Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммунизация к психотропному агенту-сиднофену-как метод долговременного изменения поведения животных

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Иммунизация к психотропному агенту-сиднофену-как метод долговременного изменения поведения животных"

¡Ьсковский ордена Лента, ордена Октябрьской революции и ордена Трудового Красного знамени государственный университет имени И В. Ломоносова

Биологический факультет

На правах рукописи УДК 612.017: 577.175.0

КУСТОВА. ЕЛЕНА ВДАДЖТРОША

.Имууннвация /с психотропному агенту - сидпофэну - как метод долговременного хзжнения поведения животных.

03. СЮ. 13 - Физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание ученей степени кандидата биологических наук

Москва - 1991

Работа выполнена на кафедре физиологии высшей нервной деятельности Биологического (факультета ИГУ им. Ы. Е Лоиопосова (аав. кафедрой - проф., д.С.н. ЕЕЩульговский).

Научный руководитель - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Р. А. Данилова

Официальные ошюнентьс Чепурнов С. А. - доктор биологических

наук, профессор;

Фрейдлин И. С. - доктор биологических наук, профессор. .

Ведущее учреждение - Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологию! АН СССР.

Зашита диссертации состоится "_" ноября 1991 г. на заседании специализированного совета Д 053. Об. 35. при Шсковскои государственном университете им. Ц Е Ломоносова (117234, Изсква, Лг-нинские горы, МГУ, биологический факультет).

¿г

Автореферат разослан **_" октября 1991 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета ишни 11. Е Ломоносова.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук Е А. Умарова.

Общая характеристика работы.

Актуальность темы. Б течение последнего десятилетия формируется новая стратегия длительного изменения физиологического и биохимического статуса животного организма (Антонова и др. ,1981; Саге 111 et al. ,1982; Ашмарин, 1984; Котов и др. ,1987; Гомаэков и др., 1987; Radvin, Jordan, 1988; Толпыго и др. , 1990 и ш. др.). Она основана на возможности активной иммунизации ко-валентными конъюгатами антигенов носителей с низкомолекулярными биорегуляторами. Такая иммунизация может вести к образованию антител не только к чужеродным биорегуляторам, но даже к собственный регуляторным пептидам, нейромедиаторам, гормонам и т. п. Поскольку достаточно высокий уровень антител удерживается обычно в течение месяцев после иммунизации, происходит постоянное связывание соответствующего (эндогенного) биорегулятора, что, в свои очередь, ведет либо к длительному снижению его содержания, либо к более сложным процессам "смещения" всего регуляторного статуса организма в силу тесной взаимосвязи различных регулятор-ных систем. В конечном счете на длительное время меняется физиологический статус. Реиммунизация тем же конъюгатом может обеспечить пролонгацию изменений в течение ряда лет.

Очевидна привлекательность этого подхода для решения ряда фундаментальных проблем физиологии и патологии, изыскания новых путей лечения ряда хронических заболеваний человека и направленного воздействия на развитие сельскохозяйственных животных. Главное, преимущество этого метода перед обычными подходами состоит в длительности и стабильности эффекта при небольшом • числе воздействий на организм.

Иммунокоррекция физиологического статуса не требует обязательного использования биорегуляторов, идентичных эндогенным регуляторам. Изучение механизмов действия фармакологических средств показывает, что многим из них соответствует в организме те или иные эндогенные аналоги-регуляторы или их комплексы. Такова, например, ситуация с эндогенными аналогами опиатов, бензо-диазепинов, антвдепрессантов, нейролептиков.

Кавалентнее присоединение фармакологических агентов к антигенам-носителям и иммунизация этими коягюгатами приводит к образованию антител . Эти антитела могут связывать не только соответствующие фармакологические агенты, но и их эндогенные регуля-

- г -

торные аналоги, вызывая длительные изменения физиологического статуса. Выбор для таких исследований собственных биорегуляторов организма или их фармакологических "родственников" может быть сходным. Ряд фундаментальных исследований целесообразнее ориентировать на использование конъюгатов со строго определенным эндогенным регулятором. Вместе с тем работа с конъюгатами фармакологических средств, обладающих сильным всесторонне изученным спектром действия, представляет интерес как для фундаментальных исследований, так и решения прикладных задач.

Основные задачи исследования. В наших экспериментах был использован н'онгюгат сиднофена - известного психостимулятора и антидепрессанта - с бычьим сывороточным альбумином (БСА). Целью данной работы являлось изучение влияния активной иммунизации конъюгатом сиднофена с БСА на условнорефлекторную деятельность и поведение белых крыс. Конкретными задачами работы стали:

1) подбор оптимальных условий для иммунизации животных конъюгатом сиднофена, включая оценку возможных изменений эффектов иммунизации при изменении ингредиентов, входящих в состав такого конъюгага;

2) выявление и полная характеристика последствий активной иммунизации к сиднофену с • помощью различных поведенческих тестов, услоЕно-рефлекторных методик, а также коразоловых судорог и киндлинга;

3) иммунологический анализ сывороток крови животных, подвергшихся активной иммунизации.

