевания у адаптирующихся афалин.

2.3.2. Гематологические показатели у афалины на разных сроках адаптации.

Результаты исследований гематологических показателей периферической крови обследуемых дельфинов представлены в Табл 2 и 3.

Таблица 2. Уровень гемоглобина, скорость оседания эритроцитов, абсолютное

Скорость Абсолютное

Группы Гемоглобин, г/л оседания количество

афалин: эритроцитов эритроцитов,

(СОЭ), мм/час х 109/икл

№1 166,67 + 9,20 2,00 + 0,71 4,047 + 0,055

№2 187,31 + 3,40 10,69* + 4,56 3,956 + 0,139

№3 174,46 + 3,21 10,00* + 1,99 4,036 + 0,110

№4 166,87 + 4,32 7,37* + 1,64 3,710 ± 0,150

№5 173,41 + 6,30 18,64* + 9,84 3,593 + 0,180

№6 182,00+ 8,33 15,00* + 9,25 3,510*+ 0,130

№7 177,80+ 5,37 4,47 + 1,50 4,193 + 0,150

№ 8 (Контрольная) 174,43 + 5,21 2,71 ± 1,08 4,073 + 0,130

* различия по сравнению с контрольной группой (№8) статистически значимы при р < 0,05

Как видно из Табл. 2, уровень гемоглобина и абсолютное количество эритроцитов во всех группах афалин на разных сроках адаптации не имели существенных отличий от данных показателей у клинически здоровых, адаптированных к неволе особей в контрольной группе № 8 Однако, анализ динамики показателей скорости оседания эритроцитов у афалин (Табл.2) показал, что в период от 2 до 14 недель адаптации (группы 2-6) данные показатели были статистически значимо выше (р < 0,05) как по сравнению с показателями СОЭ у клинически здоровых, адаптированных к условиям неволи особей в контрольной группе №8, так и по сравнению с показателями у афалин, обследованных во время отлова (группа 1) При сравнении параметров СОЭ у афалин, которые находились в условиях неволи более года (группа 7) как с

группой отлова (группа 1), так и с контрольной группой адаптированных, клинически здоровых животных (группа 8), статистически значимых отличий выявлено не было При сравнении данных показателей у афалин, которых обследовали в период отлова (группа 1) с показателями СОЭ у животных из контрольной группы №8, статистически значимых отличий также выявлено не было.

Таблица 3. Абсолютное количество лейкоцитов, лимфоцитов и лейкоцитарная формула ПК у черноморской афалины на разных сроках адаптации (X ±т).

г р АБС-НОЕ АБС-НОЕ Лейкоцитарная д Ьормула (в %)

У кол-во кол-во НЕЙТРОФИЛЫ м

II э Б л Д

П ЛЕЙКО ЛИМФО 0 А о и Р

ы ю ПАЛОЧ СЕГМЕН 3 3 н м У

ЩЛОВ, цитов, н ко Ю и О 0 ф г

Л Ы ЯДЕР ЯДЕРНЫР Н ф Ц 0 и

ф А Х103/мкл Х103/мкл Е НЫЕ ф л т 2 Е

л и ы ы т

И л м

н ы

Хи 1 8,917 1, 352* 0 1,33 58,67 23,33 0 2,00 14,67* 0

+ 0,955 + 0,465 1 + 0,41 + 8,04 + 6,18 + 0 + 4,08

№2 10,219* 0,794* 0,38* 4,08* 59,85 21,31 0 4,69* 8,54* 1,15*

+ 0,989 + 0,090 +0,15 + 1,06 + 2,46 + 1,89 +0,57 + 1,36 + 0,26

№3 9,292 1,150* 0 3,07 55,85 23,00 0 4,23* 13,31* 0,54*

+ 0,738 + 0,171 + 0,74 + 2,40 + 2,09 +0,71 + 2,21 + 0,19

Ла 4 10,806* 1, 774 0 2,12 49,00 28,88 0 2,50 17,38* 0,12*

+ 0, 941 + 0,190 + 0,65 + 2,20 + 1,04 +0,40 + 2,49 + 0,13

№5 11,043* 1,595* 0,43* 2,57 56,14 22,86 0 2,57 15,14* 0,29*

+1, 778 + 0, 220 +0,22 + 0,62 + 1,12 + 0,60 +0,57 + 1,75 + 0,20

№6 12,193* 1,654* 0,86* 4,28* 55,29 20,00 0 4,43* 14,86* 0,28*

+ 2, 972 + 0, 213 +0,28 + 1,59 1- 4,16 + 3,06 +0,99 + 1,55 + 0,20

№7 9, 850 2,183 0,20* 1,87 51,40 21,00 0 2,73 22,80 0

+1,003 + 0,207 +0,11 + 0,39 + 1,30 + 1,19 +0,36 И,15

№8 8,489 2,118 0 1,57 50,01 21,14 0 2,21 25.07 0

±0,427 ± 0,163 + 0,34 + 1,75 + 1,20 10,19 +1,63

* различия по сравнению с контрольной группой (№8) статистически значимы при р < 0,05

Анализ динамики показателей общего количества лейкоцитов и лимфоцитов ПК (Табл. 3) у афалин показал, что в процессе адаптации у животных данные показатели изменялись на разных сроках пребывания в условиях неволи. Выявлены статистически значимые различия (р < 0,05) по параметрам абсолютных чисел лейкоцитов ПК в группах № 2, 4, 5, 6 по сравнению с контрольной группой адаптированных к условиям неволи, клинически здоровых животных (группа 8). При этом уже в период отлова (группа 1) у афалин наблюдалась тенденция к увеличению общего количества лейкоцитов, которая имела продолжение и к 2 - 3 неделям адаптации (группа 2) у животных отмечали умеренный лейкоцитоз При этом уже в период отлова (группа 1) у афалин наблюдались статистически значимые низкие значения показателей абсолютного (р = 0,04) и относительного (р = 0,01) количества лимфоцитов ПК по сравнению с контрольной группой №8. В группе особей, обследованных в период от 2 до 3 недель адаптации (группа 2) было отмечено, что показатели абсолютного и относительного количества лимфоцитов были статистически значимо ниже (р < 0,05) данных параметров как по сравнению с контрольной группой (группа 8), так и по сравнению с периодом отлова (группа 1) Необходимо отметить, что в этой группе (2-3 недели адаптации) у всех животных были отмечены самые низкие

значения показателей абсолютного и относительного количества лимфоцитов ПК по сравнению со всеми группами афалин В группах особей, обследованных на 8 - 9 нед. адаптации (группа 4), 10 - 12 нед. (группа 5) и 13 - 14 нед. адаптации (группа 6) общее количество лейкоцитов было статистически значимо выше (р < 0,05) по сравнению с контрольной группой №8. При этом наблюдали, что показатели относительного количества лимфоцитов ПК у афалин за период от 8 до 14 недель адаптации (группы 4-6) были статистически значимо ниже (р < 0,05) при сравнении с контрольной группой №8, а при сравнении с периодом отлова (группа 1) статистически значимо не отличались Между группами N87 и №8 по вышеуказанным параметрам статистически значимых различий выявлено не было.

Изменения в ПК у афалин на разных сроках адаптации выявлялись и в лейкоформуле (Табл. 3). Это проявлялось в увеличении молодых форм нейтрофилов (сдвиг влево до юных форм), умеренного моноцитоза, а также появления в ПК переходных форм моноцитов на ранних сроках адаптации (2-3 недели после отлова - группа 2). На более поздних сроках адаптации состав лейкоформулы несколько восстанавливался, приближаясь к показателям в контрольной группе №8 Однако с 5 по 14 нед. адаптации (группы 3 - 6) в ПК у афалин присутствовали переходные формы моноцитов, а также с 13 до 14 нед. (группа 6) отмечали повышение относительного количества моноцитов и палочкоядерных нейтрофилов

Таким образом, в период адаптации у черноморской афалины были выявлены определенные изменения со стороны гематологических показателей.

2.3.3. Показатели иммунного статуса у афалины на разных сроках адаптации к условиям неволи

2.3.3.1. Относительное и абсолютное кол-ва Т- и В- лимфоцитов

Содержание Т- и В- лимфоцитов, определяемое методом "пэннинг".

В связи с отсутствием до последнего времени реагентов и методов, позволяющих идентифицировать Т- и В- популяции лимфоцитов у афалин по наличию дифференцировочных антигенов, нами первоначально был использован метод, основанный на иммунологическом разделении мононуклеарных клеток ПК по связыванию с поверхностью пластика, нагруженного антителами к иммуноглобулинам. В результате были получены данные по содержанию антиген-негативных клеток, относящихся условно к зрелым "Т- лимфоцитам", и антиген-позитивных клеток, определяемых условно как "В- лимфоциты" (Рис 2, 3)

г?

1 2 3 4 5 6 7 8 Группы афалин по срокам адаптации

- • относительное кол-во "Аг+" популяции лимфоцитов (В-

лимфоцитов), % ■ • - абсолютное кол-во 'Аг+" популяции лимфоцитов (В-лимфоцитов), тыс/мкл

Рисунок 2 Относительное и абсолютное содержание Аг "+" популяции лимфоцитов ПК ("В - лимфоцитов") у афалины на разных сроках адаптации к неволе (показатели в разных группах для наглядности соединены условно пунктирной линией)

Анализ показателей абсолютного и относительного содержания "В-" клеточных популяций лимфоцитов (Аг"+-клетки) ПК у афалин (Рис. 2) выявил статистически значимое снижение (р < 0,05) абсолютного и относительного количества Аг+ ("В") лимфоцитов в период от 2 до 14 недель адаптации (группы 2 - 6) по сравнению с контрольной группой №8. При этом у афалин, которые находились в условиях неволи более года (группа 7) при сравнении данных показателей с контрольной группой адаптированных, клинически здоровых животных (группа 8) статистически значимых отличий выявлено не было.

100,00

1 2 3 4 5 8 7 8 Группы афалин по срокам адаптации

- • ■■ ■ • относительное кол-во "Аг-" популяции лимфоцитов (Т-

лимфоцитов), %

- • ♦ - - абсолютноекол-во "Аг-" популяции лимфоцитов (Т-

лимфоцитов),тыс/мкл

Рисунок 3 Относительное и абсолютное содержание Аг " популяции лимфоцитов ПК (преимущественно "Т - лимфоцитов") у афалины на разных сроках адаптации к неволе (показатели в разных группах для наглядности соединены условно пунктирной линией).

Анализ абсолютного и относительного содержания "Т-" клеточной популяции лимфоцитов (Аг" -клетки) ПК у афалин (Рис 3) выявил статистически значимо низкие значения (р < 0,05) по сравнению с контрольной группой №8 в абсолютном содержании Аг" клеток (Т- лимфоцитов) от периода отлова до 7 недель адаптации (группы 1-3) При этом показатели относительного количества Аг""" ("Т") - лимфоцитов на всех сроках адаптации были без существенных отклонений от показателей у клинически здоровых, адаптированных афалин (группа 8)

Относительный состав популяций лимфоцитов, определенный в реакции непрямой иммунофлуоресценции (нРИФ) с помощью МКА.

Учитывая, что моноклональные антитела (МКА) к дифференцировочным антигенам лимфоцитов афалины были получены лишь в последние годы американскими учеными, у нас появилась возможность провести иммунологическое тестирование мононуклеарных клеток ПК в нРИФ у ограниченного количества особей в выше указанной панели МКА. При этом у двух афалин был проведен мониторинг показателей Т- и В- популяций лимфоцитов 3х-кратно (на Зеи неделе адаптации, 14ой нед и 18ой нед ) В качестве групп сравнения первоначально в этом методе были исследованы афалины, которые находились на длительных сроках пребывания в неволе (не менее года), а также особи контрольной группы, те. клинически здоровые, адаптированные к неволе афалины Полученные данные по экспрессии изучаемых дифференцировочных антигенов, характерных для зрелых Т-, Тхепп- и В-клеток лимфопоэза, представлены в таблице 4.

