Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Центросомальные и свободные микротрубочки в цитоплазме культивируемых клеток

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Центросомальные и свободные микротрубочки в цитоплазме культивируемых клеток"

Направахрукописи

Чернобельская Ольга Аркадьевна

Центросомальные и свободные микротрубочки в цитоплазме культивируемых клеток

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология.

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2004

Работа выполнена в Институте физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

д.б.н. Алиева И.Б.

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ:

д.б.н, профессор Воробьев ИА

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Доктор биологических наук, профессор Онищенко Г.Е

Биологический факультет МГУ.

Кандидат биологических наук Плетюшкина О.Ю

НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ.

НИИ Канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН

Защита состоится 18 марта 2004 г. в заседании Диссертационного Совета Д 501.001.52 при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Воробьевы Горы, Биологический факультет МГУ. —

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан 16 февраля 2004 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета

к.б.н.

Актуальност ь проблемы

Микротрубочки (МТ) как компонент цитоскелета животных клеток выполняют ряд важнейших функций, связанных с поддержанием формы клетки, клеточным транспортом, правильным расположением органелл в цитоплазме, а также участвуют в расхождении хромосом в митозе и в цитокинезе (Alberts et al., 1994). Для выполнения всех этих функций МТ должны быть специальным образом организованы. На протяжение многих лет распространенным было мнение о том, что центросома является той единственной органеллой в клетке, которая нуклеирует и организует МТ - своими минус концами МТ закреплены на центросоме, а плюс концы расположены на периферии клетки и таким образом формируется привычная взгляду исследователя радиальная система (Brinkley et al., 1980). Однако в последнее время в литературе накопилось достаточно данных, свидетельствующих о том, что описанная схема не является универсальной, в частности, не все МТ закреплены на центросоме своими минус концами (Алиева, Воробьев, 1989; Alieva et al., 1992; Vorobjev et. al 1997, Waterman-Storer, Salmon, 1997; Keating, Borisy, 1999). В настоящее время известны способы образования свободных МТ, также известно, что в некоторых клетках они обладают динамикой, отличной от динамики связанных с центросомой МТ, и могут самоорганизовываться в отсутствии центросомы (Keating, Borrisy, 1999; Rbdionov et al., 1999; Vorobjev et al., 2002). Если принять тот факт, что в клетке существуют две системы МТ, то становится непонятно, как же удается клетке сохранять радиальную систему МТ, видимую в световой микроскоп, и как могут взаимодействовать друг с другом МТ этих двух систем. Не ясно и то, как ни с чем не связанные, отдельно расположенные свободные МТ могут участвовать в клеточном движении, поддержании клеточной формы и внутриклеточном транспорте.

Поскольку работы, посвященные вопросу происхождения свободных МТ и их роли в клетке, появились в литературе только в последние годы, вопрос о том, являются ли свободные МТ в клетке правилом или же исключением, до сих пор не решен.

В данной работе показано наличие в клетке с видимой радиальной сетью большого числа свободных МТ. Исследована динамика восстановления свободных и центросомальных МТ после разрушения сети МТ с помощью различных воздействий. Предложена модель двухфазного восстановления сети МТ после их полной деполимеризации. Свободные и центросомальные МТ были изучены с функциональной точки зрения - участие во внутриклеточном транспорте и поддержании формы клетки, а также с позиций их свойств -

НОЦ---------------

i

динамические характеристики свободных и центросомальных МТ во внутренней цитоплазме клетки.

Цели работы

Целью данной работы было с помощью различных методических подходов изучить свободные и связанные с центросомой МТ, их количество в клетке с видимой радиальной сетью, их участие во внутриклеточном транспорте и различия в динамических характеристиках.

В ходе данной работы были поставлены следующие задачи:

1. Оценить долю свободных и центросомальных МТ в клетках с видимой радиальной сетью на электронномикроскопическом и световом уровнях.

2. Проанализировать динамику восстановления свободных и центросомальных МТ после разрушения сети МТ с помощью холода и нокодазола.

3. Сравнить динамические характеристики МТ, растущих непосредственно от центросомы, и МТ, с центросомой не связанных.

4. Сравнить центросомальные и свободные МТ с функциональной точки зрения -участия во внутриклеточном транспорте и поддержании формы клетки.

Научная новизна и практическая ценность работы

Результаты данного исследования имеют теоретическое научное значение, так как способствуют более глубокому пониманию того, как устроена и функционирует система МТ в животных клетках.

В работе впервые продемонстрировано, что большую долю МТ в клетках VERO составляют свободные, не связанные с центросомой МТ. С помощью различных методических подходов (электронная микроскопия, иммунофлуоресцентная микроскопия, анализ треков сальтаторных движений частиц вдоль МТ в живых клетках) были получены данные, свидетельствующие о том, что МТ в клетках VERO в основной своей массе короткие и лишь небольшой процент составляют МТ длиной до 20 мкм. Проведен анализ параметров динамической нестабильности связанных с центросомой и свободных МТ, и показано, что поведение плюс конца центросомальной МТ не отличается от поведения плюс конца свободной МТ. В работе предложена модель двухфазного восстановления системы МТ после их полной деполимеризации. Впервые показано, что на первом этапе восстанавливаются преимущественно МТ, связанные с центросомой. На более поздних сроках происходит восстановление свободных МТ, с центросомой не связанных.

Практическая значимость работы связана с расширением наших представлений о строении и функциях цитоскелета клетки в целом и системы МТ, как одного из компонентов цитоскелета. Исследование проблем функционирования сложно организованной системы цитоплазматических МТ крайне важно не только с точки зрения фундаментальной биологии, но и - в перспективе - с точки зрения практической медицины.

Апробация работы

Диссертация была апробирована на заседании кафедры цитологии Биологического факультета МГУ 13 ноября 2003 года. Результаты работы были представлены на научных конференциях: "14th Meeting of the European Cytoskeletal Forum", Португалия, 1999; "The American society for cell biology 39th meeting", Вашингтон, США 1999; "Цитоскелет и клеточная регуляция" Пущино, Россия, 2000; "The 15th meeting of the European Cytoskeleton Forum", Бланкенберг, Бельгия, 2000; Всеросийское совещание "Клеточная биология на пороге XXI века" Санкт-Петербург, Россия, 2000; "The American society for cell biology 42nd meeting", Сан-Франциско, США, 2002; "Съезд общества клеточной биологии" Санкт-Петербург, Россия, 2003; "The American society for cell biology 43rd meeting", Сан-Франциско, США, 2003; "3rd International Meeting & Workshop on Advanced Light Microscopy", Barcelona, Spain. June 11-13,2003.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ.

Структура работы

Диссертация состоит из глав Введение, Обзор литературы, Материалы и Методы, Результаты, Обсуждение, Выводы и Список литературы. Работа изложена на 1BB страницах и содержит 36 иллюстраций.

Материалы и методы

В работе использовали клетки перевивной линии VERO (фибробластоподобные клетки почки зеленой мартышки). Их культивировали при 37°С и 5% COj в среде DMEM/F-12 с добавлением 3% эмбриональной телячьей сыворотки и гентамицина. Моноклональные антитела против р-тубулина, а также меченные флуорохромом антитела Oregon green были коммерческими (Molecular Probes, США).

Иммунофлуоресцентные исследования Процедура фиксации, экстракции и окраски

антителами была стандартной, с небольшими модификациями. Полученные клетки и цитопласты фиксировали 1,5% раствором глютарового альдегида. Фиксированные клетки обрабатывали 1% раствором Triton X-100 на PBS в течение 1,5 ч., далее 2% раствором NaBPLt- Для окраски на МТ препараты инкубировали с антителами к р-тубулину (30 мин, 37°С). В качестве вторых антител использовали меченные флуорохромом антитела Oregon green. Препараты заключали в 2,5% раствор 1,4-диазобицикло-[2,2,2]-октана (DABCO) в глицерине.

Видеомикроскопия. Препараты исследовали и анализировали полученные изображения на микроскопе Nikon Eclipce TE200. Изображения записывались с помощью охлаждаемой 12-и битной камеры RTE/CCD-1317K/2 (Princeton Instruments, США).

Электронная микроскопия. Клетки фиксировали 2% глютаровым альдегидом на 0,1 М какодилатном буфере (рН 7,3) в течение 20 мин. Дофиксацию проводили 0,1% водной таниновой кислотой (20 мин) и контрастировали материал 0,3% уранил ацетатом (20 мин). Дальнейшую подготовку препарата клеток проводили, как описано ранее (Алиева и др., 1989). Первые срезы толщиной 1-1,2 мкм фотографировали при увеличении х 8000 на электронном микроскопе Н-700 (Hitachi, Япония), работающем при ускоряющем напряжении 150-175 кВ.

Анализ распределения длин МТ. Систему МТ реконструировали по отсканированным снимкам серийных электронномикроскопических срезов. Реконструкцию, измерения длин МТ и анализ данных проводили в программе Adobe Photoshop.

Получение и анализ цитопластов. Получение клеточных фрагментов (цитопластов) проводили с помощью цитохалазина D и нокодазола, как описано ранее (Gorgidze, Vorobjev, 1995). Клетки центрифугировали при 8000 об/мин (25 мин, 37°С).

Треки сальтаторных движений гранул в цитопластах и целых клетках анализировались спустя 4 ч после энуклеации. Наблюдения проводили в течение 180 сек, треки анализировали как описано ранее (Григорьев, и др. 1997). Морфометрические измерения проводили в программе MetaMorph (Universal Imaging, США)

Экспериментальные воздействия. МТ в клетке деполимеризовали двумя способами -воздействием холода и нокодазола. В первом случае МТ разрушали через 4 ч после энуклеации, охлаждая полученные клетки и цитопласты (2 ч, -'-4°С), восстановление проводили при 30°С. Реполимеризацию МТ после воздействия холода проводили при температуре 30°С, поскольку при 37°С процесс проходил столь стремительно, что проследить за тонкостями его динамики было невозможно. Во втором случае для

деполимеризации МТ клетки инкубировали в среде с нокодазолом (10 мкг/мл) 1 ч при 37°С, а восстановление проводили при температура 37°С.

Анализ интенсивности флуоресценции тубулина Интенсивность флуоресценции тубулина в ламелле измеряли, как описано ранее (Смурова и др., 2002) на фиксированных препаратах клеток и цитопластов, окрашенных антителами к Р-тубулину, в десяти квадратных участках со стороной 2,5x2,5 мкм, расходящихся по радиусу от центросомы на периферию клетки. Интенсивность флуоресценции измерялась как средняя оптическая плотность с помощью программы MetaMorph.

Анализ динамики МТ в живых клетках. Микроинъекция меченного флуорохромом Су-3 тубулина в клетки VERO и эксперименты по обесцвечиванию были выполнены И. А. Воробьевым в лаборатории Г. Бориси (G.G. Borisy). Для исследования поведения МТ в центральном районе клетки использовали метод FRAP (fluorescence recovery after photobleaching, восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания), как описано в работе Komarova et al., 2003.

Анализ параметров динамической нестабильности МТ. Анализ параметров динамической нестабильности МТ был основан на предложенных ранее методиках - Yvon et al., 1999 и Vorobjev et al., 1999, и проводился в программе MetaMorph.

Результаты и обсуждение

В работе проведен анализ системы МТ на электронномикроскопическом и световом уровнях. Показано наличие большого количества свободных МТ в фибробластоподобных клетках VERO.

Для анализа системы МТ на электронномикроскопическом уровне по серийным срезам были сделаны псевдотрехмерные реконструкции МТ в ламелле клеток VERO и в районах, содержащих центросому. Все МТ, связанные с центросомой, были короткие - их средняя длина составила 1,49 ± 0,82 мкм (N=197), что соответствует значениям, полученным для других клеточных культур (Алиева, Воробьев, 1989), и значительно меньше, чем длина свободных МТ, располагающихся на тех же срезах (рис. 1). По ранее полученным данным в эпителиальных клетках СПЭВ и IT длина связанных с центросомой МТ составила 0,67 и 0,5 мкм соответственно (Алиева, Воробьев, 1998). В работе Гудимы с соавторами (Gudima et al., 1983) было показано, что основная масса МТ в районе центросомы представлена МТ не длиннее 2 мкм.

Все это подтверждает высказанное ранее в работах Алиевой и Воробьева предположение, что большинство МТ, связанных с центросомой, короткие, и не тянутся на периферию клетки (Алиева, Воробьев, 2000).

Если количество МТ, расходящихся от центросомы, невелико (как следует из наших и представленных в литературе данных), значит в клетке, помимо центросомальных, должны присутствовать в высоком процентном соотношении и свободные МТ, что и демонстрируют полученные результаты. По данным электронной микроскопии свободные МТ в клетках VERO составляют большинство, на их долю приходится более 80% всех МТ в клетке. Свободные МТ имеют различную длину (максимальная длина 17,25 мкм, минимальная - 0,5 мкм, N=737), причем количество МТ, длина которых превышала 10 мкм, невелико, порядка 5%. Это приводит к тому, что средняя длина МТ оказывается равной 3,33±2,43 мкм (рис. 2).

На световом уровне анализ длины и количества МТ проводили по мере восстановления сети МТ после ее разборки с помощью холода или иокодазола. По данным, полученным в ходе восстановления, через 10-12 мин после начала восстановления свободные МТ составляли 30-40% от общего количества МТ в клетке. Наши результаты показывают, что свободные МТ, присутствующие в клетках VERO, также в основном короткие, и не тянутся из центра клетки на периферию. Измеренная с помощью различных методов средняя длина свободных МТ в ламелле составила около 5 мкм. Таким образом, полученные с помощью различных методов данные позволяют утверждать, что на долю свободных МТ в клетках

VERO приходится не меньше 40% от общего количества МТ клетки, а по-видимому, значительно больше.

Рис. 2. Гистограмма распределения длин МТ в ламеяле клеток VERO по данным электронной микроскопии. МТ.

Длина МТ, мкм

Динамика восстановления системы МТ

Поскольку в нативной клетке на световом уровне из-за высокой плотности МТ свободные МТ можно наблюдать далеко не всегда, мы решили понизить плотность МТ в центральном районе клетки. Один из возможных способов понизить плотность МТ в центральной области клетки - это разобрать сеть МТ с помощью различных деполимеризующих агентов и проследить за ранними этапами ее восстановления. В экспериментах по восстановлению помимо ядерных клеток использовали цитопласты как содержащие центросому, так и лишенные ее. В ходе восстановления как после холода, так и после нокодазола, первые МТ появлялись уже через несколько мин после снятия деполимеризующего воздействия (рис. 3,4). Восстановление МТ как в ядерных клетках, так и в цитопластах с центросомой, происходило преимущественно от центросомы. Через 2-4 мин после начала восстановления от центросомы расходились немногочисленные МТ' длиной 3-4 мкм. По мере восстановления их длина очень быстро увеличивалась, и через 10-12 минут с момента прекращения деполимеризующего воздействия МТ достигали края клетки. Кроме того, полимеризовались отдельные свободные МТ, которые располагались за пределами звезды из МТ, расходящихся от центросомы. Со временем количество и длина свободных МТ увеличивались, но медленнее, чем длина и количество центросомальных МТ. В целом суммарная длина свободных МТ увеличивалась со временем по линейному закону, тогда как рост суммарной длины центросомальных МТ носил параболический или экспоненциальный характер.

В цитопластах без центросомы первые свободные МТ также появлялись в течение первых 2-6 мин после начала восстановления. Со временем их количество и длина медленно увеличивались. Среднее количество МТ достигало значений, характерных для нативных цитопластов, и переставало увеличиваться лишь через 1 ч после снятия деполимеризующего воздействия.