Научная новизна В работе впервые: 1) показано наличие изменений в поведении и обучаемости животных после иммунизации конъюгатом антвделрессанта и психостимулятора - сиднофена - с белковым носителем (БСА) и неепецифической иммуиостимуляции ; 2) продемонстрирована принципиальная возможность долговременной имму-нокоррекции физиологического статуса организма посредством метода активной иммунизации к психотропному препарату - сиднофену; 3) выявлено отличие физиологических последствий иммунизации конъюгатами с различным составом компонентов.

Научно-практическая вяачимоеть. Предложенный подход применим для решения ряда проблем физиологии и патологии, в частности, для изыскания новых путей лечения некоторых хронических заболеваний человека, посколысу главное его преимущество состоит в * длительности и стабильности эффекта при небольшом числе воз-

действий на организм.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на XXVIII всесоюзной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс", г. Новосибирск, 1990 г., Меидународном симпозиуме "Новые достижения в исследовании лекарственной зависимости и алкоголизма", г. КЬсква, 1990 г., Международном патофизиологическом конгрессе, г. Москва, 1991 г. Диссертация апробирована на заседании кафедры высшей нервной деятельности биологического факультета МГУ им. 11 В. Ломоносова. По материалам диссертации опубликовано б работ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов экспериментов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы. Список литературы включает 250 работ, из них 151 отечественных и 99 зарубежных авторов. 3 диссертации 37 рисунков и 19 таблиц.

Материалы и методы исследований.

Работа проведена на 1258 белнх беспородных крысах, самцах, капоой 180-200 тр. Исследовали эффекты иммунизации кокъюгатами сиднофена (СФ) с бычьим сывороточным альбумином (БОА) на поведение животных в различных экспериментальных ситуациях. Конъюгиро-вание СФ и БСА проводили (Ü Ф. Обухова с сотр. в институте нормальной физиологии им. ii К. Анохина АМН СССР) с помощью 1%-ного глутарового альдегида при молярном соотношении белок: СФ 1:80 в ОД Н фосфатной буфере pH 7,5-8,0. Реакцию веди в течение 3-4 часов при температуре 18-20*С и постоянном перемешизании. Конъ-вгаг, полученный при таком шлярком соотноиении компонентов реакции, после диализа содержит 23-2Б молей СФ на 1 моль белка, стабилен при хранении в течение 30-45 суток при тешературе от 5' до 8' С. Количество связанного СФ определяли спектрофотометри-чески по поглощению при 310 нм.

В части опытов, варьируя молярное соотношение компонентов, получали конъюгаты, содержащее около 5 и более 30 молей СФ на 1 моль белка

Иммунизацию крыс проводили триады, с интервалом 7-8 дней. Конъюгат вводили подкожно, в несколько точек спины. . Первые дь i раза конъюгат вводили в смеси с полным адгеопточ Фр^йнда (ПАФ) в объемном соотнощении 1:1. ПА'? сметав хм с раствором конъ-ога-а до

образования стабильной водно-масляной эмульсии. Лозы были выбраны из расчета 600-800 мг белка конългата на кг веса В котроль-них опытах вводили: 1) БСА без СФ, обработанный глутаровым альдегидом, с ПАФ; 2) СФ в таких же количествах, как в конъюгате; 3) ПАФ ; 4) физиологический раствор.

Тестирование животных проводили спустя 1 месяц после первой иммунизации. Оценку физиологических последствий иммунизации проводили с использованием следующих тестов:

1) Исследование двигательной и ориентировочно-исследовательской активности животных в комплексе '* Родео-1". Экспериментальное животное помеп^ии в центр рабочего поля и фиксировали: "а) горизонтальную активность; б) вертикальную активность по количеству стоек; в) ориентировочно-исследовательскую активность по числу заглшдываний в верхние ,и нижние "норковые" отверстия. Измерения проводили в течение 5 или 10 минут, фиксируя суммарную активность по всем перечисленным показателям и активность в каждую из минут тестирования. В том случае, .если опыт проводили в течение 10 минут, оценивали угаиение ориентировочно-исследовательской активности по разнице между активностью за первые и последние 5 минут опыта.

2) Формирование условной, реакции активного избегания. • УРАИ вырабатывали в специальной камере с металической решеткой, на которую подавался электрический ток. Условным раздражителем служил свет (время действия света 10 секунд), беаусдоввнш - электрокожное раздражение; время сочетаяного действия условного и безусловного стимулов в отсутствие реакции избавления не превышало 30 сек. Интервал между сочетаниями 45-60 сек. УРАИ вырабатывали в течение 2-5 дней по 15 сочетаний в каждый.

3) Выработка условного пииедобывательного рефлекса. Выработку пищэдобывательного рефлекса проводили в У-образноы лабиринте с двумя кормушками, в одной из которых животное могло получить подкрепление. Крысу пометали в стартовый отсек и фиксировал!: время побежки ее к подкрепляемой кормушке. После выполнения правильной реакции и получения подкрепления крысу возврашдли в стартовый отсек. 1Ъ истечении 15 минут или при выполнении животным 5 подкрепляемых реакций за более короткий промежуток времени опыт заканчивали. Шпцэдобывэтелъный навык вырабатывали в течение 4 дней опыта За это время регистрировали число подкрепляемых реакций, в том числе без ошибок (без захода в неподкреп-

ляешй луч лабиринта), ошибочные движения, латентный период реакции и общэе время нахождения в лабиринте.

