Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация, выделение, физико-химическая характеристика и иммуноферментный анализ специфических альфа-2 глобулинов мозга

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Идентификация, выделение, физико-химическая характеристика и иммуноферментный анализ специфических альфа-2 глобулинов мозга"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО НАРОДНОМУ ОБРАЗОВАНИЮ

ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖБЫ НАРОДОВ имени ПАТРИСЛ ЛУМУМБЫ

На правах рукописи

КОРОТЕЕВА Елена Анатольевна

УДК 612.822.1 : 547.962.4.08.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ, ВЫДЕЛЕНИЕ, ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АЛЬФА-2 ГЛОБУЛИНОВ МОЗГА

(03.00.04 — биохимия)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва—19 9 1

Работа выполнена во Всесоюзном ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте общей и судебной психиатрии им. В. П. Сербского.

Научный руководитель —

доктор медицинских наук В. П. Чехонин.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор А. П. Хохлов,

доктор медицинских наук, профессор Л. Ф. Панченко.

Ведущая организация — Научный центр молекулярной диагностики МЗ СССР.

Защита диссертации состоится г.

в Ш часов на заседании специализированного совета Д 053.22.02 при Университете дружбы народов им. Пат-риса Лумумбы по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Университета дружбы народов им. Патриса Лумумбы (117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6).

Автореферат разослан « ^ » |дд 1 г_

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук, профессор

В. Э. ТОРБЕК

Тематический план 1991 г., ,\1> 307

Подписано к печати 11.09.91. Формат бОХЭО'Дб- Ротапринтная печать Усл. печ. л. 1,0. Уч.-изд. л. 0,98. Усл. кр.-отт. 1,125. Тираж 100 экз

Зак. 634. Бесплатно

Издательство Университета дружбы народов 117923, ГСП-1, Москва, ул. Орджоникидзе, 3

Типография УДН. 117923, ГСП-1, Москва, ул. Орджоникидзе, 3

хакиз!.!эв 47И"Гяош1ройак:У1 отдельных нерншг клеток л мозга :; vi- • ло:; невозмо-що без детального знанзя част;::«: метаболических ар>-пессоя, лезедтс в их ослоре. Одно ;:з псрспт.тлвккх налравлея::'! в исслодогдивях колекулярпас основ и1г:-.-гратлЕно:1 деятельное?:: керглой свстемы связало с взученяем биологической ролк белковх; молекул, :: первую очередь поЛроспеп^июсдг.х б ел ко р. ( НСБ ), чредстаяля-одв:: соб>2 угг.;хялыше продукты баосиктетяческо.Ч аг.т:хь~ гости ne:"ipo;ü):; л гллслькнх клеток ( Птарт; М,Б.,1985; Ворезп:; З.Л, iSSO; 1-:оого В. W. , 1S 3 2; 2ir.lt Е.,-,937; Snsrein Д., 1Q3?; Stavroi; Jj„ 198?; En г; L.F., 1949; БЛ*1зоя G., 1990 ).

Сегодня, несмотря на большое количество дн£ор;.:агки, накопляло Я за последние 25 лет, для г.яогях кдентлфктпгрозанньсс КСБ пде не разработали способ;; получения нх з гомогенном состояштд, ;е изучены ф'лзико-хммг/ческио свойства, а уакзв особенности изтп«* !оллзма этих бел коз в норма :: при патология. Лееь для отделы.-""" щенти мщкровшшкх НСБ ( 11—3—2, FOP 9.5 ) определена фуккгао-•ялъная принадлежность ( E.,3iaoinn .1. , "975; V.'illrincon Г ■<';:/}).

ля млогнх НСБ не установлена диагностическая значимость повол- • овация их з качества маркеров наругеаяя функция гематозягяj cci'Oro барьера ( ГЭБ ) при норвнцх, пслхлчосхих зайоловадд.сг, ойропа^лпггях, травмах и опухолях головного мозга.

Особнй гатерес представляет собой поиск, лдентлфакапул, лодовапяо физико-химических свойств, клеточной локализации ;:о~ 1й белков нервной ткали, что явллотся кошг?! вагон к более во/ ому потакания оргзлизапяи хлвоа материи, выявлена повкх цор;. on различие? типов нерших клеток, а тахзо язучентш Фулкцчо-г-'с-'лих систем мозга. Очзвадно :: прикладное значение НСБ для дру^опял я изучен: л патологических процессов, нропеходяцях г.

грн р-ззлачпнх первякх т. пскхкческлх заболеваниях ( Ъ.урс— :>, S.A., 198Ь; Бабаева Г.».., I9Ü9; "o-ton Р.F., 1932; S.iilt Г.., /.!"•-■»; Jon<sovi; 3-D., Яагяп^оз ''9 С 6 ).

•• гд йй^ЛГ-"UU!S♦ Цель Дадтлого г.ссдпдовм: mi ztezxty v;r,c:> г ^ф'-хямнческо:: :*дсг!т-т?,тс:пгггт. ^M'tcveeHii г. хпрактерде-" тг.е пй-г].««-ncirlл-1<;<*.:-д:х :\т?>ф-л-2 глобулдноц, а „.-•:-1 :tx

vM-nocT.'iT'fttof гмгносг:: как маркеров пар;;г; r:v: фун;-.-: ;; ГГЗ ярг

"¡осгзмлчят, Л ;л г тгг* . млп пост.?/'-

1. Провести иммунохимическое изучение спектра водорастворимых ельфа-2 глобулинов мозга человека.

2. Получить высокоочищенные препараты идентифицированных НСБ.

3. Получить моноспецифические антисыворотки к идентифицированным НСБ и провести сравнительный иммунохимический анализ их с описанными ранее антигенами.

4. Изучить физико-химические свойства и химические характеристики идентифицированных НСБ.