Рис. 3. Изменение средней длины и количества центросомальных и свободных МТ при восстановлении системы МТ, разрушенных воздействием нокодазола. А - средняя длина центросомаль-ных МТ, Б - среднее количество центросомальных МТ, В - средняя длина свободных МТ, Г - среднее количество свободных МТ.

Рис. 4. Изменение средней длины и количества центросомальных и свободных МТ при восстановлении системы МТ, разрушенных воздействием низкой температуры. А - средняя длина центросомальных МТ, Б — среднее количество центросомальных МТ, В - средняя длина свободных МТ, Г - среднее количество свободных МТ.

Через 10-15 мин после начала восстановления различить индивидуальные МТ было невозможно, однако процесс восстановления сети МТ еще не закончился. Поэтому, для того чтобы полностью проанализировать процесс восстановления, мы провели анализ плотности МТ по мере удаления от центросомы к краю клетки. Непрямой метод количественной оценки доли белка по интенсивности флуоресценции конъюгированного с ним флуорохрома уже описан в литературе (Ye Thai, Borisy, 1994; Ye Zhai et al., 1996; Khodjakov, Rieder, 1999; Morrison et al., 2000).

Оказалось, что в начальный период восстановления, когда радиально растущие от центросомы МТ только достигают края клетки, яркость флуоресценции МТ убывает по мере удаления от центросомы значительно быстрее, чем в контрольных клетках. Этот факт лишний раз убедил нас в том, что описываемая стадия не отражает полного восстановления системы МТ. Характер распределения интенсивности флуоресценции МТ в разных участках цитоплазмы не зависит от условий восстановления, а также одинаковый в целых клетках и в цитопластах, содержащих центросому, поэтому в качестве иллюстрации представлены графики только для ядерных клеток (рис. 5).

Через 20-30 мин после начала восстановления МТ происходит постепенное увеличение интенсивности флуоресценции во внутренней цитоплазме клетки, хотя интенсивность флуоресценции МТ непосредственно в районе центросомы вырастает незначительно, а на краю не меняется совсем. Мы предположили, что это увеличение интенсивности флуоресценции происходит именно за счет появления свободных МТ в цитоплазме клетки, а не за счет увеличения числа центросомальных МТ. Чтобы исключить последнее, была измерена интенсивность флуоресценции в районе центросомы (рис. 6). Из представленных графиков видно, что уже через 10 мин после начала восстановления интенсивность флуоресценции в районе центросомы достигает контрольного уровня, и в дальнейшем практически не меняется - то есть, дополнительного возрастания количества центросомальных МТ на поздних этапах восстановления не происходит.

Рис. 5. Изменение интенсивности флуоресценции МТ по мере восстановления их сети в ядерных клетках. А - после удаления нокодазола из среды культивирования. Б - после переноса из низкой температуры в 30°С. По оси х - расстояние от центросомы (мкм); по оси у - интенсивность флуоресценции (условные единицы).

Рис. 6. Изменение

интенсивности флуоресценции района центросомы ядерных клеток и цитопластов в ходе восстановления МТ после нокодазола (А) и после холода (Б). К - интенсивность флуоресценции района центросомы в контроле (4 ч. после центрифугирования, до

деполимеризации МТ).

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что на поздних сроках восстановления в клетке возникают многочисленные свободные, не связанные с центросомой МТ, минус концы которых располагаются по всей внутренней части цитоплазмы клетки. Таким образом, процесс полного восстановления сети интерфазных МТ, включающий восстановление и системы свободных МТ, идет значительно дольше, чем рост МТ от центросомы до края клетки.

Мы полагаем, что кинетика восстановления сети МТ отличается от кинетики роста индивидуальных МТ, и восстановление целостной системы МТ в клетке происходит в два этапа. На первых порах восстановление происходит со скоростью, примерно соответствующей скорости элонгации плюс концов (рост связанных с центросомой МТ). При этом рост свободных МТ вносит небольшой вклад, поскольку рост их плюс концов сопровождается укорочением свободных и нестабильных минус концов. В дальнейшем рост МТ, расходящихся от центросомы, лимитируется краем клетки, а их количество -количеством затравок на центросоме. Однако плотность МТ во внутренней цитоплазме клетки продолжает расти, как мы предполагаем, за счет образования многочисленных свободных МТ. Почему же свободные МТ немногочисленны вначале, на ранних стадиях восстановления? Мы полагаем, что помимо нестабильности свободных минус концов, образовавшихся в результате спонтанной полимеризации, существует дополнительная причина. Предполагается, что в стационарном состоянии рост свободных МТ происходит от метастабильных затравок, находящихся в цитоплазме (Zheng et al., 1995). Возможно, что эти затравки разрушаются при деполимеризации МТ, затем их функциональная активность постепенно восстанавливается. На первом этапе восстановления происходит образование многочисленных коротких МТ, что, вероятно, есть результат их спонтанной полимеризации в условиях высокой концентрации растворенного тубулина. В дальнейшем эфемерная популяция свободных МТ исчезает вследствие нестабильности их минус концов. Восстановление цитоплазматических затравок для полимеризации МТ занимает определенное время, и только после этого образование достаточного числа свободных МТ становится возможным. В пользу данного предположения говорит совокупность биохимических данных, которые показывают, что на центросоме аккумулируются так называемые большие (2200 kD) комплексы у-тубулина (Meads, Schroer, 1995), тогда как в цитоплазме находятся в основном малые (280 kD) комплексы (Moritz et al., 1998. Oegema et al., 1999), стабильность которых, по-видимому, меньше.

Таким образом, в процессе восстановления системы цитоплазматических МТ в клетках VERO можно выделить две стадии (рис. 7). На первой стадии происходит быстрая

полимеризация центросомальных МТ (возникает радиальная система) и формирование эфемерных свободных МТ. На второй стадии рост МТ, отходящих от центросомы, ограничивается краем клетки и происходит медленная полимеризация свободных МТ от затравок, находящихся в эндоплазме клетки. Полное восстановление системы цитоплазматических МТ достигается не ранее, чем через 45-60 мин после снятия деполимеризующего воздействия, когда полностью восстанавливаются медленнорастущие свободные МТ.

Рис 7. Схема двухфазного восстановления системы МТ в клетках VERO. А - первая стадия, когда полимеризуются преимущественно центросомальные МТ. В - вторая стадия, на которой происходит полимеризация свободных МТ.

Динамические характеристики центросомальных и свободных МТ во внутреннем объеме цитоплазмы

В большинстве предыдущих исследований динамику МТ в культивируемых клетках анализировали, используя микроинъекцию меченного тубулина. При этом из-за высокой плотности МТ во внутреннем объеме клетки, анализ динамических характеристик проводился преимущественно на краю. В результате, поведение МТ описывалось как частая смена фаз роста и укорочения (Sammak et al., 1998; Shelden and Wadsworth, 1993; Waterman-Storer and Salmon, 1997; Yvon and Wadsworth, 1997). Имеются все основания

А

Б

предполагать, что это не отражает полной картины поведения МТ в клетке. Прежде всего, основная масса наблюдений была сделана на краю клетки, где поведение МТ лимитируется плазматической мембраной, в которую они просто вынуждено упираются. Соответственно, поведение МТ в толще цитоплазмы оставалось неизученным. Вместе с тем в нескольких последних работах было показано, что поведение МТ на краю, может отличаться от поведения МТ во внутреннем объеме цитоплазмы (Komarova et al., 2002; Воробьев, Григорьев, 2003).

В работе исследовали динамические показатели свободных и центросомальных МТ в центральном районе клеток VERO после микроиньеции Су-3 тубулина и последующей покадровой записи. Для уменьшения плотности МТ в центральном районе клетки применялась методика обесцвечивания флуоресцентно меченного тубулина - FRAP (Fluorescent Recovery After Photobleaching). Су-3-тубулин инъецировали в клетки и по достижении стационарного состояния (через 2-4 часа после инъекции), с помощью лазерного луча обесцвечивали все МТ в полосе шириной около 3 мкм, проходящей через район центросомы. В обесцвеченной полосе можно было наблюдать только вновь полимеризующиеся фрагменты МТ.

В 10 клетках было проанализировано 50 МТ, растущих от центросомы с момента начала их полимеризации и радиально расходящихся от центросомы, и 50 МТ, которые росли в противоположном направлении - также радиально, но в сторону центросомы, а также перпендикулярно радиусу клетки (т.е. мимо центросомы) (табл. I). Такие МТ мы позволили себе считать свободными, поскольку характер роста связанных с центросомой МТ был иным — они росли прямолинейно в направлении периферии клетки, без загибов и петель.

Отделение МТ от центросомы происходило редко, с частотой 0,25 соб/мин. Гистограммы мгновенных скоростей имеют нормальное распределение для обоих типов МТ, и средние значения мгновенных скоростей оказались схожими для центросомальных и свободных МТ соответственно.

Центросомальные МТ в клетках VERO в среднем росли от центросомы без катастроф на расстояние 13 мкм, что составляет около 1/3 радиуса клетки, то есть далеко не все МТ в результате дорастали до плазматической мембраны, а претерпевали разборку в толще цитоплазмы. Динамика МТ, которые мы считали свободными, в клетках VERO не отличалась от динамики МТ, растущих от центросомы (табл. 1).

Таблица N1. Анализ параметров динамической нестабильности центросомальных

и свободных МТ

Центросомальные МТ Свободные МТ

Общее количество МТ 50 50

Общее время наблюдения (мин) 66,6В 65,56

Доля процессивно растущих МТ 22,5% 30%

Частота катастроф (сек"1) 0,018 0,017

Продолжительность фазы разборки (сек) 7,3±5,1 9,0±5,9

Частота спасений (сек1) 0,016 0,015

Продолжительность фазы роста (сек) 26,6±14Д 27,9±16,9

Мгновенная скорость (мкм/мин) 6,9±17,5 5,9±18,2

Скорость роста (мкм/мин) 13,9±10,2 13,2±10,8

Скорость разборки (мкм/мин) 14,8±10,9 14,1±10,0

Анализ динамики роста МТ выявил большой положительный снос - 5,2 мкм/мин для центросомальных и 4,2 мкм/мин для свободных МТ, что говорит о том, что во внутренней цитоплазме клетки рост МТ преобладает над их укорочением. Таким образом, динамика центросомальных МТ не отличалась от динамики свободных МТ.

Роль центросомальных и свободных МТ в поддержании формы клетки, организации ламеллы и сальтаторных движениях.

В данной работе, для оценки участия свободных МТ в таких жизненно важных клеточных процессах, как поддержание формы клетки и внутриклеточный транспорт, проводилось измерение параметров формы клетки и анализ сальтаторных движений гранул в нативных клетках, содержащих как центросомальные, так и свободные МТ, и в цитопластах, лишенных центросомы, где все имеющиеся МТ были свободными.

Соответствие движений гранул расположению МТ было давно показано в литературе (Freed, Lebowitz, 1970., Murphy, Tilney, 1974., Herman, Albertini, 1984., Bridgeman et al., 1986., Morris, Hollenbeck, 1993., Сперанская и др., 1995). Анализ треков сальтаторных движений гранул проводили в ядерных клетках, цитопластах с центросомой и без нее, находящихся на одном стекле, через 4 часа после энуклеации. Подсчет и анализ треков в каждой клетке проводился в течение 180 с (таб. 2).

Таблица 2.

Анализ сальтаторных движения гранул в ядерных клетках и цитопластах

Среднее количество сальтаторных движений, х±БО Скорость сальтаторных движений, мкм/сек х ± БЭ Длина треков сальтаторных движений, х ± 8Э, мкм

Ядерные клетки 66,8±18,5 2,4±0,7 5,6+2,2

Цитопласты, содержащие центросому 49,3 ±12,5 2,2±0,6 6,1±1,6

Цитопласты без центросомы 22,6 ±8,4 0,8±0,5 2,9+0,7

Проведенный нами анализ треков сальтаторных движений показал, что при наличии организованной радиальной сети сальтаторные движения направлены преимущественно радиально от центросомы к периферии клетки, в то время как в отсутствии центросомы гранулы движутся хаотично. Подобная дезорганизация сальтаторных движений гранул показана для целых клеток при инактивации центросомы с помощью УФ-микрооблучения (Maly, ^и^^, 2002). При деполимеризации сети МТ с помощью деполимеризующих агентов сальтаторные движения гранул вообще прекращались, а при воздействии наномолярных концентраций митостатиков происходила дезорганизация сальтаторных движений гранул (Григорьев и др., 1999). Проведенный анализ траекторий сальтаторных движений гранул в ядерных нативных клетках и в цитопластах, как содержащих центросому, так и лишенных ее, показал, что для правильной организации транспорта по МТ необходимо наличие организованной радиальной сети МТ, расходящихся от центросомы. В цитопластах, не содержащих центросому, сальтаторные движения гранул сохранялись, однако они происходили беспорядочно, отдельных перемещений было меньше, чем в присутствии центросомы. Вдвое меньшей по сравнению с нативными клетками была средняя длина, на которую перемещались гранулы, а сами перемещения происходили вдвое медленнее (табл. 2).

Сравнение морфометрических параметров целых клеток и цитопластов обоих типов позволяет заключить, что если цитопласты, содержащие центросому, по форме и общей морфологии схожи с ядерными клетками, то цитопласты, лишенные центросомы, значительно отличаются по форме и размерам (табл. 3). Во-первых, они имеют значительно меньшую площадь (34% от площади ядерных клеток). Во-вторых, в отсутствии центросомы цитопласты, как правило, не поляризованы. Цитопласты теряют

полярность через 3-4 часа после удаления центросомы из клетки. А в третьих, их ламеллла имеет множественные тонкие выросты. Степень неровности края и наличие значительных выростов у цитопластов, лишенных центросомы, иллюстрирует соотношение периметр/площадь. Это соотношение у целых клеток и содержащих центросому цитопластов не велико, что свидетельствует о более или менее округлой форме (табл. 3). В то же время, у цитопластов, лишенных центросомы, это соотношение на порядок выше.

Таблица 3.

Изменение геометрических параметров цитопластов, полученных из клеток VERO, по сравнению с целыми клетками.

Анализируемый Целые клетки Цитопласты Цитопласты

параметр с центросомой без центросомы

Периметр (Р) 100% 86% 79%

Площадь (S) 100% 69% 34%

Отношение P/S 0,0067 0,0084 0,015

Средняя длина (мкм) 62,9±10,1 56,4±12,6 43,9+14,2

Максимальная длина (мкм) 94,6 76,9 71,6

Средняя ширина (мкм) 36,1+12,9 33,1+12,5 20,7±9,5

Минимальная ширина (мкм) 20,1 19,7 8,1

МТ, направляя внутриклеточный транспорт, участвуют в поддержании полярности клетки, (Vasiliev et al., 1970; Rodionov et al., 1993; Wacker et al., 1997). При деполимеризации МТ, вызванной воздействием различных митостатиков, фибробласт теряет свою поляризованную форму (Vasiliev et al., 1970; Goldman 1971). На данный момент считается, что полярность клетки задается взаимодействием динамичных растущих МТ с актиновыми филаментами, ассоциированными с клеточным кортексом (Tanaka, Sabry, 1995; Goode et al., 2000; Small et al., 2002; Gundersen, 2002). В литературе имеются данные, свидетельствующие о том, что МТ участвуют в процессе поляризации клетки, активируя Rac-1 на лидирующем крае клетки, и прорастая в ламеллоподию (Waterman-Storer et al., 1999). Возможно, дезорганизация радиальной сети приводит к отсутствию тех единичных "пионерских" МТ на лидирующем крае, которые необходимы клетке для активации Rac и

организации полярности клетки. Дезорганизация сети МТ приводит к нарушению внутриклеточного транспорта, что напрямую отражается и на полярности клетки. Представленные в работе данные позволяют сделать вывод, что для поддержания формы клетки, также как и для правильной организации внутриклеточного транспорта, одних только свободных МТ недостаточно.