4) Изучение особенностей поведения в ситуации "неизбегаевдго" плавания.

Поведение животных в тесте неиабегаемого плавания оценивали по классической методике Шрсолта ( Porsolt et al., 1973) в более поздней модификации ( Щетинин и др., 19S9). Цринудительнов плавание изучали путем помещения отдельно каждого животного на 10 минут в сосуд, заполненный водой до отметки на высоте 30 см, тсжоратур^ воды 20-21'С. Фиксировали продолжительность периодов неподвижности , . а также, используя биоритмологический подход к ' оценке принудительного плавания, учитывали продолжительность и ритмическую структуру активного (энергичные двиаэния всеми лапами) и пассивного ( слабые гребки задними лапами) плавания.

" 5) Оценка противосудорокяых эффектов.

а) Коразол вводили подию кно в дозе 60 иг/кг веса. Регистрировали наличие судорожных припадков в течение 30 мин. от юмеята введения ¡юразола, а так т латентный период припадка.

б) В опытах по исследованию прогивосудорояной активности ганъхзгатов на модели коразолового киндликга использовались животные через 3 недели после первой иммунизации. Коразол в подло-роговой дозе 30 ьт/кг вводили подкожно, ежедневно в течение 21 дня. После инъекции коразола гизотных помещали в камеру и наблюдали 30 кинут. Поведенческие судороги выражали в баллах (КМдра и др., 1983).

Б) Иммунологический анализ сывороток ишунизировантк животных.

Через 2 месяца после первой иммунизации брали кровь на определение аг.гител. Собранную после декантации животных кровь прогревали в течение 1 часа при температуре 37'С и для лучшей ретракции сгустка оставляли на ночь при температуре 0-4"С,после чего центрифугировали 30 шн при 3000 oö/с. Титра антител определяли (совместно с Ы <5. Обуховой) с помощью твердофазного имму-ноферментного анализа (ELISA; фосфатный посадочный буфер pH 7.5).

Результаты исследования.

I. Изучение особенностей двигательной активности, развития и угасания исследовательского поведения.

Животные после иммунизации конгюгатом сиднофена в смеси о ПАФ (гр.1) характеризуются достоверным снижением показателей го-

- б -

ризонтальной и вертикальной активности, заглядываний в нижние и верхние норки. Б то лее время животные после введения сиднофена (гр. 2) и ПАФ (гр. 3) - достоверным превышением контрольного уровня по показателям верхних и нижних норок, горизонтальной активности. Высокий'уровень заглядываний в норки у групп животных после введения сиднофена и ПАФ позволяет сделать заключение о выраженности в поведении таких крыс ориентировочно-исследовательской мотивации. Прямо противоположная ситуация наблюдается при исследовании поведения животных, иммунизированных конъюгатом сиднофена (гр. 1). По снижению всех исследованных показателей можно судить о нарушекиях°ориентировочно-исследовательского поведения крыс, вызываемых активной иммунизацией к сиднофену.

При анализе динамических характеристик процесса угасания горизонтальной активности у животных 1 группы и контрольных животных группы 4 (введение физраствора - ФР) обнаружены некоторые особенности, позволяющие с ещэ большей уверенностью говорить о нарушениях ориентировочно-исследовательской реакции после активной иммунизации крыс. Так, известно, что у интактных крыс на 6-12 минуту опыта появляется отчетливая вторая волна подъема двигательной активности С Иаркель, 1981), в то время как иммунизированные мвотные (гр. 1) характеризуются полным отсутствием этой второй волны, отражающей наличие исследовательского поведения.

Часто при определении спектра действия фармакологических препаратов, особенно психотропных, использует комплекс параметров, характеризующих поведение животных. Примером комплексного анализа является использование показателя Т, определяющего в обшей структуре поведения соотношение горизонтальной активности и суммы вертикальных стоек и заглядываний в отверстия. Результаты определения показателя Т свидетельствуют о его достоверной (р<0.01) повшюнии иосдэ иммунизации конъюгатоы сиднофена, тогда как введение сиднофена (гр. 2) и ПАФ-(тр. 3) его достоверно (р<0,01) снижает.

