СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ОРГАНОСПЕЦИФИЧЕСКИХ И МЕЖОРГАННЫХ БЕЛКОВ МОЗГА И ИХ ЗНАЧЕНИЕ В ПРОГНОЗИРОВАНИИ ОСЛОЖНЕНИЙ ЧЕРЕПНО-МОЗГОВОЙ ТРАВМЫ

Мяснянкин, Александр Алексеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ОРГАНОСПЕЦИФИЧЕСКИХ И МЕЖОРГАННЫХ БЕЛКОВ МОЗГА И ИХ ЗНАЧЕНИЕ В ПРОГНОЗИРОВАНИИ ОСЛОЖНЕНИЙ ЧЕРЕПНО-МОЗГОВОЙ ТРАВМЫ
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ОРГАНОСПЕЦИФИЧЕСКИХ И МЕЖОРГАННЫХ БЕЛКОВ МОЗГА И ИХ ЗНАЧЕНИЕ В ПРОГНОЗИРОВАНИИ ОСЛОЖНЕНИЙ ЧЕРЕПНО-МОЗГОВОЙ ТРАВМЫ"

На правах рукописи

Мяснянкин Александр Алексеевич

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ОРГАНОСПЕЦИФИЧЕСКИХ И МЕЖОРГАННЫХ БЕЛКОВ МОЗГА И ИХ ЗНАЧЕНИЕ В ПРОГНОЗИРОВАНИИ ОСЛОЖНЕНИЙ " ЧЕРЕПНО-МОЗГОВОЙ ТРАВМЫ

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

г; ■ г- пз

Краснодар - 2012

005020162

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учрежде нии высшего профессионального образования «Астраханская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель: доктор медицинских наук, доцент

Кохаиов Александр Владимирович

Официальные оппоненты:

Павлюченко Иван Иванович, доктор медицинских наук, профессор, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО КубГМУ Минздравсоцразвития России), профессор кафедры фундаментальной и клинической биохимии.

Шестопалов Александр Вячеславович, доктор медицинских наук, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО РостГМУ Минздравсоцразвития России), заведующий кафедрой общей и клинической биохимии №2.

Ведущая организация:

государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (г. Москва).

Защита состоится «_» _2012 г. в _часов на заседании

диссертационного совета Д 208.038.02 на базе ГБОУ ВПО КубГМУ Минздравсоцразвития России (350063, г. Краснодар, ул. Седина, 4, тел. (861 )262-73-75).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО КубГМУ Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан «_»_2012 г.

Учёный секретарь //

диссертационного совета ' - ■''

профессор

Скорикова Людмила Анатольевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Черепно-мозговая травма (ЧМТ) остаётся одной из ведущих причин смертности и инвалидизации населения. Число инвалидов вследствие ЧМТ в России составляет 2 млн, в США - более 3 млн (Л.Б. Лихтерман и соавт., 2008; И.В. Куршакова, 2006). Даже в случае изолированной ЧМТ легкой степени, на долю которой в структуре нейротравмы приходится от 60 до 80%, все более ощутимой становится ее социальная и экономическая цена (C.B. Царенко, 2006).

Экспериментальные и клинические исследования дают основания считать, что одним из основных механизмов развития последствий и осложнений ЧМТ является дисбаланс аварийных гуморальных и клеточных реакций, вызывающих как дегенеративно-деструктивные, так и регенеративно-репаративные изменения в структурах головного мозга (C.B. Царенко, 2006).

Для своевременной оценки характера изменений в структурах головного мозга показало свою перспективность исследование в биологических жидкостях нейроспецифических белков (П.П. Кулагин, М.А. Чишиева, 1978; Е.Б. Пухов, 1995; В.В. Белопасов с соает., 1997; В.П. Чехонин с соавт., 1999; E.G. McKeating et al., 1998), а также белков-маркеров репаративной регенерации (В.М. Мирошников, 1999). Определение сывороточных концентраций таких белков немыслимо без совершенствования методов иммунохимического анализа (В.П. Чехонин с соавт., 1999). Современный этап иммунохимии характеризуется разработкой широкого спектра высокочувствительных экспресс-методов анализа, основанных на реакции антиген-антитело (Б.Б. Дзантиев с соавт., 2011), которые могут быть актуальны и в оценке течения острого периода травматической болезни мозга (ТБМ).

Кроме того, иммунохимический анализ может представлять интерес для контроля различных патологических состояний и осложнений, сопровождающих ТБМ (Г.А. Трубников и соавт., 1975, 1993; Д.М. Никулина, 1981,2009; В.В. Белопасов с соавт., 2011 ; A.B. Коханов с соавт., 2011). Следовательно, поиск и отбор иммунохимических индика-

торов, эффективных для прогнозирования осложнений и для оценк( результатов оперативного и консервативного лечения ЧМТ остаетс актуальной проблемой.

Существенным является факт отсутствия доступных коммерчески тест-систем на некоторые антигены, перспективные для оценк патологических синдромов, сопровождающих ЧМТ. К таким белкам относятся, в первую очередь, некоторые нейроспецифические белки термостабильная щелочная фосфатаза плацентарного типа, как марке энергетических процессов репаративной регенерации мозга. Разработк методов их выделения, очистки и конструирования тест-систем на эти белки представляет собой самостоятельную важную биохимическую проблему.

Цель исследования: провести сравнительный биохимический анализ органоспецифических и межорганных белков мозга человека и оценить эффективность иммунохимических тестов на эти белки в мониторинге и прогнозировании осложнений черепно-мозговой травмы.

Задачи исследования.

1.Выделить из экстрактов мозга человека органоспецифические белки, изучить их физико-химические свойства и получить на очищенные антигены мозга моноспецифические антисыворотки.

2. Разработать иммунохимические методы определения концентрации в сыворотке крови идентифицированных органоспецифических белков мозга и термостабильной щелочной фосфатазы плацентарного типа - белка-маркера процессов репаративной регенерации.

3.Изучить динамику уровня органоспецифических антигенов мозга, некоторых острофазовых белков, маркеров пролиферативных и репаративных процессов и иммуноглобулинов в сыворотке крови пострадавших с ЧМТ в различные периоды травматической болезни головного мозга при ее благоприятном и осложненном течении.

4.0пределить корреляционные взаимоотношения органоспецифических антигенов мозга, острофазовых железосодержащих белков, маркеров репаративных процессов и иммуноглобулинов со степенью

іяжести черепно-мозговой травмы и характером осложнений травма-ической болезни головного мозга.

Научная новизна исследования. В экстрактах дефинитивного мозга идентифицированы два органоспецифических белка мозга: термостабильный альфаі-глобулин и растворимый в органических кислотах альфа2-глобулин.

Впервые методами ионообменной, гидрофобной и аффинной хро-атографии дана физико-химическая характеристика термостабильному и ислотоустойчивому белкам мозга человека в сравнении с другими белками озга человека, растворимыми в органических кислотах, насыщенном астворе сульфата аммония и этакридина. Разработаны новые методы ыделения и очистки органоспецифических белков мозга.

Получены оригинальные данные комплексного анализа содержания рганоспецифических антигенов мозга (8-100, альфаі - и альфа2-глобулины озга) и белков, ассоциированных с разными сторонами патологического роцесса: железосодержащих белков острой фазы лактоферрина (ЛФ) и ерритина, (Фр), белков-маркеров процессов репаративной регенерации: іьфа-фетопротеина (АФП), раковоэмбрионального антигена (РЭА) и лацентарной щелочной фосфатазы (ГОЦФ) в сыворотке крови больных с МТ различной степени тяжести в динамике травматической болезни мозга іри различных исходах заболевания.

Научно-практическая значимость работы. Предложены схемы ыделения и очистки органоспецифических белков мозга с помощью онообменной, аффинной и гидрофобной хроматографии, позволяющие олучать очищенные препараты этих белков для последующего оделирования иммунохимических тест-систем с использованием амостоятельно полученных моноспецифических антисывороток.

ферритин, лактоферрин и органоспецифические антигены мозга может выступать в роли одного из критериев оценки эффективности лечения травматической болезни мозга и прогнозирования последствий и различных осложнений ЧМТ.

Предложен алгоритм прогнозирования гнойных внутричерепных и внечерепных осложнений ЧМТ по соотношению уровней лактоферрина и иммуноглобулинов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Иммунизацией кроликов экстрактами мозга и продуктами их жесткого фракционирования (кипячением, обработкой органической кислотой и насыщенным раствором сульфата аммония) получены антисыворотки на пять белков мозга. Два белка, названные альфа1-ТС- и альфа2-КС-глобулинами являются строго органоспецифическими антигенами мозга, а три других белка-«экстремала», обнаруживаемых также в экстрактах других органов, идентифицированы как ранее описанные белки ферритин, 8-100 и РЭА.

2. Дана физико-химическая и хроматографическая характеристика белков мозга и на основе полученных данных разработаны методы выделения и очистки двух органоспецифических белков мозга и белка-маркера репаративных процессов -термостабильного фермента ГПЦФ.

3. На очищенные белки получены моноспецифические антисыворотки и сконструированы тест-системы для иммунодиффузион-ного и иммуноферментного анализа. Дана характеристика очищенных препаратов органоспецифических белков мозга и ПЩФ и иммунохимических тест-систем для их количественного определения.

4. Установлены уровни органоспецифических белков мозга, лактоферрина, ферритина и маркеров репаративных процессов в сыворотках крови пострадавших, охарактеризованы изменения некоторых биохимических показателей крови в динамике острого периода ЧМТ различной степени тяжести и в зависимости от характера осложнений ТБМ.

5. Установлены статистически значимые корреляционные связи уровней отдельных изученных белков со степенью тяжести ЧМТ и

вероятностью развития ранних осложнений травматической болезни мозга.

Апробация результатов исследования. Материалы диссертации были представлены на межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы кардиологии детей и взрослых» (Астрахань, 2010); VII Международной научно-практической конференции «Современные достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины», Астрахань-Москва, 2010; VII научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2011»; VIII Международной научно-практической конференции «Современные достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань, 2011); Международной научной школе для молодежи «Школа научно-1ехнического творчества и концептуального проектирования» и Региональной научно-практической конференции «Исследования олодых ученых - вклад в инновационное развитие России» (Астрахань, 011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 научных абот, в том числе, 4 - статьи в журналах, рекомендованных Высшей ттестационной комиссией при Министерстве образования и науки Российской Федерации.

Объём и структура работы. Диссертация изложена на 127 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 25 таблицами, 8 рисунками, писок литературы включает 251 источник, из которых 164 работы течественных и 87 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

бъектом биохимического и иммунохимического исследования являлась группа специфических и неспецифических белков мозговой ткани, железосодержащие белки - ЛФ и Фр как представители группы БОФ, а 1акже белки из группы маркеров пролиферативных процессов и репаративной регенерации - АФП, РЭА и ПЩФ, для выделения ко-

торой использовали экстракты доношенной плаценты. Биологический материал получали в бюро судебно-медицинской экспертизы в виде аутопсийного материала мозга от лиц, погибших от случайных причин, и в городском клиническом родильном доме г. Астрахани.

Для качественной и количественной характеристики исходных препаратов, фракций и очищенных препаратов альфа1- и альфа2-глобулинов мозга и ПЩФ на этапах очистки использовали специфические методы осаждения, различные варианты электрофореза в полиак-риламидном геле, гель-фильтрацию, ионообменную, гидрофобную и аффинную хроматографию, двумерный иммуноэлектрофорез. Содержание общего белка в экстрактах и фракциях определяли по О.Н. Ьошгу е1 а1. (1951) или спектрофотометрически при 280 и 260 нм по формуле Варбурга.

Для иммунохимической идентификации и количественного определения белковых антигенов применяли методы иммунодиффузии по Оухтерлони, радиальной иммунодиффузии по Манчини, иммуноэлектрофорез (ракетный и встречный), иммуноферментный анализ (ИФА).

Антисыворотки к альфа 1- и альфа2- глобулинам мозга и ПЩФ были получены нами самостоятельно путем иммунизации кроликов очищенными антигенами по общепринятым схемам с полным адьювандтом Фрейнда. Верификацию моноспецифических тест-систем проводили с референтными наборами на эти антигены из банка тест-систем кафедры биохимии АГМА.

Клинический материал представлен данными 142 больных мужского и женского пола в возрасте от 19 до 70 лет с изолированными закрытыми черепно-мозговыми травмами различной степени тяжести и 30 больных в возрасте от 23 до 66 лет, госпитализированных с последствиями и осложнениями ЧМТ (табл.1). Диагноз ставили в соответствии с принятой единой классификацией острой ЧМТ (А.Н. Коновалов, 1992). Больные с ЧМТ условно были разделены на две группы.

В группу пациентов с легкой черепно-мозговой травмой (ЧМТ I) были включены больные с сотрясением головного мозга (СГМ) — 30 человек и ушибом головного мозга (УГМ) легкой степени — 22 чело-

клинику составила 13,7±0,09 балла.

Группу с тяжелой черепно-мозговой травмой (ЧМТII) составили 90 пациентов, из которых 41 пациент с УГМ средней степени тяжести и 49 с тяжелым УГМ и сдавлением головного мозга. Средняя оценка по шкале комы Глазго на момент поступления в клинику составила 8,0±0,19 и колебалась от 11 до 5-4 баллов.

Таблица 1

Распределение обследованных больных по степени тяжести ЧМТ

Характер повреждений Число больных в% Тяжесть травмы по глазго

ЧМТ: 142 100

СГМ 30 21,1 13,9±0,07

УГМ легкой степени 22 15,5 13,3±0,18

УГМ средней степени 41 28,9 9,7±0,9

УГМ тяжелой степени 49 34,5 6,5±0,15

Всего по группе ЧМТ I: 52 36,6 13,7±0,09

Всего по группе ЧМТ II: 90 63,4 8,0±0,19

Больные с поздними осложнениями ЧМТ: 30 14,2±0,11

Доноры 68

ВСЕГО 240

Третью группу с поздними осложнениями ЧМТ (ПО ЧМТ) составили 30 больных, поступивших повторно в нейрохирургическое отделение по поводу поздних осложнений ЧМТ. В отдельную подгруппу вошли 65 пострадавших (ЧМТ+ранние осложнения), у которых в динамике ТБМ развились те или иные осложнения. Выборка включала 63 пострадавших из группы ЧМТ II и 2-х больных из группы ЧМТ I.

