Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИДЕНТИФИКАЦИЯ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ РАЗНОЙ СТЕПЕНИ ЭФФЕКТИВНОСТИ (ЦИТОХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ)

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ИДЕНТИФИКАЦИЯ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ РАЗНОЙ СТЕПЕНИ ЭФФЕКТИВНОСТИ (ЦИТОХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ)"

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА СССР

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К, А. ТИМИРЯЗЕВА

ХСЧб'З

На правах рукописи Валерия Алексеевна С И ГУТА

ИДЕНТИФИКАЦИЯ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИИ РАЗНОЙ СТЕПЕНИ ЭФФЕКТИВНОСТИ (ЦИТОХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ)

Специальность 03.00.07 — микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА — 1979

Работа выполнена на кафедре микробиологии Московской с.-х. академии им. К- А. Тимирязева.

'Научный 'руководитель — доктор биологических маук профессор В. К. Шйльникова.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук профессор А, А. Авакян, кандидат биологических наук старший научный сотрудник Е. А. Кронгауз.

Ведущее учреждение—Институт микробиологии АН СССР.

Защита диссертации состоится « /Г* . . 1979 г.

в 15 час. на заседании Специализированного совета К-120.36.06 'в Московской с.-х. академий им. К. А. Тимирязева.

Адрес: 127550, г. Москва, И-550, ул. Тимирязевская, 49. Сектор защиты диссертаций ТСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА.

Автореферат разослан « ... 1979 г.

Ученый секретарь-Специализированного совета кандидат биологических наук доцент

ент К

В. Г. Марьеико

\

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Для производства нитрагина необходимы штаммы клубеньковых, бактерий с( повышенной эффективностью. В связи с этим вопросе быстром- и надежном методе отбора таких штаммов остается одним из ведущих в проблеме бобово-ризобиальногосимбиоза. Достоверных способов определения эффективности клубеньковых бактерий в чистой культуре до сих пор-нет. Поскольку между содержанием в клетках некоторых биополимеров (РНК, ДНК, полисахаридов, липидов, иоли-р-оксимасляной кислоты, волютина) и эффективностью штаммов ризобий в ряде случаев установлена определенная корреляция, надо полагать, что попытки отыскания критериев эффективности методами люминесцентной йитохимии, в частности, цитофлюориметрии,. перспективны. Люминесцентная микроскопия позволяет исследовать структурную .организацию конкретной клетки, оценить ее функциональную активность, дает возможность точно установить локализацию исследуемого вещества в ней; цитофлюори-метрический анализ этого вещества чувствительнее суммарного биохимического. Люминесцентная цитохимия полнее характеризует существующие -взаимозависимости, эффективности 1 клубеньковых бактерий с содержанием- биополимеров в их клетках. Систематических исследований клубеньковых бактерий цитофлюоресцентными методами ранее практически не проводилось.

Цель м задачи исследования. Выявление цитохимическими методами нуклеиновых кислот, полисахаридов, волютина, липидов (в том числе поли-р-оксимасляной кислоты) в клетках клубеньковых бактерий^ разной степени эффективности и ко- ' личественная оценка содержания! в них: ДНК, гликогена, липидов. - ' ' у Объекты исследования. Исследованы эффективные (эф.) и неэффективные (неэф.) штаммы 1?ЫгоЫит 1ир1*щ шт. 359а (эф.) л 400 (неэф.) Ш1. ]ароп1сиш шт. 646 и 606 (эф.), 640 (неэф.), ЯЬ, 1ееиш1П05агиш 245а (эф.), 2246 (неэф.), 96 (эф. для кормовых бобов), ИЬ. Ш[оШ шт. 345а (эф.), 314 (неэф.);

Kh. meliloti шт. 87 (эф. для люцерны, неэф. для кормовУ^ бобов), -Ш (эф.). 34 (неэф.). Штаммы «з коллекции ВНИИ с.-х. микробиологии и Института микробиологии АН АрмССР.

Методы исследования. Для экспериментальной работы культуры клубеньковых бактерий выращивали на среде Исва-рана (Iswaran et al„,.1973). Исследовали 18- и 36-часовые, 3-, 5- и 66-суточные культуры.

