Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS методом полимеризной цепной реакции

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Идентификация YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS методом полимеризной цепной реакции"

Р Г Б ОД

2 5 НОЯ 1396

На правах рукописи

Михайлов Николай Венерович

ИДЕНТИФИКАЦИЯ YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS МЕТОДОМ П0ЛИМЕРАЗН0Й ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

03.00.07 - Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1996

Работа выполнена на кафедре микробиологии Военно-медицинской академии и в Петербургском институте ядерной физики имени Б.П.Константинова Российской академии наук.

Научные руководители: доктор медицинских наук профессор

Е.П.Сиволодский

кандидат биологических наук старший научный сотрудник С.А.Булат

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук профессор

В.В.Тец

доктор медицинских наук профессор К.О.Гранстрем

Ведущая организация: Санкт-Петербургский химико-фармацевтический институт

Защита состоится '^^^срЛ*? 1996 года в часов на заседании Диссертационного Совета Д 106.05.01 в НИИ военной медицины МО РФ (195043, Санкт-Петербург, Лесопарковая ул., д.4).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан '-¿-С-с^ 1996 года.

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор медицинских наук профессор Р. Б. Гольдин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Среди широкого круга молекулярно-ге-нетических методов, применяемых для решения фундаментальных и прикладных задач микробиологии, наиболее перспективным является полимеразная цепная реакция (ПЦР), основанная на энзиматической амплификации фрагмента ДНК, ограниченного синтетическими олиго-нуклеотидами-праймераш /Mullls К., Faloona F., 1987/. Высокие показатели чувствительности и специфичности, быстрота получения результата придают данному методу значительные преимущества при обнаружении возбудителей инфекций, изоляция и культивирование которых слишком длительны и трудоемки, а различные варианты иммуно-химической диагностики не вполне надежны. ПЦР с универсальными (неспецифическими) праймерами (УП-ПЦР, AP-PCR, RAPD-PCR) позволяет наиболее объективно дифференцировать биологические (генетические) виды на основании единства структурной организации генома, выражением которой служит сходство во взаиморасположении и нукле-отидном составе многих генетически уникальных фрагментов ПЦР-пат-тернов исследуемых штаммов /Булат С.А., Мироненко Н.В., 1980/, а также анализировать клсналъную структуру микробных популяций путем сравнения паттернов ачплифицируемой ДНК - эффективного средства эпидемиологического маркирования изолятов.

Возбудитель псевдотуберкулеза (Yersinia pseudotuberculosis) является микроорганизмом, таксономическое положение которого остается дискуссионным ввиду противоречия между данными ДНК-ДНК гибридизации, свидетельствуюпдами о тесном генетическом родстве бактерий чумы и псевдотуберкулеза, и их принадлежностью к разным таксономическим видал согласно традиционной схеме классификации, что побуждает к поиску новых методов, вскрывающих родственные связи микроба.

Методы обнаружения и эпидемиологического маркирования Y.pseudotuberculosis также нуждаются в дальнейшем совершенствовании. Выделение чистой культуры возбудителя длительно (2-3 недели) и малоэффективно, поскольку позволяет подтвердить диагноз лишь у 25-70% больных при групповых заболеваниях и у 10-15% при спорадических случаях /Сомов Г.П. и др., 1990/. Серотипирование штаммов Y.pseudotuberculosis не способствует достоверному определению путей передачи инфекции в связи с низкой разрешающей способностью метода, маскирующей полигональную структуру популяций возбудите-

ля со сходной антигенной структурой в большинстве очагов. Наличие общих антигенных детерминант белковой и лнпополисахаридной природы является причиной перекрестных реакций антисывороток, особенно к сероварам 1, 2, 5 /ЦеневаГ.Я., 1987; Щербаков А.А., 1991/. Отсутствие в стране производства узкоспецифичных агглютинирующих псевдотуберкулезных сыЕороток приводит к применению изготовленных в различных лабораториях нестандартизированных препаратов, что не позволяет сравнивать получаемые результаты. Серодиагностика псевдотуберкулеза, используемая в настоящее время, является ретроспективной. Обнаружение псевдотуберкулезных антигенов экспрессными иммунологическими методами - иммуноферментным анализом (ИФА), непрямым методом флюоресцирующих антител (МФА), реакциями агглютинации латекса (РАЛ), коагглютинацш (РКоА), непрямой гемагглю-тинации (РИГА) - характеризуется недостаточной чувствительностью и специфичностью.

Вышеуказанные причины побудили к выбору Y.pseudotuberculosis в качестве объекта для разработки и применения методов идентификации и генотипирования патогенных микроорганизмов на основе изучения их генома (ДНК).

Таким образом, тема исследования имеет ДЕа аспекта, классификационный и клинико-микробиологический. Первый относится к решению спорных вопросов таксономии и систематики микроорганизмов с дискуссионным таксономическим рангом, в частности бактерий псевдотуберкулеза. Второй заключается в совершенствовании микробиологической диагностики псевдотуберкулеза и методов эпидемиологического типирования изолятов Y.pseudotuberculosis с учетом индивидуальных особенностей строения их генома.

Цель работы. Разработка и применение молекулярно-генетических методов идентификации и индикации Y. pseudotuberculosis на основе амплификации фрагментов геномной ДНК методом ЩР.

Задачи исследования. 1. Видоидентифицировать бактерии псевдотуберкулеза методом УП-ПЦР и сопоставить полученные результаты с данными риботипирования возбудителей чумы и псевдотуберкулеза.

2. Изучить генетическую изменчивость штаммов псевдогуберку-лезных бактерий из различных регионов страны. Геногипировать се-рОЕары и отдельные изоляты возбудителя методом УП-ПЦР.

3. Разработать метод обнаружения У. pseudotuberculosis в различных биосубстратах на основе амплификации в ПЦР фрагмента хро-

мссомкого гена инвазивности '.Inv). Сопоставить метод ГЩР с серологическими метода.® индикации антигеноЕ возбудителя (!®А, рдл, РИГА, ММ). Оценить пригодность ЩР в качестве -альтернативного метода лабораторной диагностики псевдотуберкулезной инфекции.

Научная новизна. 1. Впервые методом УП-ПЦР на основе гомологии продуктов амплификации установлена принадлежность таксономических видов У.pseudotuberculosis и Y.pestls к одному генетическому виду.