II. Изучение особенностей выработки условно-рефлекторного ' пищедобывательного навыка у белых крыс поело иммунизации коиъ-югатоы сиднофена

Животные, иммунизированные конъюгатоы, по многим показателям

достоверно отличаются от контрольных (введение ФР и иммунизация БСА с ПАФ). Так, число подкрепляемых побеквк в 1 группе (иммунизация конъюгатом сиднофзна с ПАФ) значительно (р<0.01) меньше, чем в контрольных группах (гр. 4 - введение ФР и гр. Б - иммунизация БСА с ПАФ) . Кроме того, число побежек без ошибок ("чистые побежки") в группе, иммунизированной ко нотатом, так же мало по сравнению с этим показателем в других группах (р<0.01). Около 50% животных, иммунизированных конъюгатом, не выполняет в первый день опыта ни одной подкрепляемой реакции. Время, затраченное на выполнение реакции, у животных этой группы велико и достоверно (р<0.01) отличается от этого лв показателя у животных 4 и б' групп . В то время как во всех контрольных группах наблюдается положительная динамика как по числу условно-рефлекторных реакций, так и по времени их втэягения, в опытной группе с 1 по 4 день сохраняется низкий уровень выполнения УР реакций.

Лабиринтное поведение животных, иммунизированных конъюгатом сиднофена с ПАФ (гр. 1), а также поведение животных после введения только ПАФ (гр. 3) подвергалось более детальному анализу. Интерес к последней группе животных связан с обнаруженным у них облегчением выработки пищедобывательного нависа . Так, в первый день опыта крысы, которым вводили ПАФ , характеризуются большей подвижностью и повышенным уровнем ориентировочно-исследовательской активности, что согласуется с данными, полученными при тестировании в актометре. В результате этого 38% животных этой группы выполняют в первый опытный день пять подкрепляемых побеге к против 18% в контрольной группе (введение ФР). Еивотныз после введения ПАФ характеризуется тага® более низкими (р <0.05) показателями времени выполнения реакции в опыте и достоверным увеличением числа подкрепляемых реакций, а том числе и безошибочных: побеяек, от первого к последнему дню опыта Для выявления особенностей действия ютнъюгата сиднофена и ПАФ в опытах детально протоколировались и хронометрировались все поведенческие проявления (вертикальная и горизонтальная активность, обнюхивание, груминг, вреда жевания, вегетативные проявления и т.д.).

Показано, что соотношение между количеством "хорошообучаю-щихся" и "плохообучашихся" особей в наядой экспериментально?» группе было совершенно различным. Так, доля "плохообучашяхся" (выполняющих менее 50 % подкрепляемых реашшй) животных составляла в групйе после иммунизации конъюгатом сиднофена 73 X против

В X и 38 2 крыс с такими же ниагаши показателями обучения в группах после введения ПАО и ФР соответственно. Интересно, что 14 из 95 (16 X) животных, иммунизированных конъюгатом, не выполняли во все дни опыта ни одной подкрепляемой реакции. ' Среди животных, которым вводили ПАФ, таких особей не обнаружено, а доля таких животных в контрольной группе составляет 5% (5 из 88). Все 14 животных 1 группы, характеризующееся полным отсутствием подкрепляемых побежзк, на протяжении всего времени опыта яе покидали стартового отсека, у всех отмечалась неподвижность, оцепенение. Однако такое поведение вряд лм может свидетельствовать о моторном дефиците,, связанном *г иммунизацией к сиднофену. Данные, полученные при тестировании моторной активности в "Родео" , хотя и свидетельствуют о сниженном уровне двигательной активности у иммунизированных животных, все .да не позволяют дселать вывод о полном подавлении моторики. Сравнение поведения иммунизировшгаых животных, которые в процессе опыта покидают стартовую камеру, с поведением животных двух других групп позволяет получить более определенные данные. Так, го изменению в процессе опытов латентного периода начала реакции (времени от посадки животного в лабиринт до первой подкрепляемой побежки) можно судить об ассоциации ситуационных сигналов (вид лабиринта) с результатом действия (получением пищевого подкрепления). Животные 4 группы (введение физраствора) при каждом последующем помещении в экспериментальную обстановку совершают первую побежку в подкрепляемый отсек быстрее, чем в предыдудеы опыте . Такое же снижение латентного периода реакции по мере продолжения опыта показано й для животных 3 группы (введение ПАФ). У крыс 1 группы, иммунизированных конъюгатом сиднофена, снижения латентного периода реакции не происходит. Каждая посадка таких животных в лабиринт вызывает у них заметное снижение двигательной активности. Животные пищат, некоторые стучат зубами, забиваются в угол стартовой камеры. Движение по лабиринту осуществляется импульсами, с частьыи остановками, сопровождается продолжительны!® груминговьмк реакциями.

Обращает на себя внимание поведение животных после первыз удачных (подкрепленных) побежек. При этом у животных 3 и 4 груш проявляется выраженное возбуждение. Положительное подкрепление усиливает ппервую мотивацию, способствуя эмоциональному ("аппетитному") возбуждению. Поэтому у части крыс этих групп на 4 дет опыта врэмя, затрачиваемое на выполнение всех 5 реакций, снижа-

ется по сравнен™ с 1 днем в 6-10 раз. Ситуация в группе, иммунизированной конгюгатом, иная: даже сделав правильную побежку до кормушки, многие крысы не берут корм. Время, аатрачиваемое крысами этой группы на еду, больше, чем в группах 3 и 4. Животные часто отвлекаются, замирают, а иногда и оставляют корм. При возвращении в стартовый отсек животные сопротивляются, прижимаются к полу, пищат, но признаков агрессивности не проявляют.