Все больные обследованы в соответствии с принятыми стандартами, включая клинико-инструментальные и лабораторные методы. Диагноз устанавливали в соответствии с медицинской классификацией болезней 10-го пересмотра (МКБ 10).

Пробы крови брали из подключичной вены у больных в отделении реанимации и интенсивной терапии, из локтевой вены - у доноров и больных нейрохирургических отделений в стандартных условиях при

поступлении или натощак. Образцы сыворотки крови отбирали по 1,5 мл в две пластиковые пробирки «Эппендорф» для исследования и хранили при температуре 25°С до анализа. Кровь забирали на 1-3, 5-7 и 14-19 сутки и в некоторых случаях удавалось провести дополнительный 4-й забор крови на 21-28 сутки после поступления больных в стационар. Контролем служили 68 образцов сыворотки крови доноров обоего пола, полученных из областной станции переливания крови в возрасте от 30 до 56 лет. Общее количество образцов сыворотки крови от 172 пациентов и 68 доноров составило 620 проб.

Из биохимических показателей крови, определенных на автоматическом анализаторе в исследование включены: уровень глюкозы, общего белка, альбумина, мочевины, мочевой кислоты, билирубина, креатинина и активность ферментов. Биохимическое исследование проводили в соответствии с этико-правовыми аспектами клинических исследований.

Статистическую обработку клинического и лабораторного материала проводили методами, принятыми в вариационной статистике (А.Н. Герасимов, 2007). За достоверные различия в сравнении средних величин в парных сравнениях брали t-критерий Стьюдента при р<0,05. Статистический анализ результатов исследования проведен с использованием лицензионных программ: «STATISTICA 6.0 for Windows» (StatSoft. Inc.) и Excel-2003 (Microsoft). Для определения диагностической информативности лабораторного теста рассчитывали: диагностическую чувствительность, диагностическую специфичность, диагностическую эффективность (В. А. Дюк, B.JI. Эмануэль, 2003).

Результаты исследования и их обсуждение

В результате проведенных экспериментов нами получены антисыворотки к водно-солевым экстрактам дефинитивного мозга, продуктам их фракционирования этакридином, сульфосалициловой кислотой, сернокислым аммонием, а также к термоустойчивой фракции после кипячения. После абсорбции антисывороток лиофилизированной плазмой доноров удалось получить тест-системы к трем органоспеци-фическим белкам мозга и двум межорганным антигенам: 1) термоста-

бильному (ТС) органоспецифическому альфаі-глобулину мозга, 2) кислотостабильному (КС) органоспецифическому альфа-2-глобулину мозга, 3) кислотостабильному межорганному антигену мозга, иммунохимически идентифицированному как раковоэмбриональный антигену (РЭА) Голда, 4) растворимому в насыщенном сульфате аммония органоспецифическому белку мозга, иммунохимически идентифицированному как белок 8-100 и 5) второму термостабильному межорганному белку мозга, иммунохимически идентифицированному какферритин (Фр).

Анализ физико-химических свойств выявленных органоспецифических и межорганных антигенов мозга показал (табл.2), что нами идентифицированы два органоспецифических антигена мозга с отличающимися характеристиками от общеизвестных белков мозга.

Таблица 2

Физико-химические характеристики белков, идентифицированных в дефинитивной ткани мозга человека

а2-КС а ,-ТСх Фр РЭА Б-100

Субьединичное строение мономер мономер 24 субъед мономер мономер

Э/Ф подвижность а2 а. а2 а, а2

Молекулярная масса (КДа) 145 139 450 180 21

Нативный экстракт мозга + ++ ++ + ++

Экстракт после кипячения - + + - -

Этакридиновый осадок + - + - +

Этакридиновый фильтрат - + - + -

Сульфосалицилов, фильтрат + - - + -

50% (ОТд^О,, осадок + - + - -

50% (Ш.ХБО,, фильтрат - + - + +

100% (ЫН.^О,, фильтрат - - - - +

Один из органоспецифических белков мозга (термостабильный альфа 1-ТС-глобулин) обратимо осаждается этакридином и сульфатом аммония, и необратимо - трихлоруксусной и сульфосалициловой кислотами. Иммунохимический анализ фракций белков мозга, получен-

ных по методу Саэрап^еМ, показал, что они содержат данный альфа 1-глобулин в высокой концентрации. Следует отметить, что альфа 1-термостабильный нейроспецифический белок обладает высокой аутоантигенной потенцией.

В табл. 2 представлены физико-химические параметры второго обнаруженного органоспецифического антигена мозга (кислотоста-бильного), названного альфа2-КС-глобулином (растворимого в хлорной ил сульфосалициловой кислоте). Сравнение физико-химических параметро выделенных альфа1- и альфа2-глобулинов мозга с параметрами наиболе известных нейроспецифических белков позволяет заключить, что они н имеют с ними идентичности, так как молекулярные массы ранее описанны нейроспецифических белков не превышают 40-50 КДа (В.П. Чехонин соавт., 1999).

Для выделения и очистки всех пяти органоспецифических межорганных антигенов мозга нами использованы различны хроматографические носители. При фракционировании раствора белко мозга методом гель-проникающей хроматографии на сефадексе 0-200 тольк макромолекулярный белок Фр элюируется в первом пике вслед за свободны объемом, остальные белки обнаруживаются в третьем пике. Таким образом гель-фильтрация может быть использована как этап фракционировани экстрактов тканей мозга для отделения Фр.

В опытах с ионообменными гелями установлено, что а1-ТС, а2-КС ПЩФ не адсорбируются на кагионообменнике СМ-сефадексе С-50 ни пр каких значениях рН (8,0; 6,6; 5,8) 0,02 М фосфатного и 0,02 М ацетатног буфера с рН 4,6. Однако все исследуемые белки связываются анионообменным сорбентом ДЕ-52 целлюлозой при низкой ионной сил (0,02 М) стартового буфера в диапазоне рН 5-9. Изучен характер элюци белков с этих анионообменников в зависимости от значения рН буферны систем. Наиболее эффективное разделение изучаемых белков мозга н колонке с анионообменной ДЕ-52 целлюлозой наблюдалось при элюци стартовым 0,01 М нейтральным фосфатным буфером с линейны

градиентом ШС1 от 0 до 0,ЗМ.

Из приведенных в табл. 2 данных обращает на себя внимание то факт, что диапазон высаливания сульфатом аммония для всех изуча

мых белков мозга составлял от 20% насыщения и выше, что позволяет применять для их очистки гидрофобную и амфифильную (высаливающую) хроматографию. Кроме того, все эти белки обладают гидрофобными областями, особенно белок Б-100 вследствие растворимости в растворе сульфата аммония 100% насыщения (отсюда его название), что также указывает на целесообразность применения гидрофобной хроматографии для их характеристики, разделения и очистки.

В качестве гидрофобного сорбента мы использовали фенилсефарозу СЬ-4В. Раствор белков мозга без детергентов наносили из расчета 50 мг общего белка на мл геля в 2М сульфате аммония на колонку, заполненную фенилсефарозой СЬ-4В при комнатной температуре. Результаты этих хроматографических экспериментов представлены в табл. 3.

Таблица 3

Хроматографическая характеристика белков мозга человека на гидрофобном сорбенте фенил-сефарозе

РЭА а,-КС а,-ТС Фр Б-100

Сульфат аммония градиент 2М-0М 0,8М--0Д5М 0ДЗМ- -ом 0,5 М--0,1 М 0,35 М- -ом Не десор--бируется

Сульфат аммония 1М тритон Х-100 0-1% 0,1%--0,5% 0,2%--0,4% 0,1%--0,3% 0,2%--0,5% 0,4%--1%

Сульфат аммония 1М Глицерин градиент 0- 75% 25%-75% 25%-75% Не десор--бируется 50%-75% Не десор--бируется

Сульфат аммония 2М тритон Х-100 0-0,5% 1,2-0,7М 0,2-0,33% 1,0-0,6М 0,25-0,33% 1,2-0,6М 0,2-0,35% 1,0-0,6М 0,25-0,35% 0,6-0,ЗМ 0,35-0,42%

Сульфат аммония 2М-0 Глицерин градиент 0- 75% 1.2-0.5М 29-57% 0,8-0.3М 45-65% 1,0-0.6 М 38-50% 9,0-0.6 М 34-65% 0,3-0М 65-75%

* — линейный градиент сульфата аммония 1М-0М

В первой серии опытов элюцию осуществляли нисходящим линейным градиентом сульфата аммония, забуференного до рН 7,2. РЭА начинал десорбироваться 0,8 М солью и его широкий пик заканчивался при 0,15 М концентрации соли, но следы этого белка содержались и в последних фракциях. а2-КС более прочно связывался с сорбентом и

незначительно элюировался заключительным объемом градиентного буфера, начиная с 0,13М (КН4)г804, но основная фракция агКС продолжала десорбироваться после дополнительного промывания колонки 0,02 М стартовым буфером.

Несмотря на аналогичную с а,-ТС-глобулином термоустойчивость, и казалось бы одинаковые физико-химические свойства, ферритин (Фр) элюировался с фенилсефарозы раньше а,-ТС, начиная с 0,5М (ЫН4)2804, и его пик заканчивался при 0,1М концентрации соли.

В нанесенном на фенилсефарозу растворе белков мозга в IМ (ЫН4)2804 8-100 прочно связывался с гидрофобной колонкой и не десорбировался промыванием стартовым буфером (табл.3). Для его элюции требовалось дополнительная обработка колонки неионным детергентом. Десорбция связанных с фенилсефарозой белков ускорялась снижением полярности 0,02 М фосфатного буфера 0,1 % раствором тритона Х-100, но не глицерина.

Таким образом, применение простого солевого градиента позволило нам получить в разных фракциях все три мозговых антигена. Установлено, что при изменении полярности с помощью тритона Х-100 и глицерина сходные по электрофоретической подвижности белки ведут себя по разному: тритон хорошо десорбирует а1-ТС (0,1-0,3%), РЭА (0,1-0,5%), Фр (0,2-0,5%), и а2-КС (0,2-0,4%), пики которых полностью накладываются друг на друга. Б-100 в присутствии сульфата аммония десорбируется с гидрофобной колонки плохо высокими концентрациями тритона Х-100. Глицерин частично вымывает РЭА и а2-СС, начиная с 25% концентрации вплоть до последней фракции (75%), начиная с 50% элюирует Фр и не элюирует а1-ТС и 8-100 на фоне ионной силы в 1 моль/л, задаваемой сульфатом аммония.

Таким образом, эмпирически подбирая для гидрофобной хроматографии концентрацию соли, детергента и неполярного растворителя в элюирующей буферной системе, можно создать условия для выделения по отдельности каждого из органоспецифических белков мозга.

Обнаруженные особенности поведения агТС- и а2-КС-глобулинов на хроматографических носителях и их специфические физико-химические свойства легли в основу предложенных нами способов

выделения этих белков из ткани мозга человека, в основе которых лежат последовательные варианты высаливающей, ионообменной, гидрофобной и аффинной хроматографии, что не требует промежуточных этапов диализа и концентрирования.

Таблица. 4

Характеристика препарата а1-ТС на этапах выделения

Этап очистки Содержание белка, мг. Содержание целевого продукта Степень очитски Выход (%)

общий <х,-ТС

Исходный экстракт 31200 28,8 0,09% 1 100

Термообработка 100°С х600 мин 6736 28,8 0,42% 4,5 97

Осаждение 0,5% этакридином (осадок) 1855 19,0 1,01% ид 66,0

Осаждение (ШУ^О, 40% насыщения (осадок) 872 15,3 1,8% 19,0 53,1

Высалювающая хромотография 373 14,2 3,8% 41,2 49,3

ДЕ-52 целлюлоза 194,7 12,5 6,4% 69,6 43,2

Гель-фильтрация на Сефадексе в-гоо 82,5 9,5 11,5% 125 33,0

фенил-сефароза СЬ-4В 8,0 6,7 83,8% 907 . 7,81

Экстракт мозга с концентрацией общего белка 31,2 г/л и а,-ТС-глобулина 28,8 мг/л подвергали термообработке при 100°С в течение 60 мин. Осадок отделяли центрифугированием при 6000 g 20 мин и отбрасывали.

В горячем супернатанте растворяли порошок этакридина (риванола) до конечной концентрации 0,5%. После формирования осадка в течение суток прозрачная надосадочная жидкость декантировалась. Оставшуюся часть осадка центрифугировали при 6000 g 30 мин и надосадочную жидкость сливали. Пастообразный осадок растворяли в 5% растворе хлорида натрия и центрифугировали при 6000 g 20 мин, осадок комплекса соль-этакридин отбрасывали, а к надосадочной жидкости добавляли насыщенный раствор сульфата аммония до 40% и после 2-6-часовой экспозиции центрифугировали при 6000 g 30 мин. Осадок, содержащий целевой продукт, растворяли в солевом растворе, содержащем (Ш4)2804 при 15% насыщения.

Солевой раствор, содержащий а,-ТС-глобулин, наносили на хроматографическую колонку агарозы "Serva", уравновешенную сульфатом аммония с аналогичной 15% степенью насыщения и проводили этап высаливающей хроматографии понижающимися концентрациями -соли и возрастающими концентрациями глицерина.

Рис. 1. Иммуноэлектрофорез в агарозе препарата а,-ТС-глобулина (реконструкция). В средней полосе «разгона» водно-солевой экстракт мозга человека (ЭМ), в остальных — очищенный белок а,-ТС-глобулин, в траншее - поливалентная антисыворотка к белкам мозговой ткани.

На уровне нижней полосы разгона вместо электрофореза в агаре представлена локализация фиксированного и окрашенного белка а,-ТС в 7% полиакриламидном геле (ПААГ).

Элюирующиеся с амфифильного сорбента агарозы фракции,! содержащие искомый белок, поступали непосредственно на хроматографическую колонку с анионообменной целлюлозой. После промывания стартовым буфером проводили элюцию нужного белка ступенчато возрастающей концентрацией соли в стартовом буфере.