2. Впервые методом риботипирования (рестрикционного анализа амплифицированного фрагмента рДНК) показано тесное генетическое Родстео бактерий чумы и псевдотуберкулеза еплоть до идентичности отдельных штаммов этих видов, что подтверждает результаты их УП-ПЦР Бидоидентификации.

3. Впервые разработан и экспериментально обоснован экспертный метод определения сероварОЕ Y.pseudotuberculosis на основе анализа УП-ППР паттернов. С помощью данного метода получены новые эпидемиологические данные - показано, что большая часть (5Р7.) штаммов Y.pseudotuberculosis, выделенных от людей на территории России и Украины, принадлежат к пятому, а ке к первому серовару, как считалось ранее.

4. Впервые показана возможность дифференциации бактерий чумы н псевдетуберкулега путем специфической амплификации в ЩР Фрагмента хромосомного гена инвазивности (inv) Y.pseudotuberculosis к на ?той основе разработан метод индикации псевдотуберкулезного микроба в клинических образцах.

Практическая ценность. Предложенный метод экспресс-идентификации вида и сероваров Y.pseudotuberculosis (УП-ПЦР) позволяет проводить экспортную оценку видовой и серологической принадлежности на основе индивидуальных особенностей генома выделенных штаммов псеЕдотуберкулезных бактерий. Разработанный метод обнаружения возбудителя псевдотуберкулеза на основе амплификации в ПНР фрагмента хромосомного гена инвазивности (inv) позволяет проводить индикацию Y.pseudotuberculosis в различных биосубстратах с чувствительностью 2x10 J м.к./мл.

Данные методы могут быть использованы для диагностики псевдотуберкулеза, идентификации и эпидемиологического маркирования штаммов иерсиний, что является чрезвычайно актуальным при выборе соответствующих противоэпидемических, лечебных и профилактических

- -

мероприятий. Опыт применения УП-ПЦР при псевдотуберкулезе будет полезен для генотипироЕания и идентификации возбудителей других инфекционных заболеваний.

Положения диссертации, выносимые на защиту. 1. Генотипирова-ние бактерий Y. pseudotuberculosis и Y.pestls методом УП-ПЦР в сочетании с перекрестной гибридизацией амплифицированной ДНК, а также результаты риботипирования этих микробов свидетельствуют о принадлежности У.pseudotuberculosis и Y.pestls к одному генетическому виду.

2. Профили амплифицируемой в УП-ПЦР ДНК коррелируют с серо-вариантной принадлежностью псевдотуберкулезных бактерий, что позволяет использовать данный метод для выявления серовароз и штам-моспецифических различий Y.pseudotuberculosis.

"3. На основе геноспецифической ПНР с праймерами на хромосомный локус инвазивности (inv) Y.pseudotuberculosis разработан метод геноиндикации возбудителя псевдогуберкулеза в клинических биосубстратах, обладающий высокой чувствительностью (2х103 м.к./мл.) и специфичностью, позволяющей дифференцировать бактерии псевдотуберкулеза и чумы.

Апробация работы. Результаты исследования доложены на Всесоюзной конференции "Профилактическая медицина. Состояние и перспективы" (1991), XII конференции молодых ученых Военно-медицинской академии (1992), заседании Санкт-Петербургского научного общества микробиологов (1994), пленарном заседании научной сессии отделения профилактической медицины РАМН по проблеме "Химия и здоровье. III. Экология и инфекционная заболеваемость" (1995), международных симпозиумах "Эпидемиология и здоровье населения" (Вьетнам, 1995), "Этиология и патогенез инфекционных заболеваний (.Сенегал, 1995).

Публикация материалов исследования. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов и указателя литературы. Диссертация изложена на 274 страницах машинописного текста, иллюстрирована 55 рисунками и 16 таблицами. Указатель литературы включает 114 отечественных, и 230 иностранных источников.

Материалы и методы исследования

Б работе использовали 203 штамма энтеробактерий 25 видов 14 родов, в том числе 31 типовую и коллекционную культуру. Видовой статус всех культур был верифицировал стандартным бактериологическим методом.

Внутривидовое типирование изолятов У.pseudotuberculosis проводили путем определения их серологической принадлежности и спектра антибиотикорезистентности. Серовар псевдотуберкулезных бактерий определяли с помощью ориентировочной и развернутой реакций агглютинации с антисыворотками, полученными из НИИЭМ им. Пас-тера (г.Санкт-Петербург). С целью удаления перекрестно реагирующих антител их подвергали перекрестному истощению по Кастедлани до получения положительных результатов только с типовым штаммом гомологичного серовара.

Чувствительность культур Y.pseudotuberculosis к антибиотикам определяли в соответствии с "Методическими рекомендациями по определению чувствительности к антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков" (МЭ СССР, N £575-33 от 10.03.1933).

Вирулентность псевдотуберкулезных бактерий определяли путем заражения белых мышей и рассчета LDso по первому методу Кербера /Ашмарин И.П., Воробьев А.А., 1962/ и постановки кератоконъюнкти-вальной биопробы (тест Sereny) на морских свинках в соответствии с методическими рекомендациями "Кератоконъюнктивальная биопроба для определения вирулентности возбудителя псевдотуберкулеза" (МЗ СССР, НИИЭМ им. Л.Пастера, Ленинград, 1986). На основании полученных результатов оценивали степень вирулентности исследуемых штаммов в соответствии с критериями, разработанными для возбудителя псевдотуберкулеза Г.Я.Ценевой (1907).

Кальцийзависимость роста штаммов У.pseudotuberculosis изучали по методу Higuchi К., Smith J. (1951).

Антигены псевдотуберкулезных бактерий обнаруживали при помощи иммуноферментного анализа (ИФА), непрямого метода флюоресцирующих антител (ММ), реакции агглютинации латекса (РАЛ), реакции непрямой гемагглютинации с иммуноглобулиновыми диагностикумами (РИГА). Постановку экспериментов осуществляли б соответствии с инструкциями производителей диагностических тест-систем. Исследование при помощи непрямого Шк проводили согласно методическим

рекомендациям "Реакция непрямой иммунофлюоресценции при иерсинио-за<" (МЗ СССР, НШЭМ им.Пастера, Ленинград, 1936 г.).

Методика получения препаратов геномной ДНК из чистых культур бактерий подробно описана ранее /Булат С.А. и др., 1991/. Экстракцию ДНК из копрофильтрата, полученного после отмывки 100 мг каждого образца исследуемых фекалий в 1 мл буфера (50 мМ грис-НС1 рН 3,0; 5 мМ ЭДТА; 50 мМ NaCi), проводили по методу, описанному Kato N. et al., 1993.

При обнаружении Y.pseudotuberculosis в аппендиксах, удаленных при оперативном вмешательстве, ДНК микроорганизмов выделяли ив фосфатно-солевого буфера (рН 7,4), в котором хранились отростки при 4°С. К 100 мкл этого буфера добавляли равный объем 0,5 М раствора ЭДТА и 3 мг/мл лизоцима. Смесь инкубировали 2-3 часа при 37°С, после чего к препарату последовательно добавляли 0,2 М NaOH и 0.4 М трис-HCl (рН 7,8). Содержимое пробирок центрифугировали при 8 тыс. об/мин 10 минут, неразведенный супернатант использовали е качестве матричной ДНК.

При постановке УП-ПЦР применяли универсальные олигонуклеоти-ды 45, 15/178, 178, ААЕ /Булат С.А. и др., 1991, 1992/. Для амплификации фрагмента рДНК, включающего внутренний транскрибируемый спейсер, расположенный между генами 16S и 233 рРНК, использовали консенсусные рДНК-прашеры, разработанные P.A.D.Grimont па осноЕе консервативных фланкирующих доменов /Мокроусов И.В. и др., 1995/. Фрагмент хромосомного гена inv Y.pseudotuberculosis величиной 1893 п.о. амплифицировали при помощи сконструированных нами прай-меров: 5'-ГТТТГТГГ1ЩАГТТАТА1ЩТЦААА-з'(11), б'-ГЦЦГЦГАТАГТАЦЩТТА-АЦААА-3 (13). Один из концов искомого фрагмента ДНК (праймер 11) находился вне кодирующей части гена, а другой (праймер 12) был комплементарен последовательности с координатами 2250-2272 нукле-отидов /Isberg R. et ai., 1937/.

Амплификацию ДНК (ПЦР.) проводили по Saiki R. et al. (1938) в 20-30 ыкл буфера, содержащего 250-500 мкм каждого dNTP, до 100 нг праймируюпщх олигонуклеотидов, 2-3 ед. термостабильной rtft-поли-меразы, 0,1-100 нг анализируемой геномной ДНК (0,01-0,5 мкл клеточного лизата) в режиме: денатурация 90-92°С, 50 сек; отжиг праймеров - 55°С (для универсальных праймеров), 59°С (для прайме-ров 21, 12), 64°С (для рДНК праймеров), 60-70 сек, синтез ДНК -71°С, 70-120 сек. При использовании универсальных и рДНК прайме-

рев проводили 30-32 цикла ПЦР, а для амплификации фрагмента гена inv Y.pseudotuberculosis - суммарно 40 циклов ПЦР со сменой реактивов после первых 10 циклов и использовании в качестве матрицы 0,1 мкл амшшфиката. Постановы/ Ш-ЩР осуществляли на термоцик-лере ПИ® РАН (конструкторы Третьяков А.Н., Левин Г.П.), геноспецифической ПЦР на термоциклерах трех моделей: Ampl1-250 ("Био-ком", г. Москва), ПИЯФ РАН (г. Гатчина), MJ Research Inc. (USA).

Для визуализации результатов ПЦР амплифицированные фрагменты после разделения в 1,5-2,0% агарозном или 5,5% полиакриламидном гелях окрашивали бромистым этидием и фотографировали в УФ-свете (302 нм) на пленку "Микрат-ЗОО".

Гомологию продуктов УП-ПЦР выявляли путем перекрестной блот-гибридизации по Саузерну. Блотом служил нейлоновый фильтр Hybond (Amersham, USA) с перенесенной на него из агарозного геля ДНК паттернов разных штаммов. Б качестве гибридизационной пробы использовали и2Р-меченый амплификат (все фрагменты паттерна) одного из штаммов или 32Р-меченый какой-либо из макорных фрагментов паттерна, предварительно элюироЕанный из агарозного геля и реампли-фицированный с тем же праймером. Перенос ДНК из геля на фильтр, элюцию ДНК из геля, мечение, гибридизацию по Саузерну и получение радиоавтографов проводили в соответствии с общепринятыми рекомендациями /Sambrook J. et al., 1989/.

Рестрикцию амплифицированного рДНК-фрагмента проводили тремя ферментами - zliul, Mspl, Haelll (Amersham, USA). Фрагмент гена Inv Y.pseudotuberculosis рестрицировати Alul и Mspl. Получаемые фрагменты анализировали в 1,6% агарозном геле.

Результаты типирования штаммов Y.pseudotuberculosis генетическим и фенотипическими методами, определения их вирулентности и Са2'ь-зависимости роста обрабатывав с использованием компьютерной программы BMDP4F. Отношения родства между штаммами устанавливали путем сравнения сканограмм паттернов ДНК в геле и построения дендрограмм по методу иРША при помощи пакета компьютерных программ TAXOTRON /Grimont P.A.D., 1994/. Генетическое родстео изоля-тов Y. pseudotuberculosis и Y.pestis выявляли также путем сравнения паттернов рестрикции амплифицированного фрагмента рДНК и построения бинарной матрицы (1 - наличие фрагмента; О - его отсутствие), конвертируемой в матрицу различий по формуле: Д = 1 -2Пху/Пх+Пу, где Д - коэффициент различия, Пху - число общих фраг-

ментов для штаммов X и У, Пх и Пу - суммарное число фрагментов в паттернах каждого из штаммов /Hibbet D., Vilgalys R., 1991/. Матрицу различий строили по всем рестриктазам одновременно, а для построения дендрограммы по методу UPOTA использовали пакет ТАХОТ-RON.

Для оценки результативности обнаружения Y.pseudotuberculosis в копрофильтрате экспрессными методами вычисляли средние или относительные производные показатели чувствительности и специфичности каждого из методов и их средние ошибки. Статистическую достоверность различий результатов определяли при помощи критерия t Стъюдента. Нулевая гипотеза отвергалась при уровнях вероятности Р<0,05. Для статистической обработки использовали компьютерную программу Stadia (Кулаичев A.n., 1987).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенные исследования позволяют сформулировать и представить для защиты следующие основные результаты настоящей работы.