Таблица 4. Относительное количество Т- и В- популяций лимфоцитов в ПК у

афалины, определяемое в нРИФ с помощью моноклональных антител (X + т).

Сроки адаптации афалин

МКА (моноклональные антитела) Маркер лимфо цитов № афали ны 3 нед. 14 нед. 18 нед. более года к неволе (п* «= 9) Контроль ная группа** (п ~ 9)

иСО-К21С+ Т зрелые (Гомолог челОЕ. С021 1 2 64,00 65,00 56,00 55,00 44,00 53,00 65,11 ± 11,54 66,67 + 9,38

ТЯ 1-204...33* Тхелперы (Гомолог челов. С1)-Г| 1 2 22,00 23,00 42,00 23,00 40,00 41,00 37,89 ±6,62 38,78 ±6,26

иСО::Г21Р.38ир+ ® зрелые (Гомолог челов. СП21) 1 2 3, 00 5, 00 1,00 1,00 33, 00 37, 00 21,78 + 5,56 21,89 + 5,53

*п - количество афалин в группе

**в контрольную группу вошли 9 из 15 адаптированных к условиям неволи взрослых афалин из контрольной группы № 8.

Как видно из Табл. 4, динамика показателей содержания Т-, Тхелп- и В- популяций лимфоцитов у обеих обследованных афалин в период от 3 до 18 недель адаптации к неволе сходна Отмечено некоторое снижение Т- лимфоцитов при нормализации Талеров- При этом, количество В- лимфоцитов, резко пониженное

на 3 неделе адаптации, к 18 неделе адаптации превышает показатели у афалин в контрольной группе, а также у особей, которые более года находились в условиях неволи

Относительного содержание Т -, ТхеЛп- и В- клеточных популяций лимфоцитов периферической крови у группы афалин, которые находились в условиях неволи более года, практически не отличались от контрольной группы адаптированных, клинически здоровых особей

Таким образом, у черноморской афалины в процессе адаптации была выявлена постепенная нормализация относительного содержания Т -, ТхеЛп- и В-клеточных популяций лимфоцитов в периферической крови, которая отмечалась в обоих примененных методах

2.3.3.2. Показатели фагоцитарной активности лейкоцитов

Фагоцитарную активность лейкоцитов ПК у обследуемых афалин оценивали по трем показателям "процент фагоцитоза", "фагоцитарный индекс", "индекс завершенности фагоцитоза" (Емельяненко ПА и др, 1980) Результаты исследований показателей "процента фагоцитоза" в сопоставлении с общим количеством Гр"+" кокковой микрофлоры у афалин на разных сроках адаптации к неволе представлены на рисунке 4

Группы афалин по срокам адаптации

О Нейтрофилы, в % ® Моноциты, в %

□ Эозинофилы, в % й Переходные формы моноцитов, в %

И Гр "+" кокковая микрофлора ВДП

Рисунок 4 "Процент фагоцитоза" лейкоцитов в сопоставлении с общим количеством Гр "+" кокковой микрофлоры ВДП у афалины на разных сроках адаптации к условиям неволи.

Анализ полученных данных фагоцитарной активности лейкоцитов у афалин выявил статистически значимо низкие значения (р < 0,05) по сравнению с контрольной группой №8 среди показателей "процента фагоцитоза"(Рис 4), "фагоцитарного индекса" и "индекса завершенности фагоцитоза" у нейтрофилов, моноцитов и эозинофилов ПК в период от 2 до 7 недель адаптации (группы 2-3) В ходе дальнейшей адаптации наблюдалось постепенное возрастание всех показателей фагоцитарной активности у нейтрофилов, моноцитов и эозинофилов ПК

Кроме того, впервые в эти сроки (группы 2 - 3) у афалин наблюдалось появление в ПК форм моноцитов, переходных к тканевым формам - макрофагам, которые обладали высокой фагоцитирующей активностью Вилем Гуле (1963)

описал аналогичные клетки у человека и отмечал, что их появление в ПК может указывать на развитие острого воспалительного процесса. В то же время в контрольной группе № 8, в период отлова (группа 1), а также у особей, которые более года находились в условиях неволи (группа 7) переходные формы моноцитов в ПК у афалин полностью отсутствовали При этом количество Гр"+" кокковой микрофлоры ВДП находилось на самом низком уровне Кроме того, на графике (Рис. 4) можно видеть, что именно в эти сроки (от 2 до 7 нед) высокая фагоцитарная активность переходных форм моноцитов совпадала с наивысшими значениями Гр"+" кокковой микрофлоры ВДП (Рис 1,4) При этом фагоцитарная активность других фагоцитирующих лейкоцитов ПК в этот период была понижена Это может указывать на возможную компенсаторную иммунную функцию переходных форм моноцитов у афалины Также было отмечено, что эозинофилы принимают активное участие 8 фагоцитозе у афалины

2.3.3.3. Относительное содержание иммуноглобулинов классов в и М в сыворотке ПК.

Показатели относительного уровня сывороточных иммуноглобулинов классов С и М у афалин на разных сроках адаптации к условиям неволи представлены на рисунке 5.

1 2 3 4 5 6 7 8 Группы афалин по срокам адаптации

1___||£|(3,В%

- -А- - Гр"+" кокковая микрофлора ВДП, в %

Рисунок 5 Относительное содержание сывороточных ТцС и ГцМ в сопоставлении с общим количеством Гр "+'* кокковой микрофлоры ВДП у афалины на разных сроках адаптации к условиям неволи (показатели в разных группах для наглядности соединены условно пунктирной линией).

Как видно из представленных данных, в период от 5 до 14 недель адаптации (группы 3-6) у афалин наблюдался заметный рост относительного уровня 1дО и 1дМ по сравнению с контрольной группой №8 Подобный характер изменения содержания иммуноглобулинов б и М согласуется по срокам с развитием гуморального иммунного ответа на бактериальную инфекцию у млекопитающих. У афалин, обследованных в период отлова (Группа 1) от 2 до 3 недель адаптации (Группа 2) и после года содержания в неволе (Группа 7) по сравнению с контрольной группой №8 статистически значимых отличий не выявлено

2.3.4. Мониторинг иммунологических показателей у выборочного

количества афалин в процессе адаптации к условиям неволи.

Анализ полученных данных при мониторинге иммунологических показателей у выборочного количества афалин не выявил существенных отличий при сравнении с динамикой показателей в основных опытных группах.

3. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

В настоящей работе представлено исследование адаптационных возможностей иммунной системы у китообразных, на примере черноморской афалины (Tursiops truncatus ponticus Barabash, 1940), при изменении условий среды обитания Для оценки степени адаптированности афалины к условиям жизни в неволе был применен эколого-иммунологический подход, основанный на комплексной оценке показателей иммунного статуса, гематологических и микробиологических параметров у особей афалины на разных сроках адаптации к неволе

Как было показано рядом авторов (Колесса О.В., 1986; Сыкало А. И., 1982; Романов В.В., 1991b) основной причиной гибели афалины (до 50%) в период адаптации к неволе являются бактериальные инфекции В связи с этим можно сказать, что основным лимитирующим биотическим фактором среды, который определяет выживаемость афалины в процессе адаптации к условиям жизни в неволе, является бактериальная микрофлора ноогенного происхождения, с которой афалина не сталкивается в естественной среде обитания

Хорошо известно, что одной из основных функцией иммунной системы у высокоорганизованных животных является защита от внедрения патогенов различной этиологии, направленная на поддержание гомеостаза организма (Ройт А и др , 2000) Поэтому, в настоящей работе было дополнительно изучено биотическое взаимодействие в системе "паразит - хозяин", в качестве теста на эффективность защитных функций иммунной системы, а также для выявления адаптивных особенностей механизмов иммунологической реактивности к качественному и количественному изменению биотического фактора среды обитания у конкретного вида.

В 80% случаев бактериальные инфекции у афалины в условиях неволи вызывают Грамположительные кокки (стафилококки и стрептококки)(Колесса О В , 1986; Varaldo P.E. et al, 1988). Поэтому в данном исследовании, в качестве биотического фактора среды, мы считали оправданным исследовать количественный и видовой состав именно этих микроорганизмов

Как уже было отмечено выше, по данным ряда авторов (Колеса О.В , 1986, Сыкало А И , 1982, Романов В В , 1991b) на ранних сроках адаптации к условиям жизни в неволе происходит элиминация до 50 % особей афалины Согласно наблюдениям авторов, самый высокий процент гибели животных происходит в первый и второй месяцы адаптации При этом отбор идет, по-видимому, по биотическому фактору среды, а именно по степени устойчивости животных к бактериальным инфекциям ноогенного происхождения в условиях неволи Вероятнее всего это и является результатом прямой индивидуальной элиминации афалины биотическими факторами среды, в соответствии с классификацией, предложенной академиком И И Шмальгаузеном (1940). Таким образом, можно предположить, что возможность успешной адаптации афалины к жизни в условиях неволи будет непосредственно зависеть от индивидуального уровня иммунологической защиты организма животного против патогенных факторов различной этиологии (бактерии, вирусы, грибы и др ), присутствующих в ноогенной среде обитания

В настоящей работе обследованию подвергались только выжившие в неволе особи черноморской афалины Таким образом, будет правомерным полагать, что у этих особей уровень иммунной реактивности организма оказался достаточно высоким.

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что иммунологические, гематологические и микробиологические параметры статистически значимо различались на разных стадиях адаптации афалины к условиям неволи (различия показателей в опытных группах, по сравнению с контрольной, были значимы при р < 0,05) В связи с этим можно предположить, что показатели иммунного статуса могут быть индикатором степени адаптированности афалины к условиям неволи, а также могут служить прогностическим признаком для оценки дальнейшего течения и исхода адаптационного процесса.

Проведенные исследования показали, каким образом произошли адаптивные изменения в пределах существующей видоспецифичной нормы реакции иммунной системы у черноморской афалины При сопоставлении иммунологических, гематологических и микробиологических параметров было отмечено, что в период от 2 до 7 недель адаптации (группы 2 и 3) у животных наблюдалось снижение относительного и абсолютного количества лимфоцитов ПК при абсолютном лейкоцитозе с одновременным уменьшением Т- и В- клеток, повышение скорости оседания эритроцитов, увеличение процента молодых клеток в лейкоформуле (сдвиг влево до юных форм), подавление фагоцитарной активности нейтрофилов, моноцитов, эозинофилов с одновременным появлением переходных форм моноцитов, обладающих высокой фагоцитарной активностью При этом отмечали резкое повышение количества патогенной Грамположительной кокковой микрофлоры в верхних дыхательных путях у афалины

Полученные данные позволяют предположить, что подобное взаимосвязанное изменение этих показателей могут указывать на наличие иммунного ответа организма "хозяина" - дельфина на внедрение "паразита" - Грамположительной кокковой флоры в виде развития острого воспалительного процесса и активизации функций клеточного и гуморального звеньев иммунитета

При этом необходимо отметить, что в период от 2 до 7 недель адаптации (группы 2 и 3) у афалины наблюдались признаки иммунологической недостаточности Так в этот период у животных отмечались низкие значения показателей абсолютного и относительного количества лимфоцитов в периферической крови по сравнению с адаптированными, клинически здоровыми животными в контрольной группе №8, а также данными показателями для клинически здоровых афалин А Г МисюрыиЛ.Н Богдановой (1997) Кроме того, в этот период у животных отмечены низкие показатели содержания Т- и В-субпопуляций лимфоцитов а также низкие показатели фагоцитарной активности нейтрофилов, моноцитов и эозинофилов в периферической крови по сравнению с адаптированными, клинически здоровыми особями в контрольной группе №8 Тем не менее, необходимо указать, что колебания показателей UCD-F21C* (Т-) клеточной популяции лимфоцитов у всех обследованных особей черноморской афалины находились в пределах диапазона значений, полученных Guise de с коллегами (2002) при исследовании атлантической афалины (44, 78% + 19,95). По всей видимости, в данный период элиминируются афалины с наиболее выраженными признаками иммунологической недостаточности

Полученные в данной работе результаты свидетельствуют о том, что иммунологические, гематологические и микробиологические параметры статистически значимо различались на разных стадиях адаптации дельфинов к условиям неволи (различия многих показателей в опытных группах, по сравнению

с контрольной, были статистически значимы при р < 0,05) В связи с этим можно предположить, что показатели иммунного статуса могут быть индикатором степени адаптированности афалин к условиям неволи, а также могут служить прогностическим признаком для оценки дальнейшего течения и исхода адаптационного процесса.

Tracy A. Romano с коллегами (2002) в своей работе- "Immune response, stress, and environment: implications for cetaceans" показали, что иммунная и нервная системы у китообразных очень тесно взаимосвязаны Кроме того, авторы отметили, что стресс-реакция любой этиологии может подавлять иммунные функции у афалин Это обстоятельство вполне согласуется с хорошо известным положением, обоснованным Л А Орбели (1934), об адаптационно-трофической роли симпатического отдела вегетативной нервной системы в развитии адаптивных реакций организма у млекопитающих при воздействии стрессорных факторов различной этиологии Регуляторная функция симпатической нервной системы в осуществлении контроля над течением иммунологических процессов обусловлена изменением уровня в периферической крови так называемых "гормонов стресса" или катехоламинов При воздействии стрессорного фактора любой этиологии катехоламины (дофамин, норадреналин и адреналин) оказывают мощное влияние на клеточный метаболизм, стимулируя быстрое развитие иммунного ответа за короткий период времени

По данным ПД. Горизонтова с соавт. (1980), типичная для стресса реакция периферической крови у наземных млекопитающих проявляется в виде выраженного нейтрофилеза и лимфопении с возвращением к исходному уровню через 24 ч после завершения воздействия на организм стрессорного фактора По всей видимости, у афалины при стрессе в результате отлова и первоначального содержания в неволе развивается похожая клиническая картина с изменениями в периферической крови, обусловленная аналогичными механизмами реакции организма на стрессорные воздействия Возможно, длительное воздействие стрессорных факторов на организм афалины может являться причиной развития иммунодефицитного состояния в первые месяцы пребывания в неволе Немаловажную роль играет и состояние инфицированности организма животных, доказанное резким возрастанием патогенной Грамположительной кокковой микрофлоры в первые же недели после отлова

С восьми недель адаптации у животных наблюдали четкую связь между иммунологическими (повышение относительного и абсолютного количества лимфоцитов периферической крови, постепенный рост относительного количества В- лимфоцитов, повышение фагоцитарной активности нейтрофилов, моноцитов и эозинофилов, рост относительного уровня сывороточных иммуноглобулинов, классов M и G) и количеством патогенной "Гр+" кокковой микрофлоры ВДП Похожая взаимосвязь иммунологических и микробиологических показателей сохраняется и на более поздних стадиях адаптационного процесса в группах №№ 5, 6, 7, а также в контрольной группе №8. Выявленные изменения показателей в опытных группах животных можно оценивать, как постепенное восстановление функций иммунной системы у афалины в процессе дальнейшей адаптации.

Особого внимания заслуживает факт, что в "переломные" периоды адаптации (группы 2,3,5,6) у афалины наблюдалось появление в периферической крови форм моноцитов, переходных к тканевым формам моноцитов - макрофагам Эта адаптивная особенность у афалины выявлена в данной работе впервые Аналогичные клетки у человека описал Вилем Гуле (1963) отмечая, что их появление в периферической крови может указывать на развитие острого воспалительного процесса Необходимо подчеркнуть, что самые высокие

показатели фагоцитарной активности переходных форм моноцитов отмечали только на ранних сроках адаптации афалины (группы 2 и 3), тогда как в контрольной группе № 8 и в группе условно адаптированных животных №7, а также во время отлова (группа № 1) переходных форм в периферической крови у афалины не выявлялось совсем. Кроме того, как было выявлено, что изменение показателей процента фагоцитоза переходных форм моноцитов было сопоставимо с динамикой показателей количества Грамположительной кокковой микрофлоры верхних дыхательных путей у афалины в течение всего периода адаптации Более того, следует отметить, что наиболее высокое значение процента фагоцитирующих переходных форм моноцитов наблюдали в период от 2 до 3 недель адаптации животных (группа 2), когда фагоцитарная активность остальных лейкоцитов периферической крови была снижена. По-видимому, это может указывать на возможную компенсаторную иммунную функцию переходных форм моноцитов у афалины.

В работе также было впервые показано, что в фагоцитозе у афалины принимают активное участие эозинофилы В то же время, при исследовании фагоцитарной активности лейкоцитов периферической крови у наземных видов млекопитающих обычно учитывают фагоцитоз только среди нейтрофилов и моноцитов, при этом оценку показателей для эозинофилов не проводят в виду их малого количества в периферической крови (Емельяненко П.А и др, 1980; Потемкина Е Е и др., 2003) Однако рядом авторов (Романов В.В., 1991а, Мес^ау \Л/., Сегаа XК., 1964, 1ЭДдч\гау Э Н , 1972), как и в нашем исследовании было отмечено, что отличительной особенностью афалины является высокий процент эозинофилов в периферической крови (20-25%), по сравнению с большинством других видов наземных млекопитающих (Кондратьев В С , 1988). Высокий процент эозинофилов в периферической крови, в виде верхней границы нормы был отмечен также у маралов - 2 - 28%, и серебристо-черных лисиц - 3 - 20% (Кондратьев В.С. 1988). Важно в связи с этим отметить, что у афалины высокий процент эозинофилов в периферической крови наблюдается постоянно. Необходимо указать, что в ходе нашего исследования во всех опытных группах животных отмечалось более высокое содержание эозинофилов в периферической крови (20,00 % - 28,88 %), по сравнению с данными А.Г. Мисюры и Л.Н Богдановой (1997) (у самцов до 16%, а у самок - до 14%). Тем не менее, ряд авторов приводят данные, которые хорошо согласуются с нашими результатами Так Мес1\гау и Сегаа (1964) при исследовании 6 особей атлантической афалины выявили 25,6 + 8,9 % эозинофилов в лейкоформуле, а также гас1ду/ау (1972) привел результаты обследования 10 самцов и 11 самок атлантической афалины 13 + 9% эозинофилов - для самцов, 15 + 9% эозинофилов - для самок Согласно данным В.В Романова (1991а) процент эозинофилов в лейкоцитарной формуле у клинически здоровых особей черноморской афалин составляет 20,8 ± 0,91 %

Таким образом, активное участие эозинофилов в процессе фагоцитоза у афалины, вносит существенный вклад в реализацию иммунных функций на клеточном уровне у этого вида китообразных. Мы полагаем, что это отличие также можно рассматривать как адаптивную физиологическую особенность афалины В связи с этим считаем целесообразным при исследовании фагоцитоза у афалины проводить оценку параметров фагоцитарной активности не только нейтрофилов и моноцитов, но и эозинофилов.

Суммируя полученные данные по оценке динамики показателей иммунного статуса и общего клинического состояния у афалины в период адаптации к условиям жизни в неволе можно сказать, что процесс адаптации у этого вида китообразных протекал длительно и нестабильно Так, можно было выделить два переломных пика адаптации, при которых наблюдалась сходная взаимосвязанная

перестройка всех иммунологических и гематологических показателей период от 2 до 7 недель адаптации (группы 2 и 3), а также период от 10 до 14 недель адаптации афалин к неволе (группы 5 и 6) В течение года пребывания афалин в условиях неволи (группа 7) иммунологические, гематологические и микробиологические показатели приближаются к данным параметрам в контрольной группе №8 На основании этого можно предположить, что афалинам для полноценной адаптации к условиям жизни в неволе требуется около года

Суммируя вышесказанное, можно сказать, что исследуемые дикие афалины обладали необходимыми предпосылками в организации их иммунной системы, которые позволили им выжить в ноогенной среде обитания при содержании в условиях неволи Заслуживают особого внимания две адаптивные модификации, которые, по всей вероятности, являются проявлением нормы реакции у афалины в критических случаях- 1 - появление в периферической крови и активное участие в фагоцитозе переходных к тканевой форме моноцитов, 2 - активное участие в процессе фагоцитоза эозинофилов Учитывая, что появление переходных форм моноцитов в периферической крови при остром процессе наблюдалось также у человека (Гуле В., 1963), это указывает на то, что такая адаптивная модификационная особенность характерна не только для китообразных, но и для приматов На эффективную иммунологическую реакцию организма у афалины указывает и повышение уровня иммуноглобулинов в и М в сыворотке

Таким образом, в процессе выполнения данной работы были выявлены особенности кроветворной и иммунной систем афалины, обуславливающей ее адаптационные реакции в ответ на влияние биотического фактора условий неволи.

ВЫВОДЫ:

1. В течение периода адаптации к условиям жизни в неволе у черноморской афалины (Тигзюрэ кипсаЮБ ропИсив ВагаЬазЬ, 1940) выявляется повышение инфицированности особей патогенной Грамположительной кокковой микрофлорой (как неблагоприятный биотический фактор) и подавление защитных иммунологических реакций, вызванное, вероятнее всего, стрессом после отлова диких животных из привычной среды обитания

2. Наибольшие изменения со стороны иммунной системы у афалины, выражающиеся в абсолютной и относительной лимфопении, снижении Т -клеточной и, особенно, В - клеточной субпопуляций лимфоцитов, подавлении фагоцитарной активности нейтрофилов и моноцитов при ускоренной СОЭ и абсолютном лейкоцитозе, отмечаются в течение первого месяца адаптации к условиям жизни в неволе. При этом у афалины резко возрастает количество патогенной Грамположительной кокковой микрофлоры верхних дыхательных путей, что может свидетельствовать о развитии в этот период острого воспалительного процесса при наличии иммунологической недостаточности организма у адаптирующихся животных

3. Выявлены особенности иммунологических показателей у афалины, заключающиеся в повышенном содержании в периферической крови эозинофилов, обладающих фагоцитирующей способностью, а также появлении в крови переходных к тканевой форме моноцитов с высокой фагоцитарной активностью.

Резкое повышение фагоцитарной активности у переходных форм моноцитов при снижении фагоцитарных реакций у нейтрофилов и моноцитов в первый месяц адаптации к неволе следует считать особенностью адаптационного характера иммунной системы у афалины.

4. Повышение содержания относительного количества сывороточных иммуноглобулинов (1дЭ и 1дМ) у афалины с 5 - 7 недели адаптации к неволе

согласуется с наличием патогенной Грамположительной кокковой микрофлоры в верхних дыхательных путях, представленной Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophytics, Streptococcus pyogenes и Streptococcus pneumoniae. Это может свидетельствовать о наличии гуморального иммунного ответа у афалины на внедрение патогенных микроорганизмов.

5. Появление компенсаторных иммунологических механизмов, позволяющих пережить неблагоприятные биотические факторы в новых условиях обитания, приводит к постепенной нормализации иммунологических, гематологических и микробиологических показателей, отмечаемых у афалин после 1 года пребывания их в неволе и соответствующих показателям у адаптированных, клинически здоровых животных.

6. Комплексное изучение показателей иммунологического и гематологического статуса у афалины в сочетании с микробиологическими исследованиями на разных сроках пребывания в неволе позволяет оценить степень адаптированности этих животных к измененным биотическим факторам среды

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ПРАКТИЧЕСКОМУ ПРИМЕНЕНИЮ

Предложенный эколого-иммунологический подход для оценки степени влияния среды обитания, основанный на изучении динамики показателей иммунного статуса, может быть применен более широко при исследовании степени адаптированное™ не только у китообразных, но и у других видов морских млекопитающих.

Так, данный подход был успешно применен при исследовании степени адаптированности щенков сивуча (Eumetopias jubatus) в природных условиях на полуострове Камчатка (мыс Козлова), Командорских островах (о Медный), Ямских о-вах и о. Иона.

В связи со значительным сокращением численности сивуча на большей части ареала в начале 1990х этот вид был включен в список редких и исчезающих видов в США и России. В настоящее время изучению этой проблемы уделяется большое внимание. В США была разработана специальная Программа по изучению и восстановлению численности сивуча до уровня безопасного состояния (Recovery Plan for the Steller Sea Lion) В соответствии с этой программой проводятся различные междисциплинарные исследования с целью выяснения причин значительного сокращения численности сивуча

Получен положительный отзыв о практическом применении эколого-иммунологического подхода для оценки состояния здоровья репродуктивной группировки сивуча (Eumetopias jubatus) на Камчатке, Командорских, Ямских о-вах и на о Ионы от Камчатского филиала Тихоокеанского Института Географии ДВО РАН Предварительные данные показали, что подавление иммунной реактивности организма у животных в природных ареалах обитания может стать причиной повышенной восприимчивости к воздействию патогенных факторов различной этиологии (заболеваниям вирусного, бактериального или грибкового характера), что, ведет к увеличению смертности особей и в конечном итоге к общему сокращению численности популяции

Проведенное исследование показало что изучение изменений показателей иммунного статуса животных в связи с особенностями их экологии может оказаться перспективным подходом для оценки степени устойчивости организма к изменениям условий среды обитания.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

I. Соколова О.В Некоторые иммунологические и биохимические показатели у афалины (Tursiops truncatus) при адаптации к условиям жизни в неволе // М ■ ДАН РФ, 2004 т 395. № 4. стр 569-573

2 Соколова О.В Особенности фагоцитоза у афалины (Tursiops truncatus) в период адаптации к условиям жизни в неволе // М. ДАН РФ, 2005 т 403 № 1 стр 138-141.

3 Соколова О.В., Денисенко ТЕ Корреляция показателей фагоцитоза с количественным и видовым соотношением Грамположительной кокковой микрофлоры верхних дыхательных путей у афалины (Tursiops truncatus) в период адаптации к условиям жизни в неволе // М/ Известия Академии Наук, принята к печати, 2006. № 5.

4. Денисенко ТЕ., Соколова О В. Изменение микрофлоры дельфинов -черноморской афалины (Tursiops truncatus) в период адаптации к неволе // В сб научн трудов Материалы методической и научной конференции, М МГАВМиБ им К И. Скрябина, 2001 стр 141-142

5. Соколова О В. Изменение содержания и соотношения Т- и В- лимфоцитов у черноморской афалины (Tursiops truncatus) в процессе адаптации к условиям жизни в неволе. // В сб • Морские млекопитающие Голарктики. Тез. докл. 2-ой международной конф (Байкал, Россия) М, 10-15 сент 2002 стр 232-234

6. Соколова О.В., Денисенко Т.Е. Развитие защитно-приспособительных механизмов фагоцитоза у черноморской афалины (Tursiops truncatus) в процессе адаптации к ноогенной среде обитания. // В сб ■ Морские млекопитающие Голарктики Тез. докл. 2-ой международной конф (Байкал, Россия). М , 10-15 сент 2002. стр. 234-236

7 Денисенко ТЕ, Соколова О В. Количественный и видовой состав микрофлоры черноморской афалины (Tursiops truncatus) как показатель степени адаптированности животных к условиям неволи II В сб' Морские млекопитающие Голарктики Тезисы докладов второй международной конференции (Байкал, Россия), М., 10-15 сент. 2002. стр. 89-91

8. Соколова О В. Иммунологические и биохимические показатели у черноморской афалины Tursiops truncatus в разные периоды адаптации к ноогенной среде // В сб.' Териофауна России и сопредельных территорий. Материалы Международного совещания (Москва), М , 6-7 февр. 2003. стр 330.

9. Sokoiova О V, 2003, Adaptive changes of immunological and biochemical indices in the Black sea bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) during their process of adaptation to the life in captivity. // In abstracts of the Poster and Oral papers: 31st Annual International Symposium of European Association for Aquatic Mammals, 14-17 March, Tenerife, Spain, P. 43

10. Sokoiova О V, T E Denisenko, 2003, Peculiarities of phagocytosis in the Black sea bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) in correlation with microbial indices of Gr+ coccus in upper respiratory tract of these animals during their adaptation to noogenic environment - In abstracts of the Poster and Oral papers' // XV Biennial International Conference on the Biology of Marine Mammals, 14-19 December, Greensboro, NC, USA, P. 153.

II. Denisenko T E, О V. Sokoiova, 2003, Microflora of the Black sea bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) during the different periods of adaptation to captivity - In abstracts of the Poster and Oral papers: // XV Biennial International Conference on the Biology of Marine Mammals, 14-19 December, Greensboro, NC, USA, P. 42

12 Соколова О В Иммуно-микробиологическое исследование афалины (Tursiops truncatus) в период адаптации к условиям жизни в неволе - В сб.- Актуальные проблемы экологии и эволюции в исследованиях молодых ученых. II Материалы

Конференции молодых сотрудников и аспирантов Института проблем экологии и эволюции им. А. Н Северцова, 20-21 апреля, М.- Тов-во научн. Изд. КМК, 2004. стр. 169-176.

13. Соколова О.В., Денисенко ТЕ Адаптивные изменения некоторых иммуно-микробиологических коррелятов у афалины (Tursiops truncatus) на ранних сроках обитания в условиях неволи // В сб.: Морские млекопитающие Голарктики Сборник научных трудов по материалам 3-ей междун. Конф. (Коктебель, Крым, Украина), М., 11-17 окт. 2004. стр. 510-516

14. Sokolova O.V., 2005, The investigation of the Т/В lymphocyte subpopulations in the Black sea bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) by using monoclonal antibodies during the adaptation period to captivity conditions - In abstracts of the Poster and Oral papers: II 19th Annual International Conference of the European Cetacean Society, 2ni-7th April, La Rochelle, France, P. 98-99.

15. Sokolova О V.,2005, Adaptive changes of immunological, microbiological and biochemical indices in the Black sea bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) during it process of adaptation to anthropogenic environment.- In abstracts of the Plenary, Symposium, Poster and Oral papers: IIIX International Mammalogical Congress, July 31 - August 5, Sapporo, Hokkaido, Japan, P. 403

16 Sokolova O.V, Denisenko T. £., Yezdakova I.Yu., 2006, Adaptive changes of the serum immunoglobulins level in the Black sea bottlenose dolphin (Tursiops truncatus).-In abstracts of the Poster and Oral papers: // 20th Annual International Conference of the European Cetacean Society, 2nd-7tn April, Gdynia, Poland, P.180

17 Bulycheva T.I., Sokolova О. V., Novikova M.S., 2006, Adaptive changes of the T-, B- lymphocyte subpopulations in the Black sea bottlenose dolphin (Tursiops truncatus).-In abstracts of the Poster and Oral papers' II 20th Annual International Conference of the European Cetacean Society, 2nd-7th April, Gdynia, Poland, P.171

Благодарности:

Автор сердечно благодарит, дирекцию ИПЭЭ им. А Н. Северцова РАН за предоставленную возможность обучения в аспирантуре; Генерального директора ООО "Утришский дельфинарий", кб.н. Л.М. Мухаметова за предоставленную возможность набора материала для исследований от черноморских афалин, а также ветеринарных врачей ООО "Утришский дельфинарий" за помощь в проведении отбора материала. Кроме того, автор выражает искреннюю благодарность своим научным руководителям: профессору, д б н ЕВ. Романенко и засл. деят. науки РФ, профессору, д.м н Т.И. Булычевой за строгое и чуткое руководство Автор выражает искреннюю благодарность д.б.н Г.Н. Солнцевой за неоценимую помощь в редактировании печатных работ и рукописи диссертационной работы. Также, хочется поблагодарить к б.н И.Ю. Ездакову и к.м н М.С. Новикову за ценные практические рекомендации и помощь в проведении экспериментов, кб.н Т.Е.Денисенко за неоценимую помощь в проведении этой научно-исследовательской работы Автор искренне благодарит Dr. Jeffrey L Stott, Dr. Traisy Romano за предоставленные для работы моноклональные антитела, а также Dr. Tom Loughlin и В. В. Вертянкина за помощь при доставке моноклональных антител из США в Россию. Автор благодарит компанию "Лейка" за разрешение воспользоваться их замечательной микрооптической системой для получения фотографий микрообъектов В заключение очень хочется поблагодарить мою семью, особенно моего супруга, В И Соколова, за моральную и материальную поддержку в процессе обучения в аспирантуре.

Принято к исполнению 26/04/2006 Исполнено 27/04/2006

Заказ №336 Тираж 100 экз

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56 (495) 747-64-70 www autoreferat ru

¿рШ

№10 173

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Соколова, Ольга Владимировна

Список использованных сокращений.

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Афалина или бутылкопосый дельфин

Tursiops truncatus Montagu, 1821).

1.2. Краткая характеристика факторов "ноогенной среды обитания" или "условий неволи".

1.3. Экологическая иммунология.

1.4. Адаптация на уровне организма.

1.5. Организация иммунной системы у китообразных (Cetacea).

2. Собственные исследования.

2.1. Материал и методы исследований.

2.1.1. Материал исследований.

2.1.2. Методы исследований.

2.1.2.1. Определение количественного и видового состава

Грамположительной кокковой микрофлоры верхних дыхательных путей.

2.1.2.2. Определение гематологических показателей.

2.1.2.3. Методы исследования иммунного статуса.

2.1.2.3.1. Определение относительного и абсолютного количества лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови.

2.1.2.3.2. Определение относительного и абсолютного количества Т- и В-популяций лимфоцитов.

2.1.2.3.2.1. Выделение лимфоцитов из периферической крови афалины.

2.1.2.3.2.2. Разделение лимфоцитов на поверхности пластика, нагруженного антителами к иммуноглобулинам ("пэннинг").

2.1.2.3.2.3. Метод иммунологического фенотипирования с помощью панели моноклональных антител в реакция непрямой иммунофлуоресценции (нРИФ).

2.1.2.3.3. Определение фагоцитарной активности лейкоцитов.

2.1.2.3.4. Определение относительного содержания сывороточных иммуноглобулинов, классов G и М.

2.1.2.4. Статистический анализ.

2.2. Результаты исследований.

2.2.1. Количественный и видовой состав Грамположительной кокковой микрофлоры верхних дыхательных путей у афалины на разных сроках адаптации к условиям неволи.

2.2.2. Гематологические показатели у афалины на разных сроках адаптации к условиям неволи.

2.2.3. Показатели иммунного статуса у афалины на разных сроках адаптации к условиям неволи.

2.2.3.1. Уровень относительного и абсолютного количества лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови.

2.2.3.2. Уровень относительного и абсолютного количества Т- и В-лимфоцитов.

2.2.3.2.1. Содержание Т-, В- популяций лимфоцитов, которое было определено методом "пэннинг".

2.2.3.2.2. Относительный состав популяций лимфоцитов, который был определен в реакции непрямой иммунофлуоресценции (нРИФ) с помощью моноклональных антител.

2.2.3.3. Показатели фагоцитарной активности лейкоцитов.

2.2.3.4. Относительное содержание сывороточных иммуноглобулинов, классов IgG и IgM.

2.2.4. Мониторинг иммунологических показателей у выборочного количества афалин в процессе адаптации к условиям неволи.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Иммунный статус черноморской афалины (Tursiops Truncatus Ponticus Barabash, 1940) в период адаптации к условиям жизни в неволе"

ф Актуальность темы.

За последние годы становится все более актуальной проблема сохранения видового разнообразия на нашей планете. В связи с этим проводятся мероприятиятия по охране и всестороннему изучению редких и исчезающих видов животных. Одним из возможных направлений для решения поставленной задачи является адаптация представителей уникальных видов к условиям жизни в неволе с последующим изучением, разведением и возможным восстановлением их численности в природных популяциях, ф При адаптации диких животных из естественной среды обитания к среде, искусственно созданной человеком или условиям неволи, возникает ряд трудностей, связанных с изменением воздействия абиотических и биотических факторов на организм животного в качественно новых условиях.

Как известно, иммунная система млекопитающих представляет собой физиологический механизм, который наиболее быстро и тонко реагирует на любые изменения общего состояния организма (Ройт А. и др., 2000), а также на любые колебания биотических и абиотических факторов среды (Шубик В.М., 1976; Хаитов Р. М. и др., 1995). В связи с этим изучение динамики показателей Ф иммунного статуса животных является перспективным подходом для оценки способности организма приспосабливаться к изменению условий обитания.

В настоящей работе объектом исследования является представитель отряда китообразных - черноморская афалина (Cetacea: Odontoceti - Tursiops truncatus ponticus Barabash, 1940), вид уникальный и экологически очень уязвимый.

Черноморская афалина занесена в Красную книгу России (категория 3 -"редкие таксоны и популяции"). По мнению некоторых исследователей (Соколов В.Е., 1986; Соколов В.Е. и др., 1990; Яскин В.А., Юхов В.Л., 1997) этот подвид морских млекопитающих в недалеком будущем может оказаться на ^ грани полного исчезновения. Поэтому, для спасения этих уникальных представителей морской фауны становится очевидной необходимость их содержания и разведения в условиях неволи, ф Некоторыми исследователями (Greenwood A.G., D.C. Taylor, 1977, 1978, 1979;

Cordes D.O., 1982) было показано, что ифекционные заболевания являются основной причиной развития патологических процессов в органах и системах, которые становятся основной причиной гибели афалин, содержащихся в неволе.

Согласно другим данным, причиной гибели афалины в период адаптации к условиям жизни в неволе являются инфекционные заболевания генерализованного типа, вызванные патогенами, которые часто присутствуют в ноогенной, т.е. созданной человеком, среде обитания (Сыкало А.И., 1982; ® Романов В.В., 1991). В связи с этим можно предположить, что основным лимитирующим биотическим фактором среды, который определяет выживаемость дельфинов в процессе адаптации к условиям жизни в неволе, является бактериальная микрофлора ноогенного происхождения, с которой афалины не сталкивались в естественной среде обитания. В 80% случаев бактериальные инфекции у афалины в условиях неволи вызывают Грамположительные кокки (стафилококки и стрептококки)(Колесса О.В., 1986а; Varaldo Р.Е. et al., 1988). Обычно, исход течения инфекционного процесса у афалины зависит от уровня иммунной реактивности ф макроорганизма - "хозяина" в период адаптации, а также от степени вирулентности патогенных микроорганизмов - "паразитов".

Нарушение иммунных механизмов на уровне организма существенно снижает приспособляемость особи, повышает вероятность ее гибели, и сказывается на популяционных процессах.

В связи с этим в экологическом плане интерес представляет исследование параметров иммунного статуса у диких животных в природных условиях, как критериев оценки степени влияния факторов среды, в т.ч. антропогенных, на организм животных в данном биогеоценозе.

Следует отметить, что иммунный статус морских млекопитающих, по сравнению со многими наземными млекопитающими (человек, лабораторные, домашние и дикие животные), мало изучен. Основная причина заключается в большой трудоемкости взятия прижизненного морфологического материала: крови, лимфоузлов, пунктата костного мозга, что становится возможным в условиях неволи.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы было изучение показателей иммунного статуса у черноморской афалины на разных сроках адаптации к условиям неволи при воздействии биотического фактора среды.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить количественный и видовой состав Грамположительной (Гр "+") кокковой микрофлоры верхних дыхательных путей (ВДП) у афалины на разных сроках адаптации к неволе, в качестве возможного биотического фактора среды.

2. Исследовать гематологические показатели у афалины на разных сроках адаптации.

3. Изучить клеточные и гуморальные показатели иммунного статуса у афалины на разных сроках адаптации к условиям жизни в неволе.

4. Провести сравнительный анализ между динамикой показателей Гр "+" кокковой микрофлоры ВДП и показателями иммунного статуса у афалины на разных сроках адаптации.

5. Разработать методические подходы к прижизненной комплексной оценке степени адаптированности морских млекопитающих, на примере черноморской афалины.

Научная иовизна работы.

Данная работа является первым комплексным эколого-иммунологическим исследованием адаптационных возможностей иммунной системы черноморской афалины при её содержании в измененных условиях обитания. Получены комплексные данные иммунологических показателей у клинически здоровых, адаптированных к условиям неволи афалин. Выявлены изменения показателей иммунного статуса у афалины в период адаптации к жизни в неволе, обнаружена связь между иммунологическими показателями и Гр "+" кокковой микрофлорой ВДП у афалины. Впервые показаны некоторые адаптационные физиологические особенности у этого вида китообразных: 1) появление в периферической крови форм моноцитов, переходных к тканевой форме и активное участие этих клеток в процессе фагоцитоза, 2) активное участие эозинофилов в процессе фагоцитоза, наряду с нейтрофилами и моноцитами. Установлено, что на ранних сроках адаптации (1-2 мес.) происходит подавление Т- клеточного, и, особенно, В- клеточного звеньев иммунитета у афалины. Фагоцитарная активность лейкоцитов в этот период также значительно понижена. Результаты проведенного исследования показали, что для адаптации к условиям жизни в неволе афалине требуется не менее четырех месяцев.

Показано, что показатели иммунного статуса в комплексе с гематологическими и микробиологическими показателями могут применяться для комплексной оценки приспособительных возможностей афалины к условиям неволи.

Разработан методический подход для прижизненной комплексной оценки степени адаптированности организма морских млекопитающих к изменению биотических факторов среды, на примере Т. truncatus.

Положения, выиосимые па защиту.

1. Комплексная оценка физиологического состояния афалины в период адаптации к условиям жизни в неволе должна включать исследование иммунологических, микробиологических и гематологических показателей.

2. На ранних сроках адаптации к неволе (1-2 мес.) у афалины происходит подавление иммунной реактивности организма.

3. У афалины на разных сроках адаптации к условиям неволи изменение показателей клеточного и гуморального иммунитета связано с изменением количественного и видового состава Гр "+" кокковой микрофлоры ВДП.

4. Данные о состоянии иммунного статуса у афалины на разных сроках адаптации к неволе отражают степень приспособленности особей этого вида к изменению условий обитания.

Теоретическое и практическое значение работы.

Материалы диссертации представляют интерес в плане изучения адаптационных возможностей иммунной системы морских млекопитающих. В результате проведенной работы расширены научные представления об иммунологических и микробиологических аспектах адаптации. ® Предложенный эколого-иммунологический подход к оценке физиологического состояния организма может быть применен для определения степени адаптированности не только у представителей сем. Delphinidae, но и у других видов млекопитающих в связи с изменением состояния среды в природных условиях.

Результаты настоящего исследования могут оказаться полезными для разработки комплексных экологических программ по спасению, как черноморской афалины, так и других редких и исчезающих видов животных, # что будет способствовать сохранению видового разнообразия.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Ы.Афалина или бутылконосый дельфин (Tursiops truncatus Montagu, 1821) распространение, питание)

Таксономическое положение (Соколов В.Е., 1979; Павлинов И .Я., Россолимо

О.Л., 1998):

Русское название Латинское название

Класс ! Млекопитающие 1 Mammalia Linnaeus, 1785 ртряд ! Китообразные Cetacea Brisson, 1762

Подотряд Зубатые Odontoceti Flower, 1867

Семейство Дельфиновые Delphinidae Gray, 1821

Г ----------- ( Род i ' i | Афалины или ! бутылконосые i ' дельфины ■ Tursiops Gervair, 1855 г- -------------------1 Вид || Афалина Tursiops truncatus Montagu, 1821

На основании изучения особенностей длины тела, длины черепа и окраски тела И.И. Барабаш-Никифоров (1940, 1960) счел возможным выделить черноморскую афалину в особый подвид - Tursiops truncatus ponticus. Согласно данным автора, у взрослых особей черноморской афалины средняя длина самцов составляет 245,3 см, у самок - 236,5 см; средняя длина черепа взрослой особи -477,5 мм.

Афалина {Т. truncatus Montagu, 1821) широко распространена в умеренных и тропических водах по всему миру. Афалина встречается преимущественно в прибрежной зоне, редко - в пелагических районах (Jefferson Т.А. et al., 1993).

Черноморский подвид афалины (Т. truncatus ponticus Barabash, 1940) в основном обитает в прибрежных водах. В наибольшей степени черноморские афалины сосредоточены в северо-восточной части Черного моря (Клейненберг С.Е., 1956; Гепртнер В.Г. и др., 1976; Яскин В.А., Юхов В.Л., 1997). Из-за зараженности глубинных частей Черного моря сероводородом весь бентос в этой акватории сосредоточен в прибрежных частях (Никитин В.Н., 1938), что и определяет ареал распространения черноморской афалины в северо-восточной части Черного моря, вдоль берегов Северного Кавказа и Южного Крыма.

Как уже отмечалось выше, численность популяций черноморской афалины неуклонно падает из года в год. Как полагают ученые-экологи (Яблоков А.В., 1986; Расс Т.С., 1993; Соколов В.Е., 1997; Яскин В.А., Юхов В.Л., 1997), это может являться следствием целого комплекса неблагоприятных факторов антропогенного происхождения:

- обеднение кормовой базы (значительно сократилась численность крупных пелагических рыб, таких как: кефаль, ставрида, скумбрия и др.); существенное загрязнение бассейна Черного моря аграрными, промышленными и бытовыми стоками; увеличение фактора беспокойства, за счет резкой интенсификации судоходства, особенно в период размножения. Объект питания афалины (Т. truncatus Montagu, 1821) во многом зависит от ареала обитания. Повсеместно в питании афалины преобладают различные виды рыб, но могут встречаться кальмары и ракообразные (Соколов В.Е., 1997).

По данным В.И. Цалкина и И.И. Барабаш-Никифорова (1941), черноморский подвид {Т. truncatus ponticus Barabash, 1940) в значительной степени бентофаг, но также питается и пелагическими рыбами. Согласно данным С.Е. Клейненберга (1956) и А.Г. Томилина (1957) объектами питания черноморской афалины являются следующие виды рыб: черноморский мерланг (Odontogadus merlangus euxinus), камбала (калкан) Psetta maeotica, скат (Raja clavatia), умбрина (Umbrina cirrosa), скорпена (Scorpaena porcus), хамса (Engraulis encrasicolus), барабуля (Mullus barbatus ponticus), кефаль (Lisa sp.), лобан (Mugil cephalus), пеламида (Sarda Sarda) (названия рыб даны по Рассу Т.С., 1993).

Заключение Диссертация по теме "Экология", Соколова, Ольга Владимировна

4. ВЫВОДЫ: ф 1. В течение периода адаптации к условиям жизни в неволе у черноморской афалины (Tursiops truncatus ponticus Barabash, 1940) выявляется повышение инфицированности особей патогенной Грамположительной кокковой микрофлорой (как неблагоприятный биотический фактор) и подавление защитных иммунологических реакций, вызванное, вероятнее всего, стрессом после отлова диких животных из привычной среды обитания.