Очень важным обстоятельством, обнаруженным в процессе исследований, оказалось наличие указанных особенностей пищедобыва-тельного поведения даже у тех животных этой группы, которые характеризовались достаточно высокими показателями обучения, определяемыми по количеству подкрепленных и безошибочных реакций.

III.Изучение последствий иммунизации конгюгатачи сиднофена методом пр5шудительного плавания.

Как иавестно (Батурин и др., 1990), в зависимости от исходного типа плавательной активности можно условно выделить в популяции. крыс 3 типа животных: .активный (I тип), пассивный (11 тип) и иммобилизационный (MI Tim). При определении типа реагирования экспериментальных животных нами обнаружены некоторые особенности, характеризущие поведение крыс различных групп. Так,относительное число животных, обладающих активным типом реагирования, составляло в 1 день 63% для животных, которым вводили SP (группа 4), против 10% и 14% крыс с тем же типом реагирования в группах с введением ПАФ (груша 3) и иммунизированных КН с ПАФ (группа 1), соответственно. Различия между 1 и 3 группами по сравнению с 4 группой достоверны (р<0.01). Яивотные с активным типом реагирования на дискомфортную ситуацию ("деятельные") -отличаются продолжительным периодом активного плавания - АП (до 40% времени опыта), частыми попытками выбраться из воды, нырянием и передвижением под водой.

II тип реагирования - пассивный - характеризуется преобладанием пассивного плавания - ПП, когда совершаются в основном слабые гребковые движения для поддержания тела на плаву. К этому типу относятся 37% животных группы 4 (введение ФР), 60% животных группы 3 (введение ПАФ) и 48% животных группы 1 (КН с ПАФ).

III иммобилизационный тип отличается выраженной неподвижностью в динамике плавания. В 1 день опыта в группе 4 животные данного типа отсутствовали, в то время как в группах 3 и 1 доля таких животных составляла около 1/3 всех особей.

Таким образом, в 1 день опыта большинство животных группы 4 (введение физраствора) предпочитает активное плавание, тогда как ишобилизационный тип полностью отсутствует. Ситуация в группах 3 (введение ПАФ) и 1 (иммунизация конъвгачом с ПАФ) несколько иная: до 60% животных относятся ко II и III типам.

Приняв во внимание мнение о том, что более адекватным критерием для выявления депрессивных и антидепрессивных влияний является не традиционный учет общей продолжительности времени иммобилизации, а расшифровка ритмической структуры плавания (Арута-нян, Ботвев Орхий, 1990), мы обратились к характеристике временной динамики процесса плавания. По мнению некоторых исследователей (Щетинин и др. ,1989), в структуре слагаемых плавания можно выделить периоды различной длительности, группируя их по четырем основным диапазонам: до 6, от б до 18, от 18 до 36 и более 36 секунд. Сравнение данных.по ритмической организации плавательного поведения крыс при разнонаправленных воздействиях ( депрессо-генных и антидепрессивных) позволило вывести "индекс депрессив-яости" ( ИД ):

ад - К1Ш (до 6 сек)/КЛАЛ (Щетинин и др. ,1989; Арушанян, Ботвев Орхий, 1990), где КШ -количество самых коротких периодов иммобилизации, КЛАЛ - количество периодов активного плавания. Этот показатель при деп-рессогенных воздействиях вьппе 0,98 и, напротив, ¡псг.з этих значений при действии антидепрессантов. По данным авторов метода (Щетинин и др., 1988), отклонения от этой величины на 0,07 как в ту, так и в другую сторону является достоверными.

, Структура активного плавачия у животных различных групп характеризуется рядом особенностей: периоды длительностью до 6 ее-»;уид ( самые короткие ) составляют незначительную часть активного плавания крыс 4 группы, тогда как в активном плавании животных, иммунизированных конъюгатом с ПАФ, они составляют значительную часть (до 40 У. общэго времени активного плавания). Активное плавание животных 4 группы представлено, в основном, длительными ( от 18 до 36 и более секунд) периодами, в то время как в плавании животных, иммунизированных коныогатоы с ПАФ, они ва-тшаюг незначительное место (менее 25 X общего времени активного плавания). Группа животных, которым вводили ПАФ, по особенностям структуры активного плавания занимает промежуточное положение: , по числу самых коротких периодов превышает уровень гр.4 (введе-

нке ФР), однако по числу периодов длительностью от 18 до 36 секунд сопоставима с животными гр. 4 и достоверно (р < 0,05) превышает число периодов указанной длительности у крыс, иммунизированных конъюгатсм с ПАФ.

Изучение ритмической структуры иммобилизации показало, что у животных 1 группы (иммуниаация конъюгагом с ПАФ), более 3/4 ее общэго времени занимают самые короткие (до б сек) периоды, в то время как у животных, которым вводили ПАФ (гр.З), преобладающими являются периоды длительной иммобилизации от 6 до 36 секунд, и даже , в отличие от 1 и 4 групп, имеются периоды иммобилизации длительностью более 36 секунд.