Видовдентифинация Y.pseudotuberculosis методами УП-ПЦР и риботюшрования

Генотипирование методом УП-ПЦР 29 типоеых культур и 10 природных изолятов 6 видов рода Yersinia (У.enterocolitis, Y.Treüe-riksenii, Y. intermedia, Y.kristeriscnil. Y.pestls, Y.pseudotuberculosis) показало, что практически любой из используемых прайме-ров был пригоден для видовой дифференциации иерсиний. При этом максимальное сходство УП-ПЦР паттернов наблюдалось для бактерий псевдотуберкулеза и чумы.

По праймеру 45 паттерны типовых культур У.pseudotuberculosis и изолятов Y.pestls имели по 6-8 общих мажорных фрагментов из 9 (рис. 1). Анализ дендрограммы, отражающей взаимосвязи исследуемых штаммов на основании общности фрагментов ашлифицированной ДНК (.6= ± 1,4-2,0) показал, что по данному праймеру сходство ПЦР-пат-тернов типовых культур Y.pseudotuberculosis составляет 58-83%, изолятов Y.pestis - 78-95%, штаммов Y.pseudotuberculosis и Y.pestls - 58-68%. При этом типовые штаммы Y.pseudotuberculosis серо-варов 3 (NCTC 10278) и 4 (NCTC 8579) кластеризовались с изолятами

UPGMA

0 . 6 L ' * 1 '-1

rC

П

I_

fC_

-1 1 ! П

L_

1—

~1

bpxlOO I I 2,° 1°

Y.pestis 3760 ii! iii! i hihi i ii ii

Y.pestis 2242 ill iui iiiiiii i n ii

Y.pestis 1438 iiiiii! min i in ii iiiiii i ii ii

Y.pestis 2130 Ill iui

Y.pestis EV ulli III lllllll iiiiii I Uli I II II

Y.pestis 571 iii i iui 1 iii 1 1 iii t 1 1 II 1 I t III 1

Y.pestis 295

Y.pestis 752 II IIIIII Ii II 1 IIIIII 1 IUI mm s i i

Y.pstbs NCTC 8579

Y.pstbc NCTC 10278 »III iii! 1 1 ii 1

Y.pstbc NCTC 11067 HIB 1 iiiiiii i i

Y.pstbc NCTC 10275 hihi iiiiii ii ii ii

Y.pstbc NCTC 10277 mill 1 Hill! 1 ii 1 ii

Y.pstbc NCTC 8580 и in IUI IIIIII 1

Рис.1 Дендрограмма, отражающая генетическое родство штаммов Y. pseudotuberculosis и Y.pestis (по результатам гено-типирования методом У1ЫЩР с праймером 45.).

чумного микроба, а не с эталонными штаммами других сероваров, указывая на то, что бактерии псевдотуберкулеза высоко дивергентны по структуре генома и уровень родства Y. pseudotuberculosis и Y.pestls аналогичен таковому у различных сероваров Y. pseudotuberculosis.

При определении генетического родства бактерий по праймеру 21 (б = ± 1,4-2,0) наблюдали сходную картину: подобие ПЦР-паттер-пов штаммов Y.pseudotuberculosis составляло 45-85%, изолятов Y.pestls - 55-93%, межвидовая степень сходства - 45-65% (рис. 2а). При этом штамм Y.pestls EV показал большее сходство с типовыми культурами Y.pseudotuberculosis, чем с другими вирулентными изолятами Y.pestls, а один из штаммов Y.pseudotuberculosis (NCTC 8580), выделенный в отдельный кластер, по уровню различий перекрыл различия между Y.pseudotuberculosis и Y.pestls.

На дендрограмме, отражающей родство штаммов по праймеру 178 (б = * 1,4-2,0%), видно, что при сохранении общей тенденции, свидетельствующей о большей внутривидовой стабильности генома Y.pes-tis (до 28% гетерогенности ПЦР паттернов изолятов) по сравнению с Y.pseudotuberculosis (до 40% вариабельных фрагментов) штаммы чумного микроба группируются в два кластера с уровнем сходства паттернов 83% и 94%. Однако, каждый из этих кластеров включает по одному штамму Y.pseudotuberculosis - NCTC 10275 (серовар 1) и NCTC 10277 (серовар 2) со степенью подобия 76% и 80% соответственно (Рис. 2d). Таким образом, и по этому праймеру было выявлено тесное генетическое родство двух изучаемых видов.

Следует отметить, что в УП-ПЦР применяют праймеры, амплифи-цирующие разные локусы генома, вследствие чего результаты, получаемые с каждым праймером, являются независимыми. Поэтому группировка штаммов на трех вышеописанных дендрограммах изменялась. Однако, в целом по всем используемым олигонуклеотидам для обоих видов наблюдалась сходная и перекрывающаяся изменчивость УП-ПЦР паттернов. Установление сходства или идентичности паттернов амп-лифицируемой в УП-ПЦР ДНК как одного из критериев биологического (генетического) вида /Булат С.Д., Мироненко Н.В., 1990, 1992/ позволило сделать вывод о принадлежности Y.pseudotuberculosis и Y.pestls к одному генетически гетерогенному виду.

Вместе с том известно, что решающим аргументом при определении видового родства изучаемых изолятов, независимо от степени

UPGMA

s ,_-_____

HZ -С

а).

UPGMA

rC

к

н

Y.pseudotuberculosis NCIX: 11067 Y.pseudotubereulosis NCTC 10278 Y.pseudotuberculosis NCTC 8579 Y.pseudotuberculosis NCTC 10275 Y.pestis EV

Y.pseudotuberculosis NCTC 10277

Y.pestis 752

Y.pestis 571

Y.pestis 1438

Y.pestis 2130

Y.pestis 3760

Y.pestis 2242

Y.pestis 295

Y.pseudotuberculosis NCTC 8580

Y.pestis 2242 Y.pestis 2130 Y.pestis 3760 Y.pestis 1438

Y.pestis IiV

Y.pseudotuberculosis NCTC 10275 Y.pestis 752 Y.pestis 571

Y.pestis 295

Y.pseudotuberculosis NCTC 10277 Y.pseudotuberculosis NCTC 11067 Y.pseudotuberculosis NCTC 8579 Y.pseudotuberculosis NCTC 10278 Y.pseudotuberculosis NCTC 8580

[?.2 Дендрограммы, отражающие генетическое родство штаммов Y.pseudotuberculosis и Y.pestis по праймерам 21 (а) и 1V8 (б).