Следующий этап гель-фильтрации для этого белка, проводили на колонке с сефадексом G-200, уравновешенным фосфатно-солевым буфером. Фракция агТС-глобулина перед этапом гидрофобной хроматографии насыщали сульфатом аммония до требуемой концентрации. Десорбцию белка с фенил-сефарозы осуществляли при низкой ионной силе буфера и элюат концентрировали, либо лиофилизировали. Очищенный препарат а,-ТС-глобулина выявлял только одну окрашенную полосу в зоне постальбуминов (рис.1), а электрофорез полоски 7% ПААГ во втором направлении с поливалентной (неистощенной) антисывороткой, полученной к белкам экстракта мозга, выявил единственный пик иммунопреципитата, принадлежащий а,-ТС-глобулину.

Схема очистки а2-КС-глобулина мозга отличалась этапом кислотной обработки экстракта мозга, вместо термической, и характерными для данного белка хроматографическими параметрами элюции. Полу-

а,-ТС

Ценный очищенный препарат а2-КС-глобулина мозга был гомогенен в (электрофорезе в 7% полиакриламидном геле с додецилсульфатам натрия (SDS-ПААГ электрофорезе) и не взаимодействовал с антисы-роротками против сывороточных белков донора и моноспецифически-|МИ антисыворотками к различным белкам из банка тест-систем кафедры биохимии Астраханской медакадемии. По результатам SDS-ПААГ рлектрофореза препарат а2-КС-глобулина выявлял только одну окрашенную полосу в зоне между бычьим альбумином (65 кДа) и церуло-'плазмином (180 кДа), соответствующую молекулярной массе 140-150 кДа (рис. 2).

Оба препарата не проявляют иммунохимической активности при взаимодействии с большинством коммерческих антисывороток к белкам плазмы человека, в том числе к ЛФ и Фр.

Для конструирования собственных иммунохимических тест-систем на новые антигены параллельно с разработкой схем очистки органоспецифи-ческих белков мозга нами были получены высокоочищенные препараты ПЩФ (заявка на изобретение), имеющей важное значение в процессах репаративной регенерации (В.М. Мирошников, 1999; А.Е. Сухарев, 2006).

На основе очищенных тест-антигенов и полученных на них моноспецифических антисывороток разработана панель новых иммунохимических тест-систем с чувствительностью для ИДА: на а,-ТС-глобулин мозга - 2 мг/л, на а2-КС-глобулин мозга - 5 мг/л и на ПЩФ -0,5 мг/л. Чувствительность полученных ИФА тест-систем составляла:

Рис. 2. Характеристика очищенного препарата

а2-КС-глобулин —> ** -<ф0. аг-КС-глобулнн

WW <- БСА (67 кД)

а,-КС-глобулина методом SDS-ПААГ электрофореза в сопоставлении с маркерами молекулярной массы

линия Кольрауша

на а,-ТС-глобулина мозга 5 нг/мл, на а2-КС-глобулин мозга и на ПЩФ -Юнг/мл.

Исследование содержания белков мозга выявило следующие закономерности у пострадавших с ЧМТ (табл.5). Через 1-3 дня после травмы в крови пострадавших закономерно обнаруживали в повышенных количествах мозгоспецифический глиальный антиген Б-100. Статистически значимые отличия с группой доноров наблюдались у пострадавших с тяжелой ЧМТ (р<0,001 в обоих случаях). Статистически незначимые повышенные концентрации белка Б-100 наблюдаются и в группе с легкой ЧМТ. На 5-7 день достоверно повышенные концентрации 8-100 наблюдали у пострадавших ЧМТ любой степени тяжести (различия по сравнению с контролем достоверны при р<0,05 для группы ЧМТ I и при р<0,001 для групп ЧМТ II и ЧМТ+Осл).

В отличие от белка Б-100 уровни двух других органоспецифических белков мозга не повышались при легкой ЧМТ и в первые дни тяжелой травмы мозга, а,-ТС-глобулин имел пик в крови больных с тяжелой ЧМТ (ЧМТ II и ЧМТ+Осл) на 5-7 сутки с последующим снижением его уровня. Наоборот, статистически значимый повышенный уровень а2-КС-глобулина на 5-7 день тяжелой ЧМТ продолжал повышаться к 14-19 суткам.

Таблица 5

Динамика уровней органоспецифических белков мозга в крови у больных с осложненной и неосложненной ЧМТ различной степени тяжести

Показатели Срок после травмы ЧМТ1 (п=52) ЧМТ II (п=52) ЧМТ+ранение осложнение (п=65) почмт (п=30) и доноры (п=68)

8-100 (нг/мл) 1 -3 сутки 5-7 сутки 14-19 сутки 0,7±0,18 0,9±0,24 0,5±0,16 1,2±0,20 1,3±0,18 0,5±0,15 1,0±0,15 1,0±0,И 0,3±0,05 0,6±0,08 0,4±0,05

а,-ТС- глобулин (нг/мл) 1-3 сутки 5-7 сутки 14-19 суткя 42±12 33±11 45±13 47±19 88±20 59±13 62±27 163±45 90±31 104±П 44±17

«2-КС- глобулин (нг/мл) 1-3 сутки 5-7 сутки 14-19 сутки П1±41 122±52 105±47 106±28 203±30 247±29 114±39 295±82 368±90 233±41 110±33

Примечание: выделены значимые (р<0,05) различия с контрольной группой доноров.

Проведенные исследования железосодержащих БОФ (табл.6) показали, что контрольные значения Фр в сыворотке доноров составили 115±20,5, средние концентрации Фр на 1 -3 сутки после травмы при ЧМТ I составили 166±24,7; при ЧМТ И - 222±33,7; при осложненной ЧМТ - 256±51,6 нг/мл. Таким образом, повышение уровня Фр в крови выше 150 нг/мл является референтным для ЧМТ.

Противоположные тенденции характерны в этот период для динамики лактоферрина (ЛФ): у тяжелопострадавших достоверно увеличение концентрации ЛФ на 1-3 сутки в группе (ЧМТ+осл), но не ЧМТ II (табл.6).

Таблица 6

Динамика железосодержащих белков острой фазы крови у больных в остром периоде черепно-мозговой травмы (ЧМТ)

Показатели Срок после травмы ЧМТ1 (п=52) ЧМТ II (п=52) ЧМТ+ранение осложнение (п=65) ПО ЧМТ (п=30)и доноры (п=68)

ЛФ (мг/л) 1 -3 сутки 5-7 сутки 14-19 сутки 1Д0±0Д05 1,12±0,080 1,12±0,159 1,26±0,153 1,35±0,076 1Д8±0,095 1,72±0,286 2,29±0,172 1,65±0,203 1,34±0,129 1,05±0Д02

Фр (нг/мл) 1 -3 сутки 5-7 сутки 14-19 сутки 166±24,7 141±18,9 158±12,3 222±33,7 247±25,3 196±21,5 256±51,6 295±73,2 225±49,5 135±16,5 115±20,5

Примечание: выделены значимые (р<0,05) различия с контрольной группой доноров.

На 5-7 сутки сывороточные уровни обоих железосодержащих белков остигают пика: достоверные отличия от контрольной группы доноров и для 1Ф, и для Фр характерны только у больных с тяжелой травмой (группы ЧМТ II и МТ+Осл), а на 14-19 сутки-только в подгруппе с ЧМТ+Осл (табл.6).

Анализ содержания иммуноглобулинов ^А, ^М выявил сле-ующие закономерности: при легкой ЧМТ не наблюдается существен-ого угнетения гуморального иммунитета. На 5-7 сутки проявляется енденция к гипоиммуноглобулинемии в, соответственно тяжести МТ, и к увеличению концентрации двух других типов иммуноглобу-инов, однако в этот отрезок времени результаты статистически не-начимы. На 14-19 сутки наблюдается пропорциональное тяжести

ЧМТ, более выраженное повышение концентрации 1§М и ^А, статистически значимое только для ^М при осложненной травме. Концентрация ^О, при тяжелой травме остается достоверно пониженной при осложненной ЧМТ, очевидно, за счет развития иммунодефицита н фоне гнойно-воспалительных осложнений.

Из белков-маркеров репаративной постгравматической регенерации ПЩФ имела пик на 1-3 день, а не на 5-7-й день, как АФП и РЭА, который постепенно снижался до нормы к 19 дню. Уровень ГПДФ на 1-3 сутки значимо выше в группах ЧМТ II и подгруппе ранних осложнений ЧМТ.

Максимальный уровень АФП при тяжелых ЧМТ значимо возрастает по сравнению с донорами в 3-8 раз на 14-19 сутки, а максимальные концентрации РЭА, значимо отличающиеся от контрольных цифр (р<0,01), обнаруживаются на 5-7 сутки и снижаются на 7-9 сутки Содержание в сыворотке АФП и ПЩФ в большей степени зависит от тяжести травмы, чем РЭА.

Таблица 7

Исследованные белки, имеющие высокие коэффициенты корреляции со степенью тяжести и степенью выраженности ранних осложнений ЧМТ

Показатель Коэффициенты корреляции

Степень тяжести ЧМТ Осложнения ЧМТ

№ -0,38 -0,39

0,32 -0,51

0,20 0,89

АФП 0,53 0,44

РЭА -0,21 0,22

ПЩФ 0,75 0,48

ЛФ 0,52 0,89

РФ 0,77 0,75

8-100 0,88 0,01

а1-ТС 0,92 0,21

а2-ТС 0,86 0,14

Корреляционный анализ исследованных иммунохимических показателей у пострадавших с травмами головного мозга различной степени тяжести, разделенных на подгруппы с осложненным и неосложнен-ным течением, выявил белки (табл.7), уровень которых имеет досто-

верную прямую связь в оценке степени тяжести ЧМТ (по шкале комы Глазго), и белки значимые в оценке инфекционных и гнойных осложнений (по бальной шкале выраженности системного воспалительного ответа).

ВЫВОДЫ

1. В экстрактах дефинитивного мозга с помощью кроличьих антисывороток обнаружены два органоспецифических антигена с подвижностью альфа-глобулинов: альфа1-ТС-глобулин мозга (выдерживает термообработку кипячением, идентичен по физико-химическим свойствам ранее описанному антигену Каспари-Филда) и альфа2-КС-глобулин мозга (растворим в сульфосалициловой и хлорной кислотах).

2. Иммунохимическими методами в экстрактах мозговой ткани человека помимо вышеуказанных специфических мозговых антигенов выявлены еще три антигена с экстремальными физико-химическими свойствами, которые также содержатся в экстрактах некоторых других органов и идентифицируются как ферритин, РЭА и белок Б-100.

3. Определены индивидуальные физико-химические свойства органоспецифических и межорганных белков, экстрагируемых из тканей мозга, на основе которых разработаны новые методы выделения и очистки альфа1-ТС- и альфа2-КС-глобулинов мозга, а также фермента ПЩФ, значимого для мониторинга процессов посттравматической регенерации.

4. На очищенные антигены мозга альфа1-ТС-глобулин, альфа2-КС-глобулин и очищенный фермент ПЩФ получены моноспецифические антисыворотки и сконструированы два варианта иммунохимических тест-систем. Чувствительность ИФА тест-систем составила: для а1-ТС-глобулина мозга 5 нг/мл, для а2-КС-глобулина мозга и для ПЩФ - 10 нг/мл; ИДА тест-систем - 2 мг/л, 5 мг/л и 0,5 мг/л соответственно. Установлено, что уровни ферритина, белка Б-100 и альфа 1-ТС-глобулина значимо (р<0,01) повышаются в сыворотке пациентов с тяжелой ЧМТ пропорционально степени травмы, а снижение уровня 1§0 на фоне повышенного содержания ^М и ЛФ может служить предвестником гнойного менингита. Одновременное появление определяемых иммунодиффузионными методами концентраций ПЩФ (> 500 нг/мл) и

подъем уровней лактоферрина более 1000 нг/мл и ферритина выше 20 нг/мл может прогнозировать развитие пневмонии.

Практические рекомендации

1. Комбинация методов специфической обработки и колоночно хроматографии на различных носителях дает возможность пр минимальных экономических затратах получать альфа1-ТС-и альфа2-КС глобулина мозга и ПЩФ с высоким выходом и степенью чистоты.

2. Способ получения и очистки ПЩФ может найти применение не тольк в производстве специфической тест-системы на этот белок, но и в качеств биологически активного препарата с высокой коммерческой перспективой.

3. Определение в сыворотке пациентов уровней иммуноглобулинов сочетании с ПЩФ, Фр, ЛФ может служить критерием инфекционны посттравматических осложнений.

4. Определение в сыворотке пациентов с тяжелой ЧМТ органоспе цифических альфа-глобулинов мозга, наряду с Фр и белком S-100 може применяться для оценки объема и степени повреждения ткани головної мозга.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Коханов, A.B. Термостабильная фракция сывороточного альбумина крови пострадавших в остром периоде черепно-мозговой травмы / A.B. Коханов, В.В. Белопасов, A.A. Мяснянкин, Е.В. Метелкина, П.М. Курьянов // Актуальные вопросы современной медицины (тезисы докладов 86-й итоговой научно-практической конференции сотрудников академии, врачей города и области). Труды АГМА - Астрахань. - 2009.- Т.40. - С.69. 2. Коханов, A.B. Железосодержащие белки и показатели эритрона в оценке адаптивных реакций организма в остром периоде черепно-мозговой и скелетной травмы / A.B. Коханов, Ю.А. Кривенцев, В.В. Белопасов, Е.В. Метелкина, A.A. Мяснянкин, A.A. Ларионов, Д.Б. Су-ринков, Л.Н. Федоров //Астраханский медицинский журнал: Материалы 7-й международной научно-практической конференции «Достиже-

ния фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». -2010.-Т.5,№.1(прил.).-С.38-42.

3. Кривенцев, Ю.А. Оценка диагностической эффективности иммунохимических тестов на антенатальные гемоглобины / Ю.А. Кривенцев, A.B. Коханов, М.Ю. Кривенцева, A.A. Мяснянкин, Е.Ю. Засов // Астраханский медицинский журнал: Материалы 7-й международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». - 2010. - Т.5, №. 1 (прил.). - С. 193196.

4: Коханов, A.B. Железосодержащие белки и показатели эритрона в оценке адаптивных реакций организма в остром периоде черепно-мозговой и скелетной травмы / A.B. Коханов, Д.М. Никулина, Ю.А. Кривенцев, A.A. Мяснянкин, Е.В. Метелкина, O.A. Луцева // Материалы межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы кардиологии детей и взрослых». - Астрахань, 2010.-С.158-161.