Таким образом, хотя животные, иммунизированные конъюгагом о ПАФ, и животные после введения ПАФ отличаются повышенными значениями времени иммобилизации, структура такой иммобилизации у животных этих групп представлена по-разному и характеризуется преобладанием длительных периодов у крыс после введения ПАФ и выраженностью самых коротких (менее 6 сек) периодов у животных, иммунизированных конъюгатом с ПАФ. Вследствие этого "индекс деп-рессивности" у швотных, иммунизированных конъюгатом сиднофена составляет 1. 84, в то время как в группах с введением ФР и ПАФ -0.82 и 0,68 соответственно.

IV. Изучение судорожной готовности животных после иммунизации кояьюгатом сиднофена с ПСА.

Для формирования коразоловой модели судорог через 35-40 дней либо через 2 месяца и более после начала иммунизации всем опытным (иммунизация конъигатами) и контрольным (введение ФР.сидно-фэна) группам крыс однократно вводили коразол (60 от/кг подкожно). Наблвдения за этими животными проводили в течение 30 минут после введения коразола. Оценку состояния швотных проводили по латентному периоду наступления клонкко-тонических судорог с падением животных на бок.

В контрольной группе крыс, которым вводили физиологический раствор, в течение 30 минут после введения коразола выраженные клонико-тонические судороги с падением животного на бок наблюдались более чем в 90% случаев с разным латентным периодом от 1 минуты до 30 минут. Больше половины крыс дают судорожный припадок с латентным периодом 10 минут. Аналогичная картина наблюдалась в контрольной группе йивотных, которым вводили сидяофея. В группе иммунизированных крыс при введении коразола на 35-40

день после начала иммунизации (период наиболее выраженных поведенческих изменений, показанных ранее) отмечено статистически значимое увеличение латентного периода наступления судорожных припадков по отношению к другим группам . Кроме того, динамика распределения числа животных по латентным периодам выраженных судорожных проявлений у контрольных и иммунизированных крыс имеет прямо противоположную направленность . В группе иммунизированных крыс ( группа 1) по сравнению со всеми группами статистически значимо уменьшалась (в 4 раза) доля крыс с высокой чувствительностью к кораволу, т.е. с латентным периодом наступления судорожного припадка через 10 и менее минут после введения конвульсанта. В то же время опять-таки более чеы в 4 раза увеличилась доля крыс, у которых в течение 30 минут не было припадка с падением животного на бок, а, наблюдались лишь слабые вздрагивания головы или отдельных мышц тудовипз. Однако это статистически значимо только по сравнению с контрольной группой, которой вводили физ. раствор (гр. 4). В группах крыс, иммунизированных только ВСА (гр. б) или коньюгатом, ко тестировавшихся коразовом через 2 месяца и более после начала иммунизации , тага© отмечено увеличение числа животных без выраженного судорожного припадка по сравнению с контролем. Но эти различия статистически не значимы.

Шлученные данные побудили нас сравнить контрольных и иммунизированных крыс, используя модель нарастаящгй судорожной готовности при повторных воздействиях подпороговых доз коразола, т. е. модель фармакологического киндлинга. В опытах использовались

2 группы крыс: 4 группа - контроль (введение ФР); 1 группа - иммунизация ганъюгатом сиднофена с БСА в смеси с ПАФ. Как и показано ранее (Шаядра и др. , 1S83), ежедневное введение коразола в дозе 30 иг/кг контрольным животным вызывает у них нарастающее усиление судорожной готовности и возникновение судорог. Интенсивность судорожной реакции, так пз как и латентный период наступления и продолжительность ее, варьировали как у отдельных животных, так и по группе в целом. На 11 день введения коразола у 0ОХ крью наблюдались судорожные реакции со средней тяжестью в

3 балла. Процесс формирования судорожной готовности у иммунизированных крыс на ранних этапах отличается от контрольных. Эти отличия выражаются следующим: проявление первых судорожных реакций у контрольных крыс начинается с б-го дня введения коразола,

и к концу первой недели достигает почти 60 % , в опытной группе судорожные реакции проявляются только с 8 дня у 20 % животных. Нарастание судорожной готовности в опытной группе до 11 дня несколько замедлено, о чем можно судить к?к по числу животных с судорогами (р < 0.05), так и по латентному периоду начала судорожных реакций и их средней тяжести. Начиная с 11 дня различия между группами не проявляются.

V. Иммунологический анализ сывороток крови иммунизированных животных.

Иммуноферментный анализ сывороток крови животных, иммунизированных конъюгатом сиднофека с ЕСЛ, показал, что в результате иммунизации в крови крыс появляются антитела, связывающиеся с сиднофеном. Концентрация таких антител определяется средним (медиана) титром 1/1024 ( 1/160-1/4096). Титры антисиднофеиовых антител в сыворотке крови животных контрольных групп (введение ФР, ПАФ и БСА) характеризовались более низкими значениями (1/80 -1/160).