подобия ПЦР паттернов, является гомология их ДНК (Булат С.А., Ми-роненкоН.В., 1992/. Результаты перекрестной блот-гибридизации ПЦР-паттернов с использованием в качестве гибридизационных проб 32Р-меченых амплификатов Y.pseudotuberculosis NCTC 10275 (праймер 45), Y.pseudotuberculosis NCTC 10278 (праймер АА2), Y.pestls 752 (праймер 21) подтвердили гомологию ДНК штаммов Y. pseudotuberculosis и Y.pestls.

Таким образом, на основании сравнения УП-ПЦР паттернов и данных перекрестной блот-гибридизации амплификатов возбудителей чумы и псевдотуберкудеза установлено, что по структуре генома штаммы Y.pseudotuberculosis и Y.pestls едины и поэтому представляют один генетический вид, что согласуется с данными по реассо-циации их ДНК /Bercovier Н. et al., 1980/.

Для подтверждения конспецифичности бактерий чумы и псевдотуберкулеза, выявленной методом УП-ПЦР, было проведено их риботипи-рование, заключавшееся в анализе рестрикционного полиморфизма рДНК - общепризнанного эволюционного маркера микроорганизмов /Уо-ese C.R. et al., 1990/. Длина амплифицированного фрагмента рДНК у 8 штаммов Y.pseudotuberculosis (7 эталонных и 1 природного) и 2 штаммов Y.pestls (EV, W-7.) не различалась и составила 1,1 т.п.н. При сравнении полиморфизма длин рестрикционных фрагментов в ага-розном геле было выявлено 3 электрофоретипа по каждому из энзимов (рис. За). Штаммы с идентичными электрофоретипами объединяли в один класс независимо от их таксономического ранга. В результате изученные штаммы были разделены на 3 класса (табл. 1).

Таблица 1

Риботипирование возбудителей чумы и псевдотуберкудеза

Типы рДНК полиморфизма по рестриктазам Класс рДНК Количество штаммов

Rsal Mspl Haell!

Ar Am Ah 1 7

Br Bm Bh 2 2

Cr Cm Ch 3 1

Первый класс включал 5 штаммов Y.pseudotuberculosis (типовые

культуры сероваров 1, 2, 5, б, природный изолят 21 серовара 1 по данным РА) и оба штамма Y.pestis. Ко второму классу были отнесены эталонные штаммы Y.pseudotuberculosis серовара 2а, 3; к третьему - Y. pseudotuberculosis NCTC 8580 (серовар 4). Таким образом штаммы чумного микроба не отличались от большинства изолятов псевдотуберкулезных бактерий, тогда как вид Y.pseudotuberculosis по уровню генетической изменчивости, в соответствии с данными УП-ПЦР генотипирования, оказался еысоко гетерогенным видом. Для оценки уровня дивергенции между установленными классами рДНК была рассчитана матрица различий и на ее основе по методу UPGMA построена дендрограмма (б = ± 1,4-2,0%) (рис. 3 6). Из этой дендрограммы видно, что наиболее близкими являются классы 1 (объединяющий штаммы обоих видов) и 2, группируемые в малоразличимый кластер с уровнем сходства 87% и отдаленные от класса 3 на достаточно большое расстояние с уровнем подобия 70%.

В целом, проведенное исследование свидетельствует, что по структуре амплифицируемого фрагмента изоляты чумного микроба идентичны большинству штаммов псевдотуберкулезного микроба, отдельные серовары которого по этому признаку значительно различаются между собой. Следовательно, между штаммами Y.pseudotuberculosis и Y.pestis существует более близкое генетическое родство, чем между изолятамн Y.pseudotuberculosis различных серовариантов. Объединение в один рДНК класс штаммов бактерий чумы и псевдотуберкулеза указывает на то, что и по этому тесту - структуре фрагмента рДНК - Y.pseudotuberculosis и Y.pestis могут быть отнесены к одному виду.

Таким образом, исходя из совокупности известных таксономических признаков и наших данных по рестрикционному анализу рДНК, Y.pseudotuberculosis и Y.pestis действительно принадлежат к одному виду, но виду таксономическому - категории, относительно критериев которой у микробиологов и до настоящего времени нет окончательной договоренности. И только на основе данных УП-ПЦР -сходства ЩР паттернов и, особенно, гомологии амплифицированной ДНК - Y.pseudotuberculosis и Y.pestis можно отнести к реально существующему генетическому виду. В свете полученных данных процесс видоидентификации любого микроорганизма представляется как проведение амплификации геномной ДНК штаммов с использованием практически любого универсального праймера и дот-блот-гибридизации

bpxlOO

20

10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 а/

UPGMA

1.0

- ^pseudotuberculosis NCTC 10278 (II)

'- Y.pseudotuberculosis NCTC 10275 (I)

- Y.pseu dotuberculosis NCTC 8580 (III)

6/

Рис.3. Электрофоретипы представителей (а) и дендрограмма (б) выявленных классов рДНК полиморфизма. Дорожки (рис.За): 2-7 -Rsal-рестрикция; 9-14 - ЯаеШ-рестрикция; 16-21- Mspl- рестрикция; М - маркер молекулярных весов (1 kb DNA Ladder, Gibco BRL).

ПЦР-паттернов с мечеными фрагментами паттерна эталонной (контрольной) культуры.

Генонденткфикацин сероваров У. pseudotuberculosis методом УП-ПЦР

Возможности УП-ЩР для генотипирования бактерий псевдотуберкулеза с целью выявления различий, коррелирующих с серовариантной неоднородностью микроба, были изучены на 109 изолятах Y.pseudotuberculosis, выделенных из различных источников, в большинстве случаев от больных людей на территории России и Украины. В качестве контрольных культур использовали типовые штаммы Y.pseudotuberculosis сероваров 1-6.

В ходе первичного тестирования различных универсальных прай-меров была установлена пригодность любого из них для анализа внутривидовой изменчивости Y. pseudotuberculosis. При этом наиболее эффективными оказались высоковариабельная суперолигосистема 15/178, дифференцирующая все 6 сероваров возбудителя, и олигонук-леотид 45, хорошо различающий серовары 1 и 5 (рис. 4 а, б). При необходимости получения дополнительной информации о структуре генома отдельных изолятов их анализировали методом УП-ПЦР с использованием олигонуклеотидов 21, 178, А-1/178.