5..Изучить клеточную локализацию идентифицированных НСБ в нервной ткани.

б« Разработать и апробировать высокочувствительный иимтпохтличес-кпй метод определения этих НСБ, пригодный для практического здравоохранения.

Научная новизна работы. Иниуноззасг.-гос идентифицировали ранее неописанный НСБ, названный 81 Еа так:!о бело;:.полностью идентичный большой субъедкнице епои'фпчаского ¿^-глобулина мозга ( ¿¿¡зГИ )(, Чехонин В.11., 19В9 )»обозначаемый Б работе К

дгнлым антигенам получены юно сне пифические алтисыворотки. Разработаны способы очистшг идентифидарованных НСБ, а такке изучены их физико-химические свойства. Созданы пммуноферментные системы для определения НСБ в биологических яидкостях и тканевых экстрак-~:ах. Проведена предварительная апробация разработанных иымупофор-"."тгних систем на клиническом материале, на основании чего доны ::тическив рекомендации для применения теста определения ■ В50Р з биологических жидкостях пациентов в клинике нервных и . > ¿хических болезной для комплексного обследования больных.

Практическая значимость работу. Приготовлены стандарты очищению: препаратов идентифишрованных НСБ, а тала;о соноспеипфл-ческио антисыворотки к ним. Разработали иммупофермзатние спсте-

определения НСБ к дани практичестао рекоиендащц применения 07'лх тестов ь клинике для комплексного обследования больных.

Основные полохепня. вшгосгогае нв згдгнг: ыаднчио ь »кстрал-ус из ткани улзга человека ранее нсцдегггнфапарованкого 01 1УСР и Хи^^ТП, кмцунохзшачоскя идентичного бзльпоЕ суйъсдпкню ¿¿Гй; способы очистки, получения изеоспецлфлчосинх с^тиснгоротои» .оы^о-оашлчоскле свойс-тва а х^идч^сксо характеристик:! гтах боа-кэь; меточная ловалкзахия, дашшлгга сглтоза г оптогодогс Ы 1к'-СР г: ^л'^ГМ; ооаагуавивз л тих НСЬ в бгологачрскхх акдьостях зальяш; аергсиаа» и зсг.Ха;'-¡¿егта:; 2&йол8}'.*:.хг^, ь патог^ксг;.? которых

9Т "эсто -нарушение проницаемости ГЭБ, а также в сьъоротк- крови и < /олоплодим водах беременных яенщнн, у которых впоследствии рождались дети с дефектом развития невральной трубки.

Апробация диссертационного материалу. Диссертация выполнена в соответствии с планом научных исследований ВНИИ общей и судебной психиатрии ии.В.П. Сербского. Основные положения диссертанта доложены на ме.тлабораторннх конференциях ЕКШОСП пм. В.П. Сербе«-кого С 1988-1991 гг. ), I Бсесопзном иммунологическом съезде ( Сочи, 1939 ), Всесоюзном симпозиум "Химия белков" ( Тбилиси , 1990 ), I Всесоюзном сшшозиуме с международным участием "Иммунологическая репродукция" ( Киев, 1990 ). Работа обсуздена на заседании Проблемного Совета по биологической психиатрии БШСЮОЯ пм. В.П.Сербского ( март 1991 г. ).

Публикотищ. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ л получено I авторское свидетельство на изобретение.

Структура к объем работы. Диссертация изложена па страшных машинописного текста, содержи? рисунков и таблиц. Опа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов л методов исследования, 3 глав собственпюс исследований, обсуждения получеплых результатов, выводов, списка литературы ( пшшопованзЯ, из них отечественных авторов, иностранных).

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

?'р,тррпалк и мртолк исследорагощ. Объектом исследования слу~ стли ткань головного мозга г, образшг органов п тканей нонеЯрэги :■» того происхозданяя человека я эдвотпнх ( крыс, мкаей, кролгков* ■ сгилоИ, юрекпх едпнок ), сыворотки провп п сшшномозголме е35стп С СМИ ) доноров п больных.

Тяопь мозга л образшг органов п ткопей ненсЛрогокпого прог"-» гопяеяил человека забирали на вскрытиях, проводимых в судебно-•.♦?длпзясгэг: гэрго ПОЛПЛ! км. Н.И.Пярогэва, в гэрго лрп Мэокоэ-;гэЛ кдляпч<-скоВ асжстатрической Содмшг} <•'' I см. П.П.Г-Г-дспко.

голэгкоге гозга к оргелов сп~но:1 бп-тл получен:.: па боЛля" •ггсопо.-З плата им. А.И.Млк» -ла, тлглк эг.сг "г.-п'зятакыпе: г-.гготгпг: -!3 гягартя при ШШОСП гч 3.П.Сербского. Блологкчесет.о гзздкостя •о го рои п Cn.ii.mv: голучглп со етаппт? пврелягатся грот: у родкль« зух догор, глпшп: ^г/льтстсг-ог? хирург--, дотегой неврология г!, юдгатртп, глутреппях болезиеЗ " !ЮЛГГД им. 2.11.1! ярогога,

-лпиякя болеэиеЯ 3 ГЯ гм. Й.А.Сзмс^», ЕШ поврэ-

логин ИЗ CGC?, L'OCJIOBCXOÏ! клинической пспзшхтркческой больший У, I П.П.Кадрнко, ШЕЙКИ юл. I:.tf.Владимирского.

