Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация и локализация негистоновых белков, связывающихся с "Alu-повторами" нетранскрибируемых спейсеров рРНК генов D. melanogaster

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Идентификация и локализация негистоновых белков, связывающихся с "Alu-повторами" нетранскрибируемых спейсеров рРНК генов D. melanogaster"

российская академия наук институт молекулярной биологии им. в-а-энгельгардта

На правах рукописи партолина марина павловна

УДК 576.315.42

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ЛОКАЛИЗАЦИЯ НЕГИСТОНОВЫХ БЕЛКОВ, СВЯЗЫВАЮЩИХСЯ С "А1и—ПОВТОРАМИ" НЕТРАНСКРИБИРУЕМЫХ СПЕЙСЕРОВ рРНК ГЕНОВ £>. те1апо8ав1ег

03.00.03 —молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва—1994

Работа выполнена в лаборатории молекулярной организации хромосом Института Молекулярной Биологии им. В.А.Энгельгардта РАН Научные руководители:

Академик РАН А.Д.Мирзабеков

Д.б.н. В.Л.Карпов

К.х.н. С.Б.Беликов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук кандидат биологических наук

П.М.Чумаков М.А.Эльдаров

Ведущая организация: Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН

Защита состоится

■ СС1С

1994 г в /О*

ее

на заседании специализированного совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии имени В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 117984, Москва,. В-334, ул. .Вавилова, д.32. . ..

С диссертацией можно ознакомиться . в библиотеке Института молекулярной биологии имени В.А.Энгельгардта РАН.

Автореферат разослан ^ ^ы^л^-Л^

1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

А.М.Крицын

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность пэблемы.

• Главный компонент всех эукариотических. ядер - хроматин представляет собой нуклеопротеидный кемплехс, оснозной субьединицей которого является нуклеосома. Белки хроматина весьма разнообразны по составу, большая часть из них представлена гкетопами. Гистоиы составляют структурную основу (состоящую из гистонов кора и Н1) для упаковки JHK (имеют'-н у некоторых организмов размер до нескольких метров) в ядре. Хроматин представляет собой динамическую структуру, поскольку каждая клетка, обладая генетической информацией о строении всего организма, должна активировать только определенный набор генов, соответствующий ее функциям. И, дополнительно к роли компактизации ДНК, хроматин участвует акже в модулировании геино* активности. Изучение регуляции генов - одно из . ведущих направлений молекулярной биологии. В настояяее время в составе большинства генов обнаружены так называемые цис-сктквируюшяе последовательчости. К числу таких последовательностей относятся промоторньге, глхгнеерные и другие регул.чторные элеиенты, наличие которых приводит к усилению ^или репрессированию транскрипции соотзетствующего гена в зависимости от типа клетки, стадии ее развития. Давно стало очевидным, что эти последовательности оказывают свое влияние на работу генов опосредованно, чаще всего путем взаимодействия со специфическими белгами. Исследованиями последних лет установлена прямая зависимость кехду изменениями в структуре хроматина, модификациями гистоновых белков и ДНК, и активностью эукариотических ге:ш,в. Особзе мегго в этих,

исследованиях отведено выяснению роли нуклеосок в регуляции транскрипции н ее взаимоотношениям с элементами транскрипционного комплекса (РНК полимеразой, факторами транскрипции н т.д.). Данные об участии нуклеосом в процессе транскрипции весьма противоречивы, вопрос о точной молекулярном описании генной регуляции остается открытым. Возможность реконструировать сложные внутриклеточные процессы зависит,, главным образом, от развития методов. дающих возможность исследоват> взаимодействия между ДНК и белками iл vivo. Несмотря на значительней прогресс, достигнутый в этой области, набор методов, для исследования таких взаимодействий in vivo ограничен. В связи с этим представляет интерес разработка прямых подходов, позволяющих изучать структуру хроматина на уровне конкретной нуклеотидной последовательности. Нами был применен метод, позволяющий фиксировать ДНК-белковые взаимодействия в живых клетках с помощью УФ-облучения. Сочетание этого метода с так называемым методой- гибридизации с "белковыми . тенями" позволяет исследовать эти взаимодействия на уровне конкретной нуклеотидной последовательности.