5. Мяснянкин, A.A. Уровни железосодержащих белков крови и динамика р02 при гипоксических состояниях различного генеза / A.A. Мяснянкин, A.B. Коханов, Д.М. Никулина, O.A. Луцева, В.В. Белопасов, Е.В. Метелкина, Ю.А. Кривенцев // Материалы межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы кардиологии детей и взрослых». - Астрахань, 2010. - С. 161 -162.

6. Коханов, A.B. Фетальные и острофазовые белки как маркеры репаративных процессов / A.B. Коханов, A.A. Мяснянкин, Е.В. Метелкина, О.В. Мусатов, O.A. Луцева, В.В. Белопасов // Международный журнал экспериментального образования. - 2010. - № 11. - С. 89.

7. Коханов, A.B. Уровни железосодержащих белков крови и динамика р02 в остром периоде черепно-мозговой травмы / A.B. Коханов, Д.М. Никулина, Ю.А. Кривенцев, В.В. Белопасов, A.A. Мяснянкин, Е.В. Метелкина // Международный журнал экспериментального образования.-2010.-№11.-С.93-94.

8. Коханов, A.B. Факторный анализ с использованием пакета программ "Statistica 6.0" на примерах иммунохимических исследований в

ургентной медицине: учебное пособие / A.B. Коханов, О.В. Мусатов, A.A. Мяснянкин- Астрахань: АГМА, 2011. - 42 с.

9. Амбарян, B.JI. Разработка метода иммунохимической диагностики интоксикационного синдрома / B.JL Амбарян, A.B. Коханов, A.A. Мяснянкин // Международная научная школа для молодежи «Школа научно-технического творчества и концептуального проектирования». Региональная научно-практическая конференция «Исследования молодых ученых - вклад в инновационное развитие России». г.Астрахань, 10-14 октября 2011г. - Астрахань: Астраханский государственный университет, 2011.- Т.2: Биотехнология. Медицина и фармакология. Химия, новые материалы, химические технологии. - С. 105-107.

10. Огнев, П.В. Программа дифференциальной диагностики ком в машине скорой помощи на догоспитальном этапе / П.В. Огнев, A.A. Мяснянкин, A.B. Коханов // Региональная научно-практическая конференция «Исследования молодых ученых - вклад в инновационное развитие России». г.Астрахань, 10-14 октября 2011г. - Астрахань: Астраханский государственный университет, 2011,- Т.2: Биотехнология. Медицина и фармакология. Химия, новые материалы, химические технологии. - С. 147-150.

*11. Коханов, A.B. Разработка тест-системы для индикации сывороточных уровней плацентарной изоформы щелочной фосфатазы / A.B. Коханов, О.В. Мусатов, A.A. Мяснянкин, Р.И. Асфандияров, И.С. Ямпольская // Астраханский медицинский журнал. - 2011. - №3. - С.245-246.

*12. Ларионов, A.A. Выявление белка с регенеративной и остеоиндуктивной активностью в плаценте / A.A. Ларионов, A.B. Коханов, О.В. Мусатов, Д.Б. Суринков, A.A. Мяснянкин, И.С. Ямпольская // Астраханский медицинский журнал. -2011. -№3. -С.246-248. *13. Мяснянкин, A.A. Пульсоксиметрия и мониторинг железосодержащих белков крови у больных с черепно-мозговой травмой / A.A. Мяснянкин, A.B. Коханов, В.В. Белопасов, Е.В. Метелкина, Ю.А. Кривенцев // Астраханский медицинский журнал. - 2011. - №3. - С.258-260.

*14. Чишиева, М.А. Белки мозга с экстремальными физико-химическими параметрами: иммунохимическая идентификация и моделирование тест-систем / М.А. Чишиева, A.A. Мяснянкин, A.B. Коханов //Астраханский медицинский журнал. -2012. -№ 1. -С. 154-156.

* - работа опубликована в журнале, включенном ВАК при Минобрнауки России в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий.

АФП-

БОФ-

ДГЭ-

кДа-

ИДА

ИФА-

ЛФ-

НСБ-

Список сокращений

альфа-фетопротеин белки «острой» фазы догоспитальный этап килодальтон

иммунодиффузионный анализ иммуноферментный анализ

лактоферрин нейроспецифические белки

SDS-ПААГ полиакриламидный гель с додецилсульфатом натрия

почмт-

ПЩФ-

РЭА-

СВР-

сгм-

ТБМ-УГМ-Фр-

чмт-

ЩФ-

IgM,IgG,IgA-

Ро2-

S-100-

SCG-

поздние осложнения ЧМТ щелочная фосфатаза плацентарного типа раковоэмбриональный антиген системная воспалительная реакция сотрясение головного мозга травматическая болезнь мозга ушиб головного мозга

ферритин черепно-мозговая травма щелочная фосфатаза иммуноглобулины трех классов показатель оксигенации крови

нейроспецифический белок 8-100 шкала комы Глазго

мяснянкин

Александр Алексеевич

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ОРГАНОСПЕЦИФИЧЕСКИХ И МЕЖОРГАННЫХ БЕЛКОВ МОЗГА И ИХ ЗНАЧЕНИЕ В ПРОГНОЗИРОВАНИИ ОСЛОЖНЕНИЙ ЧЕРЕПНО-МОЗГОВОЙ ТРАВМЫ

03.01.04. — биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 15.03.12 г. Набор компьютерный. Гарнитура Times. Усл. п.л. 1,0

_Тираж 100 экз. Заказ № SSJL*-_

Издательство ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации 414000, г.Астрахань, ул. Бакинская, 121

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Мяснянкин, Александр Алексеевич

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ХАРАКТЕРИСТИКА БЕЛКОВ, ЗНАЧИМЫХ ДЛЯ ОЦЕНКИ ОСЛОЖНЕНИЙ ТРАВМАТИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ МОЗГА (обзор литературы).

1.1. Основные патологические процессы и синдромы острого периода ЧМТ и их молекулярные механизмы.

1.2. Последствия и осложнения ЧМТ.

1.3. Белки острой фазы при травматической болезни мозга.

1.4. Тканевые и органоспецифические белки при ЧМТ.

1.5. Белки, перспективные для оценки процессов репаративной регенерации при ЧМТ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Общая характеристика обследованных больных.

2.2. Методы оценки тяжести ЧМТ и травматической болезни мозга

2.3. Материал и методы лабораторного исследования.

2.4. Методы идентификации, выделения и очистки белков.

2.5. Методы статистического анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

ГЛАВА 3. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИММУНОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ БЕЖОВ МОЗГА ЧЕЛОВЕКА.

3.1. Идентификация, иммунохимическая и физико-химическая характеристика органоспецифических антигенов мозга.

3.2. Хроматографическая характеристика органоспецифических и межорганных белков мозга человека.

3.3. Разработка технологии получения агТС-, а2-КС-глобулинов из экстрактов мозга и ПЩФ из экстракта плаценты.

3.4. Характеристика очищенных препаратов агТС-, аг-КС-глобулинов и ПЩФ.

3.5. Конструирование иммуноферментной тест-системы на агТС-, а2-КС-глобулинов и ПЩФ.

ГЛАВА 4. ИММУНОХИМИЧЕСКИЕ И ЛАБОРАТОРНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ В ДИНАМИКЕ ОСТРОГО ПЕРИОДА ЧМТ.

4.1. Характеристика осложнений изолированной ЧМТ.

4.2. Иммунохимические и лабораторные показатели в динамике острого периода ЧМТ различной степени тяжести.

4.3. Иммунохимические и лабораторные показатели в оценке ранних осложнений острого периода ЧМТ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ОРГАНОСПЕЦИФИЧЕСКИХ И МЕЖОРГАННЫХ БЕЛКОВ МОЗГА И ИХ ЗНАЧЕНИЕ В ПРОГНОЗИРОВАНИИ ОСЛОЖНЕНИЙ ЧЕРЕПНО-МОЗГОВОЙ ТРАВМЫ"

Актуальность работы. Черепно-мозговая травма (ЧМТ) остаётся одной из ведущих причин смертности и инвалидизации населения. Число инвалидов вследствие ЧМТ в России составляет 2 млн, в США - более 3 млн [73, 85]. Даже в случае изолированной ЧМТ легкой степени, на долю которой в структуре нейротравмы приходится от 60 до 80%, все более ощутимой становится ее социальная и экономическая цена [82, 154].

Для своевременной оценки характера изменений в структурах головного мозга показало свою перспективность исследование в биологических жидкостях нейроспецифических белков [9, 122, 157, 160, 214], а также белков-маркеров репаративной регенерации [92]. Определение сывороточных концентраций таких белков немыслимо без совершенствования методов иммунохими-ческого анализа [157]. Современный этап иммунохимии характеризуется разработкой широкого спектра высокочувствительных экспресс-методов анализа, основанных на реакции антиген-антитело [32], которые могут быть актуальны и в оценке течения острого периода травматической болезни мозга (ТБМ).

Кроме того, иммунохимический анализ может представлять интерес для контроля различных патологических состояний и осложнений, сопровождающих ТБМ [9, 65, 101, 102, 148]. Следовательно, поиск и отбор иммунохимиче-ских индикаторов, эффективных для прогнозирования осложнений и для оценки результатов оперативного и консервативного лечения ЧМТ остается актуальной проблемой.

Существенным является факт отсутствия доступных коммерческих тест-систем на некоторые антигены, перспективные для оценки патологических синдромов, сопровождающих ЧМТ. К таким белкам относятся, в первую очередь, некоторые нейроспецифические белки и термостабильная щелочная фос-фатаза плацентарного типа, как маркер энергетических процессов репаративной регенерации мозга. Разработка методов их выделения, очистки и конструирования тест-систем на эти белки представляет собой самостоятельную важную биохимическую проблему.

Цель работы:

Провести сравнительный биохимический анализ органоспецифических и межорганных белков мозга человека и оценить эффективность иммунохи-мических тестов на эти белки в мониторинге и прогнозировании осложнений черепно-мозговой травмы.

Задачи исследования:

1. Выделить из экстрактов мозга человека органоспецифические белки, изучить их физико-химические свойства и получить на очищенные антигены мозга моноспецифические антисыворотки.

3. Изучить динамику уровня органоспецифических антигенов мозга, некоторых острофазовых белков, маркеров пролиферативных и репаративных процессов и иммуноглобулинов в сыворотке крови пострадавших с ЧМТ в различные периоды травматической болезни головного мозга при ее благоприятном и осложненном течении.

4. Определить корреляционные взаимоотношения органоспецифических антигенов мозга, острофазовых железосодержащих белков, маркеров репаративных процессов и иммуноглобулинов со степенью тяжести черепно-мозговой травмы и характером осложнений травматической болезни головного мозга.

Новизна исследования:

В экстрактах дефинитивного мозга идентифицированы два органоспе-цифических белка мозга: термостабильный альфа 1-глобулин и растворимый в органических кислотах альфа2-глобулин.

Впервые методами ионообменной, гидрофобной и аффинной хроматографии дана физико-химическая характеристика термостабильному и кислотоустойчивому белкам мозга человека в сравнении с другими белками мозга человека, растворимыми в органических кислотах, насыщенном растворе сульфата аммония и этакридина. Разработаны новые методы выделения и очистки ор-ганоспецифических белков мозга.

Получены оригинальные данные комплексного анализа содержания орга-носпецифических антигенов мозга (Б-100, альфа 1- и альфа2-глобулины мозга) и белков, ассоциированных с разными сторонами патологического процесса: железосодержащих белков острой фазы лактоферрина (ЛФ) и ферритина (Фр), белков-маркеров процессов репаративной регенерации: альфа-фетопротеина (АФП), раковоэмбрионального антигена (РЭА) и плацентарной щелочной фос-фатазы (ПЩФ) в сыворотке крови больных с ЧМТ различной степени тяжести в динамике травматической болезни мозга при различных исходах заболевания.

Положения, выносимые на защиту:

1. Иммунизацией кроликов экстрактами мозга и продуктами их жесткого фракционирования (кипячением, обработкой органической кислотой и насыщенным раствором сульфата аммония) получены антисыворотки на пять белков мозга. Два белка, названные альфа 1-ТС- и альфа2-КС-глобулинами являются строго органоспецифическими антигенами мозга, а три других белка-«экстремала», обнаруживаемых также в экстрактах других органов, идентифицированы как ранее описанные белки ферритин, Б-100 и РЭА.

2. Дана физико-химическая и хроматографическая характеристика белков мозга и на основе полученных данных разработаны методы выделения и очистки двух органоспецифических белков мозга и белка-маркера репаративных процессов - термостабильного фермента ПЩФ.

3. На очищенные белки получены моноспецифические антисыворотки и сконструированы тест-системы для иммунодиффузионного и иммунофермент-ного анализа. Дана характеристика очищенных препаратов органоспецифиче-ских белков мозга и ПЩФ и иммунохимических тест-систем для их количественного определения.

4. Установлены уровни органоспецифических белков мозга, лактоферри-на, ферритина и маркеров репаративных процессов в сыворотках крови пострадавших, охарактеризованы изменения некоторых биохимических показателей крови в динамике острого периода ЧМТ различной степени тяжести и в зависимости от характера осложнений ТБМ.

5. Установлены статистически значимые корреляционные связи уровней отдельных изученных белков со степенью тяжести ЧМТ и вероятностью развития ранних осложнений травматической болезни мозга

Научно-практическая значимость:

Предложены схемы выделения и очистки органоспецифических белков мозга с помощью ионообменной, аффинной и гидрофобной хроматографии, позволяющие получать очищенные препараты этих белков для последующего моделирования иммунохимических тест-систем с использованием самостоятельно полученных моноспецифических антисывороток.

Очищенная разработанным способом ПЩФ может найти применение не только в производстве специфической тест-системы на этот белок, но и как биологически активного препарата с высокой коммерческой перспективой. Комплекс иммунохимических тестов на ПЩФ, ферритин, лактоферрин и орга-носпецифические антигены мозга может выступать в роли одного из критериев оценки эффективности лечения травматической болезни мозга и прогнозирования последствий и различных осложнений ЧМТ.

Предложен алгоритм прогнозирования гнойных внутричерепных и вне-черепных осложнений ЧМТ по соотношению уровней лактоферрина и иммуноглобулинов.

Внедрение результатов работы в практику:

Разработанные в диссертации методики и полученные результаты внедрены в практическую деятельность нейрохирургических отделений ГБУЗ «Городская клиническая больница №3» г.Астрахани, ГБУЗ «Городская детская клиническая больница им.Н.Н.Силищевой» г.Астрахани.

Материалы научных исследований используются в научных разработках и в педагогическом процессе при обучении студентов, интернов, ординаторов, аспирантов и слушателей факультета последипломного образования на кафедрах биохимии с курсом клинической лабораторной диагностики, общей и биоорганической химии, физики и информатики, патологической физиологии Астраханской государственной медицинской академии.

Апробация работы :

Материалы диссертации были представлены на межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы кардиологии детей и взрослых» (Астрахань, 2010); VII Международной научно-практической конференции «Современные достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины», Астрахань-Москва, 2010; VII научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2011»; VIII Международной научно-практической конференции «Современные достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань, 2011); Международной научной школе для молодежи «Школа научно-технического творчества и концептуального проектирования» и Региональной научно-практической конференции «Исследования молодых ученых -вклад в инновационное развитие России» (Астрахань, 2011).

Работа прошла апробацию на межкафедральной конференции с участием сотрудников кафедр биохимии с курсом клинической лабораторной диагностики; общей и биоорганической химии; медицинской биологии и генетики; нормальной физиологии с курсом экологии человека; анатомии человека; гистологии и эмбриологии; патологической физиологии; оперативной хирургии с топографической анатомией; факультетской терапии; госпитальной хирургии; кафедры нервных болезней с курсом нейрохирургии; травматологии, ортопедии и во-енно-пролевой хирургии ГБОУ ВПО АГМА Минздравсоцразвития России.

По теме диссертации опубликовано 14 научных работ, в том числе, 4 — в рецензируемых научных изданиях. Подана заявка на изобретение.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Мяснянкин, Александр Алексеевич

выводы

1. В экстрактах дефинитивного мозга с помощью кроличьих антисывороток обнаружены два органоспецифических антигена с подвижностью альфа-глобулинов: альфа 1-ТС-глобулин мозга (выдерживает термообработку кипячением, идентичен по физико-химическим свойствам ранее описанному антигену Каспари-Филда) и альфа2-КС-глобулин мозга (растворим в сульфосалициловой и хлорной кислотах).

5. Установлено, что уровни ферритина, белка 8-100 и альфа 1-ТС-глобулина значимо (р<0,01) повышаются в сыворотке пациентов с тяжелой ЧМТ пропорционально степени травмы, а снижение уровня на фоне повышенного содержания ^М и ЛФ может служить предвестником гнойного менингита. Одновременное появление определяемых иммунодиффузионными методами концентраций ПЩФ (> 500 нг/мл) и подъем уровней лактоферрина более 1000 нг/мл и ферритина выше 200 нг/мл может прогнозировать развитие пневмонии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Комбинация методов специфической обработки и колоночной хроматографии на различных носителях дает возможность при минимальных экономических затратах получать альфа1-ТС-и альфа2-КС-глобулина мозга и ПЩФ с высоким выходом и степенью чистоты.

2. Способ получения и очистки ПЩФ может найти применение не только в производстве специфической тест-системы на этот белок, но и в качестве биологически активного препарата с высокой коммерческой перспективой.

3. Определение в сыворотке пациентов уровней иммуноглобулинов в сочетании с ПЩФ, Фр, ЛФ может служить критерием инфекционных посттравматических осложнений.

4. Определение в сыворотке пациентов с тяжелой ЧМТ органоспецифических альфа-глобулинов мозга, наряду с Фр и белком Б-100 может применяться для оценки объема и степени повреждения ткани головного мозга.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Мяснянкин, Александр Алексеевич, Краснодар

1. Авдеева, М.Г. Патогенетические механизмы инициации синдрома системного воспалительного ответа / М.Г. Авдеева, М.Г. Шубич // Клиническая лабораторная диагностика. 2003. № 6. С. 3-10.

2. Антитела. Методы в 2 т. / Под ред. Д. Кэтти. М.: Мир, 1991. Т.1. - 287с.

3. Антонова, О.М. Нейроспецифическая енолаза и ее роль в механизмах антительной агрессии в мозг. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук / О.М. Антонова М., 1997.

4. Астраков, C.B. Неспецифические синдромы у больных с тяжелыми повреждениями головного мозга на нейрореанимационном этапе. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук / C.B. Астраков СПб., 2007.

5. Асфандияров, Р.И. Изомеры щелочной фосфатазы и остеогенез / Р.И. Ас-фандияров, А.Е.Лазько, А.В.Коханов //Морфология. 2002. Т. 121. №2-3. С. 13.

6. Баркаган, З.С. Основы пролонгированной профилактики тромбоэмболии / З.С. Баркаган, А.П. Момот, И.А. Тараненко, Я.Н. Шойхет. М.: Ньюдиамед, 2003.-41 с.

7. Безрукавникова, Н.В. Стероидсвязывающие белки у больных раком молочной железы / Н.В Безрукавникова., A.B. Коханов, Ю.А. Кривенцев и др.// Вопросы онкологии. 2007. Т.53. №4. С. 409-413.

8. Белик, Я.В. От химической топографии мозга к нейроспецифическим белкам и их функциям / Я.В. Белик //. Биохимия животных и человека: Биохимия белков нервной системы. 1980. С. 11-22.

9. Белопасов, В.В. Клинико-диагностическое значение иммунохимического анализа белкового спектра ликвора при заболеваниях нервной системы. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук / В.В. Белопасов М., 1997.

10. Березин, В.А. Специфические белки нервной ткани в норме и при патологии: // Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук / В.А. Березин Днепропетровск, 1985.

11. Березин, В.А. Специфические белки нервной ткани / В.А. Березин, Я.В. Велик. Киев: Наукова думка, 1990. - 264 с.

12. Бородай, Е.А. Клинико-морфологическая характеристика пневмоний в разные периоды травматической болезни / Е.А. Бородай // Скорая медицинская помощь. 2003. № 4. С. 127-131.

13. Вашетко, Р.В. Некоторые аспекты патогенеза и патоморфологии травматической болезни / Р.В. Вашетко // Скорая медицинская помощь. 2003. №4. С. 20-22.

14. Власов, В.В. Введение в доказательную медицину / В.В. Власов М.: Медиа Сфера, 2001. - 392 с.

15. Власова, И.Т. Индивидуальная устойчивость к гипоксии организма и нервной клетки / И.Т. Власова, H.A. Агаджанян // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1994. Т.118. №11. С.454-464.

16. Воскресенская, О.Н. Особенности функционирования системы антиоксидантной защиты в остром периоде сотрясения головного мозга / О.Н. Воскресенская, C.B. Терещенко // Журнал неврологии и психиатрии. 2003. № 3. С. 5557.

17. Воскресенская, О.Н. Гемостаз и перекисное окисление липидов при терапии острого периода сотрясения мозга / О.Н. Воскресенская, В.В. Щуковский, Г.В Коршунов. // Клиническая лабораторная диагностика. 2005. № 1. С. 24, 3335.

18. Гааль, Э. Электрофорез в разделении биохимических макромолекул / Э. Гааль, Г. Медьеши, JI. Верецки М., 1982. - 446 с.

19. Гайтур, Е.И. Вторичные механизмы повреждения головного мозга при черепно-мозговой травме. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук / Е.И. Гайтур М., 1999.

20. Ганнушкина, И.В. Иммунологические аспекты травмы и сосудистых поражений мозга / И.В. Ганнушкина М. Медицина, 1994. - 211 с.

21. Гланц, С. Медико-биологическая статистика. Пер. с англ. / Гланц С. М. «Практика». 1999. - 459 с.

22. Гомазков, O.A. Апоптоз нейрональных структур и роль нейротрофиче-ских ростовых факторов. Биохимические механизмы эффективности пептидных препаратов мозга / O.A. Гомазков // Журнал неврологии и психиатрии (приложение «Инсульт»). 2002. № 7. С. 17-22.

23. Горбунов, В.И. Иммунопатология травматической болезни головного мозга / В.И. Горбунов, Л.Б. Лихтерман, И.В. Ганнушкина Ульяновск, 1996. -528 с.

24. Грибачева, И.А. Изменение иммунологических показателей у больных с закрытой ЧМТ в различные сроки изучаемого катамнеза/ И.А. Грибачева, Е.Ю. Радоуцкая, Е.А. Штелле и др. // Вестник новых медицинских технологий. Тула, 2008. T. XV. №1, С.89-92.

25. Григорова, И.А. Дисметаболизм и его лечение при острой тяжелой черепно-мозговой травме / И.А. Григорова, A.JI. Борисов, В.А. Шевчук // Неотложная медицинская помощь: Сборник статей ГКБ скорой и. неотложной помощи. -Харюв, 1999. Вип. 2. С. 103-106.

26. Григорьев, Е.В. Маркеры повреждения головного мозга при тяжелой со-четанной травме / Е.В. Григорьев, Е.А. Каменева, Т.Г. Гришанова и др. // Общая реаниматология. 2010. T. VI, № 2. С. 71-74.

27. Гришанова, Т.Г. Нейронспецифические белки — маркеры энцефалопатии при тяжелой сочетанной травме / Т.Г. Гришанова, Е.В. Григорьев, Г.В. Вавин и др. // Медицина неотложных состояний. 2010. № 2 (27). С. 72-76.

28. Гришанова, Т.Г. Клинико-патогенетическая и прогностическая значимость нейронспецифических белков при тяжелых травмах. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук / Т.Г. Гришанова Кемерово, 2011.

29. Грудень, М.А. Мозгоспецифические белки группы S100. Влияние на процессы фосфорилирования-дефосфорилирования эндогенных субстратов нервной ткани / М.А. Грудень, А.Б. Полетаев // Биохимия. 1985. Т. 50. № 12. С. 1939-1942.

30. Делекторская, JI.H. Оценка диагностической информативности лабораторных тестов (методические рекомендации) / JI.H. Делекторская, Л.М. Пиме-нова, О.Г. Кадашева // Клиническая лабораторная диагностика. 1992. №1/2. С. 49-59.

31. Дерябин, И.И. Травматическая болезнь. И.И. Дерябин, О.С Насонкин. -Л.: Медицина, 1987. 304 с.

32. Дзантиев, Б.Б. Иммунохимические экспресс-тесты для медицинской диагностики / Б.Б. Дзантиев, H.A. Вызова, A.B. Жердев // Клиническая лабораторная диагностика. 2003. №9. С. 31.

33. Дзяк, Л.А. Современные представления о патофизиологии тяжелой черепно-мозговой травмы и роли прогнозирования ее исходов на этапах лечения / Л.А. Дзяк, O.A. Зозуля // Нейронауки: теоретические и клинические аспекты. 2005. Т.1, №1. С. 24-35.

34. Долгих, В.Т. Метаболизм железа в биологических системах (биохимические, патофизиологические и клинические аспекты) / В.Т Долгих, Ю.П. Орлов // Биомедицинская химия. 2007. Т. 53(1). С. 25-38.

35. Долгов, В.В. Лабораторная диагностика нарушений обмена белков / В.В. Долгов, О.П. Шевченко // Пособие для врачей. М.: РМАПО, 1997. 63 с.

36. Долгов, О.Н. Белковая специфичность как основа молекулярной организации интегративной деятельности нервной системы / О.Н. Долгов, А.Б. Полетаев, В.В. Шерстнев // Успехи физиологических наук. 1980. Т. 11, № 3. С. 47-63.

37. Дюк, В.А. Информационные технологии в медико-биологических исследованиях / В.А. Дюк, В.Л. Эмануэль. СПб, 2003.

38. Егоров, A.M. Теория и практика иммуноферментного анализа / A.M. Егоров, А.П Осипов, и др. М.: Высшая школа, 1991. - 154 с.

39. Ельский, A.B. Особенности биохимических показателей крови у пострадавших с травмой на фоне алкогольной интоксикации и пути ее коррекции / A.B. Ельский, С.Е. Золотухин, Ю.Я Крюк, A.A. Баешко // Скорая медицинская помощь. 2003. № 4. С. 24-27.

40. Ельский, В.Н., Кардаш A.M., Городник Г.А. Патофизиология, диагностика и интенсивная терапия тяжелой черепно-мозговой травмы / В.Н. Ельский, A.M. Кардаш, Г.А. Городник: Под ред. В.И. Черния. Донецк, 2004. - 200 с.

41. Ермолов, A.C. Роль лабораторной службы при оказании экстренной медицинской помощи / A.C. Ермолов, М.А. Годков, Г.В. Булава, Д.Д. Меньшиков // Клиническая лабораторная диагностика. 2008. №9. С. 39-40.

42. Ефимова, М.Г. Трансферрин и ферритин модуляторы активности каль-ций-кальмодулинзависимой фосфодиэстеразы мозга / М.Г. Ефимова, И. С. Щербакова, Н.Д. Шушакова // Биохимия. 1997. Т.62. № 2. С. 195-201.

43. Зайко, С.Д. Выделение и свойства нейроспецифических белков 14-3-2, 143-3, 10-40-4 / С.Д. Зайко, Н.И. Соколова и др. // Биохимия. 1984. Т.49. № 3. С. 355-360.

44. Зайчик, А.Ш. Механизмы развития болезней и синдромов / А.Ш. Зайчик, Л.П. Чурилов СПб.: ЭЛБИ-СПб, 2005. - 507 с.

45. Зотов, Ю.В. Идентификация тяжести ушибов головного мозга / Ю.В. Зотов //Нерохирургия. 1999. №.3. С, 41-44.

46. Иммунологические методы / Под ред. Г.Фримеля М.: Медицина, 1987. -472 с.

47. Иммуноферментный анализ / Под ред. Т.Нго и Г.Ленхоффа М.: Мир, 1988.-446 с.

48. Исаков, Ю.В. Менингит как инфекционное осложнение острого периода черепно-мозговой травмы / Ю.В. Исаков // Труды Московского НИИ скорой помощи. 1977. Т.27. С. 82-84.

49. Исхаков, О.С. Патогенетические механизмы и лечебно-диагностическая тактика при ЧМТ у детей. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук / О.С. Исхаков М., 2009. - 49 с.

50. Казимирко, Н.К. Черепно-мозговая травма, острый и отдаленный периоды. Клинико-диагностические алгоритмы / Н.К. Казимирко, Т.В. Мироненко, А.П. Коваленко и др.: Учебное пособие. Луганск, 2010. - 118 с.