Первоначальный анализ 23 штаммов, большинство из которых (21) было выделено в северо-западном регионе России, а 2 - на территории западной Сибири (г.Тюмень), показал, что только 9 штаммов тлели ЩР паттерны (праймеры 45, 178), полностью совпадающие с паттерном типовой культуры серовара 1 (NCTC 10275), а 11 штаммов по двум олигосистемам (А-1/178, 15/178) имели ЩР паттерны, идентичные эталонному штамму Y.pseudotuberculosis NCTC 8579 серовара 5. По одному штамму были отнесены к подвариантам пятого (N 20) и второго (N 21) сероваров на основании наличия в их паттернах фрагментов, характерных для типовых культур Y.pseudotuberculosis NCTC 10277 (серовар 2) и Y.pseudotuberculosis NCTC 8579 (серовар 5). Идентификация изолята 25 вызвала определенные затруднения по причине сходства его паттерна с типовыми культурами Y.pseudotuberculosis NCTC 8579 (праймер 45.) и Y.enterocolitica 09 (праймеры 178 и А-1/178).

Реакция агглютинации с использованием истощенных по Кастел-

а/

б/

Рис.4. ЩР-паттерны типовых культур У.pseudotuberculosis, полученные с праймерами 15/178 (а) и 45 (б). Дорожки (рис.4а): 1 -маркер молекулярных весов (ДНК фага Л/Pstl); 2 - NCTC 10275 (се-ровар 1); 3 - NCTC 10277 (серовар 2); 4 - NCTC 10278 (серовар 3); 5 - NCTC 8580 (серовар 4); б - NCTC 11067 (серовар 6); 7 - NCTC 8579 (серовар 5). Дорожки (рис.46): 1 - маркер молекулярных весов (ДНК фага X/PstDi 2 - NCTC 10275; 3 - NCTC 8579. Стрелками указаны фрагменты, дифференцирующие типовые штаммы У.pseudotuberculosis сероваров 1 и 5.

лани сывороток подтвердила выводы, сделанные на основе УП-ПЦР ге-нотипирования. Полное совпадение данных РА и УП-ПЦР наблюдалось в 17 случаях из 23: у 8 штаммов Y.pseudotuberculosis, отнесенных к серовару 1, и у 9 изолятов, отнесенных к серовару 5. Штаммы, имеющие незначительные отличия от геномов типовых культур Y.pseudotuberculosis первого (N21) или пятого (N20) сероваров по фрагментам ПЦР паттерна, агглютинировались антисывороткой гомологичного серовара, в связи с чем их верифицировали как подварианты этих сероваров.

При разночтении дачных РА и УП-ПЦР (3 случая из 23) предпочтение отдавалось результатам ПДР-генотипирования, так как в этих случаях, по данным литературы, дополнительные методы исследования генома микроорганизмов подтверждают данные однопраймерной ПЦР (Couto М. et al., 1996). Поэтому на основе сходства ЩР паттернов изучаемой и эталонной культур нетипируемый методом РА штамм N10 был отнесен к серовару 1, а полиагглютинабельный штамм N11 и реагирующий с антисывороткой серовара 1 изолят N13 отнесены к серовару 5 Y.pseudotuberculosis.

Изолят 25 по данным РА, электрофореза и гибридизации ампли-фицированной ДНК идентифицировали как особый подвариант серовара 5, не исключая его возможной принадлежности к неизвестному нам серовару Y.pseudotuberculosis.

Так как между результатами УП-ПЦР генотипирования и данными РА выявлено наличие сильной связи (Р=0,0022, Р<0,01). мы пришли к выводу о том, что полиморфизм ПЦР паттернов действительно отражает особенности антигенной структуры псевдотуберкулезных бактерий. Однотипный спектр антибиотикорезистентности и чувствительность всех исследуемых культур к гомологичному бактериофагу, отсутствие корреляции между данными УП-ПЦР и Са2+-зависимостью роста штаммов (Р=0,0782; Р-0,05), их вирулентностью по данным LD50 (Р=0,0717; Р>0,05) и кератоконъюнктивальной биопробы (Р0.5081; Р>0,05) также указывали на соответствие ПЦР полиморфизма штаммов Y.pseudotuberculosis их серологической принадлежности. По всей видимости, это связано с тем, что первоначальный выбор универсальных прайме-ров осуществлялся с целью дифференциации методом УП-ПЦР именно сероваров Y. pseudotuberculosis, а не каких-либо других групп псевдотуберкулезного микроба.

Отметим, что из 13 штаммов Y. pseudotuberculosis, реидентифи-

цированных как представители пятого серовара, 12 были изолированы от людей. Только у двух изолятов человеческого происхождения подтверждена принадлежность к первому серовару, 8 из 9 изолятов этого серовара были выделены от грызунов. Полученные результаты явились стимулом для продолжения исследования в данном направлении с целью выяснения истинного значения культур Y.pseudotuberculosis серовара 5 в патологии человека.

Результаты УП-ПЦР генотипирования (праймеры 45 и 15/178), 86 штаммов Y.pseudotuberculosis из различных регионов России и Украины, подтвержденные данными серотипирования с монорецепторными сыворотками (Р=0,0£42; Р<0,05), показали, что 53 штамма относились к серовару 5, а 33 - к серовару 1. Отсутствие в эксперименте микроорганизмов с иной антигенной структурой мы объясняем формированием исследуемой выборки по результатам проведенного в практических лабораториях серологического исследования, ограничившего спектр изучаемых штаммов сероваром 1 Y.pseudotuberculosis, но не позволившего дифференцировать серовары 1 и 5 данного вида из-за использования перекрестно-реагирующих сывороток.

Таким образом из 109 штаммов Y.pseudotuberculosis к серовару 1 и его подвариантам были отнесены 43 изолята (39,45%), включая 8 штаммов от грызунов, а к серовару 5 и его подвариантам - 65 штаммов от человека и 1 изолят от крысы (60,55%). При этом совпадение результатов генетического и серологического методов наблюдалось в 88,64% при идентификации штаммов серовара 1 и в 93,85% случаев при идентификации штаммов серовара 5. Следовательно, при отсутствии выпуска узкоспецифических агглютинирующих сывороток генотипирования методом УП-ПЦР можно рассматривать в качестве экспертного теста определения сероваров Y. pseudotuberculosis.

Вместе с тем модификация буфера для УП-ПЦР, заключающаяся в повышении концентрации ионов Mg2+ с 6 до 9 мМ, способствовала выделению в указанных сероварах доминирующих подвариантов, имеющих, возможно, клональную природу, и изолятов с оригинальной структурой генома.

К подварианту А серовара 1 были отнесены 8 штаммов с УП-ПЦР паттернами, идентичными типовой культуре этого серовара (NCTC 10275), тогда как к подварианту Б - 19 штаммов со сходными паттернами, отличающимися от типового штамма по 3 мажорным и 5 минорным фрагментам (рис. 5а). 6 изолятов, выделенные при споради-

Рис.5. ЩР-паттерны доминирующих и штаммоспецифических вариантов сероваров 1 (а, в) и 5 (0) Y. pseudotuberculosis, полученные с праймером 45 (концентрация ионов Mg2+ в реакционном буфере 9мМ). Дорожки: 1 - маркер молекулярных весов (ДНК фага Л/Pstl)\ 2 - NCTC 10275 (подвариант А серовара 1); 3 - 1540 (подвариант Б серовара 1) (рис.5а); 1 - маркер молекулярных весов (ДНК фага \/PstI)\ Z - NCTC 8579 (подвариант А серовара 5); 3 - 125 (подвариант Б серовара 5); 4-56 (подвариант В серовара 5) (рис. 5 б); 1 - маркер молекулярных весов (ДНК фага VPstO; 2 - NCTC 10275; 3 - 8 - штаммоспецифические варианты серовара Низоляты 351, 22, 146 , 32, 115 , 470) (рис.Бв). Стрелками показаны основные фрагменты, дифференцирующие серовары 1 и 5 Y.pseudotuberculosis.

ческих заболеваниях и идентифицированные как особые подварианты серовара! (рис. 5в), характеризовались наличием ЩР паттернов, различающихся между собой и незначительно отличающихся от паттерна типовой культуры серовара 1.

К подварианту А серовара 5 принадлежали 33 штамма У. pseudotuberculosis с идентичной типовой культуре (NCTC 8579) структурой генома. Подвариант Б включал 17 штаммов, отличающихся от эталонного штамма отсутствием мажорного и шести минорных фрагментов по праймеру 45 (рис. 5 б) и дополнительным мажорным фрагментом по праймеру 15/178. К подварианту В были отнесены 11 штаммов, имеющих незначительные отличия от подвариантов А и В по обоим используемым лраймерам (рис. 5 б).

Таким образом, на основании результатов У1ЫЩР генотипирования Y. pseudotuberculosis мы сделали вывод о гетерогенности популяции микроба на территории России и Украины, в которой доминируют его различные варианты. Следует отметить, что согласно результатам рестрикционного анализа плазмидной ДНК штаммов Y. pseudotuberculosis также выявлено широкое географическое распространение ограниченного числа эпидемически значимых клонов /Шубин Ф.Н., 1993; Dolina М., Peduzzi R., 1993/, и установлено, что большинство псевдотуберкулезных бактерий, циркулирующих на территории Японии и северной Америки, распространились из дальневосточного региона России /Fukushlma Н. etal., 1994/. С учетом высокого удельного веса штаммов серовара 5 в заболеваемости псевдотуберкулезом в Японии /Tsubokura М. etal., 1989; Toyokawa Y.et al., 1993/, а также фактов выделения возбудителя псевдотуберкулеза от птиц, заселяющих прибрежные районы островов Японии и способствующих распространению возбудителя /Hamasaki S. et al., 1989/, эти данные могут свидетельствовать о правомочности наших выводов о том, что на территории России и Украины причиной заболевания у людей в 65% случаев служат штаммы серовара 5, а в 35% - штаммы серовара 1 Y.pseudotuberculosis.

Обнаружение Y.pseudotuberculosis в различных биосубстратах методом ПЦР

Для обнаружения бактерий псевдотуберкулеза методом ЩР без выделения чистой культуры использовали 1350 образцов копрофиль-

трата, инфицированных различными дозами микроба (103-109 м.к./мл), пробах фекалий от 19 больных псевдотуберкулезом, 12 аппендикулярных отростках, удаленных при оперативном вмешательстве. С учетом возможной изменчивости штаммов Y.pseudotuberculosis, способных вызывать заболевания человека, по плазмидному спектру /Шубин Ф.Н., 1993; Fukushima Н. et al., 1991/ для проведения ЩР были сконструированы праймеры 21 и 32, при помощи которых ампли-фицировали 5'-часть гена с вышележащей некодирующей последовательностью (1,9 т.п.н.).

В процессе экспериментальных исследований были определены оптимальные параметры реакции с использованием в качестве источника ДНК грубых клеточных лизатов энтеробактерий. При температуре "отжига" 59°С и длительности каждой стадии синтеза 2 минуты после 30 циклов реакции единичный фрагмент ДНК искомой длины амплифици-ровали только у штаммов Y.pseudotuberculosis. При этом положительным контролем ПДР служила УП-ПЦР, а в качестве отрицательного контроля использовали клеточные лизаты Y.eriterocolltlca (серова-ров 03, 09, 06.30), E.coli, s.sonnel, S.flexnerl, S.typhi, S.typ-himrlum, E.cloacae, K.oxytoca и реакционную смесь без матрицы.

Осуществляя постановку ЩР в данном варианте, мы не наблюдали синтеза искомого фрагмента у штаммов Y.pestls, несмотря на гомологию генов Inv бактерий чумы и псевдотуберкулеза /Robins-Brow-ne R. et al., 1989/. Отрицательный результат реакции с изолятами чумных бактерий мог быть обусловлен единственной причиной - невозможностью образования гибрида праймер-матрица с участием одного из олигонуклеотидов, расположенного вне кодирующей части гена lnv, видимо, из-за различий в нуклеотидной последовательности ре-гуляторной области Inv-гена у возбудителей чумы и псевдотуберкулеза, однако, для проверки этого предположения необходимо секве-нирование соответствующего гена у Y.pestls. Таким образом предложенный нами вариант ПЦР позволяет дифференцировать штаммы Y.pseudotuberculosis и Y.pestls и проводить надежную идентификацию возбудителя псевдотуберкулеза.

Амшшфишруемый фрагмент гена inv был идентичным у типовых культур и природных изолятов Y.pseudotuberculosis различных серо-варов, на что указывали его равная величина (1898 п.о.) и одинаковые рестрикционные профили по рестриктаэам Alul и Mspl, свидетельствуя о правильном выборе праймеров для индикации возбудите-

ля псевдотуберкулеза.

Чувствительность используемого нами варианта ПЦР позволяла обнаруживать в 5 мкл бульонной культуры 10-12 бактериальных клеток (2х103 м.к./мл), что яеилось стимулом для изучения возможностей метода по выявлению Y.pseudotuberculosis в образцах фекалий. Параллельно для индикации иерсиний - обнаружения их антигенов до выделения в чистой культуре, использовали известные методы серологического экспресс-анализа: РИГА с иммуноглобулиновым диагнос-тикумом, реакцию агглютинации латекса, непрямой вариант метода флюоресцирующих антител и иммуноферментный анализ. Сравнительные результаты проведенного исследования приведены в таблице 2.

Таблица 2

Сравнительная оценка методов обнаружения Y.pseudotuberculosis

Метод Показатели ПЦР ИФА ША РАЛ РИГА

Чу вствитель ность (доза возбудителя в 1 мл / % обнаружения) 2Х103/ 80+13,3 5х103/ 100 105-10б/ 60+16,3 107/100 10б/60± 16,3 107/100 10б/60+ 16,3 107/100 105/20+ 13,3 108/100

Специфичность (количество посторонней микрофлоры / % обнаружения) 10-109/0 10б-107/ 20+13,380+13,3 >103/100 >107/ 20+13,3-60±16,3 10-109/0 <103/ 10+10 108-109/ 100

Установлено, что ПНР является высокочувствительным - 2х103 м.к./мл Y.pseudotuberculosis обнаружены в 80 ± 13,3%, а 5х103 м.к./мл в 100% проб - и абсолютно специфичным методом детекции возбудителя псевдотуберкулеза. Как видно из представленной таблицы, ПЦР превосходит используемые методы индикации антигенов Y.pseudotuberculosis как по чувствительности, так и по специфичности. Кроме того, методом ПЦР любой серовар Y.pseudotuberculosis может быть обнаружен с равной эффективностью по причине гомологии локуса inv у всех изолятов данного вида. В противоположность этому, чувствительность непрямого МФА при выявлении антигенов серо-

вара 1 достоверно вше чувствительности обнаружения антигенов серовара 5 Y.pseudotuberculosis (t>4,472; Р<0,01), что существенно снижает информативность данного метода, а при помощи РАЛ антигены серовара 5 Y.pseudotuberculosis выявить вообще не удавалось.

При исследовании методом ПЦР фекалий 19 больных псевдотуберкулезом людей положительный результат через б часов от начала исследования был получен у 18 человек. Совпадение результатов ПЦР и бактериологического исследования составило 97,7% и между этими методами установлено наличие сильной связи (Р=0,0079; Р<0,01). Анализ 12 образцов операционного материала от больных с диагнозом "острый аппендицит" позволил выявить фрагмент гена Inv Y.pseudotuberculosis в трех пробах, в двух из которых удалось также выделить чистую культуру Y.pseudotuberculosis.

Полученные результаты свидетельствуют о возможности успешного применения разработанного нами метода ПЦР-диагностики для экспрессного обнаружения возбудителя псевдотуберкулеза в клинических биосубстратах.

ВЫВОДЫ

1. Методом УП-ПЦР подтверждена принадлежность бактерий Yersinia pseudotuberculosis и Yersinia pestls к одному генетическому виду. Критерием генетического вида служит гомология многочисленных фрагментов ДНК, амшшфицируешх методом УП-ПЦР, а также сходство УП-ПЦР паттернов.

2. По данным риботипирования фрагмент рДНК (ген 16S рРНК -внутренний транскрибируемый спейсер - ген 23S рРНК) Y.pseudotuberculosis и Y.pestls имеет одинаковую рестрикционную структуру, что согласуется с их принадлежностью к одному генетическому виду. По сравнению с генетической гетерогенностью серовариантов Y.pseudotuberculosis родство этих таксономических видов более выражено.

3. Использование ПЦР с праймерами на хромосомный локус Inv Y.pseudotuberculosis позволяет дифференцировать бактерии чумы и псевдотуберкулеза и, тем самым, проводить надежную идентификацию возбудителя псевдотуберкулеза.

4. Метод УП-ПЦР позволяет дифференцировать серовары и штаммоспецифические варианты Y.pseudotuberculosis.

5. На основе генотипирования 109 штаммов Y.pseudotubérculo-

sis методом УП-ПЦР установлено, что возбудителем псевдотуберкулеза у людей на территории России и Украины в 55% случаев являются штаммы сероБара 5, и только в 35% - штаммы серовара 1.

6. Геноспецифическая ПЦР с праймерами на хромосомный ген ин-вазивности (inv) Y.pseudotuberculosis является высокочувствительным (2х103 м.к./мл) и специфичным методом индикации возбудителя псевдотуберкулеза в клинических биосубстратах.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Булат С.А., Михайлов Н.В., Королюк A.M. Геноидентификация видов и сероваров бактерий методом полимеразной цепной реакции с универсальными олигонуклеотидами: реидентификация ранее выделенных сероваров Yersinia pseudotuberculosis // Еурн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1991. - N 12.- С.2-7.

2. Михайлов Н.В. Применение полимеразной цепной реакции для обнаружения возбудителя псевдотуберкулеза // Природноочаговые инфекции, вирусные гепатиты и СПИД. - Матер, научной конф., 4.2. -Санкт-Петербург, 1993. - С.60.

3. Михайлов Н.В. Обнаружение видоспецифических фрагментов ДНК в геноме энтеробактерий методом УП-ПЦР // Идеи Пастера в борьбе с инфекциями. - Санкт-Петербург, 1995. - с.66.

4. Bulat S.A., Mikhailov N.V. Development of Yersinia pseudotuberculosis and Yersinia pestis PCR diagnostic assays based on INV locus of Yersinia pseudotuberculosis // Abstr. Int. Symp. "Etiology and pathogenesis of infectious diseases", 10-13 April, 1995. - Dakar, 1995. - P.129-130.

5. Mikhailov N.V., Bulat S.A., Mocrousov I.V. Detection of Yersinia pseudotuberculosis by PCR // Abstr. Int. Symp. "Epidemiology and public health". 26.02-01.03.1995. - Hanoi, 1995.- P.60.