Эффективность симбиотической азотфиксации клубеньковых бактерий люпина, сон, гороха и кормовых бобов изучали в вегетационных опытах (Журбицкий, 1968) в лаборатории искусственного чел им ата и в теплиие Опытной станции полеводства и льноводства ТСХА. Сою Харьковская скороспелая выращивали на кварцевом песке в пластмассовых сосудах Митчерлиха вместимостью 6 кг. Смесь Кнопа (0,25 нормы азота) вносили при набивке сосудов. Полив проводили по массе до 60% полной влагоемкости песка. Люпин узколистны йН емч ин о вс кн й 846, торох карликовый Метеор и кормовые бобы Русские черные выращивали в водной культуре в стек-' лянных сосудах вместимостью 1 л (люпин и кормовые бобы по 3 растения на сосуд, горох — по 5) в 10-кратной повторно-сти на растворе солей Кнопа — 0,25 нормы азота (КМОз и Са(МОзЫ, рН среды 5,6. Раствор меняли каждые 5 дней. Семена-стерилизовали по Натма«у-(Nutman, 1945). Для инокуляции растений использовали водные суспензии исследуемых штаммов из расчета 20—30 тыс. клеток на 1 семя. Концентрацию клубеньковых бактерий определяли методом- прямого счета после окрашивания суспензии акридиновым оранжевым и примулином (Шильннкова, Сигута, Чекасина, Голод, Емцев, 1976). Бактероиды из клубеньков бобовых растений выделяли в период бутонизации—цветения по методу Бергерсена (Bergersen, 1966).

Эффективность штаммов клубеньковых бактерий по продуктивности развития и содержанию в зеленой массе'общего, азота соответствовала их производственной характеристике. Так, содержание общего азота <в зеленой массе сои при бактеризации шт. 646 — 2,14; шт. 640—1,94, контроль г-1,46%; у кормовых бобов при бактеризации шт. 96—2,31; шт. 87— 2,20, контроль — 2,15; люпина при бактеризации шт. 359а — 1,9, шт. 400— 1,6, контроль— 1,7; гороха при бактеризации шт. 245а —3,27, шт. 2246 — 2,86, контроль —2,81.

В клетках клубеньковых, бактерий in vitro и бактероидах из клубеньков при бобово-рнзобиа льном симбиозе цитохими-чески выявляли:

— гликоген методами, основанными на Шифф-периодат--ном окислении ÍPAS-реакции): МакМануса (McManus, 1946), А. Л. Шабадаша (1947) и описанными: М;,В. Кудрявцевой с coaвт, (1970)—светлопольный и люминесцентный варианты;

— ДНК люминесцентнымвариантом- реакции Фёльгена (Хачатуров, Смирнова, 1966);

— РНК методом Браше (Brächet, 1940)нокраской акридиновым оранжевым (Rigler, 1966);

— количество нуклеоидов- методом Романавского-Гнмзы-Пекарского (Пешков, 1955);

— волютин методом Мейера (Пешков, 1955);

— лил иды и п о л и-ß - оке им а сл я ну ю кислоту судаиофильны-ми методами: Гольдмана (Ромейс, 1954); коллоидным раствором судама черного В по Ромейеу, Суданом черным В, растворенным в пропиленгликоле и люминесцентными: кофеин-бенз(а) пиреновым раствором-(Berg, 1951), водными растворами фосфина. 3R и нильского синего в концентрации 50 мкг/мл и методом-Шифф-надуксусная кислота, выявляющим липнды с ненасыщенными связями (Кисели, 1962);

— мезосомы. методом Дэ Бая н Шовэйкра (Du Buy, Showackre, 1961).

Все наблюдения люминесцентных препаратов проводили на микроскопе МЛ-2 в силе-фиолетоаых иди УФ-луч ах, а также методом фазового контраста; фотографировали на пленку РФ-3 (об. 90х, ап. 1,30 ФМИ, ок. 5х, гомалЬ).' Светлопольную микроскопию препаратов и их фотографирование осуществляли в микроскопе «Amplivab (об, ЮОх, an. 1,32 МИ, ок. 5х. го-маль) на пленку микрат-200. Цитофлюориметрический анализ проводили в Институте молекулярной биологии: АН СССР: гликогена на ммкрофлюориметре с цифровым отсчетом- (Бабаджанян с соавт., 1976), количества ДНК и' липидов с ненасыщенными связями— на приборе, собранном Е. Н. Хачату-ровым (1977). Люминесценцию препаратов возбуждали в области 360—400 нм.

Научная;новизна -результатов. Впервые у клубеньковых бактерий разной степени эффективности цитофлюоресцентны-ми методами установлены топография и качественный состав липидов, в том числе и полиэфира пол и-ß-оксим з с л я н ой кислоты }нуклеиновых кислот, полисахаридов. Проведена иито-флюориметрия ДНК, гликогена и липидов с ненасыщенными связями (в условных единицах, на клетку) в культуре in vitro и бактероидах из клубеньков растений при бобово-ризобиаль-ном симбиозе. Количественные измерения нуклеиновых кислот, полисахаридов, липидов и т. п. в конкретных бактероид-ных клетках имеют особое значение для исследований в условиях симбиоза. При подготовке бактероидов из клубенька для биохимических анализов возможны ошибки, вследствие загрязнения анализируемого образца растительным материалом. Цитофлюориметрия такие ошибки исключает.

Цитолюминесцентнымн методами установлена корреляция

з

уровня ДНК и гликогена в клетках клубеньковых бактерий с эффективностью последних.

Практическая ценность работы. Цитофлюоресцентные методы выявления нуклеиновых кислот, полисахаридов, липндов и полн-р-оксимасляной кислоты в клетках клубеньковых бактерий и бактероидах из клубеньков могут быть применены в лабораторной практике при характеристике )! предварительном отборе штаммов ризобий разной степени эффективности.

Апробация работы. Результаты исследования доложены на V Всесоюзном Баховском коллоквиуме по азотфиксацни (Ка-нев, 1970), республиканской конференции «Микробиологические процессы в почвах и урожайность сельскохозяйственных культур» (Вильнюс, 1978) и заседании кафедры микробиологии ТСХЛ.

Публикация результатов исследований. Основные положения диссертации опубликованы в 6 работах-

Объем работы. Диссертация состоит из 147 страниц машинописного текста, 3 таблиц, 36 рисунков. Библиография включает 327 наименований, в т. ч, 194 зарубежных авторов.

( СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. Избирательное выявление нуклеиновых кислот и полисахаридов в клетках клубеньковых бактерий

РНК и кислые мукополисахариды. До настоящего времени цнтохимически выявить РНК в клетках клубеньковых бактерий, особенно в чистых культурах, ле всегда удавалось (Лвва-кумова с соавт., 1973). Метод Браше, используемый для этих целей, не давал положительных результатов и в наших исследованиях. Это может быть следствием низкой концентрации РНК в клетках рнзобий или связи кислоты с белком. Ме-дод Рнглера 1966), основанный на окрашивании пре-

паратов акридиновым оранжевым при определенных рН раствора флюорохрома, дает возможность выявлять в клетках ризобий нуклеиновые кислоты (в т. ч. и низкие концентрации РНК). В флюорохромированной -при рН 4,1—4,5 клетке красную люминесценцию вызывает комплекс акридинового оранжевого с однонитевой молекулой нуклеиновой кислоты и кислыми мукополнеахарндами (в частности, гналуроновой кислотой), ярко-зеленую — комплекс флюорохром-а с двунитевой нуклеиновой кислотой. При рН 2,0—2,5 продолжают светиться красным только сульфатированныс мукополисахариды, хотя РНК и гиалуронозая кислота присутствуют в препарате (Зеленин, Степанова, 1968). Нуклеопротеид в клетках ризобий, флюорохромироваиных акридиновым оранжевым при ■рН 4,2, имеет изумрудно-зеленое свечение, а РНК и кпе-

лые мукополисахарнды— красное. Для бактероидов характерно преобладание над зеленым красного компонента (особенно при рН 2,2). В клетках Есех палочковидных и бакте-роидных форм ризобий выявлены флюорохромнрованием акридиновым оранжевым ДНК и. РНК. После ферментолиза ДНК-азой только препараты чистой культуры ЯЬ. 1ериштоза-гит шт. 245а приобретали желто-зеленую мозанчность. Причиной этого может быть: недостаточное время ферментолнза (что весьма сомнительно) или свечение лнпопрогеидных гранул, маскированных ранее ДНК, поскольку концентрация мономерной формы акридинового оранжевого (и при рН 4—5) возможна в липндах (Менсель, Мнролюбова, 1959).

Ферментолиз препаратов 0,1%-ным растворам!^ РНК-азы, ДНК-азы 1! гиалуроиидази '(стрептококковой) позволял дифференцировать окрашенный материал.

Количество РНК выше (визуально) у бактероидов из клубеньков по сравнению с клетками в чистых культурах. Зависимости уровня РНК от эффективности штамма не установлено.

Кислые сульфатированные мукополисахариды были выяв-* лены акридиновым оранжевым (рН 2,2) во всех нсследован-„ ных клетках клубеньковых бактерий, кроме чистых культур Ш1. 1пГоШ шт. 345а. Они имели вид крупных красных включений, расположенных преимущественно в центре клеток и на полюсах, у ПИ. ]арошсиш шт. 646, кроме крупных гранул внутри клетки, ярко окрашивалась оболочка.

Ферментолиз РНК-азой почти всегда снимал в клетках рнзобнй красное "свечение после флюорохромирования при рН 4,2. Известно, что красная люмипесцетшя при рН 4,1—1,5 может принадлежать не только РНК, но н комплексу флюоро-хрома с кислыми мукополисахарндами, в частности, гналуро-новой кислоте. Исходя из того, что реакционные группы кислых мукополисахарндов могут блокироваться белками, а сами они способны депоаимернзоваться и вымываться и, наконец, их концентрации могут быть ничтожны, чтобы быть -выявлены при наших условиях фиксации, окраски и т. п., мы не можем утверждать об отсутствии несульфатированных кислых муко-полисахаридов п клетках клубеньковых бактерий. Однако корректного выявления их нами не получено при флюорохромнро-вании акридиновым оранжевым при рН 4,2.

Дезоксирибонуклеиновая кислота. Цитохимические, особенно цитофлюорнмстрнческие, исследования ДНК в клетках клубеньковых бактерий, в связи с их эффективностью ранее не проводились.' Данные биохимических исследований ДНК в ризобиях противоречивы (Костогрыз, Доросинекий, 1971; Новикова, Розанова, 1974).

Метод Фельгена с применением риванола-БОа для цнто-флюориметрни ДНК (Хачатуров, Смирнова, 1966) позволяет,

а отличие от биохимических методов определения ее во фракциях клеток, вести учет в конкретных клеткзх бактерий. Ну-клеотиды клеток, окрашенные риванолом-БОг, имеют в клеткзх ризобий яркую желто-зеленую люминесценцию. Даже визуально наблюдается разница не только в морфологии, но к интенсивности свечения ДИК на клетку (или бактероид). Цнтофлюоримстрические измерения подтвердили эту разницу (табл. 1).

Таблица 1

Содержание ДНК (в условных единицах) в клетках клубеньковых бактерий .

Объекты Х±о

№. )ир!п( <■

шт. 359а, чисше культуры . . 0.66 ±0,07 10

» бактероиды..... 1,90 ±0,19 10

шг. 400, чисше культуры . . . 0.80 ±0.00 7.5

» бактероиды..... 057±0.06 7

НЬ. 1ейиШ1П01аг0Ш 12.5

шт. 215а, чистые культуры . . 0.08 ±0,01

* бактероиды..... 0.15 í 0,02 13

ит. 2246, чистые культуры . . 0,1 С ±0,02 12,5

> бактероиды..... 0.23 ±0,03 13

шт. 96, чистые культуры . . . 0,14±0.01 10

» бактероиды..... 0.50 ±0,07 14

КЬ. тсШоИ шт. 87

чистые культуры...... 0,13 ±0.02 15

бактероиды..... 0.15±0,02 13

Примечание. X — среднее содержание вещества на клетку (в условных единицах); с —стандарт распределения; V —коэффициент

вариаций {%), равный—. 100%. Каждая величина представляет сред-

нее для 405—1090 клеток. ,

Для штаммов клубеньковых бактерий люпина, четко различающихся по степени эффективности, уровень ДНК в бактероидах значительно выше 'в случае эффективного симбиоза; в случае неэффективного он увеличивается незначительно. В чистой культуре количество ДНК на клетку у клубеньковых бактерий люпина и гороха выше у клеток неэффективных штаммов. Для перекрестнозаражающих видов, в частности, Rh. leguminosarum шт. 9G и Rh. meliloti шт. 87 степень активности штамма не коррелировала с содержанием ДНК в клетках в условиях in vitro. Уровень ДНК на бактероид при эффективном симбиозе значительно превосходил таковой при неэффективном. Установлено также, что количество ДНК в клетках . медленнорастущих штаммов выше, чем у быстрорастущих,

. Гликоген. Биохимически (Черменская с соавт., 1974) установлена обратная зависимость между содержанием гликогена в клетках клубеньковых бактерий и эффективностью штаммов последних. Цитологически гликоген не всегда выявлялся в клетках ризобий и его наличие считалось признаком неэффективности (Вег^сгзсп, 1955;' Оо1еЫо\ь*5ка, 51рпе\У5ка, 1902; Петросян, Л в па кумова, 1966; Лввакумоза с соавт., 1973, 01x011, 1967), Однако методы, используемые для цитологического выявления гликогена и клетках клубеньковых бактерий, несовершенны: метод МакМануса обнаруживает только одну, легкодоступную фракцию углевода, поскольку не происходит полного окисления последнего; щелочной кармин Бсста не отвечает строгим цитохимическим требованиям; раствор Люго-ля способен выявить полисахарид, если концентрация его в клетке не менее 0,3—0,5%.

При сравнении цитохимических методов выявления.гликогена, основанных на Шнфф (или РЛ5-)-реэкшш, в клетках клубеньковых бактерий — МакМануса '(МсМапиэ, 1910). Л, Л, Шабадаша (1917) и описанных М. В. Кудрявцевой с соавт. (1970) •—светлопольного и люминесцентного вариантов оказалось, что наиболее чувствительным является люминесцентный вариант последнего с аурамииом ОО-БОг (Лу-502).

В люминесцентном микроскопе в сине-фиолетовых лучах клетки клубеньковых бактерий собственной флюоресценции практически не имели. При окраске АУ-ЭОг гликоген в плетках клубеньковых бактерий выявляется включениями изумрудно-зеленого цвета, иногда заполняющими всю клетку, особенно в старых культурах. При установлении времени, оптимального для пернодатиого окисления клеток-ризобий, использовались 3 срока — 20, 40 и 90 мин, предложенные для окисления гистологических препаратов (Шабадаш, 1917; Кудрявцева с соавт., 1975). Кривая нарастания количества гликогена в наших опытах не вышла на плато и не достигла стационарной <фазы, возрастая по мерс удлинения срока окисления. Интенсивность свечения клеток (в условных единицах, на клетку) у Я. 1ирии 359а (5-суточная культура на минеральной среде), обработанных АУ-502 в зависимости от продолжительности периодатпого окисления при сроке 20 мни была равна 0,11, при 40—0,15, при 90—0,16. При количественном определении но мере удлинения срока окисления наблюдалось повышение интенсивности флюоресценции, при визуальном — картииа практически не менялась. Не исключено, что срок пернодатиого окисления для -препаратов клубеньковых бактерий (90 мин) следует удлинить по аналогии с гистологическими объектами, для которых оптимум установлен в пределах 10 ч. На основании контрольных обработок клеток «-амилазой и

горячей смесью хлороформа с метанолом PAS-положительное вещество следует квалифицировать как гликоген. В клетках, ойраСотанных раствором ц-амнлазы, PAS-положи тельное вещество отсутствовало или оставались слаборазличимые единичные полярно расположенные гранулы. Обработка препаратов горячей смесью хлороформа и метанола не меняла картины'расположения гранул. Методом РЛ5-реакции с АУ-SOa установлено наличие гликогена у всех штаммов клубеньковых бактерий, независимо от эффективности, как и клетках, выросших in vitro, так и в бактероидах из клубеньков растений, анализируемых в момент наивысшей азотфиксации. При визуальном сравнении уровня накопления гликогена неодинако-'13ьгмн по эффективности штаммами чистых культур н бактероидами, выделеннымн при бобово-ризобиальном симбиозе, выявляются различия: он выше у неэффективных штаммов. Фотометрические измерения подтвердили эти различия (табл. 2). Уровень PAS-положительного вещества в клетках

Таблица 2

Содержание PAS-положительного вещества в клетках *** клубеньковых бактерий

Объекты Х±о V

№. 1ор1я1

шт. 359а, чистые культурц . . 0,22 ±0.01 4

» бактероиды..... 0,20 ±0,01 " 5

шт. 400, чистые культурц . , 0.27 ±0,01 4

» бактероиды..... 0,40 ±0,02 5

№. 1ерил1]п1$агит 0,20 ±0,01

Шт. 245а, чистые культуры , . 5

» бактероиды..... 0.23 ±0,02 8

ит. 2246, чистые культуры . . 0.33*0,02 6

» бактероиды..... 0,67*0,05 7

Примечание. Каждая величала представляет среднее для 140—260 клеток.

активных штаммоз в чистой культуре и бактероидах нз клубеньков был примерно одинаковым у Щ1. 1ирт1 и НИ. 1е£шп1-поБагит.'Некоторое превышение количества гликогена у клеток неэффективных штаммов по сравнению с эффективными в чистой культуре и значительное (в 2,5—3 раза) при сравнении соответствующих пар в условиях симбиоза даст основание считать, что цнтофлюориметрическое определение гликогена, особенно в условиях симбиозируюших культур, может служить надежным объективным показателем эффективности штамма,

П. Волютин в клетках клубеньковых бактерий

При окраске клеток по методу Мейера (Пешков, 1955) волютин выявлялся во всех исследованных видах и штаммах клубеньковых бактерий в виде многочисленных мельчайших капелек правильной формы, располагаясь 'пристснио. В бактероидах волютин имел форму грубых пятен неправильной формы,-иногда «замазывающих» клетку; наибольшие его скопления находились в местах разветвления бактероидов. Количество 'волютина выше в бактерондиых формах. Различий в содержании волютина в зависимости от степени эффективности штаммов не установлено.

III. Лнпиды клубеньковых бактерий

Суданофильные -методы (окраска шарлахом .R но Гольд-маку, коллоидным раствором судана черного В по Ромейсу, Суданом черным В, растворенным в лроннленгликоле) неэффективны при характеристике липидов у клубеньковых бактерий из-за небольших размеров последних (0,5—0,9Xlt2— 3,0 мкм) и практически не выявляют ¡каких-либо зависимостей содержания липидов от тех или иных особенностей 'клеток или факторов иоздействня. В езязи с этим при определении ли-пидного состава клубеньковых бактерий в последние годы применялись преимущественно аналитические методы оценки содержания липидов и их фракций (Романов с соавт., 1974, 1975; Фаизопа с соавт., 1971; Петренко, 1974). Вместе с тем использование флюорохромов-индикаторов определенных групп липидов, а также не применявшейся 'ранее для клубеньковых бактерий люминесцентной микроскопии, обеспечивающей контрастное окрашивание з еще ста в живых клетках, может дать достаточно полное представление о формах липидов, их локализации и уровне в клетках ризобий. В литературе имеются данные о связи содержания: лоли-р-окси-бутирата в клетках клубеньковых бактерий люпина и гороха со степенью их эффективности (Романов с соавт., 1974, 1975, 1976; Романов, 1977) и соотношении насыщенных и ненасыщенных жирных кислот у Rh. meliloti разной степени активности (Петренко, 1974).

При использовании люминесцентных методов окраски наиболее полно выявляются липиды с помощью коллоидного растзора 3,4-бе1гз(а)лирена (все группы липидов, находящихся в клетке в свободном и связанном состоянии). При окраске бенз(а)тшреном на фоне диффузного свечения цитоплазмы ярким серебристым светом выделяются четко очерченные гранулы, располагающиеся обычно по -всей клетке. В клетках чистых культур ризобий не выявляются различия не только в зависимости ог степени эффективности штаммов, но даже и

видовых особенностей культур. В -ел у час окрашивания, бенз(а)пиреном бактероидов из клубеньков подобных 'различий также нракт1гчеекн пет, но на -фоне цитоплазмы значительно более четко, чем в случае чистых культур, просматриваются крупные глыбкн лнпидов серебристого цвета.

3,4-бенз(а)пирен, добавленный в среду, может аккумулироваться клетками бактерий и локализоваться в лилндных грапулзх и лнпопротеидных мембранах (мезосомах и инто-плазматической мембране), Если клетки рнзобий и бактероиды инкубировали в течение 14ч,при2В1,С на качалке, заменяя маннит в среде (Van Efjeraat, 1972) бенз(а)пиреном, места локализации мезосом, выявляемые бенз(а) пиреном, соответствовали таковым при обработке тетрациклином и выглядели точечными светящимися гранулами, быстро гаснущими. Различий в строении, величине и яркости свечения мезосом в зависимости от биологических особенностей культур обнаружить тзкже не удалось.

Фосфин 3R дает серебристо-белую флуоресценцию (УФ-лучи) всех липндав, кроме жирных кислот, масел и стеринов. Нильский синий окрашивает нейтральные лнпнды (жиры, воска, масла), свободные жирные кислоты и фосфолипиды. Включения лнпидов при окрашивании нильским синим распо-, лагалнсь всегда ;по всей клетке равномерно, следуя как бы одно за другим — короткими или длинными цепочками; особенно своеобразно располагались гранулы в разветвленных бактероидах кормовых бобов. Для окрашивания клеток клубеньковых бактерий требуется довольно длительное воздействие красителя (60 мин при 37'С или 10 мин при 60"С). Флюоро-хромнрованне -в течение 30 мни при 37°С пригодно только для лиофнльно высушенных клеток клубеньковых бактерий и практически не обеспечивает четкой люминесценшш липид-пых гранул у живых клеток ризобий. У бактероидов из клу-бенькоз сои, ннокулированных неэффективным штаммом, свечение было значительно интенсивнее, а гранулы более крупными и четче выявляемыми, ч&ч в случае бактеризации эффективным штаммом. Однако, если эта. закономерность четко прослеживалась для сим биотической культуры сои, то у других культур она не проявлялась. Экстрагирование смесью спирта с эфиром нарушало расположение лнпидов, приводя "к частичному или лолному заполнению клеток грубыми глыб-ками.

Наши наблюдения позволяют предположить, что при всех "примененных методах окраски вместе с лилидами в преобладающем количестве выявляется полн-р-окенбутират. Об этом, В частности, свидетельствует сферическая форма выявляемых разными способами гранул, напоминающих гранулы поли-р-

оксимасляной кислоты, описанные Люндгреном с соавт. (1лшс1£геп а1., 1964).

Положительный эффект окрашивания, получаемого при тер моста тир о ванин, объясняется, очезндно, липофанерозом— разрывом части липидных гранул в клетке. Нарушение мембран липидных гранул приводит к потере сцепления между ними и в итоге — к потере ими формы и частичному высвобождению связанных форм липидов (фосфолишдов, жирных кислот и т. п.), что сопровождается единичным или полным заполнением клетки глыбками неправильной формы. Доказательством того, что липидный материал клеток р и зобик со-4 стоит в основном из поли-р-оксимальной кислоты, является экстракция липидов живых нефиксированных клеток смесью спирта с эфиром '(I :3). Липиды полностью ие исчезают из клеток, хотя свечение становится менее ярким и быстрогас-нущим, меняется и топография липидных капель. Вероятно, та незначительная часть видимых липидов, которые имеются в клетках ризобий, экстрагируется из них, а цитоплазма-тнческие гранулы поли-р-оксимасляной к полоты, не растворяющиеся в эфире и спирте, окруженные двойными мембранами и тесно связанные с цитоплазмой, разрушаются, так как спирт расщепляет соединения липидов с белками, и полимер, растекаясь, «замазывает> всю клетку. Несомненно, изменяется и физико-химическое состояние пол и - р-оке и б ути р эта, отчего свечение становится сероватым (фосфин 31? и 3,4-бенз(а)-пирен) или желтовато-зеленым (нильский синий) и быстро-гаснущим.

Метод с использованием Шифф-надуксусной кислоты для выявления липидов, содержащих ненасыщенные связи (Пирс,. 1962; Кисели, 1962), предполагает образование окрашенного соединения альдегидных групп, полученных при-окислении двойных связей ненасыщенных липидов при обработке препаратов надуксусной кислотой, с реактивом Шиффа, Надуксус-ная кислота, будучи слабым окислителем, не реагирует с углеводами. Шифф-—положительное вещество, полученное окраской препаратов реактивом Шиффа, после окисления 40%-ным раствором надуксусной кислоты, имело неяркое, но четкое свечение зеленовато-желтоватого цвета почти во всей клетке как в чистых культурах, так и бактероидах из клубеньков люпина. Окраска принадлежит липидам с непредельными связями, В препаратах, предварительно бронированных, свечение отсутствовало. При сравнении интенсивности флюоресценции окрашенных препаратов ризобий на цитофлюори-метре было установлено, что чистые культуры шт. 400 содержат липидов с непредельными связями в 6 раз больше (2,5), нем чистые культуры шт. 359а (0,4). Уровень липидов в бактероидах шт. 359а возрастает в 10 раз (4,1), тогда как в бак-

тероидах шт. 400 он снижается (2,2) по сравнению с чистыми культурами (2,5). Л. Д. Петренко (1974), биохимически показала, что уэффективиого по фиксации азота штамма ЯЬ. теШоН преобладают ненасыщенные жирные кислоты.

Анализируя избирательную растворимость красителей в лнпидах клубеньковых бактерий, следует подчеркнуть, что полиэфир 'поли-р-оксимасляная кислота, занимающий но физическим свойствам промежуточное положение между липн-дами и углеводами (Романов, 1977), обладает четко выраженной суданофилией— свойством, типичным для всех свободных лнпндов. Аналогично судакам ведут себя люминесцентные красители (нильский синий, фосфнн ЗН, 3,4-бенз(а)-пирен), которые пенетрнруют из растворов не только п липиды, но и в гранулы пол и-р-окси масля ной кислоты. «Окрашивание» полиэфира осуществляется благодаря липо-фанерозу, нарушающему стабильность езязей в гранулах этого полимера.-

Выводы'

1. Впервые при оценке эффективности штаммов клубеньковых бактерий использованы цитофлюори метрически с методы, дающие возможность измерять уровень исследуемых биополимеров (нуклеиновых кислот, полисахаридов, лнпндов) в конкретных клетках ризобий.

' 2. Методом РАБ-реакции с аурамнном 00-$02 (Кудрявцева с соавт., 1970), не применявшимся ранее для бактерий, выявлены количественные различия в содержании гликогена в клетках клубеньковых бактерий разной степени эффективности, что может быть использовано при предварительном отборе эффективных штаммов ризобий.

3. Люминесцентным вариантом реакции Фёльгеиа с рива-нолом-50а (Хачатуров, Смирнова, 1906), впервые примененным для клубеньковых бактерий, установлено, что количество ДНК на клетку (в условных единицах) ¡выше у неэффективных штаммов, исключение составляют штаммы с изменчивой эффективностью (перекрестнозаражаюшне); количество ДНК у медленнорастущих штаммов больше,. чем у быстрорастущих.

'4. Использование метода Риглера (Ш^кт, 1960), основанного на комплексовании акридинового оранжевого с нуклеиновыми кислотами н кислыми мукополнеахарндами, позволяет определять содержание РНК в клетках клубеньковых бактерий.

5. С помощью флюорохромоз нильского синего, фосфина 31?, 3;4-бенз(а)-пирена выявлены топография и качественный состав лнпндов, в том числе полиэфира полн-р-оксимаеляной

кислоты.- Установленный факт «окрашивания» поли-^-оксн-масляной кислоты совместно с фракцией свободных липидов при флюорохромировании клеток клубеньковых бактерий рас-матривается как следствие липофанероза гранул полимера.

6. Обсуждается перспективность использования метода Шнфф-надуксусная кислота (Кисели, 1962) для оценки степени эффектн-вности клубеньковых бактерий, поскольку уровень лн-пидов с непредельными связями коррелирует с эффективным симбиозом.

7. Визуально корреляции между наличием РНК, кислыми муконолнеахаридамп, волютином, липндами (в том числе по-ли-р-окснмасляной кислотой) и эффективностью штаммов цитохимическими методами установить не удалось.

8. Бактероиды клубеньковых бактерий в условиях симбиоза характеризуются повышенным содержанием ДНК, РНК, кислых мукополисахаридов, волютина, липидов по сравнению с палочковидными клетками, выросшими in vitro.

Список статей, опубликованных по теме диссертации

1. Шнльникова В. К., Снгута В. Л., Чекаснна Е. В., Голод Б. П., Емцсв В. Т. «Метод выявления живых и мертвыч клеток клубеньковых бактерий клевера и сои^. Тезисы доклада на V Всесоюзном Баховском коллоквиуме по азотфикса-цин, Киев, 1976.

2. Шнльникова £. К., Сигута В. А. «Цитохимические методы определения гликогена в клетках клубеньковых бактерий люпина и гороха». Изв. АН СССР, сер, биол,, 1978, № Ь 52—57.

3. Шнльникова В. К., Сигута В. А. «Количественная цитохимия гликогена в клетках клубеньковых бактерий гороха и люпина». Изв. АН СССР, сер. биол., 1978, Л*з 3, 376—381.

4. Снгута В, А., Шнльникова В. К. «Избирательная растворимость красителей в лнпидах клубеньковых бактерий». Изв. ТСХА, 197S.1UJH. 5, 11 — 19.

5. Сигута В. А. Шнльникова В. К. «Регуляция бобовым растсннсм-хозяипом уровня углеводного резерва клеток ми к-росимбнонтов». В сб.: «Микробиологические процессы в почвах и урожайность сельскохозяйственных культур». Вильнюс, 1978, с. 321.

6. Федулова Н. Г., Сигута В. А., Романов В. И., Шнльникова В. К. «Содержание поли-р-окенбутирата в клубеньковых бактериях люпина в связи с их выживаемостью». В сб.: «Микробиологические процессы в почвах и урожайность сельскохозяйственных культур». Вильнюс, 1978, с. 358.

Л 67578 16/Ш—79 г.

Объем I п. л.

Заказ 452. , Тираж Юб

Типография Московской с.-х. академии ни. К. Л. Тимирязева 127550, Москва И-550, Тимирязеаская ул„ 44