51. Калинкин, О.Г. К патогенезу травматической болезни / О.Г. Калинкин,

52. A.О. Калинкин // Скорая медицинская помощь. 2003. № 4. С. 30-33.

53. Каменева, Е.А. Профилактика легочных осложнений у больных с тяжелой черепно-мозговой / Е.А. Каменева, Е.В. Григорьев, В.В. Шевелев и др. // Медицина в Кузбассе. 2005. Спецвып. № 1. С. 135-136.

54. Камышников, B.C. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике: в 2 т. / B.C. Камышников. Мн„ Беларусь, 2002. Т. 1. - 254 с.

55. Камышников, B.C. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике: в 2 т. / B.C. Камышников Мн., Беларусь, 2002. Т. 2. - 318 с.

56. Карахан, В.Б. Травматические поражения центральной нервной системы /

57. B.Б. Карахан, В.В. Крылов, В.В. Лебедев // Болезни нервной системы Под ред. Н.Н. Яхно, Д.Р. Штульман М.: Медицина, 2001. - 744 с.

58. Квитницкий-Рыжов, Ю.Н. Основные направления современного изучения структурных реакций головного мозга на кислородное голодание (обзор) / Ю.Н. Квитницкий-Рыжов // Журнал невропатологии и психиатрии имени С.С. Корсакова. 1991. вып. 3. С. 107-113.

59. Клиническая лабораторная аналитика в пяти томах под общей редакцией В.В. Меньшикова / T.I. М.: Агат-Мед. 2002. - 297 с.

60. Клиническая оценка лабораторных тестов / Под редакцией Н.У. Тица. -М.: Медицина, 1986.-480 с.t

61. Клиническое руководство по черепно-мозговой травме. Под редакцией акад. РАМН А.Н.Коновалова, проф. Л.Б.Лихтермана, проф. А.А.Потапова. Т.З. М.: Антидор, 2002.

62. Клюшник, Т.П. Выделение и некоторые физико-химические свойства нового нейроспецифического белка 10-40-4 из мозга человека / Т.П., Клюшник, Г.Ш. Бурбаева// Биохимия. 1983. Т. 48, вып.7. С. 1203-1208.

63. Коновалов, А.Н. Хирургия последствий черепно-мозговой травмы / Коновалов А.Н., Потапов A.A., Лихтерман Л.Б. и др. М., 2006.

64. Коханов, A.B. Биохимические аспекты патологических изменений у больных с тяжелой черепно-мозговой травмой / A.B. Коханов, A.A. Николаев // Клиническая лабораторная диагностика. 2007. № 9. С. 63.

65. Коханов, A.B. Определение онкомаркеров и железосодержащих белков в различные периоды травмы опорно-двигательного аппарата / A.B. Коханов,

66. A.A. Николаев // Клиническая лабораторная диагностика. 2007. № 9. С. 63-64.

67. Крыжановский, Г.Н. Общая патофизиология нервной системы: Руководство / Г.Н. Крыжановский М.: Медицина, 1997. - 352 с.

68. Крыжановский, Г.Н. Нейроиммунопатология / Г.Н. Крыжановский, C.B. Магаева, C.B. Макаров М., 1997. - 282 с.

69. Кудлай, Д.А. Иммунометаболические аспекты патогенеза политравмы: Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук / Д.А. Кудлай Новосибирск, 2007. - 47 с.

70. Курако, Ю.Л. Легкая закрытая черепно-мозговая травма / Ю.Л. Курако,

71. B.В. Букина Киев: Здоров'я,1989. - 160 с.

72. Куршакова, И.В. Энцефалопатия как осложнение тяжелых внечерепных повреждений. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук / И.В. Куршакова СПб., 2006. - 45 с.

73. Кухта, В.К. Белки плазмы крови // Патохимия и клиническое значение: Справочник. / В.К. Кухта, Э.И. Олецкий, А.Н. Стожаров Мн., Беларусь. -1986.-80 с.

74. Кчибеков, Э.А. / Комплексная диагностика и прогнозирование осложненных острых воспалительных заболеваний органов брюшной полости: Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук / Э.А. Кчибеков Астрахань., 2011. - 45 с.

75. Ланкин, В.З. Свободнорадикальные процессы в норме и при патологических состояниях. Пособие для врачей / В.З. Ланкин, А.К. Тихазе, Ю.Н. Белен-ков М.: РКНПК МЗ РФ, 2001. -78 с.

76. Лебедев, В.Ф. Инфекционные осложнения тяжелой травмы: достижения ипроблемы / В.Ф. Лебедев, A.C. Рожков // Военно-медицинский журнал. 2001. Т. 322. № 10. С. 40-45.

77. Лейдерман, И.Н. Синдром гиперметаболизма универсальное звено патогенеза критических состояний. / И.Н. Лейдерман, В.А. Руднов, A.B. Клейн, Э.К. Николаев // Вестник интенсивной терапии. 1997. № 3. С. 17-23.

78. Леонов, В.Г. Посттравматические абсцессы головного мозга. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук / В.Г. Леонов М., 1998. - 30 с.

79. Лисяный, Н.И. Развитие иммунодефицита после тяжелой черепно-мозговой травмы и его коррекция тактивином (экспериментальное исследование) / Н.И. Лисяный, A.A. Радзиевский, И.В. Филъчаков // Иммунология. 1988. № 5. С. 87-89.

80. Лихтерман, Л.Б. Черепно-мозговая травма / Л.Б. Лихтерман М., 2003. -365 с.

81. Лихтерман, Л.Б. Клиническая классификация последствий и осложнений черепно-мозговой травмы. Первый съезд нейрохирургов Российской Федерации. Тезисы докладов / Лихтерман Л.Б., Кравчук А.Д., Доброхотова Т.А. и др. -Екатеринбург, 1995, с. 75.

82. Лихтерман, Л.Б. Современные подходы к диагностике и лечению черепно-мозговой травмы и ее последствий. / Л.Б. Лихтерман, A.A. Потапов, А.Д. Кравчук // Вопросы нейрохирургии. 1996. № 1, с. 35-37.

83. Лихтерман, Л.Б. Клиническая классификация, концептуальные подходы и высокие технологии в лечении последствий черепно-мозговой травмы / Л.Б. Лихтерман, A.A. Потапов, Ф.А. Сербиненко и др. // Неврология. 2008. № 1.

84. Лунев, В.Е. Моноклональные антитела к ферритину селезенки человека. I. Получение и исследование взаимодействия с изоферритинами и апоферрити-ном / В.Е. Лунев, Я.И. Мельникова, С.А. Кошкин и др. // Биохимия. 1993. Т.58. Вып.5. № 5. С. 745-757.

85. Маурер, Г. Диск-электрофорез: (Теория и практика электрофореза в по-лиакриламидном геле) / Г. Маурер М.: Мир, 1971. - 284 с.

86. Медицинская лабораторная диагностика (программы и алгоритмы): справочник / Под ред. А.И. Карпищенко. СПб.: Интермедика, 2001. - 544 с.

87. Меерсон, Ф.З. Генерализованное накопление стресс-белков при адаптации организма к стрессорным воздействиям / Ф.З. Меерсон, И.Ю. Малышев, A.B. Замортинский // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1993. Т. 116. №9. С.231-233.

88. Меркулов, А.Г. Количественное иммуноферментное определение лакто-феррина в сыворотке и плазме крови / А.Г. Меркулов, О.П. Шевченко // Вопросы медицинской химии. 1989. № 6. С. 125-128.

89. Мидленко, А.И. Циркулирующие иммунные комплексы в остром периоде сотрясения головного мозга у детей / А.И. Мидленко, Т.З. Биктимиров, Ю.А.

90. Гармашов и др. // Вопросы нейрохирургии. 2000. № 4. С. 21-23.

91. Мирошников, В.М. Восстановительные реакции организма и стадиоспе-цифические антигены / В.М. Мирошников Саратов: Саратовский мединститут, 1992.-160 с.

92. Мирошников, В.М. Сравнительная оценка действия некоторых сывороточных белков на регенерацию тканей / В.М. Мирошников, A.B. Коханов, И.И. Резников // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1987. № 1. С. 95-97.

93. Митерев, Ю.Г. Ферритин: структура, функция и клинические аспекты / Ю.Г. Митерев, М.К. Назаретян, А.П. Андреева и др. // Гематология и трансфу-зиология. 1983. № 6. С. 38-44.

94. Молдованов, М.А. Диагностика и мониторинг нейронального повреждения у пациентов с изолированной тяжелой черепно-мозговой травмой / М.А. Молдованов, В.Е. Тарасенко, A.B. Полещук // Тихоокеанский медицинский журнал. 2008. №4. С.70-72.

95. Мякотных, B.C. Клинические, патофизиологические и морфологические аспекты отдаленного периода закрытой ЧМТ / B.C. Мякотных, Н.З. Тачанкина, Т.А. Боровкова // Журнал невропатологии и психиатрии имени С.С. Корсакова. 2002. Т. 102. №4. С. 61-65.

96. Назаренко, Г.И. Лабораторные методы диагностики неотложных состояний / Г.И. Назаренко, A.A. Кишкун М.: Медицина, 2002. - 568 с.

97. Назаров П.Г. Реактанты острой фазы воспаления / П.Г. Назаров С-Пб.: Наука, 2001.-423 с.

98. Немцова, Е.П. Иммунохимическое изучение лактоферрина человека. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук / Е.П. Немцова М., 1988. - 21 с.

99. Немцова, Е.П. Иммуноферментный метод определения лактоферрина человека и его применение для диагностики гнойно-септических осложнений / Е.П. Немцова, Л.М. Иванова, Р.И. Якубовская и др. // Вопросы медицинской химии. 1995. № 3. С. 58-61.

100. Никулина, Д.М. Иммунохимические тесты риска воспалительных заболеваний / Д.М. Никулина, H.A. Белопасова // Лабораторное дело. 1991. № 1. С.24-26.

101. Никулина, Д.М. Минорный белок сыворотки крови связанный с беременностью альфа2-гликопротеин: теоретические и практические аспекты. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук / Никулина Д.М. - Астрахань., 2009. - 45 с.

102. Никулина, Д.М. Практическое освоение иммунохимических методов. Методические рекомендации / Д.М.Никулина Астрахань, 1991. - 36 с.

103. Орлов, Ю.П. Нарушенный обмен железа как маркер тяжести состояния пациентов реанимационного профиля / Ю.П. Орлов, В.Т. Долгих, Т. В. Притыкина, A.B. Ершов // Физиология человека. 2007. Т. 33, № 1. С. 114-118.

104. Остерман, Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие) / Л.А. Остерман. М.: Наука, 1981.-288 с.

105. Остерман, Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами / Л.А. Остерман М.: Наука, 1983. - 304 с.

106. Остерман, Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот / Л.А. Остерман М., Наука, 1985. - 536 с.

107. Павлова, Т.А. Прогностическая значимость показателей кислородного транспорта и водных пространств при тяжелой сочетанной травме / Т.А. Павлова, Е.В. Григорьев, Е.А. Каменева // Общая реаниматология. 2008. Т. IV, № 6. С. 16-20.

108. Палладии, A.B. Изучение белков головного мозга методом электрофореза на бумаге / A.B. Палладии, Н.М. Полякова // Доклады АН СССР ,1956, № 4, т. 107, с. 568-574.

109. Педаченко, Г.А. О некоторых факторах прогноза черепно-мозговой травмы / Г.А. Педаченко, Е.Г. Педаченко // Седьмой Всесоюзн. съезд невропатологов и психиатров. Тез. докл. М., 1981. - Т. 3. - С. 225-227

110. Петрова, О.В. Уровни ферритина в тканях больных с алкогольной болезнью / О.В. Петрова, A.B. Коханов, A.A. Лапин, Е.И. Казимирова // Вопросы наркологии. 2008. №5. С. 54-57.

111. Пискунов, А.К. Биомаркеры нейровоспаления / А.К. Пискунов // Нейро-химия. 2010. Т. 27. № 1. С. 63-73.

112. Плам, Ф. Диагностика ступора и комы / Ф. Плам, Д.Б. Познер М.: Медицина, 1986. - 544 с.

113. Полетаев, А.Б. Изучение эндогенных белковых лигандов мозгоспецифи-ческих белков группы S100 / А.Б. Полетаев, М.А. Грудень // Нейрохимия. 1985. Т. 4, № 3. С. 245-253.

114. Полетаев, А.Б. Новые данные о функциях моз-госпецифических белков группы S100: взаимодействие с тубулином нервной ткани / А.Б. Полетаев, О.Д. Мещерякова // Биохимия. 1982. Т. 47. № 11. С. 1835-1838

115. Потапов, A.A. Доказательная нейротравматология. / A.A. Потапов, Л.Б.

116. Лихтерман, В.Л. Зельман и др. М., 2003.

117. Потапов, A.A. Хронические субдуральные гематомы / A.A. Потапов, Л.Б. Лихтерман, А.Д. Кравчук М.: Антидор, 1997.

118. Редькин, Ю.В. Анемия и полипептиды средней молекулярной массы в динамике травматической болезни / Ю.В. Редькин, Т.Ф. Соколова, С.Г. Фоминых // Эндогенные интоксикации. СПб. 1994. С. 46-47.

119. Ромоданов, А.П. Прогрессирующие последствия черепно-мозговой травмы / А.П. Ромоданов // Вопросы нейрохирургии. 1986. № 1. С. 13-17.

120. Ромоданов, А.П. Патогенетическое обоснование периодов травматической болезни головного мозга / А.П. Ромоданов, О.В. Копьев, Е.Г. Педаченко // Вопросы нейрохирургии. 1990. № 6. С. 10-15.

121. Ромоданов, А.П Черепно-мозговая травма и иммунологическая реактивность организма / А.П. Ромоданов, Н.И. Лисяный Киев: Здоровья, 1991. - 149 с.

122. Рябухин, И.А. Нейроспецифические белки в оценке проницаемости ге-матоэнцефалического барьера человека и животных. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук / И.А. Рябухин М., 2004. — 42 с.

123. Селезнев, С.А. Травматическая болезнь / С.А. Селезнев, Г.С. Худайбере-нов Ашхабад: "Ылым", 1984. - 224 с.