Цель работы: Целью настоящей работы было изучение хроматиновой ^структуры "Alu-повторов", расположенных в нетранскрибируемои спейсере генов рРНК D.melanogaster активно транскрибируемых РНК-полимеразой I in vivo. Используемый в работе метод гибридизации с "белковыми тенями", основанный на индуцируемой УФ-облучением ДНК-белковой сшивке , и двумерном электрофорезе в полиакриламидном геле, позволяет идентифицировать белки, связывающиеся с исследуемш районом хроматина. Картирование с помощью экзонухлеаэы III (Exo III) и футпринтинга ДНКазой I дает возможность определить участки связывания белков с ДНК на

"А1ъ-повторг". Предполагалось, что полученные данные о расположении на "Alu-иокторе" нуклзссо>«к, К1 ч нзгистоковых белков помогут объяснить присутствие ча Alu-повторе нуклеоссмгах частиц с необычной длиной нуклеосомного позтора (240 и.о.), которые обнаруживаются в результате гидролиза микрококкозой нуслсягой (МН) не только у V.meianogzster, но и у D.virilis и B.hidci.

Научная ног.узна и практическая ценность работы. Е нашей работе был применен метог пришлгки бе^ког к ЛИХ при помояи ультрафиолетового излучения, дающий вознсгность фиксировать ДНК-белковые взаимодействия непосредственно з нибых клетка* ( in vivo). Этот метод, в соединении с методом известно г.од названием гибридизации с "белковыми тенями" а методом футпркнтияга ДНКазой 1 и картированием с помощь» Exo III, позволяет опредалкть положение белка на конкретном участке -ДНК. Была исследована структура хроматина "Alu-повтора" нетранскрибируемого спексера рибосомного гена D'.melanogaster, - который содержит -последовательности, гомологичные промотору рнбосомных генов.

Используя уже упоминавшиеся вьше методы, а также методы ретардации в геле, в области "AJu-повторов* рибосомкьгх генов D.melanogasier было обнаружено два белка с молекулярными массами 50кД (рАСБ50) и 70кД (рАСБ70) (Alu - связывчзлше белки). Определено положение нуклеоссмы, контактов гистона HI и негистоновых белков рАСБ50/70 внутри данного участка ДНК. Обнаружено, что яуклеосомный кор расположен специфически относительно нуклеотидной последовательности "А)п-повтора" и занимает положение от 70-75 до 210-215 п.о. от 5'-конца "Alu-повтора".. Гистон HI, рАСБ50/70 также -.заимодействует с определенными участками "AIu-погтора". На основе полученных данных

нами била предложена модель хроматина "Alu-повтора", согласно которой взаимное расположение нуклеосомного кора, гистона HI и белков рАСБ 50/70 создает пространственную структуру, благоприятствующую "депонированию" молекул РНК-пол>*мергзы (по одной на "Alu-повтор"). Эта модель хорошо согласуется с данными (Grimaldi & Di Nocera, 1988), в которых была обнаружена почти линейная зависимость между количеством "Alu-повторов" в иетранскрибируемом спейсерг к уровнем транскрипции рРНК.

Апробация работа. Материалы диссертации докладывались на конференции Каролинского института (Швеция, 1992), на 10-м российско-германском симпозиума "Структура и функционирование генома" (Суздаль, 1993).

Публикации, по материалам диссертации опубликованы три печатные работы. Список публикаций приведен-в конце автореферата.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов), выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на страницах' машинописного текста, содержит

рисунков.

СОДНРХ/НИЕ РАБОТЫ

1. Характеристика использованного метода.

Схема эксперимента представлена нг рис. 1. -Лия получения ДНК-белкоьой сливки, культуру клеток D.melanogaster, линия Кс облучали УФ-светом (253 нм), после чаго выделенные ядра лнзировали, и проводили очистку ДКК и ДНК-белковых комплексов от нспрншитъкс белков центрифугированием в градиенте хлористого цезия. После диализа фракцию, содержащую ДНК и ДНК-белковые комплексы подвергали гидролизу рестриктазой Alu I. Польшу» часть свободной (непришитой) ДНХ удаляли экстракцией смесью фенола я хлороформа.

После очистки и обогащения приш::тые комплексы разделяли в системе двумерного диагонального гель-электрофореза (Shick et а 1., 1980). * В первом направлении ' разделяются фрагменты ДНК и ДНК-белковые комплексы, подвижность последних в геле зависит как от длины фрагментов • ДКК-, так и размероз пришить» белков. Затем пришитые белки гядролизукггся проназой прямо в геле и проводится электрофорез во втором направлении. Фрагменты свободной ДНК разделяются в перлом и во втором направлениях в соответствии с их размерами и образует одну диагональ. Фрагменты, к которым были приоиты белки, образуют новые диагонали, сметенные относительно диагонали свободной ДНК, пропорционально размерам белков. Угол наклона диагонали тем круче, чем больше молекулярная масса пришитого белка. Эти диагонали являются как бы "белковыми тенями", поскольку их местоположениг отражает размеры ранее привитых к ДНК белков.

УФ-ОБЛУЧЕНИЕ

ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ В ГРАДИЕНТЕ СэС!

ДНК+ДНК-белковые Белки зомплексы у

ДИАЛИЗ

V

РЕСТРИКЦИЯ

V

5'--3" (+) цепь

5' (-) цепь

ОБРАБОТКА Ехо Ш

(+)

6' (-)

1-ое

белок

V ОБРАБОТКА ФЕНОЛОМ V

V 2-0 ГЕЛЬ — ЭЛЕКТРОФОРЕЗ V

V ЭЛЕКТРОПЕРЕНОС V

V ГИБРИДИЗАЦИЯ V

2-ое

с (+) цепью

"Белковая Непришитая тень" ДНК

с (-) цепью Рис. 1. Схюа эксперамента.

Ы

• и

После разделения в двумерном электрофорезе ДНК переносили электрофэретически на нейлоновую мембрану Hybond-N и затем последовательно гибридизовали с различными меченными зондами, клонированными в векторе на основе фага М13.

Чтобы точно локализовать местоположение белков внутри рестриктного фрагмента ДНК, ооогашенные ДНК-белковые комплексы обрабатывали экзонуклеизой III (Exo III) (Рзс.З.Ь.С). Exc III отщепляла нуклеотиды с 3' конца двунитевых фрагмзятов ДНК и останавливалась около сайтов сшивки (Wu, 1984). Т.о. размеры 5'-концевых однонитегых фрагментов показывают точное расположение белок связывающих сайтов, т.е. их расстояние от 5'-ко:ща рестриктного фрагмента. После обработхи Exo 111, ДНК-белковые комплексы были разделены в двумерном денатурирующем гель-электрофорезе. Для того чтобы выяснить, с какой пз цепей ДНК взаимодейстгует белок в клетке, гибридизация проводилась последовательно с йаждсГ; и; цепей того или иного" участка ДНК.

Для того чтобы более точно охарактеризовать . местоположение ДКК-белковых контактен -• внутри- анализируемого- района, - мы использовали метод геномного футпринтинга(Church, Gilbert, 1984), основанный на гидролизе хроматина ядер ЛНКаюй I в комбинации с непрямым концевым мечением.

2. Исследованный район рибосомных геног D.meíanogaster.

В нашей р=5оте мы исследовали "Alu-повтор", расположенный в нетрансхрибнруегои спейсере рибосомных генов D.meíanogaster (Long 4 David,1979; Coen к Dover,1982). Участок "Alu-повтора" образуется при расш^пленаа рибосомной ДНК р^стриктазой Alu I, при этом образуется 5-12 (обычно 8) повторов длиной 0.24 т.п.о. В качестве гибридизационних проб мы использовали клонированные в фаге М13 ( + ) и (-) цепи ДИ "Alu-повтора" (239 п.о.) и участки: Alu 24 (24 нуклеотида) и Alo I/Dde I (47 нуклеотидов) (рис.2Б).

Рис.2.А. Карта рибосомного повтора D.ne/anogaster. Черными прямоугольниками указаны районы, соотзетствуюпше рибосомным 18S-H 28S РНК. Начало и направление транскрипции указано стрелкой. Alu сайты в "Alu-шшторах" указаны как А.

F 3 1 Fla

«1 и I -4 «—

O d e I «lui

D d e I

РИС.2.Б. Внутренняя организация Alu-повтора. Показаны дм соседних повтора. Alu 1 и Dde 1-сайты рестрикции. ( + 1 )-участок, гомологичный сайту инициации транскрипции. Серый прямоугольник-(72 н.о. длиной) фрагмент, способный активировать транскрипцию рРНС (Grmaldi et al.,1990). Заштрихованный прямоугольник-участок гомологичный промотору РНК-полимеразы I (Соеп к Dover,1982). Двокяне линии, участки, соответствующие гкбридизационным пробам (24 и 47 и.о.).

для изучения структуры хроматина.. Эти гены кодируют молегульг рРНЮ, необходимые клетке в больших количествах, что обеспечивается высокой копийностью генов (Long 4 Dawid, 1979). Скэло 250 копий рибоссмных РНК генов D.nelanogaster организованы в тандемные повторы, в которых транскрипционные единицы отделены друг от друга нетранскрибируемыми спейсерами (Long 4 David, 3979). Более половины повторов имеют вставку в районе 28S РНЕ ховирукхцего участка. Биохимические и электронномикроскопические исследования показали, что у D.melanogssteг гены, имеющие вставку, практически не транскрибируются (Long 4 Dawid,1980).

Каждый нетранскрибируемый спейсер содержит промоторную последовательность (300 п.о.) и 5-12 тандемно пов*оряюшихся

3. Структура хроматина Alu-повтора. Гены р'РНК D.те 1 anegaster представляют "собой удобную систему"

последовательностей (239 п. о.), фланкированных двойными Alu I сайтами, располагающимися на расстоянии четырех п. о. друг от друга, называемых для удобства "Alu-повторами* (Long, Dawid, 1979; Coen and Dover, 1982; Kohorn and Rae, 1982) (Рис. 2A). Они содержат последовательности, имеющие высокую степень гомологии с областью начала транскрипции рибосомных генов (Bach et al., 19S1). 52 п.о. "Alu - повтора" соответствуют району, расположенному от -24 до +28 по отношению к точке начала транскрипции рибосоыного РНК предшественника (Coen and Dover, 1982; Kohorn and Rae, 1982) (Рис. 2Б) и, со-видимому, играют существенную роль в транскрипции генов рРНК (Baker and Platt, 1986; Grimaldi and Di Nocera; 1986, Hayward and Glover, 1988). Обнаружена почти линейная зависимость между количество» "Alu - повторов" и уровнем транскрипции рРНК (Grimaldi, Di Nocera, 1988). Интересно, что в таких видах, как D.virilis и D.bydei, сильно отличающихся по нуклеотидной последовательности, этот повтор- -имеет - идентичную -длину и составляет 240 п.о. (Coen, Dover, 1982). Совпадение длины повтора ДНК (240 п,о.) и длины нуклеосомного повтора данной области (240 п.о.), обнаруженного с помощью гидролиза микрококковой нуклеазой (Udvardi et al.,1984; Dzherbas-hyajan, 1988), может служить свидетельством s пользу фазированного расположения нуклеосом на данной последовательности. Такое фазированное расположение нуклеосом на тавдемно повторяющейся ДНК, может поддерживаться фазирующим белкоы (белками), которые либо сами определяют необычную картину расщепления микрококковой нуклеазой, либо задают фазу в посадке нуклеосом (Джербашьян с соавт.,1988). Для того чтобы идентифицировать положение белков на нуклеотидной последовательиости "Alu-повтора", 'мы ■ использовали метод

гибридизации с "белковыми тенями" (protein ¡stage hybridization) (Karpov et al., 1986; Nacheva et al., 1989) и ДНК-белтовой сшивки с помощью УФ-облучекия.

Результаты эксперимента показаны на рис. 3. На р«с. 3 можно видеть пятна, которые соответствуют приоивке гистона HI v. двух негистоновых белков. Крайнее левое пятно "X" на рис. ЗА, вероятно соответствует связанной с ДНК субьединице эукаркотяческой РНК полимеразы I, которая не входит в гель, как mli полагаем, из-за ее большого размера. Гистоны кора в значительных количествах при облучении ультрафиолетовым светом не пришиваются. В результате калибровочных экспериментов было найдено, что молекулярные массы двух белков, взаимодействующих с рибосомальными "А1в-повторами" составляют примерно 50 кД и 70 кД. Они были назвали рАСБ-50 и рАСБ-70 (Alu - связывающий белок (ribosomal "Alu-repeatbinding protein). Можно предположить, что рАСБ50 идентичен белку D1 (50кД"), * про который известно,' что он" связывается с АТ-богатыми" последовательностями ДНК (Alfageme et al.,1980; Levinger & Varshavsky,1982). По всей видимости именно эти "белка" задают фазу посадки нуклеосом на ДНК "Alu-повтора" и определил- необычную картГшу гидролиза хроматина микрококковой яуклеазоа- Необходимо отметить, что аналогичная структура была, описана для генов 5S РНК D.melanogaster. Не исключено,- что и в случае,тфоыггткна 5S генов негистоновые белки, участвующие в регуляции транскрипции гена, задают строго определенную фазу посадки гистонового октамера на ДНК.

Чтобы локализовать пришитые белки на ДНК, гплролизованные рестриктазой Alu I ДНК-белковые комплексы быля обработаны . экзонуклеазой II! (Exo III) и затем разделены в. двумерном

;

А. г

1 i

I да i s -23»

\х \А8Р7СКгДВР 5СК Н1 \

\ \ \ . \

ко 135 90 67

37

4V

Рис.3.Картирований местоположения белков на "Alu-повторе" рибосомных геаов. ¿.Двумерный электрофорез сшитых ДНК-белковых комплексов посда расщепления ДНК рестриктазой Alu I. Гибридизация с пробой Alu. Символы Н1, р50 и р70 обозначают "белковые тени" гистона Н1, рЗО и р70. Цифры внизу рисунка-маркеры молекулярных масс белков (кД). Ы-маркерная ДНХ Б,В.Распределение белков "Alu-повтора" D.melnnogaster после гидролиза Exo III. Цифры на фотографии указывают расстояние в нуклеотидах от 5'-концевых сшивающихся фра™®11™- Цифры 1-4 указывают: диагональ непришитой ДНК (1), ДНК сяятая с гистоном Н1 (2), с рАСБ50 (3) и с рАСБ70 (4)

диагональном гель-электрофорезе. Дискретные размеры получающихся фрагментов ДНК и отсутствие какой-либо периодичности, указывает на уникальное расположение контактов рАСБ-50, рАСБ-70 и гистона HI на ДНК *А1и-повтора*, что схематически показано на рис.б. Интенсивность пятен (после гибридизации) соответствует эффективности со<вки данного белка с исследуемой последовательностью ДНК.

Мы предполагали, что у гистона HI, места контактов будут расположены на концевых участках нуклеосомной ДНК. Однако некоторые контакты HI находятся внутри нуклеосомной ДНК, в средней части на сайтах (+)140 и (-)120 комплиментарных цепей (рис. б). Связывание HI с внутренними районами нуклеосомной ДНК, наблюдали используя метод химической пришивки (Shick et al., 1980), а с центром нуклеосомной ДНК, используя метод защиты от гидролиза нуклеазами (Crane-Robinson et al., 1984).

Негистоновые белки рАСБ-50'/70 расположены вне нуклеосомы", хотя внутри нуклеосомы наблюдается слабый участок связывания. Необходимо также упомянуть, что негистоновые белки HMG-14/17 занимают подобные участки ДНК внутри коровой частицы или хроматосомы (Shick et al.,1985). Сайты связывания для рАСБ-50/70'и гистона HI частично перекрываются. Наиболее вероятный вывод состоит в том, что HI и рАСБ-50/70 конкурируют друг с другом за связывание с ДНК. Известно что, в случае 5S РНК гена, гистон HI препятствует связыванию регуляторного фактора TFIIIA с последовательностью регуляторной ДНК, локализованной внутри нуклеосомы, вероятно, благодаря компактной, плотной структуре нуклеосомы (Rhodes, 1985). Однако, данные полученные методом сшивки, не исключают возможности одновременного взаимодействия '

Sun

DNA— protein complex

Stan

DNA— protein complex

Free fragment

С J С I

Рис.4. Идентификация белков, специфически связывающихся с ДНК "Alu-повтора"" "методом ретардации в- геле. Авторадиограмыа электрофореза ДНК-белковых комплексов фрагментов ДНК Alu-покторОЕ: Ф69 (б), Ф31 (д), Ф38 (_ф) и- белков ядерного экстракта. (а,с,е)-соответственно свободные олигонуклеотиды.

белков с участками ДНК." ' •

Специфическое связывание белка рАСБ с "Alu - повтором"' ДНК подтверждается экспериментом по ретардации в геле (Fr ich, Crothers, 1981) (на рис. 4 ). Результаты, полученные методом ретардации в геле указывают на то, что два фрагмента ДНК 0-31 иуклеотид (Ф31) и 201-239-й нуклеотид (038) (см. рис. 2 Б) специфически связывают только один белок ядерного экстракта. Связывающимся белком является, вероятно; рАСБ-50 или -рАСБ-70.

Поскольку в процессе пришивки рАСБ-50 и рАСБ-70 связываются с одной и той же последовательность» ДНК, можно предположить, что рАСБ-50 или продукт частичной деградации рАСБ-70, или эти два белка очень похожи.

Для определения возможного специфического расположения (positioning) нуклеосомного кора относительно последовательности ДНК "Alu-повтора" был использован метод геномного футпринтиига ДНКазой I, границы нуклеосомы определяли с помощью микрококковой нуклеазы (Church, Gilbert, 1984). Микрококковая нуклеаза (как следует из рис.5, дор.1) специфически "вырезает" нуклеосомы из хроматина и расщепляет ДНК "Alu-повтора" на участке 70-75-го нуклеотида на (+) цепи ДНК. Эти данные позволяют предположить, что нуклеосома расположенная на "Alu - повторе" ДНК, начинается от 70-75-го нуклеотида от 5'-конца "Alu - повтора".

Необходимо обратить внимание на то, что обнаруженное в результате " гидролиза микрококк'овой нуклеазой расположение нуклеосомы, было точно предсказано в лаборатории Р.De Santis на основе теоретической модели зависимости изгибов ДНК от нуклеосомной последовательности (Bofel Ii et al., 1992).

Сайт-специфическое положение нуклеосомы на "Alu - повторе" также подтверждается появлением десятинуклеотидной периодичности при гидролизе.ДНКазой I от 60-го до 220-го нуклеотида (рис. 5А, линия 4). Несколько смазанная картина переваривания на рис. 5А линия 4, объясняется близким расположением двух Alu I сайтов рестрикции, расстояние между которыми только четыре нуклеотида, и, поэтому может быть гияролизозан как один, так и другой сайт (рис. 2). Действительно, рестрикция ДНК рестриктазой Dde I, дает более отчетливую десяти-нуклеотидную периодичность гидролиза (рис. 5В)'.

Рис.5.0утпринтинг МН-з ой и ДНКазой I "Alu—повтора" D.nelünogBstGr. Справа указано расстояние в нуклеотидах от левого сайта рестрикции Alu I на (+)цепи (см.рис 1.Б). А:1.Гибридизация с пробой Alu 24, после гидролиза Alu I. Нуклеосомы гидролизовали МН-зой, ДНК моно-и динуклеосом гидролизовали рестриктазой Alu 1. Стрелками указана граница района, защищенного от гидролиза МН-зой. 2. Маркерная сиквенирующая реакция (rf-A. 3.Очищенную ДНК гидролизовали ДНКазой I, затем Alu 1; 4.Ядра обработали ДНКазой I, затем выделенная ДНК гидролизована Alu I. Б.Гибридизация с Dde I-Alu I пробой после гидролиза ДНК рестриктазой Dde 1. 1.Очищенная ДНК гидролизована ДНКазой I, а затем Dde'l. 2.Ядра обработаны ДНКазой I; затем Dde I

Два наиболее защищенных от ДНКазного гидролиза района в "AI и -повторе" хроматина, локализованы в области 43-63 и 210-220 нуклеотидов. Район 210-220п.н. Alu-повтора точно соответствует сайтам сшивки белков рАСБ-50, рАСБ-70 и гистона HI. В районе 43-63 нуклеотидов не обнаружено сливки рАСЕелков или HI. Так как в некоторых экспериментах мы наблюдали пришивку к "Alu - повтору" каких-то высокомолекулярных белков (рис.ЗА, пятно X, которое может соответствовать большим субъединицам РНК полимеразы I), мояно сделать предположение, что этот район взаимодействует с РНК попимеразой I. Данные по локализации сайтов пришивки, негистоновых белков, HI и расположению нуклеосомы на "Alu-повторе" суммированы на рис. 6.

Присутствие "Alu-повтора" активирует транскрипцию генов рРНК, последовательность этого активирующего фрагмента длиной..72 п.о., 3iнимает положение от 211 до 44 нуклеотида (Grimaldi et al., 1990). 'Эти данные' точно совпадают с сайтами ' пришивки для рАСБ-50/70, т.о. можно предположить, что рАСБ-50/70 соответствуют транскрипционному фактору, вероятно UBF. Рибосомальный связывающий фактор UBF (гibosomal Upstream Binding Factor), связывается с промотором и другими районами рибосомных РНК генов (Bell et al., 1988; Солпер-Веб и Тауэр, 1986), и имеет высокую степень гомологии с HMG1, содержит три или четыре ДНК связывающих домена и высокое содержание кислых аминокислотных остатков в С-конце (Jantzen и др., 1990). Если UBF-это рАСБ-50/70, тогда кислый С-конец может взаимодействовать с положительно заряженными гистонами, поскольку участки взаимодействия хоровых гистонов, HI и рАСБ-50/70 ДНК находятся по соседству и частично перекрываются с последовательность»,' взаимодействующей с нуклеосомным кором. ■

\

куклеосоиа

R.P.

I E • m 1- ESS ♦-» Я1

Sj a P <-» РЛСБ50/70

(+) -H ' 1 ' I 1 ' 1 1 ¡ ' 1 ' 4 ' v-^-- 1 1 ' 1 r

0 SO loo ISO 200 239

239 200 ISO 100 50 0

(-) 1 ' 1 ' 1 ' ' ' ' 1 f ' ' ' I ' ' ' ' i ' ' 1 1 !

É И ~ pACEjU/70

KS ^ HI

Рис .6. Распределение контактов рАСБ50, рАСБ70, гкстона к

нуклеосомы на "А1и-повторе", полученное в результате экспериментов с помощью облучения УФ-ом и нуклеазного футпрлнтинга. Стрелка указывает границу защищенного от гидролиза МН-зой района. ЕР-район предположительного связывания РНК-полимеразы.

Другой интересной особенностью "Alu - повтора" является тот факт, что его участок отЮ до 60-го нуклеотида имеет ту се последовательность, что и сайт начала транскрипции на рибосомном РНК гене (Coen, Dover, 1982; Kohorn, Rae, 1982; Siasone et al., 1982) и расположен вблизи участка связывания рАСБ-50/70. И хотя прямо не было определено, что РНК-полимераза образует сшивку-с ДНК в этом участке, такая гомология, вместе с данными по защите этого района от ДНКазного гидролиза, позволяет предположить, что этот участок занят РНК полимеразой I. Корн и Рае (1982) показали, что "Alu - повтор." может служить матрицей при транскрипции in vitro, и что инициация происходит приблизительно в том же месте, что и in vivo.

Эксперименты с использованием методов пришивки, зашиты от гидролиза нуклеазами (футпринтинг) продемонстрировали высоко организованную структуру "Alu - повтора", где нуклеосоыный кор, гистон HI, рАСБ-50/70 и, вэроятно, РНК полимераза расположены на ДНК уникальным образом. Это не было неожиданностью, т.к. хроматин "Alu - повтора", по-видимому, упаковывается в структуру высшего уровня. Удварди с соавт. (1984) предположил, что существование отличительных особенностей трехмерной структуры этого района хроматина, приводит к различиям в кинетике гидролиза кикрококковой нуклеазой между различными "Alu - повторами". Уместно вспомнить данные наблюдений электронной микроскопии, высоко компактизованной структуры транскрибируемого спейсера рДНК у Xenopus, который содержит Alu-подобные элементы, тогда как транскрибируемый хроматин рДНК, находился в растянутом состоянии (Pruitt, 4 Grainger, 1981).

Микрококковая нуклеаза,- подобно ДНКазе -I, гидролизует ДНК нуклеосомного кора, также как спейсерную ДНК с 10-нуклеотидной периодичностью. Микрскоккозая нуклеаза вырезает нуклеосомы из хроматина с длиной ДНК, дискретно увеличивающейся на 10 п.о, от 145 до 235 п.о. Исследования пришивки показали, что длина спейсерной ДНК в этих нуклеосомах кратна 10 п.о. и гистоны HI, НЗ, а в случае хроматина спермы морского ежа, гистон Н2В, связаны со спейсером. Эти данные позволяют предположить, что спейсерная ДНК подобно коровой ДНК, суперспирализозана, включает 80 п.о. на-один оборот (Bavykin et al.,1990). Эта 10 нм фибрилла далее упаковывается в компактную соленоидную структуру, одну из возможных моделей которой предложил Фельсенфельд (Feisenfeid & Мс Ghee, • 1986). Как было замечено выше, • "Alu-повторы"

л

нетранскрибируемых спенсеров на рДНК у различнах сипов Drosophila, составляют 240 п.о. в длину, несмотря на существенную дивергенцию их первоначальной куклеотидной последовательности (Соеп & Dover, 1982). Хотелось бы обратить внимание, что 240 г..о. это длина равная трет оборотам спирали ДНК вокруг нуклеосомы. Надо заметить, что ДНК "Alu - повтора" в хроматине организован в непрерывную суперспираль с 80 п.о. на оборот, формируя 10 ни фибриллу, к ь.ожст далее упаковываться в солекокдную структуру, 30 им фибриллу. Поскольку сайты прививки HI имеют периодичность з 80 п.о., вероятно, гистон HI одновременно взаимодейст«узт с ближайшими районами на двух соседних витках ДНК суперспирали, посредством этого ее стабилизируя (Bavykin et al., 1990). Сайты связывания рАСБ-50/70 к, предположительно, РНК полимзразы, всегда расположены на одной и той же внешней стороне суперскрученной поверхности ДНК и могут постоянно оставаться доступными для взаимодействия с трансфакторами в упакованной соленоидной структуре. "Alu повтор", по-вид'гмо.му, играет роль депо, аккумулирующею РНК-полимеразу перед сайтом.начала транскрипции (Udvardi et al., 1984). В этом случае, молекулы РНК-полимеразы будут находиться ::а поверхности компактной соленоидной структуры "Alu - повтора", увеличивая таким образом готовность к быстрой инициации синтеза РНК посла начала транскрипции.

выводы

1.Для изучения белкового состава и структуры хроматина "Alu-повторов" нетранскрибируемого спейсера генов рРНК D.nelanogaster был использован метод, основанный на индуцированной ультрафиолетезым .облучением.сшивке белков с ДНК непосредственно in vivo. Анализ ДНК-белковых комплексов проводили с помощью метода гибридизации с "белковыми тенями".

2.Были обнаружены два негистоновых белка - рАСБ-50 и рАСЕ-70, связывающихся с ДНК "Alu-повтора".

3.С помощь» гидролиза Exo III, было точно локализовано расположение белков рАСБ 50/70 на ДНХ "Alu-повтора". Участки сшчвки рАСБелков расположены вне нуклеосомы в концезем районе "Alu-повтора" на расстоянии 185, 215, 239 нуклеотидов от 5'-конца (+) цепи, 239, 210 нуклеотидов на (-) цепи.

4.С помощью гидролиза Exo III, была также выяснена локализация на "Alu-повторе" ги'стона НГ. HÏ связывается' с концевыми участками на расстоянии 210-225, 195 нуклеотидов от 5'-конца на (+) цепи и 160, 200-215 нуклеотидов на (-) цепи и с центральной частью "Alu-повтора" с 85, 105, 140-145 нуклеотидами (+) цепи и 115-125 иуклеотидами (-) цепи.

5.Экспериментами с использованием методов пришивки, геномного футпринтингг ДНКазой I и микрококк-озон нуклеазой было обнаружено сайт-специфическое положение нуклеосомы на "Alu-повторе". По нашим данным нуклеосома, расположенная на "Alu-повторе" начинается от 70-75 нуклеотида от 5*-конца "Alu-повтора".

б.На основе полученных результатов построена модель организации хроматина "Alu-повтора" нетранскрибируемого спейсера генов рРНК D'.aeianogaster.

Ho kiaTcpiianaM jwccepTauHii onyôjisi^oBaiiM cjieayxmme pa6oTi>i:

1. Belikov S., Beigovsky A., Partolina M., Karpov V. UY-induced DNA-protein crosslinking as a probe for chromatin structure investigation, in abstracts of 3-rd KI/CMB conference, Solba'cka, 1992, p.43.

2. Beiikov S., Beigovsky A., Farlolina H., Karpov V., Mirv;abekov Mapping and positioning DNA-binding proteins along ^enoraic DNA.

Structure of D.melanogzster ribosomal 'Alu-repcat and 1.6S3 satellite chromatin. Nucl.Acids Res.,1993, v.21 pp.4795-4802.

3. Karpov V.L., Belikov S.V., Precbrazhenskaya O.V., Beigovsky A.I., Papazenko D.A., Partolina M.P., Chkheidze A.R., Priporova I.V., Mirzabekov A.D. Mapping and positioning DNA-binding proteins along genomic DNA. In abstracts of 10-th Russian-German symposium, Suzdal," 1993. • ...