Для получения высокоочн'денннх препаратов и изучения физико-хпмпческкх свойств идентифицированных НСБ использовали методы допообменной, афтинной, гидрофобной хроматографкк, гель-^яш/гра-ïz:z, изохронатофокусирэзаяия, даск-йдектро^ороза ь 12,5 % 11ДАГ с додецисулыЗатоы натрия. Белок определяли методом о. Lowryi ISSI), углеводы - фенолсернокяслцц г. оршювмл кетодаш, скудовие кислоты - методом L. Warren ( 1956 ). Углеъодный аиелич изучаемых НС!> проюдклй ионообменной хроматографией на шшоиообмлшюй оыо-'-'-ii (zeol » Япония) в градодг.з боратного буфера, ашнокис-анализ - на аминокислотном анал:к.-':оре piirra... -tô 5001СЩА). Спешил; чес кие антаскворотки г. КСБ ;:ол>чали путем лшуииэадаа к".«»ляков полуочжзенныаза и очиденкк:": ■ t\'.vaf.os НСБ но схемам, дуально раз работали и.; Б.ВЛСалаглн;::. ■■ \ J13S). Лая характерно-антисывороток, препаратов г-литья п антигенов пршкешии исходи ншунохш.аческоГо анализа- "етод кьмуиодкфЁузи» по о. Ouchtcs ir.nу в кодификации Н.ИДрамковой и Г.И.Абелева (IS6I), метод ?,;,)Нсэлектрофореза по H. Kinchin-Clarc (IS6t3). Клеточную локата-аги-тия альфа-2 глобулинов определяли на парафиновых срезах ткани мозга человека непрямш имыунофдюоресцентным котодои (т. wilier, 1254). Для изучения впдо- и тканеспецифичности йдеитийкЕдровашпге антигенов, a такясе для опенки возьоаности использования их в ка-гостве маркеров нарушения функции ГЭБ бык разработаны ¡ишунофер™ ".:i':!thue систему с пределом чувствительносте 0,8 итд'л.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ill ОБСУШКЛЕ Идентификация. изучение Физико-химически^ свойстг .неЯдоспс-циФачески? вЬ-глобудиноя•

Сегодня, с болыаой долей вероятности, шжно предположить, что Б результате тридцатилетнего поиска идентифицированы практически все цктоплазматичэскно НСБ с концентрацией вшо 200 кьт/1 г пй-цего болхса ткани ьюзге., антегенностъ которцх достаточна, чтоои при ишукпзагкп хиеотнцх ьодко-солег.ш.: вкгтрактом из ти^пп иэзгп получить аат2сиБ0рэтку, содерк&зую {хткстрпрурь^о количества спс-тетфцч&скяп: антител. В подтверждение Бизсгсиазашюго следуо? отстать, что врг. использовании этого подхода нел: ке удалось получать антнсиворотку и кзпротоку всйроссешсичроюш ¿¡чглпоухияш. Все сорта сскгучспиих ьитисивороток содер^&ав fucokoC т»тр алтв-

тел г. белкам сыворотки крови и межорганным антигенам, присутствуй' wu помию ткани мозга в печени и легком. Очевидно, в водно-солевом экстракте из ткани мозга человека, используемом в качестве препарата для иммунизации доля этих белков бшга значительно выше уровня НСБ, характеризующихся к тому же меньшей антигенное-тыэ. В связи с этим в качестве препарата для иммунизации нами исследовалась полуочищенная и сконцентрированная белковая фракция экстракта из ткани мозга человека. Такой подход дал возможность, с одной стороны, резко ограничить спектр примесных белков, с другой - увеличить в 400-500 раз концентрацию белков с общим! фкзи- • ко-химическими свойствами, что позволяет даже при низкой антиген-ности этих белков, достигнуть полноценного гуморального ответа.

С целью получения антисыворотки к нейроспещфическим о^-гли-копротеидам для иммунизации кроликов использовалась фракция водно-солевого экстракта из ткани мозга человека, полученная в результате ионообменной хроматографии на ДЕАЕ целлюлозе и аффинной хроматографии на соп-лсефарозе ( так как большинство известных о^-глнхопротеидов имеют высокое сродство к вышеуказанным носителям ( В.П.Чехонин, I98S; Березин В.A., I990;warecka к.,1972;Ens-tein к., 1987 ). После истощения сухой плазмой человека, а так-ге лиофилизованнкми экстрактами печени, легкого, селезенки йолу-ченная антнсыворотха выявляла в препарате, используемом для иммунизации, 3 антигена с электрофоретичэской подвижностью ^-глобулинов я в тесте иммуноди^узии не прешшитировала с экстрактами органов в тканей пенейрогенного происхождения. При иммунохииичео» кон сопоставлении с g?ap,s-100, 10-40-4, 14-3-2, спешфическимц Ыj- в с^-глобулинаю шзга ( ¿ЧГЫ и ^¿^ ) • ^^ i5uJI° виявло;к>в что в данной антисывороткв содержатся антитела к c(£U, а также к 2 ранее нвжзвестныи НСБ. В дальнейшем изучали 2 НСБ, прнсутстауо-пяо в препарате в больаей концентрации. Один из них, ишунохиш-чзсгп нендентичннй ранее идентифицированным НСБ, был обозначен КАЯ 81 BSGP ( 81 Braia Specific Glycoproteia ) на основания виачонля его мэлекудярзой тяссы и принадлегностя п классу глико-протеадов. Другой антигеп, обозначенный Ia*^'» имиунохимически бил идентичен J. ¿ГИ ( Чехслш В.П., 1989 ), однако различия в фи-а*но-*ямжчесяях свойствах этих антигенов ( неоданакоЕОо сродство в ДЕАЕ целлюлозе ) обусловили необходимость дальнейшего ого ис-сдрдованяя.

Для изучения физию-ххмачесшас свойств 81 BSGP п Ь^дГМ, a

•.таксе приготовления г.оиоспецпч -гческих илтпсивсроток к шш были разработаны оригинальные схемы очистки, позволяшле получать ви-сокоочищенные препараты этих НСБ. Выделение идентифицированных КСБ из водно-солевого экстракта пз ткани мозга человек основано на последовательном применения ионообменпой, аффинной хроматогра-фдй, гель-фильтрации, гидрофобной хроматография, изохроматофоку-сарования ( рис. I ).

Водно-солевой экстракт из тканп шзга человека

Ионообменная хроматог^фпяка ДЕАЕ пеллнлозо

фр.,элюирувдаяся с носителя в фр., элюпрушаяся с носителя в диапазоне концентраций хлорида диапазоне концентраций хлорида л.тпжя'от О,55 до 0,50 II натрия от ,0,3 до 0,5 1.1

Аффинная хроматография на соп-А сефарозе I

I , !

Я-., олипрующаяся с носителя в фр.. ;; .и^уищаяея с носителя в диапазоне концентраций -метил- дизи (••••лконцентрадяй -метил» 2~г.:акнопиргнозида от. 0,1 до 0,2}.! п.раяозида от 0,13 до 0,2

I I

Гель-фшхьтрандя иг-. . .!.'с.-яъ-фцльтращш ка сефадексе с-200 ссфадексе о-юо

I !

«.р- с юлекулярноЁ массой тр. с мол окулярной массой

¡и+10 кД | ' 65+10 кД

Гидрофобная хроматография на фенил-сефарозе I

I I

-!>р., олотрувщаяся с носителя в фр., злялрувиался с носители в ."*::ппазоце концентраций сульфата диапазоне концентрат?! сульфата V 1,.ош1я от 0,20 до 0,05 и аммония от 0,45 до 0,17 У

' ■ I 1

Изохроматофокусированпо на РБЕ гаде

• ^ 1

элюирувдаяся и диапазоне фр., аяюирушаяся в диапазоне рН оч 6,0 до 5,3 / рН от 4,25 до 4,10

Р Ь^Ш

81 bsg

Ркс. I. Схема вцдедвния 81 bsgpn ïs^^li

В процессе рошшзаша давних способов очастш: Оиш получек и препараты 81 bsgp п соотвотегашко, £0 и вЬ i частоты,

юторув оценивали дисЕ-адвЕтрофоротвчгсвл и ь^тодоц ю^-аонпево-го аналета. Еотера препаратов ei bst.p ы Ie^^TU па проиезуточип этапах выделения не п?«мюада 43 а 25 t соотъ«т<~т?«»кно. У.имунЕэь-оя Даниила пресауатакз кроликор породи яинтилла дата ^зшкн^сть ио-лушгъ Екоококачестьенные глэноспешчичреклр аяти^ы кротка к

ид; ;?и$ищрованным НСБ.

Физико-химические свойства исследуеннх антигенов ( табл. I ) хорошо согласуются с их химической характеристикой ( табл. 2 ) „

Таблица I

0ШКО-ХИШЧЕСКИЕ СВОЙСТВА Is^TM и 81 bsg?.

(Ьизико-химические свойства

Isoyil

81 33G?

Осаждение сульфатом аммония

Осаяденио этанолом

Эсаздение ТХ7 Зеагденио бутснолои.

\дсорбциогганв свойства: I) окись алюминия I) гидроксилапатит

осекается при 4070 % насыщения

осаждается при либо % насыщения

я

I) сулы!лт бара '.) окись магния

1qtj?'o стабильно стъ

Ьапмэдрйствио с лектяна.тл:

'.)Concanavalln А !) J>ntil-lectin

■гносптелънал голокулярная асса:

)измеренная ;:етодо!.! голь— ;:льтра1яа

)измеренная сзтодом днсл-лсг.трофорсзп п ПАТ с r>DS

: •го'гятлдытл пл*>птрофо~ гтпчоская подг"=пость:

гот:.,",

тн^дпСстгла с Сспгл» ~фарозой

с гэпр'.'л

>r<yuop:

1 пин к

50 % этанол осая- 50 % этанол осаждает 25 % антигена дает 30 % англгепо

10 % ТХУ осаздаот антигены

10 % бутанол дсна- 15 % бутанол оса-;~ турирует антиген дает 20-25 ^ антигена, при этом Ь0л-его денатурирует

адсорбируется 90 адсорбируется

но адсорбируете -но адсорбирует'. /;

инкубаига пр;; 80 °С

связывается 100 антигена связнзается ''О-¿30 % антигена связывается 30-

ад сорбируется адсорбируется 35-

4Ü

антигена

не адсорбируется но адсорбируется

вцдеряиваог 20

связывается 80- . 90 % антигена связывается Ь0-60 1, ант иг г-н а по связывается

-го

антигена

55 + 10 кЛ 54,0 + 1,0 гЛ

<0*0,01

л,Ю - 4,25

сгпзгямется .ТОО cfntrcn.i

кобальт

ПР ергзкр.-етея

■ля с::гзкг""тсгс

но спязитартея

81 + Ю чД _

1 зона - 50+1,5 к.

2 зона - 30+2,3 п.

0,52+0,02 5,3 - 6,0 связывясvan ?0 г

гс cv-'i'raGTCi: снят паяется 1Ь

па от:~з5гг''\стся

Таблица 2

ХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА Is^^TM И 81 BSGP РЕЗУЛЬТАТЫ ОБЩЕГО ХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ЬоуИ И 81 BSGP

Химический состав, мг/ЮО мг

Is^gTU

81 BSGP

Белок

Моносахариды Сиаловые кислоты Гексозамины Сульфат_

82,42

4,62

0,55

0,91 +

69,80 9,10 0,02 1,40

АМИНОКИСЛОТНЫЙ СОСТАВ l&gU И 81 BSGP

Аминокислота % аминокислоты на 100 аминокислот Аминокислота % аминокислоты па 100 аминокислот

IsCgTl! 81 BSGP Is^gTM 81 BSGP

дас (о_н)

ГИС 3

АСП

ТИР

ПРО

АЛА

МЕГ

ИЛЕЙ

ФЕЯ

1,15 3,36 li.82

4.22 1,35 7,61 2,07

5.23 5,17

1,70 8,30 6,SO 3,40 7,90 3,10 5,80 7,90

ЛИЗ АРГ ГЛУ СЕР ГЛИ

Ii

ТРЕ TRI

7,18 2,00

4,79 2,26

iL 34 9,оо

4,78 4.30

10.04 IÖ.QO

7,35 8,60

1,86 6,40 6^22 не определялся

.1 JUi и, tu лог. УГЛЕВОДНЫЙ СОСТАВ Is^M И 81 BSGP

Моносахариды, ; т/100 мг вещества WgTU 81 BSGP BecoEoe соотношение

Iᜯ2TM 81 BSGP

Глюкоза 3,43 2,4 5,53 8,00

Ыанноза 2,12 I.I 3,41 3,67

Галактоза 1,66 I.I 2,67 3,67

Сухоза 0,82 0,4 1,32 1,33

Глюкозамин 1,36 0,6 2,19 2,00

Галактозамин 0.62 0.3 1.00 1.00

81 BSGP состоит из 2 су0ъ единиц с молекулярными шссаш 30 в 50 х£ и имэет в своей составе 2 ЕП^-конпввые аминокислоты - валив а глицин. состоит из I цоляпептпдиоВ neos, пн ^овце вой аминокислотой этого белка является глютамшювая кислот«.

I ииыунохжмически идентичен л^ГУ. Углеводный и амаво-

кдслотпыа составы отзз антигенов чрезвычайно близки меаду собой.

Ö

также схожи многие физико-химические свойства ( относительная электрофоретическая подвижность, изоэлектрическая точка, сродство к лектинам, отношение к органическим растворителям )• Однако молекулярная масса Is^gTM значительно меньше молекулярной массы ¿¿ГМ, которая соответствует 90+10 кД. Известно, что о<^ГМ состоит из 2 субъединиц с молекулярными масса},и 53,0+1,8 и 31,0+1,1 кД и в составе его определяются 2 А^-концевые аминокислоты - глицин и глютаминовая кислота ( Чехонин В.П.,1989 ). На основании сопоставления значений молекулярных масс, а также результатов отеком пе во го анализа Is XgU и ¿¿ГМ ми пришли к выводу, что идентифицированный антиген является большой субъединицей ^¿ГМ, самостоятельно присутствующей в препарате, использовавшимся для иммунизации. При иммунохимяческом сопоставлении IaokjTM и 81 bsgp с s-100, gfap , 14-3-2, 10-40-4, ¿J-ГМ, pgp 9.5. dna-110, 14-3-3, habs а также маеду собой установлена их полная иммунохимическая неидентичность.

Изучение ткане-. вилоспецифичности и динамики синтеза в онтогенезе нейроспепифических Isrf^M и 81 bsgp.

Ишлунодиффузионный анализ, позволяющий определять 81 bsgp и в концентрации 2,0 и 1,8 мкг/мл соответственно, из-за недостаточной чувствительности оказался непригодным для исследования ткане- и видоспепифичности идентифицированных антигенов, а также динамики их синтеза в онтогенезе. Получение препаратов антител к 1з:?уи и 81 BSGP из соответствующих мэноспедафических антисывороток дало возможность разработать иммуноферментныа систем для определения этих НСБ с пределом чувствительности 0,0 кг/ил. В процессе ишупоферментного анализа изучаемые антигены не были обнаружены в образцах экстрактов из тканей сердца, легкого, печени, почки, селезенки, кишечника, ниш, аорты, желудка, подделудочноа п гштовидно3 желез, желчного и мочевого пузыря, надпочечника, молочной железы, иаткн, простаты, кояи, веян, язчннков, янчка, что даот основание считать 1з<><2ГМ а 81 BSGP пеЯроспоплфячееютаа па уровпо чувствительности метода.

ок.13 ал с я плдоспескфзчным и выявлялся только в экстракта нэ тканл тяга чалов?ка в диапазоне концэптрашй от 256 да 1024 нг/ш ( про ан ал из яро пано 36 об раз ш в ). В отлично от bc^gTU 81 bsgf пидонрспенифячен, он идентифицирован в экстрактах аз ткана отзга человека, свинья, крысы. В экстрактах аз ткани ьт>зга

81 bsgp .определялся в диапазоне концентраций от 560 до 1600 нг/ш', что касается его уровней в экстрактах из ткани мозга свиньи и крк-сы, то они соответственно били равны 125+20 к 240+15 нгАя.

Если проследить за динамикой синтеза к 81 bsgp в онто-

генезе, то отчетливо видно, что их уровни весьма постоянны с момента рождения индинида и количественно равны содержанию 81 bsgp к IsKgTM в ткачи мозга взрослого человека. Что касается изменения концентраций 81 bsgp и 1с¿¿ГМ в ткани мозга в пренатальном периоде, то впервые исследуете белки били выявлены нами в экстракте из ткани мозга-эмбриона 10-13 недель в концентрации 50-100 нг/мл. До 9 месяца пренатального периода наблюдалось постепенное увеличение концентрации 81 bsg? и Ьд^М. Сопоставляя эти дшшко с результатами иммуно;/ореологического анализа к eiBsor км-

муносяюоресцентшл: методом ка пара^зшовнх срезах ткани мозга человека, при котором Is^gTU был локализован в астроцитах к олкго-дендроглиоштах, а ei bsgp - в астроцитах, ость основания предполагать, что идентифицированные белки являются метаболита;,к спон-гиобластов и сохраняются в проводных из них ияоточпцх линиях в течение всей гизни.

ИммуноДррмонтнцД .«начиз 81 bsgp и Ьз-'оГМ в экстрактах из_

ткани f.-пзгп и бкологкчргких жидкостях больных кррвно-пситк-чееккмп заболегатеяуи, а такхе огтутрлями головного к-'згр,.