124. Селезнев, С.А. Травматическая болезнь (30 лет размышлений) / С.А. Селезнев, Ю.Б. Шапот, С.Ф. Багненко // Скорая медицинская помощь. 2003. № 4. С. 6-7.

125. Силин, О.П. Возрастные изменения белков головного мозга. В кн.: Физиология, биохимия и биофизика возрастного развития / О.П. Силин, Б.В. Ку-лаченко Киев, 1980. - с. 90.

126. Симбирцев, A.C. Цигокины: классификация и биологические функции / A.C. Симбирцев // Цитокины и воспаление. 2004. Т.З. №2. С. 16-22.

127. Скоромец, Т.А. Вторичная ишемия головного мозга в остром периоде черепно-мозговой травмы. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук / Т.А. Скоромец СПб., 2002. - 42 с.

128. Скоупс, Р. Методы очистки белков / Р. Скоупс М.: Мир, 1985. - 358 с.

129. Современные представления о патогенезе закрытой черепно-мозговой травмы / Под ред. Е. Г. Педаченко. Киев, 1996. - 282 с.

130. Справочник по лабораторным методам исследования / Под ред. Л.А. Даниловой. СПб.: Питер, 2003. - 736 с.

131. Стародубцев, А.И. Черепно-мозговая травма. Методическое пособие.

132. A.И. Стародубцев, И.Н. Долгова, A.A. Стародубцев и др.- Ставрополь, 2007. -60 с.

133. Сухарев, А.Е. Плацентарная щелочная фосфатаза и острофазовые белки в клинико-лабораторной оценке факторов повышенного тромбогеморрагического риска в акушерстве / А.Е. Сухарев, Ю.В. Вайчулис, Р.И. Асфандияров и др. -М.-Астрахань, 2006. 282 с.

134. Сухарев, А.Е. Уровень сывороточного лактоферрина в норме и при патологии / А.Е. Сухарев, A.A. Николаев, М.Ю. Васильев // Вопросы медицинской химии. 1990. № 3. С. 81-82.

135. Тайлицин, В.И. Закрытая черепно-мозговая травма и ее последствия /

136. B.И. Тайлицин // Международный медицинский журнал. 2002. № 1-2. С. 58-62.

137. Татаринов, Ю.С. Прошлое и будущее онкофетальных белков. Лекция к актовому дню института / Ю.С. Татаринов М., 1988. - С. 23-25.

138. Терентьев, A.A. Стероидсвязывающие онкофетальные белки человека (идентификация, выделение, характеристика, клинические аспекты). Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук / A.A. Терентьев М., 1990,42 с.

139. Титов, В.Н. Диагностическое значение повышения уровня С-реактивного белка в «клиническом» и «субклиническом» интервалах / В.Н. Титов // Клиническая лабораторная диагностика. 2004. № 6. С. 3-10.

140. Токсамбаева, С.Ж. Острая фаза воспаления: С-реактивный белок и его роль в регуляции иммунитета. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук / С.Ж. Токсамбаева М., 1996. - 54 с.

141. Тотолян, A.A. Значение оценки системы цитокинов в лабораторной диагностике / A.A. Тотолян // Клиническая лабораторная диагностика. 2008. № 9.1. C. 3.

142. Травматическая болезнь и ее осложнения / под ред. С.А.Селезнева, С.Ф.Багненко, Ю.Б.Шапота. СПб.: Политехника, 2004. - 414 с.

143. Трубников, Г.А. Иммунохимические маркеры воспаления и опухолей в клинической пульмонологии / Г.А. Трубников Астрахань, 2000. - С.70-80.

144. Унжаков, В.В. Обеспечение седатации и изучение динамики некоторых гормонов в раннем послеоперационном периоде у пациентов с тяжелой черепно-мозговой травмой / В.В. Унжаков, А.Н. Кондратьев // Анестезиология и реаниматология. 2005. № 4. С. 52-54.

145. Флорикян, А.К. Травматическая болезнь / А.К. Флорикян // Международный медицинский журнал. 1999. Т.5. № 1. С. 106-109.

146. Фрейдлин, И.С. Регуляторные функции провоспалительных цитокинов и острофазных белков / И.С. Фрейдлин, П.Г. Назаров // Вестник Российской АМН. 1999. № 5. С. 28-32.

147. Хазанов, А.И. Функциональная диагностика болезней печени / А.И. Хазанов М.: Медицина, 1988. - 304 с.

148. Храмкова Н.И. Предел чувствительности метода преципитации в агаре / Н.И. Храмкова, Г.И. Абелев // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1961. № 12. С. 107-109.

149. Царенко, С.В. Нейрореаниматология. Интенсивная терапия черепно-мозговой травмы // С.В. Царенко М.: Медицина, 2006. - 352 с.

150. Черешнев, В.А. Иммунология воспаления: роль цитокинов / В.А. Череш-нев, Е.Ю. Гусев //Медицинская иммунология. 2001. Т.З. №3. С.361-368.

151. Черный, В.И. Некоторые особенности течения тяжелой черепно-мозговой травмы / В.И. Черный, Г.А Городник., E.JI. Островой, И.В. Качур // Скорая медицинская помощь. 2003. № 4. С. 112-114.

152. Чехонин, В.П. Иммунохимический анализ нейроспецифических антигенов / В.П. Чехонин, Т.Б. Дмитриева, Ю.А. Жирков М.: Медицина, 1999. - 416 с.

153. Чехонин, В.П. Основной белок миелина: строение, свойства, функции, роль в диагностике демиелинизирующих заболеваний / В.П. Чехонин, О.И., Турина Т.Б. Дмитриева и др. // Вопросы медицинской химии. 2000. № 6. С. 6-20.

154. Чехонин, В.П. Иммунохимическое изучение механизмов аутоиммунной агрессии антител к нейроспецифическим белкам у крыс с экспериментальным прорывом ГЭБ / В.П. Чехонин, Р.Ц. Лиджиева, Е.А. Коротеева и др. // Нейро-химия. 1989. Т. 9, № 2. С. 241-246.

155. Чишиева, М.А. Иммунохимические исследования водорастворимых антигенов фетальной, дефинитивной и опухолевой ткани мозга человека. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук / М.А. Чишиева Астрахань, 1978. - 22 с.

156. Шараев, П.Н. Клиническое значение исследований гликопротеинов и гликопептидов в сыворотке крови / П.Н. Шараев, Н.С. Стрелков, Т.Н. Васильева, О.И. Лекомцева // Клиническая лабораторная диагностика. 2005. № 10. С. 78.

157. Шевченко, Н.Г. Лабораторная диагностика нарушений обмена железа (лекция) / Н.Г. Шевченко // Клиническая лабораторная диагностика. 1997. № 4. С. 25-32.

158. Шепелева, И.И. Нейрональные молекулы клеточной адгезии (структура, функции, клинико-диагностические перспективы) / И.И. Шепелева, В.П. Чехонин // Журнал невропатологии и психиатрии имени С.С. Корсакова. 1996. № 5. С. 113-117.

159. Штарк, М.Б. Мозгоспецифические белки (антигены) и функция нейрона / М.Б. Штарк -М.: Медицина, 1985.

160. Agnati, L.F. The brain as a system of nested but partially overlapping networks. Heuristic relevance of the model for brain physiology and pathology / L.F. Agnati, D. Guidolin, K. Fuxe // J. Neural. Transm. 2007. Vol. 114. P. 3-19.

161. Bakay, R.A. Enzymatic changes in serum and cerebrospinal fluid in neurological injury / R.A. Bakay, A.A. Ward Jr. // J. Neurosurg. 1983. Vol. 58. P. 27-37.

162. Bentouati, L. Hyperphosphatasemia related to three intestinal alkaline phosphatase isoforms: biochemical study / L. Bentouati, M. Samadi, H. Hachem et al. // Clin.

163. Chim. Acta. 1990. Vol. 189. P.145-152.

164. Biberthaler, P. Elevated serum levels of S-100B reflect the extent of brain injury in alcohol intoxicated patients after mild head trauma / P. Biberthaler, T. Mussack, E. Wiedemann et al. // Shock. 2001. Vol. 16. P. 97-101.

165. Bulut, M. Tau protein as a serum marker of brain damage in mild traumatic brain injury: preliminary results / M. Bulut, O. Koksal, S. Dogan et al. // Advances in therapy. Vol. 23. N 1. P. 12-22.

166. Cairo, G. Induction of ferritin synthesis by oxidative stress. Transcriptional and posttranscriptional regulation by expansion of the "free" iron pool / G. Cairo, L. Tac-chini, G. Pogliaghi et al. // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270. N 2. P. 700-703.

167. Celtik, C. Neuron-specific enolase as a marker of the severity and outcome of hypoxic ischemic encephalopathy / C. Celtik, B. Acunas, N. Oner, O. Pala // Brain Dev. 2004. Vol. 26. P. 398-402.

168. Cooper, E.H. Neuron-specific enolase / E.H. Cooper // Int. J Biol Markers. 1994. Vol. 4. P. 205-210.

169. Crichton, R.R. Ferritin Structur und Funktion / Crichton R.R. // Med. Welt. 1981. Bd. 32. Heft. 38. S. 1401-1404.

170. Crouch, S.P. Regulation of cytokine release from mononuclear eels by the iron-binding protein lactoferrin / S.P. Crouch, K.J. Slater, J. Fletcher // Blood. 1992. Vol. 80. N1. P. 235-240.

171. Dahl, D. Glial fibrillary acidic protein from normal human brain. Purification and properties. / D. Dahl, A. Bignami // Brain Res. 1973. Vol. 57. P. 343.

172. Dauberschmidt, R. Severe head trauma and the changes of concentration of neuron-specific enolase in plasma and cerebrospinal fluid. / R. Dauberschmidt, P.J. Marangos, J. Zinsmeyer et al. // Clin. Chim. Acta. 1983. Vol. 131. P. 165-170.

173. Day, I.N.M. Levels of immunoreactive aldolase C, creatine kinase-BB, neuronal and non-neuronal enolase and 14-3-2 protein in circulating human blood cells. / I.N.M. Day, R.J. Thompson // Clin. Chim. Acta. 1984., Vol. 136. P. 219-228.

174. De Boussard, C.N. S-100 and cognitive impairment after mild traumatic brain injury / C.N. De Boussard, A. Lundin, D. Karlstedt et al. // J. Rehabil. Med. 2005. Vol. 37. P. 53-57.

175. Dionysius, D.A. Form of lactoferrin: their antibacterial effect on enterotoxigenic Escherichia coli / D.A. Dionysius, P.A. Grieva, J.M. Milne // J. Dairy. Sci. 1993.

176. Vol. 76. N 9. P. 2597-2600.

177. Drysdale, J.W. Ferritin phenotypes: structure and metabolism / J.W. Drysdale // Iron Metabolism. 1977. P. 41-57.

178. Duffau, H. Brain plasticity: from pathophysiological mechanisms to therapeutic applications / H. Duffau // J. Clin. Neurosci. 2006. Vol. 13(9). P. 885-897.

179. Elting, J.W. Comparison of serum S-100 protein levels following stroke and traumatic brain injury / J.W. Elting, A.E.J. De Jager, A.W. Teelken et al. // J. Neurol. Sci. 2000. Vol. 181. P. 104-110.

180. Eng, L.F. Glial fibrillary acidic protein: GFAP-thirty-one years (1969-2000) / L.F. Eng, R.S. Ghirnikar, Y.L. Lee //Neurochem. Res. 2000. Vol. 25. P. 1439-1451.

181. Ergun, R. Prognostic value of serumneuron-specific enolase levels after head injury / R. Ergun, U. Bostanci, G. Akdemir et al. // Neurol. Res. 1998. Vol. 0(5). P. 418-420.

182. Fishman, W.H. Immunologic and biochemical approaches alkaline phosphatase isoenzyme analysis: the Regan isoenzyme / W.H. Fishman // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1969. Vol. 166. P. 745-749.

183. Fridriksson, T. Serum neuron-specific enolase as a predictor of intracranial lesions in children with head trauma: a pilot study / T. Fridriksson, N. Kini, C. Walsh-Kelly, H. Hennes / Acad. Emerg. Med. 2000. Vol. 7. P. 816-820.

184. Fujita, T. Chromatography in presence of high concentrations of salts on columns of celluloses with and without ion exchange groups (hydrogen bond chromatography) / T. Fujita, Y. Suzuki, J. Yamauti et al. // J. Biochem. 1980. Vol. 87. N 2. P. 89-100.

185. Furuse, M. Claudin-1 and -2: novel integral membrane proteins localizing at tight junctions with no sequence similarity to occludin / M. Furuse, K. Fujita, T. Hiiragi et al. // J. Cell. Biol. 1998. Vol. 141. P. 1539-1550.

186. Gaetz, M. The neurophysiology of brain injury / M. Gaetz // Clinical Neurophysiology. 2004. Vol. 115. P. 4-18.

187. Garga, N. Posttraumatic epilepsy: A major problem in desperate need of major advances /N. Garga, D.H. Lowenstein // Epilepsy Currents. 2006. Vol. 6(1). P. 1-5.

188. Grasso, A. Preparation and properties of the brain specific protein 14-3-2 / A. Grasso, G. Roda et al. // Brain Res. 1977. Vol. 124. P. 497-507.

189. Gold, P. Specific carcinoembryonic antigen of the human digestive system / P. Gold, S.O. Freedman // J.Exp. Med. 1965. Vol. 122. P.467 481.

190. Harrison, P.M. The ferritins: molecular properties, iron storage function and cellular regulation / P.M. Harrison, P. Arosio // Biochim. Biophys. Acta. 1996. Vol. 1275. N3. P. 161-203.

191. Hayakata, T. Changes in CSF SI00b and Cytokine Concentrations in Early-Phase Severe Traumatic / T. Hayakata, T. Shiozaki, O. Tasaki et al. // Brain Injury Shock. 2004. Vol. 22(2). P. 102-107.

192. Hecke, F. Circulating complement proteins in multiple trauma patients-correlation with injury severity, development + of sepsis, and outcome / F. Hecke, U. Schmidt, A. Kola // Crit. Care Med. 1997. Vol. 25, N 12. P. 2015-2024.