2. Наибольшие изменения со стороны иммунной системы у афалины, выражающиеся в абсолютной и относительной лимфопении, снижении Т -® клеточной и, особенно, В - клеточной субпопуляций лимфоцитов, подавлении фагоцитарной активности нейтрофилов и моноцитов при ускоренной СОЭ и абсолютном лейкоцитозе, отмечаются в течение первого месяца адаптации к условиям жизни в неволе. При этом у афалины резко возрастает количество патогенной Грамположительной кокковой микрофлоры верхних дыхательных путей, что может свидетельствовать о развитии в этот период острого воспалительного процесса при наличии иммунологической недостаточности организма у адаптирующихся животных.

• 3. Выявлены особенности иммунологических показателей у афалины, заключающиеся в повышенном содержании в периферической крови эозинофилов, обладающих фагоцитирующей способностью, а также появлении в крови переходных к тканевой форме моноцитов с высокой фагоцитарной активностью.

Резкое повышение фагоцитарной активности у переходных форм моноцитов при снижении фагоцитарных реакций у нейтрофилов и моноцитов в первый месяц адаптации к неволе следует считать особенностью адаптационного т характера иммунной системы у афалины.

4. Повышение содержания относительного количества сывороточных иммуноглобулинов (IgG и IgM) у афалины с 5 - 7 недели адаптации к неволе согласуется с наличием патогенной Грамположительной кокковой микрофлоры в верхних дыхательных путях, представленной Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus pyogenes и Streptococcus pneumoniae. Это может свидетельствовать о наличии гуморального иммунного ответа у афалины на внедрение патогенных микроорганизмов.

5. Появление компенсаторных иммунологических механизмов, позволяющих пережить неблагоприятные биотические факторы в новых условиях обитания, приводит к постепенной нормализации иммунологических, гематологических и микробиологических показателей, отмечаемых у афалин после 1 года пребывания их в неволе и соответствующих показателям у адаптированных, клинически здоровых животных.

6. Комплексное изучение показателей иммунологического и гематологического статуса у афалины в сочетании с микробиологическими исследованиями на разных сроках пребывания в неволе позволяет оценить степень адаптированности этих животных к измененным биотическим факторам среды.

5. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ПРАКТИЧЕСКОМУ ПРИМЕНЕНИЮ

Предложенный эколого-иммунологнческнй подход для оценки степени влияния среды обитания, основанный на изучении динамики показателей иммунного статуса, может быть применен более широко при исследовании степени адаптированности не только у китообразных, но и у других видов морских млекопитающих.

Так, данный подход был успешно применен при исследовании степени адаптированное™ щенков сивуча (Eumetopias jubatus) в природных условиях на полуострове Камчатка (мыс Козлова), Командорских островах (о. Медный), Ямских о-вах и о. Иона.

В связи со значительным сокращением численности сивуча на большей части ареала в начале 1990х этот вид был включен в список редких и исчезающих видов в США и России. В настоящее время изучению этой проблемы уделяется большое внимание. В США была разработана специальная Программа по изучению и восстановлению численности сивуча до уровня безопасного состояния (Recovery Plan for the Steller Sea Lion, 1992). В соответствии с этой программой проводятся различные междисциплинарные исследования с целью выяснения причин значительного сокращения численности сивуча.

Получен положительный отзыв о практическом применении эколого-иммунологического подхода для оценки состояния здоровья репродуктивной группировки сивуча (Eumetopias jubatus) на Камчатке, Командорских, Ямских о-вах и на о. Ионы от Камчатского филиала Тихоокеанского Института Географии ДВО РАН. Предварительные данные показали (Sokolova O.V., Denisenko Т.Е., Burkanov V.N., 2005; Denisenko Т.Е., Sokolova O.V., Burkanov V.N., 2006) что подавление иммунной реактивности организма у животных в природных ареалах обитания может стать причиной повышенной восприимчивости к воздействию патогенных факторов различной этиологии (заболеваниям вирусного, бактериального или грибкового характера), что, ведет к увеличению смертности особей и в конечном итоге к общему сокращению численности популяции.

Проведенное исследование показало, что изучение изменений показателей иммунного статуса животных в связи с особенностями их экологии может оказаться перспективным подходом для оценки степени устойчивости организма к изменениям условий среды обитания.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Соколова, Ольга Владимировна, Москва

1. Барабаш-Никифоров И.И. Размеры и окраска дельфинов афалин (Tursiops truncatus Montagu), как критерий в вопросе их подвидовой дифференциации. I960, Научн. Докл. высш. шк., биол. науки, №1, стр. 35-42

2. Барабаш-Никифоров И.И. Фауна китообразных Черного моря. Ее состав и происхождение. Воронеж: Изд-во Воронеж. Гос. Университета, 1940, стр. 56-63

3. Березин В.В. Проблемы охраны здоровья морских млекопитающих // Изучение, охрана и рациональное использование морских млекопитающих: Тезисы докладов 10 Всесоюз. совещания, Москва, 1990, стр. 19-21

4. Биркун А.А. Микробиологический аспект адаптации дельфинов к условиям неволи.// Морские млекопитающие: Тез. докл. 9 Всес. совещ. по изуч., охране и рац. исп. мор. млек., Архангельск, 1986, стр. 41-43

5. Биркун А.А. Спорные вопросы классификации заболеваний китообразных. // Изучение, охрана и рациональное использование морских млекопитающих: Тезисы докладов 10 Всесоюз. Совещания. Москва, 1990, стр. 24-25

6. Биркун А.А., Милосердова Н.А. К характеристике микрофлоры китообразных Черного моря. // Гидробиологический журнал, 1989. Т. 25, №5. стр. 38-42

7. Богданова JI.H., Лебедев В.Г. Некоторые клинические показатели крови черноморских дельфинов.// Морфология и экология морских млекопитающих: дельфины. М.: Наука, 1971, стр. 126-129

8. Бурканов В.Н. Динамика и современное состояние численности сивуча в водах России, 1989-1999 гг.// Материалы международной конференции: "Морские млекопитающие Голарктики", Архангельск, 2000, стр. 56-65

9. Великанов JIЛ. Эволюционное учение.// Биология, М.: Мир, 2002. стр. 321345

10. Владимиров В. А. Проблема сохранения находящихся на грани исчезновения популяций полярных и серых китов Охотского моря.// Материалы международной конференции: "Морские млекопитающие Голарктики", Архангельск, 2000, стр. 82-85

11. Воронков А.С. Лечение заболевания афалины, вызванного микробами ешерихиа коли и протеус мирабилис.// Морские млекопитающие: Тез. докл. 10 Всес. совещ. по изуч., охране и рац. исп. мор. млек., Светлогорск, М., 1990, стр.64

12. Восканян Н.А., Джикидзе Э.К., Почхуа М.А. Иммунологический статус обезьян в процессе акклиматизации и коррекция его левамизолом.// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 1986. №3, стр. 62-65

13. Вуд Ф.Г. Морские млекопитающие и человек.// Ленинград: Гидрометеоиздат, 1979, 264 стр.

14. Галактионов В.Г. Эволюционная иммунология. М.: ИКЦ «Академкнига», 2005, 408 стр.

15. Гепртнер В.Г., Чапский К.К., Арсеньев В.А., Соколов В.Е. Ластоногие и зубатые киты. Серия: Млекопитающие Советского Союза. М.: Высшая школа, 1976,718 стр.

16. Глушен С.В. Автоматический анализ размеров ядер лимфоцитов периферической крови морских млекопитающих.// Изучение, охрана и рациональное использование морских млекопитающих: Тезисы докладов 8 Всесоюз. Совещания, Астрахань, 1982, стр. 93-94

17. Голиков А.Н. Адаптация сельскохозяйственных животных.// Физиология сельскохозяйственных животных (под ред. А.Н. Голикова), М.: Агропромиздат, 1991, стр. 409-415

18. Горизонтов П.Д., Белоусова О.И., Федотова М.И. Стресс и система крови. М.: Медицина, 1983, 240 стр.

19. Гублер Е.В. Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов, Л.: Медицина, 1978, 296 стр.

20. Гуле Вилем Гематологический атлас, Братислава: изд-во Словацкой Академии наук, 1963, 184 стр.

21. Денисенко Т.Е. Микрофлора черноморской афалины (Tursiops truncatus) в различные периоды адаптации к условиям неволи: Дисс. . уч. степ. канд. биол. наук. М.: МГАВМиБ, 2003, 180 стр.

22. Емельяненко П.А., Грызлова О.Н., Денисенко В.Н., Печникова Г.Н., Тулупова М.Н. Методические указания по тестированию естественной резистентности телят.//М.: ВАСХНИЛ, 1980, стр.10-19

23. Емельянов Б.А., Кузьмин С.Н., Дзагурова М.С. и др. Воспроизведение феномена исчезновения антител в эксперименте.// Иммунология, 1985. №5. стр. 58-62

24. Захарова Т.И., Дралкин А.В. Болезни кожи китообразных: обзор литературы.// Ветеринария, 1985. №4. стр. 36-39

25. Захарова Т.И., А.Ф. Алексеев, О.В. Белецкая и др. Микозы кожи китообразных.// Изучение, охрана и рациональное использование морских млекопитающих: Тезисы докладов 7 Всесоюз. Совещания, Москва, 1978, стр. 132-133

26. Кавцевич Н.Н. Применение модифицированной методики выявления неспецифической эстеразы в лимфоцитах морских млекопитающих.// Физиология морских животных, Тезисы докладов Всесоюзной конф., Мурманск, Апатиты, 1989, стр. 162

27. Камышников B.C. О чем говорят медицинские анализы, Минск: Белорусская наука, 1999, 189 стр.

28. Карпицкий В.В., Биркун А.А., Кирюхин И.Ф. Иммунозависимые реакции в процессе адаптации дельфинов к неволе.// Изучение, охрана и рациональное использование морских млекопитающих: Тезисы докладов 9 Всесоюз. Совещания, Архангельск, 1986, стр. 176-177

29. Клейненберг С.Е. Млекопитающие Черного и Азовского морей. М.: Изд-во АН СССР, 1956, 286 стр.

30. Клумов С.К., Соколов В.Е. Океанарии США и Японии.// в сборнике статей "Морфология и экология морских млекопитающих", отв. ред. В.Е. Соколов, М: Наука, 1971, стр. 153-171

31. Ковальчук J1.B., Чередеев А.Н. Актуальные проблемы оценки иммунной системы человека на современном этапе.// Иммунология, 1990. №5. стр. 4-7

32. Колесса О.В. Проблема гнойно-септической патологии у морских млекопитающих.// Изучение, охрана и рациональное использование морских млекопитающих: Тезисы докладов 9 Всесоюз. Совещания. Архангельск, 1986а, стр.204-205

33. Колчинская А.З., Мисюра А.Г. Методы физиологических обследований дельфинов: (рекомендации). // Киев: Институт физиологии, 1978, 109стр.

34. Коляда Т.И., Волянский Ю.Л., Васильев Н.В., Мальцев В.И. Адаптационный синдром и иммунитет. Харьков: «Основа», 1995, 368 стр.

35. Коржуев П.А., Глазова Т.Н. Концентрация мышечного гемоглобина в мышцах водных млекопитающих.// Биохимия, 1967, Т. 32. стр. 651 658

36. Крыжановский Г.Н., Магаева C.B., Макаров С.В., Сепиашвили Р.И. Нейроиммунопатология. Руководство. М.: Изд-во НИИ общей патологии и патофизиологии, 2003. 438 стр.

37. Купер Э.Л. Сравнительная иммунология.// М.: Мир, 1980, 424 стр.