Помимо определения концентрации антител к сиднофену проведено исследование реактивности сыворсток с рядом других лигандов: дофамином, норадреналином, серотонином, ГАМК, тиролкберином, ли-торином, вазопрессшюм, окситоцином, веществом П, динорфином, бета-эндорфином, дерморфином, АКТ Г 4-7, тафцином, l.fet-энкефали-ном. Шказано, что иммунизация крыс конъюгатом сиднофена с ВСА в смеси с ПАФ индуцирует образование антител довольно широкого спектра: к норадреналину, дофашту, серотонииу , веществу П, ди-норфину, бета-эндорфину и вазопреесину. К первым двум медиаторам титры бшш сопоставимы с титрами антител к самому сиднофену.

Заключение.

Изложенные данные позволяют сделать определенные выводы о направленных и долговременных изменениях в поведении иммунизио-ваннкх животных. Эти изменения связаны, в первую очередь, с подавлением эмоциональной сферы и появлением своеобразного "депрессивного" состояния.

Иммунизация конъюгатом свднофена вызывает в отличие от активирующего действия самого препарата выраженные седативные эффекты: снижение показателей вертикальной и горизонтальной aiсгявности, изменение общей струтуры поведения и т. д. Следует отметить, что такое изменение поведенческой структуры (значительное

снижение доли времени, проводимого в вертикальной стойке и заглядывая™ в "норковые" отверстия) присущ .например, животным типа Колецкого, представляющим собой генетически обусловленную модель тревожной депрессии человека (Golda et al., 1988).

Анализируя поведение иммунизированных животных в лабиринте, можно сделать вывод о том, что затруднения в образовании пищедо-бывательного навыка, а иногда и невозможность его формирования, связаны, по-видимому, в значительной мере о подавлением ориентировочно-исследовательского поведения и общей заторможенностью животных, а не с нарушением процесса обучения ( при выработке УРАЙ различий между контрольны!® и иммунизированными животными не обнаружено). Эффект кон-штата в этом случае прямо противополо-зкен действию самого сиднофена, который, как известно, способствует повышению обучаемости в случае выработки пшдедобывательного навыка (Еелозерцев, 1984), причем улучшение показателей выработки УР связано именно со стимуляцией преимущественно эмоциональной сферы и двигательной активности (Виноградов,' Гречко, 1982).

В свяаи с обнаруженными особенностями ориентировочно-исследовательского и пищедобывательного поведения опытных животных было весьма интересно исследовать поведение крыс после иммунизации при помощи тестов, позволяющих адекватно оценить депрессивные компоненты в его составе. Одним из таких тестов является классический плавательный тест Шрсояьта. Продолжительность иммобилизации, ее ритмическая структура, а так лаз рассчэт индекса деп-рэссивности показывает наличие выраженных депрессивных эффектов после иммунизации конъюгированным еиднофеном.

Обнаруженное при помощи различных методов свойство конъюгатг вызывать изменения в поведении животных, характерные для психо-лептиков, побудили нас предпринять попытку изучения влиягш конъюгированного сиднофена на формирование судорожной патология. Тот факт, что активная иммунизация конъюгатом сиднофена оказывает выраженное влияние только на начальные стадии развития судорожной активности, не представляется удивительным. В литературе описаны случаи, когда препараты, признанные в клинической практике аффективными антиконвудьсантами, оказывают воздействие исключительно на ранние этапы развития судорог ■ при фармакологи ческом киндлинге, не изменяя при этом других его стадий (стади спонтанных судорог,"полный" киндлияг и т.д.) (Post, 1989). Го рэядо более интересным является тот факт, что коиютат сиднофен

способен в принципе обладать антисудорожным действием. Ведь сид-нофен - психостимулятор со свойствам* ингибитора МАО, т. е. препарат, оказывающий провоцирующее влияние на судорожную активность и потенцирующий эффекты судорожных агентов (Чугунов, 1976; Лаврецкая, 1985). Использование же сиднофена в качестве гаптена при активной иммунизации животных приводит к эффэотам обратным, угнетающим развитие судорог. Обнаруженная способность конъюгата сиднофена повышать порог судорог (как в случае коразолового киндлинга, так и при использовании антикоразолового теста) слу-зкит дополнительным подтверждением наличия у такого конъюгата се-дативных свойств, поскольку антагонизм с коразолом является одним из признаков, сопутствующих седативно-гипнотическому действию фармакологических соединений (Раевский, Батулин, 1963; Вихляев, Клыгуль, 1966).

