Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Химико-ферментативный синтез, клонирование и функциональный анализ ДНК вируса увядания листьев кокосовой пальмы

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Химико-ферментативный синтез, клонирование и функциональный анализ ДНК вируса увядания листьев кокосовой пальмы"

»5» 0

л ш^мобковс

2 а московский государственный университет имени м.в.ломоносова

биологически! факультет

. На правах рукописи удк 578.2

МЕРИТС Андрее Юриевич

химико-ферментативныи синтез, клонирование и функциональный анализ днк вируса увядания листьев кокосовой пальмы

(03.00.06 - Вирусология)

Автореферат 'диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1993

Работа выполнена на кафедре вирусологии Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова.

Научные руководители: Академик РАН, профессор И.Г.Атабеков

доктор биологических наук С.Ю.Морозов Официальные оппоненты: доктор химических наук А.В.Вартшетян

кандидат биологических наук В.Г.Лунин

Ведущее учреждение: Инситут общей генетики РАН

Защита состоится " ^ " 1994 г. в ^ чао. на

заседании Специализированного Совета Д 053.05.70 при Московском Государственном Университете им. М.В.Ломонооова ш адресу 119899, Москва, Воробьевы Горы, МГУ.

О диссертацией мохно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан " ^ " 1994 г.

Ученый Секретарь специализированного совета

кандидат ашнческих наук /'л' У^ ^ В.Н.Каграманов

общая характеристика работы

Актуальность проблема. Применение вирусов, их геномов и белковых продуктов _ является важнейшим направлением всей современной биотехнологии. В последнее время одним из перспективных способов исследования вирусоз стал синтез и сборка вирусных геномных элементов in vitro из химически синтезированных олигонуклеотидов. Достоинством такого метода является, например, возможность получения необходимых вирусных геномных элементов и их комбинаций в желаемой оранжировке, а также с желаемыми изменениями и мутациями.■ Среда известных вирусов растений, доля вирусов с ДНК геномами не очень велика. Одним из них является вирус увядания листьев кокосовых пальм - ВУЛКП, который и являлся объектом исследования в данной работе. Полная последователность его кольцевой одноцепочечной ДНК была определена недавно (Rohde et ai., 1990). Длина ее составляет 1291 нуклеотид. Она имеет уникальную организацию, что не позволяет включить ВУЛКП ни в одну из известных до сих пор систематических групп вирусов.

Использование ДНН-содеряащих фитовирусов как векторов для переноса чужеродных генов, имеет целый ряд преимуществ по сравнению с известными более традиционными ■ методами конструирования грансгенных растений. Во-первых, вирусы способны-системно заражать целые растения, включая листовую, корневую и генеративную ткани. Во-вторых, при автономной репликации в ядрах растительных клеток происходит многократная амплификация переносимого гена, клонированного в составе вирусной ДНК.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлась сборка и клонирование геномной ДНК ВУЛКП и исследование его функциональных элементов и кодирующих способностей, как начальный этап в разработке вектора и кассет регуляторных элементов. Методом для этого мы выбрали химико-ферментативный синтез на основе последовательности, опубликованной в-литературе (Rohde et ai., 1990). Побочной целью работы являлась разработка быстрого и надежного метода синтеза и клонирования крупных фрагментов синтетических ДНК-дуплексов. Дополнительно были проведены компьютерные исследования вторичной структуры геномной ДНК ВУЛКП

и исследования закодированных в нем белков, с целью выяснения их возможных функции.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе впервые осуществлен химико-ферментативный синтез полноразмерного ДНК-компонента вируса, а также впервые построена модель вторичной структуры генома одноцепочечного ДНК-содержащего эукариотического вируса. Разработана методика быстрого синтеза крупных последовательностей на основе химически синтезированых олигодезоксирибонуклеотидов. Предсказано расположение возможных функциональных элементов в ДНК вируса и экспериментально определены расположения точек терминации' вирусной транскрипции. Выявлена активность вирусного промотора в системе протопластов ячменя и исследованы кодирующие области генома ВУЛКП.

Апробация работы. Результаты работы изложены в 3 публикациях. Диссертация была апробирована на заседании кафедры вирусологии Биологического факультета МГУ 28 сентября 1993 г.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсувдения и выводов. Работа изложена на' 221 страницах, содержит 22 рисунка. Список литературы включает 291 публикации.

результаты и обсуждение

Модель вторичной структуры ДНК ВУЛКП.

■ При помощи компьютерного анализа была предсказана вторичная структура ДНК ВУЛКП, обладающая наименьшей свободной энергией. Эту структуру можно условно поделить на 4 сегмента.

Весь сегмент А может быть уложен в виде пяти относительно • стабильных шпилечных структур. Наиболее длинная из этих шпилек содержит две короткие ветви, формирующие 2 "трехнаправленных узла", которые являются характерными для моделей вторичной ;с!цруктуры крупных МОЛвКуЛ РНК и ДНК (Иуа«: et а1., 1989). В целом, в этом сегменте имеются 78 в.-с, 51 а:т. и б пар, которые вместе дают величину свободной энегрии -109,8 ккал/мол.

Основная часть сегмента Б может быть уложена в виде длинной шпилечной структуры с единственным трехнаправленным узлом.

3*-конец Б-сегмента спарен очень близко с 5'-концом, хотя сам 5'-концевой район, по нашим предсказаниям, не участвует в спаривании оснований. В структуру этого сегмента входят 40 g:c, 25 а:т и 4 g:т пары (суммарная свободная энергия -62 ккал/мол).

Сегмент В может формировать две длинных шпилечных структуры, образующих 4 трехнаправленных узла, и одну небольшую шпильку (Рис. I).В этом сегменте расположены также наиболее длинные непрерывные двустгральнне участки с длиной 10-13 пар основании. В целом, в эту структуру входят 7i G:C и 74 А:т пары, имеющие суммарную свободную энергию -119,6 ккал/мол.

Сегмент Г складывается в две шпилечные структуры, образующие единственный трехнаправленный узел. В этой структуре имеется 26

G:C, 24 Л: Т И 1 G : Т Пар С СУММЭРНОЙ СВОбОДНОЙ Энергией -41,6

ккал/мол.

В этой модели кольцевая одноцепочечная вирионная ДНК ВУЛКП может формировать компактную конфигурации "цветка" со множеством ветвей. Суммарная степень спаривания оснований в ней составляет около 62%. Таким образом ДНК ВУЛКП имеет некоторые общие черты с линейной геномной РНК бактериофага ms2 (Fiers et el., 1976) и отличается от кольцевых РЕК геномов вироидов (steger et ai.. 1984) и вируса гепатита s (Wang et ai., 1986), так как эти геномы фэрмяруют двуцепочечше нерззветвленяые палочковидные структуры. •

Инвертированные повторы в ДНК ВУЛКП.

Созданная нами модель вторичной структуры одноцепочечной ДНК ВУЛКП позволила выявить также мотивы с инвертированными повторами в ДНК ВУЛКП. Наиболее интересными из них являются: палиндром из 31 нуклеотида (в позиции 40-70) и палиндром из 17 нуклеотидов (в позиции . 1075-1091 ) (Рис. 1, 2), из-за их очевидных структурных сходств с известными цис-действующида элементами геминивирусов

(Harrlsson, 1985; Davies and Stanley,- 1989; Rohde et al., 1990) и bbtv (вирус разрастания верхушек бананов) (Harding et al., 1993).

Шпилечная структура, образуемая 31 нуклеотидяым палиндромом, содержит в себе последовательность tagtattac, образупцую петлю на шпильке. Эта последовательность очень сходна с аналогичной последовательностью петли таататтас, которая является высококонсервативной последовательностью в районе инициации синтеза вирионной цепи ДНК У геминивирусов (Rohde'et al., 1990;

л

с т

С G А Г

G G

т*л

т'л

с«е т«л

с *с т*л

с с

Т А

ТСТТ Т ТА-С лт*л

А CCG CT TCGTATTTG-CC GAA х • »* •*•***•*» «* i

Т ССС-СА-АССЛТАЛЛС CG ДАТ САТГ Л С7*А

Т»Л

с*с л*т

ТТААС ТС*С

С AACAGGGCAT TGG

Т I

С TTGTCCCCTA ТЛА ТА AGA TT* Л

А*Т Л*Г Л*Т Т*А Т* Л

т*л

i*T

а

С л C*G C*G G*C G*C Л*'Г C*G C*G C*G

G 1 t«A т

ОС С А

С*CTG CCCGGCCG

T*A T*A T T

C*C C*G T*AC

1.4

Л"глет

G*C

Л*Т ССТ*Л

Т*А с I

Т*Л ССЛ*Т

Т*Л C*G

А*Т C*G

Л«г . C*G

Т*Л G*C

G«C C*G

Т*Л C*G

С AG* С С«С

•АА А-А С G*C G*С

А ТТТ ТССТССЛТСТАС АЛТАС-СС--- —-Т

А ААА AGGAGCTACATG TTATGCGGAAA AGCCCGAACTCACGCTCTATAA-

СА С С Л G С-Л G*C

С CT А*Т

С-А C*G

с*с л*т л«т

G*CT

¿.dl т«л

G

G

• Рисунок 1. Предсказанная вторичная структура для В-сагаента ДНК ВУЛКП (780-1119 нукпеотидный остаток). Нумерация остатков

соответствует схема опубликованой первичной структуры (Roh.de et

al., 1990b).

ссаат

gtgg

i— <— gata tgacg

4— —У —» —>

ссаат ссаат ссаат ccaat

GTGG

Motif 1

Spl

AATAAA

XI II Spl

aataaa

tata tata

Ihol

f Muni

f

Irai I

f 1 Stg I

A pa I

Karl S а с I I

Т-Ball

*f

Xhol

0РГ1-> I _ OPTI-»

ОРГ2Ч 0РТ2-»

0ET3-» I I OPT 4-» I

«-0РТ7 . j |«-0PT5| | «-ОРТ7

1<-0PT6~1

Рисунок 2. Расположение сигналов транскрипции и потенциальных цис-дейтвупцих элементов в ДНК ВУЛКП. и - инвертированный элемент I (последовательность 5'-acccggccgaag-з' для прямой ориентации)! spi - инвертирований элемент 2, сходный с spi связываниями - последовэтелъностгилз (последовательность

5'-tatgggcgggcccac-3 для прямой ориентации). Kotif 1 - мотив, образованный перекрывающимися энхансвршми элементами и сходный по последовательности (5'-ccacgtcaccaatccagg-3') с мотивом tag-элемента растений. Приведены сайты рестрикции, расположенные в ДНК ВУЛКП и схема расположения открытых рамок трансляции. Стрелки ( —» и «— ) указывают на ориентацию указанных элементов (прямую и комплементарную, соответственно)

stenger et 'al., 1991) а также с последовательностью tattattac навденной у ВВТУ (Harding et al., 1993).

Наблюдается сильная гомология 17 нуклеотидного палиндрома БУЛКИ с палиндромом из транскрипционного энхансера msv. Этот энхансерный элемент содержит 2 сайта связывания для ядерного фактора (факторов), выявленных у нескольких видов растении (Fenoli et al., 1990). Эти сайты связызания могут быть сформированы либо двух-стеблевой крестовидной структурой, либо двумя идентичными последовательностями, образующими инвертированный повтор. Интересно, что последовательность 5'-ggccgg-3' является весьма консервативной и для растительных и для вирусных генов. Это может отражать ее роль в цис-действупцих элементах, вовлеченных в узнавание некого широко распространенного транскрипционного фактора или факторов.

Помимо 31 и 17 нуклеотидных палиндромов, мы также обнаружили еще один элемент из инвертированных последовательностей, образованных почти исключительно из остатков g/c. Он состоит из последовательности 5'-tgggcgggc-3' в положении IIII-III9 и ее комплемента, расположенного на 95 пар нуклеотвдов влево (Рис. I, 2). Эта последовательность имеет очевидное сходство с консенсусом, узнаваемым фактором spi для РНК полимеразы хх животных.

Потенциальные цис-действующие элементы в ДНК ВУЛКП

и предполагаемое устройство промоторного района.

Кроме инвертированных элементов генома, вероятно участвующих в генной регуляции ВУЛКП, в ДНК ВУЛКП мы обнаружили еще несколько типов, последовательностей, для которых выявлены функции, характерные для знхансеров транскрипции. Из этих последовательностей следует отметить элементы (в прямой и комплементарной ориентации) типа ccaat (5 элементов такого типа), последовательность gtgg (2 элемента), gata-элемент (I элемент) и консенсус- tgacg (I элемент) (Рис. 2). В большенстве случаев связывать наличие таких последовательностей с промоторными участками в ДНК ВУЛКП кажется преждевременным, но обращает на себя внимание группа отмеченных выше элеметов" (gtgg, tgacg в комплементарной, ссаат в прямой ориентации), расположенных примерно на.120 нуклеотидов левее одного из tata-элементов ВУЛКП

Вместе эти элементы образуют последовательность, которая обладает ярко выраженным сходством с комплексным регуляторным элементом промотора гена гистона нз из пшеницу и других гистоновых генов растений (Иакаугта 1992 );

ВУЛКП ССАСбТСАССААТССАСС *************** *

ген НЗ ССАССТСАССААТССССС Интересно отметить, что активность гена гистона нз связана с э-фазой клеточного цикла. Исходя из сходства между этими элементами нельзя исключать возможности, что и активность промотора ВУЛКП может также зависеть от фаз клеточного цикла.

Исследование потенциальных цис-элементов транскрипции с учетом расположения тлтА-элементов позволило выдвинуть предпологаемую схему организации промоторной области для транскрипции с вирионной полярностью (Рис. 2, 3).

В этой промоторной области (Рис. 3) находятся 2 ТАТА-элеменга. Транскрипция возможна с использованием обоих ТАТА-Элеменгов, но только предполагаемый транскрипт, синтезируемый с участием первого гАТА-элемента (а) может инициировать синтез белка ОРТ1. Куклеотидные последовательности, расположенные непосредственно пзред гАтд-элементами, имеют мевду собой существенную гомологию. В их состав входят несовершенные прямые повторы с длиной 12 пар оснований (Рис. 3).

•I и

, I >1 » ,

a) 5 -ССССССАААААССТСТССТСАСТССССТССТ—вАСТАТААСТАС -3

b) 5 -СССТСССС-ААССТСТССТАА-ССССС—СТТСССТАТАААТСС -3'

Рисунок 3. Расположение повторов з предполагаемом промоторном регионе ВУЛКП. Инициирущии кодон ОРТ1 выделен, показана гомология последовательностей вокруг ТАтл-элементов а и ь и наличие в этом районе несовершенных прямых повторов (I, и).

Возможно, что эти регионы узнаются одинаковыми факторами

транскрипции. Это может иметь значение для определения количественных соотношений разных транскрштов с вирионной полярностью.

Химико-ферментативный синтез и клонирование полноразмерной

геномной ДНК ВУЛКП.

с целью конструирования нового вектора, способного амшшфицировать чужеродные гены, наш осуществлен синтез ДНК-копии полноразмерного генома ВУЛКП и его тандемного димера и клонирование их в составе плазмид е. coli.

Классические подходы к синтезу искусственных фрагментов ДНК связаны со сборкой требуемой нуклеотидной последовательности из отдельных олигомерных сегментов (Khorana et ai., 1986). Однако, при большой длине синтезируемой ДНК-копии требуется весьма значительное число необходимых олигомеров, что связано с резким увеличением материальных и временных затрат, и, кроме того, неизбежно приводит к сборке фрагмента по сложным многоступенчатым схемам.

Наличие разработанного в последние годы метода амплификации сегментов ДНК с помощью полиыеразной цепной реакции (ПЦР) (Saiu et ai., 1988) позволило нам усовершенствовать процедуру синтеза/клонирования синтетических ДНК. В результате полная последовательность вирусной ДНК длиной почти 1300 пар нуклеотидов былаг- сконструирована всего из трех основных протяженных субфрагиенгов cfdv2, cfdv3 и cfdv4 (Рис. 4). К настоящему времени данная работа представляет собой первый случай конструирования полноразмерной ДНК автономного вируса полностью ка основе химически синтезированных ДНК-сегментов.

Ранее было показано, что частота точечных ' мутаций, генерируемых в ходе ПЦЕ в стандартных смесях с Taq днк-голимеразой, составляет 0,25-0,4% (Saiki et al.. 1988,- Leung et al., 1989; Tlndall and Kunkel, 1988), Причем ОТ 5 ДО 20% ЭТИХ

мутаций приходится на делении или вставки. В ходе нашей работы было просеквенировано 16 независимых клонов для з суОфрагментов вирусного генома с общей длиной 5873 пары нуклеотидов. Выявлено, что частота мутаций составила о,7%. При этом частота делеций/вставок в наших экспериментах оказалась необычно высокой и составила 88%, что может быть связано с использованием в качестве матриц для ПЦР химически . синтезированных полинуклеотидэв.

Для получения полноразмерной клонированной ДНК ВУЛКП не

б

А.

Dra II

ара i 4.

Xho I

4.

Dr. II

4-

cfdv3 Б. cfdv2: 14в 1«6 144 142 cfdv2 139 1s3 155 157 cfdv 4 159 161

<-<-«-<-<-( (-<- *■

147 Its 143 140 1S2 1S4 1S6 162 160 163

cfdv3:

174 176 17S 180 ISO 148

175 177 17» 181 149 117

CFDV4:

161 164 166 168 170 172 ->-,-(-)->->

163 165 167 169 171 173

Рисунок 4. Рестрикционная карта генома ВУЛКП и схемы сборки отдельных субфрагментов.

(А) Рестрикционная карта генома ВУЛКП. Указано взаморасположение трех клонированных субфрагментов.

(Б) Схема сборки отдельных субфрагментов генома ВУЛКП из химически синтезированных олигодезоксирибонуклетидов.

содержащие мутаций вставки из клонов cfdv 2, з и 4 сшивали в г этапа. В результате, была получена плазмида cfdv 1.0,

содержащая полноразмерную вирусную ДНК, ограниченную Draii-сайтами, и короткие дупликации Psti-Draii на концах вирусспецифической вставки. Для конструирования тандемного димера, рестрикционный фрагмент Draii-xbai, содержащий полноразмерную копию ДНК ВУЛКП, вставили в вектор, полученный из cfdv 1.0 при разрезании xbai-Draii. в результате был получен клон cfdv 2.0, содержащий тандемный димер вирусной ДНК.

Исследование выражения генома ВУЛКП in vivo и in vitro. Существует не менее двух способов исследования вирусов in viro, не используя их природного хозяина. Это, во-первых, получение трансгенных растений и, во вторых, опыты с применением альтернативного растения-хозяина или его протопластов. Для данной

работы планировали использовать оба подхода параллельно. Однако, при попытках клонирования тандемного димера генома ВУЛКП в векторы трансформации растении (Btni9 и pcvoo2) наблюдалось устойчивое выщепление вирус-специфических вставок. Поэтому, опыты in vivo были проведены с использованием системы протопластов мезофила ячменя как наиболее доступной из систем протопластов однодольных растений. Кроме того, ячмень и другие злаки являются потенциальными объектами для генной инженерии с использованием элементов генома ВУЛКП.

Протопласты клеток мезофила получали из семи дневных проростков ячменя, а ДНК вируса была введена методом электропорации. Электропорированные протопласты инкубировали до трех суток при постоянном освещении в чашках Петри.

Обычно в протопласты вводили паралельно несколько вариантов клонированной ДНК: мутантный мономер в составе плазмиды, мономер без дефектов в составе плазмиды, вырезанный из плазмиды мономер в линейном и лигированном виде, тандемный димер-в составе плазмиды, который, как показано для многих геминивирусов, является наиболее Эффективной формой ДНК ДЛЯ Заражения (Stenger et al., 1990). Выделенную из протопластов ДНК анализировали с помопцо ДНК-блота. Этот метод позволил выяснить, что введенная в протопласты исходная ДНК деградирует и появляется размытая область фрагментов ДНК (с размерами от 100 до 1000 пар нуклеотидов). Однако, оказалось, что в этой области присутствуют фрагменты деградации введенной в протопласты ДНК и обнаружить продукты возможной репликации ДНК ВУЛКП не удалось. Такая же картина наблюдалось, когда тандемный димер ДНК ВУЛКП был электропорирован ' в протопласты совместно с конструкцией, где 0PTI был помещен под КОНТРОЛЬ ПрОМОТОра 35S РНК CaMV.

Картирование 3'-концов мРНК ВУЛКП.

В последовательности ДНК ВУЛКП были обнаружены . 2 эукариотических сайта полиаденилирования, что позволило предположить наличие у мРНК ВУЛКП з'-полиадениловой последовательности. Для определения конкретных точек полиаденилирования были поставлены 2 реакции ПЦР, где в качестве матрицы использовали кДНК ВУЛКП. Были выбраны праймеры, близлежащие к сайгам полиаденилирования, а в качестве второго

праймера в обоих случах использовали олигонуклеотид (^т)^. Продукты ПЦР фракционировали в 2% агарозном геле. Подходящий по размерам ПЦР-продукт был найден только для реакции, поставленной около первого сайта полиаденилирования. Использование второго сайта полиаденилирования не ьыло обнаружено и при помещении его под контроль 35S РНК промотора саму, независимо от того, имелся или не имелся перед ним первый сигнал полиаденилирования. Такое применение первого сайта полиаденилирования как места для терминации транскрипции согласуется с данными об устройстве геномного компонента отдаленно-родственного ВУЛКП вируса bbtv, в котором единственный сигнал полиаденилирования расположен практически идентично с первым поли(А) сигналом ВУЛКП (Harding et ai., 1993). Секвенпрованием полученного ПЦР-проДукта определяли точку полиаденилирования. Она оказалась расположена на 18 нуклеотидов правее ААТААА-сигнала и всего на 3 нуклеотида правее терминируюцего кодона рамки OPTI. з'-концы мРНК- имеют последовательность:

5 '—GGGACAGAATAAAACTGTGGAATATTTAAAGT (а) , ГДв ВЫДвЛвННЫЙ КОДОН таа

'"■— ■ — — — п

является терминирующим кодоном для OPTI.

Для выяснения, как влияет на терминирование замена последовательности, расположенной правее первого сигнала полиаденилирования, был сконструирован клон, в . котором последовательность после сигнала полиаденилирования (помещенный под промотор 35S РНК саму) была заменена на следующую:

5 -CAGAATAAAACTGTGGAATcgccatcctctacactccgcaaatc».. 3 . Как

показал опыт, терыинация при этом происходит на 29 нуклеотидов правее сигнала полиаденилирования., и 3 '-концы" мРНК имеют вид

5 -CAGAATAAAACTGTGGAATgcc-gatcctctac/CTCCCC (Л) . МОЖНО

* ' п

педположить, что такое смещение точки терминирования является следствием механизмов, учитывающих нуклеотидный контекст точки терминирования.

Исследование кодирующих регионов генома ВУЛКП. ДНК ВУЛКП теоретически способна направлять синтез не менее 6 вирус-специфических белков: 4 в прямой (0PTI-0PT4) и не менее 2 в комплементарной (0РТ5-0РТ6) ориентации. Попыток прямого выделения из протопластов возможных вирусных белков не предпринимали, так как. отсутствуют способы их идентификации. Количества выделенной

мРНК ВУЛКП оказалось недостаточно для постановки непосредственно на ней трансляции in vitro. В связи с этим, применяли метод амплификации .с помощью ИЦР на полученной с помощью затравки (ат12_18) кДНК вируса ВУЛКП.

Для амплификации применяли праймеры, содержащие инициаторный . кодон амшшфицируемого гена, а в качестве второго праймера применяли праймер с последовательностью

3'—сттатаааттгсatttttttttttttttgtcgacgg-5 , КОМПЛвМеНТарНОЙ

з'-концу мРНК терминируемых на первом сайге полиаденилирования (для ОРИ, 2 и 3) или праймер, соогветсвувдии терминаторному региону рамки трансляции (для 0РТ4, 5 и 6).

После амплификации полученные продукты фракционировали в агарозном геле. В случае амплификации первой рамки трансляции было найдено 2 мажорных продукта с разными размерами, один из которых точно соответствовал ожидаемым размерам, другой, названный OPTIb, .был более мелкого размера,- в случаях амплификации других рамок вирионной полярностью наблюдался лишь один макерный продукт с ожидаемыми размерами. Имелись и дополнительные зоны, представляющие собой-артефакты ПЦР. Фрагмент для 0РТ5 и 0РТ6 обнаружить не удалось.

Полученные продукты клонировали в векторных пазмидах sk" и ks~ под контролем промотора фага Т7. С целью выявления возможных мутаций, а также возможных событий сплайсинга было проведено секвенирование полученных клонов. Клоны ОРИ, 2, 3 и 4 полностью соответствовали исходной последователности, а клон OPTIb представлял- -- гибрид рамок 0PTI и ОРТЗ, кодирующая .последовательность которого состояла из инициаторного кодона и следующих за ним 15 кодонов OPTI и почти всей последовательности ОРТЗ за исключением инициатора и первых пяти кодонов. Такое сливание двух рамок трансляции произошло без сдвига рамки трансляции, и OPTIb теоретически может синтезировать белок из 62 аминокислот с молекулярной массой 7,6 кДа. К сожалению, остается неясным происхождение рамки OPTIb, так как один из краев делении не соответствует каноническим границам интрона.

Была проведена транскрипция in vitro полученных клонов РНК-полимеразой фага Т?. Полученные транскрипты транслировали в системах трансляции in vitro: Кребс 2 и в системе лизата

ратикулоцигов кролика с использованием разных меченных аминокислот. Продукты трансляции анализировали с помощью электрофореза в трис-фосфатном и трис-глициноЕЫХ буферах.

Авторадиографии позволили выявить наличие следующих продуктов трансляцииг

0РТ1 : на авторадиографиях, полученных с гелей с применением метки з35-метионина и с14-смеси аминокислот видна полоса, соответствующая по размерам предсказанному продукту 0РТ1 (33,4 кДа). Наличие этой полосы на авторадиографе с применением з35-метионина указывает на то, что инидарующий метионин 0РТ1 (он единственный в составе этого белка) не отщепляется, по крайней мере, после трансляции in vitro.

0РТ1в: На авторадиографиях с применением обеих меток не наблюдается наличия ни полоон ожидаемого размера, ни каких-либо других специфических полос. Означает ли это, что 0РТ1в является артефактом эксперимента с ПЦР или белковый продукт 'не . был обнаружен (например кз-за его мелких размеров)-, установить на основе этих данных с полной определенностью невозможно.

0РТ2 : Продукт ожидаемого размера (17,2 кДа) виден на авторадиографиях о применением обоих типов меток.

ОРГЗ : Продукт с предсказанными размерами был обнаружен с применением метки 335-метиона. Полоса, соответствующая этому белку (6,4 кДа) видна слабо, но имеется ряд полос, существующих также на авторадиографиях с применением 0РТ1 и 0РТ2. Размеры этих полос составляют примерно 12, 18 и 30 кДа. Нами предложено объяснение, что эти полосы являются агрегатами белка, кодируемого ОРТЗ: комплексами с белками из системы трансляции или олигомерами самого болка ОРТЗ. Были также предприняты попытки разрушить предполагаемые комплексы ОРТЗ с помощью различных денатурирующих агентов: избытком p-меркаптоэтанола, лаурилсульфатом лития и 8М раствором мочевины. Ни один из этих реагентов не вызывал изменения картины полос. Исходя из этого, можно предположить, что комплексы с участием ОРТЗ обладают большой прочностью.

ОРТ4 : на авторадиографии с з35-метионином видна полоса, по размерам соответствующая предсказанному белку о мол. весом 6,8 кДа. Других характерных полос на этих авторадиографиях

обнаружено не было.

Для рамок из комплементарной цепи, 0РТ5 и 0РТ6, а также для описанной нами гипотетической, безиннциаторной рамки 0РТ7 (см. ниже) были сконструированы клоны для транскрипции in vitro на основе полной копии ДНК ВУЛКП. Дальнейший их анализ проводили аналогично анализу рамок из (+) цепи генома. Авторадаографии позволили выявить наличие следующих продуктов трансляции:

0РТ5 и 0РТ6: были обнаружены продукты траноляцш, по размерам соответствующие предсказанным на основе первичной структуры.

0РТ7: выявились 2 полосы примерно одинаковой интенсивности. Первая из них, примерно 21 кДа, соответствует по размерам предсказанному продукту для 0РТ7 и может представлять собой продукт, синтезированный с использованием неканонического инициаторного кодона (например на 9 кодоне ОРТ? ctg, находящийся в сильном контексте gtactgg). Второй продукт имеет размер около 40 кДа и его происхождение остается неизвестным.

Компютерный анализ кодирующих областей и предполагаемых генных продуктов ВУЛКП.

Была проведена компьютерная оценка кодирующих областей генома ВУЛКП методом Трифонова (Trifonov, 1987). Из рамок (+) цепи были обнаружены яркие сигналы для ОРИ и 0РТ4, в то время как сигнал для 0РТ2 был значительно слабее, а для ОРТЗ отсутствовал совсем. Для ОРТ (-) цепи наличие сигналов было обнаружено и для 0РТ5, и 0РТ6. В (-) цепи ВУЛКП было обнаружена еще одна рамка, лишенная инициаторного кодона, но имеющая длину 179 кодонов. Для этой рамки, названой 0РГ7, был найден достаточно сильный сигнал. Это позволяв!' предполагать, что 0РТ7 действительно представляет собой кодирующую последовательность.

■ На сегоднящншг день роль ни одного из белкоз ВУЛКП экспериментально не установлена. Поэтому был проведен компьютерный поиск гомологии закодированных белков с использованием банка аминокислотных последовательностей swiss-92.

Для 0PTI, кроме отмеченного в литературе сходства с 0PTI bbtv (Harding et ai.( 1993), были обнаружены сходства с репликативныш белками гемшшвирусов всех групп. Также наблюдалось сходство с разными хеликазами вирусного и невирусного происхождения. Эти данные согласуются с ранее существующими

(Rohde et al., 1990) и позволяют предполагать участие 0PTI белка в репликации ДНК ВУЛКП.

Для 0РТ2 имелись данные о наличии в нем домена, подобного репликативным ДНК-эндонуклеазам (iiyina and Koonin, 1992). Тем нэ менее, нам не удалось обнаружить существенной гомологии продукта 0РТ2 с эндонуклеазными белками. Наиболее заметные гомологии были выявлены с различными ДНК-связыванцими активаторными белками, в частности, с белком р57 из папиломавируса.

Для аминокислотной последовательности белка ОРТЗ были отмечены некоторые черты, характерные для капсидных белков вирусов, а также определенная гомология с геном art hiv (Rohde et ai., 1990). Хотя в данной работе удалось обнаружить некоторую гомологию последовательностей ОРТЗ с капсидными белками аденовирусов, все же кажется маловероятным, что белок, кодируемый ' ОРТЗ, может играть роль'капсидного белка ВУЛКП и более вероятной представляется его ДНК-связывзвдая и регуляторная роль.

Аминокислотная последовательность 0РТ4 обнаруживала заметную гомологию со множеством трансмембранных и мембранносвязанных белков. Так как мембранносвязанные белки кодируются ДНК многих вирусов, была предпринята попытка анализа продукта 0РТ4 методом Pao и Аргоса (Rao and Argos, 1986). Полученные результаты подтвердили наличие гидрофобного трансмеыбранного домена на С-коице данного белка (Рис. 5А). Профиль погруженной спирали, расчитаный для этого гипотетического белка сходен с профилем, полученным нами для 10-11 кДА белков wdv и msv (Рис. 5Б,В).

Для ОРТ5 не удалось выявить какую-либо гомологию с вирусными и невирусными белками из банка данных.

Для ОРТ6 было выявлено некоторое сходство с продуктами env многих штаммов hivi и hiv2, а также с капсидным белком реовируса rdv. Отражают ли эти данные роль продукта 0РТ6 в упаковке ДНК вируса остается неясным.

Весьма интересные данные были получены для продукта 0РТ7. Были обнаружены два достаточно ярко выраженных участка сходства 0РТ7 с 0РГ-1С bbtv. Кроме того, были найдены достаточно выраженные гомологии с разными хеликазными белками (tri 2 хеликаза и никаза из f фактора е. соц., хеликазный домен из полимеразы pvx), хотя gks мотав в самом 0РТ7 белке отсутствует.

».:.

1.3 -1.2 -1.1

1 ■ 19 -.8 " .7

.4 '

Рисунок 5. Сравнение предсказанных профилей . погруженных спиралей дня продукта 0РТ4 ВУЛКП с предсказанными профилями погруженных спиралей ы-кондевых участков (1-62 аминокислотный остаток) 10-11 кДа белков геминивирусов однодольных раЬтений.

A) Профиль погруженной спирали дат продукта 0РГ4 ВУЛКП.

Б) Лрофгль погруженной спирали для белка 13кДА ¡¡37.

B) Профиль погруженной спирали для белка 10 кДа Ш7.

Было также найдено сходство ОРТ7 ВУЛКП с некоторыми мембранными белками. Предпринятый поиск по методу Pao и Аргоса (Rao and Argos, 1986) выявил наличие в последовательности белка 0РГ7 трех предполагаемых трансмембранных домена. Полученная картина имеет явное сходство с профилью погруженной спирали 14,5 кДА бежа csmv. Интересно отметить, что средняя часть (от 50 до III остаток) профиля погруженной спирали для 0РТ7 сильно напоминает профиль, расчиганный для 0РТ4.

Таким образом, в составе предоологаемых белков ВУЛКП были выявлены два потенциально трансмембранных белка (кодируемых рамками 0РТ4 и 0РТ7), каждый из которых имеет сходства по расположению трансмембранных сегментов с разными предполагаемыми транспортными белками геминивирусов однодольных растений.

Были также проведены поиски гомологий между белками ВУЛКП с целью выявления возможной дупликации на уровне белков. В целом не наблюдалось заметной гомологии, кроме двух случаев:

1. имеется непротяженный гомологичный участок локализованный в н- концевых участках ОРТЕ и ОРТЗ ОРТЕ (27) sstesrlvl

ОРТЗ (16) SRTQARLVL

2. имеются 2 участка, с ограниченной гомологией между белками 0PTI и 0РТ7 :

0pti ( 27) ieslnlvyaivgdevapstgqrhlqgfihlktgrrl — _*■*_ — _**_--- —__*

0РТ7 (126) LEKHPFLRTVVSILFVGTTGRLQVNPVIPXNSLQSL И .

0pti ( 93) ERVLLEHGVPIRPGVKRPRLAQRFAEEPDELR *_* ** _* — —__«

0РТ7 ( 22) EPVGLESEIFGKHGLPVSSVSSAYPEDCAIVR

Наличие таких сходных участков в белках, закодированных разными цепями ДНК, является весьма интересным, хотя значение этого остается невыясненным.

Обращает на себя внимание факт, что ДНК ВУЛКП, согласно выше приведеным данным, не содержит последовательности для белка оболочки. Предположение о' том, что ОРТЗ яаляется геном для капсидного бежа (Rohde et ai., 199оъ) кажется недостаточно обоснованным. В то же время известно, что ВУЛКП упаковывается в

вирионы (Randies et al., 1986), СХОДНЫ6 С ВИрИОНЭМИ SCSV И BBTV,

а белки оболочки этих вирусов имеют размеры порядка 19-20 кДа

(Chu et al., 1990; Harding et al., 1993). ТЭК КЭК В ИЗВвСТНОЙ ДНК

ВУЛКП нет кандидатов на роль капсидного белка, кажется весьма вероятнш, что ВУЛКП также обладает многокомпонентным геномом и по крайней мере капсидный белок кодируется неизвестным пока компонентом генома ВУЛКП.

ВЫВОДЫ

1. Построена модель вторичной структуры для геномной ДНК вируса увядания листьев кокосовой пальмы (ВУЛКП). Показана высокая степень спаривания основании (62%) и наличие во вторичной структуре черт, похожих на "модель цветка" РНК-содержащих бактериофагов.

2. Методом компьютерного анализа выявлены потенциальные цис-действукщие элементы генома ВУЛКП и показано их сходство с цис-элементами эукариот и вирусов эукариот.

3. Осуществлен химико-ферментативный синтез и клонирование полной геномной ДНК ВУЛКП в составе бактериальных плазмидных векторов. Разработана методика для химико-ферментативного синтеза крупных ДНК фрагментов.

4. Путем электропорации протопластов ячменя копией генома ВУЛКП и анализа полученных продуктов установлено наличие в протопластах вирус-специфических РНК. Определены з'-концы РНК транскршггов с (+) цепи ДНК, показано, что они полиаденилированы.

5. Методом ПЦР амплификации кДНК и -последующей их транскрипции и трансляции in vitro обнаружены вирус-специфические белки, соответствующие ОРТ из ДНК ВУЛКП.

6. Компьютерным анализом кодирующих последовательностей выявлена новая ОРТ в геноме ВУЛКП (0РТ7). Показано наличие иембраносвязанных доменов в белках, кодируемых 0РТ4 и 0РТ7. Показаны сходства профилей погруженной спирали этих белков и предполагаемых транспортных белков геминивирусов однодольных растении.

is

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Чернов Б.К., Мерите А., Мизенина О.А. и Морозов O.D. -Химико-ферментативный синтез и клонирование полноразмерного генома ДНК-содержащего вируса растении.- Биоорганическая химия, т.18, с.1487, 1992.

2. Morozov S.Yu., Chernov В.К., Merits A. and Blinov V.M. -Oomputer-aeeisted prediotione of the eeoondary struoture in the plant virus вingle stranded DNA genome, Journal oi biomoleoular etruoture & dynamios, 1994, in press.

3. Merits A., Zelenina D.A., Chernov B.K. and Morozov S.Yu. -Transcripts mapping and the oDNA, in vitro expression in plant oiroovims, FEES Letters, 1994, in ргевв.

Подписано в печать ft/193 Усл. печ. л. /, О

Формат 80*tl//C

Заказ Тираж НО

Типография Россельхозакадемня