38. Люблинская М.М., Алешкин В.А. Использование моноспецифических антисывороток к сывороточным белкам мыши для анализа соответствующих белков других представителей отряда Rodentia, М.: Медицина, №2, 1984, стр. 15-18

39. Мейсон Д., Пенхейл Дж., Седжуик Дж. Выделение различных субпопуляций лимфоцитов (Глава 2).// Клаус Дж. (ред.) Лимфоциты. Методы., М.:Мир, 1990. стр. 69-96

40. Мисюра А.Г., Богданова Л.Н. Система крови черноморской афалины.// Черноморская афалина Tursiops truncatus ponticus: морфология, физиология, акустика, гидродинамика. М.: Наука, 1997, стр. 186-213

41. Михалев Ю.А., Савусин В. П., Зеленая Ф.Е. О численности черноморских дельфинов.// Морские млекопитающие: Тез. докл. 7 Всесоюз. совещания, М., 1978, стр. 226-227

42. Никитин B.H. Нижняя граница донной фауны и ее распределение в Черном море.//Доклады АН СССР, 1938. т.21, №7, стр. 341-345

43. Нифонтов С.Н. Бактериологическое исследование павших дельфинов // Ветеринария, 1969, №6. стр. 25-27

44. Новикова М.С. Иммунофенотипическая характеристика лейкозных клеток в панели моноклональных антител : Дисс. . уч. степ. канд. медиц. наук. М.: Министерство здравоохранения СССР, ГНЦ РАМН, 1990, 122 стр.

45. Одум 10. Основы экологии, М.: Мир, 1975, 740 стр.

46. Одум 10. Экология (в 2-х томах), Пер. с англ. М.: Мир, 1986, 376 стр.

47. Ожерелков С.В., Хозинский В.В., Семенов Б.Ф. Течение экспериментальной инфекции, вызванной вирусом Лангет у мышей, на фоне стресса, связанного с ограничением движения.// Вопросы вирусологии, 1986. №5. стр. 634-636

48. Орбели Л.А. Лекции о физиологии нервной системы. М., Л.: ОГИЗ, 1934, 182 стр.

49. Павлинов И.Я., Россолимо О.Л. Систематика млекопитающих СССР (дополнения). М.: Изд-во МГУ, 1998, 190стр.

50. Полякова О.В. Приоритетные органические загрязняющие вещества в водной экосистеме озера Байкал. Сравнение химического и биологического подходов.// Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук, М., 2000, 27стр.

51. Потемкина Е.Е., Позднякова Р.З., Манукян Л.М. Пособие по лабораторной клинической иммунологии. М.: РУДН, 2003, 283 стр.

52. Расе Т.С. Ихтиофауна Черного моря и некоторые этапы ее истории.// Ихтиофауна черноморских бухт в условиях антропогенного воздействия. Киев: Наук. Думка, 1993, стр. 1-140

53. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология, М: Мир, 2000, 592 стр.

54. Романов В.В. Иммунный статус афалин, содержащихся в неволе, как критерий инфекционной устойчивости.// Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук, М.: 1991, 230 стр.

55. А 74. Романов В.В., А.И. Сыкало, Занин А.В., Сергиевская М.О. Состояниесистемы иммунитета дельфинов при гнойно-септических заболеваниях (ГСЗ) //

56. Изучение, охрана и рациональное использование морских млекопитающих: Тезисы докладов 9 Всесоюз. Совещания, Архангельск, 1986, стр. 344-345

57. Романов В.В., Сергиевская М.О. Динамика гематологических показателей черноморских афалин в ходе послеотловной адаптации.// Физиология морских животных, Тезисы докладов Всесоюз. Совещания, Мурманск, Апатиты, 1989, стр. 112

58. Руднева И.И. Ответные реакции морских животных на антропогенное загрязнение Черного моря.// Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук, М., 2000, 55стр.

59. Сергиенко В.И., Бондарева И.Б. Математическая статистика в клинических исследованиях.// М.: изд. дом «ГЭОТАР-МЕД», 2001, 255 стр.

60. Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Федотов В.Б. Определитель зоопатогенных микроорганизмов. М.: Колос, 1995, 319 стр.

61. Симонян Г.А., Хисамутдинов Ф.Ф. Ветеринарная гематология. М.: Колос, 1995, 256 стр.

62. Соколов В.Е. Систематика млекопитающих: Отряды китообразных, хищных, ластоногих, трубкозубых, хоботных, даманов, сирен, парнокопытных, мозоленогих, непарнокопытных. М.: Высш. шк., 1979, 528 стр.

63. Соколов В.Е. Обзор исследований по черноморской афалине.// Черноморская афалина Tursiops truncatus ponticus: морфология, физиология, акустика, гидродинамика. М.: Наука, 1997. стр. 9-18

64. Соколов В.Е. Редкие и исчезающие виды животных: Млекопитающие. Москва, 1986, 518 стр.

65. Соколов В.Е., Яскин В.А., Юхов B.J1. Распределение и численность черноморских дельфинов.// 5 Съезд Всесоюзного Териологического общества АН СССР: Тезисы докладов, Москва, 1990. Т.З. стр. 178-179

66. Сухих Г.Т. Механизмы стрессорных нарушений функций клеток естественной резистентности и пути их коррекции.// Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук, М.: 1985,40 стр.

67. Сыкало А.И. Иммунологические проблемы адаптации китообразных к ноогенной среде обитания.// Изучение, охрана и рациональное использование морских млекопитающих: Тез. докл. 8 Всесоюз. совещания. Астрахань, 1982, стр. 355-357

68. Томилин А.Г. В ми ре китов и дельфинов.// Москва, "Знание", 1974, 206 стр.

69. Томилин А.Г. Китообразные.// Звери СССР и прилежащих стран. М.: изд-во АН СССР, 1957. Т.9. 756 стр.

70. Томилин А.Г., Близшок Я.И. Заболевания афалин, содержащихся в неволе.// Бюл. мое. об-ва испытат. природы, 1981. Т. 86, вып.1. стр. 13-18

71. Тюпелеев П.А., Мельников В.В. О причинах гибели белух во время промысла // Териология, орнитология и охрана природы.// Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума "Биология и проблемы севера", Якутск, 1986, вып. 3. стр. 78-79

72. Филиппов В.К. Неспецифические факторы защиты и иммунный ответ организма при стрессе.// Автореферат диссертации па соискание ученой степени кандидата медицинских наук, Челябинск, 1986, 25 стр.

73. Хаитов P.M., Пинегин Б.В., Истамов Х.И. Экологическая иммунология. М.: ВНИРО, 1995,219 стр.

74. Цалкин В.И., Барабаш-Никифоров И.И. Фауна китообразных Черного моря, ее состав и происхождение.//Зоологический журнал, 1941.Т.20, вып.1. стр. 176178

75. Чередеев А.Н. Характеристика и функциональные свойства субпопуляций лимфоцитов человека.// Итоги науки и техники, ВИНИТИ, сер.: Иммунология, • 1984, Т. 13. стр. 108-133

76. Чернохвостова Е.В., Герман Г.П. Иммунохимическая диагностика гаммапатий // Методические рекомендации, М.: Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского МЗ РСФСР, 1984, 51 стр.

77. Шилов И.А. Экология. М.: Высшая школа, 2000, 512 стр.

78. Шмальгаузен И.И. Пути и закономерности эволюционного процесса, JL, М.: изд-во Академии наук Союза ССР, 1940, 232 стр.

79. Шубик В.М. Проблемы экологической иммунологии. JL: Медицина, 1976, 240 стр.

80. Яблоков А.В. Популяционные проблемы биологии и охраны морских млекопитающих.// Изучение, охрана и рациональное использование морских млекопитающих: Тезисы докладов 9 Всесоюз. Совещания. Архангельск, 1986, стр. 439-440

81. Яблоков А.В., Белькович В.М., Борисов В.И. Киты и дельфины. Монографический очерк. М.: Наука, 1972, 473 стр.

82. Яскин В.А., Юхов B.J1. Численность и распределение черноморских афалин.// Черноморская афалина Tursiops truncatus ponticus: морфология, физиология, акустика, гидродинамика. М.: Наука, 1997, стр. 19-26

83. Arvy L. The unknowns of the lymphatic system in Cetacea.// In: Investigations on Cetacea, G. Pilleri (ed.), "Der Bund", New York, 1976. pp. 169-177

84. Arvy L., Pilleri G. Some characteristics of the cetacean spleen.// In: Investigations on Cetacea, G. Pilleri (ed.), Benteliag, Berne, Switzerland, 1970. pp. 165-167

85. Baker J.R. Causes of mortality and parasites and incidental lesions in dolphins and whales from British waters.// Vet. Rec., 1992. Vol. 130. pp. 569-572

86. Bossart G.D., Dierauf L.A. Marine mammal clinical laboratory medicine.// In: Handbook of Marine Mammal Medicine, Dierauf L.A. (ed.), CRC Press, Boca Raton, Florida, 1990. pp. 1-52

87. Buck J.D., Overstrom N.A., Patton G.W., Anderson H.F., Gorzelany J.F. Bacteria associated with stranded cetaceans from the northeast USA and southwest Florida Gulf coasts.//Dis. Aquat. Org., 1991. Vol.10, pp. 147-152

88. Skilling D.E., Evermann J., Stott J.L., Trites A.W. Disease agents in Steller Sea Lions in Alaska: a review and analysis of serology data from 1975-2000, Fisheries Centre Research Reports, Canada, 2003. V.l 1, №4,26 pp.

89. Calle P.P., Kenny D.E., Cook R.A. Successful treatment of suspected Erysipelas septicemia in a beluga whale {Delphinapterus leucas).// J. of Zoo Biology, 1993. Vol. 12. pp. 483-490

90. Cavagnolo R.Z. The immunology of marine mammals.// Dev. Сотр. Immunol., 1979. Vol. 3. pp.245-257

91. Colgrove G.S. Stimulation of lymphocytes from dolphin (Tursiops truncatus) by ф phytomitogens.// Am. J. Vet. Res., 1978. Vol. 39. pp. 141-144

92. Cordes D.O. Dolphins and their disease.// N. Z. Vet. J. 1982. Vol. 30. pp. 46-49

93. Cornell L.H., Duffield D.S., Joseph B.E., Stark B. Hematology and serum chemistry values in the beluga {Delphinapterus leucas).!7 J. Wildl. Dis., 1988. Vol.24, pp. 220-224

94. De Guise Sylvain Cellular immunology of cetaceans.// In Molecular and cell biology of marine mammals, Krieger Publishing Company, Malabar, Florida, 2002. pp.235-244

95. De Guise S., Martineau D., Beland P., Fournier M. Possible mechanisms of action of environmental contaminants on St. Lawrence beluga whales

96. Delphinapterus leucas). Environ. Health Persp., 1995a, Vol. 103 (4), pp.73-77

97. De Guise S., Bernier J., Dufresne M.M., Martineau D., Beland P., Fournier M. Phenotyping of beluga whale blood lymphocytes using monoclonal antibodies, Dev. Сотр. Immunol., 1997a . Vol. 21. pp. 425-433

98. Dierauf L.A., Gulland F.M.D. (ed.) Handbook of marine mammal medicine: health, disease, veterinary medicine and wildlife rehabilitation (2nd ed.). CRC Press LLC, 2001. 1063 pp.