Наибольший интерес вызывает обнаруженный в процессе исследования спектр антител к некоторым биорегуляторам, отличным от сиднофена В отношении наличия в сыворотке крови иммунизированных юныогатом животных антител к катехоламинам приемлемым, хотя и не исчерпывающим, могло бы стать известное положение о том, что в некоторых элементах своей структуры сиднофэн сходен с катехо-ламздами.С точки зрения структурного сходства объяснить появление в крови иммуииаированных животных АТ к серотонину и ГАМК значительно сложнее. Молекула- серотонина содержит индольнуга группу, а молекула ГАМК вообще не имеет циклических структур. Чрезвычайно интересно и наличие связывания возникающих в про-' цессе активной иммунизация к сиднофену АТ против динорфина, бе-та-эндорфина и вавопрессина. В то жэ время не образуются в определимых титрах антитела к окситоцину, тафцину, меланостатину, АКТГ 4-7, литорину и ряду опиоидов: Met-энкефалину, гамма-эндор-фину, нескиоторфииу, дерморфнну, FMRFa и MSGMRFa Все вышеизложенные факты позволяют исключить феномен поликлональной активации. Кроме того, следует подчеркнуть, что титры АТ, обнаруженные к ряду биорегуляторов, относительно невелики. Если принять во внимание представления о постоянном присутствии АТ в крови человека и животных и их гомеостатической функции (Закс, Быкова, 1977; Nieto et al.; ГЬлевая, Крупник, 1989; Шлевел и др. ,1990), то можно полагать, что посредством иммунизации к сиднофену мы не воспроизводим некого патологического аутоиммунного состояния (вследствие незначительности титров аутоЛТ), а лишь инициируем

"запуск" системы иммунологической коррекции физиологических функций. Б связи с этим, интересно обратить внимание на тот факт, что повышенное содержание ат в крови обнаруживается только против тех биорегуляторов, которые тем или иным способом сдвигают уровень эндогенного баланса (Полевая и др., 1990). Естественно, что такое изменение содержания данного биорегулятора (особенно, если этот биорегулятор - медиатор или гормон) доллага иметь и определенные физиологические проявления. Вероятно, заслуживает внимания тог факт, что животные, иммунизированные конъюгатом сиднофена, демонстрировали яркое подавление эмоционального поведения, в реализации которого, как известно, принимает участие и катехоламииы, и серотонин, и ГАШ (Кулагин, Бэ-лондинский, 1986). Таким образом, обнаруженные изменения титров АТ к некоторым биорегуляторам является, скорее, своего рода показателем того, на какие системы организма оказывает влияние предпринятая иммунизация животных коныогированным сидкофонзк.

Подученные результаты позволяют полагать плодотворной концепцию о возможностях долговременной иммунокоррекции физиологического статуса организма посредством метода активной иммунизации к эндогенным биорегуляторам и некоторым фармакологическим препаратам.

Выводы.

1. Иммунизация крыс конъюгатом антидепрессанта и психостимулятора сиднофена с БСА вызывает длительное изменение физиологического статуса, характеризующееся депрессией поведенческой активности.

2. Изучение двигательной я ориентировочно-исследовательской активности, выработки пшздобывательного кавыка и плавательного поведения животных после активной шмунизации к сиднофену показало, что направленность изменений, вызываемых конъюгатом, противоположна действию саъюго сиднофена,

3. Каждый из ингредиентов коншгата (сиднофен, БСА) и ПАФ вносят свой специфический вклад в изменение поведения. Однако ни ПАФ, ни один из компонентов конъюгата не оказывает влияния на поведение иммунизированных животных, характерного для конъюгата

4. На модели коразоловых судорог и коразолового киндлинга показано, что иммунизация крыс кон-ыогированным сиднофеном оказывает некоторый противосудорохный эффект, выражающийся как в уве-

личении латентного периода судорожного припадка ( коразоловые судороги), так и з скорости формирования судорожной патологии ( коразоловьй юшдлинг).

5. Изучение сыворотки крови иммунизированных животных показало наличие антител к сиднофену, а так же к некоторым другим биорегуляторам. Это может служить подтверждением предполагаемого сложного воздействия на состояние организма образующихся в результате иммунизации антител.

По материалам диссертации опубликованы еледуиццз работы:

1. Федорова И. М., Кустова S. В. Влияние конъюгатов психостимулятора сиднофена на условпорефлекторнув деятельность белых крыс // Материалы XXVIII всесоюзной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс".- Новосибирск, 1990. - С. 39 - 44.

2. Ashmarin LP,, Danllova R. A., Kustova E. V., Obuchova M. F. Immunization by covalent conjugates of pharmacological drugs as a method . long-term modification of physiological and immunological status of animals // Problems of 1 mrtmopharrraco 1 ogy. - Tbilisi, 1990. - P.6.

3. Данилова P. A., Кустова E. R , Обухова Ы. Ф., Ашмарин И. П. Судорожная активность белых крью после иммунизации конъюгатом сиднофена с серумальбугшном // Бмл. экспер. биол. мед. - 1991." - N 2. - С. 137-139.

4. Ashmarin I. Р., Dani lova R. A. , Martjanov A. A., Obuchova M F., Kustova E. V., Sagimbaeva Sh-K. Imunoregulation of nonimmunological function in the organism // Const. Congress Internat. Soc. for pathophysiology. - Moscow, 1991. - P. 186.

6. Ashmarin I.P., Kustova E. V., Danllova R.A. The immunization against antidepressant supresses . emotional behaviour and kindling of rats // XXII congr. internet, soc. of psychoneuroendocr1nology "Life processes and events: psychoneuroendocrine mechanisms of adaptation". - Siena, 1991.

6. Кустова E. E , Данилова P. A., Ашмарин И. П. Эффекты иммуностимулятора - полного адъюванта Орейнда - на некоторые функции мозга белых крыс Еиол. науки. - 1991 (в печати).