Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Хлоридные клетки жаберного эпителия в онтогенезе тихоокеанских лососей и механизмы осморегуляции в средах различной солености

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Хлоридные клетки жаберного эпителия в онтогенезе тихоокеанских лососей и механизмы осморегуляции в средах различной солености"

- 8 &ЕЛ 497

На правах рукописи

СЕРКОВ , Вадим Михайлович

ХЛОРИДНЫЕ КЛЕТКИ ЖАБЕРНОГО ЭПИТЕЛИЯ В ОНТОГЕНЕЗЕ ТИХООКЕАНСКИХ ЛОСОСЕЙ И МЕХАНИЗМЫ ОСМОРЕГУЛЯЦИИ В СРЕДАХ РАЗЛИЧНОЙ СОЛЕНОСТИ

03.00.13 - физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток 1997

Работа выполнена в Лаборатории физиологии рыб Института биологии моря ДВО РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук

A.A. Максимович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Ю.С. Хотимченко, кандидат биологических наук Н.П. Токмакова

Ведущее учреждение - Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова

Защита диссертации состоится 19 года

в_час. на заседании диссертационного совета К 003.66.02

при Институте биологии моря ДВО РАН по адресу: 690041, Владивосток, ул. Пальчевского, 17. Тел.: (4232)310-905.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии моря ДВО РАН.

Автореферат разослан "£f" ^^ 1997 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, доктор биологических наук

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Для тихоокеанских лососей, которые относятся к типичным проходным рыбам, миграция из реки в море и обратно является физиологической нормой. Успех подобного перехода имеет огромное значение не только для индивидуумов, но и для выживания вида в целом. В ходе анадромных и катадромных миграций лососи несколько раз в течение жизни меняют среду обитания. Наиболее значимым фактором при атом является изменение солености воды. В настоящее время в связи с возрастанием интереса к адаптационным механизмам в условиях меняющейся окружающей среды появилась необходимость более детального изучения важнейших этапов онтогенеза лососей, таких как покатная (катадромная) и нерестовая (анадромная) миграции. Успешная адаптация к смене солености среды достигается главным образом благодаря эффективной работе осморегулирующей системы рыб (Наточин, Лаврова, 1984). Среди осморегулирующих органов весьма важное значение имеют хлоридные клетки жаберного эпителия, ответственные за поддержание стабильной концентрации преимущественно одновалентных, а также некоторых двухвалентных ионов в тканях теяа (Fenwick, 1989; Perry et al., 1992a; Flik et al., 1993; Jures, Bastrop, 1995; Максимович, Загальская, 1997). Функциональные изменения этих клеток, отражающие перестройку осморегулирующей системы в целом, однозначно характеризуются динамикой концентрации ионов в плазме крови.

Несмотря на глубокую и детальную проработку отдельных вопросов физиологии и биохимии лососей, многие даже весьма общие проблемы до сих пор остаются мало изученными. Огромный интерес представляет выяснение сути императивного (повелительного) стимула, под влиянием которого проходные рыбы меняют среду обитания. Наши результаты показывают, что этим стимулом, вероятно, является изменение концентрации осмотически активных веществ в организме рыб (Серков, 1996). Снижение уровня некоторых ионов (в первую очередь натрия) вынуждает пресноводную молодь лососей мигрировать в морскую воду, а повышение этого уровня у взрослых рыб стимулирует их заход в реки.

В последние годы появилось немало работ, посвященных ультраструктуре и функции осморегулирующих органов рыб в норме и при различных экспериментальных воздействиях. Углубились исследования ионной регуляции молоди лососевых и анадромных производителей (Варнавекий, 1990; Pisam, Rembourg, 1991; Наточин и др., 1992, 1993; Brauer et al., 1992; Marsha!! et al., 1992; Chernitsky et al., 1993; Flik, Verbost, 1993; Flik et al., 1993; Максимович, Серков, 1994, а,б,в; Pisam et al., 1995; Серков, 1996). Однако весьма мало работ, описывающих перестройки осморегулирующих органов в результате естественной перемены солености среды и связь ультраструктурных изменений с физиологическими характеристиками. Кроме того, практически не изученным остается

вопрос о видовых особенностях хлоридных клеток жаберного эпителия. Всестороннее исследование морфо-функциональных особенностей хлоридных клеток у проходных костистых рыб, изучение ульграструктуры этих клеток у рыб с различной экологией расширят представления о механизмах адаптации костистых рыб к меняющимся условиям среды.

Цель и задачи работы. Целью исследования являлось изучение изменения ультраструктуры и функции хлоридных клеток жаберного эпителия в онтогенезе проходных костистых рыб, а также сравнительный анализ физиологической активности этих клеток у пресноводных рыб с различной экологией.

Основные задачи работы заключались в следующем:

1. Изучить динамику ультраструктурных изменений хлоридных клеток жаберного эпителия тихоокеанских лососей в процессе смолтификации и ската в море, а также в ходе нерестовой миграции.

2. Проследить развитие способности к гипоосмотической регуляции у молоди лососей и жилых форм.

3. Исследовать динамику концентрации ионов натрия и некоторых других электролитов плазмы крови в онтогенезе тихоокеанских лососей.

4. Выполнить сравнительный анализ физиологической активности хлоридных клеток у пресноводных рыб с различной экологией.

Научная новизна и теоретическое значение работы. Дано подробное описание ультраструктурных и функциональных изменений хлоридных клеток жаберного эпителия в онтогенезе тихоокеанских лососей. Показан преадаптивный характер этих изменений у молоди лососей в процессе смолтификации и у взрослых рыб перед миграцией в реки.

г

Впервые сделан стереологический анализ ультраструктуры хлоридных клеток на разных стадиях жизненного цикла лососей.

Предложена концепция императивного стимула, под влиянием которого проходные рыбы меняют среду обитания. В связи с тем, что молодь лососей испытывает потерю солей из тканей тела еще до своей миграции в море, гипоосмотический стресс является повелительным механизмом, вынуждающим рыб мигрировать в море. Аналогичный механизм работает на заключительном этапе морского периода нерестовой миграции лососей. Концентрация электролитов в тканях тела рыб, находящихся в море недалеко от своих'родных рек, возрастает до верхней границы нормы реакции. Гиперосмотический стресс является стимулом, который побуждает взрослых рыб к переходу в пресную воду. В основе предлагаемой концепции лежит обобщение собственных и литературных данных об условиях миграции, миграционном поведении и физиологическом состоянии лососей на разных этапах их онтогенеза.

Впервые сделан детальный сравнительный анализ структуры хлоридных клеток жаберного эпителия у пяти пресноводных видов рыб, обитающих в одном водоеме, но

ведущих различный образ жизни. Полученные результаты позволяют прийти к выводу, что экологические особенности видов влияют на интенсивность ионного обмена рыб и отражаются на структурной организации хлоридных клеток жаберного эпителия.

Практическое значение работы. В настоящее время в связи с приближением мирового промысла лососей к предельно допустимым для их нормального воспроизводства значениям повысились требования к качеству заводского разведения и подращивания молоди. Данное обстоятельство обусловливает необходимость более детального изучения биологии промысловых ендов и особенно ранних этапов онтогенеза, охватываемых рыбоводным процессом.

Ключевым моментом раннего онтогенеза тихоокеанских лососей является переход молоди из пресных водоемов в море доя нагула. Именно в это время гибнет более 90% заводской молоди. Миграции молоди лососей из реки в море предшествует длительная внутренняя перестройка организма (смолтификация). У дикой и заводской молоди этот процесс завершается в разные сроки. Правильно определив степень завершения смолтификации и своевременно выпустив молодь можно значительно увеличить коэффициент возврата.

Малый коэффициент возврата, как правило, обусловлен не только объективными причинами (низкая температура воды, плохое качество кормов, недостатки проекта или строительства), но и субъективными факторами. В частности, отсталой биотехнологией рыборазведения. В практике отечественных рыбоводных заводов распространен выпуск в естественную среду молоди при достижении ею определенной массы тела, либо в определенные сроки без учета ее физиологического состояния. Это имеет негативные последствия, чрезвычайно снижая коэффициент возврата. Причиной гибели чаще всего бывает преждевременный выпуск, который приводит к длительной задержке большого количества мальков в бедной кормами реке. Ранний морской период также является критическим в жизненном цикле лососей и определяет формирование численности поколения. Поэтому задержка выпуска не менее вредна, так как в организме рыб развиваются изменения, снижающие успех адаптации к морской воде.

Многие ученые (Глубоковский, 1989; Марковцев, 1989; Рухлов, 1989; Варнавский, 1990) отмечают необходимость разработки простого доступного для рыбоводов метода оценки качества молоди и степени завершения смолтификации, дающего однозначные результаты. Наши исследования показали, что этим требованиям в значительной степени соответствует определение момента "включения" питьевого рефлекса (как известно, морские рыбы пьют окружающую их воду, а пресноводные - нет). Физиологически готовая к миграции молодь лососей после пересадки в морскую воду начинает пить через несколько минут после переноса, тогда как рыбы не готовые к адаптации начинают пить морскую воду только через несколько часов после переноса.

Кроме того, физиологическое состояние молоди характеризуется на основании анализа электролитного состава крови в ходе тестов на солевую устойчивость. Наши исследования показали, что сезонное наблюдение за динамикой концентрации ионов натрия в крови рыб также позволяет точно определить оптимальные сроки выпуска рыб.

Таким образом, исследования процесса смолтификации имеют не только теоретический интерес, но и практическое значение. Результаты данной работы могут быть использованы: I) для разработки критериев оценки качества заводской молоди с целью определения вероятного процента возврата рыб и, следовательно, эффективности работы конкретных рыбоводных заводов; 2) для получения экспресс-информации о степени готовности рыб к переходу в морскую воду и успешной адаптации к ней с целью определения оптимального срока выпуска молоди в природную среду; 3) для определения эффективности тех или иных биотехнологических приемов, используемых или внедряемых в рыбоводную практику.

Апробация работы. Основные положения диссертации представлялись и обсуждались на Международной симпозиуме по марикультуре (Краснодар, 1995), на конференции молодых ученых ТИНРО (Владивосток, 1992), на ежегодных конференциях ИБМ и межлабораторных семинарах.

Публикации: По теме диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа общим объемом 120 страниц машинописного текста содержит 8 таблиц и 45 рисунков, в том числе 3 светооптических и 31 электронно-микроскопических фотографии. Список литературы включает 136 названий, в том числе 90 иностранных.

Материалы и методы исследований. В работе были использованы представители трех видов тихоокеанских лососей рода Oacorhynchus - горбуши О. gorbuscha, кеты О. keta и симы О. masou, находившиеся на разных стадиях онтогенеза, а также половозрелые особи пяти пресноводных видов рыб: налим Lota lota, щука Esox lados, плотва Rutilas rutilas, пелядь Coregonuspcledи сиг Coregonus lavaretuspudschian.

Ультраструхтурные изменения хлорида ых клеток (ХК) жаберного эпителия молоди тихоокеанских лососей во время смолтификации и естественного перехода в море изучали на примере дикой молоди горбуши. Личинок горбуши отбирали из нерестовых бугров, мальков того же вида отлавливали во время покатной миграции в реке и в море у побережья.

Сезонная динамика концентрации ионов натрия в крови у молоди лососей в речной период жизни и развитие способности к гипоосмотической регуляции в ходе процесса смолтификации были исследованы на примере молоди симы. Диких двух- и трехлеток

снмы отлавливали сачком, а во время ската ловушкой в р. Барабашевка (южное Приморье). С целью исключения влияния стресса, вызванного отловом рыб и их транспортировкой, на результаты эксперимента, молодь выдерживали в течение трех дней в бассейнах с проточной водой, поступавшей из реки, т.е. при гидрохимическом режиме, максимально приближенном к природному. Накануне и во время ската использовали рыб с внешними признаками смолтификации. Этих рыб мы назвали серебрянками, а остальных - пестрятками. Немигрируюгцую молодь отлавливали сачком, а мигрантов собирали ловушкой. Содержание натрия в крови у пресноводной молоди определяли с февраля по декабрь. Эксперименты по прямому переводу молоди в морскую воду (28%о) проводили ежемесячно с февраля по август. Уровень натрия в крови определяли через 24, 48 и 72 ч после перевода в морскую воду, а в нескольких случаях дополнительно через 1,6 и 12 ч. В каждой точке эксперимента использовали от 5 до 10 особей. Всего было использовано 295 экземпляра молоди симы.

Функциональная морфология ХК лососей во время нерестовой миграции была исследована на примере горбуши и проиллюстрирована данными по изменению концентрации ионов в сыворотке крови у горбуши и симы. Горбуша была отловлена в море у юго-восточного побережья Сахалина и в р. Еахура. Вследствие малого стока воды из этой реки достигается резкий перепад солености воды на пути миграции рыб из моря в реку (табл. 1). Соленость воды в море в зоне отлова составляла 32%>,

Табл. 1. Характеристики воды из мест сбора материала.

Место взятия проб Осмоляльность, моем/юг НЮ Концентрация электролитов, ммоль/л

натрий калий кальций магний

Море перед устьем 939,0 424,0 5,2 9,6 42,0

Устье р. Бахуры • 5,0 3,5 0,3 2,5 0,6

Горбушу, входящую из моря в реку, отлавливали с помощью сачков и установленных в русле реки садков с открытой передней стенкой. У первой группы рыб кровь д ля анализа и кусочки тканей для фиксации брали сразу после их захода в пресную воду. Вторую группу помещали в садки и выдерживали в речной воде в течение б суток. Садки с рыбами третьей группы выдерживали в речной воде в течение 24 часов, затем переносили рыб в садок, установленный в море, и брали кровь и ткань через 24 часа после переноса. Всего в работе использовали 76 особей обоего пола.

Эксперимент по переносу в морскую воду карликовых самцов симы проводили с рыбами массой 10-12 г, имеющими третью стадию зрелости гонад. ХК анализировали через четверо суток после переноса рыб в морскую воду.

Видовые морфо-функциокальные особенности ХК были изучены на примере пресноводных видов с различной экологией - налима, щуки, плотвы, пеляди и сига. Материал был собран в июне 1993 г. в Вилюйском водохранилище (Якутия). Концентрация ионов натрия в воде составляла 0,15 ммоль/л.

Для электронно-микроскопических исследований фиксировали образцы тканей от четырех экземпляров разного пола в каждой точке эксперимента.

Концентрацию ионов натрия в сыворотке крови определяли методом фотометрии пламени на спектрофотометре ПФМ и на атомно-абсорбционном спектрофотометре Nippon Garral Ash, модель АА 855.

В работе использовали методы световой и электронной микроскопии. Для стереологического анализа при определении относительного объема органелл использовали морфометрическую решетку случайного шага (Стефанов, 1974), площадь поверхности органелл определяли с помощью тестовой системы коротких отрезков (Киселева и др., 1974). Измерения были сделаны на 10 микрофотографиях для каждого объекта с 5-10 повторениями.

Определение времени начала питья морской воды у молоди симы проводили по собственной методике. Пресноводных двухлеток симы в течение 3-4-х минут подвергали анестезии в 0,01% растворе анестетика MS-222. В пищеварительный тракт обездвиженных рыб через рот аккуратно вводили гибкий прозрачный капилляр с воронкообразным расширением на конце. Выходящий из анального отверстия капилляр перехватывали и вводили воронку в задний отдел желудка. Затем рыб возвращали в хорошо аэрируемый проточный пресноводный бассейн. Через несколько минут они возвращались к нормальному состоянию и обретали подвижность. Спустя 2-3 часа молодь симы с введенным в пищеварительный тракт капилляром переносили в морскую воду. Благодаря физическим законам вода не заполняет капилляр через его наружный конец. Но в морской среде рыба начинает пить окружающую ее воду, фона, лишенная возможности всасываться в кишечнике, поступает в капилляр и вытесняет из него воздух. Прозрачные стенки капилляра позволяют наблюдать этот процесс и регистрировать время начала питья.

Введение

Способность костистых рыб поддерживать постоянный состав внутренней среды позволяет им обитать как в пресной, так и в морской воде. При этом морские рыбы поддерживают содержание плазменных электролитов на уровне около 1/3 концентрации морской воды, а пресноводные рыбы имеют плазму крови в несколько сот раз более концентрированную, чем окружающая их среда. Покровы тела рыб не являются непреодолимым барьером для диффузии ионов и воды, и действие физических сил

пестрятка (ПВ)

. смолт (ПВ)

смолт (MB)

в»;1

-плотный контакт

----проницаемый

контакт

-Ь.

Рис. 1. Схема ультраструктурных изменений хлорцциых и вспомогательных клеток в жаберном эпителии атлантического лосося в процессе смолтификации. Слева показан срез, перпендикулярный поверхности эпителия (а), справа - схема развития межклеточных контактов в апикальной зоне клеток (Ь). ПВ - пресная вода, MB - морская вода, ХК -хлоридная клетка, Вс - вспомогательная клетка, Р - респираторная клетка, ВтЛ

- вторичная ламелша, м - митохондрии, т - тубулярная система, я - ядро, мв - везикулы, G -аппарат Гольджи, j - плотный межклеточный контакт, стрелками показаны высокопроннцаемые контакты. По Pisam et al., 1988.

направлено в пресной воде на деминерализацию и обводнение тканей, а в морской - на их обезвоживание и гиперминерализацию. Однако этого не происходит. Физиологические механизмы обеспечивают постоянство объема, осмотической концентрации, ионного состава и рН жидкостей внутренней среды у рыб, обитающих в столь различных по концентрации солей средах.

Среди осморегулирующих органов костистых рыб чрезвычайно важное значение имеют жабры. Жаберный эпителий содержит различные типы клеток (покровные, слизистые, хлоридные и др.), нз которых мы исследовали только зрелые хлоридные клетки.

Ионотранспортная функция ХК обусловлена особенностями их ультраструктуры. Как в пресной, так и в морской воде рыбы сталкиваются с проблемой транспорта ионов против градиента концентрации, что требует затрат энергии. Высокое количество митохондрий в ХК отличает их от прочих клеток жаберного эпителия. Распространенное в международной литературе второе название этих клеток - митохондриально-богатые клетки - весьма ярко отражает их структурные особенности. Митохондрии тесно связаны с тубулярной системой, обеспечивая энергией АТФ транспорт ионов.

Электронно-микроскопические исследования показали, что ХК обладают совершенно своеобразной, чрезвычайно развитой мембранной системой - тубулярным ретикулуыом. Мембраны тубулярной системы являются продолжением базолатеральных плазматических мембран ХК и служат местом локализации Иа^/ВС-АТФазы, которая является биохимической основой ионного транспорта.

Тихоокеанские лососи в своем жизненном цикле двазцды меняют среду обитания, каждый раз перестраивая соответствующим образом всю систему осморегуляции.

Ультраструктурные изменения хлоридных клеток жаберного эпителия наблюдаются у молоди тихоокеанских лососей еще в пресной воде незадолго до качала покатной миграции, при этом клетки приобретают особенности, характерные для морских рыб (рис 1). У производителей, мигрирующих к рекам для нереста также происходит предварительная перестройка ультраструктуры хлорвдных клеток. Предварительные изменения осморегулирующих органов имеют важное преадаптационкое значение для успешной миграции рыб.

Структура и функция хлоридных клеток жаберного эпителия в онтогенезе тихоокеанских лососей

При анализе ультраструктуры ХК у личинок горбуши, взятых из нерестовых бугров, не было найдено различий, характерных для большинства пресноводных рыб, описанных в литературе. Интенсивность метаболизма ХК личинок горбуши, физиологически соответствующих стадии пестрятки у молоди лососей с длительным

пресноводным периодом, была ниже, чем у смолтов и у молоди, скатившейся в море. Тубулярный ретикулум развит слабее, тубулы были узкие, мало ветвящиеся. Слабо развита и тубуло-везикулярная система, среди ее пузырьков не было электронно-плотных везикул, отделившихся от аппарата Гольджи. Слабее был развит и шероховатый эндоплазматический ретикулум. Количество митохондрий было меньше, а матрикс более светлый. Это говорит о том, что в обычной пресной воде снижены требования к транспорту ионов, вследствие чего невысок и уровень метаболизма ХК.

Горбуша является видом с кратким пресноводным периодом. Миграция мальков горбуши в море происходит практически сразу после выхода из нерестовых бугров. Поэтому в ее жизненном цикле отсутствует стадия пестрятки, характерная для видов лососевых, имеющих длительный пресноводный период. В частности, у молоди горбуши не развивается типичная для парр-молоди пятнистая окраска. Тем не менее говорить о том, что у горбуши выпадает стадия смолтификации, было бы неправильно. Исследование гистологического строения жаберного эпителия и ультраструктуры ХК показало, что молодь горбуши в период покагной миграции подвергалась тем же изменениям, что и другие лососи в период смолтификации.

Например, у покатников горбуши значительно увеличивалось количество ХК, которые пролиферировали не только в иежламеллярном районе, но появлялись и на вторичных ламеллах. При этом ХК образовывали многоклеточные комплексы, состоящие из нескольких зрелых и вспомогательных клеток, как это отмечалось у молоди, выловленной в море.

В отличие от большинства литературных данных мы обнаружили уменьшение числа ХК у молоди горбуши, скатившейся в море. Вероятно, в предмиграционный период происходит избыточное формирование этих клеток в жаберном эпителии, а в морской воде их количество снижается до оптимального. Но возможна и другая причина: вследствие интенсификации метаболизма ХК в морской воде, а следовательно, и сокращения продолжительности их жизни, скорость отмирания клеток может некоторое время опережать процессы регенерации. Не исключено, что в дальнейшем их количество вновь увеличивается и даже превышает уровень, характерный для смолтов, так как в литературе отмечается достоверное увеличение числа ХК в течение 5-6 недель после переноса смолтов атлантического лосося в морскую воду (Burton, Idler, 1984; Lubin et al., 1989).

Необходимо отметить, что у молоди горбуши в морской воде чаще встречались картины разных стадий физиологической гибели клеток, чем у смолтов в пресной воде. При этом наблюдался пикноз клеток и как следствие увеличение межклеточного пространства; клеточные тельца иногда приобретали вогнутую форму. Причем начальной стадией этого процесса было набухание тубулярной системы. Такие клетки, теряя межклеточные контакты, сяущиваются в окружающую среду либо поглощаются

макрофагами. Факт увеличения количества гибнущих клеток при адаптации организма к морской воде согласуется с литературными данными. Так, было отмечено 4-5-кратное увеличение количества апопготических (физиологически отмирающих) ХК у мозамбикской тнляпии в течение первых 3-х суток пребывания в морской воде ^еп(1е1ааг Во^а, Мец, 1989).

Ультраструктура ХК покатной молоди горбуши, а также смолтов горбуши из моря свидетельствует об интенсивном метаболизме этих клеток. Обилие микропузырьков и вакуолей в цитоплазме, мощное развитие тубулярной системы подтверждают высокую интенсивность удаления ионов из организма. К такому же выводу пришли Лубин с соавторами (ЬиЬт е1 а1., 1989), которые обнаружили корреляцию между интенсивностью развития тубулярной сети и возрастанием активности Ыа+/К+-АТФазы, которая локализуется на мембранах тубулярной системы и является молекулярной основой натриевого насоса. Секреция ионов облегчается наличием хлоридных комплексов. Как известно, через межклеточные пространства таких комплексов накопленные в тубулах ионы удаляются во внешнюю среду. Этому способствуют высокопроницаемые клеточные контакты, которые образуются между пальцевидными переплетающимися выростами хлоридных и вспомогательных клеток. Кроме того, углубление апикальной ямки увеличивает поверхность клеток, контактирующую с внешней средой. Некоторые сложные апикальные ямхи приобретают вид длинного извитого канальца.

Таким образом, среди изменений ультраструктуры ХК, сопровождающих процесс смолтификации и адаптацию к морской воде, наиболее характерными являются интенсивное развитие тубулярной системы, увеличение количества митохондрий, углубление апикальной ямки, развитие тубуловезикулярной системы в апикальной зоне клеток, повышение проницаемости межклеточных контактов. Возможно, эти изменения являются универсальными для всех эвригалинных рыб при адаптации к морской воде.

При анализе ультрасгрукгуры ХК горбуши из морской воды не было найдено отличий от нормальных признаков, характерных для этих клеток у других видов рыб. Ультраструктура ХК свидетельствовала об их интенсивном метаболизме. Обилие микропузырьков и цистерн в цитоплазме позволяет предполагать высокую интенсивность, выведения ионов из организма, которое облегчается наличием хлоридных комплексов. Как известно, через просветы между клетками, образующими такие комплексы, могут свободно удаляться ионы, накопленные в тубулах. Увеличению площади клеток, контактирующих с внешней средой, способствовали также сложные апикальные ямки.

При переходе горбуши из моря в реку возникало состояние физиологического стресса, сходное с описанным в литературе состоянием в первые минуты после переноса рыб из пресной воды в морскую. Об этом свидетельствовало временное прекращение

функции ядрышка, везикуляция ШЭР, увеличение числа лнзосом, расширение перинуклеарного пространства и межмембранного пространства митохондрий. Совпадение этих признаков при смене солености в обоих направлениях говорит об универсальности механизмов реакции на изменение солености окружающей среды в первые минуты стресса. Однако появлялись также и изменения, специфические для перехода из морской воды в пресную. В их числе удлинение и утончение тубул, уменьшение числа микропузырьков, отпочковавшихся от аппарата Гольджи, которые в морской воде заполняли слизью апикальную ямку.

Изменения, связанные с переходом к гиперосмотической регуляции, были наиболее выражены через 6 суток пребывания рыб в пресней воде. В этот период отчетливо наблюдалась ультраструктурная организация, характерная для ХК рыб из пресной воды. Округлое ядро, умеренно развитое ядрышко, более светлый, чем в морской период, матрикс митохондрий. Тубуляриая система была развита слабо, тубулы тонкие, узкие, мало ветвящиеся. В цитоплазме не наблюдалось электронноплотных пузырьков, отделившихся от аппарата Гольджи. ШЭР был развит слабо. Появлялись одиночные апикальные ямки без длинных микроворсинок, респираторные клетки частично прикрывали ХК. За счет сокращения площади апикальной мембраны и тубулярной системы уменьшилась общая площадь клеточной поверхности ХК. Данные изменения свидетельствуют о снижении уровня метаболизма ХК.

В эксперименте по переносу рыб обратно в морскую воду физиологический стресс намного превышал тот, который имел место при переходе лососей из моря в реку. В ядрах происходила резкая конденсация хроматина, что говорит о подавлении функции ядерного аппарата. Мембраны ШЭР приобретали везикулярное строение. Апикальные ямки, образованные несколькими ХК, были гипертрофированны и приобретали вид длинных извитых канальцев. Тубулы возвращались в состояние, характерное для рыб, живущих в море. Процессы внутриклеточного лизиса шли намного интенсивнее, чем при переходе горбуши из моря в реку, о чем свидетельствовало большое количество гибнущих клеток.

Эти изменения по своей направленности соответствуют тем, которые происходят при миграции рыб из пресной воды в морскую. Однако столь бурный характер изменений, которые мы наблюдали у горбуши, в литературе не описан.

Выше мы описали ультраструктуру ХК личинок горбуши из пресной воды, которая свидетельствовала об их умеренной осморегуляторной активности. Об этом же говорят и литературные данные, посвященные хпоридным клеткам пресноводных рыб. Однако не для всех пресноводных рыб характерна картина умеренного метаболизма ХК. В наших наблюдениях у карликовых самцов симы, выловленных в горном ручье с мягкой водой, количество ХК было столь большим, что они почти полностью покрывали вторичные ламеллы. Их ультраструктура свидетельствует о чрезвычайно высокой функциональной активности: множество митохондрий с плотно упакованными кристамн, тубулярная

система "суперпресноводного" типа. Следовательно, в мягкой, бедной ионами воде требования к сорбции ионов очень высоки, поэтому функциональная нагрузка на ХК, возможно, даже выше, чем в морской воде. Рыбы приспосабливаются к этим условиям в первую очередь за счет увеличения числа ХК.

Наши результаты согласуются сданными Авеллы и соавторов (Avella et al., 1987), которые обнаружили пролиферацию ХК на вторичных жаберных ламеллах форели в водах, бедных натрием. Кроме того, было показано, что такое увеличение количества клеток может являться следствием уменьшения содержания кальция в воде при неизменной концентрация других ионов (Perry, Wood, 1985). Следовательно, снижение концентрации даже одного из электролитов во внешней среде вызывает пролиферацию ХК на вторичных ламеллах. О повышении функциональной активности ХК форелей, адаптированных к деионизированной воде, свидетельствует и увеличение активности Na+/K+-AT<t>a3bi (Bornancin et al., 1987).

У карликов симы в пресной воде структура жаберного эпителия полностью соответствует таковой у форели, живущей в мягкой воде горных ручьев (Laurent et al., 1985). На ламеллах присутствует большое количество ХК, ультраструктура которых свидетельствует о более высокой активности, чем у ХК большинства пресноводных рыб. У карликовых самцов симы, перенесенных в морскую воду, присутствуют признаки мощного стресса, вызванного изменением осмотического давления и сходного с состоянием, описанным для стеногалинных пресноводных рыб при переносе в морскую воду (Pisam et al., 1990): бурный лизис цитоплазмы, набухание ядер и митохондрий, конденсация. хроматина, везикуляция ШЭР. Но есть изменения, специфические для перехода к гипоосмотической регуляция. Среди них - увеличение числа митохондрий, интенсивное развитие везикулярной системы с большим количеством элекгронноплотных пузырьков, которые переносят слизь в апикальную ямку. Наибрлее ярким различием в ультраструктуре ХК у экспериментальных карликов н молоди горбуши в морской воде было различное строение системы тубуя. У карликовых самцов симы после переноса в морскую воду тубулы оставались неизменными, а у горбуши они становились толстыми, сильно разветвленными, короткими, то есть типичными для морских рыб.

Наши эксперименты по пересадке в морскую воду карликовых самцов симы интересны тем, что эти рыбы самостоятельно не выходят в море, проводя весь жизненный цикл в реке. Но в результате мощного паводка они могут быть вынесены в море. Семенченко (1985) описал случай, когда после трехлетнего пребывания в реке самцы симы весной попали в море, но не погибли и после кратковременного периода морской жизни вместе с проходными особями вернулись в реку для размножения. В нашем эксперименте все карликовые самцы симы также выжили в морской воде и продолжали там жить в течение нескольких месяцев. В связи с этим представляло интерес выяснить, происходит

ли адаптация к морской воде у неотенических форм так же, как у проходных, или другим образом.

Проведенный анализ показал, что адаптация карликовых самцов симы к морской воде происходит на пределе их физиологических возможностей. В жаберном эпителии не появляются ХК морского типа. Но тем не менее неотенические самцы сиМы успешно выживают в морской воде, что свидетельствует о высокой степени их эвригалинности.

Стереологический анализ упьтраструктуры хлоридных клеток жаберного эпителия у горбуши на разных стадиях жизненного никла. Стереологический анализ показал, что относительный объем тубулярной системы ХК возрастал у молоди в устье реки на 74% по сравнению с личинками из нерестовых бугров. У молоди горбуши, уже мигрировавшей в море, объем тубулярной системы ХК был на 86% больше, чем у личинок.

В процессе покатной миграции относительный объем митохондрий ХК возрастал у молоди в устье реки на 50%. У морской молоди горбуши относительный объем митохондрий ХК был на 40% больше, чем у личинок (рис. 2 ).

Таким образом, изменения ХК у молоди лососей наблюдаются еще в пресной воде в ходе процесса смолтификации, что рассматривается как преадаптация, позволяющая молоди быстро проходить опасную для нее эстуарную зону.

40 35 30 25 20 15 10 5 0

Личинки Молодь в буграх во время ската

Молодь из моря

Зрелая в Зрелая в море реке

Рис. 2. Объем органелл в хлоридных клетках жаберного эпителия горбуши на разных стадиях ее жизненного цикла (% объема цитоплазмы).

У взрослой горбуши в течение нерестовой миграции объем тубулярной системы уменьшался на 54% у рыб, адаптировавшихся к речной воде по сравнению с морскими. Объем митохондрий уменьшался соответственно на 24%.

Ранее нами было отмечено, что интенсивность развития митохондрий и тубулярного ретикулума являются показателями физиологической активности ХК. Следовательно, на основании стереологического анализа можно заключить, что физиологическая активность ХК зависит от осмолярности среды, к которой адаптирована рыба.

Основные положения этой главы представлены следующими выводами:

1. Ультраструктурные изменения хлоридных клеток жаберного эпителия наблюдаются у молоди тихоокеанских лососей еще в пресной воде незадолго до начала покатной миграции, при этом клетки приобретают особенности, характерные для морских рыб. У производителей, мигрирующих к рекам для нереста также происходит предварительная перестройка ультраструктуры хлоридных клеток. Предварительные изменения осморегулирующих органов имеют важное преадаптационное значение для успешной миграции рыб.

2. Среди изменений ультраструктуры хлоридных клеток, сопровождающих процесс смолтификации и адаптацию к морской воде, наиболее характерными являются интенсивное развитие тубулярной системы, увеличение количества митохондрий, углубление апикальной ямки, развитие тубуловезикулярнок системы в апикальной зоне клетки, повышение проницаемости межклеточных контактов. Кроме того, в процессе смолтификации увеличиваются число и размеры хлоридных клеток.

3. Несмотря на перечисленные подготовительные изменения, даже в процессе естественного перехода молоди лососей из рек в море или обратном заходе производителей в реки, их хлоридные клетки демонстрируют признаки физиологического стресса. Однако, в случае переноса в морскую воду неподготовленных рыб (например, пестряток, карликовых самцов симы. или уже зашедших в реки производителей) физиологический стресс намного превосходит тот, который имеет место в ходе естественной миграции лососей.

4. Интенсивность развития митохондрий и тубулярного ретикулума является показателем физиологической активности клеток. Следовательно, на основании стереологического анализа можно заключить, что физиологическая активность хлоридных клеток зависит от осмолярности окружающей среды.

Динамика концентрации ионов в крови лососей при адаптации к средам различной солености

Сезонная динамика концентрации ионов натрия в сыворотке крови у пресноводной молоди симы Опсо&упсЪш тавои.

Бьио обнаружено, что с января до начала мая средние значения выборок находились на одном уровне (рис. 3) и различались между собой не более чем на 3,1% (минимальное среднее 131,4±3,1 ммоль/л, максимальное среднее 135,5 ±4,6 ммоль/л).

В последних числах мая в реке Барабашевка (Приморский край) начинается массовая покатиая миграция молоди симы к морю. В течение мая наблюдалось значительное увеличение содержания Ыа+ в крови рыб, что свидетельствовало о происходящих физиолого-биохимических изменениях в организме молоди. 20 мая был отмечен пик 147,0 ± 3,8 ммоль/л, что на 8,5% больше среднего значения предыдущей выборки. Контрольные измерения в последующие два года подтвердили наличие этого пика, хотя абсолютные значения показателен и сроки несколько менялись. Затем в конце мая - начале июня началось быстрое уменьшение уровня N3*. 5 июня его концентрация составила 88,8% и продолжала снижаться еще в течение месяца, достигнув 3 июля 123,2 ± 3,0 ммоль/л, что составляет 83,8% от максимального значения. Между всеми последовательными выборками в мае и июне выявляются достоверные различия (Р<0,05).

ммоль/л

150

+ Z

я а

=Г К

о «

140

130

120

i и т. иг Y

yi т ш а х x¡ xa

Месяш

Рис. 3. Сезонная динамика концентрации ионов натрия в сыворотке крови у пресноводной молоди симы. По оси абсцисс - месяцы; по оси ординат - концентрация ионов натрия, ммоль/л. Вертикальные отрезки у точек - стандартные ошибки средних значений.

Впоследствии у оставшихся в реке рыб в процессе десмолтификацик началось постепенное увеличение содержания которое продолжалось вплоть до декабря, выходя к этому времени на уровень зимнего плато (136,2 ± 4,7 ммоль/л). Хотя между

соседними осенними выборками различие несущественно, между крайними выборками в июле и декабре различие по t-критерию Стьюдента является достоверным (Р<0,05).

Интенсивное снижение концентрации одновалентных ионов в крови у молоди лососевых рыб в период покатной миграции является известным фактом. "Деминерализация", в основе которой лежит деятельность ХК, является основным стимулом к миграции из реки в море. Однако нам не удалось найти в литературе данных, объясняющих кратковременное, но значительное увеличение содержания Na+ в крови рыб перед началом его снижения. Этот факт представляется весьма интересным, так как возрастание концентрации электролитов крови в пресной воде может быть вызвано только усилением активного поглощения ионов. С нашей точки зрения это можно объяснить следующим образом. Физиологически оптимальная концентрация ионов в крови находится между крайними значениями нормы реакции. Снижение осмолярности от оптимального значения к минимальному является, видимо, недостаточным для стимуляции миграционной активности. Тут нужна более сильная "встряска". С этой целью концентрация ионов вначале повышается до максимума, организм как бы набирает резервы для разбега, после чего начинается быстрое снижение уровня Na\ что является простым и надежным стимулом миграционной активности.

Снижение содержания Na+ у смолтов-покатников вряд ли может быть объяснено началом активной секреции этих ионов, т.е. переходом рыб, находящихся еще в пресной воде, к морскому гипоосмотическому типу регуляции. Скорее всего, это снижение связано с происходящими под контролем нейроэндокринной системы ультраструктурными перестройками ХК, необходимыми для жизни в море. При этом уменьшается сорбция солей из окружающей пресной воды и происходит ничем не компенсируемое или недостаточно компенсируемое вымывание солей из тканей тела, что и приводит к снижению осмолярности крови.

В подтверждение этого мнения свидетельствует тот факт, что общий трансэпителиальный приток натрия из внешней среды уменьшается у молоди лососей в

период смолтификацни (Eddy et al., 1987). Возможно, это уменьшение является причиной

\

возрастания активности АТФ-азы, которая увеличивает способность жаберного эпителия к активному транспорту ионов. Таким образом, компенсаторный ответ на потерю солей в пресной воде является в то же время соответствующим подготовительным изменением для будущей жизни в море.

Проведенные наблюдения за сезонной динамикой концентрации Na* в сыворотке крови у пресноводной молоди симы объясняют противоречивость литературных данных относительно направления изменения концентрации ионов Na* и осмолярности крови во время смолтификацни.

Так, было отмечено возрастание уровня Na* в плазме крови у мигрирующей молоди кижуча и атлантического лосося по сравнению с немигрирующей (Наточин и др.,

1970; Соколова и др., 1971; Chemitsky, 1980), отсутствие изменений (Варнавский, 1981), а также снижение концентрации этого иона в плазме кровн (Черннцкий, 1980; Варнавский, 1981; Черницкий, Штерман, 1981). Эта противоречивость вызвана, видимо, тем, что молодь, исследованная указанными авторами, несмотря на сходство внешних признаков, связанных с процессом смолтификации, на самом деле имела разный физиологический статус и находилась на разных этапах миграции.

Серебрянки и серебристые пестрягки накануне ската по своему физиологическому статусу являются пресмолтами и отличаются от смолтов-мигрантов лишь более высоким уровнем Na* в крови, обладая практически сформировавшимся механизмом гипоосморегуляции. В связи с этим снижение содержания ионов в организме представляется основный стимулом миграционной активности молоди (Наточин и др., 19926, 1993), так называемым императивным стимулом, лежащим в основе их непреодолимого влечения к миграции в море,

Развитие способности к гипоосмотической регуляции у молоди симы Oncorhvnchus mason, как показателя физиологического статуса рыб.

Процент смертности рыб в ходе тестов на солевую устойчивость является одним из наиболее доступных показателей способности рыб к гипоосмотической регуляции. Из 203 пестряток и серебрянок, переведенных нами в морскую воду, за время экспериментов ни одна рыба не погибла. Это говорит о высокой степени эвригалинности молоди симы, даже пестряток, заведомо не готовых к переходу в морскую воду. Считается, что тихоокеанские лососи обладают наибольшей степенью эвригалинности среди лососевых (Boeuf, Harache, 1982; Clarke, 1982). Тем не менее, по данным Варнавского (1985), даже у серебрянок кижуча и нерки смертность в течении 48 ч достигала 5%, у крупных пестряток - 8%, а у мелких - 34% от количества переведенных в соленую воду рыб. Тогда как у сеголеток радужной форели за то же время смертность в разных размерных группах колебалась от 0% до 20% (Gorie, 1993). У представителей других близких семейств, например аю, прямой перевод молоди массой 2 г из пресной воды в морскую приводил в течение 24 ч к 90%-ной гибели (Hasegaiva et al., 1983).

Однако, несмотря на полную выживаемость исследованной нами молоди симы, адаптацию пестряток к морской воде нельзя назвать успешной. Концентрация ионов натрия в сыворотке крови у них через 24 ч испытания продолжала превышать уровень пресноводного контроля на 22-40% (рис. 4).

Смолтификация молоди является длительным процессом, развивающимся на протяжении двух - трех месяцев, предшествующих покатной миграции. Смолтификация -весьма многосторонний процесс, протекающий на различных уровнях организации, и в той или иной степени ему подвергается вся пресноводная молодь лососей, в том числе пестрятки, и даже жилые формы, о чем свидетельствует увеличение степени их

эвригалинности в это время (Harache et а!., 1980; Варнавский, 1985; Fujioka, Fushiki, 1989; Franklin et al., 1992).

Масовая покатная миграция исследуемой дикой молоди симы началась в конце мая - начале июня. Среди пресмолтов в мае и смолтов в июне встречались как серебрянки, так и серебристые пестрятки. Однако по динамике Na* между ними не было обнаружено достоверных различий (Р>0,05). В первые 6 ч пребывания в морской воде концентрация Na* у пресмолтов и смолтов возрастала до 30%, затем снижалась и стабилизировалась через 24 ч на уровне 5-12% от пресноводного. Указанный уровень стабилизации согласуется с данными других авторов. Так, у адаптированной к морской воде каспийской кумжи концентрация Na* в крови была на 5-7% выше, чем у пресноводной (Черницкий, Тамарина, 1985), у кижуча - на 10% (Варнавский, 1990).

В первые 6 ч солевого воздействия у пресмолтов и смолтов наблюдался достоверно более высокий рост уровня №*, чем у пестряток (Р<0,05). Быстрый и существенный рост уровня Na* у молоди лососей в первые часы солевого воздействия является следствием "включения" питьевого рефлекса. Наши наблюдения показали, что все смолты начинают пить морскую воду в первые 30 минут после переноса, тогда как пестрятки начинают пить только спустя 2 и более часа (Серков, 19956). В связи с этим интересно отметить следующий факт. Измерение объема потребляемой морской воды у радужной форели показало, что количество выпитой жидкости увеличивается в течение немногих часов после переноса, а затем уменьшается до более низкого постоянного уровня. Хотя механизм выведения солей активируется медленней - в течение суток или более (Hoar, 1988). Это объясняет причины гипернатриемии.

В августе динамика концентрации ионов натрия у молоди, перенесенной в морскую воду, очень похожа на таковую в феврале. Очевидно, что в это время оставшиеся в реке рыбы уже подверглись десмолтификационным изменениям и не способны быстро адаптироваться к морской воде.

Полученные результаты показывают, что успешной адаптации молоди тихоокеанских лососей к морской воде в ходе покатной миграции предшествует процесс смолтификации, который представляет собой комплекс существенных изменений, происходящих практически на всех уровнях организации. Изменения затрагивают биохимические, ультраструктурные, морфологические и поведенческие процессы. Динамика изменения содержания Na* в крови рыб, переведенных в морскую воду в разное время года, является лишь отражением структурно-функциональных перестроек, которым подвергаются хлоридные клетки жаберного эпителия (Максимович, Серков, 1994 а,б).

Период смолтификации и перехода в миграционное состояние рассматривается как этап индивидуального развития, обеспечивающий приспособление молоди к жизни в море. Глубокие изменения физиологического состояния молоди при смолтификации, по

мнению Баранниковой (1975), позволяют считать этот процесс по его биологическому значению сходным с метаморфозом.

¡•<40 ль/л февраль 1с0

1о0 1о0

О ¿4

апрель

1Ь0 160 140

мо 160

72

Ч

Рис. 4. Динамика концентрации ионов натрия в сыворотке крови у молоди симы в ходе адаптации к морской воде в разное время года.

По осям абсцисс - время, ч; по осям ординат - концентрация ионов натрия, ммоль/л. Вертикальные отрезки у точек - стандартные ошибки средних значений.

Время, в течение которого происходит стабилизация содержания ионов у переведенных в морскую воду рыб, по разным данным весьма сильно различается. Так для кижуча указывается 30-40 суток, а для молоди кеты, как пресмолтов, так и смолтов - 10 суток (Варнавский, 1990). По другим данным и мелкая, и крупная молодь кеты достигала нового устойчивого состояния в течение 24ч (1пга1а & а1., 1982). У пестряток и смолтов жилой озерной формы симы это время составляло 7 дней (Ри^ока, РшЫЫ, 1989). А у смолтов атлантического лосося уровень.достигал пресноводных значений через 2,5ч (СЬепШзку м а!., 1993). Столь большой разброс данных, видимо, объясняется использованием в экспериментах молоди разного физиологического статуса. Несомненно,

восстановление нонного гомеостаза у смолтов должно происходить в минимальные сроки. Наши данные свидетельствуют, что у серебрянок симы это происходит в течение первых суток адаптации к морской воде, что согласуется с данными Ямаучи и соавторов (УатаисЫ п а)., 1984). К сожалению, ежемесячные эксперименты этих авторов не отразили полной картины развития гипоосморегуляторной способности у симы. В период пика смолтификации такие измерения надо проводить чаще. Как показали наши исследования, в это время в крови у молоди происходят резкие колебания уровня Ыа* (Серков, 19956, 1996).

Рис. 5. Сезонная динамика концентрации ионов натрия через 24ч солевого воздействия на фоне природного изменения уровня натрия в крови у пресноводной молоди симы.

По оси абсцисс - время, мес.; по оси ординат - концентрация ионов натрия, ммоль/л. Вертикальные отрезки у точек - стандартные ошибки средних значений. Горизонтальный отрезок - время массовой покатной миграции молоди. МВ - морская вода, ПВ - пресная вода.

Таким образом, начало пребывания молоди лососей в морской воде сопровождается ростом осмолярносги крови. Неполная смена типа осморегуляции вызывает длительное повышение этого показателя, что приводит к таким негативным последствиям, как снижение двигательной активности молоди, прекращение питания, повышение чувствительности к неблагоприятным факторам среды, возникновение

неадекватных поведенческих реакций. Как следствие, такие особи погибают первыми. В связи с этим способность быстро восстанавливать водно-солевой гомеостаз при смене солености среды является решающим фактором, позволяющим выжить на данном этапе онтогенеза.

Многие ученые (Марковцев, 1989; Рухлов, 1989; Варнавский, 1990) отмечают необходимость разработки простого доступного для рыбоводов метода оценки качества молоди и степени завершения смолтификации, дающего однозначные результаты. Наши исследования показали, что этим требованиям для видов с длительным пресноводным периодом в значительной степени отвечает метод определения момента включения питьевого рефлекса. По нашим данным у перенесенных в морскую воду смолтов симы, готовых к адаптации, питьевой рефлекс появлялся в течение первых 30 минут. Тогда как пресмолты, внешне похожие на смолтов, но физиологически не готовые к переходу, заглатывали первую порцию морской воды только спустя 2 и более часов после переноса. К сожалению, предложенный нами метод определения момента "включения" питьевого рефлекса с помощью гибкого прозрачного капилляра был опробован только на симе -виде с длительным пресноводным периодом, имеющим достаточно крупные размеры накануне ската. Небольшие размеры покатников кеты и горбуши не позволили провести с ними аналогичные эксперименты.

Таким образом, наблюдение за сезонным изменением уровня На* в крови у пресноводной молоди лососей наряду с тестами на солевую устойчивость и определением момента "включения" питьевого рефлекса могут быть использованы как для оценки качества заводской молоди, так и для определения степени готовности рыб к успешному переходу в морскую воду.

Динамика концентрации тканевых электролитов в онтогенезе тихоокеанских лососей.

У личинок горбуши, извлеченных из нерестовых бугров, концентрация ионов Na+ в мышцах составляла 38,1 £ 0,08 ммоль/г сырого веса. У дикой молоди горбуши в процессе катадромной миграции содержание Na* в тканях тела уменьшалось перед их переходом в морскую воду до 86% от аналогичного показателя у личинок, находившихся в нерестовых буграх. У молоди, мигрировавшей в море, этот показатель составлял 110% по сравнению с личинками.

В море, в 9 км от устья ближайшей нерестовой реки, концентрация ионов Na+ в сыворотке крови у мигрирующей на нерест горбуши составляла 148,6 ± 5,2 ммоль/л. К моменту захода в реку этот показатель увеличивался до 122%. После захода производителей из моря в реку концентрация Na+ уменьшалась до 97% от уровня Na+ у морских рыб.

Таким образом, мы наблюдали уменьшение концентрации ионов натрия в тканях тела у горбуши непосредственно перед ее миграцией в гиперосмотическую морскую среду и увеличение этого показателя у морских рыб перед их заходом в гипоосмотическую пресную воду (рис. 6). По нашему мнению этот факт является достаточно убедительным доказательством теории императивного стимула, вынуждающего рыб к миграциям, связанным с изменением солености среды.

Хотя ранние стадии развития лососевых проходят в пресной воде, большинство видов проводят длинный или короткий период своего активного роста в море. У горбуши и кеты способность к гипоосмотической регуляции развивается в стадии малька на первом году жизни. У других видов тихоокеанских лососей, а также атлантических лососей и гольцов, способность к гипоосморегуляции полностью развивается после варьирующего периода пребывания в пресной воде (обычно один год или более). В конце этого периода лососи подвергаются процессу смолтификации.

Хотя плазменные и тканевые электролиты сохраняются постоянными на протяжении почти всей пресноводной жизни молоди лососевых, эксперименты показали, что разные виды различаются по своей способности поддерживать осмотический гомеостаз при переносе в соленую воду. Все виды лососевых могут переносить слабые изменения окружающей солености, однако тихоокеанские лососи являются в целом более устойчивыми к морской воде, чем атлантические лососи и гольцы.

зрелые зрелые зрелые в море перед в реке устьем

Рис. 6. Концентрация в мышечной ткани у молоди (ммоль/г) и в сыворотке крови у взрослой горбуши (ммоль/л) на разных стадиях ее жизненного цикла.

Из многочисленных исследований солевой чувствительности пресноводной молоди лососевых можно сделать следующие обобщения.

Все виды могут переносить слабые изменения солености окружающей среды. Более крупные особи имеют большую устойчивость, чем мелкие члены популяции. Солевая устойчивость изменяется сезонно и является более выраженной весной и ранним летом, чем осенью и зимой.

Когда имеется выбор между пресной и соленой водой, молодь лососей может проявить явное предпочтение к одной или другой. Предпочтение морской воды наиболее сильно в пик стадии смолта, когда в природе наблюдается покатная миграция. Но подобно солевой устойчивости, предпочтение различается по видам, времени года и состоянию развития смолта (Ти^а е( а!., 1985; Белковский и др., 1991).

Перенос молоди лососей в более соленую воду как в стадии пестрятки, так и в стадии смолта, сопровождается временными изменениями тканевых электролитов, после которых их уровень в плазме стабилизируется около прежних значений. Приспособительный период отличается изменениями в функциональной морфологии осморегулируюгцих органов.

Способность адаптироваться к полно соленой морской воде присутствует у всех видов и возрастных групп пресноводной молоди, но постепенный переход к более соленой воде является более успешным, чем внезапное испытание, даже у таких видов, как кета и горбуша, которые способны переносить морскую воду на стадии личинки (1\уа1а, Коп^и, 1984).

Смолтификация является критическим периодом для дальнейшего успешного роста в море, и хотя в течение стадии пестрятки некоторые виды могут акклиматизироваться к морской воде, они не способны нормально расти и становятся "карликами" или гибнут. Вынужденная задержка смолтов в пресной воде в дальнейшем также необратимо сказывается на снижении темпа их роста в море.

Стадия смолта весьма кратковременна, и рыбы, которые не переходят в морскую воду в период этого узкого "окна" во времени, возвращаются обратно к состоянию пестрятки, то есть подвергаются десмолтификации. Это "узкое окно" соответствует периоду максимальной активности жаберных ферментов и соответствующих изменений в обмене веществ.

Факторы внешней среды, особенно фотопериод и температура, регулируют время смолтификации, десмолтификации, солевые предпочтения и изменение солевой устойчивости.

Результаты этой главы можно резюмировать следующим образом:

1. Впервые обнаружено, что за несколько дней до начала катадромной миграции в крови у молоди снмы наблюдается кратковременный, но значительный рост уровня Затем начинается постепенное снижение этого показателя до значений существенно более

низких, чем первоначальные. Миграция молоди лососей из рек в море происходит в период снижения концентрации ионов Ыа+ в крови рыб.

2. Впервые предложен механизм действия императивного стимула, под влиянием которого проходные рыбы меняют среду обитания. В связи с тем, что молодь лососей испытывает потерю солей из тканей тела еще до своей миграции в море, гипоосмотический стресс является причинным механизмом, вынуждающим рыб мигрировать в море. Аналогичный механизм работает на заключительном этапе морского периода нерестовой миграции лососей. Концентрация электролитов в тканях тела рыб, находящихся в море недалеко от своих родных рек возрастает до верхней границы нормы реакции. Гиперосмогический стресс является императивным стимулом, побуждающим взрослых рыб к переходу в пресную воду.

3. Развитие способности к гипоосмотической регуляции у пресноводной молоди лососей происходит в течение двух-трех месяцев до начала покатной миграции. Начало пребывания молоди лососей в морской воде, как в стадии пестрятки, так и в стадии смолта, сопровождается ростом концентрации тканевых электролитов. Неполная смена типа осморегуляции вызывает длительное повышение этого показателя у пестряток в морской воде. Стабилизация уровня N3*, главного осмотически активного катиона плазмы крови, около прежних значений происходит у смолтов в течение 24 часов.

4. В первые 6 часов солевого воздействия у физиологически готовых к переходу в морскую воду рыб наблюдается быстрый рост уровня Ыа+ в плазме крови, что является следствием срабатывания питьевого рефлекса. Смолты симы начинают пить морскую воду в течение первых 30 мин)гг после переноса, тогда как пестрятки - только спустя несколько часов.

5. Наблюдение за сезонным изменением уровня N8* в крови у пресноводной молоди лососей наряду с тестами на солевую устойчивость и определением момента начала питья морской воды может быть использовано в практике лососевых рыбоводных заводов для определения степени завершенности смолтификации у подращиваемой молоди.

Видовые морфофункциональные особенности хлоридных клеток жаберного эпителия рыб

Несмотря на то, что к исследованию ультраструкгуры и функции ХК привлекается все большее число видов, вопрос о видовых морфофункциональных особенностях ХК остается недостаточно изученным. Недавнее исследование участия ХК в поглощении кальция у представителей трех пресноводных ввдов рыб показало, что различная скорость поглощения ионов кальция тесно связана с удельной площадью апикальной поверхности ХК у каждого вида (Реггу е1 а1., 1992). Имеются ли другие видовые

морфофункциональные особенности XIC и с чем они связаны? Поиск ответа на эти вопросы и был целью данной части работы.

Общая морфология жаберного эпителия у пяти исследованных нами видов (налим, щука, плотва, пелядь и сиг) была типичной для рыб, живущих в умеренно минерализованной пресной воде. Наибольшее число ХК наблюдалось в межламеллярных районах и у основания вторичных ламелл. Несмотря на их тесное расположение в этой области, ХК никогда не образовывали комплексов, как это характерно для некоторых других пресноводных рыб (Hwang, 1988), и всегда были разделены хотя бы тонкими отростками респираторных клеток. Исследованных рыб в порядке возрастания общего количества ХК в жаберном эпителии можно выстроить в следующий ряд: налим < щука < плотва < сиг, пелядь.

ХК легко идентифицировались по большому числу митохондрий, интенсивно развитой тубулярной системе и светлой цитоплазме. Эти довольно крупные клетки в первичном эпителии имели, как правило, округлую форму. По размерам ХК исследованные виды не различались, диаметр клеток составлял 9-14 мкм. Большое сферическое ядро размером 7-8 мкм в диаметре содержало конденсированный хроматин и располагалось в базальной части клетки. В околоядерной области наблюдался довольно развитый ШЭР, присутствовало много полисом и свободных рибосом. Иногда в клетках встречались мультивезикулярные тельца и комплекс Гольджи.

Апикальная поверхность ХК первичного эпителия была ровная, у ХК вторичного эпителия она могла быть слегка выпуклой. Апикальные ямки, характерные для других пресноводных рыб (Pisam et al., 1987; Cioni et al., 1991), отсутствовали. Апикальн'ая мембрана образовывала небольшие микроворсинки, более развитые у ХК в первичном эпителии. С соседними респираторными клетками ХК в апикальной области были соединены малопроницаемыми плотными контактами, характерными для пресноводных рыб (Pisam et al., 1990). В базолатеральной области клетки соединялись между собой межклеточными контактами типа "замка", представляющими собой цктоплазматические выросты одной клетки в другую.

Наибольший интерес вызвало сравнение ХК исследованных видов по интенсивности развития тубулярного ретикулума и митохондрий, являющихся показателем физиологической активности ХК. Ранее было показано, что активность ХК у горбуши на разных стадиях ее жизненного цикла различна и зависит от осмолярности окружающей среды. Однако, как показали наши исследования, интенсивность.развития ХК зависит не только от условий, предъявляемых средой обитания.

Относительный объем тубулярного ретикулума у налима и щуки был достоверно меньше, чем у плотвы, пеляди и сига (Р<0,01). Та же картина при Р<0,05 наблюдалась и при сравнении относительных объемов митохондрий. Оба эти показателя у щуки были незначительно больше, чем у налима (рис. 7). Однако площадь поверхности тубулярного

ретикулума как у плотвы, пеляди и сига, так и у щуки была достоверно больше (Р<0,05), чем у налима (рис. 8).

Обнаруженные различия, вероятно, связаны с экологическими особенностями исследованных видов и отражают интенсивность ионного обмена, в котором участвуют ХК. Чем более активны (подвижны) рыбы, тем более развиты их жаберные ХК.

Строение тубулярного ретикулума у исследованных видов было такое же, как и у большинства других пресноводных рыб (Pisam et al., 1987; Pisam, Rambourg, 1991; Cioni et al., 1991). Тубулярный ретикулум представлял собой систему длинных, тонких, относительно мало ветвящихся трубочек диаметром 35-40 нм. Однако у налима их диаметр был в два раза больше (70-80 нм). У всех изученных видов тубулярный ретикулум был наиболее развит в центральной области клетки, где он находился в тесном контакте с митохондриями. Узкая зона апикальной цитоплазмы, если в ней отсутствовали везикулы и вакуоли, была свободна от тубулярной системы. Однако в некоторых ХК у сига, пеляди и плотвы тубулярный ретикулум наблюдался даже в непосредственной близости к апикальной мембране. У всех видов, кроме налима, встречались ХК с интенсивно развитой тубуло-везикулярной системой в апикальной области, что подтверждает появившиеся в последнее врем представления о разных типах ХК (Pisam et al., 1987; Pisam, Rambourg, 1991). Наше исследование показало, что несмотря на обитание в одном водоеме некоторые виды пресноводных рыб различаются между собой ультраструктурными особенностями и количеством ХК. Следуя известному девизу "от структуры к функции", можно предположить, что функциональная нагрузка на ХК как органы осморегуляции у таких гидов, как сиг, пелядь и плотва, выше, чем у налима и щуки, а у щуки выше, чем у налима. Чем же это вызвано? Что общего между плотвой и сиговыми и каковы различия между ними, а также щукой и налимом? Очевидно, что эти различия не могут быть объяснены исключительно их таксономическим положением, поскольку пелядь и сиг принадлежат к одному роду, а плотва относится к другому отряду. Вместе с тем и плотва, и сиги ведут сходный образ жизни. Это активные пловцы-планктофаги с высоким уровнем обмена, а щука и налим -"хищники-засадчики, наименее подвижный из всех - налим (Никольский, 1961; Кириллов, 1972). Поскольку физиологическая активность ХК зависит от интенсивности ионного обмена организма со средой, будет логичным предположить, что и ультрасгруктура ХК должна отражать. экологические особенности вида.

Известно несколько способов увеличения общей площади клеточной мембраны. Один из них - развитие микроворсинок апикальных отделов клеток (например, во всасывающем эпителии проксимальных отделов нефронов или в тонком кишечнике), другой - инвагинация плазиалеммы (например, апикальные ямки у тех же ХК или секреторные канальцы в обкладочных клетках желудка). Но наиболее ярким примером такой инвагинации является тубулярный ретикулум ХК. Благодаря тубулярной системе

площадь клеточной мембраны увеличивается от 17 раз у налима до 36 раз у пеляди. У морских и адаптированных к мягкой воде рыб тубулярный ретикулум еще более развит (Bornancin et al., 1987; Pisara et a!., 1987; Cioni et al., 1991; Максимович, Серков, 1994 б,в). Та же зависимость наблюдается и в отношении митохондрий, которые обеспечивают энергией АТФ Na^/K*-насосы, локализованные в мембранах тубулярной сети.

а

<и >0 ю

о «

3 я л

и

(U H

о я

H

О

45 40 35 30 25 20 15

m

5 О

□ Тубулярная система

□ Митохондрии

Налим

Щука

Плотва

П елядь

Сиг

Рис. 7. Объем органелл в хлоридных клетках пресноводных рыб цитоплазмы).

(% объема

м s

ю

и С — *

в Й S «i

а 3

х S

О, rt

<и я*

« а

о а

С о

ч

с]

Э о к С

30 25 20 15 10 5 О

Налим

Щука

Плотва

Пелядь

.. _________ L. ! 1

1 'Л Л

3Í':'

С.'

г- •s

Ш V 1 / ш ítf' »i;, ¿¿S

í. г ^

Сиг

Рис. 8. Площадь поверхности тубулярного ретикулума в хлоридных клетках у пресноводных рыб (мкмг в 1 мкм3 цитоплазмы).

Таким образом1, несмотря на общее сходство ультраструктуры ХК исследованных видов, стереологический анализ выявил зависимость физиологической активности ХК от экологии вида. Площадь и относительный объем тубулярной системы, также как и относительный объем митохондрий, характеризующие функциональную активность клеток, увеличивались в следующем порядке: налим < щука < плотва, сиг, пелядь.

Подводя итоги этой главы, можно кратко сформулировать следующие основные результаты:

1. Впервые выполнен детальный сравнительный анализ структуры хлоридных клеток жаберного эпителия у пяти пресноводных видов рыб, обитающих в одном водоеме, но ведущих различный образ жизни.

2. Методами стереологии и электронной микроскопии показано, что несмотря на обитание в одном водоеме, некоторые виды пресноводных рыб различаются между собой ультраструктурными особенностями хлоридных клеток и их количеством. Исследованных рыб в порядке возрастания общего количества хлоридных клеток в жаберном эпителии можно выстроить в следующий ряд: налим < щука < плотва < сиг, пелядь. Площадь тубулярной системы и ее относительный объем, также как и относительный объем митохондрий увеличивались в следующем порядке: налим < щука < плотва, сиг, пелядь. Эти различия обусловлены разной функциональной нагрузкой на осморегулирующую систему рыб и отражают интенсивность ионного обмена у каждого вида.

3. Полученные результаты позволяют прийти к выводу, что экологические особенности видов влияют на интенсивность ионного обмена рыб и отражаются на структурной организации хлоридных клеток жаберного эпителия.

Основные выводы

I. Процесс смолтификации и последующей адаптации к морской воде сопровождается у лососей изменениями в функциональной морфологии жаберных хлоридных клеток. Существует несколько типов структурных трансформаций, способствующих усилению ионного транспорта. Конечной целью этих изменений является увеличение площади того участка клеточной мембраны, в котором локализуются ионные каналы или насосы. Общая площадь апикальной поверхности хлоридных клеток может увеличиваться за счет а) увеличения количества хлоридных клеток; б) укрупнения размеров существующих клеток; в) развития иикроворсинок и микрогребней, которые служат также в качестве якоря дня слоя слизи, покрывающего наружную поверхность клеток; г) за счет углубления апикальной ямки, так что иногда она превращается в глубокую извитую щель. Изменение общей площади базолатеральной части клеточной мембраны, контактирующей с внутренней средой организма, помимо увеличения количества и размеров хлоридных клеток может возрастать за счет интенсификации

развития тубулярной системы клетки, так как мембраны тубулярного ретикулума являются продолжением плазматической мембраны и по сути - ее инвагинацией.

2. Впервые обнаружено, что за несколько дней до начала катадромной миграции в крови у молоди лососей наблюдается кратковременный, но значительный рост уровня Na*. Затем начинается постепенное снижение этого показателя до значений существенно более низких, чем первоначальные. Миграция молоди лососей из рек в море происходит в период снижения концентрации ионов Na* в крови рыб.

3. Впервые предложен механизм действия императивного стимула, под влиянием которого проходные рыбы меняют среду обитания. В связи с тем, что молодь лососей испытывает потерю солей из тканей тела еще до своей миграции в море, гипоосмотический стресс является повелительным механизмом, вынуждающим рыб мигрировать в море. Аналогичный механизм работает на заключительном этапе морского периода нерестовой миграции лососей. Концентрация электролитов в тканях тела рыб, находящихся в море недалеко от своих родных рек, возрастает до верхней границы нормы реакции. Гиперосмотический стресс является стимулом, который побуждает взрослых рыб к переходу в пресную воду.

4. Впервые сделан детальный сравнительный анализ структуры хлоридных клеток жаберного эпителия у пяти пресноводных видов рыб, обитающих в одном водоеме, но ведущих различный образ жизни. Полученные результаты позволяют прийти к выводу, что экологические особенности видов влияют на интенсивность ионного обмена рыб и отражаются на структурной организации хлоридных клеток жаберного эпителия.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Структура и функция хлоридных клеток костистых рыб (обзор литературы) // Биология

моря. 1997. Т.23, №4. С. 193-198.

2. Определение физиологического статуса лососей в процессе смолтификации // Биология

моря. 1996. Т. 22, №5. С. 311-314.

3. Ультраструктурные и морфометрические доказательства различной физиологической

активности хлоридных клеток жаберного эпителия у пресноводных рыб с различной экологией II Ж. эволюц. биохимии и физиологии. 1995. Т. 31, № 2. С. 170-174.

4. Функциональная морфология хлоридных клеток жаберного эпителия тихоокеанских

лососей в средах различной солености // Цитология. 1994. Т. 36, № 2. С. 148-155. (совместно с A.A. Максимовичем).

5. Изменения ультраструктуры хлоридных клеток жаберного эпителия горбуши

Oncorbynchus gorbuscha во время нерестовой миграции II Цитология. 1994. Т. 36, № 3. С. 239-245. (совместно с A.A. Максимовичем).

6. Ультраструктура и функция хлоридных клеток жаберного эпителия молоди

тихоокеанских лососей в пресной и морской воде // Цитология. 1994. Т. 36, № 3. С. 246-251. (совместно с A.A. Максимовичем).

7. Определение физиологического статуса молоди лососей II Международный симпозиум

по марикультуре. 1995. Краснодар. Издательство ВНИРО. С. 73-74.