Выводы

1. В цитоплазме клеток VERO, имеющих видимую в световой микроскоп радиальную систему, помимо связанных с центросомой МТ присутствуют и свободные МТ, составляющие не менее половины от всех МТ клетки.

2. Средняя длина свободных МТ в цитоплазме клеток VERO не превышает 10 мкм.

3. Свободные МТ в клетках VERO образуются как вследствие отделения от центросомы (с частотой 0,25 соб/ мин), так и вне связи с ней.

4. Динамические характеристики плюс концов связанных с центросомой и свободных МТ не различаются.

5. Предполагается, что восстановление сети- цитоплазматических МТ после их деполимеризации происходит в два этапа: на первом этапе происходит быстрый рост преимущественно центросомальных МТ при незначительной полимеризации свободных МТ. На более поздней стадии, когда связанные с центросомой МТ дорастают до плазматической мембраны, происходит заполнение внутренней цитоплазмы клетки за счет полимеризации свободных МТ, не связанных с центросомой.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Алиева И.Б., Горгидзе Л.А., Комарова Ю.А., Чернобельская ОА., Воробьев И.А. 1998.

Экспериментальная модель для изучения первичной реснички в клетках культуры ткани.

Биол. мембр. т. 15, N б. с. 109-1 П.

I. В. Alieva, L.A Gorgidze, Yu.A Komarova, O.A. Chernobelskaya, I.AVorobjev. 1999.

Experimental model for studying the primary cilia in tissue cultured cells. Membr. Cell Biol. V.I2, N

6. p. 895-905.

2. I. В. Alieva, O.A. Chernobelskaya, YuA Komarova, I. A Vorobjev. 1999. EM analysis of the spatial distribution of microtubules in cultured cells. Mol. Cell Biol. Supplement volume 10, 267a.

3. Alieva I.B., Chemobelskaya O.A., Vorobjev I.A., 1999. Quantitative analysis of cenrosomal and non-centrosomal microtubules in cultured cells. 14th Meeting of the European Cytoskeletal Forum. Aug. 28 - Sept. 2, Portugal. P. 35.

4. Чернобельская О.А, Григорьев И.С., Алиева И.Б, Воробьев И.А Длина и расположение микротрубочек в культивируемых клетках. Конференция "Цитоскелет и клеточная регуляция" Пущино, Россия, 11-12 мая 2000.

5. Chernobelskaya O.A., Grigoriev I.S., Alieva I.B., Vorobjev LA. The length and spatial organization of microtubules in cultured Vero cells. The 15th meeting of the European Cytoskeleton Forum. Blankenberge, Belgium, August 26-30,2000.

6. Чернобельская OA, Григорьев И.С., Алиева И.Б, Воробьев И.А. Анализ длин микротрубочек в культивируемых клетках Vero. Всеросийское совещание "Клеточная биология на пороге XXI века " Санкт-Петербург, Россия, 17-19 окт. 2000. Росс. Акад. Наук. С. 35.

7. Чернобельская О.А., Григорьев И.С., Алиева И.Б., Воробьев И.А. 2001. Анализ различных методических подходов к измерению длины микротрубочек в цитоплазме культивируемых клеток. Онтогенез, Т. 32, N 1, р. 58-66.

8. Chernobelskaya O.A., Alieva I.B., Vorobjev LA. 2002. Centrosomal and free microtubules in the presence and in the absence ofthe centrosome. Mol. Biol. Cell. Supplement volume 11, p. 43a.

9. O.A. Чернобельская, И.Б. Алиева, И.А Воробьев. 2003. Динамика микротрубочек во внутренней цитоплазме клеток VERO. Цитология. Т. 45. С. 943.

10. I. В. Alieva, О. Chernobelskaya, LA. Vorobjev, G.G. Borisy. 2003. Dynamics of centrosomal and non - centrosomal microtubules in the interior cytoplasm of VERO cell. Moll. Biol. Cell. Supplement volume 14, p. 429a.

11. Чернобельская OA, Алиева И.Б., Воробьев И.А 2004. Динамика реполимеризации микротрубочек в клетке: быстрый рост от центросомы и медленное восстановление свободных микротрубочек. Цитология, (в печати).

ООП МГУ. Заказ 17-100-04

»- 37 6/,

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Чернобельская, Ольга Аркадьевна

Введение

Обзор литературы

Микротрубочки - компонент цитоскелета животной клетки

Строение микротрубочек

Полярность микротрубочек

Динамическая нестабильность микротрубочек

Регуляция динамической нестабильности

Тредмиллинг

Митостатические агенты

Динамичные и стабильные микротрубочки

Функции микротрубочек в интерфазе

1. Движение органелл по микротрубочкам

2. Участие микротрубочек в поддержании полярности клетки

3. Участие микротрубочек в поддержании архитектуры клетки 30 Центросома, ее роль в жизнедеятельности клетки 31 Строение центросомы 32 Белки центросомы 34 1.у-Тубулин 35 Участие центросомы в организации системы микротрубочек 36 Свободные микротрубочки 38 Происхождение свободных микротрубочек

1. Отсоединение микротрубочек от центросомы

2. Разлом предсуществующих микротрубочек

3. Нуклеация на нецентросомальных сайтах

4. Полимеризация микротрубочек в цитоплазме 43 Организация нецентросомальных микротрубочек 44 Механизм нуклеации микротрубочек

Контроль нуклеации микротрубочек в цитоплазме

Методы исследования системы микротрубочек в интерфазной 47 животной клетке

Цитопласты: получение и основные свойства

Микротрубочки и центросома в цитопласте

Длина микротрубочек в культивируемых клетках

Цели и задачи работы

Материалы и методы

Клеточная культура

Прижизненные наблюдения

Антитела

Иммунофлуоресцентные исследования

Видеомикроскопия

Электронная микроскопия

Анализ распределения длин микротрубочек

Анализ пространственного расположения микротрубочек

Получение цитопластов

Экспериментальные воздействия

Измерение длин микротрубочек в цитоплазме клетки

Анализ интенсивности флуоресценции тубулина

Анализ сальтаторных движений гранул в живой клетке

Микроинъекция

Частичное фотообесцвечивание (FRAP) 64 Анализ параметров динамической нестабильности микротрубочек

Результаты 66 1. Анализ системы микротрубочек в фиксированных клетках VERO

Качественный анализ расположения микротрубочек на 68 электронномикроскопическом уровне

Центросомальные микротрубочки на электронномикроскопическом 71 уровне

Свободные микротрубочки на электронномикроскопическом уровне

Анализ пространственного расположения микротрубочек

Количественный анализ свободных микротрубочек на световом 77 уровне в целых клетках

Цитопласты

Морфология цитопластов

Влияние процесса центрифугирования на систему микротрубочек

Система микротрубочек в цитопластах, содержащих центросому

Исследование динамики восстановления свободных и связанных 85 с центросомой микротрубочек после воздействия холода

Исследование динамики восстановления свободных и связанных 91 с центросомой микротрубочек после воздействия нокодазола

Оценка восстановления сети микротрубочек по изменению 96 интенсивности флуоресценции.

2. Анализ системы микротрубочек в живых клетках

Динамические характеристики центросомальных микротрубочек

Динамические характеристики свободных микротрубочек

Анализ траекторий сальтаторных движений гранул в живых 116 клетках и цитопластах обоих типов

Обсуждение результатов

Методы исследования системы микротрубочек в клетках, их 124 преимущества и недостатки

Цитопласт как модель для исследования системы микротрубочек 131 в в цитоплазме клеток - адекватность модели

В клетках VERO присутствуют многочисленные короткие, не 132 связанные с центросомой микротрубочки

Происхождение свободных микротрубочек.

Динамические характеристики центросомальных и 139 свободных микротрубочек во внутреннем объеме цитоплазмы.

Роль центросомальных и свободных микротрубочек в поддержанш 143 формы клетки, организации ламеллы и сальтаторных движениях

Динамика восстановления центросомальных микротрубочек.

Динамика восстановления свободных микротрубочек.

Двухфазное восстановление сети микротрубочек.

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Центросомальные и свободные микротрубочки в цитоплазме культивируемых клеток"

Микротрубочки как компонент цитоскелета животных клеток выполняют ряд важнейших функций, связанных с поддержанием формы клетки, клеточным транспортом, правильным расположением органелл в цитоплазме, а также участвуют в расхождении хромосом в митозе и в цитокинезе (Alberts et al., 1994). Для выполнения всех этих функций микротрубочки должны быть специальным образом организованы. На протяжение многих лет распространенным считалось мнение о том, что центросома является той единственной органеллой в клетке, которая нуклеирует и организует микротрубочки - своими минус концами микротрубочки закреплены на центросоме, а плюс концы расположены на периферии клетки и таким образом формируется привычная взгляду исследователя радиальная система (Brinkley et al., 1980). Однако в последнее время в литературе накопилось достаточно данных, свидетельствующих о том, что описанная схема не является универсальной, в частности, не все микротрубочки закреплены на центросоме своими минус концами (Алиева, Воробьев, 1989; Alieva et al., 1992; Vorobjev et. al 1997, Waterman-Storer, Salmon, 1997; Keating, Borisy, 1999).

Прежде всего, уже достаточно давно было показано, что в цитоплазме клеток, как в митозе, так и в интерфазе, присутствуют свободные микротрубочки, ни один из концов которых не связан ни с центросомой, ни с какими-либо иными центрами организации микротрубочек (Chalfie and Tompson., 1979; Baase et al., 1988; Mastronarde et al., 1993). В дальнейшем оказалось, что в ряде клеток таких микротрубочек большинство - до 90% (Vorobjev et. al 1997, Waterman-Storer, Salmon, 1997). В настоящее время известны способы образования свободных микротрубочек, также известно, что в некоторых клетках они обладают динамикой, отличной от динамики связанных с центросомой микротрубочек и могут самоорганизовываться в отсутствии центросомы (Keating, Borrisy, 1999; Rodionov et al., 1999; Vorobjev et al., 2002). Наличие 2 систем подтверждается и тем фактом, что центросомальные и свободные микротрубочки могут различаться также и структурно. Так, в работе Mogensen и Tuker было показано, что микротрубочки, полимеризующиеся в дифференцирующихся эпидермальных клетках крыла дрозофилы в отсутствии центросомы, состоят из 15 протофиламентов, тогда как микротрубочки, полимеризующиеся позднее на центросоме, состоят из 13 протофиламентов (Tucker et al., 1987).

Если принять тот факт, что в клетке существуют две системы микротрубочек, то становится непонятно, как же удается клетке сохранять радиальную систему микротрубочек, видимую в световой микроскоп, и как могут взаимодействовать друг с другом микротрубочки этих двух систем. Не ясно и то, как в таком случае ни с чем не связанные, отдельно расположенные свободные микротрубочки могут участвовать в клеточном движении, поддержании клеточной формы и внутриклеточном транспорте.

Поскольку работы, посвященные вопросу происхождения свободных микротрубочек и их роли в клетке, появились в литературе только в последние годы, вопрос о том, являются ли свободные микротрубочки в клетке правилом или же исключением, до сих пор не решен.

В настоящее время интерес к свободным микротрубочкам сильно возрос, поскольку факт их присутствия в клетке может в корне изменить всеобщее представление о системе микротрубочек и о том, как она функционирует.

Целью данной работы было с помощью различных методических подходов изучить строение системы микротрубочек в клетке, где, визуально кажется, что все микротрубочки связаны с центросомой.

В данной работе на электронном и световом уровнях показано наличие в клетке с видимой радиальной сетью большого числа свободных микротрубочек. Исследована динамика восстановления свободных и центросомальных микротрубочек после разрушения сети микротрубочек с помощью различных воздействий. Предложена модель двухфазного восстановления сети микротрубочек после их полной деполимеризации.

Свободные и центросомальные микротрубочки были изучены с функциональной точки зрения - участие во внутриклеточном транспорте (сальтаторные движения) и поддержании формы клетки, а также были изучены с позиций их свойств - динамические характеристики свободных и центросомальных микротрубочек во внутренней цитоплазме клетки.

25 nm про то фила менты

Обзор литературы Микротрубочки - компонент цитоскелета животной клетки

Цитоскелет животных клеток представлен тремя компонентами и одной из его составляющих, наряду с промежуточными и актиновыми филаментами, является система микротрубочек. Согласно прочно устоявшемуся и вошедшему в учебники мнению, система микротрубочек в интерфазе представляет собой радиально расходящиеся микротрубочки, закрепленные на центросоме, которая является центром нуклеации и организации микротрубочек во всех животных клетках (Alberts et al., 1994).

В интерфазной клетке микротрубочки играют важную роль в процессах внутриклеточного транспорта, поддержании клеточной формы и клеточном движении (Kellog et al., 1994). Во время митоза микротрубочки формируют митотическое веретено и участвуют в цитокинезе, таким образом, непосредственно участвуя в клеточном делении. Строение микро трубочек

Микротрубочки представляют собой дим ер тубулина протяженные полые неветвящиеся цилиндры с постоянным диаметром около 25 нм и различной 1-Строение микротрубочки длиной (Рис. I). На 80%-95% стенка такого цилиндра состоят из высоко консервативного глобулярного белка тубулина, представляющего собой гетеродимер. Гетеродимер состоит из двух субединиц - а и Р (Weisenberg 1972; Mitchison, Kirschner., 1984). В животной клетке встречается, по меньшей мере, шесть изоформ а-и Р-тубулина. Размер димера тубулина составляет 4x8 нм. Гетеродимеры в составе микротрубочки линейно полимеризуются в протофиламенты.

На 1 мкм длины протофиламента приходится 1625 димеров тубулина. Гетеродимер тубулина имеет 2 сайта связывания с GTP. Один из них, находящийся на р - субъединице, является обмениваемым, в отличие от сайта связывания, локализованного на а-субъединице (Geahlen, Haley 1979; Nath et al., 1985; Hesse et al., 1985; Linse, Mandelkow, 1988; Terry, Purich, 1980). По мере роста микротрубочки GTP гидролизуется до GDP и Pj. В результате на растущем конце микротрубочки всегда имеется участок из не гидролизованного тубулина.

При полимеризации микротрубочек in vitro образуется смесь из микротрубочек, состоящих из 13, 14 и 15 протофиламентов (Pierson et al., 1979; Langford, 1980). Микротрубочки в животных клетках обычно состоят из 13 протофиломентов (Tilney et al., 1973; Burton et al., 1975; Amos and Baker, 1979), хотя могут встречаться микротрубочки и другого состава - от 9 до 18 протофиламентов (Chre'tien, Wade, 1991). Так в клетках беспозвоночных микротрубочки могут состоять из 11, 12, или 15 протофиламентов (Burton et al., 1975; Nagano, Suzuki 1975). Кроме тубулина в состав микротрубочек входят различные минорные белки с молекулярной массой от 20 кД до 350 кД. Эти белки получили общее название MAP (от английского microtubular associated proteins). Их состав варьирует в зависимости от клеточного типа. В интерфазе MAP связаны с микротрубочками по всей длине, стабилизируя их структуру. При переходе к митозу происходит гиперфосфорилирование MAP, их связь с микротрубочками ослабляется, и микротрубочки становятся более динамичными (Tournebize, 2000). На данный момент их известно несколько десятков, и если первые из открытых белков получали соответствующий порядковый номер (MAPI, МАР2 и т.д.), то по мере открытия все новых и новых белков им стали присваивать персональные названия. Наиболее изученные белки, традиционно относимые к этой группе - MAPI, МАР2, МАР4 и tau - влияют на динамические показатели микротрубочек, как правило, стабилизируя их. Белки группы MAPs имеют домен, выступающий из стенки микротрубочки, что позволяет белкам из этого семейства выступать как связующее звено между микротрубочками и различными регуляторными молекулами (Gundersen, Cook., 1999; Srivastava et al., 1998; Gundersen, Cook., 1999).

Наиболее хорошо изученный белок, относящейся к группе MAPs, присутствующий в клетках животных - МАР4 (Bulinski, 1994; Nguyen et al., 1997). Данный белок стабилизирует микротрубочки (Ookata et al., 1995). Связь МАР4 с микротрубочками регулируется белком мапмодулином (mapmodulin) (Ulitzur et al., 1997). Кроме того, на микротрубочках располагаются различные белки-моторы, которые осуществляют транспорт макромолекул по микротрубочкам (Nguyen et al., 1997), о чем более подробно описано в главе функции микротрубочек.

Таким образом, в состав микротрубочек помимо белка тубулина входят множество других белков, способных регулировать динамику микротрубочек, тем самым, влияя на функции микротрубочек в клетке. Полярность микротрубочек

Микротрубочки представляют собой полярные структуры. Полярность микротрубочек впервые была продемонстрированная Алленом и Бориси (Allen, Borisy., 1974). В их работе по полимеризации растворенного тубулина, выделенного из мозга, на фрагментах аксонем ресничек, было показано, что с одного конца микротрубочки растут быстрее, чем с другого (Allen, Borisy., 1974). Быстро растущие концы были названы плюс концами, а медленно растущие - минус концами. Асимметрия концов микротрубочек основана на асимметрии гетеродимеров а- и р-тубулина. Возможны два способа определения полярности микротрубочек: декорирование их молекулами динеина (Heidemann, Mcintosh, 1980) и полимеризация на них экзогенного тубулина в условиях повышенной ионной силы (Haimo et al., 1979; Telzer, Rosenbaum, 1979). Минус конец микротрубочки - ее проксимальный конец - закреплен на центросоме, а плюс конец -дистальный конец микротрубочки - направлен в цитоплазму. Последние исследования свободных микротрубочек in vivo выявили функциональное различие плюс и минус концов микротрубочек. Показано, что плюс конец вносит основной вклад в распространение сети микротрубочек в клетке, а минус конец обеспечивает обновление интерфазной сети микротрубочек, определяя время жизни отдельной микротрубочки (Vorobjev., 1997; Yvon, Wadsworth., 1997). Помимо белков, связанных со стенкой микротрубочки, существуют белки, располагающиеся на ее концах - плюс и минус концевые белки. Цитоплазматический линкерный белок CLIP-170 (cytoplasmic linker protein 170) был первым белком, для которого была показана колокализация с плюс концом микротрубочек (Rickard, Kreis., 1990; Diamantopoulos et al., 1999). Причем взаимодействует этот белок только с растущим плюс концом микротрубочки (Perez et al., 1999). В одной из последних работ из лаборатории Г. Бориси было показано, что CLIP-170 может выступать как фактор спасения для микротрубочек (Komarova et al., 2002). К этому же семейству относится белок CLIP-115, который может связываться с другими плюс концевыми белками, образуя сложный комплекс на плюс конце микротрубочки (Akhmanova et al., 2001).

Еще один представитель группы белков, локализующихся на плюс конце микротрубочек - белки семейства ЕВ (end bounding), ЕВ 1 и ЕВЗ консервативного от дрожжей до человека (Tirnauer and Bierer, 2000). Эти небольшие белки (около 35 kD) также специфически связываются только с растущим плюс концом микротрубочки (Schuyler and Pellman, 2001а). Как и другие плюс концевые маркеры, ЕВ1 формирует кометообразный комплекс на полимеризующемся конце микротрубочки (Mimori-Kiyosue et al., 2000). Находясь на растущем плюс конце микротрубочки, белок может регулировать его динамику и выступать маркером для взаимодействия с другими белками (Scroer, 2001). Дрожжевой гомолог ЕВ1 - Bimlp, связываясь с растущим концом микротрубочки, выполняет две функции: влияет на динамику микротрубочек, увеличивая частоту переходов, и снижая частоту пауз (Tirnauer et al., 1999), таким образом, стабилизируя микротрубочки (Tirnauer et al., 2002), а также маркирует плюс конец микротрубочки для связи с клеточным кортексом, взаимодействуя с кортикальным белком Kar9p (Lee et al., 1999; Tirnauer et al., 1999; Miller et al., 2000). Детали взаимодействия EB1 с микротрубочками в животных клетках пока неясны. Известно лишь, что гиперэкспрессия в клетках культуры ткани GFP-EB1 приводит к образованию длинных микротрубочек.

Помимо этих белков известны CLASP (CLIP Associated Proteins) и pl50glud, также связанные с плюс концом микротрубочек (Akhmanova et al., 2001; Hoogenraad et al., 2000). Считается, что перечисленные белки образуют сложный комплекс на плюс конце микротрубочки (Akhmanova et al., 2001; Komarova et al., 2002).

На минус конце микротрубочки локализуется у-тубулин, катанин и нинеин (ninein). у-тубулин - это высоконсервативный белок, который в составе сложного комплекса способен нуклеировать микротрубочки (Moritz , 1995; Moritz et al., 1995; Vogel et al., 1997; Martin et al., 1998; Oegema et al., 1999; Moritz et al., 2000). Катанин - белок, способный разрезать микротрубочки, который участвует в отсоединении микротрубочек от центросомы (Ahmad et al., 1999). Белок нинеин, для которого в некоторых клеточных линиях была показана локализация на минус конце микротрубочек, участвует в заякоревании минус конца микротрубочки на материнской центриоле (Mogensen et al., 2000; Piel et al., 2000).

Таким образом, полярность микротрубочек определяется не только наличием а- или Р-тубулина на ее конце, но и специфическими белками, которые могут связываться с одним из концов микротрубочки и влиять на их свойства.

Динамическая нестабильность микротрубочек

В современной литературе поведение микротрубочек в животной клетке принято описывать в терминах динамической нестабильности. Явление динамической нестабильности было впервые описано Митчисоном и Киршнером (Mitchison, Kirshner) в 1984 году. Было показано in vitro, что микротрубочки в равновесном состоянии не являются статичными структурами: их концы находятся в состоянии постоянного роста или укорочения (Mitchison, Kirshner, 1984). После включения димера а-Р-тубулина в состав микротрубочки происходит гидролиз GTP, связанного с р-тубулином, до GDP и Pj. Молекулы р~ тубулина, несущие GTP, прочнее связываются с концом микротрубочки (имеют большее сродство) и имеют меньшую константу диссоциации. При быстром росте микротрубочки происходит запаздывание гидролиза, поэтому на быстро растущем конце образуется «шапочка» из GTP-P-тубулина, препятствующая разборке и способствующая росту микротрубочки. При уменьшении скорости роста происходит полный гидролиз GTP на Р-тубулине, и микротрубочка начинает укорачиваться (Mejillano et al., 1996). Таким образом, динамическая нестабильность микротрубочек - это чередование фаз роста (полимеризации) и укорочения (деполимеризации) концов микротрубочки (Mitchison, Kirschner, 1984).

В отличие от системы in vitro, в живых клетках концы микротрубочек могут расти и укорачиваться, а также могут находиться в неподвижном состоянии, получившем название пауз (Mitchison, Kirshner, 1984; Gliksman et al. 1993., Waterman-Storer, Salmon., 1997, Mikhailov, Gundersen, 1998). Если продолжительность фазы роста преобладает над фазой укорочения, то конец микротрубочки растет и наоборот.

С усовершенствованием техники прижизненных наблюдений, с использованием методики инъекций флуоресцентно меченого тубулина, стало возможно исследовать динамику микротрубочек в живых клетках (Sammak et al., 1987; Cassimeris et al., 1988; Sammak, Borisy., 1988; Keating et al., 1997). Было показано, что фазы роста и укорочения концов микротрубочек длятся по несколько десятков секунд и, как правило, продолжаются на небольшие расстояния (1,3 мкм в клетках PtKj и 3,2 мкм в клетках СНО), а переход от роста к укорочению носит случайный характер (Walker et al., 1989; Shelden, Wadswirth, 1993). В разных работах, выполненных на различных объектах, время полуобмена отдельной микротрубочки варьирует от 5 до 10 мин (Saxton et al., 1984; Sammak et al., 1987; Rodionov and Borisy, 1994). Таким образом, каждая микротрубочка в клетке находится в состоянии динамической нестабильности, живет недолго и довольно быстро разбирается и заменяется новой.

Динамические свойства концов микротрубочек могут изменяться на протяжении клеточного цикла. Так, наблюдается существенная разница между динамикой и длиной микротрубочек в интерфазной клетке и митотическом веретене. В интерфазной клетке количество микротрубочек значительно меньше, чем в митозе (Snyder, Mcintosh, 1975; Kuriyama, Borisy, 1981) а их средняя длина значительно выше (Rieder, 1977; Cassimeris et al., 1988; Hayden et al., 1990; Aist, Bayles, 1991). Митотические микротрубочки более динамичные, чем интерфазные, вследствие чего скорость обмена микротрубочек в митотическом веретене выше, чем в интерфазе (Wadsworth, Salmon, 1986а; Cassimeris et al., 1988; Joshi et al., 1992). Регуляция динамической нестабильности

Регуляция динамической нестабильности играет важную роль в функционировании системы микротрубочек. Скорость сборки микротрубочек in vitro в несколько раз меньше, чем их скорость роста in vivo. Так, в клетках позвоночных скорость роста плюс конца микротрубочек выше в 5-10 раз, а частота катастроф и спасений - в 10 раз, чем те же показатели для чистого тубулина in vitro (Desai, Mitchison, 1997). Это связано с тем, что в клетке присутствуют многочисленные молекулы, связывающиеся с микротрубочками, которые могут регулировать динамику микротрубочек. Прежде всего, это уже упоминавшиеся белки семейства MAPs. Например, белок МАР-2 подавляет динамическую нестабильность микротрубочек, а белок ХМАР наоборот, стимулирует (Ookata et al., 1995).

В нескольких работах было показано, что Opl8/stathmin, небольшой термоустойчивый белок, связывающийся с двумя тубулиновыми димерами, увеличивает частоту катастроф, вызывая гидролиз GTP (Belmont and Mitchison, 1996; Jourdain et al., 1997). Сейчас этот белок активно исследуется, поскольку показано, что он может играть определенную роль в опосредовании локальных изменений в динамике микротрубочек в митозе. Показана его локализация в непосредственной близости от хроматина при сборке веретена (Andersen et al., 1997; Walczak, 2000). Opl8/stathmin может выступать как промотор катастроф (Belmont, Mitchison, 1996), а также может разрезать микротрубочки (Curmi et al., 1997; Jourdain et al., 1997). В настоящее время известно, что это полифункциональный белок, преобладание того или иного механизма, действия которого зависит от рН среды.

Помимо внутриклеточных белков, способных регулировать динамику микротрубочек, существуют и экзогенные вещества, способные изменять параметры динамической нестабильности микротрубочек: так, некоторые митостатики (вещества, ингибирующие прохождение митоза), например, винбластин и таксол, в низких концентрациях ингибируют динамическую нестабильность микротрубочек без изменения массы полимеризованного тубулина (Tosso et al., 1993, Derry et al.,1995). (смотри главу Митостатические агенты).

Параметры динамической нестабильности (скорость сборки и разборки, продолжительность фаз сборки и разборки, а также пауз между ними) различаются в разных клеточных линиях (Yvon, Wadsworth, 1997). Так, в эпителиальных клетках скорость роста и укорочения микротрубочек меньше, чем в фибробластах, а частота перехода из фазы укорочения к фазе роста выше (Yvon, Wadsworth., 1997). Вышеупомянутые белки Opl8/stathmin и ХКСМ предположительно, играют роль регуляторов поведения микротрубочек в клеточном цикле: ХКСМ-1 активен в интерфазе и митозе, но не вызывает катастроф в интерфазе из-за стабилизирующего действия MAP. При переходе в митоз, когда влияние MAP ослабляется и, одновременно, ослабляется действие Opl8/stathmin, дестабилизирующая активность ХКСМ-1 увеличивается. Данная гипотеза вполне согласуется с поведением микротрубочек, которые в митозе действительно становятся более динамичными.

С появлением методов видеомикроскопии с усилением контраста и микроинъекций меченого тубулина в клетку, когда стало возможным исследовать не только фиксированные, но и живые клетки, было показано, что динамическая нестабильность микротрубочек является фундаментальным свойством микротрубочек в клетках эукариот (Zhai,

Borisy, 1994; Dhamodharan, Wadsworth, 1995; Mikhailov, Gundersen, 1995; Keating et al., 1997; Yvon, Wadsworth, 1997; Vorobjev et al., 1997; Danowski, 1989; Borisy, Rodionov, 1999; Воробьев и др., 2000; Komarova et al., 2002). Тредмиллинг

Помимо динамической нестабильности, микротрубочки в клетке могут претерпевать тредмиллинг (от английского - treadmilling) (Margolis, Wilson., 1978).

Первоначально тредмиллинг был описан in vitro для сборки актиновых протофиламентов (Wegner, 1976). Позднее Марголис и Вильсон (Margolis, Wilson) показали, что микротрубочки, полимеризующиеся in vitro из тубулина мозга в присутствии MAPs, могут претерпевать тредмиллинг (Margolis, Wilson, 1978). В стационарном состоянии, когда наблюдается равновесие между полимеризованным и деполимеризованным тубулином в растворе, плюс и минус концы микротрубочки ведут себя по-разному: на плюс конце происходит полимеризация тубулина, а на минус конце деполимеризация. Таким образом, включенные в состав микротрубочки молекулы тубулина совершают в стационарном состоянии медленное движение от плюс конца к минус концу микротрубочки. Скорость этого потока субъединиц в составе микротрубочки не велика, и составляет около 1мкм в час (Margolis, Wilson, 1978; Walker et al., 1988).

Тот факт, что тредмиллинг долгое время наблюдали только in vitro, объясняется тем, что в клетке довольно сложно увидеть оба конца микротрубочки из-за их высокой плотности в цитоплазме. Несмотря на это, с усовершенствованием технических подходов, тредмиллинг был описан и в живых клетках - в 1988 году с использованием темнопольной микроскопии (Hotani, Horio, 1988). Также тредмиллинг наблюдали в цитоплазматических фрагментах, лишенных центросомы, где плотность микротрубочек не высока и можно с уверенностью различить оба конца микротрубочки (Rodionov, Borisy, 1997, Rodionov et al., 1999; Komarova et al., 2002). Однако скорость потока субьединиц в ходе тредмиллинга в живых клетках оказалась намного выше, чем скорость тредмиллинга, измеренная in vitro, и была скорее сравнима со скоростями, измеренными для динамической нестабильности (Walker et al., 1988; Hotani, Horio, 1988).

В работе Родионова с соавторами (Rodionov et al., 1999) было показано, что в клеточных фрагментах, полученных из фибробластов, в отсутствии центросомы может происходить переключение процесса динамической нестабильности микротрубочек на тредмиллинг. В цитопластах, полученных из эпителиальных клеток, лишенных центросомы, поведение микротрубочек описывается параметрами динамической нестабильности. Авторы предполагают, что в клетках фибробластов, где микротрубочки выступают как более динамичные структуры, может присутствовать некий фактор, способный при необходимости переключить поведение микротрубочек с динамической нестабильности на тредмиллинг (Rodionov et al., 1999).

Недавно был открыт новый способ визуализации тредмиллинга в живых клетках. Этот способ основан на неравномерности флуоресценции меченной микротрубочки при низком уровне микроиньецированного тубулина (Waterman-Storer and Salmon, 1998). В результате, из-за неоднородности свечения, вызванной тем, что не весь тубулин в составе микротрубочки помечен, каждая микротрубочка имеет свой рисунок, который может служить хорошим маркером индивидуальной микротрубочки. Если микротрубочка передвигается, а рисунок остается на месте, то можно говорить о тредмиллинге. Если же микротрубочка передвигается вместе со своим рисунком, то можно говорить о передвижении микротрубочки с помощью внешних сил.

Митостатические агенты

Белки, ассоциированные с микротрубочками, являются внутриклеточными регуляторами обмена тубулина. Однако существует ряд веществ - таких, как растительные алкалоиды (митостатические агенты, цитостатики), которые, связываясь с микротрубочками, приводят к изменению динамики их концов как in vitro, так и in vivo. (Malawista et al., 1968; Wilson, Bryan, 1974; DeBrabander et al., 1976; Hoebeke et al., 1976; Lee et al., 1980; Baas, Black, 1990). Данные вещества достаточно легко проникают в клетку. Введенные в соответствующей концентрации в культуральную среду, они за 1-2 часа вызывают полную деполимеризацию микротрубочек как в делящихся, так и в интерфазных клетках (Kleinfield, Sisken, 1966; Brinkley et al., 1967; Karsenti et al., 1984b; Hoebeke et al., 1976; Lee et al., 1980)

Одним из первых в ряду цитостатиков в 1962 году был открыт колхицин (Wani et al., 1971; Schiff et al., 1979). Он останавливает митоз, вызывая разборку микротрубочек. Колцемид является полусинтетическим аналогом колхицина. Широко используемый в настоящее время нокодазол - полностью синтетический аналог колхицина. Преимущества этого цитостатика заключаются в том, что он достаточно быстро проникает в клетку, обратимо связывается с растворенным тубулином, образуя комплекс нокодазол-тубулин, и быстро выводится из клетки при переносе в чистую среду (Алиева, Воробьев, 1987; 1990; Mejilano etal., 1996).

Винбластин (и аналогичный ему винкристин) - алкалоиды растительного происхождения, широко использующиеся в онкологии (Rowinsky, Donwhower, 1991). Они вызывают образование паракристаллов тубулина, тем самым повышая уровень цитоплазматического пула белка. Таксол (paclitaxel), в отличие от вышеперечисленных цитостатиков, является агентом, стабилизирующим ш микротрубочки (Schiff et al., 1979; Kumar, 1981). Он обратимо связывается с микротрубочками in vitro в соотношении 1 молекула таксола на 1 молекулу тубулина в составе микротрубочек, не взаимодействуя с пулом растворенного тубулина (Parness, Hirwitz, 1981; Diaz et al., 1993). Таксол ингибирует GTP-азную активность тубулина в составе микротрубочек, в результате чего микротрубочки принимают стабильную конформацию, а это не дает им деполимеризоваться и стимулирует бурную полимеризацию тубулина, в свою очередь приводящую к снижению уровня растворенного тубулина (Schiff et al., 1979; Kumar, 1981; Howard, Timasheff, 1988). Воздействие таксола в высокой концентрации приводит к образованию пучков микротрубочек (Schiff, Horwitz, 1980; DeBrabander et al., 1981; Rowinsky et al., 1988; Jordan etal., 1993).

Разные концентрации алкалоидов могут по-разному влиять на динамику микротрубочек: высокие (микромолярные) концентрации вызывают полную разборку, а низкие (наномолярные) - блокируют динамику микротрубочек in vivo (DeBrabander et al., 1976; Jordan, Wilson, 1990) и in vitro (Hoebeke et al.,1976; Friedman, Platzer.1978; Ireland, 1979; Lee et al.,1980; Jordan, Wilson, 1990; Toso et al., 1993).

Деполимеризовать микротрубочки можно и физическими воздействиями - высоким гидростатическим давлением (Воробьев, Драчев, 1989) и низкой температурой (Frankel, 1976; Osborn, Weber, 1976; Brady et al., 1984; Watson et al., 1990; E. McBeath, K.Fujiwara 1990).

Процесс деполимеризации микротрубочек с помощью различных митостатиков может быть обратим при удалении деполимеризующего агента из среды культивирования или при переносе в нормальные физические условия. Процесс восстановления начинается спустя 20-30 минут после удаления колцемида (Osborn, Weber, 1976), спустя 2-3 минуты после удаления нокодазола (De Brabander et al., 1982; Karsenti et al., 1984b; Смурова и др., 2002), и спустя несколько минут после снятия воздействия низкого давления (Воробьев, Драчев, 1989) или холода (Vorobjev, Chentsov, 1983; McBeath, Fujiwara 1990). Процесс восстановления микротрубочек занимает до часа (De Brabander et al., 1981; McBeath, Fujiwara 1990). Восстановление микротрубочек, после снятия деполимеризующего воздействия происходит преимущественно на центросоме (Brinkley et al., 1976; Frankel, 1976; Osborn, Weber 1976; Brinkley et al., 1981; Karsenti et al., 1984b;. McBeath, Fujiwara 1990; Смурова и др., 2002), хотя некоторые авторы отмечали и возможность полимеризации микротрубочек в цитоплазме (Speigelman et al., 1979; Brinkley et al., 1981; de Brabander et al., 1981; Karsenti et al., 1984b; Bri et al., 1987; McBeath, Fujiwara 1990; Waterman-Storer et al., 1999). Так в работе De Brabander было показано, что при отмывке нокодазола и дальнейшей реполимеризации в присутствии таксола, происходит мгновенная полимеризацию свободных микротрубочек и множественных звезд в цитоплазме. Таким образом, таксол вызывает спонтанную полимеризацию свободных микротрубочек, отменяя преимущество центросомы, за счет снижения критической концентрации полимеризации тубулина (De Brabander et al., 1981). Однако в большинстве перечисленных работ анализировалось лишь первые 15-20 минут процесса восстановления, когда растущие микротрубочки можно было различить как индивидуальные структуры (de Brabander et al., 1981; Karsenti et al., 1984b; Waterman-Storer et al., 1999).

К сожалению, в литературе мало статей, в которых описывалась бы полная динамика процесса восстановления, а количественная оценка полимеризующихся микротрубочек проводилась лишь в нескольких работах. Так, в работе Воробьева и Ченцова на электронномикроскопическом уровне оценивается количество микротрубочек, полимеризующихся на центросоме после воздействия холода (Vorobjev, Chentsov, 1983). Было показано, что по мере восстановления количество микротрубочек, полимеризующихся на центросоме растет, а через 15-20 минут после переноса в тепло уменьшается (Vorobjev, Chentsov, 1983). Количественная оценка микротрубочек, полимеризующихся после холода, проводилась и в работе McBeath, Fujiwara на клетках чешуи рыбы - LT (McBeath, Fujiwara 1990). В данной работе показано восстановление - наряду с центросомальными - и большого количества свободных микротрубочек. Авторы считают, что в клетках LT свободные микротрубочки образуются за счет отсоединения микротрубочек от центросомы (McBeath, Fujiwara 1990).

Таким образом, применение цитостатиков при использовании современной аппаратуры открывает возможности экспериментального изучения процесса восстановления сети микротрубочек в клетке, позволяет изучить этот процесс под новым углом зрения. Динамичные и стабильные микротрубочки

Микроинъекция флуоресцентно меченного тубулина в живые клетки показала, что время полуобмена микротрубочек в среднем составляет около 10 минут (Saxton et al., 1984; Scherson et al., 1984; Schulze, Kirschner, 1986); т.е. микротрубочки представляют собой высоко динамичные структуры. Помимо этого, в клетке существуют популяция стабильных микротрубочек, являющихся долгоживущими (обзор Gelfand, Bershadsky, 1991). Стабильные микротрубочки тоже обладают динамической нестабильностью, но их динамика медленнее, чем у динамичных микротрубочек: они имеют меньшую скорость деполимеризации, больше времени проводят в паузе и имеют меньшую частоту катастроф (Shelden, Wadsworth, 1993). Время полуобмена таких микротрубочек составляет более одного часа (Schulze, Kirschner, 1986;

Webster et al., 1987). Стабильные микротрубочки более устойчивы к агентам, деполимеризующим микротрубочки (Job et al., 1982; Wehland, Weber, 1987; Kreis, 1987).

Следствием стабилизации микротрубочек являются, как правило, пострансляционные модификации тубулина. Из них наиболее известны детирозилирование а-тубулина на С-конце (Glu-тубулин) (Raubin, Flavin, 1977; Argarana et al., 1978) и ацетилирование с-аминогруппы Lys-40 а-тубулина (L'Hernault, Rosenbaum 1985; LeDizet, Piperno, 1987).

Динамичные микротрубочки могут становиться стабильными и наоборот. Пострансляционные модификации тубулина являются скорее следствием стабилизации микротрубочек, нежели ее причиной (Gundersen et al., 1987; Bulinski, Gundersen, 1991; Gelfand, Bershadsky, 1991), поскольку увеличение количества детирозилированного тубулина в клетке не приводит к увеличению популяции стабильных микротрубочек in vitro (Skoufias, Wilson, 1998) или in vivo (Khawaja et al., 1987). Стабилизация микротрубочек может быть вызвана взаимодействием с различными белками, стабилизирующими микротрубочки (Chapin, Bulinski, 1992; Dhamodharan, Wadsworth, 1994). Наиболее хорошо охарактеризованные из них, как уже указывалось, MAPI, МАР2, МАР4 и tay - связываются с тубулином по всей длине микротрубочки и стабилизируют ее (Hirokawa, 1994). Однако ни для одного из этих белков не было показано участие в стабилизации отдельно взятой микротрубочки, или некой группы микротрубочек. Эти белки стабилизируют всю популяцию микротрубочек в клетке (Hirokawa, 1994). Вероятно, селективная стабилизация некой популяции микротрубочек или одной микротрубочки в клетке происходит по неизвестному пока механизму. На данный момент в литературе имеется мнение, что такая селективная стабилизация микротрубочек может происходить за счет формирования на плюс конце микротрубочки кэпа", не позволяющего микротрубочке разбираться (Gundersen et al., 1987b; Webster et al., 1987a; Schulze, Kirschner, 1987), чем и вызвана большая, чем у обычных микротрубочек, устойчивость к воздействию деполимеризующих агентов, влияющих на деполимеризацию плюс конца микротрубочек (Job et al., 1981; Wehland, Weber, 1987; Kreis, 1987). Наличие такого АТР-зависимого "кэпа" недавно было показано на плюс конце стабильных детирозилированных микротрубочек эпителиальных клеток (Infante et al., 2000).

В литературе имеется мнение, что наличие стабильной субпопуляции микротрубочек в клетке имеет физиологическое значение, хотя на данный момент экспериментальных данных, подтверждающих эту теорию в литературе не много: так, было показано, что динамичные микротрубочки участвуют в транспорте трансцитозных молекул к апикальной мембране, а стабильные микротрубочки участвуют в транспорте к базолатеральной мембране (Poul et al., 1998).

Количество стабильных и динамичных микротрубочек различается в разных типах клеток. В фибробластах большинство микротрубочек динамичны (Wadsworth and McGrail., 1990). В эпителиальных клетках, напротив, стабильных микротрубочек значительно больше (Wadsworth and McGrail., 1990; Gelfand, Bershadsky., 1991). Интересно, что увеличение количества детирозилированного и ацетилированного тубулина в клетках происходит при таких событиях, как направленное движение фибробласта (Gundersen, Bulinski, 1988; Nagasaki et al., 1992; Gundersen, et al., 1994), формирование отростков нейрона (Baas, Black, 1990), образование эпителиального пласта (Pepperkok et al., 1990) и в ходе эмбриогенеза (Warn et al., 1990). Все это указывает на то, что стабилизация и пострансляционные модификации микротрубочек могут играть важную роль в формировании сети микротрубочек, а значит и в жизнедеятельности как клетки, так и в морфогенетических процессах целого организма (Kirschner, Mitchison, 1986; Bulinski, Gundersen, 1991). Функции микротрубочек в интерфазе

С того момента, как микротрубочки были впервые описаны и охарактеризованы как компоненты цитоскелета клетки, а также в процессе изучения их функций, их важная роль в жизнедеятельности клетки не подвергалась сомнению. Во время митоза микротрубочки формируют митотическое веретено, непосредственно участвуя в клеточном делении. В интерфазной клетке, а именно эта стадия клеточного цикла интересовала нас в настоящей работе, микротрубочки играют важную роль в процессах внутриклеточного транспорта, поддержании клеточной формы, распластывании и клеточном движении. Таким образом, благодаря согласованной работе микротрубочек и центросомы обеспечива!ется координация различных процессов в клетке.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Чернобельская, Ольга Аркадьевна

Выводы

1. В цитоплазме клеток VERO, имеющих видимую в световой микроскоп радиальную систему, помимо связанных с центросомой микротрубочек присутствуют и свободные микротрубочки, составляющие не менее половины от всех микротрубочек клетки.

2. Средняя длина свободных микротрубочек в цитоплазме клеток VERO не превышает 10 мкм.

3. Свободные микротрубочки в клетках VERO образуются как вследствие отделения от центросомы (с частотой 0,45 соб/мин), так и вне связи с ней - за счет полимеризации на цитоплазматических сайтах нуклеации.

4. Динамические характеристики плюс концов связанных с центросомой и свободных микротрубочек не различаются.

5. Предполагается, что восстановление сети цитоплазматических микротрубочек после их деполимеризации происходит в два этапа: на первом этапе происходит быстрый рост преимущественно центросомальных микротрубочек при незначительной полимеризации свободных микротрубочек; на более поздней стадии, когда связанные с центросомой микротрубочек дорастают до плазматической мембраны, происходит заполнение внутренней цитоплазмы клетки за счет полимеризации свободных микротрубочек, не связанных с центросомой.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чернобельская, Ольга Аркадьевна, Москва

1. Алиева И.Б., Воробьев И.А., Ченцов Ю.С. Стереоскопический анализ расположения микротрубочек вокруг центросомы в в клетках культуры тканей. Доклад Акад. Наук. 1989. N. 305 (5). Р. 1232-4.

2. Бершадский А.Д., Тинт И.С., Гельфанд В.И., Розенблат В.А., Васильев Ю.М., Гельфанд И.М. Морфология системы микротрубочек в эпителиальных клетках почки мыши. Онтогенез. 1979. N. 10. Р. 231-235.

3. Воробьев И .А., Григорьев И .С., Бориси Г .Г. Динамика микротрубочек в культивируемых клетках. Онтогенез. 2000. N. 31. Р. 420-428.

4. Воробьев И.А., Ченцов Ю.С. Динамика восстановления микротрубочек вокруг клеточного центра в культивируемых клетках после их охлаждения. Цитология. 1982. N. 24 (11). Р. 1286-1289

5. Воробьев И.А., Драчев В.П. Эффект высокого гидростатического давления на клеточный центр и микротрубочки в клетках культуры ткани. Цитология. 1989. N. 31. Р. 170-175.

6. Григорьев И.С. Чернобельская А.А., Воробьев И.А. Влияние наномолярных концентраций нокодазола, винбластина и таксола на движение фибробластов и на сальтаторные движения органелл. Биол. Мембр. 1999. N. 16. Р. 21-41.

7. Григорьев И.С. Чернобельская А.А., Воробьев И.А. Количественный анализ движений в поляризованных фибробластах. Биол. Мембр. 1997. Т. 14(2). Стр. 160-173.

8. Зиновкина JI.A., Надеждина Е.С. Белки центросомы. Биохимия. 1996. N. 61(8). Р. 1347-1365.

9. Надеждина Е.С., Зиновкина JT.A. Регуляция системы микротрубочек животных клеток. Успехи Биол. Химии. 1999. N. 39. Р. 187-224.

10. Онищенко. Преобразования клеточного центра при дифференцировке клеток. Онтогенез. 2000. Т. 31. Р. 445-456.

11. Онищенко Г.Е., Ченцов Ю.С. Центриоли в полиплоидных клетках. Тез. Докл. 2 Сипм. По сомат. Полиплоидии. 1977. Р. 89-90.

12. Прудовекий И.А., Зеленин А.В. Влияние энуклеации на структурно-функциональное состояние L-клеток. Цитология. 1978. Т. 20. Р. 952-956.

13. Сперанская С.Р., Вотчал М.С., Воробьев И.А. Сальтаторные движения цитоплазматических гранул в клетках культуры ESK. Цитология. 1975. Т. 37. Стр. 783-790.

14. Смурова К.М., Алиева И.Б., Воробьев И.А. Динамика восстановления цитоплазматических микротрубочек после из разрушения нокодазолом в клетках культуры VERO. Биол. Мембр. 2002. Т. 19. N6. С.472-482.

15. Abal М., Piel М., Bouckson-Castaing V., Mogensen М., Sibarita J-B.,

16. Bornens M. Microtubules released from the centrosome in migrating cells. J. Cell Biol. 2002. N. 159. P. 713-737.

17. Ahmad F.G., Yu W., Mcnally F.J., Bass P.W. An essential role for katanin in severing microtubules in neuron. J. Cell Biol. 1999. N. 145(2). P. 305315.

18. Ahmad F.G. and Bass P.W. Microtubules released from the neuronal centrosome and transported into the axon. J.Cell Sci. 1995. N. 108. P. 2761-2769.

19. Ahmad F.G., Echeverri J., Vallee R. B, Bass P.W., Cytoplasmic dynein and dynactin are required for the transport of microtubules into the axon. J. Cell Biol. 1998. N. 140. P. 391-401.

20. Aist JR, Bayles CJ. Organelle motility within mitotic asters of the fungus Nectria haematococca. Eur J Cell Biol. 1991. N. 56(2). P.358-63.

21. Akhmanova A., Hoogenraad C.C., Drabek K., Stepanova Т., Dortland В.,

22. Verkerk Т., Vermeulen W., Burgering B.M., De Zeeuw C.I., Glosveld F., Galjart N. CLASP are CLIP-115 and -170 associating proteins involved in the regional regulation of microtubule dynamics in motile fibroblasts. Cell 2001. N. 104. P. 923-935.

23. Allan V, Vale R.D. movements of membrane tubules along microtubules in vitro: evidence for specialised sites of motor attachments. J. Cell Sci. 1994. N. 107. P. 1885-1897.

24. Alberts В., Bray D., Lewis J., Raff M., Watson J.D. Molecular Biology of the Cell, edn. 3. Garland publishing, New York. 1994.

25. Alien R.D., Metural J., Tosaki I., Brady S.T., Gilbert S.P. Science. 1982. N. 218. P. 1127-1129.

26. Alieva I.В., Nadezhdina E.S., Vaisberg E.A., Vorobjev I.A. Microtubule and intermediate filament patterns around the centrosome in interphase cells. The centrosome. 1992. P. 103-126.

27. Alieva IB, Vorobjev IA. Centrosome behaviour and orientation of centrioles under the action of energy transfer inhibitors. Cell Biol Int. 1995. N. 19(2). P.103-12.

28. Alieva, I.B., Vorobjev, I.A. Interphase microtubules in cultured cells: long or short? Membr Cell Biol.2000.N. 14(1). P. 57-67

29. Allan V., Vale R.D. Movements of membrane tubules along microtubules in vitro: evidence for specialised sites of motor attachments. J. Cell Sci. 1994. N. 107. P. 1885-1897.

30. Allen C., Borisy G.G. Structural polarity and directionality of growth ofmicrotubules of Chlamydomonas flagella. J. Moll. Biol. 1974. N. 80. P. 381-402.

31. Amos, L.A., and Baker, T.S. The three-dimensional structure of tubulin protofilaments. Nature. 1979. N. 279. P. 607-612.

32. Andersen S. S. Molecular characteristics of the centrosome. Int. Rev. Cytol. 1999. N. 187. P. 51-109.

33. Andersen S., Ashford AJ, Tournebize R, Gavet O, Sobel A, Hyman AA, KarsentiE. Mitotic chromatin regulates phosphorylation of Stathmin/Opl8. Nature. 1997. N. 389(6651). P. 640-3.

34. Aniento F., Emans N., Griffiths Gruenberg J. Cytoplasmic dynein-dependent vesicular transport from early to late endosomes. J. Cell Biol. 1993. N. 123. P. 1373-1387.

35. Argarana CE, Barra HS, Caputto R. Release of 14C.tyrosine from tubulinyl-[14C]tyrosine by brain extract. Separation of a carboxypeptidase from tubulin-tyrosine ligase. Mol Cell Biochem. 1978. N. 19(1). P. 17-21.

36. Baas P. W., Black M.M. Individual microtubules in the axon consist of domain that differ in both composition and stability. J. Cell Biol. 1990. N. 111. P. 495-509.

37. Baase P.W., Deitch J.S., Black M.M., Banker G.A. Polarity orientation of microtubules in hippocampal neurons: uniformity in the axon and nonuniformity in the dendrite. Proc Natl Acad Sci USA. 1988. N. 85. P. 8335-9.

38. Balczon R. The centrosome in animal cells and its functional homologs in plant and in yeast cells. Int. Rev. Cytol. 1996. N. 169. P. 25-82.

39. Baumann O., Murphy D.B. Microtubule-associated movement ofmitochondria and small particles in Acanthamoeba castellanii. Cell Motil Cytoskeleton. 1995. N. 32(4). P. 305-17.

40. Belmont L.D., Hyman A.A., Sawin K.E., Mitchison T.J. Real-time visualization of cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in cytoplasmic extracts. Cell. 1990. N. 62. P. 579-89.

41. Belmont L.D., Mitchison T.J., Identification of a protein that interacts with tubulin dimers and increases the catastrophe rate of microtubules. Cell: 1996. N. 84. P. 623-631.

42. Ben-Zeev A., Farmer, S.R., Penman, S. Cell. 1979. N. 17. P. 319-325

43. Bershadsky AD, Gelfand VI. ATP-dependent regulation of cytoplasmic microtubule disassembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 1981. N. 78(6). P. 3610-3.

44. Bobinnec Y, Moudjou M, Fouquet JP, Desbruyeres E, Edde B, Bornens M. Glutamylation of centriole and cytoplasmic tubulin in proliferating non-neuronal cells. Cell Motil Cytoskeleton. 1998. N. 39(3). P. 22332.

45. Bomsel M., Patron R., Kuznetsov S.A., Schroer T.A., Gruenberg J.

46. Microtubule- and motor-dependent fusion in vitro between apical and basolateral endocytic vesicles from MDCK cells. Cell. 1990. N. 62. P. 719-731.

47. Borisy, G.G. and Rodionov, V.I. Lessons from the Melanophore. FASEB J. 1999. N. 13. P. 2221-2224

48. Brady S.T., Tytell M., Lasek R.J. Axonal transport and axonal tubulin: biochemical evidence for cold stability. Cell Biol. 1984. N. 99. P. 1716-1724.

49. Bre M.C., Karsenti E. Effects of brain microtubule-associated proteins of microtubule dynamics and nucleating activity of centrosome. Cell Motil. 1990. N. 15. P. 88-98.

50. Bre MH, Kreis ТЕ, Karsenti E. Control of microtubule nucleation and stability in Madin-Darby canine kidneycells: the occurrence of noncentrosomal, stable detyrosinated microtubules. J Cell Biol. 1987. N. 105(3). P. 1283-96.

51. Bridgeman P.C., Kacher В., and Reese T.S. The structure of cytoplasm in directly frozen cultured cell. 2. Cytoplasmic domeins associated with organelle movement. J. Cell Biol. 1986. N. 102. P. 1510-1521.

52. Brinkley B.R., Cox S.M., Pepper D.A., Wible L., Brenner S.L., Pardue R.L. Tubulin assembly sites and the organization of cytoplasmic microtubules in cultured mammalian cells. J. Cell Biol. 1981. N. 90. P. 554-562.

53. Brinkley BR, Fuller EM, Highfield DP. Cytoplasmic microtubules in normal and transformed cells in culture: analysis bytubulin antibody immunofluorescence. Proc Natl Acad Sci USA. 1976 N. 72 (12). P. 4981-5.

54. Brinkley BR, Stubblefield E, Hsu TC. The effects of colcemid inhibition and reversal on the fine structure of themitotic apparatus of Chinese hamster cells in vitro. J. Ultrastruct Res. 1967. N. 19(1). P. 1-18.

55. Brinkley BR, Wible LJ, Asch BB, Medina D, Mace MM, Beall PT, Cailleau RM. The microtubule cytoskeleton in normal and transformed cells in vitro. Results Probl. Cell Differ. 1980. N. 11. P. 132-8.

56. Brinkley B.R., Cox S.M., Pepper D.A., Wible L. , Brenes S.L., Pardue R.L. Tubulin assembly sites and the organisation of cytoplasmicmicrotubules in cultured mammalian cells. J. Cell .Biol. 1981. N. 90. P. 554-562.

57. Bulinski J.C. MAP4 In Microtubules. Edited by JS Hymans, CW Lioyd. New York. Wiley-Liss Inc. 1994. P. 167-182.

58. Bulinski J.C., Gundersen G.G. stabilization and posttranslational modification of microtubules during cellular morphogenesis. BioEssays. 1991. N. 13. P. 285-293.

59. Burkhardt J.K., McLlivan J.M., Sheetz M.P., Argon Y. Lytic granules from cytitoxic T cell inhibit kinesin-dependent motility on microtubules in vitro. J. Cell Biol. 1994. N. 104. P. 151-162.

60. Burton P.R., Hinkley R.E., Pierson G.B. Tannic acid stained microtubules with 12, 13 and 14 protofilaments. J. Cell Biol. 1975. N. 65. P. 227233.

61. Caron J.M., Jones A.L., Rail L.B., Kirschner M.W. Autoregulation oftubulin sinthesis in enucleated cell. Nature. 1985. N. 317. P. 684-651.

62. Cassimeris L., Pryer N.K., Salmon E.D. Real-time observation of microtubule dynamic instability in living cell. J. Cell Biol. 1988. N. 107. P. 22232231.

63. Chalfie M., Thomson J. N. Organization of neuronal microtubules in thenematode Caenorhabditis elegans. J. Cell. Biol. 1979. N. 93. P. 1523.

64. Chapin S.J., Bulinski J.C. Microtubule stabilization by assembly promoting microtubule associated protein: A repeat performance. Cell Motil. Cytoskel. 1992. N. 23. P. 236-243.

65. Chausovsky A., Bershadsky A.D., Borisy G.G. Cadherin-mediated regulation of microtubule dynamics. Nat. Cell Biol. 2000. N. 2(11). P. 797-804.

66. Chrertien, D., and Wade, R.H. New data on the microtubule surface lattice. Biol. Cell .1991. N. 71. P. 161-174.

67. Cleveland DW, Lopata MA, Sherline P, Kirschner MW. Unpolymerized tubulin modulates the level of tubulin mRNAs. Cell. 1981. N. 25(2). P. 537-46.

68. Cleveland DW, Pittenger MF, Feramisco JR. Elevation of tubulin levels by microinjection suppresses new tubulin synthesis. Nature. 1983. N. 305(5936). P. 738-40.

69. Cole N.B., Sciaky N., Marotta A., ong J., Lippincott-Schwartz. Golgi dispersal during microtubule disruption: regeneration of Golgi stacks at peripheral endoplasmic reticulum exit sites. Mol. Biol. Cell, 1996. N.7(40). P. 631-50.

70. Curmi PA, Andersen SS, Lachkar S, Gavet O, Karsenti E, Knossow M, Sobel A. The stathmin/tubulin interaction in vitro. J Biol Chem. 1997. N. 272(40). P. 25029-36.

71. Dabora S.L., Sheetz M.P. The microtubule-dependent formation of atubulovesicular network with characteristics of the ER from cultured cell extracts. Cell. 1988. N. 54. P. 27-35.

72. Danowski B. Fibroblast contractility and actin organization are stimulated by microtubule inhibitors. J. Cell Sci.1989. N. 92. P. 255-266.

73. Debek A., Detraves C., Montmory С et al. Polar organization of gamma-tubulin in acentriolar mitotic spindles of Drosophila melanogaster cells. Ibid. 1995. N. 108. P. 2645-2653.

74. De Brabander M, Geuens G, Nuydens R, Willebrords R, De Mey J. Microtubule stability and assembly in living cells: the influence of metabolicinhibitors, taxol and pH. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1982. N. 46. P. 227-40.

75. De Brabander M. Microtubules, central elements of cellular organization. Endeavour. 1982. N. 6(3). P. 124-34.

76. Cell Dev. Biol. 1997. N. 13. P. 83-117. Dhamodharan R, Wadsworth P. MAPs modulate dynamic instability in vivo.1994. N. P. 1679-1689

77. Dhamodharan R., Wadsworth P. Modulation of microtubule dynamicinstability in vivo by brain microtubule associated proteins. J Cell Sci.1995. N. 108 (Pt 4). P. 1679-89.

78. Diamantopoulos G.D., Perez F., Goodson H.V., Batelier G., Melki R., Kreis Т.Е., Rickard J.E. Dynamic localization of CLIP-170 to microtubule plus end is coupled to microtubule assembly. J. Cell Biol. 1999. N. 144. P. 99-112.

79. Diaz J.F., Menendez M., Andreu. J.M. Boichemistry. 1993. N. 32. P. 1006710077.

80. Dogterom M, Maggs A.C, Leibler S. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 6683-6688.

81. Doxsey S., Re-evaluating centrosome function. Nat. Rev Mol. Cell Biol. 2001. N. 2. P. 688-698.

82. Endow S.A. Microtubule motors in spindle and chromosome motility. Eur. J. Biochem. 1999c. N. 262. P. 12-18.

83. Erickson HP, Stoffler D. Protofilaments and rings, two conformations of the tubulin family conserved frombacterial FtsZ to alpha/beta and gamma tubulin. J Cell Biol. 1996. N. 135(1). P. 5-8.

84. Esponda P, Avila J. In vitro microtubule assembly on centrioles from mammalian spermatids. Eur J Cell Biol. 1983. N. 30(2). P.313-5.

85. Evans L., Mitchison Т., Kirshner M. The influence of the centrosome on the structure of the nucleated microtubule. J. Cell Biol. 1985. N. 100. P. 1185-1191.

86. Fais DA, Nadezhdina ES, Chentsov YS. The centriolar rim. The structure that maintains the configuration of centriolesand basal bodies in the absence of their microtubules. Exp Cell Res. 198. N. 164(1). P. 27-34.

87. Fais D., Nadezhdina E.s., Chentsov Yu.S. Evidence for the nucleus-centriole association in living cells obtained by ultracentrifugation. Eur. J. Cell Biol. 1984. N. 33. P. 190-196.

88. Frankel F.R. Organization and energy-dependent growth of microtubules in cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1976. N. 73. P. 2798-2802.

89. Freed J. J. and Lebowitz M.M., The association of a class of saltatory movements with microtubules in cultured cells. J. Cell Biol. 1970. N. 45. P. 334-354

90. Friedman.P.A., Platzer, E.G. Interaction of antihelmintic benzimidazoles and benzimidazole derivatives with bovine brain tubulin. Biochim. Biophys. 1978.V.544. P. 605-614.

91. Fuller G.M., Brinkley B.R., Boughter J.M. Immunofluorescence of mitotic spindles by using monospecific antibody against bovine brain tubulin. Science. 1975. N. 187. P. 948-950.