Иммуно^ер.чентные систем:; для определения ei bsgp к b'^TU, тлеющие предел чувствктельностп 0,8 :tr/i~, били апробировали памп для оценки изменения биосинтеза этих белков Б ткшп; иэг.га болыиа; некоторыми нервными к психачоскдми заболовекгякл п опухоли.::: золотого мозга, а такте возмзшостп использования вьдеукзгьштх гл:~ укгенов в качество маркеров парупення цронкцаскостг. ГЭБ ерп ря^с патологическою: процессов. Hai; но удалось 1л/:в:1ть лзионенгл урос-ueü I sJtjTil и 81 bsgp ь экстрактах и тке-.г.п юз га глдой, .'Г-'--:-"-стредакаих фоОрильной цизофрондой, остро.': алкогольное asmc-icronc« тиеЁ, алокачественкшл нейролеатечвекка еккдрогом» шеулътэи. Б s» zo время незначительное увеличено копцектрацга я» «»б

шсгЛ'Л о-тмэчалоеь в 5 (• сз 5 тестируоущс 5 экстры:?«* в x ( кз 9 ) экстракте глг.оолесто^ в ъ Ь v 1:3 12 )

одкгод »зндро гл 1,0 !■,

Прогдз чал крлступять к UibSwy г.сзультато? нмчуно ипродс<ле;;глг lu-oi''' u 51 i- iraMriiverauc пидг.ост«л

то

Л ч>

следует отмзтп'.-ъ, что с помощью иммуноформентник систем, имеющих предел чувствительности 0,8 нг/мл, в сыворотке крови здоровых до~ норов ( просмотрено 1025 образцов ) и беременных женщин, у которых впоследствии рождались здоровые дети ( 40 ), не определялся, в то время кап 81 БЗСР был выявлен в 15 образцах сыворотки крови доноров. Учитывая это, за верхнюю Гранину нормы были приняты уровни Тс^^ГМ и 31 взс? соответственно равные 0,8 к 1,6 кг/мл. Увеличение концентрации этих антигенов в сыворотке "рог'И Екяе предельно допустимых значений свидетельствовало о на-рулении прошшаемэсти ГЭБ и отмечалось при тяжелых заболеваниях ШС различной этнологии, так. прорыв ГЭБ Ьс^-Дл.; и 81 ЗБОР наблюдался при критических состояниях, обусловленных фебрильнои шизофренией, острой алкогольной энцефалопатией, нейролепсией, а так-ле при тромботичоском и геморрагическом инсультах, бактериальном п вирусном менингитах, энцефалитах, черепно-мозговых травмах, при критических состояниях ногороздсшшх детей, обусловленных нарушением -„таз го во го кровообращения, при опухолях головного мозга астрогитарного л олигодендроглпального происхождения ( табл.. 3 п 4 ).

При сравнении кезду собой диагностической ценности маркирования наруяенля проницаемости ГЭБ при подази Ьс/^Н 11 81 ЗЗйР очевидно преимущество последнего. Так частота выявления его з образцах сыворотки крови исследуемых групп больных била несколько вы~ по частоты обнаружения при этом концентрация 81 ББОР в

поло^лп-эльннх пробах всегда з несколько раз превышала уровень

который в 60 % случаев соответствовал 0,8 нг/мл, то есть опроделялся аа продоле чувствительности метода. Таким образом, мн пршлн и закяспоииа, что л:гмуноферментная система для опреде- ■ ленил Ь >2П.! с пределом чувствительности 0,8 ¡гг/мд непригодна для использования з качества млркора нарушения проницае-

г-остл ГЭБ а для этоЗ полл требуется разработка болоо чузствн-толыипг :г>тодоя дотошна этого НСБ.

Следует отмотать, что и?."{упофармонтяий скрининг исследуемых НСБ в СП по :пг:е? ззкзжзх днагйостячоскях пропмучзств пород глпд™;ем ит в енгоротяо провп, тая как, несмотря на то, что з С?I г^'П^нтрашя этих «штягеяов п 1,2—1,5 раза в!по, частота вы-явл<»кяя гя в С":С! яе> зр?г-ьт1пт частоты выявления в сыворотка крови, лнлд.т»* л¿ологических гадкосте? больных, в иатогоноэо зо-отторнх отсутствует но?ротоксачоска2 сиздроа ^ годзт,

Таблица 3

РЕЗУЛЬТАТЫ ИМШЮОЕИШШЮГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ Isc^TM В СЫВОРОТКЕ КРОВИ БОЛЬНЫХ

:онцентрация Xsс^'М I нг/мл )

ШШ5-тельных ДВОР ,

Диагноз

число проб

.811.в! 3.21б.4 Il2.8l 25.б! 61.'2

Критические состояния, обусловленные:

1) (¿¡ебрильной шизофренией

2) острой алкогольной ' энцефалопатией

3) нейролепсией

4) тяжелым алкогольным делирием

Инсульты:

1) тромботический

2) геморрагический

Бактериальный менингит:

1) гнойный

2) серозный

Вирусный менингит Энцефалит

Черепно-мозговая травма:

1) открытая

2) закрытая

Опухоли головного1 мэага:

1) астрогитарные

2) олкгодендроглиадъные

3) нейрональные .

4) низкодифС-еренпдрованные

Критические состояния новорожденных детей, обусловленные нарушением шагового кровообращения ШЫК): ^

1) НМК I степени

2) НШС II степени

3) НИК III степени

56 6 I 12,5

52 65 3 6 I 'I 5,7 l£,3

30 I 3,3

72 52 9 7 3 5 2 3 I I 19,4 32,6

72 55 9 9 6 3 4 I I 26,3 21,8

70 5 5 3 I 21,4

65 ' 8 5 3 I 26,4

40 56, 8 5 2 2 2 I I 32,5 16,0

14 15 12 2 2 I 14,2 20,0 0

19 3 16,7

40 53 69 2 4 8 I I 5,0 iS.O

Таблица 4

рззу2:»тлт11 ![^,;у110у]др:,131тя0г0 опрдашшя 81 в8ср в сыворотке крое'1 больных

,'1::аг:;оз

'пслс

проб

концентрация 81 350Р , (мрДм)

0,8

1*1

3,2

шл

ШЛ

'¡>ПОЛО

рсгтелт ¿22 й..

^рнг.1 пэскле состояния ооусломеиные:

1)'. обВИЛМГОЙ ШИЗОфОО-ЛНеи

) остроалг.огольно;; знпг.Салонатле;:

3)ненролепсиеи •<ггялелкм алкогольным делирием

Инсульты: I ) тро>.б о тине ели Д

2) геглзрряг ине скд :>

Бактериальный менингит:

1)гно1:н1гл

'¿) серозн)--;?

Еируснмл мешшгит

Эплефалит

Черсдно-^юзгог-ая травма :

1)открытая

2)закрытая

Опухоли голоеного мозга:

1)гстротатарине

2) о л зт ■о д с г игрл г ли ял ь -

.3) поЯронолыше

4) нлз кодафферпнтро-

ваши; о

Критические состояния ПОЕЭрОГДРНПЮС детой, о 0 уело вл е пну р г. арул •-•-»

залепил и^-'-Ю : ЛНМК 1 стопеяи 0 II степштд ЗМГ'К III етезеди

!

75 16 5 4 6 9 I

60 "Л 2 I р 3 7 л5,0

70 17 4 4 3 I 1 I '¿0,0

50 о I 2 I 12,0

78 II 6 4 р п I 20,5

56 3 5 3 2 2 I О г, О ""1 "

84 13 10 12 9 а о I 50,0

63 16 8 7 I 3 I

ТОЙ 36 20 17 9 4 2 I 51,9

76 17 II II 3 •* I I 47,3

44 II 3 5 6 4 2 I. 47,?

62 II 10 8 3 2 I 38,7

14 I 5 I I 3 73,5

15 2 4 .3 I 2 65,6

12 0

19 2 3 I 21,1

42 Л 4 р I 21,4

53 6 ь 3 21,4

74 12 5 о и а I 3 2 '¿■у, 7

гастрит, пневмония к др. ) повышение концентрации и 81 ББСр

вше донорского уровня отмечено не было.

Исследование изменения уровня 81 вбср в динамике развития заболевания, в патогенезе которого имеет ыэсто нарушение проницаемости ГЭБ, показало, что наиболее высокие значения концентрации НСБ в биологических жидкостях пациентов определяются в период, характеризующийся наиболее тяжелым клиническим состоянием больного. Следует отметить, что, если после 10-15 суток с момента развития критического состояния у больных с фебрильной шизофренией не происходит снижения уровня 81 вбср , то, с большой вероятностью, можно говорить о неблагоприятном исходе заболевания. При гнойном менингите и энцефалите критический период приходится на 8-10 сутки. Поэтому иимуноферментный анализ 81 ВБвР в биологических жидкостях больных различным/! заболеваниями, характеризующихся как органическими, так и функциональными поражениями ШС,. по-видимому, мокет быть рекомендован для комплексной оцзшш степени нарушения функции ГЭБ. Количественный мониторинг его в сыворотке крови в процессе развития заболевания или во время посттравматического периода позволяет установить объективный контроль за функциональным состоянием ГЭБ и эффективностью проводимой терапии.

В последнее время появились работы, в которых показана диагностическая значимость некоторых НСБ для пренаталъной диагностики дефектов развития невральной трубки плода на ранних сроках беременности ( Березин В.А., 1Э35;1^гбсп8еп 0.,19в2;Воск к.,1987) Лтя оценки возможного использования 81 ЗВОР в качество маркера патологии развития норвиой спстемп плода бил проведен юаунофер-иоитииЯ. скрининг этого еггткгена в' околоплодных водаг п сыьорэгцо крови беременных копцгл: груши риска рокдонкя ребенка с деЗоктои невральной трубки. Установлено, что с сиворотке крогл боремзнпнх яошшш, у которых впоследствии рохдалась дети с .с-агьозои пгдро-цофалия, анэнцофааия с оолеэпь Дауна от^зчалось п«пм&Ч£Тсды:оо повышенно уровня 81 ВЙО? вше донорского сэотвстспа::;::' р ¿'¿, 73 п 80 $ случаев. Прд атом средаай уровззь 01 вал- » скюрэтг.: крови составляет в первой г: второй случаях 2,1*0,1 стЛп, б тро~ пои - 3,010,1 нгД:.". Сродош уровял :-того гдтеге:;:. зг околоплодник ъоядх равны пра болезкк Дауна 3,22*0,2 кг/хи, пр.- гпдр^пМ---лди - 3,6+0,2 нгАя, при ¡м::лшофйл;х 3,1^0,1 и г/гл. К сиюузгю ;:рош доицки, У ко торах рог. дались ядиромк» дети, Я1 прзы'лг.: догорсг:ого уровня» а в оподондодщ;* гддги; по -»Пгл-лгл-

К

ся. Таким образом феномен повышения концентрации 81 bsgp в сыворотке крови беременных и появление его в околоплодных водах позволяет предположить наличие дефектов развития нервной трубки плода, и иммуноферментный анализ 81 bsgp может быть рекомендован в качестве дополнительного теста в комплексной пренатальной диагностике этой патологии.