99. Dierauf L.A., Gage L.J. Gross necropsy of cetaceans and pinnipeds.// In: Handbook of Marine Mammal Medicine: Health, Disease and Rehabilitation, Dierauf L.A. (ed.), CRC Press, Boca Raton, Florida, 1990. pp. 285-286

100. Domingo M., Vilafranca M., Visa J., Prats N., Trudgett A., Visser I. Evidence for chronic morbillivirus infection in the Mediterranean striped dolphin (Stenella coeruleoalba).H J. of Veterinary Microbiology, 1995.Vol. 44. pp. 229-239

101. Dunn J.L. Bacterial and micotic diseases of cetaceans and pinnipeds. // In Dierauf L.A. (ed.). CRC Handbook of Marine Mammal Medicine: Health, Disease and Rehabilitation. CRC Press. Boca Raton, Florida, 1990. pp. 73-87

102. Eisner Т., Dalton L.M. Emetic voidance of stomach lining induced by massive beetle ingestion in a beluga whale.// J. of Chemical Ecology, 1993.Vol. 19(8). pp. 1833-1836

103. Evermann J.L.S., Trites A.W. Disease agents in Steller Sea Lions in Alaska: a review and analysis of serology data from 1975-2000, Fisheries Centre Research Reports, Canada, 2003.V.11. №4. 26 pp.

104. Gingerich P.D., Wells N.A., Russell D. E., Ibrahim Shah S.M. Origin of whales in epicontinental remnant seas: new evidence from the Early Eocene of Pakistan.// Science, 1983. Vol. 220. pp. 403-406

105. Graham M.S., Dow P.R. Dental care for a captive Killer Whale {Orcinus orca).// J. of Zoo Biology, 1990.Vol. 9. pp. 325-330

106. Greenwood A.G., Taylor D.C. Clinical and pathological findings in dolphins in 1978.// J. of Aquat. Mammals. 1979.Vol. 7(3). pp.71-74

107. Greenwood A.G., Taylor D.C. Clinical and pathological findings in dolphins in 1977.// J. of Aquat. Mammals. 1978. Vol. 6(2). pp. 33-38

108. Greenwood A.G., Taylor D.C. Clinical and pathological findings in dolphins in 1976.// J. of Aquat. Mammals. 1977. Vol. 5(2). pp. 34-39

109. Harwood J., Hall A. Mass mortality in marine mammals: its implications for population dynamics and genetics.// Trends in Ecology and Evolution, 1990. Vol.5, pp. 254-257

110. Heide-Jorgensen M.-P., Harkonen Т., Dietz R., Thompson P.M. Retrospective of the 1988 European seal epizootic.// J. of diseases of aquatic organisms, 1992.Vol. 13. pp. 37-62

111. Howard E.B., Britt J.O. Tissue residues of selected environmental contaminants in marine mammals.// In: Howard E.B. (ed.), Pathobiology of Marine Mammal Diseases. CRC Press. Boca Raton. FL., 1983. Vol. 2. pp. 79-94

112. Inskeep II W., Gardiner C.H., Harris R.K., Dubey J.P., Goldston R.T. Toxoplasmosis in Atlantic bottlenosed dolphins (Tursiops truncatus)./I J. of Wildlife Diseases, 1990.Vol. 26(3). pp. 377-382

113. Jacobson C.N., Aasted В., Broe M.K., Petersen J.L. Reactivities of 20 anti-human monoclonal antibodies with leucocytes from ten different animal species.// Vet. Immunol. Immunopathol., 1993.Vol. 39. pp. 461-466

114. Jefferson T.A., Leatherwood S., Webber M.A. Marine mammals of the world. FAO Species Identification Guide. United nations environment programme, food and agriculture organization of the United Nations. Rome, 1993. 320 p.

115. Joseph B.E., Cornell L.H. Metastatic squamous cell carcinoma in a beached California sea lion (Zalophus californianus).// J. of Wildlife Deseases, 1986.Vol. 22(2). pp. 281-283

116. Kennedy S., Smyth J.A., Cush P.F., Duignan P., Platten M., McCullough S.J., Allan G.M. Histopathologic and immunocytochemical studies of distemper in seals.//

117. J. of Veterinary Pathology, 1989. V. 26. pp. 97-103

118. Kinsel M.J., Murnane R.D. Fatal Erysipelothrix rhusiopathiae septicemia in a captive Pacific white-sided dolphin {Lagenorhynchus obliquidens).// Proceedings american association of zoo veterinarians, 1996. pp. 337-339

119. Persistent organochlorines in Steller sea lion {Eumetopias jubatus) from the Bulk of Alaska and the Bering sea, 1976-1981 // Marine Pollution Bulletin, 1996. V. 32. pp. 535-544

120. Lipscomb T. P., Schulman F.Y., Moffett D., Kennedy S. Morbilliviral disease in Atlantic bottlenose dolphins (Tursiops truncatus) from the 1987-1988 Epizootic.// J. of Wildlife Diseases, 1994.Vol. 30(4). pp.567-571

121. Loughlin T.R. The Steller sea lion: A declining species.// Biosphere Conservation, 1998. Vol.1, pp. 91-98

122. MacNeill A.C. Blood values for some captive cetaceans.// Can. Vet. J., ф 1975.V.16. pp. 187-193

123. Martineau D., Lagace A., Beland P., Higgins R., Armstrong D., Shugart L.R. Pathology of stranded Beluga Whales (Delphinapterus leucas) from the St. Lawrence estuary, Quebec, Canada// J. of Comparative Pathology, 1988. V. 98. pp. 287-311

124. Martineau D., De Guise S., Fournier M., Shugart L., Girard C., Lagace A., Beland P. Pathology and toxicology of beluga whales from the St. Lawrence estuary, Quebec, Canada-past, present and future.// Sci. Total Environ., 1994. V. 154, pp. 201-215

125. Merrick R.L., Loughlin T.R., Calkins D.G. Decline in abundance of the northern sea lion, Eumetopias jubatus in Alaska, 1956-86, Fish Bull., U.S., 1987. Vol. 85. pp. 351-365

126. Monyan J.A., Ader R., Grata L.J. The effects of stress on the development of immunological memory following low-dose antigen priming in mice.// Brain, Behaviour & Immunity, 1990. Vol. 4, №1, pp. 1-12

127. Mumford D.M., Stockman G.D., Barsales P.B., Whitman Т., Wilbur J.R. Lymphocyte transformation studies of sea mammal blood.// Experientia, 1975. Vol. 31, p. 498

128. Nash D.R., Mach J.P. Immunoglobulin classes in aquatic mammals.// J. Immunol., 1971. Vol. 107, pp. 1424-1430

129. Nunoya Т., Tajima M., Ishikawa Y., Samejima Т., Ishikawa H., Hasegava K. Occurrence of a canine distemper-like disease in aquarium seals.// Jpn. J. Vet. Sci., 1990.Vol. 52(3). pp. 469-477

130. Patterson Rhonda A., Middlebrooks Bob L. Methods for purification and study of cetacean immunoglobulins.// In: Molecular and cell biology of marine mammals. Krieger Publishing Company, Malabar, Florida, 2002, pp. 245-252

131. Pilleri G., 1983, Cetaceans in captivity.// Investigations on cetacea. Berne, Vol.15, p.221-249

132. Recovery Plan for the Steller Sea Lion (Eumetopias jubatus). Prepared by the team for the Office of Protected Resources National Marine Fisheries Service National Oceanic and Atmospheric Administration, Silver Spring, Maryland, December 1992. 92p.

133. Reddy M., Echols S., Finklea В., Busbee D., Reif J., Ridgway S. PCBs and chlorinated pesticides in clinically healthy Tursiops truncatus: relationships between levels in blubber and blood.// Marine Pollution Bulletin, 1998. V.36(l 1). pp. 892-903

134. Ridgway Sam H. (ed.) Mammals of the sea: Biology and medicine, Springfield (III.), 1972. 432 p.

135. Ridgway Sam H., Simpson J. G., Patton G. S., Gilmartin W.G. Hematologic findings in certain small cetaceans.// J. Am. Vet. Med. Assoc., 1970. Vol. 157. pp. 566-575

136. Romano T.A., Ridgway S.H., Quaranta V. MHC class II molecules and immunoglobulins on peripheral blood lymphocytes of the bottlenosed dolphin, Tursiops truncatus.// J. Exp. Zool., 1992. Vol. 263, pp. 96-104

137. Romano Tracy A., Felten S.Y., Olschowka J.A., Felten D.L. A microscopic investigation of the lymphoid organs of the beluga, Delphinapterus leucas: ananatomical link between the nervous and immune systems.// J. Morphol., 1993. Vol. 221. pp. 243-259

138. Romano T.A., Ridgway S.H., Felten D.L., Quaranta V. Molecular cloning and characterization of CD4 in an aquatic mammal, the white whale Delphinapterus leucas.ll Immunogenetics, 1999. Vol. 49. pp. 376-383

139. Ross P.S. The role of immunotoxic environmental contaminants in facilitating the emergence of infectious diseases in marine mammals. Human and Ecological Risk Assessment, 2002. Vol. 8. pp. 277-292

140. Scott G.P., Burn D.M., Hansen L.J. The dolphin dieoff: long-term effects and recovery of the population.// In: Proceedings of the Oceans 88 Conference, 31 October-2 November 1988, Baltimore, MD.Vol.3, pp. 819-823

141. Selye H. Stress and Disease.// Science, 1955. Vol. 122, pp. 625-631

142. Simpson J. G., Gardner M.B. Comparative anatomy of selected marine mammals.// In: Mammals of the Sea: Biology and Medicine, S. H. Ridgway (ed.), Charles С Thomas, Springfield, IL., 1972. pp. 298-418

143. Smith A.W., Boyt P.M. Caliciviruses of ocean origin: a review.// J. Zoo Wildl. Med., 1990.Vol. 21(1). pp. 3-23

144. Smith A.W., Skilling D.E., Ridgway S.H., Fenner C.A. Regression of cetacean tattoo lesions concurrent with conversion of precipitin antibody against a poxvirus, Javma, 1983.Vol. 183(11). pp. 1219-1222

145. Smith A.W., Prato C.M., Gilmartin W.G., Brown R.J., Keyes M.C. A preliminary report on potenciale pathogenic microbiological agents recently isolated from pinnipeds.// J. of Wildl. Diseases, 1974. Vol.10, pp. 54-59

146. Solntseva G.N. The effect of water pollution on the development of pathological processes in the kidneys of the ringed seals of different populations (Pusa Hispida).//

147. Proceedings of the Soviet-Swedish Symposium: Influence of human activities on the Baltic ecosystem, Leningrad gidrometeoizdat. 1989. pp. 60-67

148. Solomon G.F. Emotion, immunity and philosophical perspectives.// Stress, Immunity and Aging . Marsel Dekker, Inc., New York, Basel, 1984. pp. 1-10

149. Tanaka E., Kimura Т., Wada S., Hatai K., Sonoda S. Dermatophytosis in a Steller sea lion {Eumetopias jubatus) JI J. Vet. Med. Sci., 1994. Vol. 56(3). pp.551553

150. Travis J.C., Sanders B.G. Whale immunoglobulins I. light chain types.// Сотр. Biochem. Physiol., 1972 a. Vol. 43 B, pp. 627-635

151. Travis J.C., Sanders B.G. Whale immunoglobulins II. heavy chain structure.// Сотр. Biochem. Physiol., 1972 b. Vol. 43 B. pp. 637-641

152. Varaldo P.E., Kilpper-Balz R., Biavasco F., Satta G., Schleifer K.H. Staphylococcus delphini sp. nov., a coagulase-positive species isolated from dolphins.// International Journal of systematic bacteriology. 1988. Vol. 38, №4. pp. 436-439

153. Wantzelius E.O.B. Management of gastrointestinal problems in Orinoco river dolphins {Inia geoffrensis) kept in captivity at Aquarium.// J.V. Seijas, Venezuela, Proceedings American Association of Zoo Veterinarians, 1990. pp.40-42

154. Williams III, C.R., Chapmen G.B., Blake A.S. Ultrastructural study of the blood cells of the beluga whale, Delphinapterus leucas JI J. Morphol., 1991. Vol. 209. pp. 97-110

155. Рисунок 7.1 Черноморская афалина (Tursiops truncatus ponticus Barabash, 1940).