92. Fygenson D.K., Flyvbjerg H., Sneppen K., Libchaber A., Leibler S. Spontaneous nucleation of microtubules. Phys. Rev. Lett. 1995. N. 51. P. 5058-5063.

93. Gaglio T, Saredi A, Compton DA. NuMA is required for the organization of microtubules into aster-like mitotic arrays. J Cell Biol. 1995. N. 131(3). P. 693-708.

94. Gilbert S.P., Sloboda R.D. J. Cell Biol. 1994. N. 99. P. 445-452.

95. Goldman R.D., Pollak R., Chang C.M., Bushnell R. Properties of enucleated cells. Changes in cytoplasmic architecture of enucleated BHK cellsfollowing trypsinization and replating. Exp. Cell Research. 1975. N. 93. P. 175-183.

96. Goode BL, Drubin DG, Barnes G. Functional cooperation between themicrotubule and actin cytoskeletons. Curr Opin Cell Biol. 2000. N. 12(1). P. 63-71.

97. Gorgidze L.A., Vorobjev I.A. Centrosome and microtubules behavior in the cytoplasts. J. Submicrosc Cytol Pathol. 1995. N. 27. P. 381-9.

98. Gundersen G.G., Cook T.A. Microtubules and signal trancduction. Curr. Opin. Cell Biol. 1999. N. 11. P. 81-94.

99. Gundersen G.G. Microtubule capture: IQGAP and CLIP-170 expand the repertoire. Curr Biol. 2002. N. 12(19). P. R645-7.

100. Gundersen G.G., Bulinski J.C. Selective stabilization of microtubules oriented toward the direction of cell migration. Proc Natl Acad Sci USA. 1988. N. 85(16). P. 5946-50.

101. Gundersen GG, Kim I, Chapin CJ. Induction of stable microtubules in 3T3 fibroblasts by TGF-beta and serum. J Cell Sci. 1994. N. 107. P. 64559.

102. Haimo L.T., Telzer B.R., Rosenbaum J.L. Dynein binds to and cross-bridges cytoplasmic microtubules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. N. 76. P. 5779-5763.

103. Harris P, Osborn M, Weber K. A spiral array of microtubules in the fertilized sea urchin egg cortex examinedby indirect immunofluorescence and electron microscopy. Exp Cell Res. 1980. N. 126(1). P. 227-36.

104. Hayden JH, Bowser SS, Rieder CL. Kinetochores capture astral microtubules during chromosome attachment to themitotic spindle: direct visualization in live newt lung cells. J Cell Biol. 1990. N. 111(3). P. 1039-45.

105. Heald R., Tournebize R., Blank Т., Sandaltzopoulos R., Brcker P., hyman A., Karsenti E. Self-organization of microtubules into bipolar spindles around artificial chromosomes in Xenopus egg extracts. Nature. 1996. N. 382. P. 420-425.

106. Heidemann S.R., Mcintosh J.R. Visualisation of the structural polarity of the microtubules. Nature. 1980. N. 286. P. 517-519

107. Herman B. and Albertini. D.F. A time-lapse video image intensification analysis of cytoplsmic organelle movements during endosome translocation. J. Cell Biol. 1984. 98. 565-576.

108. Hesse J., Maruta H., Isenberg G. FEBS Lett. 1985. N. 179. P. 91-95.

109. Hirokawa N. Microtubule organization and dynamic depend on microtubule-associated protein. Curr. Opin. Cell Biol. 1994. N. 6. P. 74-81.

110. Ho, W.C., Allan,V.G., van Meer, G., Berger, E.G., Kreis, Т.Е. Reclustering of scattered Golgi elements occurs along MTs. Eur. J.Cell Biol. 1989. V. 48(2). P. 250-63.

111. Hoebeke J., Van Nijen, De Brabander. Interaction of oncodozole (R 17934), a new anti-tumoral drug, with rat drain tubulin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1976. N. 69. P. 319-324.

112. Holleran EA, Karki S, Holzbaur EL.The role of the dynactin complex in intracellular motility. Int Rev Cytol. 1998. N. 182. P. 69-109.

113. Hoogenraad C.C., Akhmanova A., Grosveld F., Zeeuw C.I., Galjart N. Functional analysis of CLIP-115 and its binding to microtubules. J. Cell Sci. 2000. N. 113. P. 2285-2297.

114. Hotani H., Horio T. Dynamics of microtubules visualized by darkfield microscopy: treadmilling and dynamic instability. Cell Motil Cytoskeleton. 1988. N. 10(1-2). P. 229-36.

115. Howard W.D., Timasheff S.N. Linkages between the effects of taxol,colchicine, and GTP on tubulin polymerization. J Biol Chem. 1988. N. 263(3). P. 1342-6.

116. Hush J.M., Wadsworth P., Callaham D.A., Helper P.K. Quantification of microtubule dynamics in living plant using fluorescence redistribution after photobleaching. J. Cell Sci. 1994. N. 107. P. 775-784.

117. Job D., Rauch C.T., Fischer E.H., Margolis R.L. Recycling of cold-stable microtubules: evidence that cold stability is due to substichiometric polymer blocks. Biochem. 1982. N. 21 (3). P. 509-15.

118. Jordan M.A., Wilson L. Kinetic analysis of tubulin exchange at microtubule ends at low vinblastine concentrations. Boichemistry. 1990. N. 29. P. 2730-2739.

119. Jourdain L, Curmi P, Sobel A, Pantaloni D, Carlier MF. Stathmin: a tubulin-sequestering protein which forms a ternary T2S complex withtwo tubulin molecules. Biochemistry. 1997. N. 36(36). P. 10817-21.

120. Kalt a., Shliwa . Molecular components of the centrosome. Trends Cell Biol. 1993. N. 3. P. 118-128.

121. Karsenti E., Kobayashi S., Mitchoson Т., Kirschner M. Role of the centrosome in organizing the interphase microtubule arrays: properties of cytoplasts containing or lacking centrosomes. 1984b. J. Cell Biol. 98. 1763-1776.

122. Kaverina I., Krylyshkina O., Small J.V. Regulation of substrate adhesion dynamics during cell motility. Int. J. Biochem. Cell Biol. 2002. N. 34. P. 746-761.

123. Kaverina I., Rottner K., Small J.V. Targeting, capture and stabilization of microtubules at early focal adhesions. J. Cell Biol. 1998. N. 142. P. 181-90.

124. Keating T.J., Borisy G.G. Immunostructural evidence for the template mechanism of microtubule nucleating. Curr. Opin. Struct. Biol. 2000. N. 2. P. 352-357.

125. Keating T.J., Peloquin J.G., Rodionov V.I., Momcilovic D., Borisy G. G.

126. Microtubule release from the centrosome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. N. 94. P. 5078-5073. Keating, T.J., Borisy, G.G. Centrosomal and non-centrosomal microtubules.

127. M Biol Cell. 1999. N 91(4-5). P. 321-329. Kellogg D.R., Moritz M., Alberts B.M. Ann. Rev. Biochem. 1994. V. 63. P. 639-74.

128. Kennedy, Donald A. Preparation and characterization of mast cell cytoplasts.

129. Kirschner M., Mitchison T. Beyond self-assembly: from microtubules to morphogenesis. Cell. 1986. V. 45. P. 329-342.

130. Kirschner MW. Implications of treadmilling for the stability and polarity of actin and tubulinpolymers in vivo. J. Cell Biol. 1980 Jul. N. 86(1). P. 330-4.

131. Kimble M., Kuriyama R. Functional components of microtubule-organizing centers. Int. Rev. Cytol. 1992. N. 13. P. 34-50.

132. Kleinfield R.G., Sisken J.E. Morphologycal and kinetic aspects of mitotic arrest by and recovery from from cilcemid. J. Cell Biol. 1966. N. 31. P. 396-379.

133. Knops J, Kosik KS, Lee G, Pardee JD, Cohen-Gould L, McConlogue

134. Kreis Т.Е. Microtubules containing detyrosinated tubulin are less dynamic.

135. EMBO J. 1987. N. 6 (9). P. 2597-606. Kreis, Т.Е. Role of MTs in the organization of the Golgi a apparatus. Cell

136. Kuriyama R., Borisy G.G., Microtubule-nucleating activity of centrosomes in Chinese hamster ovary cells is independent of the centriole cycle but coupled to the mitotic cycle. J. Cell Biol.: 1981; N. 91. P. 822-826

137. Malawista S.E., Bensch K.G., Sato H. Vinblastine and griseofulvin reversibly disrupt the living mitotic spindle. Science. 1968. N. 160. P. 770-772.

138. Maly I.V., Vorobjev I.A. Centrosome-dependent anisotropic random walk of cytoplasmic vesicles. Cell Biol. Intern. 2002. N. 9. P. 791-799.

139. Maniotis A. and Schliwa M. Microsurgical removal of centrosomes blocks cell reproduction and centriole generation in BSC-1 cells. Cell 1991. 67. 495-504.

140. Marchisio P.S., Weber K., Osborn N. Identification of multiple sites in mouse neuroblastoma cells. Eur. J. Cell Biol. 1979. N. 20. P. 45-50.

141. Marks D.L., Larkin J.M., McNiven M.A. Association of kinesin with the Golgi apparatus in rat hepatocytes. J. Cell Sci. 1994. N. 107. P. 24172426.

142. Marsh B.I., Mastronarde D.N., Buttle K.F., Howell K.E., Mcintosh J.R. Organellar relationships in the Golgi region of the pancreatic beta cell line, HIT-T15, visualized by high resolution electron tomography. PNAS. 2000. N. 98(5). P. 2399-2406.

143. Martin ОС, Gunawardane RN, Iwamatsu A, Zheng Y. Xgripl09: a gammatubulin-associated protein with an essential role in gamma tubulin ring complex (gammaTuRC) assembly and centrosome function. J Cell Biol. 1998. N. 141(3). P. 675-87.

144. Mastronarde D.N., McDonald K.L., Ding R., Mcintosh J.R. 1993. Interpolar spindle microtubules in PTK cells. J. Cell Biol. 123: 1475-89.

145. McBeath E., Fujiwara K. Microtubule detachment from the microtubule-organizing center as a key event in the complete turnover of microtubules in cell. Eur. J. Cell Biol. 1990. N. 52. P. 1-16.

146. McNally F.J., Thomas S. Katanin is responsible for the M-phase microtubule-severing activity in Xenopus eggs. Mol. Biol. Cell. 1998. N. 9. P. 1847-61.

147. Mitchison Т., Kirschner M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 1984. V. 312. P. 237-242.

148. Mogensen MM, Tucker JB, Baggaley ТВ. Multiple plasma membrane-associated MTOC systems in the acentrosomal cone cells of Drosophila ommatidia. Eur J Cell Biol. 1993. N. 60(1). P. 67-75.

149. Mogensen M.M., Malik A., Piel M., Bouckson-Castaing V., Bornens M. Microtubules minus-end anchorage at centrosomal and noncentrosomal sites: the role of ninein. J. Cell Sci. 2000. N. 275. P. 215218.

150. Moritz M, Braunfeld MB, Fung JC, Sedat JW, Alberts BM, Agard DA.

151. Three-dimensional structural characterization of centrosomes from early Drosophila embryos. J. Cell Biol. 1995. N. 130(5). P. 1149-59.

152. Moritz M, Braunfeld MB, Guenebaut V, Heuser J, Agard DA. Structure of the gamma-tubulin ring complex: a template for microtubule nucleation. Nat Cell Biol. 2000. N. 2(6). P. 365-70.

153. Moritz M, Zheng Y, Alberts BM, Oegema" K. Recruitment of the gamma-tubulin ring complex to Drosophila salt-strippedcentrosome scaffolds. J Cell Biol. 1998. N. 142(3). P. 775-86.

154. Morris R. and Hollenbeck P. The regulation of bidirectional mitochondrial transport is coordinated with axonal outgrowth. J. Cell Sci. 1997. N. 104. P. 917-927.

155. Morrison E.E., Moncur P.M., Askham J.M. EB1 identifies sites ofmicrotubule polymerisation during neurite development. Brain Res Mol Brain Res. 2002. N. 98. P. 145-52.

156. Murphy D. and Tilney L. The role of microtubules in the movement of pigment granules in the teleost melanofores. J. Cell Biol. 1974. 61. P. 757-779.

157. Nagano Т., Suzuki F. Microtubules with 15 subunits in cockroach epidermal cells. J. Cell Biol. 1975. N. 64. P. 242-245.

158. Nagasaki T, Chapin CJ, Gundersen GG. Distribution of detyrosinatedmicrotubules in motile NRK fibroblasts is rapidly altered upon cell-cell contact: implications for contact inhibition of locomotion. Cell Motil Cytoskeleton. 1992. N. 23(1). P. 45-60.

159. Nath J.P., Fagle G.R., Himes R.H. Biochemistry. 1985. N. 24. P. 1555-1560.

160. Nedelec F, Surrey T, Karsenti E Self-organisation and forces in themicrotubule cytoskeleton. Curr Opin Cell Biol. 2003. N. 15(1). P. 118-24.

161. Nguyen H-L., Chari S., Gruber D., Lue C-M., Chapin S.J., Bulinski J.C. Overexpression of full- or partial-length MAP4 stabilizes microtubules and alters cell growth. J. Cell Sci. 1997. N. 110. P. 281294.

162. Oakley, 2000 An abundance of tubulins.Trends Cell Biol. 2000. N. 10(12). P. 537-42.

163. Oegema K, Wiese C, Martin ОС, Milligan RA, Iwamatsu A, Mitchison TJ, ZhengY. Characterization of two related Drosophila gamma-tubulin complexes that differin their ability to nucleate microtubules. J Cell Biol. 1999 Feb 22;144(4):721-33.

164. Ohno Y., Fallon J., Bruse E., Seligmann N.J., Friedman M.M., Gallin I. Separation and function of neutrophil kariorganuloplasts and comparison with cytoplasts and intact cell. Inflammation. 1987. N. 11. P. 298-308.

165. Osborn M, Born T, Koitsch HJ, Weber K. R. Stereo immunofluorescence microscopy: I. Three-dimensional arrangement of microfilaments, microtubules and tonofilaments. Cell. 1978. N. 14(3). P. 477-88.

166. Osborn M., Weber K. Tubulin-specific antibody and the expression of microtubules in 3T3 cells after attachment to a substratum. Further evidence for the polar growth of cytoplasmic microtubules in vivo.

167. Exp. Cell Res. 1976. N. 103. P. 331-40.

168. Parness J, Hirwitz S.B. taxol binds to polymerized tubulin in vivtro. L. Cell Biol. 1981. N. 91. P. 478-87.

169. Parschal B.M., Vallee R.B., 1987 Retrograde transport by the microtubuleassociated protein MAP 1С. Nature. 1987. N. 18;330(6144). P. 181-3.

170. Paschal B.M., Shpetner H.S., Vallee R.B. MAP 1С is a microtubule-activated ATPase which translocates microtubules in vitro and has dynein-like properties. J Cell Biol. 1987. N. 105(3). P. 1273-82.

171. Paweletz N., Mazia D. The "nuclear mitotic apparatus" in sea urchun eggs. Cell Reproduction ICN-UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology. 1978. P. 495-503

172. Pepperkok R., Bre M.H., Davoust J., et at. Microtubules arestabilized in confluent epithelial cells but not in fibroblasts. J. Cell. Biol. 1990. V. 111. P. 3003-3012.

173. Perez F., Diamantopoulos G.D., Stalder R., Kreis Т.Е. CLIP-170 high-lights growing microtubule end in vivo. Cell. 1999. N. 96. P. 517-527.

174. Pernet-Gallay K, Antony C., Johannes L., Bornens M., Goud В., Rios R.M. The overexpression of GMAP210 blocks anterograde and retrograde transport between the ER and the GA. Traffic. 2002. N. 3. P. 822-832.

175. Pickett- Heaps, J.D. Cytobios. 1969.1:257-280

176. Piel M., Meyer P., Khodjakov A., Rieder C.I., Bornens M. The respective contributions of the mother and daughter centrioles to centrosome activity and behavior in vertebrate cells. J. Cell Biol. 2000. N. 149. P. 317-330.

177. Pierson G.B., Burton P.R., Himes R.H. Wall structure of microtubulespolymerized in vitro from tubulin of crayfish nerve cord and fixed with tannic acid. J. Cell Sci. 1979. N. 39. P. 89-99.

178. Pittenger M.F., Clevelend D.W. Retention of autoregulatory control of tubulinin cytoplasts. J. Cell Biol. 1985. N. 101. P. 1941-1952. Porter., K.R. Cytoplasmic microtubules and their runction. Ciba Found.

179. Rickard j.E., Kreis Т.Е. Identification of a novel nucleotide- sensitivemicrotubule- binding protein in HeLa cells. J. Cell Biol. 1990. N. 110. P. 1623-1633.

180. Roobol A, Havercroft JC, Gull K. Microtubule nucleation by the isolated microtubule-organizing centre of Physarumpolycephalum myxamoebae. J Cell Sci. 1982 N. 55. 365-81.

181. Rowinsky, E.K., Donwhower R. Pharmacol. Ther. 1991. N. 52. P. 38-54.

182. Sammak P.J., Gorbsky G.J., Borisy G.G. Microtubule dynamics in vivo: a test of mechanisms of turnover. 1988. N. 104. P. 395-405.

183. Sammak P.J., Gorbsky G.J., Borisy G.G. Microtubule dynamics in vivo: a test of mechanisms of turnover. J. Cell Biol. 1988. N. 104. P. 395405.

184. Sammak, P.J., and G.G. Borisy. Direct observation of microtubule dinamic in living cells. Nature (Lond.). 1988a. N. 332. P. 724-726

185. Saxton W.R., Stemple D.L., Leslie R.J., Salmon E.D., Zavortink M., Mcintosh J.R. Tubulin dynamic in cultured mammalian cells. J. Cell Biol. 1984. N. 99. P. 2175-2186.

186. Scherson Т., Kreis Т.Е., Schlessinger J., Littauer U.Z., Borissy G.G., Geiger B. Dynamic interaction of fluorescently labeled microtubule associated proteins in living cells. J. Cell Biol. 1984. N. 99. P. 425434.

187. Schiff P.B., Horwitz S.B. Taxol stabilizes microtubules in mouse fibroblast cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. N. 77. P. 1561-1565.

188. Schiff P.B., Fant J., Horwitz .B. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol. Nature. 1979. N. 277. P. 665-667.

189. Schliwa M. Mechanismsof intracellular organelle transport. Cell Muscle Motil. 1984. N. 5. P. 1-82.

190. SchroerT.A., Sheetz M.P. Two activators of microtubule-based vesicle transport. J. Cell Biol. 1991. N. 115. P. 1309-1318.

191. Schulze E., Kirschner M. Dynamic and stable populations of microtubules in cells. J. Cell Biol. 1987. N. 104. P. 277-288.

192. Schulze E., Kirschner M. Microtubule dynamic in interphase cells. J. Cell Biol. 1986. N. 102. P. 1020-1031.

193. Schuyler S., Pellman D. Microtubule "plus-end-tracking proteins': the end is just the beginning. J. Cell Sci. 2001a. N. 105. P. 421-424

194. Scroer T.A. Microtubules don and doff their caps: dynamic attachments at plus and minus ends. Curr. Opin. Cell Biol. 2001. N. 13. P. 92-96.

195. Sharp D.J., Kuriyama R., Essner R., Baas P.W. Expression of a minus-end-directed motor protein indused Sf9 cells to form axon-like processes with uniform micritubule polarity orientation. J. Cell Sci. N. 110. P. 2373-80.1997

196. Sharp DJ, Rogers GC, Scholey JM.Cytoplasmic dynein is required for poleward chromosome movement during mitosis in Drosophila embryos. Nat Cell Biol. 2000. N. 2(12). P. 922-30.

197. Sharp G.A., Osborn M., Weber K. Ultrastructure of multiple microtubule initiation sites in mouse neuroblastoma cells. J. Cell Sci. 1981. N. 47. P. 1-10.

198. SharpG.A., Osborn M., Weber K. Ultrastructure of multiple micritubuleinitiation sites in mouse neuroblastoma cells. J. Cell Sci. 1981. N. 47. P. 1-24.

199. Shelden E, Wadsworth P. Observation and quantification of individual microtubule behavior in vivo: Microtubule dynamics are cell-type specific. J. Cell Biol. 1993. N. 120. P. 935-945.

200. SkoufiasD.a., Wilson L. Assembly and binding characteristic of tubulin with maximally tyrosinated and detyrosinated alpha-tubulins. Arch. Biochem. Biophys. 1998. N. 135. P. 115-122.

201. Small JV, Geiger B, Kaverina I, Bershadsky A. How do microtubules guide migrating cells? Nat Rev Mol Cell Biol. 2002. N. 3(12). P. 957-64.

202. Small J.V., Kaverina I. Microtubules meet substrate adhesions to arrange cell polarity. Curr Opin Cell Biol. 2003. N. 15(1). P. 40-7

203. Snyder JA, clntosh JR. Initiation and growth of microtubules from mitotic centers in lysed mammaliancells. J Cell Biol. 1975. N. 67(3). P. 744759

204. Spiegelman B.Lopata .A., Kirschner .W. ultiple sites for theinnitiation of microtubule assembly in mammalian cells. Cell. 1979. N. 16. P. 239-259.

205. Stearns and Winey. The cell center at 100. Cell. 1997. N. 91(3). P. 303-9.

206. Stearns .EM Brown D.L. Purification of cytoplasmic tubulin and microtubule initiation from the alga Polytomella. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. N. 76. P. 5745-5749.

207. Stearns E, Brown DL. icrotubule organizing centers ( TOCs) of the alga

208. Polytomella exert spatialcontrol over microtubule initiation in vivo and in vitro. J Ultrastruct Res. 1981. N. 77(3)P. 366-78.

209. Stearns E, Wang , Sousa O. Evidence that estramustine binds AP-lAtoinhibit type IV collagenasesecretion. J Cell Sci. 1991. N. 98. P. 55-63.

210. Svitkina T, Borisy GG. Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells, ethods Enzymol. 1998. N. 298. P. 570-92.

211. Szollosi D, Calarco P, Donahue RP. Absence of centrioles in the first andsecond meiotic spindles of mouse oocytes. J Cell Sci. 1972. N. 11(2). P. 521-41182 2128 ©SMfM9a n n ■ n © © пд v

212. SzolIosi.A Electron microscope study of spermiogenesis in Locustamigratoria (Insect Orthoptera). J Ultrastruct Res. 1975. N. 50(3). P. 322-46.

213. Sonnenblick B.P. The early embriology of Drosophila melanogaster. Biology of Drosophila. / Ed. M. Demerec. N.Y.: Hafner Publishing. 1950. P. 62-167.

214. Tanaka, Sabry. Making the connection: cytoskeletal rearrangements during growth cone guidance. Cell. 1995. N. 83(2). P. 171-6.

215. Tassin A.M., Maro В., Bornens M. Fate of microtubule-organizing centers during myogenesis in vitro. J. Cell Biol. 1985. N. 100. P. 35-46.

216. Telzer B.R., Rosenbaum J.L. Cell cycle-dependent in vitro assembly of microtubules onto the pericentriolar material of Hella cells. J. Cell Biol. 1979. N. 83. P. 484-497.

217. Terry В J., Purich D.L. J. Biol. Chem. 1980. N. 255. P. 10532-10536.

218. Thyberg J., Moskalewski S. Role of microtubules in the organization of the Golgi complex. Exp. Cell Res. 1999. N. 246. P. 263-279.

219. Tilney L.G., Bryan J., Bush D.J., Fujiwara K., Mooseker M.S., Murphy D.B., Snyder D.H. Microtubules: evidence for 13 protofilaments. J. Cell Biol. 1973. N. 59. P. 267-275.

220. Tirnauer J.S. and Bierer B.E. EB1 proteins regulate microtubule dynamics, cell polarity, and chromosome stability. J. Cell Biol. 2000. N. 149. P. 761-766.

221. Tirnauer J.S., Canman J. C., Salmon E.D., Mitchison T.J. EB1 targets to kinetochores with attached polimerizing microtubules. Mol. Biol. Cell. 2002. N. 45. P. 239-251.

222. Tirnauer J.S., Otoole е., Berrueta L., Bierer В., Pellman D. Yeast Biml promotes the G1 -specific dynamics of microtubules. J. Cell Biol. 1999. N. 145. P. 993-1007.

223. Toso R.J., Jordan M.A., Farrel K.W., Matsumoto В., Wilson L. Boichemistry. 1993. N. 32. P. 1285-1293.

224. Travis, Allen, 1981; Studies on the motility of the foraminifera. I.

225. Ultrastructure of the reticulopodial network of Allogromia laticollaris (Arnold). J Cell Biol. 1981. N. 90(1). P. 211-21.

226. Tucker JB, Mathews SA, Hendry KA, Mackie JB, Roche Spindle microtubule differentiation and deployment during micronuclear mitosis in Paramecium. J Cell Biol. 1985. N. 101(5 Pt 1). P. 1966-76.

227. Tucker J.B. Spatial organization of microtubule-organizing centers and microtubules. J Cell Biol. 1984. N. 99. P. 55-62.

228. Ulitzur N., Numbert M., Pfeffer S.R. Mapmodulin, a possible modulator of the interaction of microtubule-associated proteins with microtubules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. N. 128. P. 5084-5089.

229. Urrutia M, Mergo PJ, Ros LH, Torres GM, Ros PR Cystic masses of the spleen: radiologic-pathologic correlation. Radiographics. 1996. N. 16(1). P. 107-29.

230. Vale R.D. Severing of stable micritubules by a mitotically activated protein in Xenopus egg extracts. Cell. 1991. N. 64. P. 827-39.

231. Vasiliev J.M., Gelfand I.M., Domnina L.V., Ivanova O.Y., Komm S.C., Olshevskaja L.V. Effects of colcemid on the locomotory behaviour of fibroblasts. J Embriol. Exp. Morphol. 1970. N. 24. P. 625-40.

232. Verde F, Berrez JM, Antony C, Karsenti E.

233. Taxol-induced microtubule asters in mitotic extracts of Xenopus eggs: requirement for phosphorylated factors and cytoplasmic dynein. J Cell Biol. 1991. N. 112(6). P. 1177-87.

234. Verde F., Labbe J.C., Doree M., Karsenti E. Regulation of microtubule dynamics by cdc2 protein kinase in cell-free extracts of Xenopus eggs. Nature. 1990. 343. 233-238.

235. Vogel JM, Stearns T, Rieder CL, Palazzo RE. Centrosomes isolated from Spisula solidissima oocytes contain rings and anunusual stoichiometric ratio of alpl^eta tubulin. J Cell Biol. 1997. N. 137(1). P. 193-202.

236. Vorobjev I.A., Alieva I.B., Grigoriev I.S., Borisy G.G. Microtubule dynamics in living cells: direct analysis in the internal cytoplasm. Cell Biol. Intern. 2002.

237. Vorobjev I.A., Chentsov, Yu.S. Centrioles in the cell cycle. I. Epitelial cells.

238. J. Cell Biol. 1982. Jun. V.93:938-49. Vorobjev I.A., Chentsov, Yu.S. The dynamics of reconstitution of microtubules around the cell center after cooling. J. Cell Biol. 1983. N.30. P. 139-143

239. Vorobjev I.A., Nadezhdina, E.S. The centrosome and its role in the organization of microtubules. Intern. Review of Cytology. 1987.V. 106. P. 227-293

240. Wacker I., Kaether C., kromer A., Migala A., Aimers w., Gerdes H.H. Microtubule-dependent transport of secretory vesicles visualised in real time with a GFP-tagged secretory protein. J. Cell Sci. 1997. N. 110. P. 1453-63.

241. Wadsworth P, McGrail M. Interphase microtubule dynamics are cell type-specific. J Cell Sci. 1990. N. 95 ( Pt 1). P. 23-32.

242. Wadsworth P, Salmon ED. Analysis of the treadmilling model during metaphase of mitosis usingfluorescence redistribution after photobleaching. J Cell Biol. 1986. N. 102(3). P. 1032-8.

243. Walczak C. Microtubule Dynamics and tubuline interacting proteins. Curr. Opinion in Cell Biol.2000. N. 12. P. 52-56.

244. Walker R.A., Sheetz M.P. Cytoplasmic microtubule-associated motors. Annu. Rev. Biochem. 1993. N. 62. P. 429-451.

245. Walker, R.A., Inoue, S., and Salmon, E.D. Asymmetric behavior of severed microtubule ends after ultraviolet-microbeam irradiation of individual microtubules in vitro. J. Cell Biol. 1989.108, 931-937.

246. Wani M.C., Tayler H.L., Wall M.E., Coggon P., McPhail A.T. J. Am. Chem. Soc. 1971. N. 93. P. 2325-2327.

247. Warn RM, Harrison A, Planques V, Robert-Nicoud N, Wehland J.

248. Distribution of microtubules containing post-translationally modified alpha-tubulin during Drosophila embryogenesis. Cell Motil Cytoskeleton. 1990. N. 17(1). P. 34-45.

249. Waterhouse PD, Anderson PJ, Brown DL. Increases in microtubule assembly and in tubulin content in mitogenicallystimulated mouse splenic T lymphocytes. Exp Cell Res. 1983. N. 144(2). P. 367-76.

250. Waterman-Storer C.M., Salmon E.D. Endoplasmic reticulum membrane tubules are distributed by microtubules in living cells using three distinct mechanisms. Curr Biol. 1998 N. 8(14). P. 798-806

251. Waterman-Storer C., Worthylake R.A., Liu B.R., Burridge., Salmon E. Nature cell Biol. 1999. V. 1. P. 45-48.

252. Watson D.f., Hiffman P.N., Griffin J.W. The cold stability of microtubules increases during axonal maturation. J. Neurosci. 1990. N. 10. P. 33443352.

253. Weber K., Ralhke R.C., Osborn M., Franke W. W. Distribution of actin and tubulin in cells and in glycerinated cells models after treatment with cytochalasin B. Exp. Cell Res. 1976. 102. P. 285-297.

254. Webster D., Gundersrn G.G., Bulinski J.C., Borisy G.G. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.1987. N. 84. P. 9040-9044.

255. Wegner. Head to tail polymerization of actin. J Mol Biol. 1976. N. 108(1). P. 139-50.

256. Wehland J., Weber K. Turnover of the carboxy-terminal tyrosine of alpha-tubulin and means of reaching elevated levels of detyrosination in living cells. J Cell Sci. 1987. N. 88(Pt2). P. 185-203.

257. Weisenberg R. Microtubule formation in vitro in solutions containing low calcium concentration. Science. 1972. N. 177. P. 1104-1105.

258. Wiese C., Zheng X.Y. A new function for the gamma-tubulin ring complex as a microtubule minus-end cap. Nat. Cell Biol. 1999. N. 2. P. 358-364.

259. Wilson L.W., Bryan J. Biochemical and pharmacological properties of microtubules. Advan. Cell Mol. Biol. 1974. N. 3. P. 21-72.

260. Wolf J. Basal body fine structure and chemistry. Adv. Cell Mol. Biol. 1972. N. 2. P. 151-192.