Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация белков, взаимодействующих с пероксиредоксином 6

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Идентификация белков, взаимодействующих с пероксиредоксином 6"

На правах рукописи

Буданова Евгения Николаевна

ИДЕНТИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ, ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИХ С ПЕРОКСИРЕДОКСИНОМ 6.

03.00.04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

003064720

Пущино - 2007

003064720

Работа выполнена в лаборатории механизмов рецепции Института биофизики клетки РАН.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Новоселов Владимир Иванович; кандидат биологических наук Быстрова Марина Федоровна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Орлов Николай Яковлевич;

кандидат биологических наук

Масулпс Ирина Станиславовна

Ведущая организация:

Государственное учреждение научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН.

Защита состоится « 4 » октября 2007г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.038.01 в Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБК РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Инстшутская, 3.

Автореферат разослан 2007г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, кандидат биологических наук

Смолихина Т.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Пероксиредоксины (Ргх) - это недавно открытое семейство неселеновых пероксидаз с широким спектром биологических функций. Во-первых, пероксиредоксины, нейтрализуя пероксид водорода, органические пероксиды и пероксинитрит, участвуют в защите клеточных компонентов от окислительного стресса, как экзогенного, так и эндогенного (Rhee S.G. et al., 2005; Bryk R. et al., 2000). Во-вторых, пероксиредоксины вовлечены в процессы внутриклеточной сигнализации, опосредованные при участии перекиси водорода (Rhee S.G. et al., 2005; Wood Z.A. et al., 2003). И, наконец, открытие у некоторых представителей семейства пероксиредоксинов шаперонной активности дает основание полагать, что они предотвращают неправильный фолдинг и агрегирование клеточных белков, сопутствующие окислительному стрессу (Chuang М.Н. et al., 2006; Moon J.C. et al., 2005). По особенностям протекания каталитического цикла Ргх делятся на две основных группы: 1-Cys Ргх и 2-Cys Ргх.

Более 10 лет назад в лаборатории механизмов рецепции ИБК РАН из обонятельного эпителия крысы был выделен белок, обладающий антиоксидантными свойствами, и установлена его принадлежность к 1-Cys пероксиредоксинам, по современной номенклатуре это пероксиредоксин б (Новоселов В.И. и др., 1998). При открытии любого нового белка обычно исследования ведутся по трем основным направлениям. Во-первых, определяется первичная структура белка. Во-вторых, исследуется его локализация в клетках и тканях. И, наконец, для функциональной характеристики белка очень важно установить его белок-белковые взаимодействия, и в том числе способность к само-ассоциации, т.е. его четвертичную структуру. Во многих случаях формирование олигомеров в четвертичной структуре белка обуславливается его биологической функцией, а взаимодействие субъедишщ обеспечивает дополнительный механизм ее регуляции (Овчинников Ю. А., 1987). По первым двум направлениям в лаборатории механизмов рецепции были проведены фундаментальные исследования пероксиредоксина 6. Кроме того, был установлен уникальный терапевтический потенциал этого белка при коррекции патологических состояний, связанных с окислительным стрессом. Данная работа является продолжением работ лаборатории и посвящена исследованиям белок-белковых взаимодействий пероксиредоксина б. К настоящему времени существуют два основных подхода для изучения белок-белковых взаимодействий - биохимический и молекулярно-генетический. В нашей работе были использованы оба эти подхода.

Цель и задачи работы. Целью данной работы было идентифицировать белки, взаимодействующие с 1-Cys пероксиредоксином. В связи с этим были поставлены следующие экспериментальные задачи: (1) с помощью генетического метода двухгибридной дрожжевой системы изучить бинарные белок-белковые взаимодействия пероксиредоксина 6

in vivo; (2) изучить белок-белковые взаимодействия пероксиредоксина б с помощью биохимических методов; (3) проверил, гипотезу, что молекулы пероксиредоксина 6 способны формировать олигомеры.

Научная новизна работы. Были идентифицированы новые белки-партнеры по взаимодействию с Ргхб: калпаин, Sec-14 белок p50RhoGAP, Hsp90, Hsp70, GAPDH (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа), GS (глутаминсинтетаза), Prxl, Р-акгин. Впервые было зарегистрировано взаимодействие между представителями подгрупп I-Cys и 2-Cys пероксиредоксинов. Впервые было показано, что межмолекулярные дисульфидные связи принимают участие в гомодимеризации молекул Ргхб. Впервые были получены данные, указывающие на возможность олигомеризации молекул Ргхб. Впервые было обнаружено существование укороченной формы Ргхб, имеющей молекулярную массу 14 кДа.

* Значение работы. Полученные данные имеют фундаментальное значение для понимания механизмов функционирования антиоксидантных систем клетки. Результаты работы могут найти применение при разработке препаратов для антиоксидангной терапии патологических состояний, связанных с окислительным стрессом.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на российских конференциях: «Медико-биологические проблемы противолучевой и противохимической защиты» (Санкт-Петербург, 2004); на 9-й Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2005); на всероссийской школе-конференции «Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты» (Москва, 2006); на 11-й Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 2 статьи в реферируемых журналах, 1 статья находится в печати.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзор литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения результатов, выводов, списка литературы и приложений. Работа содержит 3 j рисунков и 2 таблицы. Библиографический указатель включает цитированных работ.

Результаты и обсуждение.

1. Поиск белковых партнеров Ргхб человека с помощью двухгибридного скрининга клонотеки кДНК Hybrid Hunter. Поиск белков, взаимодействующих с Ргхб, проводили с помощью двухгибридной дрожжевой системы системы Hybrid Hunter (Invitrogen). Метод основан на реконструкции доменов фактора транскрипции в дрожжевых клетках, запуске транскрипции и последующей экспрессии репортерных генов (Рис. 2А). На первом этапе работы мы создали гибридную pHybLex/Zeo/p28h плазмиду (Bait), которая определяет синтез в дрожжах химерного белка LexA-p28h. Схема получения гибридной плазмиды

представлена на рис.1. Ген ргхб (GenBaiik ВС052550) человека был псреклонирован в плазмиду pHybLex/Zeo из ппазмиды pBlueScript/p28h, предоставлен! юй S-1 Fenstein, США

А Б

.¡M ....................i ™ u>i* . с*6

piiyhLex-'/tio '

I 'i J. Г- л .:S

■it но.-"....-'■' HB ■: ' .

t ¡ixÁ ^ КюМ_ргхб_M -—

«О M-Sftfi, ' IS ^

i 1 3

Рис I. Схема конструирования Bait плаз.чпды pIlybLex/Zco,'p2Sii. (А) Схема получения гтлачмиды pHybLex/Zeo/Ргхб Стрелками указаны положения ГПДР праймеров, применяемых для тестирования размера вставки и обозначены размеры амплифнцированных участков ДНК. (Б) Характеристика продуктом ПЦР, полученных при анализе плазмид pHybLex/Zeo и pHy bL е x/Z ео/р2 Я h. i - ДНК-маркеры, по.; 2 - плазмида pHybLex/Zeo, определяющая синтез белка LexA; 3. плазмида pHybLex/Zeo/p28h, определяющая синтез химерного белка LexA-Prxfij,

Продукция в трансформированных клетках дрожжей L40 химерного белка LexA-p28h была подтверждена иммуноблоттингом с применением антзьЬехА антител, а также ai IT» сыворотки к нативному пероксиредоксину б крысы (Рис. 2В) Результаты иммуиоблоттинга показали, что клетки L40, трансформированные «пустой» плазмидой pHybl-ex/Zeo, продуцируют белок LexA (26 кДа) (Рис. 2В, дорожка 3), клетки, трансформированные плазмидой pHybLcx.'Zeo/p2Sh, продуцируют химерный белок LexA-Ртеб с молекулярной массой около 54 кДа (Рис. 2В, дорожка 6), а также примесь белка I.exA. Для контроля продукции химерны я белков дрожжевые клетки трансформировали контрольными плазмидами из системы Hybrid Hunter: плазмида pHybLex/Zeo/Lamín определяет продукцию химерного белка LexA-Lamirc (42 кДа), плазмида pHybLex/Zeo/Fos-2 кодирует химерный белок LexA-Fos (32,3 кДа) (Рис. 2 В, дорожки 4,5). В негрансформировакных клетках L40 иммунореакттганости анти-LexA антител обнаружено не было (отрицательный контроль) (Рис. 2В, дорожка 2) Интересно, что с помощью акгисьшоротки к Ргхб в трансформированных плазмидой pFIybLex'Zeo/p28h дрожжевых клетках удалось обнаружить не только продукцию химерного белка ожидаемого размера (54 кДа), но также белок с молекулярной массой 2Ü к Да., что соответствует нативному пероксиредоксину дрожжей (Рис 2В, дорожка 7).

Плазмида pHy bLex/Z е о/р2 8 h была проверена в тестах на самоактивацию с использованием стандартного протокола системы Hybrid Fluirter (Рис 2Б).

Ргхб

»

Le:

LacZ, His3

-Г ""'"1-

"LacZ, His3

^___/

Среда L40 L40 pHybLex/Zeo/p28h

YC-WU ZJ® - -

YC-WU -

YC-WHUK -

YC-UZ3Ö0 - +

YC-I.i, VpAD + +

В

V- ' : ' , v'. . i1 *: v: ■'':'' i

25 ^Zm^k^iZk ¡--/ЯШ"

¿й^ЩЩККй??? ...... .......... . ... (iS.^'-' - - ---_-i - ig

12 3 4 5 6

aLexA

ap2 8 His/rat

Рис. 2. Принцип метода двухгибридной дрожжевой системы н тестирование конструкции pH;ybLex/Zeo/p28h. (А) Принцип метода. В тралсформировалных клетках L40 продуцируются химерные белки LexA-Ргхб (Bait) и В42-произвольный пептид кл о натеки кДНК (Prey). При взаимодействии Ргхб с каким-либо полшеттгидом в дрожжах происходит взаимодействие доменов фактора транскрипции и запускается экспрессия репортер пых генов His3 и LacZ. Клетки приобретают способность к росту на селективной среде YC-WHUK 7300. (Б) Тестирование гяазмвды pHybLex/Zeo,'p28b ла самоактивацшо. Клетки L40, трансформированные Bait-плазмидой не были способны к росту на селективных средах, используемых для скрининга. (В) Оценка продукции в трансформированных клетках дрожжей рекомбинантных белков методом иммуноблоттинга с применением антител к LexA (1-ö) и к Ргхб (7,8). 1,8 - маркеры молекулярного веса (кДа); 2 - клетки L40 (отрицательный контроль); 3 - LexA 26 кДа; 4 - LexA-Lamin 42 кДа; 5 - LexA-cFos 32,3 кДа; б - LexA-Ргхб 54 кДа.

Дрожжевые клетки L40 без плазмиды и трансформированные плазмидой pHybLex/Zeo/p28h были протестированы на способность к росту на нескольких типах

селективных сред, используемых в процессе скрининга. В результате трансформации гибридной плазмидой pHybLex/Zeo/p28h клетки дрожжей L40 приобретали способность к росту на средах с зеоцином, но не приобретали фенотип His+ LacZ+ (Рис. 2Б). На следующем этапе работы плазмида pHybLex/Zeo/p28h была использована для скрининга коммерческой клонотеки кДНК ткани семенников Н. sapiens, созданной на основе плазмиды pYESTrp (Invitrogen). Клетки L40, трансформированные плазмидами клонотеки pYESTrp/Library, приобретают фенотип Тгр+ и продуцируют химерные белки, состоящие из активирующего домена транскрипционного фактора В42 и произвольных полипептидов, кодируемых кДНК-клонами клонотеки. Для скрининга клонотеки кДНК человека мы трансформировали Bait-линию дрожжевых клеток (L40, трансформированные pHyt>Lex/Zco/p28h) плазмидами клонотеки. В результате двухгибридного скрининга отбирались дрожжевые колонии положительные по активации двух репортерных генов lacZ и His3, способные к росту на селективной среде YC-WHUK Z300, содержащей 3-аминотриазол (3-АТ).

При скрининге полученных двойных трансформантов выросло 226 дрожжевых колоний с прототрофностью по гистидину на среде YC-WHUK Z300 3-АТ. Эти клоны тестировались на экспрессию второго репортерного гена lacZ. Из 226 колоний, прототрофных по гистидину только 22 имели фенотип lacZ+, то есть проявляли ß-галактозидазную активность. Пример тестирования колоний представлен на рис. ЗА. В качестве положительного контроля двухгибридного скрининга клетки L40 были котрансформированы коммерческими плазмидами pHybLex/Zeo/Fos-2 и pYESTrp-Jun, определяющими синтез химерных белков LexA-Fos и B42-Jun. Так как белки c-Fos и c-Jun взаимодействуют (Curran Т., Franza B.RJr., 1988), котрансформация клеток L40 контрольными плазмидами приводила к активации экспрессии репортерных генов lacZ и His3, и на среде YC-WHUKZ300 3-АТ вырастали колонии, проявляющие ß-галактозидазную активность (Рис. ЗА, 3).

Из 22 позитивных колоний, выявленных в результате скрининга клонотеки, с помощью ПЦР были выделены кДНК клоны в составе плазмид клонотеки (Рис. 4), затем ПЦР-фрагменты были клонированы в вектор pGEM-T-Easy (Promega) и определена их нуклеотидная последовательность. На рис. ЗБ представлены результаты ПЦР-анализа положительных клонов с помощью праймеров, позволяющих амплифицировать вставку из плазмиды pYESTrp/Library.

Поиск гомологичных последовательностей в базе данных NCBI GenBank выявил три наиболее вероятных кандидата на роль партнеров по взаимодействию с Ргхб: ими оказались калпаин, Hsp90 и белок p50RhoGAP из семейства БесМ-содержащих белков. Остальные найденные последовательности соответствовали генам рибосомальных .белков,

шиохондрдальяш белков и белков, имеющих участки взаимодействия с нуклеиновыми кислотами, н том числе, транскрипционных факторов Все они ранее были идентифвдироваяы как ножноположительные результаты при скрининге различных двухгибридаых клонотек (УапСЙекпще W., 1999).

А

Рис. 3. Скрининг клонотекн кДНК. (А) Скрининг клонотеки и тестирование колоний на экспрессию гена 1ас2 1 - колонии двойных трансформантов клеток Ь40 на селективной среде УС-ШНиК ZЗQQ 3-АТ; 2 — тест на р-галактозидазную активность колоний с этой же чашки; 3 - тест на [З-галактозидазную активность контрольных двойных трансформантов клеток МО рНуЬЬех/2ео/Тоя-2 и рУЕЗТгр-1ин. (Б) ПНР-анализ колоний, полученных в результате двухшбрилного скрининга с применением праймеров, позволяющих амплнфицировать кДНК фрагменты плазмид клонотеки.

842 йвешадк»

•шапскрия«»»! ШШ фргй-вдщ- кДНК ия»ют

И—------------------------------—4— .... ......— .............. ИПВ.ПИ.

Рис. 4. Схема положения ПЦР-праймеров для амплификации кДНК фрагментов клонотеки на плазмиде р\"ЕЗТгр/ЫЬгагу.

Выявленный белковый партнер калпаин (ЕС 3.4.22.17) является кальций-зависимой цистеиновой нелизосомной эндопептидазой, широко распространенной в клетках млекопитающих. Калпаин осуществляет ограниченный протеолиз белков, приводящий не к деградации, а к модификации его мишеней (Saido Т.С. et al., 1994). Данные литературы относительно 2-Cys пероксиредоксинов подтверждают, что идентифицированное нами взаимодействие является истинным и Ргхб может быть связан с калпаином функционально. По одним данным протеолитическое расщепление калпаином приводит к ингибировашпо антиоксидантной активности 2-Cys пероксиредоксинов, и таким образом может служить механизмом усиления окислительного стресса в клетках (Seo M.S. et al., 1999; Mukhopadhyay S.S. et al., 2006). Однако, согласно другим данным калпаин, специфически отщепляя С-концевой участок 2-Cys пероксиредоксина, напротив, делает его более устойчивым к окислительному стрессу (Schroder Е. et al., 1998). Кроме того, учитывая полученные в нашей лаборатории данные о секреторной природе Ргхб и отсутствие сигнального пептида в его последовательности (Novoselov S.V. et al, 1999), можно предположить, что калпаин участвует в процессе секреции Ргхб по альтернативному механизму, минуя комплекс Гольджи. Протеолитическая модификация Ргхб калпаином возможно способствует его секреции по каким-то нетрадиционным путям (Nickel W. et al., 2005). В литературе есть многочисленные данные о взаимодействии 2-Cys пероксиредоксинов с калпаином, мы впервые зарегистрировали такое взаимодействие у представителя 1-Cys пероксиредоксинов.

Вторым идентифицированным в результате двухгибридного скрининга партнером Ргхб является белок p50RhoGAP из семейства Яес14-подобных белков, которых объединяет присутствие в составе молекулы домена Secl4. Многие представители этого семейства способны связывать различные гидрофобные молекулы (Sirokmany G. et al., 2006). В настоящее время относительно возможной биологической роли p50RhoGAP существует мало информации. Поэтому пока непонятно, насколько функциональным является обнаруженное нами взаимодействие между Ргхб и p50RhoGAP. Интересно, что с помощью двухгибридной системы ранее уже было зарегистрировано взаимодействие между дрожжевым пероксиредокишом ТРхП и 8ес14-подобным белком (SFH2p), опосредованное окислительным стрессом (Cha М-К. 2003). Это косвенно подтверждает, что между пероксиредоксинами и 8ес14-подобными белками может существовать функциональная связь.

2. Получение и очисткарекомбинантных белков Ргхб человека и крысьи

Для изучения белок-белковых взаимодействий Ргхб биохимическими методами мы получили рекомбинантные белки Ргхб человека и крысы. На основе коммерческого вектора рЕТ28Ь(+) были сконструированы плазмиды pET28b/p28rat и pET28b/28hum, несущие гены пероксиредоксина 6 крысы и человека, которые определяют продукцию рекомбинантных

белхов с Х-кощевым лолигасщциновым кластером. В качестве матрицы для клонирования ргхб человека использовали плазмяду, несущую ген ргхб человека. В качестве матрицы для клонирования Ргхб крысы использовали кДНК, полученную в результате ОТ-ПЦР на мРНК, выделенной из ткани обонятельного эпителия крысы.

А В ......__ _.......

47 l;.,:

:;Щ :ШТ:ЩъЩL- о £

26 . ;;.....

Ш fiü 116

66,2

[45

;з5

Я 25

ШЙЙ18.4

ЯЗЯ

щи.: Ü ШШШ

Ж.....' -

pi 6,3 pl 7,6

Рнс.5. Получение рекомбннантных белков Ргхб человека и крысы и тестирование антисывороткн к p2SBüs/rat. (А) Продукция рекомбинантных белков в клетках В. со Ii Rosetta (i2,5% ПААГ). 1,4 - маркеры молекулярного веса бачков, кДз; 2,5 -тотальный белок Е coli до индукции; 3 - тотальный белок через 4 часа после индукции ИПТГ, в районе 28 кДа наблюдается суперпродуция p28His/rat; б - то же для p2STTis/hum. (Б) Иммуноблоттинг тотального белка E.coli Rosetta, трансформированных плазмидой pET28b/p28hum, с помощью антисывороткн ap28His/rat 1 - маркеры молекулярного веса белков, кДа, 2 - тотальный белок клеток, продуцирующих p28Iiis/lmm. Подтверждена продукция Ргхб человека (В) Тестирование сыворотки ap28His/rat с помощью двухмерного электрофореза и иммуноблота тотальных белков обонятельного эпителия в градиенте р! 4-7. i — двухмерный электрофорез белков обонятельного эпителия (10% ПААГ), окраска кумасси R250; 2 — иммуноблоттинг тотальных белков обонятельного эпителия, разделенных 2-0 ПААГ с помощью антисыворстки p28His/rat. Стрелкой указано единственное пятно, соответствующее Ргхб. 3 — белко вые маркеры йзоэлекгрической точки.

Плазмиды pET28h/p28rat и pET28b/28hum были наработаны в клетках Е. coli штамма Тор 10. Индукция экспрессии осуществлялась в клетках Е. coli штамма Rosetta добавлением ИПТГ в среду культивирования. Рекомбинантные p28His/rat и p28His/hum содержались во фракциях водорастворимых белков E.coli (Рис. 5А, дорожки 3,6) и были очищены с помощью металлохелатной аффинной хроматографии в нативных условиях на Ni-NTA агарозе.

Очищенный до состояния гомогенности белок (Рис. 6А, дорожка 2) p28His/rat был использован для иммунизации кролика с целью получения антисыворотки. Полученная сыворотка была протестирована на специфичность с помощью иммуноблоттинга водорастворимых белков обонятельного эпителия крысы, разделенных двухмерным электрофорезом (Рис. 5В-2). Антисыворотка обладала высокой специфичностью по отношению к нативному Ргхб крысы, выявив единственное пятно с pl~6,3 и молекулярной массой около 28 кДа, соответствующее по молекулярной массе и изоэлектической точке Ргхб. Антисыворотка к Ргхб крысы была использована для подтверждения идентичности рекомбинантного белка, полученного путем экспрессии плазмиды pET28b/p28hum в E.coli. На рисунке 5Б, дорожка 2, показано, что антисыворотка специфически узнавала p28His/hum на иммуноблоте, подтверждая его идентичность нативному белку.

3. Поведение Ргхб крысы в нативных условиях. Согласно данным рентгеносруктурного анализа представители 1-Cys пероксиредоксинов в окисленном состоянии (Cys-SpOH) являются гомодимерами, образованными за счет нековалентных связей (Choi H.J. et al, 1998). Для 2-Cys пероксиредоксинов известно, что они способны образовывать одигомерные структуры в зависимости от редокс-состояния белка. Для 1-Cys пероксиредоксинов известно лишь то, что в растворе их молекулы существуют как в мономерной, так и в димерной форме (Wu Y.Z. et al., 2006; Peshenko I.V. et al., 1999). Поэтому мы исследовали способность очищенного рекомбинантного p28His/rat в растворе и нативного Ргхб в обонятельном эпителии образовывать белковые комплексы. Мы провели градиентный электрофорез в нативных условиях двух препаратов: очищенного рекомбинантного белка и тотальных белков ткани обонятельного эпителия крысы с последующим иммуноблоттингом. И рекомбинантный (Рис. 6А, дорожка 2), и нативный 1-Cys Ргх (Рис. 5В, дорожка 2) на денатурирующем редуцирующем Na-ДС ПААГ были представлены в мономерной форме. На нативном градиентном геле рекомбинантный белок был представлен двумя полосами (Рис. 6Б, дорожка 1). Вестерн-блот анализ также показал наличие двух белковых полос среди тотальных белков обонятельного эпителия, разделенных нативным градиентным электрофорезом (Рис. 6В). На гель-электрофорезе в нативных условиях белки разделяются в соответствии с зарядом белковой молекулы. И хотя белки с

более высокой молекулярной массой мигрируют медленнее (особенно на градиентном геле), точную ее величину определить нельзя, применяя белковые маркеры

118

s: 47

36

26 -I

20 V.: А

my^v

■■■ s ■■■'■■ ■

внняй!

ШжШшШШ 5 -«о.типочср

Р

днмвр^ мономер^!

р^динер Ц^мономср

В

ЛИ мер

iv:мономер

I 2

р281 iii'rit

нат. F'o.6

Рис. 6. Электрофорстический анализ Ргхб в нативцых условиях. (А) Na-ДС электрофорез очищенного р екомбинантного p28His/rat. 1 - белковые маркеры молекулярного веса, кДа. 2 - электрофарктически гомогенный белок p28His/rat. (Б) Натннный электрофорез р28 His/rat в 4-15% ПААГ. 1 - p28His/rat, наблюдаются две полосы, соответствующих мономеру и димеру, 2 - р2 8 His/rat. инку бир о ванный 15 мил с 3 мМ ДТТ, наблюдается появление дополнительной полосы, соответствующей опигомеру, полоса мономера очень слабая. (8) Иммуноблоттинг водорастворимых белков обонятельного эпителия крысы, разделенных в нативном 4- i 5% ПААГ с помощью антисыворотки ap28His/rat. Наблюдаются две полосы белка, соответствующие мономеру и димеру Ргхб.

Однако на основе представленных данных, а также результатов гель-фильтрацгш рекомбинантных белков, полученных другими авторами (Wu Y.Z. et al, 2006), и рентгеноструктурных исследований (Choi II.J. et а!.. 1998), можно сделать вывод, что в растворе Ш vitro и в обонятельном эпителии Ргхб крысы существует в двух состояниях: в Риде мономера И го мод и мер а, Известно, что олигомерное состояние 2-Cys Ргх зависит от редо кс-статуса сульф гидр ильной группы каталитического цисте ин а, и ее восстановленное состояние способствует ассоциации молек>'.ч Ргх и формированию высокомолекулярных одигомеров (Wood Z.A. et at, 2002). Известно также, что 2-Cys пероксиредоксины в восстановленном и гиперокисленном состоянии являются либо олигомерами, либо мономерами. Образование S-S связей меящу протомерами 2-Cys пероксиредокеинов приводит к дестабилизации ояыпшера и его распаду на димеры (Schroder Е. et aL, 1998). Способность 1-Cys пероксиредокгашов образовывать олигомеры ранее не исследовалась Известно, что 2-Cys Ргх переходят в олигомерное состояние в искусственно созданных редуцирующих условиях (при добавлении ДТТ) (Wood Z.A. et al, 2002). Для 1 -Суз пероксиредокишов подобных исследований ранее не проводилось. Мы показали, что

кратковременная инкубация рекомбинантного Ргхб с ДТТ приводила к появлению третьей верхней полосы на нативном градиентном геле, соответствующей, по-видимому, олигомерному состоянию белка (Рис. 6Б, дорожка 2). При этом нижняя полоса, соответствующая мономеру, хотя и присутствовала, но ее интенсивность была значительно слабее, чем у двух верхних полос. Таким образом, полученные результаты могут свидетельствовать о возможности существования динамического перехода между мономерной, димерной и олигомерной формами Ргхб в растворе и на то, что этот переход является редокс-зависимым.

4. Изучение белок-белковых взаимодействий Ргхб штуно-аффинными методами. В экспериментах мы использовали метод аффинной хроматографии (Pull-down assay) и метод аффинного иммуноблотпшга (Far-western blot). На первом этапе аффинную хроматографию проводили с помощью Со2+-агарозы с иммобилизованным за счет полигистидинового кластера p28His/rat (набор фирмы Pierce). Подготовленный аффинный матрикс инкубировали с водорастворимыми белками обонятельного эпителия. На полученной электрофореграмме белков элюата кроме мажорной полосы, соответствующей p28His/rat, можно наблюдать две отчетливые полосы в районе 14 и 45 кДа (Рис. 7 А, дорожка 6). Полосы вырезали из геля и анализировали с помощью MALDI TOF/TOF (коммерческий анализ проведен в ЗАО ПИННИ на базе Института физико-химической медицины РАМН). MALDI TOF анализ показал, что белок 45 кДа соответствовал ß-акгину (42 кДа), а белок 14 кДа оказался пероксиредоксином б. Выявленная укороченная форма Ргхб свидетельствует о специфичном ограниченном протеолизе, которому белок подвергается в процессе инкубации аффинного носителя с белками обонятельного эпителия. Недостатком данного метода явилось малое количество материала, которое можно было использовать в соответствии с протоколом производителя (Pierce). Поэтому далее мы использовали BrCN-активированную сефарозу для иммобилизации p28His/rat. Аффинный матрикс инкубировали с водорастворимыми белками обонятельного эпителия, в качестве контроля использовали BrCN-сефарозу с иммобилизованным бычьим сывороточным альбумином (БСА) и BrCN-сефарозу с заблокированными активными группами (Рис. 7Б, дорожки 2,3). На рис. 7Б, дорожка 5, отмечены белковые полосы элюата, проанализированные методом MALDI TOF.

Результаты анализа методом MALDI TOF показали, что полоса 70-75 кДа соответствует белку теплового шока Hsp70, полоса 45 кДа соответствует ß-акгину, полоса 42 кДа соответствует глутаминсинтегазе (GS), полоса 38 кДа - глицеральдегад-3-фосфатдегидрогеназе (GAPDH). На геле, окрашенном Кумасси также отчетливо видна полоса, соответствующая укороченной форме Ргхб (Рис. 7Б, дорожка 5).

Кроме того, мы применили модифицированный метод аффинной хроматографии, так называемую ступенчатую аффинную хроматографию, элюируя белковые комплексы сначала

буфером с ДТТ, затем буфером с низким рН. Элюция буфером, содержащим ДТТ, приводит к восстановлению дисульфидных связей, тем самым способствуя высвобождению белков, способных взаимодействовать с Ргхб за счет образована дисульфидов

4os «OAFDH

ЬЬ.2 "■'■■"■'■. --

! , .-Ofîtïih

Рис. 7. Результаты идентификации бел о к-белковых взаимодействий Рг\6 иммуно-аффинными методами. (А) Аффинная хроматографии с использованием набора фирмы Piercc 1,3 - белковые маркеры молекулярнорго веса, кДа; 2 — контроль: Со2~-агароза без иммобилизованного белка, инкубированная с белками обинятельного эпителия; 4,5 -смыв с колонки; 6 - ЭЛЮЦИЯ белковых комплексов с помощью имидазола. (Б) Аффинная хроматография белков на BrCN-активированной сефарозе. 1,4 — белковые маркеры, кДа; 2 -контрольная элюция с BrCN сефарозы, заблокированной Tptic-HCl; 3 - контрольная элюция белков с колонки BrCN-bCA; 5 - элюция связавшихся белков с колонки BrCN-Ргхб буфером с низким pli. (В) Аффинная хроматография с последовательной элюпией. 1 — белковые маркеры, кДа, 2,3 - белки, элюированные буфером с ДТТ, высвобождались белковые комплексы, образованные за счет S-S связей (проанализированы отмеченные стрелками полосы — Hsp70, HspS'J, GAPDH, GS, Prxl, актин), 4,5 — белковые комплексы, элюированные буфером с низким рН, высвобождаются белки, ассоциро ванные с Ргхб за счет нековалентных взаимодействий (проанализированы отмененные стрелками полосы — акт™, GS. Ргхб). (Г) Аффинный блоттинг тотальных белков обонятельного эпителия с помощью антисыворотки ap28His/rat. 1,3 - белковые маркеры, кДа, 2 - контрольный блоттинг обонятельного эпителия с ap28His/rat отмечается единственная полоса, соответствующая Ргхб; 4 - аффинный блоттинг с 5 мкг/мл p2KHis/rat, антлсыворотка ap2SHis/rai выявила полосы, соответствующие Iisp70, Ргхб, GAPDH, р-актину.

Данный метод на сегодняшний день является единственным признанным подходом, дающим возможность различить ковалентные и нековалентные взаимодействия. Нужно отметить, что, любой метод аффинной хроматографии позволяет определить лишь участников образующихся белковых комплексов, которые стабилизируются за счет S-S связей, но не позволяет установить белки, непосредственно взаимодействующие с Ргхб за счет дисульфидных связей.

На рис. 7В представлен электрофорез белков, полученных в результате последовательной элюции. Можно отметить, что основная масса белков высвобождается на первом этапе элюции (Рис. 7В, дорожки 2,3), а элюция буфером с низким рН приводит к значительно меньшему высвобождению белка (Рис.7В, дорожки 4,5). Результаты MALDI TOF показали, что после первого этапа элюции высвобождаются белки районе 80-90 кДа (Hsp90), 65-70 кДа (Hsp70), 45 кДа (Р-актин), 38 кДа (GAPDH), 28 кДа (Ргхб) и 23кДа (Prxl), свидетельствующие о возможном образовании S-S связей между этими белками и p28His/rat. После второго этапа элюции появлялись белки в районе 28 кДа (Ргхб), 42 кДа (GS), 45 кДа (р-актин).

5. Аффинный блоттинг. В нашей работе мы также использовали метод аффинного блоттинга (Far-Westem blot) для поиска белков, взаимодействующих с Ргхб. Водорастворимые белки обонятельного эпителия разделялись в Na-ДС ПААГ в присутствии ДТТ, затем переносились на мембрану и далее мембрану инкубировали с рекомбинантным белком p28His/rat (5мкг/мл). Детекцию потенциальных взаимодействий проводили с помощью антисыворотки к p28His/rat. Хотя из-за способа иммобилизации белков в денатурирующих условиях детекция части белок-белковых взаимодействий невозможна, данный метод, в отличие от Far-Westem блота в нативных условиях, является более информативным и позволяет оценить молекулярную массу выявленных белков-партнеров пероксиредоксина б. На рис. 7Г, дорожка 4, кроме основной интенсивной полосы в районе 28 кДа, соответствующей нативному Ргхб, можно наблюдать дополнительные полосы, соответствующие по молекулярной массе обнаруженным белкам GAPDH, р-актину и Hsp70. Эти результаты подтверждают данные, полученные нами с использованием аффинной хроматографии.

6. Исследование белок-белковых взаимодействий Ргхб с помощью кросс-сшивки и переноса метки. Применяя это метод, можно выявить не только постоянные, но и временные короткоживущие взаимодействия. В нашей работе мы использовали p28His/rat, меченный сшивкой Sulfo-SBED (Pierce). Формула сшивки представлена на рис. 8. Оценку биотинилирования p28His/rat проводили аффинным блоттингом с помощью коньюгата стрептавидина и щелочной фосфатазы (Рис. 9).

Биотинилированный р28Ш/га1 мы инкубировали с водорастворимыми белками обонятельного эпителия, обрабатывали смесь ультрафиолетом для активации сшивки и связывания взаимодействующих белков. Затем с помощью аффинной хроматографии на сефаррзе с иммобилизованным мономерным авидином мы изолировали биотинилированные белковые комплексы из смеси, обрабатывали элюат ДГТ для восстановления Б-Э связей и высвобождения белков из комплексов и разделяли белки в 12,5% Ка-ДС ПААГ (Рис. 10А).

Присоединение взаимодействующих * болков за счет

:. - фоиттнвацгш fi \

И ° О

о s "V ^—ч а

00 ? I Л--

^"о"""4^ 0 \ О ^"W 1

° " восстанавливаемая S

№1

Присоединение исследуемого белка

дисульфидно* связь Биотип

Рис. 8. Химическая формула используемой метки. Отмечены сайты присоединения исследуемого белка, присоединения взаимодействующих белков за счет фотоакгивации, остаток молекулы биотина и дйсульфидная связь, восстановление которой приводит к переносу метки на белок-мишень.

Ш-

85-

47 — Рис. 9. Проверка биотинилирования

молекулы р28Шз/га! аффинным блоттингом с помощью коньюгата стрептавидина и щелочной фосфатазы. 1 — белковые маркеры, кДа; 2 -^Щ^Й.'чй^Р-^'''^131 биотинилированный белок отмечен в районе 28 и 56

2бШ111Я1 кДа-

i 2

На рисунке 10А видны отчетливые полосы в районе 23, 38, 45 и 90 кДа, отмеченные стрелками, сопоставимые с результатами блотгинга (РисЛОБ). Перечисленные белковые полосы анализировали методом MALDI TOF. Для идентификации белков, на которые была перенесена биотиновая метка, проводили блоттинг с помощью коньюгата стрептавидина и

щелочной фосфатазы (Рис. 10Б). На рис. 10Б проявились полосы белков, идентифицированных нами ранее методом аффинной хроматографии (Нзр70, ОАРРН, р-акгин), дополнительно были проанализированы полосы 85-90кДа, 23 кДа, 38 кДа. Для подтверждения присутствия в элюате Р-актина (полоса на геле и на блоте в районе 45 кДа) был проведен иммуноблотгинг элюата с помощью антител к а-актину (гомология между а и Р-актином составляет 80%). На рис. 10В можно наблюдать полосу в районе 45кДа, соответствующую р-актину.

А Б В

116 - ' Г- , . ' • V- ^¡¡Р«) №р90^Ш111111111111;6 11Й

66,2 •..,.„ • ■

■*Hsp70 >£sp70». rjlllllllí i 66 2

45 í ' „ . ' , \Чакг.ш

' -«GAPDH GAPDHf

35 "" Щ1з5

25 ' • - ,. , «Pnd Prxl*-

18,4

25

18,4

66,2

45

35

I4'4 ~ • y - ' ШЙ111н,4 25

Рис. 10. Исследование белок-белковых взаимодействий Ргхб методом кросс-сшнвки. (А) Электрофорез биотинилированных белковых комплексов, выделенных с помощью авидин-сефарозы. 1,3 — белковые маркеры; 2 - контрольная элюция небиотиннлированных белков с авидин-сефарозы; 4 - белки, иммобилизованные на авидин-сефарозе; 5 - элюция биотинилированных белковых комплексов с авидин-сефарозы. Отмечены идентифицированные белки. (Б) Аффинный блоттинг водорастворимых белков обонятельного эпителия после переноса метки с помощью коньюгата стрептавиднна и щелочной фосфатазы. 1 — водорастворимые биотинилированные белки; 2 — белковые маркеры, кДа. Отмечены белки, идентифицированные иммуно-аффинными методами. (В) Иммуноблотгинг белков элюата с авидин-сефарозы с помощью моноклональных антител к актину. 1 - белковые маркеры, кДа; 2 - элюат белков с авидин-сефарозы, с помощью антител выявлена единственная полоса 42 кДа, соответствующая Р-актину.

В результате биохимических экспериментов по идентификации белок-белковых взаимодействий Ргхб мы идентифицировали Hsp90, как потенциального партнера по взаимодействию с Ргхб. Учитывая то, что мы идентифицировали этот белок и в результате двухгибридного скрининга in vivo, можно полагать, что взаимодействие Ргхб и Hsp90 является физиологическим, так как партнерство этих белков было подтверждено двумя независимыми подходами. Нужно отметить, что белки теплового шока функционируют в комплексах друг с другом, поэтому неудивительно, что мы зарегистрировали взаимодействие Ргхб с двумя белками теплового шока—Hsp70 и Hsp 90.

Из результатов нашей работы следует, что Ргхб может взаимодействовать с Р-актином. Известно, что актин формирует комплекс с глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой (GAPDH), которую мы так же идентифицировали как предполагаемого партнера Ргхб, и увеличивает ее активность. Также существуют многочисленные данные, что взаимодействие различных ферментов с компонентами актинового цитоскелета, способствует их активации и транслокации к мембране (Pei Z. et al.,1996, Rustier D.J. et aL, 2003, Tamura M. et al., 2000). Поэтому мы полагаем, что взаимодействие Р-актина и пероксиредоксина 6 может иметь значение для транслокации Ргхб в клетке, а также для регуляции его ферментативной активности.

Наши эксперименты показали, что Ргхб способен ассоциировать с глутаминсинтетазой in vitro, причем это взаимодействие осуществляется преимущественно за счет нековалентных связей. Глутаминсинтетаза - единственный фермент, синтезирующий глутамин в клетке, а также осуществляющий функцию по элиминации токсичных продуктов метаболизма - глутамата и аммония. Интересно, что пероксиредоксины впервые были открыты именно при изучении регуляции активности глутаминсингетазы (Kim К. et al., 1985). Этот фермент достаточно легко инактивируется в присутствии активных форм кислорода, поэтому взаимодействие с Ргхб может обеспечивать поддержание глутаминсингетазы в активном состоянии, но по какому принципу это осуществляется, пока неизвестно.

Нами было показано, что Ргхб in vitro способен взаимодействовать с GAPDH и Prxl. GAPDH является ключевым ферментом гликолиза, способным окисляться активными формами кислорода. Учитывая тот факт, что взаимодействие GAPDH с Ргхб осуществляется преимущественно за счет образования дисульфидов, можно предположить, что Ргхб участвует в защите фермента от окисления и в поддержании его активности.

Интересным, на наш взгляд, оказалось обнаруженное взаимодействие Ргхб с другим пероксиредоксином, относящимся к 2-Cys подклассу, Pixl. Известно, что 2-Cys пероксиредоксины разных подклассов способны к взаимодействию между собой с образованием гегерокомплексов. Например, с помощью двухгибридной системы ранее было обнаружено взаимодействие белков Pixl и Ргх4. Мы впервые зарегистрировали взаимодействие между 1-Cys и 2-Cys пероксиредоксинами.

Таким образом, учитывая природу идентифицированных возможных белков-партнеров Ргхб и тот факт, Ргхб является мажорным питозольным белком, можно сделать вывод, что этот белок функционирует в клетке не только как пероксидаза, но и как важный белок-регулятор, воздействующий на различные процессы жизнедеятельности клетки.

7. Проверка способности Ргхб образовывать меясмолекулярные дисульфидные связи. На сегодняшний день считается, что молекулы 1-Cys Ргх способны образовывать

димеры за счет неко валентных взаимодействий. Это было показано с помощью рентгеноструктурного анализа рекомбтгнантного белка Ргхб человека (Choi H.J. el al., !998). Мы впервые обнаружили, что в результате последовательной элюции белков с аффинной колонка BiCN-p2SWs/rat наткввьт белок Ргхб крысы появляется как после элюции с ДТТ (Рис 11А, дорожка 2), так и после элюции буфером с низким рН (Рис. 11 А, дорожка 3). Эти данные дают возможность предположить, что молекулы Ргхб могут взаимодействовать между собой с образованием межмолекулярных дисульфндных связей. Для подтверждения этого факта мы исследовали поведение рекомбинантного белка с помощью Na-ДС электрофореза в редуцирующих и нер еду пирующих условиях.

Рис, 11. Образование межмолекулярных д и сульфидных связен молекулами Ргхб.

(А) Иммуноблоттинг белков последовательной эллюции с ВгСЫ-р28Шз/га1 сефарозы. 1 -белковые маркеры, кДа; 2 - блоттинг белков после элюции ДТТ с помощью антисыворотки ар28Нк/га(, выявляются полосы пативного и рекомбинантного Ргхб; 3 - то же, но элюция буфером с низким рН; 4 - белки, элюированные ДТТ, выявлялись с помощью аН]а МАВ, видна полоса рекомбинантного белка Ргхб; 5 - то же, но элюция белков буфером с низким рН. (Б) Иа-ДС электрофорез очищенных белков р28Ш/ш и р28Ш/1шт 1,4 - белковые маркеры, кДа, 2 - р28Шк/гат в редуцирующих условиях (ДТТ); 3 - р23Н1£/га1 в кер еду пирующих условиях (без ДТТ), помимо полосы 2% кДа можно наблюдать полосу в районе 56 кДа, соответствующую днмерной форме, образованной за счет межмолекулярной дисульфидной связи; 5 - р28Н1з/1шт в редуцирующие условиях (ДТТ), б - р28НмЛшт в нереду пирующих условиях, кроме мопомера 28 кДа наблюдаются высокомолекулярные полосы, соотееггетвуюшяе димерам и олигомерам белка в растворе в невосстанавливающих условиях.

На рис ПБ (дорожка 3) видно, что в отсутствие восстанавливающего агента (ДТТ) появляется двойная полоса в районе 50 кДа, соответствующая димерной форме белка Интересно, что в таких же условиях рекомбинантный пероксиредоксин человека р28Нв/Ьит

обнаруживает дополнительные полосы в районе 100 и более кДа (Рис. 11Б, дорожка 6), соответствующие олигомерным структурам белка. Отличия в элекгрофоретической картине между p28His/rat и p28His/hum связаны, по-видимому, с тем, что в полипептидной цепи Ргхб человека есть второй дополнительный неконсервативный цистеиновый остаток в С-концевой области. Поэтому молекулы p28His/hum способны к само-ассоциации с образованием олигомеров.

Наши результаты противоречат современной догме о том, что молекулы 1-Cys пероксиредоксинов не способны образовывать межмолекулярные дисульфидные связи. Основаниями для этих выводов были данные о кристаллической структуре Ргхб человека, а также элекгрофоретический анализ в нередуцируюпщх условиях поведения рекомбинантного Ргхб человека (Kang S.W. et al., 1998) и нативного Ргхб крысы (Peshenko I.V. et al., 1998). Элекгрофоретический анализ подвижности белков, содержащих SH группы, в нередуцирующих условиях является широко распространенным методом для изучения способности белка образовывать межмолекулярные S-S связи. Мы проводили эксперименты в тех же условиях, как и в ранних работах (Kang S.W., 1998 и Peshenko I.V., 1998), но получили противоположные результаты. Наши данные дают основания полагать, что молекулы Ргхб способны ассоциировать с образованием межмолекулярных белок-белковых взаимодействий. Таким образом, мы впервые показываем, что Ргхб способны образовывать дисульфидные связи с образованием димеров и за счет этих же связей могут взаимодействовать с другими белками.

8. Обнаружена укороченная форма Ргхб. В ходе биохимических экспериментов по детекции белок-белковых взаимодействий нами был обнаружен белок с молекулярной массой около 14 кДа, который по данным MALDI TOF оказался укороченной формой пероксиредоксина б. Вероятно, в процессе экспериментов происходил ограниченный протеолиз Ргхб. С помощью aHisMAB мы выявили на иммуноблоте N-концевую часть полипептидной цепи рекомбинантного Ргхб, несущую полигистидиновый кластер. Интересно, что С-концевая протеолитическая деградация недавно была показана и для 2-Cys пероксиредоксинов, и полагают, что подобная модификация модулирует функции белка. Предполагают, что регуляция пероксидазной активности in vivo может осуществляться с помощью ограниченного протеолиза С-концевого участка, предотвращающего инактивацию пероксиредоксинов при возрастающих концентрациях перекисей. Для Ргх2 дрожжей отмечено, что удаление последних аминокислотных остатков повышает устойчивость этого белка к окислению (Коо К.Н. et al., 2002), подобное было показано и для Ргх2 эритроцитов (Cha М.К. et al., 2000). Интересно то, что протеаза калпаин присутствует в эритроцитах и специфично отщепляет эту область Prx2 in vitro (Schroder Е. et al., 1998).

Заключение. Для выполнения поставленных задач по идентификации белок-белковых взаимодействий Ргхб мы применили как in vitro биохимические методы, так и in vivo метод дрожжевой двухгибридной системы. Интересно, что in vitro и in vivo методы детекции взаимодействий показали разные результаты, единственным совпадением обоих подходов оказался белок Hsp90. Метод двухгибридной системы позволяет детектировать бинарные белок-белковые взаимодействия in vivo, и, кроме того, короткоживущие и низкоаффинные взаимодействия. Однако, у этого метода есть недостатки - так называемые ложноотрицательные результаты, возникающие из-за того, что продукция некоторых гетерологичных белков, а также их взаимодействия, могут быть токсичными для дрожжевых клеток. Биохимические методы позволяют детектировать участников белковых комплексов, не позволяя, однако, определить последовательность взаимодействующих белков. Именно по этой причине результаты, полученные с использованием разных подходов, отличаются.

Выводы.

1. Было установлено, что Ргхб способен к образованию многочисленных белок-белковых взаимодействий.

2. С помощью биохимических методов были выявлены возможные партнеры Ргхб среди водорастворимых белков обонятельного эпителия крысы. Ими оказались белки: Hsp70, Hsp90, Prxl, ß-акпш, GAPDH, глутаминсшггетаза.

3. Методом двухгибридной системы было установлено, что потенциальными партнерами по взаимодействию с Ргхб являются калпаин, Sec-14 белок RhoGAP и Hsp90.

4. Впервые было показано, что молекулы Ргхб способны к самоассоциации за счет образования межмолекулярных дисульфидных связей.

5. Результаты указывают на то, что молекулы 1-Cys пероксиредоксинов способны к олигомеризации.

6. В обонятельном эпителии крысы была обнаружена укороченная форма Ргхб с приблизительной молекулярной массой 14 кДа, существование которой свидетельствует о способности Ргхб специфически подвергаться ограниченному протеолизу.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Быстрова М.Ф., Буданова E.H. Перекись водорода и пероксиредоксины в редокс-регуляции внутриклеточной сигнализации // Биологические мембраны. 2007. Т. 24. №. 2. С. 115-125.

2. Быстрова М.Ф., Буданова E.H.. Новоселов В.И., Фесенко Е.Е. Исследование четвертичной структуры 1-Cys пероксиредоксина крысы//Биофизика. 2007. Т. 52. № 3. С. 436-442.

3. Буданова Б.Н.. Новоселов В.И., Быстрова М.Ф. Пероксиредоксины: новые взгляды на механизмы физиологической активности и поиск белков-партнеров. Материалы всероссийской конференции молодых ученых и II школа им. академика Н.М. Эммануэля «Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты». Москва. Изд-во РУДН. 1-3 июня 2006. С. 164-166.

4. Буданова E.H. Изучение белок-белковых взаимодействий пероксиредоксина методом двухгибридной системы в дрожжах. Материалы IX международной Путинской школы-конференции молодых ученых 18-22 апреля 2005г. Пущино, 2005. С. 71.

5. Новоселов В.И., Янин В. А., Амелина С.Е., Барышникова JI.M., Буданова E.H.. Фесенко Е.Е. Лекарственные препараты на основе пероксиредоксйнов для ранней терапии химических поражений органов дыхания. Конференция «Медико-биологические проблемы противолучевой и противохимической защиты». Санкт-Петербург. Изд-во «Фолиант», 2004. С.365.

6. Буданова E.H.. Быстрова М.Ф. Поиск белок-белковых взаимодействий пероксиредоксина 6 с применением метода дрожжевой двугибридной системы // Генетика (в печати).

7. Буданова E.H.. Новоселов В.И., Быстрова М.Ф. Изучение белок-белковых взаимодействий пероксиредоксина 6 из обонятельного эпителия крысы. Материалы XI международной Пущинской школы-конференции молодых ученых. 29 октября - 2 ноября 2007г. Пущино, 2007 (в печати).

Подписано в печать 17.08.2007 г. Исполнено 17.08.2007 Печать трафаретная

Заказ №629 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495)975-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Буданова, Евгения Николаевна

1. Введение.

2. Обзор литературы.

2.1. Белок-белковые взаимодействия.

Силы, участвующие в белок-белковом взаимодействии.

Методы изучения белок-белковых взаимодействий.

Аффинная хроматография.

Аффинный блоттинг.

Иммунопреципитация.

Кросс-сшивка.

Методы на основе использования клонотек.

Фаговый дисплей.

Двухгибридная система.

2.2. Пероксиредоксины.

Открытие семейства пероксиредоксинов.

Каталитический цикл пероксиредоксинов.

Олигомеризация и бифункциональность пероксиредоксинов.

1-Cys пероксиредоксины.

Установленные белок-белковые взаимодействия пероксиредоксинов.

3. Материалы и методы.

Электрофорез белков.

Двухмерный электрофорез.

Иммуноб л оттинг.

Электрофорез ДНК.

Получение рекомбинантных Ргхб человека и крысы.

Аффинная хроматография рекомбинантных Ргхб человека и крысы.

Получение сыворотки к рекомбинантному Ргхб крысы.

Твердофазный иммуноферментный анализ.

Метод аффинной хроматографии (Pull-down assay) с использованием коммерческого набора Pierce.

Метод аффинной хроматографии (Pull-down assay) на BrCN-активированной сефарозе.

Метод аффинного блоттинга (Far-western blot).

Метод кросс-сшивки и переноса метки.

Двухгибридная система.

Конструирование плазмиды pHybLex/Zeo/p28h (Bait).

Трансформация дрожжей.

Тестирование плазмид.

Клонотека к ДНК.

Трансформация линии L40 pHybLex/Zeo/p28h (bait) клонотекой кДНК.

Определение Р-галактозидазной активности.

4. Результаты исследования.

Поиск белковых партнеров Ргхб человека с помощью скрининга двухгибридной клонотеки Hybrid Hunter.

Биохимическая идентификация белков, взаимодействующих с Ргхб.

Получение рекомбинантных Ргхб человека и крысы.

Детекция белок-белковых взаимодействий аффинной хроматографией.

Исследование белок-белковых взаимодействий методом кросс-сшивки и переноса метки.

Метод аффинного блотинга (Far-Western блоттинга).

Проверка способности Ргхб образовывать межмолекулярные дисульфидные связи.

Исследование способности молекул Ргхб образовывать олигомерные комплексы.

5. Обсуждение результатов.

6. Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Идентификация белков, взаимодействующих с пероксиредоксином 6"

Пероксиредоксины (Ргх) - это недавно открытое семейство неселеновых пероксидаз с широким спектром биологических функций. Во-первых, пероксиредоксины, нейтрализуя пероксид водорода, органические пероксиды и пероксинитрит, участвуют в защите клеточных компонентов от окислительного стресса, как экзогенного, так и эндогенного [Rhee S.G. et al., 2005; Bryk R. et al., 2000]. Во-вторых, пероксиредоксины вовлечены в процессы внутриклеточной сигнализации, опосредованные участием перекиси водорода [Rhee S.G. et al., 2005; Wood Z.A. et al., 2003]. И, наконец, открытие у некоторых представителей семейства пероксиредоксинов шаперонной активности дает основание полагать, что они предотвращают сопутствующие окислительному стрессу неправильный фолдинг и агрегирование клеточных белков [Chuang М.Н. et al., 2006; Moon J.C. et al., 2005]. По особенностям протекания каталитического цикла Prxs делятся на две основных группы: 1-Cys и 2-Cys пероксиредоксины. Более 10 лет назад в лаборатории механизмов рецепции из обонятельного эпителия крысы был выделен белок, обладающий антиоксидантными свойствами, и установлена его принадлежность к 1-Cys пероксиредоксинам, по современной номенклатуре это пероксиредоксин 6. При открытии любого нового белка обычно исследования ведутся по трем основным направлениям. Во-первых, определяется первичная структура белка. Во-вторых, исследуется его локализация в клетках и тканях. И, наконец, для функциональной характеристики белка очень важно установить его белок-белковые взаимодействия, и в том числе способность к самоассоциации, т.е. его четвертичную структуру. Во многих случаях формирование олигомеров в четвертичной структуре белка обуславливается его биологической функцией, а взаимодействие субъединиц обеспечивает дополнительный механизм ее регуляции [Овчинников Ю.А., 1987]. По первым двум направлениям в лаборатории механизмов рецепции были проведены фундаментальные исследования пероксиредоксина 6. Кроме того, был установлен уникальный терапевтический потенциал этого белка при коррекции патологических состояний, связанных с окислительным стрессом. Данная работа является продолжением работ лаборатории и посвящена исследованиям белок-белковых взаимодействий пероксиредоксина 6 с применением целого ряда биохимических и иммунохимических методов, а также генетического метода дрожжевой двухгибридной системы, которая позволяет идентифицировать белок-белковые взаимодействия in vivo, в том числе низкоаффинные и короткоживущие.

Целью работы было идентифицировать белки, способные взаимодействовать с 1-Cys пероксиредоксином 6.

Задачи:

1. С помощью генетического метода двухгибридной дрожжевой системы изучить бинарные белок-белковые взаимодействия пероксиредоксина 6;

2. Изучить белок-белковые взаимодействия пероксиредоксина 6 с помощью биохимических методов;

3. Проверить гипотезу, что молекулы пероксиредоксина 6 способны формировать олигомеры.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Буданова, Евгения Николаевна

6. Выводы.

1. Было установлено, что Ргхб способен к образованию многочисленных белок-белковых взаимодействий.

2. С помощью биохимических методов были выявлены возможные партнеры Ргхб среди водорастворимых белков обонятельного эпителия крысы. Ими оказались белки: Hsp70, Hsp90, Prxl, Р-актин, GAPDH, глутаминсинтетаза.

3. Методом двухгибридной системы было установлено, что потенциальными партнерами по взаимодействию с Ргхб являются калпаин, Secl4 белок RhoGAP и Hsp90.

4. Впервые было показано, что молекулы Ргхб способны к самоассоциации за счет образования межмолекулярных дисульфидных связей.

5. Результаты указывают на то, что молекулы 1-Cys пероксиредоксинов способны к олигомеризации.

6. В обонятельном эпителии крысы была обнаружена укороченная форма Ргхб с приблизительной молекулярной массой 14 кДа, существование которой свидетельствует о способности Ргхб специфически подвергаться ограниченному протеолизу.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Буданова, Евгения Николаевна, Пущино

1. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. М.: Просвещение. 1987. 815 с.

2. Archakov A.I., Ivanov Yu.D. The optical biosensor study of the protein-protein interactions with cytochrome P450s. 1999. Biophysics of electron transfer and molecular bioelectronics. Pleum Publication Corporation: USA. P. 173-194.

3. Bankaitis V.A., Malehorn D.E., Emr S.D., Greene R. The Saccharomyces cerevisiae SEC 14 gene encodes a cytosolic factor that is required for transport of secretory proteins from the yeast Golgi complex // J. Cell. Biol. 1989. V. 108. P. 1271-12811.

4. Biteau В., Labarre J., Toledano M.B. ATP-dependent reduction of cysteine-sulphinic acid by Saccharomyces cerevisiae sulfiredoxin // Nature. 2003. V. 425. P. 980-984

5. Blackwood E.M., Eisenmann R.N. Max: a helix-loop-helix zipper protein that forms a sequence-specific DNA-binding complex with Мус // Science. 1991. V. 251. P. 1211-1217.

6. Breeden, L., and Nasmyth, K. Regulation of the Yeast HO Gene // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1985. V. 50. P. 643-650.

7. Brent R., Ptashne M. A bacterial repressor protein or a yeast transcriptional terminator can block upstream activation of a yeast gene // Nature. 1984. V. 314. P. 612-615.

8. Brent R., Ptashne M. A eukaryotic transcriptional activator bearing the DNA specificity of a prokaryotic repressor // Cell. 1985. V.43. P. 729-736.

9. Bryk, R., Griffin P., Nathan C. Peroxynitrite reductase activity of bacterial peroxiredoxins // Nature. 2000. V. 407. P. 211-215.

10. Budanov A.V., Sablina A.A., Feinstein E., Koonin E.V., Chumakov P.M. Regeneration of peroxiredoxins by p53-regulated sestrins, homologs of bacterial AhpD // Science. 2004. V. 304. P. 596-600.

11. Butterfield L.H., Merino A., Golub S.H., Shau H. From cytoprotection to tumor suppression: the multifactorial role of peroxiredoxins // Antioxid.Redox.Signal. 1999. V. 1. N. 4. P. 385-402.

12. Cha M-K., Hong S-K., Oh Y-M., Kim I-H. The protein interaction of Saccharomyces cerevisiae cytoplasmic thiol peroxidase II with SFH2p and its in vivo function // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. N. 37. P. 34952-34958.

13. Cha M.K., Yun C.H., Kim I.H. Interaction of human thiol-specific antioxidant protein 1 with erythrocyte plasma membrane // Biochemistry. 2000. V. 39. N. 23. P. 6944-6950.

14. Chae H. Z., Uhm Т. В., Rhee S. G. Dimerization of thiol-specific antioxidant and the essential role of cysteine 47 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994 a. V. 91. P. 7022-7026.

15. Chang J.W., Jeon H.B., Jeung H.L., Yoo J.S., Chun J.S., Kim J.H., Yoo Y.J. Augmented expression of peroxiredoxin 1 in lung cancer // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. V. 289 N. 2. P. 507-512.

16. Chauhan, R. and Mande, S.C. Characterization of the Mycobacterium tuberculosis H37Rv alkyl hydroperoxidase AhpC points to the importance of ionic interactions in oligomerization and activity // Biochem. J. 2001. V. 354. P. 209215.

17. Chen J.W., Dodia C., Ferinstein S.I., Jain M.K., Fisher A.B.l-Cys peroxiredoxin, a bifunctional enzyme with glutathione peroxidase and phospholipase A2 activities // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 28421-28427.

18. Chien C.T., Bartel P.L, Sternglanz R., Fields S. The two-hybrid system: a method to identify and clone genes for proteins that interact with a protein of interest// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 1991. V. 88. P. 9578-9582.

19. Choi H.J., Kang S.W., Yang C.H., Rhee S.G., Ryu S.R. Crystal structure of a novel human peroxidase enzyme at 2,0 A resolution // Nat. Struct. Biol. 1998. V. 5. P. 400-406.

20. Cumming R.C., Andon N.L., Haynes P.A., Park M., Fischer W.H., Schubert D. Protein disulfide bond formation in the cytoplasm during oxidative stress // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. N. 21. P. 21749-21758.

21. Curran T, Franza B.R. Jr. Fos and Jun: the AP-1 connection // Cell. 1988 V. 55. N. 3. P. 395-397.

22. Demarchi F., Schneider C. The calpain system as a modulator of stress/damage response // Cell Cycle. 2007. V.6. N. 2. P. 136-138.

23. Ebina Y., Takahara Y., Kishi F., Nakazava A. LexA protein is a repressor of colicin El gene // J.Biol.Chem. 1983. V. 258. P. 13258-13261.

24. Estojak J., Brent R., Golemis E.A. Correlation of two-hybrid affinity data with in vitro measurements // Mol.Cell Biol. 1995. V. 15. P. 5820-5829.

25. Fields S., Song O.K. A novel genetic system to detect protein-protein interactions //Nature. 1989. V.340. P.245-246.

26. Fields S., Sternglanz R. The two-hybrid system: an assay for protein-protein interactions // Trends Genet. 1994. V.10. P. 286-292.

27. Fisher A.B., Dodia C., Manevich Y., Chen J.W., Feinstein S.I. Phospholipids hydroperoxides are substrates for non-selenum glutathione peroxidase // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 21326-21334.

28. Flohe L., Budde H., Hofmann B. Peroxiredoxins in antioxidant defense and redox regulation // Biofactors. 2003. V. 19. P. 3-10.

29. Fraser H.B., Hirsh A.E., Steinmetz L.M. Scharfe C., Feldman M.W. Evolutionary rate in the protein interaction network // Nature. 2002. V. 296. N. 5568. P. 750-752.

30. Fujii Т., Fujii J., Taniguchi N. Augmented expression of peroxiredoxin 6 in rat lung and kidney after birth implies an antioxidative role // Eur. J. Biochem. 2001. V. 268. P. 218-225.

31. Glenney J.R., Weber K. Detection of calmodulin-binding polypeptides1ЛСseparated in SDS-polyacrylamide gels by sensitive I calmodulin gel overlay assay//Meth. Enzymol. 1993. V. 102. P. 204-210.

32. Hall R.A. Studying protein-protein interactions via blot overlay or far western blot. Protein-protein interactions: methods and protocols. Humana Press Inc., Totowa, NJ. 2004. Vol. 261.

33. Hool L.S., Соггу В. Redox control of calcium channels: From mechanisms to therapeutic opportunities // Antioxidants and Redox Signaling. 2007. V.9. N. 4. P. 409-435.

34. Hubbard S.J., Argos P. Cavities and packing at protein interfaces // Protein Sci. 1994. V.3. P. 2194-2206.

35. Hybrid Hunter. A two-hybrid system for analysis of protein-protein interactions in the yeast, Saccharomyces cerevisidae. Instruction manual. Invitrogen. Version E. 2003.

36. Jacobson F. S., Morgan R. W., Christman M. F., Ames B. N. An alkyl hydroperoxide reductase from Salmonella typhimurium involved in the defense of DNA against oxidative damage. Purification and properties // J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 1488-1496.

37. Janin J., Chotia C. The structure of protein-protein recognition sites // J. Biol. Chem. 1990. V. 265. P. 16027-16030.

38. Jin D.Y., Chae H.Z., Rhee S.G., Jeang K.T. Regulatory role for a novel human thioredoxin peroxidase in NF-kappaB activation // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. N. 49. P. 30952-30961.

39. Jones S., Thornton J.M. Principles of protein-protein interactions // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 13-20.

40. Kajkowski E.M., Price L.A., Pausch M.H., Young K.H., Ozenberger B.A. Investigation of growth hormone releasing hormone receptor structure and activityusing yeast expression technologies // J.Recept.Signal.Transduct.Res. 1997. V. 17. P. 293-303.

41. Kang S.W., Baines I.C., Rhee S.G. Characterization of a mammalian peroxiredoxin that contains one conserved cysteine // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. N. 11. P. 6303-6311.

42. Karihtala P., Mantyniemi A., Kang S.W., Kinnula V.L., Soini Y. Peroxiredoxins in breast carcinoma // Clin. Cancer. Res. 2003. V. 9. N. 9. P. 34183424.

43. Kearns B.G., McGee T.P., Mayinger P., Gedvilaite A., Phillips S.E., Kagiwada S., Bankaitis V.A. Essential role of diacylglycerol in protein transport from the yeast Golgi complex //Nature. 1997. N. 387. P. 101-105.

44. Kim K., Kim I.H., Lee K.Y., Rhee S.G., Stadtman E.R. The isolation and purification of specific "protector" protein which inhibits enzyme inactivation by a thiol/Fe(III)/02 mixed-function oxidation system // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 4704-4711.

45. Kim K., Rhee S. G., Stadtman E. R. Nonenzymatic cleavage of proteins by reactive oxygen species generated by dithiothreitol and iron // J. Biol. Chem. 1985. V. 260. P. 15394-15397.

46. Kitano K., Niimura Y., Nishiyama Y., Miki K. Stimulation of peroxidase activity by decamerization related to ionic strength: AhpC protein from Amphibacillus xylanus // J. Biochem. (Tokyo). 1999. V. 126. P. 313-319.

47. Koo K.H. Lee S., Jeong S.Y., Kim E.T., Kim K., Song K., Chae H.Z. Regulation of thioredoxin peroxidase activity by C-terminal truncation // Arch. Biochem. Biophys. 2002. V. 397. P. 312-318.

48. Kristensen P., Rasmussen D.E., Kristensen B.I. Properties of thiol-specific anti-oxidant protein or calpromotin in solution // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. V. 262. P. 127-131.

49. Kusner D.J., Barton J.A., Qin C., Wang X., Iyer S.S. Evolutionary conservation of physical and functional interactions between phospholipase D and actin// Arch. Biochem. Biophys. 2003. V. 412. P. 231-241.

50. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.

51. Lee K., Park J.S., Kim Y.J., Soo Lee Y.S., Sook Hwang T.S., Kim D.J. Differential expression of Prxl and 2 in mouse testis and their upregulation by radiation // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. V. 296. N. 2. P. 337-342.

52. Lee S.P., Hwang Y.S., Kim Y.J., Kwon K.S., Kim H.J., Kim K., Chae H.Z. Cyclophilin A binds to peroxiredoxins and activate its peroxidase activity // JBC. 2001. V. 276. N. 32. P. 29826-29832

53. Li В., Ishii Т., Tan C.P., Soh J.W., Goff S.P. Pathways of induction of peroxiredoxin 1 expression in osteoblasts // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. N. 14. P. 12418-12422.

54. Logan, C. and Mayhew, S.G. Cloning, over-expression and characterization of peroxiredoxin and NADH-peroxiredoxin reductase from Thermus aquaticus YT-1 // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 30019-30028.

55. Manevich Y., Feinstein S.I., Fisher A.B. Activation of the antioxidant enzyme 1-Cys peroxiredoxin requires glutationilation mediated by heteromerisation with 7iGST // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. P. 3780-3785.

56. McCoy A.J., Chandana E.V., Colman P.M. Electrostatic complementarity at protein/protein interfaces // J. Mol. Biol. 1997. V. 268. P. 570-584.

57. Motohashi K., Kondoh A., Stumpp M.T., Hisaboru T. Comprehensive survey of proteins targeted by chloroplast thioredoxin // Proc. Natl. Acad. Sci. 2001. V. 98. N. 20. P. 11224-11229.

58. Mukhopadhyay S.S., Leung K.S., Hicks M.J. Hustings P.J., Youssoufian H., Plon S.E. Defective mitochondrial peroxiredoxin-3 results in sensitivity to oxidative stress in Fanconi anemia // J. Cell Biol. 2006. V. 175. N. 2. P. 225-235.

59. Nickel W. Unconventional secretory routes: direct protein export across the plasma membrane of mammalian cells // Traffic. 2005. V.6. P. 607-614.

60. Nixon R.A. The calpains in aging and aging-rellated diseases // Aging Res. Rev. 2003. V. 2. N. 4. P. 407-418.

61. Nogoceke E., Gommel D.U., Kiess M., Kalisz H.M., Flohe L. A unique cascade of oxidoreductases catalyses trypanothione-mediated peroxide metabolism in Crithidia fasciculate // J. Biol. Chem. 1997. V. 378. P. 827-836.

62. Noguera-Mazon V., Krimm I., Walker O., Lancelin J.M. Protein-protein interactions within peroxiredoxin systems // Photosunth. Res. 2006. V. 89. P. 277290.

63. O'Farrell P.H. High resolution two-dimensional electrohoresis of proteins // J. Biol.Chem. 1975. V. 250. N. 10. P. 4007-4021.

64. Park S.G., Cha M.K., Jeong W., Kim I.H. Distinct physiological functions of thiol peroxidase isoenzymes in Saccharomyces cerevisiae // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 5723-5732.

65. Pedrajas J.R., Miranda-Vizuete A., Javanmardy N., Gustafsson J.A., Spyrou G. Mitochondria of Saccharomyces cerevisiae contain one-conserved cysteine type peroxiredoxin with thioredoxin peroxidase activity // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 16296-16301.

66. Pei Z., Yang L., Williamson J.R. Phospholipase C-yl binds to actin-cytoskeleton via its terminal SH2 domein in vitro // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. V. 228. P. 802-806.

67. Peshenko I.V., Novoselov V.I., Evdokimov V.A., Nikolaev Yu.V., Shuvaeva T.M., Lipkin V.M., Fesenko E.E. Novel 28-kDa secretory protein from rat olfactory epithelium // FEBS Lett. 1996. V.381. P. 12-14.

68. Peshenko I.V., Shichi H. Oxidation of active center cysteine of bovine 1-Cys peroxiredoxin to the cysteine sulfenic acid form by peroxide and peroxinitrate // Free Rad. Biol. Med. 2001. V. 313. N. 3. P. 292-303.

69. Phizicky E.M., Fields S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis // Microbiol. Rev. 1995. V. 59. N. 1. P. 94-123.

70. Phizicky E., Bastiaens P.I., Zhu H. et al. Protein analysis on a proteomic scale //Nature. 2003. V. 422. № 6928. P. 208-215.

71. Plishker G.A., Chevalier D., Seinsoth L., Moore R.B. Calcium-activated potassium transport and high molecular weight forms of calpromotin // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 21839-21843.

72. Poglazov B.F., Livanova N.B. Interaction of actin with the enzymes of carbohydrate metabolism // Adv. Enz. Reg. 1986. V. 25. P. 297-305.

73. Radyuk S.N., Klichko V.I., Spinola В., Sohal R.S., Orr W.C. The peroxiredoxin gene family in Drosophila melanogaster // Free Rad. Biol. Med. 2001.V. 31. N. 9. P. 1090-1100.

74. Ralat L.A., Manevich Y., Fisher A.B., Colman R.F. Direct evidence for the formation of a complex between 1-Cys peroxiredoxin and gltation S-transferase я with activity changes in both enzymes // Biochem. 2006. V. 45. P. 360-372.

75. Rand J.D., Grant C.M. The thioredoxin system protects ribosomes against stress-induced aggregation // Mol.Biol.Cell. 2006. V. 17. N. 1. P. 387-401.

76. Ray S.K., Fidan M., Nowak M.W. Wilford G.G., Hogan E.L., Banik N.L. Oxidative stress and Ca influx upregulate calpain and induce apoptosis in PC 12 cells // Brain Research. 2000. V. 852. N. 2. P. 326-334.

77. Rhee S.G., Bae Y.S., Lee S.-R., Kwon J. Hydrogen peroxide: a key messenger that modulates protein phosphorylation through cysteine oxidation // Sci. STKE 2000. V. 53. P. 1-6.

78. Rhee S.G., Chae H.Z., Kim K. Peroxiredoxins: a historical overview and speculative preview of novel mechanisms and emerging concepts in cell signaling //Free Rad. Biol. Med. 2005. V. 38. P. 1543-1552.

79. Royer Catherine. Protein-protein interactions // Biophysics textbook online. 2004. (www.biophysics.org/education/topics.htm)

80. Saido T.C., Sorimachi H., Suzuki K. Calpain: new perspectives in molecular diversity and physiological-pathological involvement // FASEB J. 1994. V. 8. P. 814-822.

81. Saito K., Hamos J.E., Nixon R.A. Widespread activation of calcium-activated neutral proteinase (calpain) in the brain in Alzheimer's disease: a potentialmolecular basis for neuronal degeneration // Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 1993. V. 90. P. 2628-2632.

82. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1993. P.

83. Sasaki M., Kunimatsu M., Tada T. Nishimura J., Ma X.J., Ohkubo I.,. Calpain and kininogen mediated inflammation // Biomed.Biochim.Acta. 1991. V. 50. P. 499-508.

84. Schroder E., Littlechild J.A., Lebedev A.A., Errington N., Vagin A.A., Isupov M.N. Crystal structure of decameric 2-Cys peroxiredoxin from human erythrocytes at 1.7 A resolution // Structure. 2000. V. 8. P. 605-615.

85. Schroder E., Willis A.C., Ponting C.P. Porcine natural-killer-enhancing factor-B: oligomerisation and identification as a calpain substrate in vitro // Biochim. Biophys. Acta. 1998. V. 1383. N. 2. P. 279-291.

86. Seo M.-S., Kim J. K., Lim Y. Kang S.W., Cho Y.J., Lee W.K., Kim H.J., Cho K.K., Lee K.H., Rhee S.G. Rapid degradation of Prxl and PrxII induced by silica in Rat2 cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. V. 265. P. 541-544.

87. Serebriiskii I.G., Khazak V., Golemis E.A. Redefinition of the yeast two-hybrid system in dialogue with changing priorities in biological research // BioTechniques. 2001. V.30. P. 634-655.

88. Siders W.M., Klimovitz J.C., Mizel S.B. Characterization of the structural requirements and cell type specificity of IL-1 alpha and IL-1 beta secretion // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. N. 29. P. 22170-22174.

89. Sirokmany G., Szidonya L., Kaldi K., Gaboric Z., Ligeti E., Geiszt M. Sec 14 homology domain targets p50RhoGAP to endosomes and provies a link between Rab and Rho GTPases // J. Biol. Chem. 2006. V. 281. N. 9. P. 6096-6105.

90. Smith G.P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface // Science. 1985. V. 228. P. 1315-1317.

91. Smith I.J., Dodd S.L. Calpain activation causes a proteasome-dependent increase in protein degradation and inhibits the Akt signaling pathway in rat diaphragm muscle // Exp. Physiol. 2007. V. 92. N. 3. P. 561-573.

92. Tamura M., Kai Т., Tsunawaki S., Lambeth J.D., Kameda K. Direct interaction of actin with p47(phox) of neutrophil NADPH Oxidase // Biochim. Biophys. Res. Commun. 2000. V. 276. P. 1186-1190.

93. Tsai C.J., Lin S.L., Wolfson H.J., Nissinov R. Studies of protein-protein interfaces: a statistical analysis of hydrophobic effect // Protein Sci. 1997. V. 6. P. 53-64.

94. Uetz P., Vollert C.S. Protein-protein interactions // ERGPMM. 2006. Springer Verlag. Part 16. P. 1548-1552.

95. Van Criekinge W., Beyaert R. Yeast two-hybrid: state of the art // Biological Procedures Online. 1999. V.2. N.l. P. 1-38.

96. Van Straaten H.W., He Y., Van Duist M.M., Labuyere W.T., Vermeulen J.L., Van Dijk P.J., Ruijter J.M., Lamers W.H., Hakvoort T.B. Cellular concentrations of glutamine synthetase in murine organs // Biochem. Cell Biol. 2006. V. 84. N. 2. P. 215-231.

97. Veselovsky A.V., Ivanov Yu.D., Ivanov A.S., Archakov A.I., Lewi P., Janssen P.J. Protein-protein interactions: mechanisms and modification by drugs // J. Mol. Recognit. 2002. V. 15. P. 405-422.

98. Wang Y., Phelan S.A., Manevich Y., Feinstein S.I., Fisher A.B. Transgenic mice overexpressing peroxiredoxin 6 show increased resistance to lung injury in hyperoxia//Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2006. V. 34. N. 4. P. 481-486.

99. Watabe, S., Kohno H., Kouyama H., Hiroi Т., Yago N., Nakazawa T. Purification and characterization of a substrate protein for mitochondrial ATP-dependent protease in bovine adrenal cortex // J. Biochem. (Tokyo). 1994. V. 115. P. 648-654.

100. Weber H., Huhns S., Luthen F. Jonas L., Schuff-Werner P. Calpain activation contributes to oxidative stress-induced pancreatic acinar cell injury // Biochem. Pharmacol. 2005. V.70. N. 8. P. 1241-1252.

101. Wells J.A. Binding in the growth hormone receptor complex // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 1-6.

102. Wen L., Huang H.M., Juang R.H., Lin C.T. Biochemical characterization of 1-Cys peroxiredoxin from Antrodia camphorata // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007. V. 73. N. 6. P. 1314-1322.

103. Wen S.T., Van Etten R.A. The PAG gene product, a stress-induced protein with antioxidant properties, is an Abl SH3-binding protein and a physiological inhibitor of c-Abl tyrosine kinase activity // Genes Dev. 1997. V. 11. P. 24562467.

104. West R.W.Jr., Yoccum R.R., Ptashne M. Saccharomyces cerevisidae GAL1-GAL10 divergent promotor region: location and function of the upstream activating sequence UASC//Mol.Cell.Biol. 1984. P.2467-2478.

105. Wilson I.A., Stanfield R.L. Antibody-antigen interactions // Curr. Opin. Struc. Biol. 1993. V.3.P. 113-118.

106. Wood, Z.A., Poole L.B., Hantgan R.R., Karplus P.A. Dimers to doughnuts: redox-sensitive oligomerization of 2-cysteine peroxiredoxins // Biochemistry. 2002. V.41.P. 5493-5504.

107. Wood Z.A., Schroder E., Harris J.R., Poole L.B. Structure, mechanism and regulation of peroxiredoxins // Tren. Biochem. Sci. 2003. V. 28.1. P. 32-39.

108. Wu Y.Z., Manevich Y., Baldvin J.L., Dodia C., Yu K., Feinstein S.I. Integration of surfactant protein A with peroxiredoxin 6 regulates phospholipase A2 activity // J. Biol. Chem. 2006. V. 281. N.l 1. P. 7515-7525.

109. Xu D., Tsai C.J., Nissinov R. Hydrogen bonds and salt bridges across protein-protein interfaces // Protein Eng. 1997. V. 10. P. 999-1012.

110. Young K.H., Ozenberger B.A. Investigation of ligand binding to members of the cytokine receptor family within a microbial system // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1995. V. 766. P. 279-281.

111. Zhou F., Galan J., Geahlen R.L., Tao W.A. A novel quantative proteomics strategy to study phosphorilation-dependent peptide-protein interactions // J. Prot. Res. 2007. V. 6. P. 133-140.