вкводы

1, В фракции экстракта из ткани мозга человека, полученной в результате ионообменной и аффинной хроматографий и сконцентрированной в 400-500 раз идентифицированы 2 НСБ:81 bsg? и IstfgTM, являющийся большой субъединицей описанного ранее d-ffih..

2. Разработан!; способы выделения и очистки НСБ на основе комбинации ионообменной, аффинной хроматографий, гель-фильтрации, гидрофобной хроматографии, изохроматсфокуснрования, позволяющие получать препараты Is^ft-? и 81 3SG? высокой степени чистоты.

.3. Установлено, что 81 BSGP и IsögTM являются гликопротеидами с молекулярными массачи 8!uI0 и 55^10 кД, изоэлектрическими точками 5,3-6,0 и 4,10-4,25, относительной слектрофоретической подвижностью 0,62+0,02 и 0,86+0,01 соответственно, В углеводной части молекул этих антигенов преобладают глюкоза, иашоза и галактоза, а и белковой - ыоноалинодшшрбоноЕые и гидрофобные аминокислоты.

Л. В ходе исследования тканевой локализации идентифицированных антигенов установлено, тгго 1ойрП! синтезируется в астроцнтах и олигодендроглиоцитах, а 81 BSGP - в астроцитах.

5. Разработаны и апробнровшш в мимической практике и^мунофзр-ч'.'нтныэ тест-систем.» для определения 81 bsgp ц JacLTd, отличающиеся г"-сокоЯ тссюстьа, наделностьп и специфичностью. Установлена ппатеянго» иммуноформонтной спстсп* для определения 81 bsgp для н ке:ггроля за зффзгггигиостьп тералия заболеваний ЦПС природ», в пс.тогсноэо которге «моет мосто нарупошю ''.унта:;;' Г2Ь, п. ?.i:r:o n kctuokchoR прэнпталыюЯ диагностико до' р^огптпп лтргной трубка.

СШССК РЛБОТ, ОПШГКСЗ/diHKX ПО ТЕ»"3 ДОЗСС2РТЛЦИИ

т_ и0рГПА;. Г.З.. П.!!., Кйгселиаяо З.П., 1Торсг-:э?-. П.Л.,

Л. А., лгГлг,-"!? A.CS, ^"-тт-гг а Е.Л. , В,"..,

З.П. •««»гм ; 'нги:з нсйросп"*: ,г. <

аутспнткгел к ним в сыворотке крови богышх, нахоияпихсл в ,:р»ти~ чес ко).: состоянии, обусловленном психпчсскиш лаболовалия'.:;:/'/' Неотложные состояния в психиатрии.- Ii. .Чэука.- I9ü'J.- С. II5--IH.

2. Чехонин В.П., Морозов Г.Е. , KopotSL-вг. S.A., Лебедев A.C., Морозов С.Г. Идентификация, физико-химические свойства специфического белка мозга, окспрессируемого астроцитами //J Всесоюзный съезд иммунологов ( Сочи-1939 ): Тезису докл.- М. , 1939.- Т. 2,-С. 91.

3. Морозов Г.В., Лейкин ¡O.A., Чехонин В.П., Черкасова Т.А., Коро-теева Е.А., Медведев В.М. Иммуноацсорбция аутоантител к н<.;ироспе-цифическим белкам как способ защиты мозга от аутоантительноП агрессии // I Всесоюзна симпозиум "Химия белков" ( Тбилисн-1990 ): Тезисы докл.- Пущино, 1990.- С. 121.

4. Чехонин В.П., Бородин ЮЛ., Соднхов Б.Г., Коротеева Е.А. Пре-натальная неПроиммунодиагностика вроядеиних пороков развития ЦП С плода // I Всесоюзный симпозиум с международны, участием "Иммунологическая репродукция" ( Киев-1990 ),: Тезисы докл.- Киев, 1920.~ С. 235.

5. Чехонин В.П., Лидкиева Р.Ц., Коротеева Е.А. 1!ммунохимпческос изучение механизмов аутоиммунной агрессии антител к нсйроспецифи-ческим белкам у крыс с экспериментальным прорывом гематоэшнзфали-ческого барьера // Нейрохимия.- 1990.- Т. 4.- ?," 2. - С. 120-124.

6. Чехонин В.П., Лиджиева Р.Ц., Коротеева Е.А., Берестов А.П. Роль глиоспецифических антигенов в диагностике ксрвно-г.сихичсо» ких заболеваний // Курн. невропатологии и психиатрии им. С.С.Корсакова.- 1990. - 6. - С. I30-I4C.

7. Чехонин В.П., Морозов Г.Б., Коротеоьа Е.А., Макаров A.B. Идентификация, выделение, физико-химические .свойства кейроемф:« фического альфа-2 глобулина // Балл. окспари,:. б иол. ¿••■-д, -1991. - PI. - С. 39—»2.

8. Кубасова A.A., Чехонин В.П., Иатувевсквл Е.В., llcpc-rtu:: - ¡".Л., Лебедев A.C. &£™унохпмпчсскиИ домна мЬг-роспь-циф:^.'скгл umtre-ноб в сыворотке крови бсямса: люфоарссьфораткск1 .ми pgöosci.

г.ш коаи» саркоиой liacoca и диффуяным »;сГ,ро;;ср ч)тон // Гс;-',,ч;:. дорма.7. - 1991. - ]? 3. - С.

9. Чсжонии В.П., Коротиеьи Е.А., Гроши С. к., Буль f.-гл. А Гч- _ гвадос А.И. }ь;:^у«офор:гснт»ш.1 «ма специфического

пр^'гоядп 3 c'.SBOpaTKC Крови болНГ.:?: ?!OpCH!>-nckx»:v-'Ci:i:!-:^.v«.'-.{»!'.1-f.--

Ki.i,:.-.: // Л;.С>ор.'»торноа дело. - 1991. - с. - C V'/'^iZs