193. Hergenroeder, G.W. Identification of serum biomarkers in brain-injured adults: potential for predicting elevated intracranial pressure / Hergenroeder G.W., Redell,

194. J.B., Moore, A.N. et al. // J. Neurotrauma. 2008. Vol. 25. P. 79-93.

195. Hergenroeder, G.W. Serum IL-6: a candidate biomarker for intracranial pressure elevation following isolated traumatic brain injur / G.W. Hergenroeder, A.N. Moore, J.P. McCoy et al. // J. Neuroinflammation. 2010. Vol. 7. P. 19.

196. Herrmann, M. Brain derived proteins as markers of acute stroke: their relation to pathophysiology, outcome prediction and neuroprotective drug monitoring / M. Herrmann, H. Elirenreich // Restor. Neurol. Neurosci., 2003. Vol. 21. P. 177-90.

197. Ingebrigtsen, T. Biochemical serum markers of traumatic brain injury / T. Ingebrigtsen, B. Romner // J.Trauma. 2002. Vol. 52. P. 798-808.

198. Ingebrigtsen, T. Biochemical serum markers for brain damage: a short review with emphasis on clinical utility in mild head injury / T. Ingebrigtsen, B. Romner // Restor. Neurol. Neurosci. 2003. Vol. 21. P. 171-176.

199. Jackson, R.G. Extra cranial sources of S-100B / R.G. Jackson, K.M. Sales, G.S. Samra, L. Strunin // Br. J. Anaesth. 2001. Vol. 86. P. 601.

200. Korfias, S. Serum S-100B protein monitoring in patients with severe traumatic brain injury / S. Korfias, G. Stranjalis, E. Boviatsis et al. // Intensive Care Med. 2007. Vol. 33(2). P.255-260.

201. Langfitt, T.W. A holistic view of head injury including a new clinical classification Head Injury: Basic and clinical aspects / T.W. Langfitt, T.A. Gennarelli: Ed. R.G. Grossman, P.L Gildenberg. New York, Raven Press, 1982. - P. 1-14

202. Laurell, C.B. Electroimmunoassay / C.B. Laurell // Scand. J. Clin. Lab. Invest. 1972. Vol. 29. Suppl.124. P. 21-37.

203. Li, N. S-100B and neuron specific enolase in outcome prediction of severe head / N. Li, J.K. Shen, W.G. Zhao et al. // Chin J. Traumatol. 2004. Vol. 7(3). P. 156-158.

204. Lowry, O.H. Protein measurement with Folin phenol reagent / O.H. Lowry, N.J. Rosenbrough, A.L. Farr, R.J. Randall // J.Biol. Chem. 1951. Vol. 193. P. 265269.

205. Mancini, G. Further studies on single radial immunodiffusion. III. Quantitative analysis of related and unrelated antigens / G. Mancini, D.R. Nash, J.F. Heremans // Immunochemistry. 1970. N.7. P. 261-264.

206. Maneva, A.I. Effect of bovine milk antigens and egg lysozyme on the binding of 59Fe-Lactoferrin to platelet plasma membranes / A.L Maneva, B.M. Taleva, V.V. Manev et al. // Int. J. Biochem. 1993. Dec. Vol. 25. N 12. P. 1785-1790.

207. Missler, U. Measurement of glial fibrillary acidic protein in human blood: analytical method and preliminary clinical results / U. Missler, M. Wiesmann, G. Wittmann et al. // Clin. Chem. 1999. N 45. P. 138-141.

208. Monnard, C. Lactoferrin: biochemistry, physiological role and value in human biology / C. Monnard, M. Vernet // Pathol. Biol. 1988. Vol. 36. N 7. P. 933-939.

209. Moore, B.W. A soluble protein characteristic of the nervous system / B.W. Moore // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1965. Vol. 19. P. 739-744.

210. Moore, B.W. Chromatographic and electrophoretic fractionation of soluble proteins of brain and liver / B.W. Moore, D. McGregor // J. Biol. Chem. 1965. Vol. 133. P. 1647-1653.

211. Morgan, C.L. Immunosensors: Technology and opportunities in laboratory medicine / C.L. Morgan, D.J. Newman, C.P. Price // Clin. Chem. 1996. N 2. P. 193209.

212. Nylen, K.J. Increased serum-GFAP in patients with severe traumatic brain injury is related to outcome / K.J. Nylen, M. Ost, L.Z. Csajbok et al. // Neurol. Sci. 2006. Vol. 240. N 1-2. P. 85-91.

213. Ouchterlony, O. Diffusion in gel methods for immunological analysis / O. Ouchterlony // Progress in Allergy. 1958. Vol. 5. P.l-15.

214. Pelinka L.E. Serum markers of severe traumatic brain injury: are they useful? / L.E. Pelinka, L. Boltzmann // Scand. J. Trauma Resusc. Emerg. Med. 2005. Vol. 13. P. 113-115.

215. Pelinka, L.E. Nonspecific increase of systemic neuron-specific enolase after trauma: clinical and experimental findings / L.E. Pelinka, H. Hertz, W. Mauritz et al. // Shock. 2005. Vol. 24(2). P. 119-123.

216. Pelinka, L.E. S100B and NSE as a marker of severity and outcome after traumatic brain injury / L.E. Pelinka, W. Mauritz, E. Toegel, H. Redl // Rest. Neurol. Neurosci. 2000. Vol. 16. P. 283.

217. Pelinka, L.E. Serum S100B as a marker of brain damage in the trauma intensive care unit / L.E. Pelinka, H. Redl, A. Kropfl, W. Mauritz // Critical Care. 2002. Vol. 6. Suppl. 1. P.58-60.

218. Pelinka, L.E. Serum S100B: a marker of brain damage in traumatic brain injury with nd without multiple trauma / L.E. Pelinka, E. Toegel, W. Mauritz, H. Redl // Shock. 2003. Vol. 19. P.195-200.

219. Petzold, A. Role of serum S100B as an early predictor of high intracranial pressure and mortality in brain injury: a pilot study / A. Petzold, A.J. Green, G. Keir et al. // Crit. Care Med. 2002. Vol. 30. P. 2705-2710.

220. Persson, L. S-100 protein and neuronspecific enolase in cerebrospinal fluid and serum: markers of cell damage in human central nervous system / L. Persson, H.G. Hardemark, J. Gustafsson et al. // Stroke. 1987. Vol. 18. P. 911-918.

221. Raabe, A. Serum S-100ß in severe head injury / Raabe A., Grolms C., Sorge O. et al. //Neurosurgery. 1999. Vol. 45. P. 477-483.

222. Regner, A. Neurochemical characterization of traumatic brain injury in humans / A. Regner, L.B. Alves, I. Chemale et al. // J. Neurotrauma. 2001. Vol. 18. P. 783792.

223. Redell, J.B. Human traumatic brain injury alters plasma microRNA levels / J.B. Redell, A.N. Moore, N.H. Ward // J. Neurotrauma. 2010. Vol. 27. P. 2147-2156.

224. Reilly, P.L. Head injury, pathophysiology and management. Reilly P.L., Bullock R. (eds). 2nd ed. -NY, 2005. - 501 p.

225. Romner, B. Traumatic brain damage: serum S-100 protein measurements related to neuroradiological findings / B. Romner, T. Ingebrigtsen, P. Kongstad, S.E. Bor-gesen // J. Neurotrauma. 2000. Vol. 17. P. 641-647.

226. Rothoerl, R.D. S-100 Serum levels and outcome after severe head injury / R.D. Rothoerl, C. Woertgen, A. Brawanski // Acta Neurochir. 2000. Vol. 76. Suppl. P. 97100.

227. Rueger, R. Purification of a brain-specific astroglial protein by immunoaffinity chromatography. / R. Rueger, D. Dahl, A. Bignami // Anal. Biochem. 1978. Vol. 89. P. 360.

228. Skogseid, I.M. Increased serum creatine kinase BB and neuron specific enolase following head injury indicates brain damage / I.M. Skogseid, H.K. Nordby, P. Urdal et al. // Acta Neurochir (Wien). 1992. Vol. 115(3-4). P. 106-111.

229. Snyder-Ramos, S.A. Molecular markers of brain damage — clinical and ethical implications with particular focus on cardiac arrest / S.A. Snyder-Ramos, B. Boettiger // Restor. Neurol. Neurosci. 2003. Vol. 21. P. 123-140.

230. Strecker, W. Early biochemical characterization of soft-tissue trauma and fracture trauma / W. Strecker, F. Gebhard, I. Roger et al. // J. Trauma. 1999. Vol. 47. N 2. P. 358-364.

231. Theil, E. Ferritin: structure, gene regulation and cellular function in animals, plants and microorganisms / E. Theil // Ann. Rev. Biochem. 1987. Vol. 56. P. 289315.

232. Von der Haar, F. Purification of proteins by fractional interfacial salting out chromatography on unsubstituted agarose gels / F. Von der Haar // Biochem. Bio-phys. Res. Commun. 1976. Vol. 70. N 4. P. 1009-1013.

233. Vos, P.E. Glial and neuronal proteins in serum predict outcome after severe traumatic brain injury / P.E. Vos, K.J. Lamers, J.C. Hendriks et al. // Neurology. 2004. Vol. 62(8). P. 303-1310.

234. Warecka, K. Isolation of brain-specific glycoprotein / K. Warecka // J. Neuro-chem. 1970. Vol. 17. P. 829.

235. Waterloo, K. Neuropsychological function in patients with increased serum of protein S-100 after minor head injury / K. Waterloo, T. Ingebrigtsen, B. Romner // ActaNeurochir. (Wien). 1997. Vol. 139. P. 26-32.

236. Wiesmann, M. Plasma S-lOOb protein concentration in healthy adults is age and sex independent / M. Wiesmann, U. Missler, D. Gottman, S. Gehring // Clin Chem. 1998. Vol. 44(5). P. 1056-1058.

237. Woertgen, C. Neuron-Specific Enolase Serum Levels After Controlled Cortical Impact Injury in the Rat / C. Woertgen, R.D. Rothoerl, A. Brawanski // Journal of Neurotrauma. 2001. Vol. 18(5). 569-574.

238. Wu, H.E. Neutralization of heparin activity by neutrophil lactoferrin / H.E. Wu, R.L. Lundbild, F.C. Church // Blood. 1995. Vol. 85. N 2. P. 421-428.

239. Утверждаю» Главный врач K.MjijDpjioB Ф.В.пеии/111. Щъ^'-^рос,1. Я* iy * ИЮЛ^

240. Зав. нейрохирургическим отделением1. К.М.Н.

241. Зав. отделением анестезиологии реанимации1. K.M.H.

242. Зав. отделением травматологии

243. Заместитель главного врача по хирургии, K.M.H.

244. МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЕ

245. АСТРАХАНСКОЙ ОБЛАСТИ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ АСТРАХАНСКОЙ ОБЛАСТИ «ОБЛАСТНАЯ ДЕТСКАЯ КЛИНИЧЕСКАЯ

246. БОЛЬНИЦА имени H.H. Силищевой» (ГБУЗ АО «ОДКБ им.Н.Н.Силищевой»)

247. Медиков ул., д 6, г.Астрахань, 414011 тел./факс: (85-12) 61-87-50 e-mail,: odkbf2005@mail.ru ОКПО 01917120 ОГРН 1023000868670 ИНН/КПП 3016007310 / 3016010011. ОДКБ

248. Утверждаю» „ач ГБУЗ АО евои»1. Акт внедрения

249. Зам. главного врача по медицинской части ГБУЗ АО «ОДКБ им. Н.Н.Силищевой»

250. Заведующий отделением хирургии № 1 ГБУЗ АО «ОДКБ им. Н.Н.Силищевой»

251. Зав. нейрохирургическим отделением ГБУЗ АО «ОДКБ им. Н.Н.Силищевой»t1. А.В.Кокуев1. С.В.Чукарев1. А.П.Михеев1. УТВЕРЖДАЮ

252. Ректор государственного бюджетного образовательного учреждениявысшего профессионального образования «Астраханская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития

253. Российской Федерации профессор, д.м.н.1. Х.М.Галимзянов2011г.1. АКТоб использовании предложения

254. НАЗВАНИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ: способ выделения и очистки термостабильного антигена мозга.

255. ПРЕДЛОЖЕНИЕ ИСПОЛЬЗУЕТСЯ: на кафедре биохимии с курсом клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО АГМА Минздравсоцразвития России с 1 ноября 2011г.

256. ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРЕДЛОЖЕНИЯ: используемый новый способ расширяет возможности в научных исследованиях по биохимии белков мозга.

257. Зав. кафедрой биохимии с курсом КЛД ГБОУ ВПО АГМА Минздравсоцразвития России д.м.н., профессор Д.М.Никулина

258. Автор предложения уо// ^ А.А.Мяснянкин1. УТВЕРЖДАЮ

259. Ректор государственного бюджетного образовательного учреждениявысшего профессионального образования «Астраханская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития

260. Российской Федерации профессор, д.м.н.1. Х.М.Галимзянов2011г.1. АКТоб использовании предложения

261. НАЗВАНИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ: способ выделения и очистки плацентарной щелочной фосфатазы.

262. ПРЕДЛОЖЕНИЕ ИСПОЛЬЗУЕТСЯ: на кафедре общей и биоорганической химии ГБОУ ВПО АГМА Минздравсоцразвития России с 1 июня 2011г. ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРЕДЛОЖЕНИЯ: используемый новый способ расширяет возможности в научных исследованиях по биохимии белков.

263. Зав. кафедрой общей и биоорганической химии ГБОУ ВПО АГМА Минздравсоцразвития России д.м.н., профессор1. Автор предложения1. А.А.Николаев1. А.А.Мяснянкин

264. Утверждаю" Проректор по учебной работе ГБОУ ВПО «Астраханская1. Акт внедрения

265. Зав. учебной частью кафедры патологической физиологии АГМА, к.м.н., доцент

266. Подписи Л.С.Сурковой и И.Р.Шагиной Заверяю:

267. Ученый секретарь ученого совета ГБОУ ВПО АГМА Минздравсоцразв Доцент1. В.Д.Ничога

Информация о работе

Мяснянкин, Александр Алексеевич
кандидата медицинских наук
Краснодар, 2012
ВАК 03.01.04

Диссертация

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ОРГАНОСПЕЦИФИЧЕСКИХ И МЕЖОРГАННЫХ БЕЛКОВ МОЗГА И ИХ ЗНАЧЕНИЕ В ПРОГНОЗИРОВАНИИ ОСЛОЖНЕНИЙ ЧЕРЕПНО-МОЗГОВОЙ ТРАВМЫ - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы