Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеризация комплекса BBS белков и его роли в формировании и функциональной активности ресничек и микротрубочек клеток человека

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Характеризация комплекса BBS белков и его роли в формировании и функциональной активности ресничек и микротрубочек клеток человека"

На правах рукописи

Локтев Александр Валерьевич

ХАРАКТЕРИЗАЦИЯ КОМПЛЕКСА BBS БЕЛКОВ И ЕГО РОЛИ В ФОРМИРОВАНИИ И ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ РЕСНИЧЕК И МИКРОТРУБОЧЕК КЛЕТОК

ЧЕЛОВЕКА

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцово - 2009

003462181

Работа выполнена в ФГУН Государственный научный центр вирусологии

и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития РФ и в компании «Генентех», США

Научный руководитель:

Доктор Питер Джексон

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор

Елена Ивановна Рябчикова

Доктор медицинских наук, профессор

Андрей Георгиевич Покровский

Ведущая организация:

Институт Цитологии и Генетики Сибирского отделения РАН, Новосибирск

Защита состоится 5 марта 2009 года часов на заседании диссертационного совета Д.208.020.01 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии "Вектор" по адресу: ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора, Кольцово Новосибирской области, 630559, тел. (383) 3336-74-28

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ ВБ "Вектор" Автореферат разослан ¿У,- 2009 года Ученый секретарь

диссертационного совета Л.И.Карпенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Первичные реснички являются важной органеллой клетки и необходимы для жизнедеятельности многих многоклеточных организмов. У позвоночных ранние нарушения сборки первичных ресничек приводят к серьезным сбоям эмбрионального развития, вплоть до гибели эмбриона. В организме позвоночных функции первичных ресничек варьируют в зависимости от типа клеток и тканей, хотя более известна их сенсорная функция. Значимость первичных ресничек, как сенсорных органелл клетки, подтверждается наличием многочисленных патологических синдромов человека, имеющих одинаковую этиологию - нарушение функции первичных ресничек (Badano J.L. et al, 2006).

Синдром Барде-Бидля (также известного как Лоуренса-Муна-Барде-Бидля) является одним из самых плейотропных синдромов этого типа. Мутации в любом из 12-ти картированных BBS генов (Bardet-Biedl syndrome) вызывают развитие патологического синдрома с практически одинаковыми симптомами, которые включают ожирение, диабет, дистрофию сетчатки, врожденное слабоумие, многопалость, а также многочисленные вторичные симптомы. По структурной организации BBS белки существенно отличаются друг от друга, кроме того, их молекулярные функции или неизвестны, или являются гипотетическими. Однако, генетические исследования различных видов организмов позволили предположить, что BBS белки участвуют в функционировании ресничек клетки (Blacque О.Е. et al, 2006). Было предложено две модели функциональной активности BBS белков на клеточном уровне. Для нематод было показано, что BBS белки участвуют в координации внутри ресничкового транспорта (ВРТ), который необходим для построения ресничек (Ou G. et al, 2005). С другой стороны, на основе исследования клеток млекопитающих, было высказано аргументированное предположение о том, что белок BBS4 необходим для транспорта центриольных спутников (ЦС) к центросоме клетки, которая в свою очередь обеспечивает правильную сборку ресничек (Ansley S.J. et al, 2003). Однако, ни одна из этих двух активностей не позволяет в полной мере объяснить взаимосвязь между потерей функциональной активности любого из двенадцати BBS белков у человека и возникновением разнообразных патологических симптомов синдрома Барде-Бидля.

Связь клинических проявлений, характерных для синдрома Барде-Бидля, с молекулярной функцией 12-ти BBS белков представляет не только важную и интересную фундаментальную научную проблему, она также принципиально важна для понимания молекулярных механизмов развития некоторых тяжелых заболеваний

человека. Это собственно сам синдром Бардет-Бидла и, вне сомнения, сопутствующие ему диабет и ожирение. Сегодня, по данным ВОЗ, от диабета в различных странах мира страдает около 180 миллионов человек и приблизительно около 1,1 миллиона человек погибает ежегодно (www.who.int/whr/en). Ожирение и диабет тесно взаимосвязаны между собой, а статистические данные по ожирению не менее впечатляющие. Общее количество больных ожирением оценивается в 300 миллионов человек, а так или иначе страдает от ожирения до 30% взрослого населения и 10% детей проживающих в развитых странах. Поэтому исследование возможной взаимосвязи генетически обусловленных нарушений функций ресничек с развитием диабета и ожирения также актуально и принципиально важно для понимания генетических основ патогенеза всех этих заболеваний и поиска принципиально новых подходов для борьбы с этими тяжелыми заболеваниями человека.

Цель и задачи исследования. Основной целью настоящей работы являлось изучение молекулярной функции BBS белков в клетке и поиск модели, функционально объединяющей эти 12 белков на молекулярном уровне.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

• Создание клеточной линии человека, позволяющей эффективно выделять белки, ассоциированные in vivo с известными BBS белками.

• Выделение и биохимическая очистка BBS ассоциированых белков с их предварительной характеризацией.

• Исследование возможной функциональной активности BBS белков, а также связанных с ними белков, с помощью биохимических и цитологических методов для уточнения их роли в функционировании ресничек и центросомы.

• Структурно-функциональный анализ BBS белков и BBS ассоциированных белков.

Научная новизна и практическая ценность. В результате проделанной работы получена уникальная линия клеток человека, стабильно экспрессирующая белок 30B-BBS4. С использованием полученной клеточной линии, технологии тандемной аффинной очистки в комбинации с тандемной масс-спектроскопией впервые было показано, что семь самых консервативных из 12 BBS белков связываются друг с другом и образуют белковый комплекс, который был назван ББсома. Биохимическая характеризация показала, что белки, составляющие ББсому (BBS1, 2,4, 5, 7, 8 и 9), в

условиях in vivo присутствуют исключительно в составе комплекса в стехиометрических количествах, причем комплекс слабо связывается с белком центриоляриых спутников РСМ-1. Также было показано, что ББсома внутри первичной реснички ассоциирована с мембраной реснички, тогда как в цитоплазме наблюдалась на центриоляриых спутниках.

Впервые были получены убедительные доказательства того, что ББсома необходима для сборки первичных ресничек и, в частности, для построения мембраны реснички. Было показано, что BBS1 субъединица ББсомы связывается с фактором обмена гуанозин трифосфата (ГТФ) для маленькой Rab8 ГТФазы - Rabin8 - которая необходима для активации Rab8. Активация белка Rab8 с помощью белка Rabin8 является необходимым этапом при слиянии мембранных везикул у основания реснички и построения мембраны реснички. Таким образом, нами впервые была предложена единая молекулярная модель развития BBS. Она предполагает, что мутация в любом из 7 составляющих ББсому BBS белков может существенно подавлять функцию всего комплекса в процессе сборки мембраны реснички при участии белка Rab8. Именно с этим может быть связан плейотропный фенотип заболевания.

При характеризации белков, ассоциированных с ББсомой, был обнаружен новый консервативный белок, который получил название BBIP10. Было показано, что BBIP10 является стехиометрической субъединицей ББсомы. Он необходим для сборки реснички и сборки ББсомы, как белкового комплекса. Сравнение клеточных функций BBS белков и BBIP10 позволило выявить функциональную роль BBIP10. Она заключалась в регуляции стабильности микрогрубочек (МТ) и ацетилировании тубулина, составляющего МТ. Было продемонстрировано, что цитоплазматическая фракция BBIP10 не связанна с ББсомой и необходима для поддержания стабильности МТ цитоскелета и их ацетилирования, причем эти активности не зависят друг от друга. Возможным механизмом контроля ацетилирования тубулина является ингибирование диацетилазы тубулина - HDAC6. Таким образом, можно предположить, что ББсома осуществляет координацию между построением мембраны реснички за счет связывания с белком Rabin8 и ацетилированием аксонемы реснички за счет BBIP10 субъединицы.

Расшифровка молекулярного механизма формирования ББсомы открывает принципиально новый подход к исследованию молекулярной основы патологии тяжелого генетического заболевания человека. Этот подход может быть полезен для поиска потенциальных мишеней для лекарственных препаратов. Полученные данные о молекулярном механизме развития BBS могут быть в дальнейшем использованы для разработки методов лечения таких заболеваний, как ожирение и диабет.

Положения, выносимые на защиту:

1. Очистка и характеризация ББсомы, как олигомерного белкового комплекса состоящего из белков BBS1, 2,4,5, 7, 8 и 9, а также факультативной субъединицы PCM-1.

2. Функциональная роль ББсомы в построении первичных ресничек.

3. Участие ББсомы и связаного с ней активатора Rabin8 в активации ГТФазы Rab8.

4. Участие белка Rab8 в построении мембран ресничек.

5. Обнаружение нового белка BBIP10 в составе ББсомы, данные по его биохимической и функциональной характеризации.

6. Участие BBIP10 в регуляции стабильности микротрубочек цитоскелета и их ацетилирования независимо от его функции в составе ББсомы.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на следующих международных конференциях: The American Society for Cell Biology 46th Annual Meeting, San Diego, CA, США; FASEB Meeting «The Biologyof cilia and flagella», Saxton's River, VT, США. По материалам диссертации опубликованы 8 полноразмерных статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 20 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы, включающего 2 отечественных и 148 зарубежных источников. Общий объем работы составляет 117 страниц текста, иллюстрированного 4 таблицами и 36 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В настоящей работе использовался принципиально новый подход для исследования молекулярных механизмов плейотропных генетических заболеваний человека, на примере синдрома Барде-Бидля. Большинство данных о функциях BBS белков было получено с использованием генетических методов и различных модельных организмов. Нами был избран подход, основывающийся на характеризации белок-белковых связей между BBS белками посредством метода локализации и тандемной аффинной очистки (JIAO) с последующией идентификацией белков с помощью тандемной масс-спектроскопии. Данный подход является аптернативным по отношению к классическим молекулярно-генетическим исследованиям.

Для реального использования этого подхода была получена уникальная линия клеток человека RPE-[JIAO]BBS4, экспрессирующая белок BBS4, который был модифицирован для очистки и идентификации взаимодействующих с ним белков. С использованием этой линии впервые была показана локализация одного из BBS белков в

первичных ресничках позвоночных, помимо их присутствия в центриольных спутниках, что хорошо согласуется с данными о локализации BBS белков у нематод (Рис. 1 А) (Ои G. el al, 2005). Схема тандемной аффинной очистки и идентификация белков, ассоциированных с BBS4. из клеток RPE[J1A0]BBS4 представлена на рисунке 1Б. Идентификация белков очищенных таким метдом с помощью тандемной масс-спектроскопии показала что 7 из 12 самых эволюционно консервативных BBS белков взаимодействуют в BBS4 (Рис.1 Б и 1В). Кроме того, был открыт новый белок получивший название BBIP10 (BBSome interacting protein of 10 kDa) и было подтверждено взаимодействие между BBS4 и белком центриольных спутников РСМ-1.

А

BBS4 ацтуб РСМ-1 РСМ-1 ДНК 4 '"'губ

V" : Ч .

Рисунок 1. Характеризация клеточной линии RPE-[JIAO]BBS4 и очистка комплекса BBS белков.

(A) RPE-[JIAO]BBS4 клетки, выращенные при отсутствии ФБС, были проанализированы с помощью иммуно-флюоресцентной микроскопии с использованием антител к ЗФБ и РСМ-1, ДНК окрашена Hoechst. Контуры клеток приведены для ориентации. Масштабные отрезки 5 мкм. Рисунок 7. Очистка BBS4 ассоциированных белков из клеточной линии RPE-[JIAO]BBS4. (Б) Схематическое изображение процедуры тандемной аффинной очистки белков связанных с BBS4. (В) Анализ исходного лизата клеток RPE-[JIAO]BBS4, а также конечных элюатов тандемной афинной очистки из контрольных RPE клеток и клеток RPE-[JIAO]BBS4 с помощью электрофореза в 4-12% ПААГ с окрашиванием нитратом серебра. Идентификация индивидуальных белковых бэндов была проведена с помощью тандемной масс-спектроскопии.

+TEV протеаза

элюция/электрофорез

идентификация белков о помощью тандемной масс-спектроскопии

Детальная физико-химическая характеристика взаимодействия белков взаимодействующих с BBS4 позволила заключить, что белки BBS1, BBS2, BBS4, BBS5, BBS7, BBSS, BBS9 и BBIP10 формируют стабильный мультисубъединичный белковый комплекс, который получил название ББсома (Рис. 2). In vivo, почти все субъеденицы ББсомы присутствуют исключительно в составе ББсомы в стехиометрических количествах. Исключение составляет новый белок BBIP10, с помощью гель-фильтрации было показано что значительное количество этого белка находится в цитоплазме в несвязаном с ББсомой виде.

ИБ: BBS4|# -BBIP10f^~

Рисунок 2. Биохимическая характеризация комплекса белков ассоциированных с BBS4. Элюат после первого этапа аффинной очистки (Рис. 1Б) был подвергнут центрифугированию в градиенте плотности сахарозы. Фракции были разделены электрофорезом в 4-12% ПААГ, который был окрашен нитратом серебра. Белки с известными коэффициентами седиментации анализировались идентично. Фракции были также проанализированы с помощью иммуноблота с антителами к BBS4 и BBIP10 (нижняя панель).

Белок РСМ-1 является основным компонентом центриольных спутников и, согласно нашим данным, связывается периферически с ББсомой. Модель функции BBS4 в клетках позвоночных, предложенная Ким с соавторами, постулирует роль BBS4 в функции ЦС и центросомы (Kim J.C. et al, 2004). Тем не менее, различие в консервативности между РСМ-1 и всеми субъединицами ББсомы (включая BBS4) позволяет предположить, что функции РСМ-1 и ББсомы не полностью совпадают. Для сравнительного анализа роли РСМ-1, ББсомы и остальных BBS белков в функции центриольных спутников, а также в сборке первичных ресничек, была

успешно использована технология подавления экспрессии белков с помощью малых интерферирующих РНК (миРНК) с последующим фенотипическим анализом.

Как и ожидалось, ингибирование синтеза РСМ-1 трансфекцией соответствующей миРНК в клетках RPE-[JIAO]BBS4 привело к исчезновению ЦС и ресничек. При подавлении продукции BBS белков при помощи соотвествующих миРНК, только ингибирование экспрессии белков BBS1, BBS5 и BBIP10, являющихся субъеденицами ББсомы, привело к уменьшению образования ресничек (Рис. 3), тогда как маркеры функции ЦС не изменились. Из результатов по подавлению экспрессии BBS1, можно заключить что локализация BBS4 и РСМ-1 осталась неизменной, в то время как негативный эффект на образование ресничек был сравним с эффектом миРНК, подавляющей экспрессию РСМ-1.

100,

миРНК

Рисунок 3. Количественный анализ формирования ресничек в RPE клетках, трансфецированных миРНК к ВВ1РЮ, РСМ-l и BBS генам.

Таким образом, полученные результаты показывают, что ББсома осуществляет регуляционный контроль образования ресничек и не играет роли в функции ЦС. На основе литературных данных, а также описанных выше результатов можно предположить, что ББсома транспортируется ЦС к базальному тельцу, посредством связывания с РСМ-l, где происходит диссоциация с РСМ-1, после чего ББсома выполняет свою роль в образовании ресничек в непосредственной близости к центросоме и/или внутри реснички.

Диссоциация ББсомы с РСМ-1, происходящая перед локализацией ББсомы в первичную ресничку, позволяет предположить изменение физико-химического состояния этого белкового комплекса. Для проверки этой гипотезы клетки RPE-

[JIAOJBBS4 были подвергнуты обработке неионными детергентами, экстрагирующими клеточные мембраны. Было показано, что при обработке клеток Тритоном Х-100 перед фиксацией и ИФМ, окрашивание BBS4 внутри первичной реснички исчезает, в то время как сигнал на центриольных спутниках остается неизменным (Рис. 4), что позволяет предположить что ББсома связывается с мембраной реснички. Было установлено, что ББсома ассоциирована с мембраной реснички, возможно путем непосредственного связывания с липидами мембраны, опосредованного взаимодействием BBS5 субъеденицы с фосфатидил инозитолами.

Рисунок 4. Экстрагирование клеточных мембран в клетках RPE-[JIAO]BBS4. Перед фиксацией клетки были инкубированы в буфере с добавлением детергента Тритон Х-100 или без него. После фиксации была проведена ИФМ с использованием AT к ЗФБ, ац-тубулину и РСМ-1, ДНК была окрашена по Hoechst. Маленькие стрелки указывают на дистальный конец реснички, а большие стрелки на конец, проксимальный к базальному тельцу. Масштабный отрезок 5 мкм.

Дальнейшее детальное изучение роли ББсомы в формировании первичных ресничек позволило выявить взаимодействие между ББсомой, а именно BBS1 субъединицей, и белком Rabin8. Белок Rabin8 является фактором обмена нуклеотидов для малой ГТФазы Rab8, то есть стимулирует замену ГДФ на ГТФ, вызывающую активацию Rab8. В целом, ГТФазы группы Rab участвуют в регуляции транспорта мембранных пузырьков между различными органеллами клетки, осуществляемой путем индуцирования слияния мембран пузырьков с мембраной целевой органеллы (Zerial М. et а!, 2001). Функциональная важность этого взаимодействия была подтверждена тем фактом, что RabinS, как и ББсома, необходим для формирования первичных ресничек. Из этого следует, что ББсома

может быть необходима для активации ГТФазы Rab8 и это регулирует построение мембран первичных ресничек.

Проведенные исследования позволили впервые показать, что белок Rab8 локализован в ресничках, а экспрессия конститутивно-активного варианта Rab8[67L] вызывает удлинение мембран и аксонем ресничек (Рис. 5А). Было установлено, что ингибирование функции белка Rab8 приводит к ингибированию образования первичных ресничек. Наши данные о зависимости локализации Rab8 в реснички от присутствия белка RabinS свидетельствуют, что только активированная форма Rab8 находится в первичных ресничках (Рис. 5Б). Кроме того было показано, что подавление функции Rab8 у модельных животных Danio rerio приводило к появлению BBS фенотипов, что предполагает функциональную связь между BBS белками и Rab8 в формировании ресничек. Таким образом, совокупность полученных результатов свидетельствует, что сбалансированая активация Rab8 играет важную роль в образовании мембраны первичных ресничек.

3<¡>B-Rab8[WTj__3<¡>B-Rab8[Q67L)__3$E-Rab8[T22N]

ДНК ЗФБ /6 пер / ""......■•■■ ... • - - • ' ' " ¡J.1, „

ЗФБ /

Б _миРНК_

_контроль__Rabín8

ДНКЗФБ-RabÖ

íii;tv6 пер

И

Рисунок 5. Локализация Rab8 в клетке и его роль в образовании ресничек.

(А) Клетки RPE были трансфецированы указанными вариантами Rab8 и проанализированы ИФМ, с использованием антител к ЗФБ, перицентрину, ац-тубулину, ДНК была окрашена по Hoechst. Масштабные отрезки 5 мкм. (Б) RPE клетки были трансфецированы плазмидой ЗФБ-ЯаЬ8 через 12 часов после трансфекции миРНК к Rabin8 или контрольной миРНК. Через 12 часов после второй трансфекции клетки были инкубированы в среде без ФБС в течение 24 часов, после чего проанализированы ИФМ с AT к ЗФБ, перицентрину и ац-тубулину, ДНК была окрашена по Hoechst. Масштабные отрезки 5 мкм.

Исходя из вышесказанного, можно предположить, что функциональная активность ББсомы в клетке включает в себя следующие этапы. Сначала ББсома связывается с РСМ-1 и транспортируется центриольными спутниками к базальному тельцу, где происходит ее диссоциация с РСМ-1. Затем, происходит взаимодействие ББсомы с Rabin8, что обуславливает строго локализованную активацию ГТФазы Rab8. Активация Rab8 у основания реснички стимулирует направленный транспорт и слияние мембранных пузырьков, предназначенных для формирования мембраны реснички. На следующем этапе ББсома направляется внутрь реснички, где может осуществлять координацию субъединиц ВРТ и, возможно, обеспечивать координацию роста мембраны и аксонемы первичной реснички.

Предложенная нами модель была поддержана последующими исследованиеми других групп. Так, в мышах с делегированным геном BBS4 было обнаружено отсутствие траисмембранных рецепторов соматостатина и серотонина в первичных ресничках нейронов мозга, где они находятся в норме (Berbari N.F. et al, 2008). Ингибирование функции Rab8 в фоторецепторных нейронах приводит к массивному накоплению мембранных пузырьков содержащих родопсин у основания перетяжки (Moritz O.L. et al, 2001).

Как уже упоминалось выше изучение BBS белков, идентифицированных в результате очистки ББсомы, привело к открытию нового белка, получившего название BBIP10 (Рис 1В). Открытый нами белок является чрезвычайно консервативным и присутствует в геномах человека, млекопитающих и далее вплоть до геномов одноклеточных жгутиковых. При этом BBIP10 не содержит никаких доменов и мотивов с уже известной функцией (Рис 6).

Человек

Мышь

Лягушке

Данио

Губка

Морской_еж

Дрозофила

Нематода

Хламидомонада

Тетрахнмена

Инфузория

Трнпаносома

Лейшмания

Человек

Мышь

Лягушка

Данио

Губка

Морсконе*

Дрозофила

Нематода

Хламидомонада

Тетрахимена

Инфузория

Трипаносома

Лейшмания

1-------mlkaaakrpelsgknti snnsdmalvklmfr®vlрк

I...........................- -mAIvkImF RfrVl Р К

1-----------------------------mpBvksmfrevlpk

1-----------------------------mp|VKSMFREVLPK

i----------------------------mstskl|mfiti6vlpk

1......-.....-................mpdnknqfkevlpk

1.........................ms sveaivlqk IOL I epttJkuff

1 mdivtflnggvdegevapateknekqe rvvmsqc e

-msiqksa

1

-mndlqk>ml

1 -....................- meqpqqrac sde

i......................md 5qap ycdvvde

se 30 i к 30

45 ib

23 vtlmvlckpkllp

23 VPTMV LCKPBj LP ¡3 v'PTMVLCKPKLLP

24 5pSLVLCKPKIMP ¿3QPTMVLCKPKLLP 27 kteLLFlRPHLMP s3 tl|pi fikpkl ip

25 nl|eiLCKPlLMP

26 tnkeiLCKPll LP 19 qfsevlckp|imp

31 EPKGLLCPPlKLLP i! OMOLQLCICPkLLP

■maekdqrqith---

Imaekatsk------

Ipvqsdpppgpe---

ilalkeqppsekae-

qkemenk se s.....

|mae rlqqsqgiccf 4rdtarqlqkkrqqkkksteptgsl-|reqmerlqvp|gqkartpesaeaes

iljemeakisevt| Kit e leiqmlnqi кihq leqqvn e qnl

rl1hle|rmadet| kl|bme|klahev|

qaarlgtaacprpgt

pkdn-

-rqe rqqqkatpqwn rdan raqkqaa lvwt

92 67 70

72 69

73 76 103 75 67 52

Рисунок 6. Выравнивание аминокислотных последовательностей BBfPIO и его гомологов из 13 видов организмов, проведенное с помощью ClustalX (Thompson J.D. et al, 1997) и редактора Jalview (Clamp M. el al, 2004).

Аминокислотные остатки с более чем 30% идентичностью окрашены согласно матрице сравнения ClustalX.

Исследование взаимодействия между ББсомой и BBIP10 дало основание считать, что BBIP10 является стехиометрической субъединицей ББсомы, вместе с описанными выше семью BBS белками (Рис. 2). Однако надо отметить, что значительная часть внутриклеточного BBIP10 не связана с ББсомой, что позволило предположить, что не связанный с ББсомой белок имеет независимую от нее функцию.

В отличие от BBS4, BBIP10 не наблюдается на центриольных спутниках, а локализован непосредственно в первичной ресничке RPE клеток, ВВ1Р10 также обнаруживается в цитоплазме (Рис. 7). Таким образом, обобщая результаты исследования локализации ВВ1Р10, можно заключить, что его связывания ББсомой происходит в первичной ресничке. Подавление экспрессии BBIP10 в клетках человека вызывало ингибирование формирования первичных ресничек (Рис. 3), а в эмбрионах D.rerio - появление типичных BBS фенотипов. Полученные данные позволяют предположить, что BBIP10 в составе ББсомы, также как и другие ее субъеденицы, выполняет важную функцию в процессе формирования первичных ресничек.

Рисунок 7. Локализация BBIP10 RPE-[JIAO]BBS4 клетках.Результаты иммуно-флюоресцентной микроскопии с использованием антител к ЗФБ, BBIP10, ац-тубулину, ДНК была окрашена по Hoechst. Масштабные отрезки 5 мкм.

Для более детального изучения функции BBIP10 был проведен сравнительный анализ эффектов подавления экспрессии BBIP10 и всех двенадцати BBS белков с помощью РНК интерференции. Все опубликованные данные о функции BBS белков так или иначе связаны с микротрубочками, поэтому сравнительный анализ фенотипов было решено ограничить исследованием клеточных процессов, связанных с ними. В частности, были проанализированы следующие параметры: ацетилирование тубулина; формирование ресничек; целостность центросомы; активность центра организации микротрубочек; распределение центриольных спутников в клетке. Проведенный сравнительный анализ показал, что помимо участия в образовании первичных ресничек BBIP10 также играет важную роль в регуляции стабильности микротрубочек цитоскелета и ацетилирования тубулина. В частности, наблюдалось значительное снижение количества полимеризованного и ацетилированного тубулина в клетках лишенных BBIP10, что сопровождалось нарушением целостности центросом (Рис. 8А). При этом на основании сравнения фенотипов возникающих при ингибировании экспрессии BBIP10 и BBS белков можно заключить, что набор фенотипов появляющихся при ингибировании экспрессии BBIP10, является уникальным. Сходные индивидуальные фенотипы, например потеря активности центра организации микротрубочек и нарушение целостности центросом, также возникают при ингибировании экспрессии некоторых BBS белков (BBS8 и BBS 11). При этом уменьшение ацетилирования тубулина не воспроизводится ни одной миРНК из исследовательной панели, что позволяет предположить, что этот фенотип специфичен только для BBIP10 и не зависит от функции ББсомы и BBS белков.

миРНК

BBIP10 BBS1 контр. фракция: С О С О С О а-тубулин 1 ■ шт

ац-туб глю-туб полиглю-туб

45 40 1 35

8 125

|120 | ?15

| 10

5

0

Ii

BBIP10 BBS1 контр. миРНК

Рисунок 8. Исследование эффекта ингибирования ВВ1РЮ на ацетилирование тубулина.

(А) Клетки RPE были трансфецированы контрольной или BBIP10 миРНК и подвергнуты иммуно-флюореецентной микроскопии с использованием антител к ац-тубулину, у-тубулину, ДНК была окрашена по Hoechst. Центросомы обозначены стрелками. (Б) Лизаты клеток, траисфецированных соотвествующими миРНК, были фракционированы с помощью метода позволяющего разделить полимеризованный и неполимеризованный тубулин. Затем, осадки (О), содержащие микротрубочки, и супернатанты (С), содержащие неполимеризованный тубулин, были проанализированы с помощью количественного иммуноблота с использованием антителами к а-тубулину, ац-, глю-, полиглю-тубулину. Процент полимеризованного тубулина был рассчитан исходя из отношения интенсивностей ац-тубулиновых бэндов в О и С фракциях на блоте.

Субъединицей микротрубочек является гетеродимер тубулина, состоящий из а и |3 изоформ. Тубулин микротрубочек, а также органелл, основанных на микротрубочках (центросома и ресничка), подвергается многочисленным пост-

трансляционным модификациям (ПТМ), таким как ацетилирование, полиглютаминирование, детирозинирование (Westermann S. et al, 2003). В отличие от остальных ПТМ, где модифицируется и а и р тубулин, ацетилированию подвергается только К40 а-тубулина (L'Hernault S.W. et al, 1985). Антитела, специфичные к ацетилированному эпитопу а-тубулина, традиционно используются в качестве маркера ресничек, так как микротрубочек аксонемы реснички ацетилированы в значительной степени (Westermann S. et al, 2003). Тубулин цитоплазматических микротрубочек также ацетилируется. Предполагается, что ацетилирование происходит после полимеризации тубулина (Maruta Н. et al, 1986; Piperno G. et al, 1987). При этом ацетилирование цитоплазматических микротрубочек кореллирует с продолжительностью их существования в клетке, то есть ацетилированные МТ являются самыми стабильными и долгоживущими (Webster D.R. et al, 1989). Тем не менее, непосредственная роль ацетилирования в регуляции стабильности МТ остается спорной (Palazzo A. et al, 2003).

Для доказательства специфичности влияния BBIP10 на ацетилирование тубулина была проведено исследование ПТМ тубулина в клетках с трансфецированных миРНК к BBIP10 биохимическими методами. В качестве дополнительного контроля специфичности была использована миРНК к BBS1, так как белок BBS1 необходим для образования ресничек, и является субъединицей ББсомы, как и BBIP10. Полученные нами экспериментальные данные свидетельствуют, что при ингибировании экспрессии BBIP10 уменьшается только ацетилирование тубулина, другие пост-трансляционные модификации тубулина остаются неизменными (Рис. 8Б). Также было показано что в этих клетках существенно уменьшается количество полимеризованного тубулина (Рис. 8Б).

Если снижение экспрессии BBIP10 с помощью РНК интерференции приводит к уменьшению ацетилирования микротрубочек то искуственное повышение экспрессии BBIP10 должно иметь обратный эффект. В подтверждение этой гипотезы было обнаружено увеличение ацетилирования тубулина в RPE клетки которы были трансфецированы плазмидой экспрессирующей химерный белок ЗФБ-ВВ1Р10.

уровень

ац-губулина о высокий и средний ■ низкий рО.ОООГ

ЗФБ ЗФБ-N=T5 BBIP10

Рисунок 9. Исследование эффекта повышенной экспрессии ЗФБ-ВВ1Р10 на апеллирование тубулина. Клетки RPE были трансфецированы экспрессионными плазмидами ЗФБ-ВВ1Р10 или ЗФБ и подвергнуты ИФМ с использованием AT к ац-тубулину, а-тубулину, ДНК была окрашена по Hoechst. Масштабные отрезки 5 мкм. Уровень окрашивания AT к ац-тубулину оценивался как высокий, средний или низкий только в клетках, экспрессирующих умеренное количество ЗФБ-ВВ1Р10 или ЗФБ. Низким считался уровень окрашивания, равный уровню в нетрансфецированных клетках. Статистическая достоверность разницы между двумя распределениями была рассчитана с помощью теста хи-квадрат и составила р<0,0001.

Механизм с помощью которого BBIP10 оказывает воздействие на стабильность цитоплазматических МТ остается неясным, так как, согласно полученным данным, динамика полимеризации МТ в клетках с ингибированной экспрессией BBIP10 является нормальной. Возможными механизмами, получившими некоторое экспериментальное подтверждение в настоящей работе, могут быть нарушение прикрепления МТ к центросоме и/или прямое связывание BBIP10 с МТ.

Основываясь на полученных данных можно предположить, что изменение ацетилирования тубулина, опосредованное BBIP10, осуществляется либо путем регуляции ферментов катализирующих ацетилирование-деацетилирование тубулина, либо является косвенным следствием изменений микротрубочек цитоскелета, описанных выше. Для того, чтобы подтвердить или опровергнуть один из этих двух предполагаемых механизмов, были проведены эксперименты с использованием таксола и нокадазола, - препаратов обработка которыми приводит к полимеризации/деполимеризации микротрубочек, соответственно. Установление факта ацетилирования тубулина после полной деполимеризации микротрубочек с помощью нокодазола позволяет предположить, что ингибирование экспрессии ВВ!Р10 предотвращает ацетилирование микротрубочек сформированных de novo.

Так как ацетилирование тубулина происходит после полимеризации в микротрубочки, стабилизация микротрубочек с помощью таксола является эффективным методом увеличения степени ацетилирования тубулина (Piperno G. et al, 1987). При обработке контрольных клеток возрастающими концентрациями таксола наблюдалось значительное увеличения количества МТ, что сопровождалось увеличением относительного содержания ац-тубулина в 15 раз. В случае с клетками, трансфецированными миРНК к BBIP10, несмотря на то, что уровень полимеризации тубулина при обработке таксолом приближался к уровню в контроле, уровень ац-тубулина оставался низким. Необходимо отметить, что, как и в предыдущих экспериментах, эффект обработки таксолом на другие ПТМ тубулина в обоих типах клеток был одинаковым. Таким образом, совокупность результатов, полученных в серии экспериментов по искусственной полимеризации/деполимеризации МТ позволяет предположить, что BBIP10 осуществляет контроль над ацетилированием тубулина на ферментативном уровне.

Исходя из этого предположения можно высказать две гипотезы, объясняющие комплекс полученных данных. Первая гипотеза предполагает, что BBIP10 активирует тубулин ацетилтрансферазу, а вторая гипотеза состоит в том, что BBIP10 способен ингибировать тубулин диацетилазу. Обе гипотезы удовлетворительно объясняют исчезновение ацетилирования тубулина при ингибировании экспрессии BBIP10 и увеличение его количества при оверэкспрессии BBIP10. Экспериментальная проверка первой гипотезы представляется весьма сложной, так как молекулярная природа тубулин ацетилтрансферазы не известна. Поэтому была предпринята попытка подтвердить или опровергнуть вторую гипотезу.

Если вторая гипотеза верна, то ингибирование тубулин диацетилазы HDAC6, являющимся доминантным ферментом диацетилирующим тубулин (Zhang Y. et al, 2008), в клетках с подавлсной экспрессией BBIP10 должно привести к восстановлению ацетилирования тубулина. Удалось установить, что ингибирование деацетилазы тубулина HDAC6, как химическим ингибитором так и с помощью РНК интерференции, частично восстанавливает ацетилирование тубулина в клетках с подавленной экспрессией BBIP10, из чего следует, что BBIP10 ингибирует HDAC6 (Рис. 10). Дальнейшее исследование механизма контроля ацетилирования затрудняется отсутствием информации о свойствах фермента осуществляющего ацетилирование тубулина, поэтому на основании наших данных нельзя исключить возможности того, что BBIP10 активирует ацетилтрансферазу. В будущем,

продолжение исследования роли ВВ1Р10 в регуляции ацетилирования тубулина может привести к получению новых знаний о молекулярных компонентах и функции этой пост-трасляционной модификации.

£■3.50 . £.3.00 ■ i 2.50 ■ 5,2.00 ■ ®,1.50. ¿.1.00 . ш 0.50 -

ац-туб

а-туб 1 HDAC6' миРНК:

t 1.ЧЭ 1,1

Jill

to to

о и

< <

о а

х I

+ +

о. а. ш m

¡2 со

О <

а

х

Рисунок 10. Исследование подавления активности HDAC6 в клетках с ингибированной экспрессией ВВ1Р10. Клетки RPE были трансфецированы HDAC6, BBIP10 миРНК, по отдельности или вместе (25 нМ или 50 нМ каждая миРНК). Лизаты были подвергнуты анализу с помощью количественного иммунблота с антителами к HDAC6, ац-тубулину и а-тубулину. Относительная интенсивность сигнала ац-тубулина, представленая в условных единицах (УЕ), была рассчитана как отношение интенсивностей ац-туб и а-туб бэндов.

Можно предположить, что функцией BBIP10 в составе ББсомы является стабилизация МТ аксонемы реснички путем контроля диацетилирования или ацетилирования. В пользу этой гипотезы говорит тот факт, что нами было обнаружено нарушение координации между образованием мембран и ацетилированием аксонем ресничек в клетках с гиперактивированным Rab8. Другими авторами было показано, что HDAC6 стимулирует резорбцию ресничек (Pugacheva E.N. el al, 2007). Исходя из выше сказаного, интересной гипотезой представляется то, что ролью ББсомы, как белкового комплекса в ресничке, является координация формирования мембраны и аксонемы реснички.

Полученные в настоящей работе данные являются важным вкладом в понимание механизмов патогенеза BBS на молекулярном уровне. Открытие стабильного комплекса из 7 BBS белков и белка BBIP10 позволяет значительно упростить

возможное моделирование BBS на уровне молекулярных взаимодействий. Можно предположить, что ББсома, и выполняемая ею роль в функционировании ресничек, является принципиально важной точкой развития сидрома Барде-Бидля и других заболеваний с сходными симптомами. Мутация одной из субъединиц ББсомы может привести к нарушению функции всего белкового комплекса. Представляется возможным, что остальные 5 BBS белков, которые не входят в состав комплекса, также оказывают влияние на функцию ББсомы. Дальнейшие исследования патогенеза BBS и фундаментальной биологии ресничек должны быть направлены, на наш взгляд, на развитие настоящей работы в следующих направлениях: исследование процесса контроля сборки ББсомы в виде белкового комплекса, изучение роли других BBS белков и выявление других белков, взаимодействующих с ББсомой.

ВЫВОДЫ

1. Открыт стабильный белковый комплекс, состоящий из 7 высоко консервативных BBS белков (BBS1, BBS2, BBS4, BBS5, BBS7, BBS8 и BBS9), получивший название ББсома.

2. Впервые установлено, что белки BBS1, BBS5 и BBIP10, формирующие ББсому, необходимы для построения первичных ресничек в клетках.

3. Получены доказательства связывания ББсомы с белком Rabin8, активатором ГТФазы Rab8, а также показано участие белков Rabin8 и Rab8 в образовании мембраны первичных ресничек.

4. Предложена единая модель функциональной активности ББсомы, которая заключается в регуляции построения мембраны реснички посредством активации белка Rab8, что обеспечивает направление мембранного транспорта к основанию реснички.

5. Обнаружен новый консервативный белок BBIP10 и показано, что BBIP10 является новой стехиометрической субъединицей ББсомы.

6. Установлено, что BBIP10 в составе ББсомы функционирует сходно с BBS белками, и он необходим для формирования и функционирования первичных ресничек в клетках и модельном организме.

7. Обнаружено, что часть свободного внутриклеточного BBIP10 необходима для поддержания стабильности и ацетилирования цитоплазматических микротрубочек.

8. Доказано, что BBIP10 регулирует ацетшшрование тубулина на уровне ферментов, катализирующих ацетилирование/диацетилирование и получены экспериментальные данные, показывающие, что возможным механизмом регуляции является ингибирование активности тубулин диацетилазы - HDAC6.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Loktev A.V., Zhang Q., Beck J.S., Searby C.C., Scheetz Т.Н., Bazan J.F., Slusarski D.C., Sheffield V.C., Jackson P.K., Nachury M.V. A BBSome Subunit Links Ciliogenesis, Microtubule Stability, and Aeetylation // Dev. Cell - 2008 - V. 15, P.854-865.

2. Nachury M.V., Loktev A.V., Zhang Q., Westlake C.J., Peranen J., Merdes A., Slusarski D.C., Scheller R.H., Bazan J.F., Sheffield V.C., and Jackson P.K. A core complex of BBS proteins cooperates with the GTPase Rab8 to promote ciliary membrane biogenesis.//Cell.-2007,-V. 129.-P. 1201-1213.

3. Eldridge A.G., Loktev A.V., Hansen D.V., Verschuren E.W., Reimann J.D., and Jackson P.K. The evi5 oncogene regulates cyclin accumulation by stabilizing the anaphase-promoting complex inhibitor emi 1. // Cell. - 2006. - V. 124. - P. 367-380.

4. Miller J.J., Summers M.K., Hansen D.V., Nachury M.V., Lehman N.L., Loktev A., and Jackson P.K. Emil stably binds and inhibits the anaphase-promoting complex/cyclosome as a pseudosubstrate inhibitor. // Genes Dev. - 2006. - V. 20. • P. 2410-2420.

5. Tung J.J., Hansen D.V., Ban K.H., Loktev A.V., Summers M.K., Adler J.R., 3rd, and Jackson P.K. A role for the anaphase-promoting complex inhibitor Emi2/XErpl, a homolog of early mitotic inhibitor 1, in cytostatic factor arrest of Xenopus eggs. II Proc Natl Acad Sci USA.- 2005. - V. 102. - P. 4318-4323.

6. Hansen D.V., Loktev A.V., Ban K.H., and Jackson P.K. Plkl regulates activation of the anaphase promoting complex by phosphorylating and triggering SCFbetaTrCP-dependent destruction of the APC Inhibitor Emil. // Mo! Biol Cell. - 2004. - V. 15. -P. 5623-5634.

7. Margottin-Goguet F., Hsu J.Y., Loktev A., Hsieh H.M., Reimann J.D., and Jackson P.K. Prophase destruction of Emil by the SCF(P-TrCP/Slimb) ubiquitin ligase activates the anaphase promoting complex to allow progression beyond prometaphase. // Dev Cell. - 2003. - V. 4. - P. 813-826.

8. Локтев A.B., Кувшинов B.H., Меламед H.B., Иванисенко В.А., Мишин В.П., and Ильичев А.А. Локализация антигенной детерминанты белка Е вируса клещевого энцефалита узнаваемой антигемагглютинирующими моноклональными антителами ЮН 10 с помощью пептидных фаговых библиотек. // Вопросы Вирусологии. - 2002. - V. 47. - Р. 31-34.

9. Loktev A.V., Bazan F., Nishimura D.Y., Beck J.S., Zhang Q., Slusarcki D.C., Sheffield V.C., Jackson P.K., Nachury M.V. «А Novel BBSome Subunit Regulates Ciliogenesis, Microtubule Stability and Aeetylation.» Abstract, The American Society for Cell Biology 46th Annual Meeting, San Francisco, CA, USA, 2008.

10. Loktev A.V., Bazan F., Nishimura D.Y., Beck J.S., Zhang Q., Slusarcki D.C., Sheffield V.C., Jackson P.K., Nachury M.V. «The Novel BBSome Subunit BBSX is Required for Primary Cilium Assembly, BBSome Integrity and Microtubule Nucleation.» Abstract, FASEB Conference «The Biology of Cilia and Flagella», Saxton River, VT, USA, 2007.

11. Loktev A.V., Bazan F., Nishimura D.Y., Beck J.S., Zhang Q., Slusarcki D.C., Sheffield V.C., Jackson P.K., Nachury M.V. «A prefoldin-like protein provides a link between the core BBSome and the chaperonin-like proteins BBS6 and BBS 10» Abstract №2311, The American Society for Cell Biology 46th Annual Meeting, San Diego, CA, USA, 2006.

12. Nachury M.V., Loktev A.V., Bazan F„ Sheffield V.C., Jackson P.K. «A core complex of BBS proteins promotes ciliary membrane biogenesis.» Abstract №45, The American Society for Cell Biology 46th Annual Meeting, San Diego, CA, USA, 2006.

Локтев Александр Валерьевич

Характеризация комплекса BBS белков и его роли в формировании и функциональной активности ресничек и микротрубочек клеток человека

Автореф. дисс. на соискание ученой степени кандидата биологических Подписано в печать 23.01.2009. Заказ № 81. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Типография Института катализа им. Г.К. Борескова СО РАН

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Локтев, Александр Валерьевич

Содержание.

Список сокращений.

Введение.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Характеризация комплекса BBS белков и его роли в формировании и функциональной активности ресничек и микротрубочек клеток человека"

Цель и задачи исследования.8

Научная новизна и практическая ценность.8

Положения, выносимые на защиту:.10

Апробация работы.10

Объем и структура диссертации:.10

Благодарности:.11

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Локтев, Александр Валерьевич

Выводы

1. Открыт стабильный белковый комплекс, состоящий из 7 высоко консервативных BBS белков (BBS1, BBS2, BBS4, BBS5, BBS7, BBS8 и BBS9), получивший название ББсома.

2. Впервые установлено, что белки BBS1, BBS5 и BBIPIO, формирующие ББсому, необходимы для построения первичных ресничек в клетках.

3. Получены доказательства связывания ББсомы с белком Rabin8, активатором ГТФазы Rab8, а также показано участие белков Rabin8 и Rab8 в образовании мембраны первичных ресничек.

4. Предложена единая модель функциональной активности ББсомы, которая заключается в регуляции построения мембраны реснички посредством активации белка Rab8, что обеспечивает направление мембранного транспорта к основанию реснички.

5. Обнаружен новый консервативный белок BBIPIO и показано, что BBIPIO является новой стехиометрической субъединицей ББсомы.

6. Установлено, что BBIP10 в составе ББсомы функционирует сходно с BBS белками, и он необходим для формирования и функционирования первичных ресничек в клетках и модельном организме.

7. Обнаружено, что часть свободного внутриклеточного BBIP10 необходима для поддержания стабильности и ацетилирования цитоплазматических микротрубочек.

8. Доказано, что ВВЕРЮ регулирует ацетилирование тубулина на уровне ферментов, катализирующих ацетилирование/диацетилирование и получены экспериментальные данные, показывающие, что возможным механизмом регуляции является ингибирование активности тубулин диацетилазы - HDAC6.

3.3. Заключение

Результаты, представленные в настоящей работе, свидетельствуют о успешности использования подхода, основанного на поиске новых белок-белковых взаимодействий, для исследования молекулярных механизмов плейотропных генетических заболеваний человека, на примере синдрома Барде-Бидля. Данный подход является алтернативным по отношению к классическим генетическим исследованиям. Его использование позволило получить новые знания о функциональной активности белковых продуктов 12-ти BBS генов предопределяющих развитие синдрома Барде-Бидля.

Для реального использования этого подхода была получена уникальная линия клеток человека RPE-[JIAO]BBS4, экспрессирующая белок BBS4, который был модифицирован для очистки и идентификации взаимодействующих с ним белков. С использованием этой линии впервые была показана локализация BBS белков в первичных ресничках позвоночных, помимо их присутствия в ЦС, что хорошо согласуется с данными о локализации BBS белков у нематод (Ou G. et al, 2005). Очистка и идентификация белков, ассоциированных с BBS4, из клеток RPE[JIAO]BBS4 методом тандемной аффинной очистки в комбинации с тандемной масс-спектроскопией позволила получить целый комплекс новых знаний о молекулярных свойствах BBS белков. В частности, впервые было выявлено, что 7 из 12 самых эволюционно консервативных BBS белков способны взаимодействовать между собой. Физико-химическая характеристика этого взаимодействия позволила заключить, что белки BBS1, BBS2, BBS4, BBS5, BBS7, BBS8 и BBS9 формируют стабильный мультисубъединичный белковый комплекс, который получил название ББсома. In vivo, эти белки присутствуют исключительно в составе ББсомы в стехиометрических количествах, кроме того также было обнаружено кратковременное связывание ББсомы с основным белком ЦС - РСМ-1.

Технология подавления экспрессии белков с помощью миРНК была успешно использована для установления основных функций ББсомы в клетках человека. Впервые были получены доказательства, что ББсома необходима для сборки первичных ресничек, и не играет существенной роли в функции ЦС. Было установлено, что в певичных ресничках ББсома ассоциирована с мембраной, возможно путем непосредственного связывания с липидами мембраны, опосредованного взаимодействием BBS5 с фосфатидил инозитолами.

Дальнейшее детальное изучение роли ББсомы в формировании первичных ресничек позволило выявить взаимодействие между ББсомой (BBS1 субъединица) и белком Rabin8, являющимся активатором ГТФазы Rab8. Функциональная важность этого взаимодействия была подтверждена тем фактом, что Rabin8, как и ББсома, необходим для формирования первичных ресничек. Из этого следует, что ББсома может быть необходима для активации Rab8 и это регулирует построение мембран первичных ресничек. Важно также отметить, что ГТФазы семейства Rab являются хорошо охарактеризованными регуляторами мембранного транспорта в клетке.

Проведенные исследования позволили впервые показать, что белок Rab8 входит в состав локализован в реснички, а экспрессия конститутивно-активного варианта Rab8[67L] вызывает удлинение мембран и аксонем ресничек. Было установлено, что ингибирование функции белка Rab8 приводит к ингибированию образования первичных ресничек. Наши данные о зависимости локализации Rab8 в реснички от присутствия белка Rabin8 свидетельствуют, что только активированная форма Rab8 находится в первичных ресничках. Таким образом, совокупность полученных результатов свидетельствует, что сбалансированая активация Rab8 играет важную роль в образовании мембраны первичных ресничек.

Исходя из вышесказанного, можно предположить, что функциональная активность ББсомы в клетке включает в себя следующие этапы. Сначала ББсома связывается с РСМ-1 и транспортируется центриольными спутниками к базальному тельцу, где происходит ее диссоциация с РСМ-1. Затем, происходит взаимодействие ББсомы с Rabin8, что обуславливает строго локализованную активацию ГТФазы Rab8. Активация Rab8 у основания реснички стимулирует направленный транспорт и слияние мембранных пузырьков, предназначенных для формирования мембраны реснички. На следующем этапе ББсома направляется^ внутрь реснички, где может осуществлять координацию субъединиц ВРТ и, возможно, обеспечивать координацию роста мембраны и аксонемы первичной реснички.

Предложенная нами модель была поддержана последующими исследованиеми других групп. Так, в мышах с делегированным геном BBS4 было обнаружено отсутствие трансмембранных рецепторов соматостатина и серотонина в первичных ресничках нейронов мозга, где они • находятся в норме (Berbari N.F. et al, 2008). Ингибирование функции Rab8 в фоторецепторных нейронах приводит к массивному накоплению мембранных пузырьков содержащих родопсин у основания перетяжки (Moritz*O.L. et al, 2001).

Дальнейшее изучение BBS белков, идентифицированных в результате очистки ББсомы, привело к открытию нового белка, получившего название BBIP10. Открытый нами белок является чрезвычайно консервативным и присутствует в геномах человека, млекопитающих и далее вплоть до геномов одноклеточных жгутиковых. При этом BBIP10 не содержит никаких доменов с уже известной функцией. Исследование взаимодействия между ББсомой и BBIP10 дало основание считать, что BBIP10 является стехиометрической субъединицей ББсомы, вместе с описанными выше семью BBS белками. Однако надо отметить, что значительная часть внутриклеточного BBIP10 не связана с ББсомой.

В отличие от BBS4, BBIP10 не наблюдается на ЦС, а локализован непосредственно в первичной ресничке, BBIP10 также обнаруживается в цитоплазме. Подавление экспрессии BBIP10 в клетках человека вызывало ингибирование формирования первичных ресничек, а в эмбрионах D.rerio - появление типичных BBS фенотипов. Таким образом, полученные данные позволяют предположить, что BBIP10 в составе ББсомы выполняет важную функцию в процессе формирования первичных ресничек. Тем не менее, сравнительный анализ эффектов подавления экспрессии BBIP10 и BBS белков позволил установить, что BBIP10 также играет важную роль в регуляции стабильности микротрубочек цитоскелета и ацетилирования тубулина.

Полученные нами экспериментальные данные свидетельствуют, что при ингибировании экспрессии BBIP10 происходит значительное снижение количества полимеризованного и ацетилированного тубулина в клетках. Причем другие посттрансляционные модификации тубулина остаются неизменными. Принципиально важная роль BBIP10 в регуляции ацетилировании тубулина была подтверждена в экспериментах с клетками, характеризующимися высоким уровнем экспрессии BBIP10.

Механизм с помощью которого BBIP10 оказывает воздействие на стабильность цитоплазматических МТ остается неясным, так как, согласно полученным данным, динамика полимеризации МТ в клетках с ингибированной экспрессией BBIP10 является нормальной. Возможными механизмами, получившими некоторое экспериментальное подтверждение в настоящей работе, могут быть нарушение прикрепления МТ к центросоме и/или прямое связывание BBIP10 с МТ.

Совокупность результатов, полученных в серии экспериментов по искусственной полимеризации/деполимеризации МТ позволяет предположить, что BBIP10 осуществляет контроль над ацетилированием тубулина на ферментативном уровне. Более того, удалось установить, что ингибирование деацетилазы тубулина HDAC6 частично восстанавливает ацетилирование тубулина в клетках с подавленной экспрессией BBIP10, из чего следует, что BBIP10 ингибирует HDAC6. Дальнейшее исследование механизма контроля ацетилирования затрудняется отсутствием информации о свойствах фермента осуществляющего ацетилирование тубулина, поэтому нельзя исключить возможности того, что BBIP10 активирует ацетилтрансферазу. В будущем, продолжение исследования роли BBIP10 в регуляции ацетилироваиия тубулина может привести к получению новых знаний о молекулярных компонентах и функции этой пост-трасляционной модификации.

Можно предположить, что функцией BBIP10 в составе ББсомы является стабилизация МТ аксонемы реснички путем контроля диацетилирования или ацетилироваиия. В пользу этой гипотезы говорит тот факт, что нами было обнаружено нарушение координации между образованием мембран и ацетилированием аксонем ресничек в клетках с гиперактивированным Rab8. Другими авторами было показано, что HDAC6 стимулирует резорбцию ресничек (Pugacheva E.N. et al, 2007). Исходя из выше сказаного, интересной гипотезой-представляется то, что ролью ББсомы, как белкового комплекса в ресничке, является координация формирования мембраны и аксонемы реснички.

Полученные в настоящей работе данные являются важным вкладом в понимание механизмов патогенеза BBS на молекулярном уровне. Открытие стабильного комплекса из 7 BBS белков и белка ВВГРЮ позволяет значительно упростить возможное моделирование BBS на уровне молекулярных взаимодействий. Можно предположить, что ББсома, и выполняемая ею роль в функционировании ресничек, является принципиально важной точкой развития сидрома Барде-Бидля и других заболеваний с сходными симптомами. Мутация одной из субъединиц ББсомы может привести к нарушению функции всего белкового комплекса. Представляется возможным, что остальные 5 BBS белков, которые не входят в состав комплекса, также оказывают1 влияние на функцию ББсомы. Дальнейшие исследования патогенеза BBS и фундаментальной биологии ресничек должны быть направлены, на наш взгляд, на развитие настоящей работы в следующих направлениях: исследование процесса контроля сборки ББсомы в виде белкового комплекса, оценку роли других BBS белков, выявление других белков, взаимодействующих с ББсомой.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Локтев, Александр Валерьевич, Кольцово

1. Afzelius В. Electron microscopy of the sperm tail; results obtained with a new fixative. // J Biophys Biochem Cytol. 1959. - V. 5. - P. 269-278.

2. Afzelius B.A. A human syndrome caused by immotile cilia. // Science. 1976. - V. 193. -P. 317-319.

3. Allen R.A. Isolated cilia in inner retinal neurons and in retinal pigment epithelium. // J Ultrastruct Res. 1965. - V. 12. - P. 730-747.

4. Alvarez-Buylla A., Garcia-Verdugo J.M., Mateo A.S., and Merchant-Larios H. Primary neural precursors and intermitotic nuclear migration in the ventricular zone of adult canaries. // J Neurosci. 1998. - V. 18. - P. 1020-1037.

5. Amemiya T. Significance of appearance of cilia in the retinal pigment epithelium (author's transl). //Nippon Ganka Gakkai Zasshi. 1977. - V. 81. - P. 355-359.

6. Ang A.L., Folsch H., Koivisto U.M., Pypaert M., and Mellman I. The Rab8 GTPase selectively regulates AP-IB-dependent basolateral transport in polarized Madin-Darby canine kidney cells. // J Cell Biol. 2003. - V. 163. - P. 339-350.

7. Archer F.L., and Wheatley D.N. Cilia in cell-cultured fibroblasts. II. Incidence in mitotic and post-mitotic BHK 21-C13 fibroblasts. // J Anat. 1971. - V. 109. - P. 277-292.

8. Argarana C.E., Barra H.S., and Caputto R. Release of 14C.tyrosine from tubulinyl-[14C]tyrosine by brain extract. Separation of a carboxypeptidase from tubulin-tyrosine ligase. //Mol Cell Biochem. 1978. - V. 19. - P. 17-21.

9. Badano J.L., Ansley S.J., Leitch C.C., Lewis R.A., Lupski J.R., and Katsanis N. Identification of a novel Bardet-Biedl syndrome protein, BBS7, that shares structural features with BBS1 and BBS2. // Am J Hum Genet. 2003a. - V. 72. - P. 650-658.

10. Badano J.L., Mitsuma N., Beales P.L., and Katsanis N. The ciliopathies: an emerging class of human genetic disorders. // Annu Rev Genomics Hum Genet. 2006. - V. 7. - P. 125148.

11. Barnes B.G. Ciliated secretory cells in the pars distalis of the mouse hypophysis. // J Ultrastruct Res. 1961. - V. 5. - P. 453-467.

12. Barnett S., Reilly S., Carr L., Ojo I., Beales P.L., and Charman T. Behavioural phenotype of Bardet-Biedl syndrome. // J Med Genet. 2002. - V. 39. - P. e76.

13. Barr M.M., DeModena J., Braun D., Nguyen C.Q., Hall D.H., and Sternberg P.W. The Caenorhabditis elegans autosomal dominant polycystic kidney disease gene homologs lov-1 and pkd-2 act in the same pathway. // Curr Biol. 2001. - V. 11. - P. 1341-1346.

14. Barr M.M., and Sternberg P.W. A polycystic kidney-disease gene homologue required for male mating behaviour in C. elegans. //Nature. 1999. - V. 401. - P. 386-389.

15. Beales P.L., Elcioglu N., Woolf A.S., Parker D., and Flinter F.A. New criteria for improved diagnosis of Bardet-Biedl syndrome: results of a population survey. // J Med Genet. 1999. - V. 36. - P. 437-446.

16. Berbari N.F., Lewis J.S., Bishop G.A., Askwith C.C., and Mykytyn K. Bardet-Biedl syndrome proteins are required for the localization of G protein-coupled receptors to primary cilia. // Proc Natl Acad Sci USA.- 2008. V. 105. - P. 4242-4246.

17. Blacque O.E., and Leroux M.R. Bardet-Biedl syndrome: an emerging pathomechanism of intracellular transport. // Cell Mol Life Sci. 2006. - V. 63. - P. 2145-2161.

18. Bobinnec Y., Khodjakov A., Mir L.M., Rieder C.L., Edde В., and Bornens M. Centriole disassembly in vivo and its effect on centrosome structure and function in vertebrate cells. // J Cell Biol. 1998. - V. 143. - P. 1575-1589.

19. Brailov I., Bancila M., Brisorgueil M.J., Miquel M.C., Hamon M., and Verge D. Localization of 5-HT(6) receptors at the plasma membrane of neuronal cilia in the rat brain. // Brain Res. 2000. - V. 872. - P. 271-275.

20. Cellis J.E. (2006). Cell Biology, a Laboratory Handbook, Vol 1 (London: Elsevier Academic Press).

21. Cheeseman I.M., and Desai A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. // Sci STKE. 2005. - V. 2005. -P. pll.

22. Clamp M., Cuff J., Searle S.M., and Barton G.J. The Jalview Java alignment editor. // Bioinformatics. 2004. - V. 20. - P. 426-427. :

23. Cole D.G. The intraflagellar transport machinery of Chlamydomonas reinhardtii. // Traffic. 2003. - V. 4. - P. 435-442.

24. Corbit K.C., Aanstad P., Singla V., Norman A.R., Stainier D.Y., and Reiter J.F. Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium. // Nature. 2005. - V. 437. - P. 1018-1021.

25. Dammermann A., and Merdes A. Assembly of centrosomal proteins and microtubule organization depends on PCM-1. // J Cell Biol. 2002. - V. 159. - P. 255-266.

26. Bardet-Biedl syndrome 1 M390R mutation has cilia defects, ventriculomegaly, retinopathy, and obesity. // Proc Natl Acad Sci USA.- 2007. V. 104. - P. 19422-19427.

27. Di Paolo G., and De Camilli P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. // Nature. 2006. - V. 443. - P. 651-657.

28. Eisen M.B., Spellman P.T., Brown P.O., and Botstein D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. // Proc Natl Acad Sci USA.- 1998. V. 95. - P. 1486314868.

29. Fauser S., Munz M., and Besch D. Further support for digenic inheritance in Bardet-Biedl syndrome. // J Med Genet. 2003. - V. 40. - P. el04.

30. Fawcett D.W. (1981). The Cell, 2nd edition edn (Philadelphia, USA: W. B. Saunders Co.).

31. Fawcett D.W., and Porter K.R. A study of the fine structure of ciliated epithelia. // Journal of Morphology. 1954. -V. 94. - P. 221-281.

32. Fisher S.K., and Steinberg R.H. Origin and organization of pigment epithelial apical projections to cones in cat retina. // J Comp Neurol. 1982. - V. 206. - P. 131-145.

33. Follit J.A., Tuft R.A., Fogarty K.E., and Pazour G.J. The intraflagellar transport protein IFT20 is associated with the Golgi complex and is required for cilia assembly. // Mol Biol Cell. 2006. - V. 17. - P. 3781-3792.

34. Gaertig J., Cruz M.A., Bowen J., Gu L., Pennock D.G., and Gorovsky M.A. Acetylation of lysine 40 in alpha-tubulin is not essential in Tetrahymena thermophila. // J Cell Biol. -1995.-V. 129.-P. 1301-1310.

35. Gibbons I.R., and Rowe A.J. Dynein: A Protein with Adenosine Triphosphatase Activity from Cilia. // Science. 1965. - V. 149. - P. 424-426.

36. Haggarty S.J., Koeller K.M., Wong J.C., Grozinger C.M., and Schreiber S.L. Domain-selective small-molecule inhibitor of histone deacetylase 6 (HDAC6)-mediated tubulin deacetylation. // Proc Natl Acad Sci USA.- 2003. V. 100. - P. 4389-4394.

37. Hattula K., Furuhjelm J., Arffman A., and Peranen J. A Rab8-specific GDP/GTP exchange factor is involved in actin remodeling and polarized membrane transport. // Mol Biol Cell. -2002. -V.13. -P. 3268-3280.

38. Haycraft C.J., Banizs В., Aydin-Son Y., Zhang Q., Michaud E.J., and Yoder B.K. Gli2 and Gli3 localize to cilia and require the intraflagellar transport protein polaris for processing and function. // PLoS Genet. 2005. - V. 1. - P. e53.

39. Hoskins B.E.,.Thorn A., Scambler P .J., and Beales P.L. Evaluation of multiplex capillary heteroduplex analysis: a rapid and sensitive mutation screening technique. // Hum Mutat. -2003.-V. 22.-P. 151-157. t

40. Hou Y., Qin H., Follit J.A., Pazour G.J., Rosenbaum J.L., and Witman G.B. Functional analysis of an individual IFT protein: IFT46 is required for transport of outer dynein arms into flagella. // J Cell Biol. 2007. - V. 176. - P. 653-665.

41. Huangfu D., Liu A., Rakeman A.S., Murcia N.S., Niswander L., and Anderson K.V. Hedgehog signalling in the mouse requires intraflagellar transport proteins. // Nature. -2003. V. 426. - P. 83-87.

42. Hubbert C., Guardiola A., Shao R., Kawaguchi Y., Ito A., Nixon A., Yoshida M., Wang X.F., and Yao T.P. HDAC6 is a microtubule-associated deacetylase. //Nature. 2002. - V. 417.-P. 455-458.

43. Jiang X.R., Jimenez G., Chang E., Frolkis M., Kusler В., Sage M., Beeche M., Bodnar

44. A.G., Wahl G.M., Tlsty T.D., and Chiu C.P. Telomerase expression in human somatic cells does not induce changes associated with a transformed phenotype. // Nat Genet. 1999. -V. 21. - P. 111-114.

45. Jones C., Roper V.C., Foucher I., Qian D., Banizs В., Petit C., Yoder B.K., and Chen P. Ciliary proteins link basal body polarization to planar cell polarity regulation. // Nat Genet.- 2008. V. 40. - P. 69-77.

46. Katsanis N. The oligogenic properties of Bardet-Biedl syndrome. // Hum Mol Genet. -2004. V. 13 Spec No 1. - P. R65-71.

47. Kozminski K.G., Beech P.L., and Rosenbaum J.L. The Chlamydomonas kinesin-like protein FLA 10 is involved in motility associated with the flagellar membrane. // J Cell Biol. 1995. - V. 131. - P. 1517-1527.

48. Kozminski K.G., Diener D.R., and Rosenbaum J.L. High level expression of nonacetylatable alpha-tubulin in Chlamydomonas reinhardtii. // Cell Motil Cytoskeleton. -1993a.-V. 25.-P. 158-170.

49. Kozminski K.G., Johnson K.A., Forscher P., and Rosenbaum J.L. A motility in the eukaryotic flagellum unrelated to flagellar beating. // Proc Natl Acad Sci USA.- 1993b. -V. 90.-P. 5519-5523.

50. Kubo A., Sasaki H., Yuba-Kubo A., Tsukita S., and Shiina N. Centriolar satellites: molecular characterization, ATP-dependent movement toward centrioles and possible involvement in ciliogenesis. // J Cell Biol. 1999. - V. 147. - P. 969-980.

51. L'Hernault S.W., and Rosenbaum J.L. Chlamydomonas alpha-tubulin is posttranslationally modified by acetylation on the epsilon-amino group of a lysine. // Biochemistry (Mosc). -1985.-V. 24.-P. 473-478.

52. Leeuwenhoek A.V. (1932). Antony Van Leeuwenhoek and His "Little Animals" (New York: Harcourt Brace).

53. Li X., Luo Y., Starremans P.G., McNamara C.A., Pei Y., and Zhou J. Polycystin-1 and polycystin-2 regulate the cell cycle through the helix-loop-helix inhibitor Id2. // Nat Cell Biol. 2005. - V. 7. - P. 1202-1212.

54. Мак H.Y., Nelson L.S., Basson M., Johnson C.D., and Ruvkun G. Polygenic control of Caenorhabditis elegans fat storage. //Nat Genet. 2006. - V. 38. - P. 363-368.

55. Marszalek J.R., Liu X., Roberts E.A., Chui D., Marth J.D., Williams D.S., and Goldstein L.S. Genetic evidence for selective transport of opsin and arrestin by kinesin-II in mammalian photoreceptors. // Cell. 2000. - V. 102. - P. 175-187.

56. Maruta H., Greer K., and Rosenbaum J.L. The acetylation of alpha-tubulin and its relationship to the assembly and disassembly of microtubules. // J Cell Biol. 1986. - V. 103.-P. 571-579.

57. McMahon A.P., Ingham P.W., and Tabin C.J. Developmental roles and clinical significance of hedgehog signaling. // Curr Top Dev Biol. 2003. - V. 53. - P. 1-114.

58. Mikule K., Delaval В., Kaldis P., Jurcyzk A., Hergert P., and Doxsey S. Loss of centrosome integrity induces p38-p53-p21-dependent Gl-S arrest. // Nat Cell Biol. 2007. -V. 9.-P. 160-170.

59. Minotti A.M., Barlow S.B., and Cabral F. Resistance to antimitotic drugs in Chinese hamster ovary cells correlates with changes in the level of polymerized tubulin. // J Biol Chem. -1991. -V. 266. P. 3987-3994.

60. Morrissey J.H. Silver stain for proteins in polyacrylamide gels: a modified procedure with enhanced uniform sensitivity. // Anal Biochem. 1981. - V. 117. - P. 307-310.

61. Murcia N.S., Richards W.G., Yoder B.K., Mucenski M.L., Dunlap J.R., and Woychik R.P. The Oak Ridge Polycystic Kidney (orpk) disease gene is required for left-right axis determination. // Development. 2000. - V. 127. - P. 2347-2355.

62. Mykytyn K., Nishimura D.Y., Searby C.C., Beck G., Bugge K., Haines H.L., Cornier A.S., Cox G.F., Fulton A.B., Carmi R., Iannaccone A., Jacobson S.G., Weleber R.G., Wright

63. A.F., Riise R., Hennekam R.C., Luleci G., Berker-Karauzum S., Biesecker L.G., Stonei

64. E.M., and Sheffield V.C. Evaluation of complex inheritance involving the most common Bardet-Biedl syndrome locus (BBS1). // Am J Hum Genet. 2003. - V. 72. - P. 429-437.

65. Nachury M.V. Tandem affinity purification of the BBSome, a critical regulator of Rab8 in ciliogenesis. //Methods Enzymol. 2008. - V. 439. - P. 501-513.

66. Nakane Т., and Biesecker L.G. No evidence for triallelic inheritance of MKKS/BBS loci in Amish Mckusick-Kaufman syndrome. // Am J Med Genet A. 2005. - V. 138. - P. 32-34.

67. Nonaka S., Shiratori H., Saijoh Y., and Hamada H. Determination of left-right patterning of the mouse embryo by artificial nodal flow. // Nature. 2002. - V. 418. - P. 96-99.

68. North B.J., Marshall B.L., Borra M.T., Denu J.M., and Verdin E. The human Sir2 ortholog, SIRT2, is an NAD+-dependent tubulin deacetylase. // Mol Cell. 2003. - V. 11:;- P. 437444.

69. Orozco J.T., Wedaman K.P., Signor D., Brown H., Rose L., and Scholey J.M. Movement of motor and cargo along cilia. // Nature. 1999. - V. 398. - P. 674. С

70. Ou G., Blacque O.E., Snow J.J., Leroux M.R., and Scholey J.M. Functional coordination of intraflagellar transport motors. //Nature. 2005. - V. 436. - P. 583-587.

71. Palazzo A., Ackerman В., and Gundersen G.G. Cell biology: Tubulin acetylation and cell motility. // Nature. 2003. - V. 421. - P. 230.

72. Peranen J., Auvinen P., Virta H., Wepf R., and Simons K. Rab8 promotes polarized membrane transport through reorganization of actin and microtubules in fibroblasts. // J Cell Biol. 1996. - V. 135. - P. 153-167.

73. Piperno G., LeDizet M., and Chang X.J. Microtubules containing acetylated alpha-tubulinin mammalian cells in culture. // J Cell Biol. 1987. - V. 104. - P. 289-302.

74. Praetorius H.A., and Spring K.R. Bending the MDCK cell primary cilium increasesintracellular calcium. // J Membr Biol. 2001. - V. 184. - P. 71-79.

75. Pugacheva E.N., Jablonski S.A., Hartman T.R., Henske E.P., and Golemis E.A. HEF1dependent Aurora A' activation induces disassembly of the primary cilium. // Cell. 2007. 1. V. 129.-P. 1351-1363.

76. Reed N.A., Cai D., Blasius T.L., Jih G.T., Meyhofer E., Gaertig J., and Verhey K.J. Microtubule acetylation promotes kinesin-1 binding and transport. // Curr Biol. 2006. - V. 16.-P. 2166-2172.

77. Rigaut G., Shevchenko A., Rutz В., Wilm M., Mann M., and Seraphin B. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. // Nat Biotechnol. 1999. - V. 17. - P. 1030-1032.

78. Ringo D.L. Flagellar motion and fine structure of the flagellar apparatus in Chlamydomonas. // J Cell Biol. 1967. - V. 33. - P. 543-571.

79. Rohatgi R., Milenkovic L., and Scott M.P. Patchedl regulates hedgehog signaling at the primary cilium. // Science. 2007. - V. 317. - P. 372-376.

80. Rosenbaum J.L., and Child F.M. Flagellar regeneration in protozoan flagellates. // J Cell Biol. 1967. - V. 34. - P. 345-364.

81. Rosenbaum J.L., and Witman G.B. Intraflagellar transport. // Nat Rev Mol Cell Biol. -2002.-V.3.- P. 813-825. -112

82. Sali A., and Blundell T.L. Comparative protein modelling by satisfaction of spatial restraints. // J Mol Biol. 1993. - V. 234. - P. 779-815.

83. Schatz C.A., Santarella R., Hoenger A., Karsenti E., Mattaj I.W., Gruss O.J., and Carazo-Salas R.E. Importin alpha-regulated nucleation of microtubules by TPX2. // Embo J. -2003. V. 22. - P. 2060-2070.

84. Singla V., and Reiter J.F. The primary cilium as the cell's antenna: signaling at a sensory organelle. // Science. 2006. - V. 313. - P. 629-633.

85. Slavotinek A.M., Stone E.M., Mykytyn K., Heckenlively J.R., Green J.S., Heon E., Musarella M.A., Parfrey P.S., Sheffield V.C., and Biesecker L.G. Mutations in MKKS cause Bardet-Biedl syndrome. // Nat Genet. 2000. - V. 26. - P. 15-16.

86. Soding J., Biegert A., and Lupas A.N. The HHpred interactive server for protein homology detection and structure prediction. // Nucleic Acids Res. 2005. - V. 33. - P. W244-248.

87. Sorokin S. Centrioles and the formation of rudimentary cilia by fibroblasts and smooth muscle cells. // J Cell Biol. 1962. - V. 15. - P. 363-377.

88. Sorokin S.P. Reconstructions of centriole formation and ciliogenesis in mammalian lungs. // J Cell Sci. 1968. - V. 3. - P. 207-230.

89. Stoetzel C., Laurier V., Faivre L., Megarbane A., Perrin-Schmitt F., Verloes A., Bonneau D., Mandel J.L., Cossee M., and Dollfus H. BBS8 is rarely mutated in a cohort of 128 Bardet-Biedl syndrome families. // J Hum Genet. 2006b. - V. 51. - P. 81-84.

90. Stone D.L., Slavotinek A., Bouffard G.G., Banerjee-Basu S., Baxevanis A.D., Barr M., and Biesecker L.G. Mutation of a gene encoding a putative chaperonin causes McKusick-Kaufman syndrome. //Nat Genet. 2000. - V. 25. - P. 79-82.

91. Supp D.M., Witte D.P., Potter S.S., and Brueckner M. Mutation of an axonemal dynein affects lefit-right asymmetry in inversus viscerum mice. //Nature. 1997. - V. 389. - P. 963-966.

92. Tayeh M.K., Yen H.J., Beck J.S., Searby C.C., Westfall T.A., Griesbach H„ Sheffield V.C., and Slusarski D.C. Genetic interaction between Bardet-Biedl syndrome genes and implications for limb patterning. // Hum Mol Genet. 2008. -. -.

93. Thompson J.D., Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmougin F., and Higgins D.G. The CLUSTALX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. //Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. - P. 4876-4882.

94. Verhey K.J., and Gaertig J. The tubulin code. // Cell Cycle. 2007. - V. 6. - P. 2152-2160.

95. Warner F.D., and Satir P. The structural basis of ciliary bend formation. Radial spoke positional changes accompanying microtubule sliding. // J Cell Biol. 1974. - V. 63. - P. 35-63.

96. Webster D.R., and Borisy G.G. Microtubules are acetylated in domains that turn over slowly. // J Cell Sci. 1989. - V. 92 ( Pt 1). - P. 57-65.

97. Webster D.R., Gundersen G.G., Bulinski J.C., and Borisy G.G. Differential turnover of tyrosinated and detyrosinated microtubules. // Proc Natl Acad Sci USA.- 1987. V. 84. -P. 9040-9044.

98. Wessel D., and Flugge U.I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. // Anal Biochem. 1984. - V. 138. - P. 141-143.

99. Westermann S., and Weber K. Post-translational modifications regulate microtubule function. // Nat Rev Mol Cell Biol. 2003. - V. 4. - P. 938-947.

100. Wheatley D.N. Cilia in cell-cultured fibroblasts. I. On their occurrence and relative frequencies in primary cultures and established cell lines. // J Anat. 1969. - V. 105. - P. 351-362.

101. Wheatley D.N. Cilia in cell-cultured fibroblasts. 3. Relationship between mitotic activity and cilium frequency in mouse 3T6 fibroblasts. // J Anat. 1971. - V. 110. - P. 367-382.

102. Yen H.J., Tayeh M.K., Mullins R.F., Stone E.M., Sheffield V.C., and Slusarski D.C. Bardet-Biedl syndrome genes are important in retrograde intracellular trafficking and Kupffer's vesicle cilia function. // Hum Mol Genet. 2006. - V. 15. - P. 667-677.

103. Zeigel R.F. On the occurrence of cilia in several cell types of the chick pancreas. // J Ultrastruct Res. 1962. - V. 7. - P. 286-292.

104. Zerial M., and McBride H. Rab proteins as membrane organizers. // Nat Rev Mol Cell Biol.-2001.-V. 2.-P. 107-117.

105. Алиева И.Б., and Узбеков P.E. Центросома полуфункциональный мультибелковый клеточный комплекс. // Биохимия. - 2008. - V. 73. - Р. 626-643.

106. Узбеков Р.Е., and Алиева И.Б. Центросома загадка "клеточного процессора". // Цитология. - 2008. - V. 50. - Р. 91-112.