Идентификация и картирование регуляторных элементов в локусе FXYD5-COX7A1 хромосомы 19 человека

Дидыч, Дмитрий Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Идентификация и картирование регуляторных элементов в локусе FXYD5-COX7A1 хромосомы 19 человека
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Идентификация и картирование регуляторных элементов в локусе FXYD5-COX7A1 хромосомы 19 человека"

На правах рукописи

Дидыч Дмитрий Александрович

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И КАРТИРОВАНИЕ РЕГУЛЯТОРНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ В ЛОКУСЕ ГХУО5-С0Х7А1 ХРОМОСОМЫ 19 ЧЕЛОВЕКА

специальность 03.01.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2009

2 8ЯНВ?910

003490689

Работа выполнена в лаборатории структуры и функций генов человека Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Научный руководитель:

кандидат биологических наук

Акопов Сергей Борисович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор кандидат биологических наук

Карпов Вадим Львович Эльдаров Михаил Анатольевич

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт биологии гена РАН

Защита состоится

2010 года в

часов на заседании

диссертационного совета Д002.019.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан

2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор физ.-мат. наук

В.А. Олейников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

Вся совокупность генов и транскрибируемых областей генома многоклеточных организмов связана в сложнейшую регулируемую сеть, определяющую существование многочисленных типов специализированных клеток. Первостепенную роль в существовании этой регулируемой сети играют различные классы i/ыс-регуляторных элементов генома. После определения полной нуклеотидной последовательности геномов ряда организмов одной из главных задач современной геномики стало изучение функциональных некодирующих элементов генома, таких как промоторы, энхансеры, сайленсеры, инсуляторы, S/MAR-элементы и др.

Известно, что функциональная активность регуляторного элемента генома зависит не только от его нуклеотидной последовательности, но и от специфического набора связывающихся с ними белковых факторов транскрипции, модификации ДНК этого элемента, положения данной последовательности на хромосоме, структурной компартментализации ядра и др. По этим причинам, несмотря на стремительное развитие методов биоинформатики, использование компьютерных подходов для предсказания положения в геноме ¡/ыс-регуляторных элементов крайне затруднительно.

Согласно теоретическим предсказаниям в геномах эукариотических организмов содержатся сотни тысяч ^ис-регуляторных последовательностей (Pennisi, 2004). Поэтому создание подходов, позволяющих осуществить как масштабный поиск этих элементов в геноме, так и их функциональный анализ, является одним из приоритетных направлений современной функциональной геномики.

В последнее время было предложено большое число различных экспериментальных подходов для идентификации регуляторных последовательностей внутри генома. Во всех этих подходах используется один и тот же ключевой этап - получение высокообогащенных клонотек фрагментов ДНК, содержащих соответствующие регуляторные элементы. После конструирования таких клонотек нахождение их места в геноме становится чисто технической задачей и может быть осуществлено при помощи различных технологий, таких как гибридизация с геномными микрочипами, массированное секвенирование, технологии, сходные с SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) и др. Эти подходы можно разделить на две группы. В первую входят методы, которые можно назвать структурными, т.е. методы, основанные на взаимодействии ДНК с белками или субклеточными структурами, а также на структурных особенностях ДНК. В данной работе были задействованы функциональные подходы, относящиеся ко второй группе методов, обычно использующих "метод репортерного гена".

К сожалению, на сегодняшний день картирование всех функциональных областей на уровне целого генома с учетом всевозможных типов клеток многоклеточных организмов выходит за пределы наших возможностей. Поэтому, альтернативой данного рода исследованиям служит полный функциональный анализ отдельных протяженных сегментов генома с последующей интеграцией полученных данных и созданием полной геномной карты регуляторных элементов.

В нашей лаборатории проводится работа по построению полной функциональной карты регуляторных последовательностей, расположенных в полигенном сегменте длиной 1 млн. п.о. хромосомы 19 человека. Ранее в этом локусе нами были идентифицированы и нанесены на карту около сотни последовательностей, относящихся к различным классам функциональных элементов генома, что делает исследуемый нами локус одним из наиболее охарактеризованных участков генома человека.

Данная диссертационная работа состоит из трех частей. В первой части описан подход, позволяющий проводить скрининг геномных фрагментов по их способности усиливать экспрессию репортерного гена (потенциальные энхансеры) и определять их местоположение в геноме. С помощью этого метода нами были обнаружены и картированы 15 потенциальных энхансеров в локусе РХУ05-С0Х7А1 хромосомы 19 человека. Во второй части работы с помощью ранее разработанной методики (Акороу е) а1, 2006) произведено картирование в том же локусе десяти новых последовательностей, проявляющих инсуляторную активность. Третья часть посвящена анализу энхансер-блокирующей' активности десяти обнаруженных ранее в исследуемом локусе СТСР-связывающих последовательностей (УеКЫпоуа а а1, 2006). Было показано, что все десять проверенных СТСР-связывающих последовательностей проявляют энхансер-блокирующую активность в системе позитивно-негативной селекции.

Цели и задачи работы.

Целью диссертационной работы являлось выявление и картирование 1/ис-регуляторных элементов (энхансеры, инсуляторы) в локусе /•"ЛТД5-СОЛ7Л/ хромосомы 19 человека, а также выявление энхансер-блокирующей функции десяти ранее обнаруженных в исследуемом локусе СТСР-связывающих фрагментов (Уе^Ыпоуа е! а!., 2006) с помощью позитивно-негативной селекции.

В ходе работы были поставлены следующие задачи:

1. С помощью предложенного нами подхода выявить и картировать в локусе РХУй5-СОХ7А1 хромосомы 19 человека последовательности, проявляющие свойства энхансеров.

2. Провести анализ обнаруженных фрагментов методом сдвига электрофоретической подвижности в полиакриламидном геле (ЕМБА), а также определить активность обнаруженных фрагментов с помощью системы двойной люциферазной детекции.

3. Выявить с помощью ранее разработанной в лаборатории системы позитивно-негативной селекции энхансер-блокирующих элементов все, или почти все, потенциальные инсуляторы, расположенные в локусе РХУй5-СОХ7А 1 хромосомы 19 человека.

4. Проверить на наличие энхансер-блокирующей активности десять ранее выявленных СТСР-связывающих последовательностей, расположенных в локусе РХУй5-СОХ7А1 хромосомы 19 человека.

Научная новизна и практическая значимость работы.

В работе разработан оригинальный метод функционального картирования энхансер-подобных элементов в протяженных участках генома, основанный на отборе геномных фрагментов по их способности усиливать транскрипцию репортерного гена С помощью предложенного подхода впервые идентифицированы в клетках культуры НеЬа 15 потенциальных энхансеров в локусе РХ¥05-С0Х7АI хромосомы 19 человека Было показано, что идентифицированные последовательности взаимодействуют т \itro с белками ядерного экстракта НеЬа. Для 13 обнаруженных последовательностей была показана способность активировать сильный промотор 8У40 при транзиентной трансфекции клеток НеЬа с использованием системы двойной люциферазной детекции. Была построена карта распределения обнаруженных в работе потенциальных энхансеров в локусе РХУй5-СОХ7А1 хромосомы 19 человека.

С помощью ранее разработанной методики идентификации потенциальных инсуляторов (Акороу е/ а/., 2006) выявлены и картированы 10 новых последовательностей в локусе РХУй5-СОХ7А1 хромосомы 19 человека. Был проведен исчерпывающий анализ полученной в работе библиотеки потенциальных инсуляторов, позволивший обнаружить в исследуемом локусе большую часть последовательностей, проявляющих свойства инсуляторов.

В работе с помощью системы позитивно-негативной селекции был проведен анализ энхансер-блокирующей активности десяти СТСР-связывающих последовательностей, картированных ранее в локусе РХУй5-СОХ7А1 хромосомы 19 человека.

Данная диссертационная работа является частью масштабной работы, направленной на создание полной функциональной карты области хромосомы 19 человека длиной 1 млн. п.о.

Публикации и апробация работы.

По теме диссертационной работы опубликованы 3 статьи в отечественных и зарубежных научных журналах. Результаты работы были представлены на российских и международных конференциях: Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2008" (Москва, 2008); IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); 3rd ESF Functional Genomics Conference "Functional genomics and Disease" (Инсбрук, 2008); XXI Зимняя международная молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2009); Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии (Москва-Пущино, 2009).

Структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на'^Г^траницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, основных выводов и списка цитируемой литературы, включающегб^. Ссылки. Диссертация содержит'?таблиц и и . рисунков.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И КАРТИРОВАНИЕ ЭНХАНСЕР-ПОДОБНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ В ЛОКУСЕ FXYD5-COX7A1 ХРОМОСОМЫ 19 ЧЕЛОВЕКА.

Энхансеры - тип регуляторных элементов генома, способных усиливать транскрипцию с промоторов, находясь на значительных расстояниях от них. Для многих энхансеров показана их способность активировать гетерологичные промоторы. Основываясь на этих свойствах энхансеров, нами предложен метод, позволяющий идентифицировать энхансеры в протяженных участках генома по способности этих элементов активировать транскрипцию гена неомицинфосфотрансферазы И (NPTII), находящегося под контролем минимального промотора цитомегаловируса (CMV). Схема метода изображена на рис. 1-Б.Энхансеры - тип регуляторных элементов генома, способных усиливать транскрипцию с промоторов, находясь на значительных расстояниях от них. Для многих энхансеров показана их способность активировать гетерологичные промоторы. Основываясь на этих свойствах энхансеров, нами предложен метод, позволяющий идентифицировать энхансеры в протяженных участках генома по способности этих элементов активировать транскрипцию гена неомицинфосфотрансферазы II (NPTII), находящегося под контролем минимального промотора цитомегаловируса (CMV). Схема метода изображена на рис. 1-Б (стр. 5).

Фрагменты библиотеки локуса РХУВ5-СОХ7А1 хромосомы 19 человека

нsv-t^

Хко1 тР

ЫРТН

хш

5'-ЬТЛ картирование энхансеров

Рисунок 1. Схема предложенного подхода, предназначенного для отбора фрагментов генома, обладающих энхансерной активностью. А) Схема самоинактавирующегося ретровирусного вектора рС^СХК-ЕМН, предназначенного для поиска энхансеров в длинных геномных фрагментах. Б) Основные этапы селекции последовательностей, обладающих энхансерной активностью, в длинных геномных фрагментах. Фрагменты библиотеки локуса РХШ5-СОХ7А1, полученной путем расщепления 30 космид, содержащих перекрывающиеся последовательности области хромосомы 19 человека длиной 1 млн. п.о., были клонированы в вектор pQCXIX-Enh(+) по сайгу Хко\. Полученным набором векторов трансфицировали клетки пакующей линии Июетх-АМРНО для получения вирусных частиц. Вирусными частицами инфицировали клетки НеЬа и проводили селекцию в среде с генетицином. Из выживших клеток выделяли геномную ДНК с фрагментами библиотеки, обладающими энхансерной активностью. Выделенные фрагменты секве нировали и определяли их местоположение в геноме человека.

На первом этапе работы нами был получен вектор р(}СХ1Х-Еп11, предназначенный для отбора геномных фрагментов, обладающих энхансерной активностью (Рис. 1-А). Вектор был сконструирован на основе самоинактавирующегося ретровирусного вектора рС>СХ1Х (ОоШесЬ), и содержал ген составного белка СТЫ, в состав которого входила неомицинфосфотрансфераза II. Были получены контрольные векторные конструкции: положительный р(2СХ1Х-Еп!1(+), содержащий ген йШ под контролем минимального промотора и энхансера СМУ, и отрицательный р(}СХ1Х-Еп11(-), из которого был удален минимальный промотор СМУ.

Подготовка и клонирование библиотеки геномных фрагментов в ретровирусный вектор pQCXIX-Enh.

Отбор фрагментов, обладающих энхансерными свойствами, проводили из фрагментов геномной библиотеки локуса FXYD5-COX7A1 хромосомы 19 человека, любезно предоставленной И.П. Черновым. При конструировании библиотеки 30 космид, содержащих перекрывающиеся фрагменты исследуемого локуса длиной 1 млн. п.о., были обработаны ферментами рестрикции Sau3A и Csp61, позволяющими получить фрагменты длиной от 200 до 700 п.о. Два фермента было использовано для того, чтобы исключить потери функциональных элементов из-за присутствия сайта расщепления внутри функциональной области фрагмента К выступающим концам ресгриктных фрагментов посредством специфических олигонуклеотидных адаптеров был присоединен праймер LP, содержащий сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции Sail. Итоговая библиотека содержала около 4 тыс. уникальных фрагментов.

Фрагменты библиотеки клонировали по сайту Xhol в вектор pQCXIX-Enh. Было получено около 16 тыс. колоний Е. coli, из которых была выделена плазмидная ДНК и получен пул плазмид pQCXlX-Enh(L), представляющий собой набор ретровирусных векторов pQCXIX-Enh(L), содержащих фрагменты библиотеки локуса FXYD5-COX7A1 хромосомы 19 человека.

Отбор последовательностей ДНК, обладающих энхансерной активностью.

Набором плазмид pQCXIX-Enh(L), а также контрольными конструкциями, проводили трансфекцию клеток пакующей линии Phoenix-AMPHO (Kinsella and Nolan, 1996). Клетки линии Phoenix-AMPHO способны экспрессировать вирусные белки, необходимые для образования амфотропных вирусных частиц.

Были получены четыре популяции вирусных частиц: pQCXIX-Enh, pQCXIX-Enh(L), pQCXIX-Enh(+) и pQCXIX-Enh(-). Определение титра вирусных частиц проводили по экспресс-методу, предложенному в работе Byun et al. (Byun et al., 1996). Для каждой популяции татр составил не менее 5*103 часгии/мл.

Полученными вирусными частицами инфицировали клетки линии HeLa. Выбор клеточной культуры был обусловлен тем, что ранее в нашей лаборатории были картированы в исследуемом локусе S/MAR-элементы (Chernov et al., 2002),а также участки связывания белка CTCF (Vetchinova et al., 2006) с использованием этой клеточной линии. Инфицированные клетки HeLa культивировали в среде с генетицином (800 мкг/мл) в течение двух недель.

В результате инфекции происходит интеграция кДНК-копии вирусной мРНК в геном хозяйской клетки. Если интегрированная кассета содержит фрагмент библиотеки, усиливающий активность гена селективного маркера (NPTII в составе белка GTN), т.е. проявляющий энхансерную активность, то содержащие такую конструкцию клетки выживают в среде с генетицином. После селекции клеток из них была выделена геномная ДНК и проанализирована с помощью двустадийной ПЦР (nested-PCR) с использованием внешних плазмидных праймеров (1L и 1R), а затем с помощью библиотечного праймера LP (Раунд 1, Рис. 2-А).

Известно, что интеграция ретровирусной ДНК происходит в основном в активно транскрибируемые области генома (Scherdin et al., 1990), поэтому гены, находящиеся в составе ретровирусного вектора, после интеграции в геном могут быть подвержены регуляции со стороны эндогенных i/uc-регуляторных элементов. Если таким элементом окажется энхансер, то в результате селекции отберутся фрагменты библиотеки, не обладающие энхансерной активностью (ложные энхансеры).

Чтобы снизить вероятность отбора ложных энхансеров мы проводили два раунда селекции. Для этого фрагменты библиотеки, амплифицированные с геномной ДНК популяции pQCXIX-Enh(L) после первого раунда селекции, снова клонировали в вектор pQCXIX-Enh. Количество выросших на этом этапе трансформантов составило около 10 тысяч. Из выросших клонов была выделена плазмидная ДНК, представляющая собой набор ретровирусных векторов с фрагментами библиотеки, прошедшими отбор в первом раунде селекции. Полученным набором векторов, а также контрольными векторами, снова трансфицировали клетки Phoenix-AMPHO и получали вирусные частицы. Полученными вирусными частицами инфицировали клетки HeLa для проведения второго раунда селекции.

После селекции из выживших клеток выделяли геномную ДНК и анализировали с помощью двухстадийной ПЦР (Раунд 2, Рис. 2-Б, стр. 8). На рисунке 2-Б видно, что на дорожке 4 (раунд 2) содержится меньше фрагментов ДНК, чем в исходной библиотеке (дорожка 2) и в библиотеке после первого раунда (дорожка 3), что свидетельствует об отборе последовательностей, обладающих энхансерной активностью. Клонирование энхансер-подобных элементов и анализ выросших клонов Exoli.

Амплифицированные после второго раунда селекции фрагменты библиотеки клонировали в плазмидный вектор pGEM-T Easy (Promega), которым трансформировали клетки Е. coli. Выросшие клоны ранжировали в двух 96-луночных планшетах. Таким образом, была получена библиотека (клонотека) потенциальных энхансеров.

& ж

❖ Я 1 2 3

п.о. I

1200- I 1000- 1 800- 1 600-

5'-ЬТ11

фрагмент 11 библиотеки 1Я

з'-ьта

10 20 30 Общее число ссквснироваппых клопов

Рисунок 2. Получение библиотеки потенциальных энхансеров, расположенных в локусе ГХ\Т)5-СОХ7Л 1 на хромосоме 19 человека. А) Электрофорез в агарозном геле продуктов двустадийной ПЦР-амплификации фрагментов исходной библиотки (дорожка 2), после первого (дорожка 3) и второго (дорожка 4) раундов селекции. Первая стадия амплификации проводилась с использованием «внешних» праймеров 1Ь и Ш. (схема внизу). На второй стадии был использован библиотечный праймер ЬР, фланкирующий фрагменты библиотеки. Б) Гибридизация индивидуальных клонов с тотальной библиотекой, полученной после двух раундов селекции (Показана лишь часть проанализированных клонов). Верхняя панель - электрофорез (Э) в 1 % агарозном геле продуктов ПЦР-амшшфикации фрагментов библиотеки, выделенных из индивидуальных клонов. Нижняя панель - результат гибридизации (Г) амплифицированных фрагментов с тотальнойбиблиотекой, полученной после двух раундов селекции. Клоны, давшие слабый гибридизационный сигнал (отмечены стрелками), были исключены из дальнейшего анализа. В) Размер полученной библиотеки потенциальных энхансеров. Показана зависимость идентифицированных уникальных последовательностей, от общего числа секвенированных клонов. Всего было обнаружено 15 энхансер-подобныхэлементов.

Для исключения случайных (background) последовательностей, доля которых среди фрагментов незначительна, проводили анализ ранжированных клонов с помощью блот-гибридизации по Саузерну. Для этого проводили ПЦР-амплификацию ДНК индивидуальных клонов с использованием праймера LP. Продукты ПЦР разделяли в 1% агарозном геле (Рис. 2-Б, верхняя панель), переносили на нейлоновую мембрану и проводили гибридизацию с меченой фракцией тотальной ДНК, содержащей фрагменты библиотеки после двух раундов селекции (Рис. 2-В, нижняя панель). В результате гибридизации были выделены клоны, дающие сильный гибридизационный сигнал. Такие клоны содержали последовательности библиотеки, в существенном количестве представленные во фракции ДНК, полученной после двух раундов селекции. Клоны, давшие слабый гибридизационный сигнал, были исключены из дальнейшего анализа.

Секвенирование библиотеки потенциальных энхансеров.

В результате секвенирования 50 клонов полученной библиотеки было обнаружено 15 различных последовательностей, 6 из которых встретились при анализе полученных данных один раз, 2 последовательности - два раза, 4 последовательности - три раза, 2 последовательности - четыре раза и одна последовательность двенадцать раз. Как видно из графика (Рис. 2-В), число обнаруженных уникальных последовательностей перестает увеличиваться с увеличением числа секвенированных клонов, поэтому появление новых энхансеров при дальнейшем секвенировании библиотеки маловероятно.

Свойства обнаруженных последовательностей представлены в таблице 1 (стр. 10).

Проверка способности обнаруженных последовательностей взаимодействовать с ядерными белками in vitro.

Активность регуляторного элемента зависит от специфического набора взаимодействующих ним белков. Поэтому способность формировать ДНК-белковые взаимодействия с ядерными белками является одним из критериев, по которому последовательность ДНК можно считать функциональным элементом. С помощью метода сдвига электрофоретической подвижности (EMSA), позволяющего выявить ДНК-белковые взаимодействия, нами была проверена способность идентифицированных фрагментов взаимодействовать с ядерными белками. Поскольку отбор энхансеров проводили с использованием клеточной линии HeLa, для EMSA-анализа нами был выбран ядерный экстракт, выделенный из клеток этой культуры по методу, предложенному в работе Дигнам (Dignam et al., 1983).

Таблица 1. Расположение потенциальных энхансеров в области FXYD4-COX7A1 хромосомы 19 человека.

№ Энхансера Координаты на хромосоме 19** Длина, п.о. Положение относительно генов локуса Активность* Перекрытие с повторяющими ся элементами

1 4034182140342118 298 Интрон 3 гена FXYDS 2.2

2 4034450640344897 392 Интрон 4 гена FXYD5 2.1

3 4042799440428292 299 ~2 т.п.о. от 5'-конца гена LSR 3.5 1-232 Alu-Y

4 4063442140635308 888 1 т.п.о. от З'-конца гена FFAR2 2.8

5 4071872040719018 299 Интрон 1 гена GAPDHS 2.3

6 4074823740748490 254 2 т.п.о. от 5'-конца гена ЛТР4А 4.7

7 4075779540758182 388 Межгенное*** 1.4 1-388 HERV-K LTR

8 4076346940763799 331 Межгенное*** 1.6

9 4076418440764486 303 Межгенное*** 3.9 1-240 Alu-Y

10 4079238940792543 156 3 т.п.о. от 5'-конца гена KIAA0841 2.8

11 4081285040813109 260 Интрон 2 гена RBM42 2.8 1-220 Alu-Sc

12 4092741040927666 257 Интрон 2 гена U2AF1L4; 0.7 т.п.о. от 5'-конца гена PSENEN 4.3

13 4096582440966019 196 Интрон 15 гена SNX26 4.9

14 4109151741091714 198 0.5 т.п.о. от 5-конца гена TYROBP 4.3

15 4111096041111236 277 8 т.п.о. от 5'-конца гена LRFN3 2.9 70-277 Alu-Sx

*Данные по транзиентным трансфекциям в системе двойной люциферазной детекции (Рис. 3-Б). ""Согласно Human Genome Browser (сборка от марта 2006 г.). ***На расстоянии > 103 п.о. от ближайших генов.

Способность взаимодействовать с ядерными белками была проверена для нескольких идентифицированных фрагментов (фрагмент 7, 8, 10, 11 и 12). В качестве положительного контроля использовали последовательность энхансера цитомегаловируса, который активен в клетках НеЬа, а значит, способен связывать ядерные белки этой клеточной линии. Для того чтобы показать специфичность обнаруженных ДНК-белковых взаимодействий, в реакционные смеси с мечеными фрагментами ДНК добавляли в качестве конкурирующих те же немеченые фрагменты в трех- и шести- кратном избытке (Рис. 3-А, стр. 11). О специфичности судили по ослаблению зон торможения ДНК-белковых комплексов в результате конкуренции немеченных фрагментов с мечеными за связывание с белками. Все проверенные последовательности с высокой специфичностью образуют комплексы с

белками ядерного экстракта НеЬа. В то же время, добавление в реакционные смеси немеченого неспецифического конкурента (фрагмент промоторной области гена с-тус человека), взаимодействующего с ядерным белком СТСБ (РШрроуа а/., 1996), не влияет на способность анализируемых фрагментов образовывать комплексы ДНК-белок (данные не представлены).

А Б

фрагмент

HeLa ЯЭ конкурент Зоны торможения ДНК-белковых комплексов

1 7 8 ! 10 I 11 I 12 I CMV энх.

' 1 - - хЗ*б1 - - хЗ >6 ! - Й*б1 - - *3>sl - - хЗ £ 1 - - «3 >£

t - :

í ¡5'

о С

к о i

Я I

X m

SV40 промотор

Потенциальный энхансер

ген люциферазы

Т f mlliÉjIsÉi,

О 123456709« 11 12 13 «15PV

1 2 3 4 5 6 7 0 9 10 11 12 13 W 15 PV CV

Исследуемый фрагменты

Рисунок 3. Анализ функциональной активности обнаруженных фрагментов.

А) EMSA-анализ связывания обнаруженных потенциальных энхансеров с белками ядерного экстракта (ЯЭ) из клеток культуры HeLa. Б) Проверка энхансерной активности обнаруженных фрагментов в системе двойной люциферазной детекции. Данные получены на основе трех независимых трансфекций. Активность потенциальных энхансеров представлена в процентах от активности энхансера SV40, принятой за 100 %. PV - трансфекция с использованием контрольного вектора pGL3-promoter, содержащего ген люциферазы под контролем промотора SV40. CV -трансфекция с использованием контрольного вектора pGL3-control, содержащего ген люциферазы под контролем промотора и энхансера SV40.13 из 15 обнаруженных фрагментов активируют S V40 промотор в клетках HeLa.

Как видно на рисунке 3-А, почти все из исследованных фрагментов образуют одну или более ярко выраженных зон торможения, что указывает на способность этих фрагментов взаимодействовать с белками ядерных экстрактов. ДНК-белковые комплексы некоторых фрагментов заметно отличаются по электрофоретической подвижности (например, фрагменты 7 и 8, 7 и 10), что указывает на то, что эти фрагменты связывают белки с разной молекулярной массой.

Проверка энхансерной активности обнаруженных фрагментов в системе двойной люциферазной детекции.

Энхансерная активность обнаруженных 15 последовательностей была проверена в системе двойной люциферазной детекции (Promega). Обнаруженные фрагменты клонировали по сайту Sal I в вектор pGL3-promoter (Promega). Полученными конструкциями

проводили котрансфекцию клеток НеЬа с нормирующей плазмидой рЯЬ-ТК с использованием реагента ЦроГеОагшпе 2000 (Inv¡trogen).

Тринадцать из пятнадцати обнаруженных потенциальных энхансеров проявляют энхансерную активность в данной системе, усиливая активность гена люциферазы в 2-5 раз, что соответствует 15-30% от активности сильного энхансера БУ40 (СУ, Рис. 3-Б). Стоит подчеркнуть, что полученные значения активностей обнаруженных фрагментов могут не соответствовать активностям, которые проявляют эти фрагменты, располагаясь в геноме в своем нативном окружении. Кроме того, существуют указания на то, что промотор БУ40 сам по себе обладает сильной активностью в клетках НеЬа, обусловленной взаимодействием промотора с транскрипционным фактором Бр1 (Бупап ап<Х Т^ап, 1983). Вероятно поэтому способность промотора 8У40 быть подверженным модуляции со стороны гетерологичных энхансеров в этих клетках сильно снижена (ЗсИееГ е/ а/., 2001), либо вовсе отсутствует, как, например, для обнаруженных последовательностей 7 и 8, несмотря на их способность взаимодействовать с белками ядерного экстракта (Рис. 3-А).

Согласно полученному результату около 85 % (13 из 15) прошедших отбор фрагментов библиотеки проявляют энхансерную активность, что указывает на высокую эффективность предложенного подхода.

Анализ расположения потенциальных энхансеров в геноме.

Положение предполагаемых энхансеров в исследуемом локусе показано на рисунке 6. Шесть фрагментов были идентифицированы внутри генов (в интронах), пять фрагментов локализуются со стороны промоторов генов, один предполагаемый энхансер расположен с З'-стороны от гена и три фрагмента в межгенных областях (ближайшие гены находятся на расстоянии более 10 тыс. п.о.). Учитывая то, что гены локуса (включая интроны) составляют не более 50 % всей длины локуса, можно заключить, что обнаруженные потенциальные энхансеры преимущественно располагаются внутри, либо вблизи генов локуса.

Некоторые из обнаруженных последовательностей (фрагмент 3, 9, 11 и 15) перекрываются с ретроэлементами, в частности А1и-элементами и длинным концевым повтором (ЬТЯ) семейства НЕЯУ-К (фрагмент 7) (таблица 1). Энхансерная активность ЬТИ. НЕЯУ-К хорошо изучена (Оотагики е/ а1, 2002, Шапошт е! а1., 2007, 11ис1а е! а1., 2004), поэтому обнаружение среди потенциальных энхансеров фрагмента, расположенного в этом классе повторяющихся элементов генома, подтверждает достоверность предложенного метода. Гораздо меньше данных о проявлении энхансерной активности у А1и-элементов. Тем не менее, известно, что некоторые энхансеры, например, энхансер гена ВЯСА1, представляет собой А1и-элемент со свойствами эстроген-зависимого энхансера.

Два энхансера было идентифицировано непосредственно рядом с ранее обнаруженными активными промоторами (Kim et al., 2005). Однако это не означает, что энхансеры участвуют в регуляции именно этих промоторов, так как действие энхансера может распространяться на значительные расстояния.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И КАРТИРОВАНИЕ ДЕСЯТИ НОВЫХ ИНСУЛЯТОРОВ В ЛОКУСЕ FXYD5-COX7A1 ХРОМОСОМЫ 19 ЧЕЛОВЕКА.

Инсуляторы - это последовательности ДНК, способные предотвращать нежелательные взаимодействия между регуляторными элементами генома, например между промотором и энхансером, а также, будучи помещенными по краям генетической конструкции (трансгена), вводимой генно-инженерными способами в клетки, образовывать независимые домены и тем самым защищать экспрессию трансгена от эффекта положения (Gaszner and Felsenfeld, 2006, Valenzuela and Kamakaka, 2006, West and Fraser, 2005). В частности, одним из основных свойств инсуляторов является их способность блокировать действие энхансера на промотор только в том случае, если инсулятор располагается между этими элементами. На основе этого свойства ранее в нашей лаборатории была разработана система для поиска инсуляторов в длинных геномных последовательностях, позволившая обнаружить в локусе FXYD5-COX7AI хромосомы 19 человека восемь потенциальных инсуляторов. В данной работе мы попытались с помощью уже испытанной системы поиска инсуляторов идентифицировать и картировать все или подавляющую часть потенциальных инсуляторов исследуемой области генома.

А I)

.I imim.il- к.ипшрпнанпмс фра) мчим.

<li'tputHtiка Mi' ikoiiiciuiiiihmii ]НЧ° 1 }ШК I Л 1'ЛМИ. liptU'tiV IHIIt UHV СИМ ICI IIЧССКИ\ II|i;illMl |lilll

К' I'linipohaiiiic чгж i\

11|!..Ч..|,.|)..Ч1 п н1\ан<Ч'|)«ч

. N /*/// • ¿4 . HSV-/Â .........................' Шт зля

••митр )||\;||ЦЧ|) NliiiiiiMa.ii.iii.iii

14.К 1 ( м\ 11|)<>м1ппр

< \1\

Ипicip.iniHi к Iспим. iiiiiiiMii-.iuiii ci икни» lIci »utiMi»H cc ivwmiu. 1(1(1' K.MHiiipuitaiiiic. ccKUi iilipoiiaiiiic. ana.m s

Piioiiok 4 Oiûop iipc.nio.iai асмыч iiiicv.шiiipon и ciicicmc ношi iihiio-nci:iiiiHnoii cc.k'kiiiiii. Л) С'.чома и.ипмиш pl\\ I l.ml'ия мошппшо-ноиншчиш сс к'кцпи iiiiv.'\ 1ян»н. !>)( )Гицам c.WMaoïôopa про.шо iai асмых шкл. шорок. ml4 ik -1 промоюр фоофоинцсратпшы мыши: МЧИ iai иеохшшшфосфофапсфсра >,u. J/Sl tlt -I он Iими.ишкппа «ы кируса просттi сриоса.

Стратегия отбора предполагаемых инсуляторов.

Принцип отбора предполагаемых инсуляторов основан на защите промотора репортерного гена от влияния энхансера и позитивно-негативной селекции. Общая схема метода представлена на рисунке 4-Б.

Для отбора инсуляторных последовательностей был сконструирован вектор, названный pPNT/EmP, схема которого представлена на рисунке 4-А. Вектор содержит маркер устойчивости к генетицину, позволяющий проводить позитивную селекцию клеток с интегрированной плазмидой, а также негативный маркер селекции - ген тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV-tk), экспрессия которого придает клеткам с интегрированным вектором чувствительность к ганцикловиру. Исходный вектор эффективно экспрессирует ген HSV-tk, однако, если поместить между промотором и энхансером этого гена последовательность ДНК, способную блокировать действие энхансера (инсулятор), экспрессия гена HSV-tk в стабильно трансфицированных таким вектором клетках прекращается или же существенно снижается, и содержащие эту последовательность клетки становятся устойчивыми к ганцикловиру.

В качестве положительного контроля был сконструирован вектор pPNT/mP, содержащий в регуляторной области гена HSV-tk минимальный промотор цитомегаловируса. Клетки, в геном которых интегрирует такая конструкция, не чувствительны к ганцикловиру.

Получение библиотеки фрагментов, предназначенной для отбора инсуляторов.

Поиск последовательностей (потенциальных инсуляторов), способных нарушать взаимодействие между промотором и энхансером, проводили в пределах участка хромосомы 19 человека длиной 1 млн. п.о., расположенного между генами FXYD5 и СОХ7А1. При получении библиотеки фрагментов, предназначенной для отбора потенциальных инсуляторов, ДНК 30 космид, перекрывающих область FXYD5-COX7A1, расщепляли по отдельности рестриктазами SauiA и CspiЯ. К полученным фрагментам (длиной 200-700 п.о.) посредством синтетических адаптеров был присоединен праймер 27Рг, позволяющий проводить ПЦР-амплификацию фрагментов библиотеки. Праймер 27Рг содержит сайг расщепления Xhol. Обе библиотеки объединяли. Полученная библиотека была ПЦР-амплифицирована с использованием праймера 27Рг и обработана рестрикгазой Xhol. Обработанные рестрикгазой фрагменты клонировали в плазмиду pPNT/EmP по сайту Sail. Для сохранения репрезентативности библиотеки было получено 12 000 колоний, что примерно соответствует 4-кратному перекрыванию области FXYD5-COX7A1. Из выросших клонов была выделена плазмидная ДНК.

Отбор предполагаемых инсуляторов.

Полученный набор плазмид линеаризовали обработкой эндонуклезой рестрикции I и трансфицировали электропорацией в клетки линии СНО. Условия электропорации (20 мс, 360 В, 800 мкФ) для клеток культуры СНО были отработаны в нашей лаборатории ранее, и обеспечивают интеграцию одной копии линеаризованной плазмиды в геном. Параллельно проводили контрольные трансфекции плазмидами рР1ЧТ/тР и рРЫТ/ЕтР. На стадии позитивной селекции клетки, в геном которых интегрировал вектор, были отобраны по их устойчивости к генетицину (0418). Генетицин-устойчивые клетки затем подвергали негативной селекции ганцикловиром (бСУ). Доказательством успешно проведенной селекции служила 100%-ная гибель клеток, содержавших вектор рРОТ/ЕтР, обусловливающий чувствительность клеток к ганцикловиру. В то же время большая часть клеток, трансфицированных контрольной плазмидой рРЫТ/тР, была устойчива к ганцикловиру. Незначительная гибель клеток может объясняться тем, что в этих клетках интеграция рРЫТ/тР произошла в участки генома, находящиеся под контролем эндогенных энхансеров.

Следует отметить, что клетки могут стать чувствительными к ганцикловиру, и в том случае, если клонированный фрагмент ДНК обладает свойствами сайленсера.. Однако последовательность со свойствами сайленсера не обладает направленностью к будет подавлять также и транскрипцию гена устойчивости к неомицину, что приведет к гибели таких клеток на этапе позитивной селекции.

После негативной селекции из клеток, устойчивых к ганцикловиру, была выделена геномная ДНК. На этой матрице была проведена ПЦР-амплификация участка между энхансером и промотором СМУ с помощью праймеров 2Ь и 211 (Рис. 4-Б). Продукты амплификации повторно клонировали в вектор рРШТЕтР для проведения второго раунда селекции.

На рисунке 5-А показаны результаты ПЦР с праймерами 2Ь и 2Я пула плазмид перед трансфекцией (дорожка 1) и ПЦР с теми же праймерами на матрице геномной ДНК из клеток, трансфицированных библиотекой в плазмиде рРЭТУЕтР и прошедших позитивную и негативную селекции (дорожка 2). На рисунке видно, что в результате селекции исходная библиотека, содержащая набор большого числа фрагментов разной длины (дорожка /), превращается в «лесенку» (дорожка 2) из ограниченного числа фрагментов. Ранее в лаборатории была проанализирована небольшая часть полученных фрагментов. В данной работе мы попытались клонировать все или подавляющую часть потенциальных инсуляторов исследуемой области. Для этого отобранные фрагменты ДНК (дорожка 2, рисунок 5-А) были клонированы в вектор рОЕМ-Т (Ргогг^а), и полученные клоны были

проверены на наличие и длину вставок ПЦР с теми же праймерами (Рис. 5-Б). Видно, что вставка наблюдалась во всех 12 проверенных клонах, и длины вставок в основном различались для разных клонов. 20 клонов были секвенированы, четыре идентифицированные последовательности не принадлежали к исследуемой области (содержали фрагменты ДНК Е. coli и человеческую ДНК других хромосом). Анализ остальных выявил 10 новых последовательностей. Далее для полученных в этой работе последовательностей вместе с ранее обнаруженными последовательностями была построена зависимость между числом секвенированных клонов и числом новых (уникальных) последовательностей (Рис. 5-В). На рисунке видно, что идентификация новых инсуляторов при дальнейшем секвенировании библиотеки маловероятна. В результате секвенирования было получено 10 новых последовательностей. Эти последовательности были нанесены на карту исследуемой хромосомы 19 между генами FXYD5 и СОХ7А1 (Рис. 6, инсуляторы 9-18, стр. 18), а их свойства представлены в таблице 2 (стр. 17).

А - В

п.о.

х 2 3 5

5 Г"

■юоо g Ц 'М

■750 2-: 1

500 Ч 5

О 5

250 =■ 3

13 1» •

/ж

g 9 5 1» 15 20 25 Ж X

Общее число секвенированных клонов

Рисунок 5. Анализ библиотеки потенциальных инсуляторов. А) Результаты отбора инсуляторов. ПЦР-амплификация с праймерами 21_ и 2К. на матрицах: 1 - пул плазмид до трансфекции, 2 - геномная ДНК клеток, которые трансфицированы библиотекой коротких фрагметов, клонированной в векторе рРЫТ/'ЕшР после позитивной (С-418) и негативной (ОСУ) селекции. М - маркер длин ДНК. Б) ПЦР-амплификация с праймерами 21. и 2Я 12 случайно выбранных клонов из библиотеки потенциальных инсуляторов. В) Оценка числа независимых клонов в библиотеке. Показана зависимость числа клонов с уникальными последовательностями от общего числа секвенированных клонов.

Анализ расположения инсуляторов в геноме.

Предполагается, что одна из основных функций инсуляторов - образование функциональных доменов генома. Нужно отметить, что термин «инсулятор» применяется для обозначения как энхансерблокирующих элементов, так и пограничных элементов генома, отделяющих участки хроматина с различной структурой или активностью. Так как инсуляторы в данной работе были идентифицированы только по энхансерблокирующей активности, то, в принципе, они могут не проявлять «барьерной» активности, хотя она и располагается, скорее всего, вблизи этих элементов. Тем не менее, в ряде случаев можно выделить гипотетические домены, заключенные между инсуляторами.

Область FXYD5-COX7A1 содержит кластер генов, кодирующих рецепторы, ассоциированные с G-белком, - FFAR1, FFAR2, FFAR3 и GPR42P. Ранее было обнаружено, что гены FFAR3 и FFAR2 имеют различные профили экспрессии (Brown et al., 2003). Расположение инсулятора 6, находящегося между генами FFAR3 и FFAR2, и инсулятора 2, отделяющего FFAR2 от гена KRTDAP, экспрессирующегося преимущественно в эпидермальных кератиноцитах (Bazzi et al., 2007), согласуется с независимой экспрессией этих генов. Гены АТР4А и KIAA0841 находятся каждый в своем гипотетическом домене (между инсуляторами 5 и 1, а также 1 и 18 соответственно). Ген АТР4А транскрибируется преимущественно в тканях желудка (Chalaya et al., 2006, Herrmann et al., 2007) и резко отличается в этом отношении от окружающих генов.

Таблица 2. Расположение потенциальных инсуляторов в области FXYD5-COX7A1 хромосомы 19 человека.

№ Координаты на хромосоме 191 Длина (П.О.) Расположение относительно генов

9 40347492-40347685 194 6-й интрон гена FXYD5

10 40406076-40406590 515 ~1 т.п.о. с З'-стороны от гена ТМЕМ162

11 40437627-40437699 73 2-й интрон гена LSR

12 40909389-40909561 173 14-й интрон гена MLL4

13 40932935-40933049 114 1-й интрон гена LIN37

14 41067647-41067745 99 ~4 т.п.о. с З'-стороны от гена NFKB1D

15 41116085-41116309 225 -4 т.п.о. с 5'-стороны от гена LRFN3

16 41147417-41147594 178 Межгенное'2

17 41350295-41350437 143 Межгонное*

18 40801090-40801286 197 10-й и 11-й интроны, 11-й экзон гена К1АА0841

'Согласно Human Genome Browser (Kuhn et al., 2007), сборка от марта 2006 г. 2На расстоянии более 10 т.п.о. от ближайших генов.

INS9 И

4 + 1^ 4 MAGH>lt>'>IH наурН

И9Ш fl

.........ЯШЖ 8

К ШШ®^ : ;?

в пштитж №

■ шшшпт « «

« №

FFAH11 FFAR3|

JOSN |Н • А'

mkniH Hi ecoMJiSL.

gapdhsHHUH

INS12 | INS13

12АР1Ы ||

..J И»! I

Т\ EMUSfeM

___--I KIRKELS

PROQHI hUHt

INS4 INS8INS14

iwm яйвтшшмш i

ЯШИЙ

Ulli«

IMi ыш

мт

INS15 зИН

LOCW

Рисунок 6. Метрическая карта области FXYD5-COX7A1 хромосомы 19 человека длиной 106 п.о. Вертикальными линиями показано положение потенциальных инсуляторных последовательностей, идентифицированных ранее (INS № 1-8) (Akopov et al., 2006) и в этой работе (INS № 9-18). Пунктирными вертикальными линиями показано положение обнаруженных в работе потенциальных энхансеров (№1-15). Гены обозначены горизонтальными линиями. Нижние горизонтальные панели отображают данные по экспрессии генов локуса в различных тканях человека (черный цвет соответствует высокому уровню экспрессии, светло-серый соответствует низкому уровню экспрессии) (Su et а/., 2004). Карта составлена с помощью Human Genome Browser (сборка от марта 2006 г.).

Гены ЯС5Г и ТУКОВР расположены между инсуляторами 14 и 15 и характеризуются выской тканеспецифичностью экспрессии, отличной от специфичности окружающих их генов. Так, эти гены экспрессируются на высоком уровне в миелоидных клетках (Така1а е/ а!., 2006, \Уи е1 а1, 1999), тогда как отделенный от них инсулятором 14 ген АР1Р1 экспрессируется преимущественно в коре головного мозга (К1ш е/ а!., 1995), а отделенный инсулятором 15 ген ЬЯРЫЗ - в нейрональных клетках (Мопшига е/ д/., 2006). Эти данные согласуются с представлением о том, что последовательности, обладающие инсуляторной активностью, разделяют цепь ДНК на независимые домены, в каждом из которых находятся гены, характеризующиеся специфичным для них профилем экспрессии.

Нужно отметить, что изученная область может содержать инсуляторы, которые не были идентифицированы из-за ограниченных возможностей использованного подхода. Идентифицируемые при данном подходе инсуляторы должны быть активны в клетках СНО и по отношению к промоторно-энхансерной паре цитомегаловируса. Таким образом некоторые ткане- или энхансерспецифичные инсуляторы могли быть пропущены. Эти недостатки, однако, могут быть преодолены путем использования других клеточных линий и промоторно-энхансерных конструкций.

ЭНХАНСЕР-БЛОКИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ СТСР-СВЯЗЫВАЮЩИХ

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, КАРТИРОВАННЫХ В ЛОКУСЕ РХУО5-С0Х7А1 ХРОМОСОМЫ 19 ЧЕЛОВЕКА.

Ранее с помощью разработанного нами метода двумерного сдвига элекгрофоретической подвижности в нашей лаборатории были выявлены и картированы в локусе хромосомы 19 человека длиной 1 млн п.о., расположенном между генами РХУй5 и СОХ7А1, десять фрагментов ДНК, содержащие участки связывания транскрипционного фактора СТСР (Уе1сЫпоуа е1 а1., 2006). В данной работе мы предприняли попытку определить, обладают ли эти фрагменты инсуляторной (энхансер-блокирующей) активностью в системе позитивно-негативной селекции. Для этого были приготовлены плазмиды представленные на рис. 7 (стр. 20).

Инсуляторная активность СТСТ-связывающих фрагментов.

Для проверки энхансер-блокирующих свойств десяти СТСТ-связывающих фрагментов в системе позитивно-негативной селекции, их клонировали в плазмиду рРМУЕтР между энхансером и минимальным промотором цитомегаловируса. Было приготовлено 20 плазмид, каждая содержала один из фрагментов, связывающих СТСР, клонированный в прямой или обратной ориентации.

pPNT/mP

— NPTII

Промотор mPGK1

. HSV-tk

pPNT/EmP

pPNT/EmPS

Промотор mPGK1

pPNT/E-sns-mP

NPTII инс^ятор I-HSV-tk

SXXXZS}—СЭ-ЕЯ—Ш-i

pPNT/E-A-mP

NPTII

Промотор mPGKI

Рисунок 7. Схемы плазмизиых конструкций. использованных в работе. mPGK-1 - промотор фосфошшерятишаш-! мыши; NPTII -r eu неомицинфосфотрансфсразы Е. coli: 1ISV-/A- -ген тимцдигшшазы вируса простого герпеса. Платмида pPNT/E-sns-mP, содержащая между энхансером и минимальным промотором CMV инсулятор sns морского ежа Paracenlraius lividus. была использована в качестве положительного контроля. В качестве отрицательного контроля использовали вектор pPNT/E-/.-mP, содержащий между энхансером и минимальным промотором CMV фрагмент ДНК фага Для проверки способности CTCF-связывающих фрагментов проявлять сайленсерную активность, из вектора pPNT/EmP был удален сайг рестрикции Sa Л. расположенный между энхансером и минимальным промотором СМ V, а с 3'-стороиы от гена HSV-1k был лигирован полшшнкер, содержащий сайт рестрикции Sali. Полученная плазмида была обозначена как pPNT/EmPS. Анализируемые CTCF-связывающие фрашенты (3.7 и 8) были вставлены в pPNT/EmPS по сайгу^тЯ.

Для интеграции в геном клеток плазмиды pPNT/EmP со вставками были линеаризованы, и все 20 плазмид объединены в общую смесь в равных количествах. В качестве вложенного контроля в смесь были добавлены в эквивалентном количестве линеаризованные плазмиды pPNT/E-sns-mP (положительный контроль) (рис. 7), содержащие инсулятор sns в обеих ориентациях.

Полученным пулом плазмид, были трансфицированы клетки линии СНО в отработанных ранее условиях элекгропорации, приводящих к интеграции единственной копии плазмиды в геном (Baer et al., 2000). После позитивно-негативной селекции, которую проводили как описано в предыдущей главе, из выживших клеток была выделена геномная ДНК.

Анализ полученных образцов геномной ДНК проводили при помощи двухстадийной ПЦР. На первом этапе на матрице геномной ДНК с праймерами 2L и 2R амплифицировали фрагменты, заключенные между энхансером и промотором CMV. Для каждого CTCF-связывающего фрагмента из локуса FXYD5-COX7A1, а также для инсулятора морского ежа sns были подобраны внутренние праймеры, которые в комбинации с плазмидными праймерами 2L или 2R позволяли определять как наличие в смеси каждой из вставок, так и

их ориентацию. Результаты ПЦР приведены на рисунке 8 (стр. 21).

Прямая ориентация

CTCF-cfui ллмющнс фрагменты ДН ЕС Ml 23456784 10 «и

Обратная ориентация

СТСТ-свшывакнцне фрмменты ДНК М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1в sns

Рисунок 8. ПЦР-анализ на матрице геномной ДНК из трансфицированнын клеток СНО после позитивной (G418) и негативной (GCV) селекции с праймерамн, специфичными к 10 CTCF-связывающим последовательностям ДНК. (А)

"Прямая" и (Б) "обратная" ориентации относительно промотора. М -маркер ДНК.

Как видно на рисунке 8 (верхние панели, рис. 8-А и 8-Б) все 10 CTCF-связывающих фрагментов и контрольный инсулятор sns присутствуют в геномной ДНК клеток после селекции G-418, то есть содержащие их конструкции интегрированы в геном клеток. Те же фрагменты присутствуют и в нижних панелях (рис. 8) после селекции с 10 мкМ GCV. Аналогичные результаты были получены при селекции с 4 мкМ GCV в ростовой среде (не показано). Таким образом, можно заключить, что все 10 клонированных нами CTCF-связывающих фрагментов придают клеткам устойчивость к ганцикловиру, будучи помещенными между промотором и энхансером.

Кроме инсуляторов, устойчивость к ганцикловиру трансфицированным клеткам могут придавать последовательности с активностью сайленсеров, которые, в отличие от инсуляторов, способны подавлять активность промотора независимо от их положения относительно последнего (Ogbourne and Antalis, 1998). Таким образом, активность сайленсера должна распространяться и на промотор гена неомицинфосфотрансферазы, и клетки, несущие такой вектор должны погибать на стадии позитивной селекции (Akopov et al, 2006). Тем не менее, для проверки возможного присутствия сайленсерной активности у CTCF-связывающих фрагментов мы клонировали три из них (3, 7 и 8) в плазмиду pPNT/EmPS с З'-сгороны от гена HSV-tk (Рис. 7). Клетки, трансфицированные этими

плазмидами, погибали на стадии негативной селекции с вСУ, т.е. не оказывали ослабляющего действия на энхансер СМУ и не являлись сайленсерами.

Таким образом, анализ инсуляторной активности сайтов связывания транскрипционного фактора СТСР, картированных в локусе РХУ05-С0Х7А1, с помощью системы позитивно-негативной селекции показал, что все эти фрагменты обладают энхансер-блокирующими свойствами, причем эта их способность наблюдается в обеих ориентациях относительно промотора. Способность инсулятора морского ежа бш блокировать действие энхансера на промотор в системе позитивно-негативной селекции также не зависит от ориентации.

выводы

Предложен подход к идентификации и картированию потенциальных энхансеров в протяженных областях генома.

С помощью предложенного подхода с использованием культуры клеток НеЬа идентифицировано 15 потенциальных энхансеров в локусе, расположенном на хромосоме 19 человека между генами ГХУй5 и СОХ7А1.

Обнаруженные потенциальные энхансеры специфически взаимодействуют с белками ядерных экстрактов из клеток культуры НеЬа. 13 из 15 обнаруженных последовательностей проявляют энхансерную активность в системе двойной люциферазной детекции в экспериментах по транзиентным трансфекциям линии клеток НеЬа.

С помощью ранее разработанного метода позитивно-негативной селекции энхансер-блокирующих элементов генома идентифицировано 10 новых потенциальных инсуляторов в локусе, расположенном на хромосоме 19 человека между генами РХГРЗ и СОХ7А1.

С помощью системы позитивно-негативной селекции проведен анализ энхансер-блокирующей активности ранее обнаруженных 10 СТСР-связывающих фрагментов ДНК, расположенных в локусе РХУй5-СОХ7А1 хромосомы 19 человека. Все исследованные СТСР-связывающие последовательности проявляют энхансер-блокирующую активность в данной системе.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ Публикации в научных журналах

1. Chernov, I., Е. Stukacheva, S. Akopov, D. Didych, L. Nikolaev and E. Sverdlov (2008). "A new technique for selective identification and mapping of enhancers within long genomic sequences." Biotechniques 44(6): 775-84.

2. Дидыч Д.А., Акопов С.Б., Снежков E.B., Скапцова Н.В., Николаев Л.Г., Свердлов Е.Д. (2009) «Идентификация и картирование 10 новых потенциальных инсуляторов в области FXYD5-COX7A1 хромосомы 19ql3.12 человека». Биохимия (Москва) 74(7), 728-733.

3. Nikolaev, L. G.; Akopov, S. В.; Didych, D. A.; Sverdlov, E. D. (2009). Vertebrate Protein CTCF and its Multiple Roles in a Large-Scale Regulation of Genome Activity. Current Genomics 10,294-302.

Материалы российских и международных конференций

1. Д.А. Дидыч. «Поиск и картирование энхансерных элементов внутри длинных геномных последовательностей». Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2008». 8-11 апреля 2008 г., Москва, тезисы докладов, стр.148.

2. С.Б. Акопов, А.С. Ветчинова, Д.А. Дидыч, В.М. Руда, В.В. Батрак, Л.Г. Николаев, Е.Д. Свердлов. «Картирование участков с активностью инсуляторов в мультигенном локусе хромосомы человека 19ql3.12». IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. 11-15 мая 2008 г., Новосибирск, тезисы докладов, стр.119.

3. Л.Г. Николаев, И.П. Чернов, Е.А. Стукачева, Д.А. Дидыч, С.Б. Акопов, Е.Д. Свердлов. «Прямая идентификация и картирование энхансеров внутри протяженных областей генома». IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. 11-15 мая 2008 г., Новосибирск, тезисы докладов, стр.131.

4. D. Didych, I. Chernov, Е. Stukacheva, S. Akopov, L. Nikolaev, E. Sverdlov. «Straightforward identification and mapping of enhancers within long genomic sequences». 3rd European Science Foundation functional genomics conference «Functional genomics and Disease». October 1-4,2008, Innsbruck, Austria. Abstract book, p. 83.

5. Д.А. Дидыч, С.Б. Акопов, Н.В.Скапцова, Е.В.Снежков, Е.А.Стукачева, И.П.Чернов, Л.Г.Николаев. «Экспериментальные подходы к функциональному картированию энхансерных и инсуляторных последовательностей в протяженных участках генома человека». XXI Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». 9-11 февраля 2009 г., Москва

6. Е.С. Котова, А.С. Ветчинова, ДА. Дидыч, С.Б. Акопов, Л.Г. Николаев. «Выявление инсуляторной активности CTCF-связывающих последовательностей с использованием метода позитивно-негативной селекции». XXI Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». 9-11 февраля 2009 г., Москва.

7. Д.А. Дидыч. «Идентификация и картирование регуляторных элементов в локусе FXYD5-COX7A1 хромосомы 19 человека». Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии. 28 сентября - 1 октября 2009 г., Москва, тезисы работ участников Конкурса молодых ученых, стр. 65.

Подписано в печать:

22.12.2009

Заказ Х° 3230 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дидыч, Дмитрий Александрович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 2. ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ.

ГЛАВА 3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

3.1 ЭУКАРИОТИЧЕСКИЕ ЭНХАНСЕРЫ И МЕТОДЫ ИХ ИДЕНТИФИКАЦИИ.

3.1.1 Общая характеристика и свойства энхансеров.

Структура энхансеров.

Особенности структуры хроматина энхансеров.

Локализация энхансеров в геноме.

Механизмы действия энхансеров.

Модель выпетливания (Looping model).

Модель отслеживания (Tracking model).

Модель распространяющегося выпетливания (Spreading/looping model).

Роль энхансеров в формировании преинициаторного транскрипционного комплекса (ПИК).

Специфичность энхансеров.

Роль энхансеров в развитии болезней.

3.1.2 Методы идентификации энхансеров.

Экспериментальные подходы.

Картирование участков гиперчувствительности ДНК к ДНК-азе I.

Методы на основе хроматин-иммунопреципитации (ChIP).

Картирование энхансеров с помощью метода фиксации конформации хромосом (ЗС).

Биоинформатические подходы.

Идентификация энхансеров с помощью методов сравнительной геномики. 30 Идентификация энхансеров in silico.

3.2 ЭНХАНСЕРБЛОКИРУЮЩИЕ ЭЛЕМЕНТЫ (ИНСУЛЯТОРЫ).

3.2.1 Общая характеристика и свойства инсуляторов.

3.2.2 Механизмы действия энхансерблокирующих элементов.

Образование петлевых доменов (looping model).

Нарушение «tracking»-MexaHU3Ma действия энхансера.

3.2.3 Регуляция активности инсуляторов.

3.3 CTCF - МНОГОФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ РЕГУЛЯТОР.

3.3.1 CTCF и функционирование генома.

CTCF и пограничные элементы генома.

Распределение сайтов связывания CTCF в геноме.

CTCF и повторяющиеся элементы генома.

CTCF и когезиновый комплекс.

3.3.2 Модели функционирования CTCF.

Транскрипционное инсулирование.

Заякоривание» регуляторных комплексов.

Образование функциональных независимых доменов хроматина.

ГЛАВА 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

4.1 МАТЕРИАЛЫ.

4.2 МЕТОДЫ.

4.2.1 Стандартные методики.

4.2.2 ПЦР-амплификация фрагментов ДНК.

ПЦР-амплификация фрагментов библиотеки.

ПЦР-скрининг колоний Е. coli, содержащих плазмидную ДНК со вставками.

Радиоактивное мечение фрагментов ДНК с помощью ПЦР.

4.2.3 Использованные культуры клеток.

4.2.4 Трансфекция клеток с использованием реагента Lipofectamine 2000.

4.2.5 Трансфекция клеток электропорацией.

4.2.6 Получение вирусных частиц и инфицирование клеток.

4.2.7 Определение титра вирусных частиц.

4.2.8 Получение библиотеки фрагментов ДНК локуса FXYD5-COX7A хромосомы 19 человека.

4.2.9 Радиоактивное мечение праймеров.

4.2.10 Очистка меченой ДНК.

4.2.11 Связывание меченых фрагментов ДНК с белками in vitro.

4.2.12 Метод сдвига электрофоретической подвижности в полиакриламидном геле (EMSA - Electrophoretic Mobility Shift Assay).

4.2.13 Определение активности люциферазы.

4.2.14 Селекция предполагаемых энхансеров.

4.2.15 Фиксация и окрашивание клеток с помощью Coomasie Blue.

4.2.16 Позитивно-негативная селекция инсуляторных последовательностей.

4.2.17 Клонирование библиотеки и трансформация клеток Е. coli.

4.2.18 Приготовление компетентных клеток E.coli и их трансформация

4.2.19 Подготовка плазмид для секвенирования.

4.2.20 Картирование последовательностей.

ГЛАВА 5. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

5.1 ИДЕНТИФИКАЦИЯ И КАРТИРОВАНИЕ ЭНХАНСЕР-ПОДОБНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ В ЛОКУСЕ FXYD5-COX7A1 ХРОМОСОМЫ 19 ЧЕЛОВЕКА.

5.1.1 Получение ретровирусных конструкций, предназначенных для поиска энхансеров.

5.1.2 Подготовка и клонирование библиотеки геномных фрагментов в ретровирусный вектор pQCXIX-Enh.

5.1.3 Отбор последовательностей ДНК, обладающих энхансерной активностью.

5.1.4 Клонирование потенциальных энхансеров и анализ выросших клонов E.coli.

5.1.5 Секвенирование библиотеки потенциальных энхансеров.

5.1.6 Проверка способности обнаруженных последовательностей связывать ядерные белки с помощью ЕМвА.

5.1.7 Проверка энхансерной активности обнаруженных фрагментов в системе двойной люциферазной детекции.

5.1.8 Анализ расположения потенциальных энхансеров в геноме.

5.2 ИДЕНТИФИКАЦИЯ И КАРТИРОВАНИЕ ДЕСЯТИ НОВЫХ ИНСУЛЯТОРОВ В ЛОКУСЕ РХУЕ>5-СОХ7А1 ХРОМОСОМЫ 19 ЧЕЛОВЕКА.

5.2.1 Стратегия отбора потенциальных инсуляторов.

5.2.2 Получение библиотеки фрагментов, предназначенной для селекции инсуляторов.

5.2.3 Отбор предполагаемых инсуляторов.

5.2.4 Анализ расположения инсуляторов в геноме.

5.3 ЭНХАНСЕР-БЛОКИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ СТС¥-СВЯЗЫВАЮЩИХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, КАРТИРОВАННЫХ В ЛОКУСЕ РХУТ)5-СОХ7А 1 ХРОМОСОМЫ 19 ЧЕЛОВЕКА.

5.3.1 Конструирование плазмид.

5.3.2 Инсуляторная активность СТСЕ-связывающих фрагментов.

ГЛАВА 6. ВЫВОДЫ.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Дидыч, Дмитрий Александрович

ГЛАВА 6. ВЫВОДЫ

1. Предложен подход к идентификации и картированию потенциальных энхансеров в протяженных областях генома.

2. С помощью предложенного подхода с использованием культуры клеток НеЬа идентифицировано 15 потенциальных энхансеров в локусе, расположенном на хромосоме 19 человека между генами РХЮ5 и СОХ7А1.

3. Обнаруженные потенциальные энхансеры специфически взаимодействуют с белками ядерных экстрактов из клеток культуры НеЬа. 13 из 15 обнаруженных последовательностей проявляют энхансерную активность в системе двойной люциферазной детекции в экспериментах по транзиентным трансфекциям линии клеток НеЬа.

4. С помощью ранее разработанного метода позитивно-негативной селекции энхансер-блокирующих элементов генома идентифицировано 10 новых потенциальных инсуляторов в локусе, расположенном на хромосоме 19 человека между генами РХУВ5 и СОХ7А1.

5. С помощью системы позитивно-негативной селекции проведен анализ энхансер-блокирующей активности ранее обнаруженных 10 СТСР-связывающих фрагментов ДНК, расположенных в локусе РХУй5-СОХ7А1 хромосомы 19 человека. Все исследованные СТСР-связывающие последовательности проявляют энхансер-блокирующую активность в данной системе.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дидыч, Дмитрий Александрович, Москва

1. Agalioti, Т.; Chen, G.; Thanos, D., (2002). Deciphering the transcriptional histone acetylation code for a human gene. Cell 111(3), 381-392.

2. Agalioti, Т.; Lomvardas, S.; Parekh, В.; Yie, J.; Maniatis, Т.; Thanos, D., (2000). Ordered recruitment of chromatin modifying and general transcription factors to the IFN-beta promoter. Cell 103(4), 667-678.

3. Altschul, S. F.; Madden, T. L.; Schaffer, A. A.; Zhang, J.; Zhang, Z.; Miller, W.; Lipman, D. J., (1997). Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res 25(17), 3389-3402.

4. Ashe, H. L.; Monks, J.; Wijgerde, M.; Fraser, P.; Proudfoot, N. J., (1997). Intergenic transcription and transinduction of the human beta-globin locus. Genes Dev 11(19), 2494-2509.

5. Atchison, M. L., (1988). Enhancers: Mechanisms of Action and Cell Specificity. Annual Review of Cell Biology 4(1), 127-153.

6. Baer, A.; Schubeier, D.; Bode, J., (2000). Transcriptional properties of genomic transgene integration sites marked by electroporation or retroviral infection. Biochemistry 39(24), 7041-7049.

7. Banerji, J.; Olson, L.; Schaffner, W., (1983). A lymphocyte-specific cellular enhancer is located downstream of the joining region in immunoglobulin heavy chain genes. Cell 33(3), 729-740.

8. Banerji, J.; Rusconi, S.; Schaffner, W., (1981). Expression of a beta-globin gene is enhanced by remote SV40 DNA sequences. Cell 27(2 Pt 1), 299-308.

9. Bao, L.; Zhou, M.; Cui, Y., (2008). CTCFBSDB: a CTCF-binding site database for characterization of vertebrate genomic insulators. Nucleic Acids Res 36(Database issue), D83-87.

10. Barrera, L. O.; Li, Z.; Smith, A. D.; Arden, K. C.; Cavenee, W. K.; Zhang, M. Q.; Green, R. D.; Ren, В., (2008). Genome-wide mapping and analysis of active promoters in mouse embryonic stem cells and adult organs. Genome Res 18(1), 46-59.

11. Barski, A.; Cuddapah, S.; Cui, K.; Roh, Т. Y.; Schönes, D. E.; Wang, Z.; Wei, G.; Chepelev, I.; Zhao, K., (2007). High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell 129(4), 823-837.

12. Basehoar, A. D.; Zanton, S. J.; Pugh, B. F., (2004). Identification and distinct regulation of yeast TATA box-containing genes. Cell 116(5), 699-709.

13. Bazzi, H.; Fantauzzo, K. A.; Richardson, G. D.; Jahoda, C. A.; Christiano, A. M., (2007). Transcriptional profiling of developing mouse epidermis reveals novel patterns of coordinated gene expression. DevDyn 236(4), 961-970.

14. Bell, A. C.; Felsenfeld, G., (2000). Methylation of a CTCF-dependent boundary controls imprinted expression of the Igf2 gene. Nature 405(6785), 482485.

15. Bell, A. C.; West, A. G.; Felsenfeld, G., (1999). The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators. Cell 98(3), 387-396.

16. Belozerov, V. E.; Majumder, P.; Shen, P.; Cai, H. N., (2003). A novel boundary element may facilitate independent gene regulation in the Antennapedia complex of Drosophila. EMBO J22(12), 3113-3121.

17. Berg, O. G.; Winter, R. B.; von Hippel, P. H., (1981). Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids. 1. Models and theory. Biochemistry 20(24), 6929-6948.

18. Berger, S. L., (2002). Histone modifications in transcriptional regulation. Curr Opin Genet Dev 12(2), 142-148.

19. Bi, X.; Broach, J. R., (1999). UASrpg can function as a heterochromatin boundary element in yeast. Genes Dev 13(9), 1089-1101.

20. Blackwood, E. M.; Kadonaga, J. T., (1998). Going the distance: a current view of enhancer action. Science 281(5373), 60-63.

21. Blanton, J.; Gaszner, M.; Schedl, P., (2003). Protein:protein interactions and the pairing of boundary elements in vivo. Genes Dev 17(5), 664-675.

22. Bondarenko, V. A.; Liu, Y. V.; Jiang, Y. I.; Studitsky, V. M., (2003). Communication over a large distance: enhancers and insulators. Biochem Cell Biol 81(3), 241-251.

23. Boyle, A. P.; Davis, S.; Shulha, H. P.; Meltzer, P.; Margulies, E. H.; Weng, Z.; Furey, T. S.; Crawford, G. E., (2008). High-resolution mapping and characterization of open chromatin across the genome. Cell 132(2), 311-322.

24. Brodsky, A. S.; Meyer, C. A.; Swinburne, I. A.; Hall, G.; Keenan, B. J.; Liu, X. S.; Fox, E. A.; Silver, P. A., (2005). Genomic mapping of RNA polymerase II reveals sites of co-transcriptional regulation in human cells. Genome Biol 6(8), R64.

25. Brown, D. D., (1984). The role of stable complexes that repress and activate eucaryotic genes. Cell 37(2), 359-365.

26. Bushey, A. M.; Dorman, E. R.; Corces, V. G., (2008). Chromatin insulators: regulatory mechanisms and epigenetic inheritance. Mol Cell 32(1), 1-9.

27. Butler, J. E.; Kadonaga, J. T., (2001). Enhancer-promoter specificity mediated by DPE or TATA core promoter motifs. Genes Dev 15(19), 2515-2519.

28. Byun, J.; Kim, J. M.; Kim, S. H.; Yim, J.; Robbins, P. D.; Kim, S., (1996). A simple and rapid method for the determination of recombinant retrovirus titer by G418 selection. Gene Ther 3(11), 1018-1020.

29. Cai, H.; Levine, M., (1995). Modulation of enhancer-promoter interactions by insulators in the Drosophila embryo. Nature 376(6540), 533-536.

30. Cai, H. N.; Shen, P., (2001). Effects of cis arrangement of chromatin insulators on enhancer-blocking activity. Science 291(5503), 493-495.

31. Capelson, M.; Corces, V. G., (2005). The ubiquitin ligase dTopors directs the nuclear organization of a chromatin insulator. Mol Cell 20(1), 105-116.

32. Chao, W.; Huynh, K. D.; Spencer, R. J.; Davidow, L. S.; Lee, J. T., (2002). CTCF, a candidate trans-acting factor for X-inactivation choice. Science 295(5553), 345-347.

33. Chen, H.; Walker, G. E.; Taylor, S. I.; McKeon, C., (1994). Proximal enhancer of the human insulin receptor gene binds the transcription factor Spl. Diabetes 43(7), 884-889.

34. Chen, X.; Xu, H.; Yuan, P.; Fang, F.; Huss, M.; Vega, V. B.; Wong, E.; Orlov, Y. L.; Zhang, W.; Jiang, J., et al., (2008). Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells. Cell 133(6), 1106-1117.

35. Chernov, I. P.; Akopov, S. B.; Nikolaev, L. G., (2004). Structure and function of nuclear matrix associated regions (S/MARs). Bioorg Khim 30(1), 314.

36. Chung, J. H.; Whiteley, M.; Felsenfeld, G., (1993). A 5' element of the chicken beta-globin domain serves as an insulator in human erythroid cells and protects against position effect in Drosophila. Cell 74(3), 505-514.

37. Crowley, E. M.; Roeder, K.; Bina, M., (1997). A statistical model for locating regulatory regions in genomic DNA. J Mol Biol 268(1), 8-14.

38. Dekker, J.; Rippe, К.; Dekker, M.; Kleckner, N., (2002). Capturing chromosome conformation. Science 295(5558), 1306-1311.

39. Dermitzakis, E. Т.; Reymond, A.; Antonarakis, S. E., (2005). Conserved non-genic sequences an unexpected feature of mammalian genomes. Nat Rev Genet 6(2), 151-157.

40. Di Simone, P.; Di Leonardo, A.; Costanzo, G.; Melfi, R.; Spinelli, G., (2001). The sea urchin sns insulator blocks CMV enhancer following integration in human cells. Biochem Biophys Res Commun 284(4), 987-992.

41. Dignam, J. D.; Lebovitz, R. M.; Roeder, R. G., (1983). Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Res 11(5), 1475-1489.

42. Dillon, N., (2006). Gene regulation and large-scale chromatin organization in the nucleus. Chromosome Res 14(1), 117-126.

43. Dobi, K. C.; Winston, F., (2007). Analysis of transcriptional activation at a distance in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol 27(15), 5575-5586.

44. Domanskii, A. N.; Akopov, S. B.; Lebedev Iu, B.; Nikolaev, L. G.; Sverdlov, E. D., (2002). Enhancer activity of solitary long terminal repeat of the human endogenous retrovirus of the HERV-K family. Bioorg Khim 28(4), 341345.

45. Dorsett, D., (1993). Distance-independent inactivation of an enhancer by the suppressor of Hairy-wing DNA-binding protein of Drosophila. Genetics 134(4), 1135-1144.

46. Dorsett, D., (1999). Distant liaisons: long-range enhancer-promoter interactions in Drosophila. Curr Opin Genet Dev 9(5), 505-514.

47. Dunn, K. L.; Zhao, H.; Davie, J. R., (2003). The insulator binding protein CTCF associates with the nuclear matrix. Exp Cell Res 288(1), 218-223.

48. Dynan, W. S.; Tjian, R., (1983). The promoter-specific transcription factor Spl binds to upstream sequences in the SV40 early promoter. Cell 35(1), 79-87.

49. Edlund, T.; Walker, M. D.; Barr, P. J.; Rutter, W. J., (1985). Cell-specific expression of the rat insulin gene: evidence for role of two distinct 5' flanking elements. Science 230(4728), 912-916.

50. Falvo, J. V.; Thanos, D.; Maniatis, T., (1995). Reversal of intrinsic DNA bends in the IFN beta gene enhancer by transcription factors and the architectural protein HMG I(Y). Cell 83(7), 1101-1111.

51. Farrell, C. M.; West, A. G.; Felsenfeld, G., (2002). Conserved CTCF insulator elements flank the mouse and human beta-globin loci. Mol Cell Biol 22(11), 3820-3831.

52. Felsenfeld, G.; Groudine, M., (2003). Controlling the double helix. Nature 421(6921), 448-453.

53. Fiering, S.; Whitelaw, E.; Martin, D. I., (2000). To be or not to be active: the stochastic nature of enhancer action. Bioessays 22(4), 381-387.

54. Filippova, G. N., (2008). Genetics and epigenetics of the multifunctional protein CTCF. Curr Top Dev Biol 80, 337-360.

55. FitzGerald, P. C.; Shlyakhtenko, A.; Mir, A. A.; Vinson, C., (2004). Clustering of DNA sequences in human promoters. Genome Res 14(8), 1562-1574.

56. Fried, M.; Crothers, D. M., (1981). Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res 9(23), 6505-6525.

57. Frith, M. C.; Hansen, U.; Weng, Z., (2001). Detection of cis-element clusters in higher eukaryotic DNA. Bioinformatics 17(10), 878-889.

58. Gaszner, M.; Felsenfeld, G., (2006). Insulators: exploiting transcriptional and epigenetic mechanisms. Nat Rev Genet 7(9), 703-713.

59. Gerasimova, T. I.; Byrd, K.; Corces, V. G., (2000). A chromatin insulator determines the nuclear localization of DNA. Mol Cell 6(5), 1025-1035.

60. Gerasimova, T. I.; Lei, E. P.; Bushey, A. M.; Corces, V. G., (2007). Coordinated control of dCTCF and gypsy chromatin insulators in Drosophila. Mol Cell 28(5), 761-772.

61. Geyer, P. K.; Spana, C.; Corces, V. G., (1986). On the molecular mechanism of gypsy-induced mutations at the yellow locus of Drosophila melanogaster. EMBO J 5(10), 2657-2662.

62. Gillies, S. D.; Morrison, S. L.; Oi, V. T.; Tonegawa, S., (1983). A tissue-specific transcription enhancer element is located in the major intron of a rearranged immunoglobulin heavy chain gene. Cell 33(3), 717-728.

63. Gomos-Klein, J.; Harrow, F.; Alarcon, J.; Ortiz, B. D., (2007). CTCF-independent, but not CTCF-dependent, elements significantly contribute to TCR-alpha locus control region activity. J Immunol 179(2), 1088-1095.

64. Gross, D. S.; Garrard, W. T., (1988). Nuclease hypersensitive sites in chromatin. Annu Rev Biochem 57, 159-197.

65. Guarente, L., (1988). UASs and enhancers: common mechanism of transcriptional activation in yeast and mammals. Cell 52(3), 303-305.

66. Hahn, S., (2004). Structure and mechanism of the RNA polymerase II transcription machinery. Nat Struct Mol Biol 11 (5), 394-403.

67. Hammer, R. E.; Krumlauf, R.; Camper, S. A.; Brinster, R. L.; Tilghman, S. M., (1987). Diversity of alpha-fetoprotein gene expression in mice is generated by a combination of separate enhancer elements. Science 235(4784), 53-58.

68. Hark, A. T.; Schoenherr, C. J.; Katz, D. J.; Ingram, R. S.; Levorse, J. M.; Tilghman, S. M., (2000). CTCF mediates methylation-sensitive enhancer-blocking activity at the H19/Igf2 locus. Nature 405(6785), 486-489.

69. Heintzman, N. D.; Hon, G. C.; Hawkins, R. D.; Kheradpour, P.; Stark, A.; Harp, L. F.; Ye, Z.; Lee, L. K.; Stuart, R. K.; Ching, C. W., et al., (2009). Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature.

70. Heintzman, N. D.; Ren, B., (2007). The gateway to transcription: identifying, characterizing and understanding promoters in the eukaryotic genome. Cell Mol Life Sci 64(4), 3 86-400.

71. Herendeen, D. R.; Kassavetis, G. A.; Geiduschek, E. P., (1992). A transcriptional enhancer whose function imposes a requirement that proteins track along DNA. Science 256(5061), 1298-1303.

72. Herrmann, M.; Selige, J.; Raffael, S.; Sachs, G.; Brambilla, A.; Klein, T., (2007). Systematic expression profiling of the gastric H+/K+ ATPase in human tissue. Scand J Gastroenterol 42(11), 1275-1288.

73. Holmgren, C.; Kanduri, C.; Dell, G.; Ward, A.; Mukhopadhya, R.; Kanduri, M.; Lobanenkov, V.; Ohlsson, R., (2001). CpG methylation regulates the Ig£2/H19 insulator. Curr Biol 11(14), 1128-1130.

74. Holohan, E. E.; Kwong, C.; Adryan, B.; Bartkuhn, M.; Herold, M.; Renkawitz, R.; Russell, S.; White, R., (2007). CTCF genomic binding sites in Drosophila and the organisation of the bithorax complex. PLoS Genet 3(7), el 12.

75. Hou, C.; Zhao, H.; Tanimoto, K.; Dean, A., (2008). CTCF-dependent enhancer-blocking by alternative chromatin loop formation. Proc Natl Acad Sci U SA 105(51), 20398-20403.

76. Hu, Q.; Kwon, Y. S.; Nunez, E.; Cardamone, M. D.; Hutt, K. R.; Ohgi, K. A.; Garcia-Bassets, I.; Rose, D. W.; Glass, C. K.; Rosenfeld, M. G., et al., (2008).

77. Enhancing nuclear receptor-induced transcription requires nuclear motor and LSD 1-dependent gene networking in interchromatin granules. Proc Natl Acad Sci USA 105(49), 19199-19204.

78. Illarionova, A. E.; Vinogradova, T. V.; Sverdlov, E. D., (2007). Only those genes of the KIAA1245 gene subfamily that contain HERV(K) LTRs in their introns are transcriptionally active. Virology 358(1), 39-47.

79. Inoue, H.; Nojima, H.; Okayama, H., (1990). High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene 96(1), 23-28.

80. Kadauke, S.; Blobel, G. A., (2009). Chromatin loops in gene regulation. Biochim Biophys Acta 1789(1), 17-25.

81. Karlsson, O.; Walker, M. D.; Rutter, W. J.; Edlund, T, (1989). Individual protein-binding domains of the insulin gene enhancer positively activate beta-cell-specific transcription. Mol Cell Biol 9(2), 823-827.

82. Kellum, R.; Schedl, P., (1992). A group of scs elements function as domain boundaries in an enhancer-blocking assay. Mol Cell Biol 12(5), 2424-2431.

83. Kent, W. J., (2002). BLAT~the BLAST-like alignment tool. Genome Res 12(4), 656-664.

84. Kim, A.; Zhao, H.; Ifrim, I.; Dean, A., (2007). Beta-globin intergenic transcription and histone acetylation dependent on an enhancer. Mol Cell Biol 27(8), 2980-2986.

85. Kim, T. H.; Abdullaev, Z. K.; Smith, A. D.; Ching, K. A.; Loukinov, D. I.; Green, R. D.; Zhang, M. Q.; Lobanenkov, V. V.; Ren, B., (2007). Analysis of the vertebrate insulator protein CTCF-binding sites in the human genome. Cell 128(6), 1231-1245.

86. Kim, T. H.; Barrera, L. O.; Zheng, M.; Qu, C.; Singer, M. A.; Richmond, T. A.; Wu, Y.; Green, R. D.; Ren, B., (2005). A high-resolution map of active promoters in the human genome. Nature 436(7052), 876-880.

87. Kim, T. W.; Wu, K.; Xu, J. L.; McAuliffe, G.; Tanzi, R. E.; Wasco, W.; Black, I. B., (1995). Selective localization of amyloid precursor-like protein 1 in the cerebral cortex postsynaptic density. Brain Res Mol Brain Res 32(1), 36-44.

88. Kinsella, T. M.; Nolan, G. P., (1996). Episomal vectors rapidly and stably produce high-titer recombinant retrovirus. Hum Gene Ther 7(12), 1405-1413.

89. Klamut, H. J.; Bosnoyan-Collins, L. O.; Worton, R. G.; Ray, P. N.; Davis, H. L., (1996). Identification of a transcriptional enhancer within muscle intron 1 of the human dystrophin gene. Hum Mol Genet 5(10), 1599-1606.

90. Kolesky, S. E.; Ouhammouch, M.; Geiduschek, E. P., (2002). The mechanism of transcriptional activation by the topologically DNA-linked sliding clamp of bacteriophage T4. JMolBiol 321(5), 767-784.

91. Kong, S.; Bohl, D.; Li, C.; Tuan, D., (1997). Transcription of the HS2 enhancer toward a cis-linked gene is independent of the orientation, position, and distance of the enhancer relative to the gene. Mol Cell Biol 17(7), 3955-3965.

92. Krivan, W.; Wasserman, W. W., (2001). A predictive model for regulatory sequences directing liver-specific transcription. Genome Res 11(9), 1559-1566.

93. Kuhn, E. J.; Viering, M. M.; Rhodes, K. M.; Geyer, P. K., (2003). A test of insulator interactions in Drosophila. EMBO /22(10), 2463-2471.

94. Kurdistani, S. K.; Grunstein, M., (2003). Histone acetylation and deacetylation in yeast. Nat Rev Mol Cell Biol 4(4), 276-284.

95. Kutach, A. K.; Kadonaga, J. T., (2000). The downstream promoter element DPE appears to be as widely used as the TATA box in Drosophila core promoters. Mol Cell Biol 20(13), 4754-4764.

96. Lee, T. I.; Young, R. A., (2000). Transcription of eukaryotic protein-coding genes. Annu Rev Genet 34, 77-137.

97. Li, X.; Noll, M., (1994). Compatibility between enhancers and promoters determines the transcriptional specificity of gooseberry and gooseberry neuro in the Drosophila embryo. Embo J 13(2), 400-406.

98. Ling, J.; Ainol, L.; Zhang, L.; Yu, X.; Pi, W.; Tuan, D., (2004). HS2 enhancer function is blocked by a transcriptional terminator inserted between the enhancer and the promoter. J Biol Chern 279(49), 51704-51713.

99. Ling, J.; Baibakov, B.; Pi, W.; Emerson, B. M.; Tuan, D., (2005). The HS2 enhancer of the beta-globin locus control region initiates synthesis of non-coding, polyadenylated RNAs independent of a cis-linked globin promoter. J Mol Biol 350(5), 883-896.

100. Liu, Z.; Garrard, W. T., (2005). Long-range interactions between three transcriptional enhancers, active Vkappa gene promoters, and a 3' boundary sequence spanning 46 kilobases. Mol Cell Biol 25(8), 3220-3231.

101. Lomvardas, S.; Barnea, G.; Pisapia, D. J.; Mendelsohn, M.; Kirkland, J.; Axel, R., (2006). Interchromosomal Interactions and Olfactory Receptor Choice. Cell 126(2), 403-413.

102. Loots, G. G.; Locksley, R. M.; Blankespoor, C. M.; Wang, Z. E.; Miller, W.; Rubin, E. M.; Frazer, K. A., (2000). Identification of a coordinate regulator of interleukins 4, 13, and 5 by cross-species sequence comparisons. Science 288(5463), 136-140.

103. Louie, M. C.; Yang, H. Q.; Ma, A. H.; Xu, W.; Zou, J. X.; Kung, H. J.; Chen, H. W., (2003). Androgen-induced recruitment of RNA polymerase II to a nuclear receptor-pl60 coactivator complex. Proc Natl Acad Sci USA 100(5), 2226-2230.

104. MacPherson, M. J.; Beatty, L. G.; Zhou, W.; Du, M.; Sadowski, P. D.,2009). The CTCF insulator protein is posttranslationally modified by SUMO. Mol Cell Biol 29(3), 714-725.

105. Magdinier, F.; Yusufzai, T. M.; Felsenfeld, G., (2004). Both CTCF-dependent and -independent insulators are found between the mouse T cell receptor alpha and Dadl genes. J Biol Chem 279(24), 25381-25389.

106. Magis, W.; Fiering, S.; Groudine, M.; Martin, D. I., (1996). An upstream activator of transcription coordinately increases the level and epigenetic stability of gene expression. Proc Natl Acad Sci USA 93(24), 13914-13918.

107. Magram, J.; Niederreither, K.; Costantini, F., (1989). Beta-globin enhancers target expression of a heterologous gene to erythroid tissues of transgenic mice. Mol Cell Biol 9(10), 4581-4584.

108. Majumder, P.; Gomez, J. A.; Boss, J. M., (2006). The human major histocompatibility complex class II HLA-DRB1 and HLA-DQA1 genes are separated by a CTCF-binding enhancer-blocking element. J Biol Chem 281(27), 18435-18443.

109. Maksimenko, O.; Golovnin, A.; Georgiev, P., (2008). Enhancer-promoter communication is regulated by insulator pairing in a Drosophila model bigenic locus. Mol Cell Biol 28(17), 5469-5477.

110. Malik, S.; Roeder, R. G., (2000). Transcriptional regulation through Mediator-like coactivators in yeast and metazoan cells. Trends Biochem Sci 25(6), 277-283.

111. Maniatis, T.; Falvo, J. V.; Kim, T. H.; Kim, T. K.; Lin, C. H.; Parekh, B. S.; Wathelet, M. G., (1998). Structure and function of the interferon-beta enhanceosome. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 63, 609-620.

112. Margueron, R.; Trojer, P.; Reinberg, D., (2005). The key to development: interpreting the histone code? Curr Opin Genet Dev 15(2), 163-176.

113. Martin, C.; Zhang, Y., (2005). The diverse functions of histone lysine methylation. Nat Rev Mol Cell Biol 6(11), 838-849.

114. Maston, G. A.; Evans, S. K.; Green, M. R., (2006). Transcriptional Regulatory Elements in the Human Genome. Annual Review of Genomics and Human Genetics 7(1), 29-59.

115. Meneghini, M. D.; Wu, M.; Madhani, H. D., (2003). Conserved histone variant H2A.Z protects euchromatin from the ectopic spread of silent heterochromatin. Cell 112(5), 725-736.

116. Merli, C.; Bergstrom, D. E.; Cygan, J. A.; Blackman, R. K., (1996). Promoter specificity mediates the independent regulation of neighboring genes. Genes Dev 10(10), 1260-1270.

117. Molne, M.; Houart, C.; Szpirer, J.; Szpirer, C., (1989). Combinatorial control of positive and negative, upstream and intragenic regulatory DNA domains of the mouse alpha 1-foetoprotein gene. Nucleic Acids Res 17(9), 3447-3457.

118. Mongelard, F.; Corces, Y. G., (2001). Two insulators are not better than one. Nat Struct Biol 8(3), 192-194.

119. Morimura, N.; Inoue, T.; Katayama, K.; Aruga, J., (2006). Comparative analysis of structure, expression and PSD95-binding capacity of Lrfn, a novel family of neuronal transmembrane proteins. Gene 380(2), 72-83.

120. Morrison, A.; Ariza-McNaughton, L.; Gould, A.; Featherstone, M.; Krumlauf, R., (1997). HOXD4 and regulation of the group 4 paralog genes. Development 124(16), 3135-3146.

121. Muravyova, E.; Golovnin, A.; Gracheva, E.; Parshikov, A.; Belenkaya, T.; Pirrotta, V.; Georgiev, P., (2001). Loss of insulator activity by paired Su(Hw) chromatin insulators. Science 291(5503), 495-498.

122. Murrell, A.; Heeson, S.; Reik, W., (2004). Interaction between differentially methylated regions partitions the imprinted genes Igf2 and HI 9 into parent-specific chromatin loops. Nat Genet 36(8), 889-893.

123. Nikolaev, L. G.; Akopov, S. B.; Didych, D. A.; Sverdlov, E. D., (2009). Vertebrate Protein CTCF and its Multiple Roles in a Large-Scale Regulation of Genome Activity. Current Genomics 10, 294-302.

124. Nobrega, M. A.; Ovcharenko, I.; Afzal, V.; Rubin, E. M., (2003). Scanning human gene deserts for long-range enhancers. Science 302(5644), 413.

125. Nolte, C.; Amores, A.; Nagy Kovacs, E.; Postlethwait, J.; Featherstone, M., (2003). The role of a retinoic acid response element in establishing the anterior neural expression border of Hoxd4 transgenes. Mech Dev 120(3), 325-335.

126. Ogbourne, S.; Antalis, T. M., (1998). Transcriptional control and the role of silencers in transcriptional regulation in eukaryotes. BiochemJ 331 (Pt 1), 1-14.

127. Ohlsson, R; Renkawitz, R; Lobanenkov, V., (2001). CTCF is a uniquely versatile transcription regulator linked to epigenetics and disease. Trends Genet 17(9), 520-527.

128. Ohtsuki, S.; Levine, M.; Cai, H. N., (1998). Different core promoters possess distinct regulatory activities in the Drosophila embryo. Genes Dev 12(4), 547-556.

129. Pai, C. Y.; Lei, E. P.; Ghosh, D.; Corces, V. G., (2004). The centrosomal protein CP 190 is a component of the gypsy chromatin insulator. Mol Cell 16(5), 737-748.

130. Panne, D., (2008). The enhanceosome. Curr Opin Struct Biol 18(2), 236242.

131. Papatsenko, D. A.; Makeev, V. J.; Lifanov, A. P.; Regnier, M.; Nazina, A. G.; Desplan, C., (2002). Extraction of functional binding sites from unique regulatory regions: the Drosophila early developmental enhancers. Genome Res 12(3), 470-481.

132. Parelho, V.; Hadjur, S.; Spivakov, M.; Leleu, M.; Sauer, S.; Gregson, H. C.; Jarmuz, A.; Canzonetta, C.; Webster, Z.; Nesterova, T., et al., (2008). Cohesins functionally associate with CTCF on mammalian chromosome arms. Cell 132(3), 422-433.

133. Parnell, T. J.; Geyer, P. K., (2000). Differences in insulator properties revealed by enhancer blocking assays on episomes. EMBOJ 19(21), 5864-5874.

134. Pennisi, E., (2004). Searching for the genome's second code. Science 306(5696), 632-635.

135. Peters, J. M.; Tedeschi, A.; Schmitz, J., (2008). The cohesin complex and its roles in chromosome biology. Genes Dev 22(22), 3089-3114.

136. Ptashne, M., (1986). Gene regulation by proteins acting nearby and at a distance. Nature 322(6081), 697-701.

137. Queen, C.; Baltimore, D., (1983). Immunoglobulin gene transcription is activated by downstream sequence elements. Cell 33(3), 741-748.

138. Rastegar, M.; Kobrossy, L.; Kovacs, E. N.; Rambaldi, I.; Featherstone, M., (2004). Sequential histone modifications at Hoxd4 regulatory regions distinguish anterior from posterior embryonic compartments. Mol Cell Biol 24(18), 8090-8103.

139. Recillas-Targa, F.; Bell, A. C.; Felsenfeld, G., (1999). Positional enhancer-blocking activity of the chicken beta-globin insulator in transiently transfected cells. Proc Natl Acad Sci USA 96(25), 14354-14359.

140. Reeder, R. H., (1984). Enhancers and ribosomal gene spacers. Cell 38(2), 349-351.

141. Reneker, L. W.; Chen, Q.; Bloch, A.; Xie, L.; Schuster, G.; Overbeek, P. A., (2004). Chick delta 1-crystallin enhancer influences mouse alphaA-crystallin promoter activity in transgenic mice. Invest Ophthalmol Vis Sci 45(11), 4083-4090.

142. Roh, T. Y.; Cuddapah, S.; Zhao, K., (2005). Active chromatin domains are defined by acetylation islands revealed by genome-wide mapping. Genes Dev 19(5), 542-552.

143. Roh, T. Y.; Wei, G.; Farrell, C. M.; Zhao, K., (2007). Genome-wide prediction of conserved and nonconserved enhancers by histone acetylation patterns. Genome Res 17(1), 74-81.

144. Ronshaugen, M.; Levine, M., (2004). Visualization of trans-homolog enhancer-promoter interactions at the Abd-B Hox locus in the Drosophila embryo. Dev Cell 7(6), 925-932.

145. Ruda, V. M.; Akopov, S. B.; Trubetskoy, D. O.; Manuylov, N. L.; Vetchinova, A. S.; Zavalova, L. L.; Nikolaev, L. G.; Sverdlov, E. D., (2004). Tissue specificity of enhancer and promoter activities of a HERV-K(HML-2) LTR. Virus Res 104(1), 11-16.

146. Ruiz-Narvaez, E. A.; Campos, H., (2008). Evolutionary rate heterogeneity of Alu repeats upstream of the APOA5 gene: do they regulate APOA5 expression? J Hum Genet 53(3), 247-253.

147. Sagai, T.; Hosoya, M.; Mizushina, Y.; Tamura, M.; Shiroishi, T., (2005). Elimination of a long-range cis-regulatory module causes complete loss of limb-specific Shh expression and truncation of the mouse limb. Development 132(4), 797-803.

148. Sambrook, J. G.; Russell, D. W., (2001). Molecular Cloning. A laboratory Manual. CSHL Press, Cold Spring Harbor.

149. Sass, A. V.; Ruda, V. M.; Akopov, S. B.; Snezhkov, E. V.; Nikolaev, L. G.; Sverdlov, E. D., (2005). Regulatory potential of S/MAR elements in transient expression. BioorgKhim 31(1), 77-81.

150. Scherdin, U.; Rhodes, K.; Breindl, M., (1990). Transcriptionally active genome regions are preferred targets for retrovirus integration. J Virol 64(2), 907912.

151. Scott, K. C.; Taubman, A. D.; Geyer, P. K., (1999). Enhancer blocking by the Drosophila gypsy insulator depends upon insulator anatomy and enhancer strength. Genetics 153(2), 787-798.

152. Scott, K. S.; Geyer, P. K., (1995). Effects of the su(Hw) insulator protein on the expression of the divergently transcribed Drosophila yolk protein genes. EMBO J 14(24), 6258-6267.

153. Shang, Y.; Myers, M.; Brown, M., (2002). Formation of the androgen receptor transcription complex. Mol Cell 9(3), 601-610.

154. Sleckman, B. P.; Bardon, C. G.; Ferrini, R.; Davidson, L.; Alt, F. W., (1997). Function of the TCR alpha enhancer in alphabeta and gammadelta T cells. Immunity 7(4), 505-515.

155. Smale, S. T., (2001). Core promoters: active contributors to combinatorial gene regulation. Genes Dev 15(19), 2503-2508.

156. Spicuglia, S.; Kumar, S.; Yeh, J. H.; Vachez, E.; Chasson, L.; Gorbatch, S.; Cautres, J.; Ferrier, P., (2002). Promoter activation by enhancer-dependent and -independent loading of activator and coactivator complexes. Mol Cell 10(6), 1479-1487.

157. Spilianakis, C. G.; Flavell, R. A., (2004). Long-range intrachromosomal interactions in the T helper type 2 cytokine locus. Nat Immunol 5(10), 1017-1027.

158. Steinmetz, E. J.; Warren, C. L.; Kuehner, J. N.; Panbehi, B.; Ansari, A. Z.; Brow, D. A., (2006). Genome-wide distribution of yeast RNA polymerase II and its control by Senl helicase. Mol Cell 24(5), 735-746.

159. Stenson, P. D.; Ball, E. V.; Mort, M.; Phillips, A. D.; Shiel, J. A.; Thomas, N. S.; Abeysinghe, S.; Krawczak, M.; Cooper, D. N., (2003). Human Gene Mutation Database (HGMD): 2003 update. Hum Mutat 21(6), 577-581.

160. Struhl, K., (1984). Genetic properties and chromatin structure of the yeast gal regulatory element: an enhancer-like sequence. Proc Natl Acad Sci USA 81(24), 7865-7869.

161. Su, A. I.; Wiltshire, T.; Batalov, S.; Lapp, H.; Ching, K. A.; Block, D.; Zhang, J.; Soden, R.; Hayakawa, M.; Kreiman, G., et al., (2004). A gene atlas of the mouse and human protein-encoding transcriptomes. Proc Natl Acad Sci USA 101(16), 6062-6067.

162. Swift, G. H.; Craik, C. S.; Stary, S. J.; Quinto, C.; Lahaie, R. G.; Rutter, W. J.; MacDonald, R. J., (1984). Structure of the two related elastase genes expressed in the rat pancreas. J Biol Chem 259(22), 14271-14278.

163. Szutorisz, H.; Dillon, N., (2005). The epigenetic basis for embryonic stem cell pluripotency. Bioessays 27(12), 1286-1293.

164. Szutorisz, H.; Dillon, N.; Tora, L., (2005). The role of enhancers as centres for general transcription factor recruitment. Trends Biochem Sci 30(11), 593-599.

165. Takaki, R.; Watson, S. R.; Lanier, L. L., (2006). DAP12: an adapter protein with dual functionality. Immunol Rev 214, 118-129.

166. Teferedegne, B.; Green, M. R.; Guo, Z.; Boss, J. M., (2006). Mechanism of action of a distal NF-kappaB-dependent enhancer. Mol Cell Biol 26(15), 57595770.

167. Thanos, D.; Du, W.; Maniatis, T., (1993). The high mobility group protein HMG I(Y) is an essential structural component of a virus-inducible enhancer complex. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 58, 73-81.

168. Torigoi, E.; Bennani-Baiti, I. M.; Rosen, C.; Gonzalez, K.; Morcillo, P.; Ptashne, M.; Dorsett, D., (2000). Chip interacts with diverse homeodomain proteins and potentiates bicoid activity in vivo. Proc Natl Acad Sci USA 97(6), 2686-2691.

169. Tuan, D.; Kong, S.; Hu, K., (1992). Transcription of the hypersensitive site HS2 enhancer in erythroid cells. Proc Natl Acad Sci USA 89(23), 1121911223.

170. Valadez-Graham, V.; Razin, S. V.; Recillas-Targa, F., (2004). CTCF-dependent enhancer blockers at the upstream region of the chicken alpha-globin gene domain. Nucleic Acids Res 32(4), 1354-1362.

171. Valenzuela, L.; Kamakaka, R. T., (2006). Chromatin insulators. Annu Rev Genet 40, 107-138.

172. Vernimmen, D.; De Gobbi, M.; Sloane-Stanley, J. A.; Wood, W. G.; Higgs, D. R., (2007). Long-range chromosomal interactions regulate the timing of the transition between poised and active gene expression. Embo J 26(8), 20412051.

173. Vieira, K. F.; Levings, P. P.; Hill, M. A.; Crusselle, V. J.; Kang, S. H.; Engel, J. D.; Bungert, J., (2004). Recruitment of transcription complexes to the beta-globin gene locus in vivo and in vitro. J Biol Chem 279(48), 50350-50357.

174. Wallace, J. A.; Felsenfeld, G., (2007). We gather together: insulators and genome organization. Curr Opin Genet Dev 17(5), 400-407.

175. Wasserman, W. W.; Fickett, J. W., (1998). Identification of regulatory regions which confer muscle-specific gene expression. J Mol Biol 278(1), 167-181.

176. Wendt, K. S.; Yoshida, K.; Itoh, T.; Bando, M.; Koch, B.; Schirghuber, E.; Tsutsumi, S.; Nagae, G.; Ishihara, K.; Mishiro, T., et al., (2008). Cohesin mediates transcriptional insulation by CCCTC-binding factor. Nature 451(7180), 796-801.

177. West, A. G.; Fraser, P., (2005). Remote control of gene transcription. Hum Mol Genet 14 Spec No 1, R101-111.

178. West, A. G.; Gaszner, M.; Felsenfeld, G., (2002). Insulators: many functions, many mechanisms. Genes Dev 16(3), 271-288.

179. Willoughby, D. A.; Vilalta, A.; Oshima, R. G., (2000). An Alu element from the K18 gene confers position-independent expression in transgenic mice. J Biol Chem 275(2), 759-768.

180. Wu, C. T., (1993). Transvection, nuclear structure, and chromatin proteins. J Cell Biol 120(3), 587-590.

181. Wu, J.; Song, Y.; Bakker, A. B.; Bauer, S.; Spies, T.; Lanier, L. L.; Phillips, J. H., (1999). An activating immunoreceptor complex formed by NKG2D and DAP 10. Science 285(5428), 730-732.

182. Xu, Q.; Li, M.; Adams, J.; Cai, H. N., (2004). Nuclear location of a chromatin insulator in Drosophila melanogaster. J Cell Sci 117(Pt 7), 1025-1032.

183. Yannaki, E.; Tubb, J.; Aker, M.; Stamatoyannopoulos, G.; Emery, D. W., (2002). Topological constraints governing the use of the chicken HS4 chromatin insulator in oncoretrovirus vectors. Mol Ther 5(5 Pt 1), 589-598.

184. Yao, S.; Osborne, C. S.; Bharadwaj, R. R.; Pasceri, P.; Sukonnik, T.; Pannell, D.; Recillas-Targa, F.; West, A. G.; Ellis, J., (2003). Retrovirus silencer blocking by the cHS4 insulator is CTCF independent. Nucleic Acids Res 31(18), 5317-5323.

185. Yie, J.; Liang, S.; Merika, M.; Thanos, D., (1997). Intra- and intermolecular cooperative binding of high-mobility-group protein I(Y) to the betainterferon promoter. Mol Cell Biol 17(7), 3649-3662.

186. Yu, W.; Ginjala, V.; Pant, V.; Chernukhin, I.; Whitehead, J.; Docquier, F.; Farrar, D.; Tavoosidana, G.; Mukhopadhyay, R.; Kanduri, C., et al., (2004). Poly(ADP-ribosyl)ation regulates CTCF-dependent chromatin insulation. Nat Genet 36(10), 1105-1110.

187. Yusufzai, T. M.; Felsenfeld, G., (2004). The 5'-HS4 chicken beta-globin insulator is a CTCF-dependent nuclear matrix-associated element. Proc Natl Acad Sci USA 101(23), 8620-8624.

188. Yusufzai, T. M.; Tagami, H.; Nakatani, Y.; Felsenfeld, G., (2004). CTCF tethers an insulator to subnuclear sites, suggesting shared insulator mechanisms across species. Mol Cell 13(2), 291-298.

189. Zhan, H. C.; Liu, D. P.; Liang, C. C., (2001). Insulator: from chromatin domain boundary to gene regulation. Hum Genet 109(5), 471-478.

190. Zhang, R.; Burke, L. J.; Rasko, J. E.; Lobanenkov, V.; Renkawitz, R., (2004). Dynamic association of the mammalian insulator protein CTCF with centrosomes and the midbody. Exp Cell Res 294(1), 86-93.

191. Zhou, J.; Barolo, S.; Szymanski, P.; Levine, M., (1996). The Fab-7 element of the bithorax complex attenuates enhancer-promoter interactions in the Drosophila embryo. Genes Dev 10(24), 3195-3201.

192. Zhu, X.; Ling, J.; Zhang, L.; Pi, W.; Wu, M.; Tuan, D., (2007). A facilitated tracking and transcription mechanism of long-range enhancer function. Nucleic Acids Res 35(16), 5532-5544.

Информация о работе

Дидыч, Дмитрий Александрович
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.01.03

Диссертация

Идентификация и картирование регуляторных элементов в локусе FXYD5-COX7A1 хромосомы 19 человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы