Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика транспортных систем кальция клеток слюнной железы личинки Chironomus plumosus L.

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика транспортных систем кальция клеток слюнной железы личинки Chironomus plumosus L."

ЛЬВІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ІВАНА ФРАНКА

V/

КОРОЛЬ ТЕТЯНА ВАЛЕРІЇВНА

УДК 612.014.42:612.31:591.431.2

ХАРАКТЕРИСТИКА ТРАНСПОРТНИХ СИСТЕМ КАЛЬЦІЮ КЛІТИН

слинної залози личинки снтокомш рі тюяия ь.

03.00. ІЗ - фізіологія людини і тварин

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

І

Львів - 2000

Робота виконана на кафедрі фізіології людини і тварин Львівського національного університету імені Івана Франка

Науковий керівник:

доктор біологічних наук Клевець Мирон Юрійович,

Львівський національний університет імені Івана Франка Міністерства освіти і науки України, завідувач кафедри фізіології людини і тварин

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Воробсць Зіновій Дмитрович,

Львівський державний медичний університет імені Данила Галицького Міністерства охорони здоров'я України, завідувач кафедри медичної біології

Провідна установа:

кандидат біологічних наук Стояновський Володимир Григорович, Львівська державна академія ветеринарної медицини імені С.З.Гжицького Міністерства аграрної політики України, доцент кафедри фармакології і патологічної фізіології

Київський національний університет імені Тараса Шевченка, м. Київ

'Л

. 2000 р.

о Л'-

годині на засіданні

Захист відбудеться “¿¿о? ” _

спеціалізованої вченої ради К 35.051.14 у Львівському національному університеті імені Івана Франка за адресою: 79005, м. Львів, вул. Грушевського, 4, біологічний факультет Львівського національного університету імені Івана Франка, аудиторія № 333.

З дисертацією можна ознайомитися у науковій бібліотеці Львівського національного університету імені Івана Франка за адресою:

79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 17.

«А? »

Автореферат розісланий р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук

Д.І.Санагурський

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ Актуальність теми. Через мембрану секреторних клітин слинної залози личинки Chironomus plumosus L. зареєстровано вхідний кальцієвий струм (Клевец, Гу-раль, 1990) і проведено дослідження його характеристик (Клевець, Манько, 1992), що є електрофізіологічним підтвердженням наявності у ній потенціалозалежних кальцієвих каналів. Однак відсутні функціональні підтвердження існування цих каналів. У мембрані цих же клітин виявлено №*-Са2'’-обмінник шляхом реєстрації його струму (Клевець, Манько, Федірко, 1995) та дослідженням змін вмісту Са2+ у тканині залоз і секреції загального білка у гіпонатрієвих умовах (Клевець, Манько, Федірко, 1996), коли обмінник транспортує Са2+ у клітини. Проте функціонального підтвердження роботи обмінника у режимі виведення Са2+ з клітин немає. Відсутні відомості про наявність Са2+-помпи у мембранах досліджуваних клітин.

У зв’язку з цим отримання функціональних підтверджень наявності потенціалозалежних кальцієвих каналів, №+-Са2,-обмшшіка та Са2,-помпи є актуальним для з’ясування механізмів підтримання кальцієвого гомеостазу у досліджуваних клітинах та його ролі у секреторному процесі.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана в рамках держбюджетних теми ’’Виявлення механізмів функціонування Na+-Са2+-обміну мембрани секреторних клітин”, № держреєстрації 0196V002178 (здобу-вачем проведено дослідження Ка+-залежного транспорту катіонів Са2+ із секреторних клітин слинної залози личинки Chironomus plumosus L. та його стимуляцію Са2+-кальмодулшовим комплексом) та теми “Кальцієвий гомеостаз і енергетичний метаболізм секреторних клітин травних залоз та їх зміни під впливом екстремальних факторів”, № держреєстрації 01000001452 (здобувачем проведено дослідження систем пасивного і первинно-активного транспорту Са2+ у секреторних клітинах).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи є одержання функціональних доказів наявності мембранних систем активного і пасивного транспорту катіонів Са2+ в екзокринних секреторних клітинах слинної залози личинки Chironomus plumosus L. Об’єктом досліджень є механізми підтримання внутрішньоклітинного гомеостазу Са2+ як вторинного посередника, а предметом - трансмембранні кальційтранспортні системи клітин слинної залози. Про наявність і властивості потенціалозалежних кальцієвих каналів, Na+-Ca2'-обмініпіка та Са2+-помпи судили на основі аналізу змін рівня секреції загального білка in vitro у середовищах з різним іонним складом та під впливом блокаторів цих систем, змін сумарного вмісту Са2+ у тканині залоз, вмісту мембранозв’язаного Са2+ та АТФазної активності тканини залоз за приростом Р„ у середовищі інкубації. Для виявлення доказів наявності цих Са2+-транспортних систем необхідно було:

1. Підтвердити наявність у плазматичній мембрані (ПМ) секреторних клітин слинної залози личинки Chironomus plumosus L. потенціалозалежних кальцієвих

каналів, використовуючи гіперкалієву деполяризацію мембрани та блокатори цих каналів.

2. Одержати підтвердження функціонування №+-Са2+-обмінника ПМ цих клітин в умовах гіпернатрієвих середовищ та дослідити вплив хлорпромазину на його роботу у прямому режимі.

3. Вияснити залежність функціонування обмінника від ступеня деполяризації мембрани гіперкалієвими розчинами.

4. З’ясувати, чи притаманна клітинним мембранам слинних залоз личинки хі-рономуса Ca2+,Mg2+-ATOa3iia активність.

5. Визначити оптимальні концентрації АТФ та Са2+ для Ca2+,Mg2+-AT®a3Hoi' активності клітинних мембран слинних залоз.

6. Виявити вплив окситоцину, еозину Y і бутилгідроксихіиону на Ca2+,Mg2+-АТФазну активність клітинних мембран слинних залоз мотиля, а також окситоцину і бутнлгідроксихінону на вміст Са2+ у тканині цих залоз і секрецію загального білка.

7. Дослідити вплив кофеїну на функціонування Са2+-транспортних систем секреторних клітин.

Наукова новизна одержаних результатів. На основі виявлених змін вмісту Са2* у тканині залоз та їх секреторної активності під впливом гіперкалієвої деполяризації мембрани та дії блокаторів кальцієвих каналів вперше одержано функціональне підтвердження наявності у ПМ досліджуваних клітин потенціалозалежних кальцієвих каналів, що є подальшим розвитком уявлень про пасивний транспорт Са2+ у секреторні клітини.

Дослідженнями змін вмісту Са2+ у тканині залоз та їх секреції у гіпернатрієвих середовищах вперше виявлено активацію Na’-залежного транспорту катіонів Са2+ із секреторних клітин та його регуляцію комплексом Са2+-кальмодулін (Са2+-КМ). Ці результати служать подальшим розвитком знань про вторинно-активний транспорт Са2+ через ПМ.

З використанням еозину Y, окситоцину і бутилгідроксихінону, як блокаторів транспортних Са2*-АТФаз, вперше доведено наявність системи первинно-активного транспорту Са/' у клітинах слинної залози личинки Chironomus plumosus L. та встановлено оптимальні концентрації АТФ та Са2+ для Са2+,М§2+-АТФазної активності.

Виявлено також кофеїнчутливе вивільнення Са2+ з ендоплазматичного ретику-луму (ЕПР) цих клітин.

Практичне значення роботи. Одержані результати мають фундаментальне значення для розвитку уявлень про мембранні системи транспорту катіонів Са2+ за участю яких здійснюється регуляція секреторного процесу в клітинах екзокринних залоз. Ці результати використовуються у загальному курсі фізіології людини і тварин у Львівському національному університеті імені Івана Франка, спецкурсах з фізіології травлення, електрофізіології та електрофізіології секреторних клітин. Во-

ни можуть бути використані для розробки фармакологічних методів корекції секреції травних залоз людини і тварин, а тому мають значення для медицини і ветеринарії.

Особистий внесок здобувача. Відповідно з поставленою метою і задачами автором особисто виконано всі експериментальні дослідження, налагоджено методику визначення Ca2+,Mg2+-ATi>a3Hoi' активності тканини слинних залоз, проведено статистичну обробку одержаних результатів, їх аналіз, сформульовано основні висновки роботи, підготовлено до друку публікації за матеріалами дисертації.

У плануванні основних напрямків досліджень, обговоренні їх результатів, а також у формуванні висновків брали участь науковий керівник та інші співавтори публікацій. У проведенні мікрофлуориметричних досліджень взяли участь д.б.н. Дем-ків О.Т. та к.б.н. Манько В.В.

Апробація результатів дисертації. Основні положення й результати дисертації доповідали: на 33-у Міжнародному конгресі фізіологічні« наук (Санкт-Петербург, 1997 p.), на 2-у з’їзді Українського біофізичного товариства (Харків, 1998 p.), на 3-у з’їзді біофізиків Росії (Москва, 1999 p.), на засіданні кафедри фізіології людини і тварин у червні 2000 р. та на щорічних наукових конференціях Львівського університету (1997- 2000 pp.).

Публікації. Основні результати дисертаційної роботи висвітлені у 5 статтях, 4 з яких опубліковані у наукових фахових виданнях, а також у 1 депонованій статті та З тезах.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису методів досліджень, результатів досліджень, їх обговорення, висновків, а також списку використаних джерел із 219 найменувань. Робота викладена на 140 сторінках, ілюстрована 13 рисунками і 10 таблицями.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Дослідження проводили на ізольованих малоклітинних (32-48 клітин) слинних залозах личинки (мотиля) Chironomus plumosus L., (клас Insecla, ряд Diptera, родина Chironomidae, рід Chironomus Meig.). Максимальних розмірів слинні залози досягають перед перетворенням личинки у лялечку і становлять 2 мм в довжину і 0,8 мм в ширину. Про функціональний стан кальційтранспортних систем клітин досліджуваних залоз судили на підставі змін сумарного та мембранозв’язаного вмісту Са2+ у тканині та рівня секреції загального білка.

Базовий зовнішньоклітинний розчин містив (ммоль/л): NaCl - 136,90; КС1 -5,36; СаС12 - 1,76; MgCl2 - 0,49; Na2HP04 - 0,35; КН2Р04 - 0,44; глюкоза - 5,55; pH 7,2. Його використовували для дослідження змін вмісту Са2+ у тканині залоз та секреції загального білка у базальних умовах. Потенціалозалежні кальцієві канали активували гігіеркалієвою деполяризацією мембрани, збільшуючи концентрацію КС1 у

базовому зовнішньоклітинному розчині до 40 ммоль/л. У дослідженнях використовували блокатори цих каналів: верапаміл (0,1 ммоль/л), дилтіазем (0,1 ммоль/л), ні-федииін (0,1 ммоль/л) та LaCl3 (0,1 ммоль/л). Для активації 'Na+-Ca2*-обміну у прямому режимі збільшували [Na+]3 до 180 ммоль/л, а у зворотному - зменшували [Na+], до 35 ммоль/л, замінюючи 101,90 ммоль/л NaCl у базовому розчині на еквімо-лярну концентрацію трис-С1. Для дослідження впливу хлорпромазину на стимульовані гіперкалієвим та гіпернатрієвим розчинами зміни вмісту Са2+ у тканині залоз та секреції загального білка його додавали у концентраціях 5, 20, 50 і 100 мкмоль/л до гіперкалієвого та у концентрації 100 мкмоль/л - до гіпернатрієвого середовищ інкубації. Для активації вивільнення Са2' з ЕПР використовували кофеїн у концентраціях 1, 2, 4, 8, 10 та 15 ммоль/л.

Вміст Са2+ у тканині залоз визначали з використанням арсеназо III і виражали у наномолях на залозу. Вміст загального білка у середовищі інкубації визначали за методом Лоурі (Lowry et al., 1951) і виражали у процентах від сумарного вмісту білка у гомогенаті залоз та середовищі інкубації. Визначення вмісту мембра-нозв’язаного Са2+ у клітинах проводили на основі вимірювання інтенсивності флуоресценції комплексу Са2+-хлортетрациклін (Са2+-ХТЦ) у різних мікроділянках залози за допомогою цитофлуориметра ЛІОМАМ-Р-3 (Росія) при збільшенні 10x7 з діаметром ЩІЛИНИ 0,5 ММ Й Інтерференційним фільтром Кглах = 541 ± 12 нм.

Середовище інкубації для визначення загальної АТФазної активності тканини слинних залоз містило (ммоль/л): NaCl - 16,0; КС1 - 130,14; СаС12-0,10; MgCl2 -5,0; трис-АТФ - 5,0; глюкоза - 5,55; pH 7,0. АТФазну активність виражали у мікро-молях неорганічного фосфату на міліграм білка за 30 хвилин (мкмоль Р„ /мг білка за ЗО хв.). Для пригнічення Na+,K+-АТФазної активності до наведеного середовища інкубації додавали строфантин К (25 мкмоль/л). Мо2+-АТФазну активність визначали у тих же умовах, але за відсутності СаС12 і з додаванням ЕГТА (0,65 ммоль/л). У дослідженнях використовували блокатори транспортних Са2+-АТФаз - еозин Y (10 мкмоль/л), бутилгідроксихінон (25 мкмоль/л) і окситоцин (100 мкмоль/л).

Цифрові результати усіх вимірювань піддавали варіаційно-статистичній обробці за Стьюдентом. Опрацювання результатів здійснювали з використанням програмного пакету для персональних комп’ютерів Microsoft Excel та калькулятора Sharp EL-509G.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

1. Функціональні підтвердження наявності потенціалозалежних кальцієвих каналів у мембрані секреторних клітин. Для цього ми досліджували зміни вмісту Са’* у тканині слинних залоз та їх секрецію під впливом гіперкалієвої деполяризації мембрани. Як виявилося, підвищення [К+]3 від 5,36 до 10, 20, 40, 80 і 100 ммоль/л викликає концентраційнозалежне збільшення вмісту Са2+ у тканині залози в середньому відповідно у 1,67-2,82 разів (п=5). Одночасно з цим відбувається деяке

збільшення вмісту загального білка у середовищі інкубації, проте воно виявилося статистично недостовірним (рис. 1). Таким чином, при [К+]3 10, 20 і 40 ммоль/л стимульоване гіперкалієвим середовищем збільшення вмісту Са2+ у тканині залози корелює з інтенсивністю секреції загального білка, яка була максимальною за наявності 40 ммоль/л КСІ у зовнішньоклітинному розчині. У зв’язку з цим у наступних серіях дослідів стимуляцію входу Са2+ у секреторні клітини викликали розчином,

А

І! *,________________________

[К+Ь, ммоль/л

'Л

А *

.5 ’=

Сб

<я

и

15

ь-

- е*

и »

1 ? р о

45

40

35

ЗО-)

25

20

15

10

5-1

0

5,36

[К ]„ ммоль/л

Рис. 1. Залежність вмісту Са2* у тканині залози (А) та загального білка у середовищі інкубації (Б) від зовнішньоклітинної концентрації К4. Примітка: * - тут і далі різниця порівняно з контролем достовірна з Р<0,05; ** - з Р<0,01; *** - з Р<0,001

який містив 40 ммоль/л КС1.

Таким чином, результати вимірювання змін вмісту Са2+ у тканині слинних залоз мотиля під впливом гіперкалієвої деполяризації мембрани та аналіз стимульованої секреції загального білка свідчать на користь наявності потенціалозалежного входу Са2+ у досліджувані секреторні клітини.

Підтвердженням цьому служить також збільшення вмісту Са2+ у тканині залоз залежно від [Са2яке було більш вираженим за умови їх інкубації у гіперкалієво-му середовищі ([К+]3=40 ммоль/л), ніж у базальному ([К+]3=5,36 ммоль/л). Очевидно, виявлена залежність вмісту Са2* у тканині залоз від його зовнішньоклітинної концентрації і повинна спостерігатися за умови, що він проникає у клітини за своїм електрохімічним градієнтом через потенціалозалежні кальцієві канали.

Для підтвердження надходження Са2+ у секреторні клітини власне через кальцієві потенціалозалежні канали ми досліджували вплив блокаторів цих каналів на стимульоване гіперкалієвою деполяризацією збільшення його вмісту у тканині залоз та активацію секреції загального білка. Додавання до гіперкалієвою середовища верапамілу, дилтіазему, ніфедипіну та LaClj у всіх випадках супроводжувалося пригніченням стимульованого входу Сг2* у клітини та рівня секреції загального білка. Розрахунки показали, що під впливом верапамілу (0,1 ммоль/л) стимуляція гіперкалієвим розчином зміни вмісту Ca2f у тканині залоз (різниця між вмістом Са2+ у тканині залоз, інкубованих у гіперкалієвому розчині, та залоз, які інкубували у базовому розчині) була меншою на 58,82% (Р<0,01, п=6) порівняно з контролем (без бло-катора). Щодо секреції загального білка, то за таких умов практично не спостерігалося її стимуляції деполяризацією мембрани 40 ммоль/л КС1. За наявності дилтіазему (0,1 ммоль/л) у гіперкалієвому розчині нами виявлено статистично достовірне (Р<0,05, п=6) зменшення стимуляції змін вмісту Са2+ у тканині залоз на 63,50%, а секреції загального білка - на 66,14% (Р<0,05, п=6) порівняно з контролем. Під впливом ніфедипіну (0,1 ммоль/л) стимуляція гіперкалієвим розчином змін вмісту Са2+ у тканині залоз була меншою на 62,02% (Р<0,05, п=6), а секреції загального білка — на 34,45% шодо контролю. А піл впливом 1.аС!3 (0,1 ммоль/л) стимуляція розчином із [К+]3 = 40 ммоль/л змін вмісту Са2+ у тканині залоз та секреції загального білка була меншою відповідно на 39,85 та 36,27% відносно контролю. Ці результати переконливо підтверджують наявність у мембрані секреторних клітин досліджуваних залоз потенціалозалежних кальцієвих каналів.

Стимульоване гіперкалієвою деполяризацією надходження зовнішньоклітинно-го Са2+ викликає підвищення його цитоплазматичної концентрації. Завдяки функціонуванню у клітинах систем депонування і зв’язування іонів Са2+ (Костюк, 1986) та систем їх виведення проти електрохімічного градієнта у позаклітинне середовище (Костюк, 1986; Рьібальченко, 1988) рівень іонізованого Са2+ швидко відновлюється до вихідного, а зміни частки, зв’язаної внутрішньоклітинними мембранами, є більш

тривалими. Тому ми досліджували зміни вмісту мембранозв’язаного Са2ь у секреторних клітинах слинних залоз мотиля під впливом блокаторів потенціалозалежних кальцієвих каналів на фоні гіперкалієвої деполяризації мембрани.

Як з’ясувалося, за умов додавання до базового розчину дилтіазему та ніфедипі-ну спостерігається збільшення інтенсивності флуоресценції, спричинене, мабуть, люмінесценцією цих речовин, оскільки під їх впливом сумарний вміст Са2+ у тканині залоз дещо зменшувався. Тому ми аналізували лише вплив цих речовин на стимульоване гіперкалієвою деполяризацією збільшення флуоресценції, а не абсолютне її значення. Виявилося, що під впливом гіперкалієвої деполяризації мембрани спостерігалося збільшення інтенсивності флуоресценції Са2+-ХТЦ-комплексу у контролі у 3,79 разів. За присутності у середовищі інкубації дилтіазему спостерігалося збільшення інтенсивності флуоресценції Са2+-ХТЦ-комплексу під впливом гіперкалієвої деполяризації мембрани лише у 1,92 разів, тоді як за наявності ніфедипіну нами практично не відмічено стимульованого збільшення вмісту мембранозв’язаного Са2+ у досліджуваних клітинах.

Одержані результати досліджень ми розцінюємо як ще одне доведення надходження Са2+ у секреторні клітини слинної залози мотиля через потенціалозалежні кальцієві канали ПМ.

На наступному етапі ми досліджували зміни вмісту Са2+ у тканині залоз та секреції загального білка під впливом специфічного блокатора КМ - хлорпромазину. Розрахунки показали, що стимульоване гіперкалієвою деполяризацією мембрани збільшення вмісту Са2+ у тканині залоз становило 2,50±0,15 нмоль на залозу, в той час як під впливом хлорпромазину у концентраціях 5, 20, 50 і 100 мкмоль/л даний показник зменшувався відповідно у 1,21 (Р>0,05), 1,34 (Р<0,05), 1,62 (Р<0,05) і 1,70 (Р<0,01) разів (п=6). Зміна ж секреції загального білка за даних умов мала більш складний характер: при 20 мкмоль/л змін не було, при 10 і 50 мкмоль/л спостерігалася тенденція до зменшення, яке було статистично достовірним (Р<0,05) лише при 100 мкмоль/л хлорпромазину у середовищі інкубації.

Отже, зменшення вмісту Са2+ у тканині залоз та секреції загального білка під впливом хлопромазину свідчить про його ефективну блокуючу дію на потенціалозалежні кальцієві канали ПМ досліджуваних клітин.

2. Дослідження властивостей №+-Саи-обмінника плазматичної мембрани секреторних клітин. У секреторних клітинах слинної залози личинки СИігопотт ріиіпозт Ь. ідентифіковано №*-Са2"-обмін шляхом реєстрації його струму та на основі дослідження змін вмісту Са2+ у тканині залоз і секреції загального білка у гіпонатрієвих умовах, коли обмінник транспортує Са2+ у клітини (Клевець, Манько, Федірко, 1996). Разом з тим, об’єктивно можна судити про роль Иа^-Са2’-обміну у підтриманні кальцієвого гомеостазу у секреторних клітинах, якщо досліджувати його роботу у прямому режимі.

ос

rr

Для з’ясування даного питання ми активували 'На+-Са~+-обмін у прямому режимі, збільшуючи [Ма+]3 до 150, 165, 180 і 200 ммоль/л. Виявилося, що в умовах гіпернатрієвих середовищ спостерігалося інтенсивне зменшення вмісту Са + у тканині залоз та секреції загального білка, що свідчить про ефективне за таких умов (пДцМі > Дцса) виведення об-мінником Са2+ із секреторних клітин проти його електрохімічного градієнта. Максимальною активація Т\’а'-Са2+-обмінного механізму була при ¡ТМа+]3 = 180 ммоль/л (рис. 2), коли вміст Са2* у тканині залоз та рівень секреції загального білка знижувалися відповідно у 2,28 та 1,21 разів порівняно з контролем.

Стимульоване гіперкалі-євим середовищем надхо-

г' 2+ •

дження Са у клітини може бути зумовлене активацією як потенціалозалежних каль-

Ж

S

Я

та

іі5

н

+

U

S

я

са

136,9 150 165 180 200 [Na+]3, ммоль/л

Рис. 2. Зменшення рівня секреції загального білка (1) і вмісту Са2+ у тканині слинних залоз личинки хіроно-муса (2) внаслідок їх інкубації у гшернатріевих умовах

цісвих каналів, так і системи На+-Са2+-обміну, оскільки відомо, що деполяризація мембрани призводить до зміни режиму функціонування обмінника (Веп'пагп, 1989). Для з’ясування можливості надходження Са2+ системою №‘-Са2і-обміну у клітини слинної залози мотиля у відповідь на деполяризацію мембрани ми досліджували залежність стимульованого гіпонатрієвим середовищем збільшення вмісту Са2+ у тканині залоз (рис. 3) та загального білка у середовищі інкубації (рис. 4) від ступеня деполяризації мембрани гіперкалієвими розчинами.

Виявилося, що вміст Са2+ у тканині залоз та загального білка у середовищі під впливом гіперкалієвих розчинів із зниженою концентрацією №+ (35,0 ммоль/л) був

більшим, ніж під впливом розчинів із фізіологічною концентрацією На4. Зміни вміс-

„2+ . • ■ ... . ту Са у тканині залоз під впливом гіперкалієвих і гіпонатрієвих середовищ характеризуються адитивністю і не дозволяють з’ясувати нам який вклад вносить Иа+-

Са -обмінник у надходження Са у клітини в ході деполяризації мембрани. Але оскільки під впливом верапамілу (0,1 ммоль/л), збільшення вмісту Са2+ у тканині залоз та секреції загального білка при [К+]-, = 40 ммоль/л К.С1 пригнічувалися відпо-

відно у 2,16 (Р<0,05, п=6) і 1,52 (Р>0,05, п=6) разів, а при [К4]3 = 100 ммоль/л - у 3,13 (Р<0,01, п=6) і 7,94 (Р<0,05, п=6) разів, то можна зробити висновок, що при даних деполяризацій-них зміщеннях мембранного потенціалу збільшення обох показників зумовлене, в основному, надходженням Са2+ через потенціалозалежні кальцієві канали.

Відомо, що комплекс Са2+-КМ стимулює функціонування №' Са2+-обміну ПМ секреторних клітин слинних залоз мотиля у зворотному режимі (Федірко, 1997). З метою з’ясування можливості регуляції Са2+-КМ комплексом функціонування №і+-Са2+-обмінника ПМ цих клітин у прямому режимі використовували хлорпромазин, який у концентрації 100 мкмоль/л додавали до гіперна-трієвого (180 ммоль ИаС1) середовища інкубації. Підвищення ГИа+]3 від 136,9 до 180,0 ммоль/л супроводжувалося зменшенням вмісту Са2+ у тканині залози та секреції загального білка відповідно у 1,85 (Р<0,01, п=6) та 1,07 (Р<0,05, п=6) разів,щодо контролю. За наявності у розчині хлорпромазину вміст Са2+ у тканині залоз зменшувався під впливом гіпернатрієвого середовища лише у 1,41 разів (Р<0,01, п=6), секреція ж загального білка при цьому збільшувалася у 1,13 разів (Р<0,01, п=6).

Одержані нами результати свідчать про пригнічення хлорпромазином Са2+-обміну через ПМ секреторних клітин досліджуваних залоз у прямому режимі,

«

я

ю

ь

2

М

[К^|„ ммоль/л

Рис. 4. Залежність вмісту загального білка у інкубаційному середовищі за наявності фізіологічної (1) та зменшеної до 35,0 ммоль/л (2) концентрації №+ у середовищі інкубації від ступеня деполяризації мембрани гіперкалієвими розчинами

о

СЗ “

Ч £

1 § “ ОО

+ ' ТГ и С2-

н >>

и со ~ о л =5 02 я

[К+], ммоль/л

Рис. 3. Залежність вмісту Са2+ у тканині залози за наявності фізіологічної (1) та зменшеної до 35,0 ммоль/л (2) концентрації №+ у середовищі інкубації від ступеня деполяризації мембрани гіперкалієвими розчинами

що доводить участь комплексу Са2+-КМ у регуляції робота обмінника у прямому режимі.

3. Са2+,1У^2+-АТФазна активність тканини слинних залоз. Збільшення амплітуди струму №+-Са2'-обміну під впливом блокаторів Са2',К^2'-АТФази еозину У та ортованадату опосередковано вказує на наявність у ПМ секреторних клітин слинної залози личинки СЫгопотш ріитозш Ь. системи АТФ-залежного транспорту Са2+ (Манько, Клевец, Ларина, 1999). Тому наші зусилля були спрямовані на підтвердження наявності Са2+-помпи у цих клітинах, використовуючи метод визначення Са2+,Г\^2*-ЛТФазної активності тканини досліджуваних залоз.

З’ясувалося, що рівень Рн у середовищі, яке містило 0,1 ммоль/л СаС12, 5,0 ммоль/л АТФ та 5,0 ммоль/л М§С12, після 30-хвилинної інкубації тканини слинних залоз збільшився і становив 12,46±0,11 мкмоль/мг білка. Під впливом строфантину К (25 мкмоль/л) він статистично достовірно зменшувався на 19,98±1,17% (Р<0,001, п=16), що свідчить про наявність №+,К+-АТФази у ПМ клітин слинної залози мотиля, активність якої становила 2,47±0,14 мкмоль Рн /мг білка за ЗО хв. (п=16). За умов додавання до безкальцієвого середовища інкубації строфантину К і ЕГТА (0,65 ммоль/л) блокуються Ыа+,К+- і Са2+-помпи, тому за приріст в ньому Рн відповідала Mg2+-ATФaзa, середнє значення активності якої становило 7,33+0,26 мкмоль Рн /мг білка за 30 хв. (п= 16), що відповідає 58,51±1,69% загальної АТФазної активності тканини. Розрахована Ca2+,Mg2+-ATФaзнa активність становила 5,94±0,13 мкмоль Рн /мг білка за 30 хв. (22,88±0,56% від загальної АТФазної активності).

Таким чином, тканина секреторних клітин слинних залоз мотиля характеризується Ca2+,Mg2+-ATФазною, а також М£2+-АТФаз-ною та строфантинчутливою Ка',К+-АТФаз-ною активностями.

На наступному етапі ми досліджували залежність Са2+,М£2+-АТФазної активності тканини залоз від концентрації АТФ у середовищі інкубації. Виявилося, що Са2+,М§2+-АТФазна активність була найвищою за наявності у середовищі інкубації АТФ у концентрації 5 ммоль/л і становила 2,42±0,04 мкмоль Рн /мг білка за ЗО хв. (рис. 5). З’ясувалося також, що і Mg2+-ATФaзнa активність за цих умов була максимальною (7,80+0,24 мкмоль Рн /мг білка за 30 хв.), а мінімальною - за наявності 1 ммоль/л АТФ у середовищі інкубації. На відміну від цього, №+,К+-АТФазна

Св

е;

15

и

.0

О

2

[АТФ], ммоль/л

Рис. 5. Залежність Са2+,ІУ^2І-АТФаз-ної (1), М^-АТФазної (2) і Ка+,К*-АТФазної (3) активностей тканини слинної залози личинки Скігопотиз ріитозиз Ь. віл концентрації АТФ у ссоеловиші інкубації

активність за наявності у середовищі інкубації 1 ммоль/л АТФ мала виражений максимум. Отже, дані ферментні системи тканини слинних залоз личинки СМгопотия ріитохт Ь., очевидно, характеризуються різною інтенсивністю протікання ферментативного гідролізу АТФ.

Ще одним питанням для з’ясування було дослідження залежності між Са2+,М§2+-АТФазною активністю і вмістом Са2+ у середовищі інкубації. Як виявилося у ході досліджень, ця залежність має куполоподібний характер з максимумом при 0,1 ммоль/л Са21 у середовищі інкубації (3,90±0,13 мкмоль Рн /мг білка за 30 хв.). Вищі концентрації Са2+ пригнічували Са2' ,М^2АТФазну активність тканини слинних залоз. Активність №+,К+-АТФази виявилася найвищою за наявності у середовищі інкубації СаСЬ у концентрації

0,01 ммоль/л (3,67+0,30 мкмоль Рн /мг білка за ЗО хв.) і суттєво пригнічувалася при збільшенні концентрації Са2+ (рис. 6).

Нами показано, що Са2+,К^2+-АТФазна активність повністю пригнічувалася (Р<0,01, п=6) під впливом еозину У (10 мкмоль/л) та суттєво зменшувалася під впливом бутилгідроксихінону у концентрації 25 мкмоль/л (на 68,62±2,96%, Р<0,001 при п=6) і окситоцину у концентрації 100 мкмоль/л (на 65,74+13,50%, Р<0,001 при п=6). З цими даними добре узгоджуються результати вимірювань сумарного вмісту Са2+ у тканині залоз та рівня секреції загального білка в присутності окситоцину та бутилгідроксихінону. Виявилося, що за таких умов обидва показники виразно збільшувалися, що вказує на пригнічення окситоцином та бутилгідроксихіноном Са2+,М^2+-АТФазної активності тканини залоз. Ми виявили також, що бутилгідрок-сихінон викликав збільшення вмісту мембранозв’язаного Са2' у цих клітинах у 1,16 разів (Р=2,74-10‘4 при п=188).

Усі ці факти свідчать про наявність системи енергозалежного транспорту Са2+ у секреторних клітинах слинної залози личинки СИігопотш ріитохиь Ь.

4. Вплив кофеїну на функціонування Са2+-транспортних систем клітинних мембран слинних залоз. Активоване кофеїном вивільнення Са2+ з цистерн ЕПР, яке забезпечується ріанодинчутливими кальцієвими каналами мембрани ретикулуму, призводить до збільшення його вмісту у цитоплазмі і, як наслідок, до активації усіх внутрішньоклітинних Са2+-залежних процесів. Крім того, вплив кофеїну на рівень

[Са2+], ммоль/л

Рис. 6. Залежність Са2+,М§2+-АТФазної (1) і Ка+,К+-АТФазної (2) активностей тканини слинної залози личинки СЫгопотиа ріи-ото5,м5 Ь. від концентрації Са2+ у середовищі інкубації

цитоплазматичного Са1+ може бути зумовлений не лише його дією на згадані канали, а й на інші кальційтранспортні системи клітин (Китайгородская, Мукумов, Дмитриева, 1981), що також доводять результати проведених нами досліджень (рис. 7).

§ с

О4'

.5 зд ^

>>

сб

ий

5

ю

ю

2 ю ’5 &

СО Ж

2 4 8

кофеїн, ммоль/л

Рис. 7. Вплив кофеїну на вміст Са2+ у тканині слинних залоз (1), інкубованих у розчинах з фізіологічним іонним складом, та секрецію загального білка (2)

Як видно з цього рисунка, зміни вмісту Са2+ у тканині залоз та секреції ними загального білка під впливом кофеїну у концентраціях 1, 2, 4, 8, 10 та 15 ммоль/л мали складний характер. Спочатку спостерігалося збільшення вмісту Са2, у тканині залоз та секреції загального білка, яке виявилося найбільш суттєвим (63,20% іг 7,50% відповідно під впливом кофеїну у концентрації 4 ммоль/л. За наявності ж > середовищі інкубації кофеїну у вищих концентраціях (10 і 15 ммоль/л) показники вмісту Са2* у тканині залоз практично не відрізнялися від контролю. Тобто кофеїн за нормального іонного складу середовища має виражений подвійний вплив на вміст Са2< у тканині слинних залоз. Тому ми припустили, що збільшення вмісту Са2+ у тканині досліджуваних залоз під впливом кофеїну у низьких концентраціях (<4 ммоль/л) може бути зумовлене або збільшенням його надходження через потенціа-лозалежні кальцієві канали, або зміною функціонального стану №+-Са2+-обмінникг чи Са2+-помпи. Але з’ясувалося, що стимульоване гіперкалієвою деполяризацією збільшення Са2+ у тканині залоз становило 83,0% (Р<0,001, п=6), а секреції загального білка - 20,0% (Р<0,05, п=6). На фоні ж 4 ммоль/л кофеїну ці зміни були менш вираженими: стимульоване гіперкалієвим середовищем збільшення вмісту Са2+ у тканині залоз становило лише 19,5% (Р<0,05, п=6), а секреції загального білка -7,0% (Р>0,05, п=6). Отже, ефект кофеїну у концентрації 4 ммоль/л не зумовлений його впливом на потенціалозалежні кальцієві канали ПМ секреторних клітин. Не

підтвердилося також припущення про можливість кофеїнстимульованого збільшення входу Са2+ у секреторні клітини системою N3 ‘-Са^-обміну у гіпонатрієвих умовах. Стимульоване гіпонатрієвим середовищем збільшення вмісту Са2* у тканині залоз становило 50,5% (Р<0,001, п=7), а секреції загального білка - 5,3% (Р>0,05, п=7). А на фоні кофеїну (4 ммоль/л) стимульоване збільшення вмісту Са2+ у тканині залоз та секреції загального білка становило 20,4% та 11,2% (Р>0,05, п=7) відповідно. Таким чином, теоретично можливо, що збільшення вмісту Са2+ у тканині залоз за цих умов зумовлене зміною активності Са2+,]У^2+-АТФази ПМ або мембрани ЕПР. Згідно одержаних результатів, в присутності блокаторів Са2+-АТФаз бутилгідрокси-хінону (25 мкмоль/л) і еозину У (10 мкмоль/л) кофеїн у концентрації 4 ммоль/л спричиняв не збільшення, а статистично достовірне (Р<0,001, п=6) зменшення вмісту Са2+ у тканині залоз на 31,66*4,32 і 63,02±4,51% відповідно. Під впливом ж кофеїну у концентрації 10 ммоль/л зменшення вмісту Са2’ у тканині залоз на фоні бу-гилгідроксихінону та еозину У становило 13,95±5,0 (Р<0,05, п=6) та 62,24±4,15% 'Р<0,001, п=6) відповідно. Таким чином, кофеїн у високих концентраціях, а також у присутності блокаторів Са2‘-ЛТФаз дійсно сприяє вивільненню Са2+ з внутрішньок-чітинних депо досліджуваних клітин, чим і пояснюється зменшення його вмісту у тканині залоз за даних умов. Це дозволяє нам стверджувати про наявність у мемб-зані ЕПР клітин слинної залози мотиля ріанодинчутливих кальцієвих каналів. А у шзьких концентраціях кофеїн збільшує вміст Са2+ у тканині досліджуваних залоз, іайбільш ймовірно, за рахунок стимуляції роботи Са2+-помпи ЕПР, яка повертає іивільнений Са2+ назад у цистерни ретикулуму. При цьому також активується робо-'а №+-Са2+-обмінника ПМ, який забезпечує виведення надлишку Са2+ у позаклітин-іе середовище. Причому це зумовлено виключно зростанням внутрішньоклітинної :онцентрації іонізованого Са2+ за рахунок його вивільнення під впливом кофеїну з ^ПР, оскільки стимульоване гіпернатрієвим середовищем зменшення вмісту Са2+ у канині залоз, яке у контролі становило 35,5% (Р<0,01, п=6), на фоні кофеїну (10 гмоль/л) було більш вираженим і дорівнювало 54,3% (Р<0,05, п-6).

Очевидно, що під впливом кофеїну змінюватиметься також вміст Са2+, в’язаного внутрішньоклітинними мембранами. З’ясувалося, що кофеїн у концент-ації 4 ммоль/л спричинив збільшення вмісту мембранозв’язаного Са2+ у досліджу-аних залозах у 1,29 разів (Р = 1,81 • 10"6 при п=231). Водночас на фоні бутилгідрок-ихінону кофеїн призводив не до збільшення, а до зменшення вмісту мембра-озв’язаного Са2т за рахунок, очевидно, його вивільнення з ЕПР ріанодмнчутливими альцієвими каналами і виведення у позаклітинне середовище №+-Са2+-бмінником. Це підтверджує той факт, що кофеїнстимульоване (<4 ммоль/л) збіль-іешія вмісту мембранозв’язаного Са2+ у досліджуваних клітинах дійсно зумовлене ліною функціонального стану транспортні« Са2+-АТФаз.

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ Методом фіксації потенціалу в умовах внутрішньоклітинної перфузії у ПМ се креторних клітин слинної залози личинки Скігопотт ріитозж Ь. ідентифіковане потенціалозалежні кальцієві канали (Клевец, Гураль, 1990; Клевець, Манько, 1992 1994). Нами одержано функціональне підтвердження наявності цих каналів у ПРу досліджуваних клітин та їх ролі у секреторній активності залоз. Потенціалозалежн кальцієві канали забезпечують надходження Са2+ у секреторні клітини, в результат чого відбувається короткочасне підвищення його цитоплазматичної концентрації необхідне для ініціації секреції (рис. 8). Зростання внутрішньоклітинного вміст;

Рис. 8. Мембранні системи транспорту катіонів у секреторних клітинах слинної залози личинки Chironomus plumosus L.: 1 - потенціалозалежні кальцієві канали ПМ: 2 - Na+-Ca2+-o6MinniiK ПМ; 3 - Ca2+,Mg2+-AT Фаза ПМ; 4 - ріанодинчутливі кальцієві канали; 5 - Ca2+,Mg2+-AT<E>a3a ЕПР; 6 - Na',K -помпа ПМ

іонізованого Са2+ вище базального рівня, зумовлене його пасивним надходження» через потенціалозалежні кальцієві канали, необхідне для ініціації вивільнення Са2+: ЕПР, яке в секреторних клітинах досліджуваних залоз проходить, зокрема, за меха нізмом Са2+-індукованого вивільнення Са2+ через ріанодинчутливі кальцієві каналі мембрани ЕПР. Не виключено, що вивільнення Са2+ із цистерн ретикулуму відбува ється через 1Р3-чутливі канали, виявлені, наприклад, у клітинах ацинусів підшлун кової залози щурів (Petersen, 1996), хоча експериментальні докази цього відсутні Відновлення ж вмісту кальцієвого депо відбувається за рахунок його трансмембран

ного надходження у секреторні клітини (Гаращук, 2000). Що стосується мітохонд-рій, то їхня роль у забезпеченні гомеостазу Са2+ у секреторних клітинах досліджуваних залоз поки що залишається нез’ясованою.

Відновлення концентрації' іонізованого Са2+ у цих клітинах забезпечується системами енергозалежного транспорту Са2+, локалізованими у ПМ та мембрані ЕПР. Первинно-активне виведення Са2+ із цитозолю секреторних клітин здійснюється Са2+ помпою ПМ і мембрани ЕПР. Крім того, у ПМ досліджуваних клітин наявна система вторинно-активного виведення Са2+ у позаклітинне середовище - №+-Са2*-обмінник. Спрямований всередину секреторних клітин градієнт Ыа+, енергія якого використовується для антипортного виведення Са2+ з них, підтримується за допомогою електрогенної Ка+,К+-помпи ПМ.

Значення процесу відновлення внутрішньоклітинного рівня іонізованого Са2+ до вихідної величини полягає у попередженні можливості інгібування секреції загального білка його високою цитоплазматичною концентрацією та створює передумови для повторного запуску секреції. '

ВИСНОВКИ

У дисертації відповідно до поставленої мети та задач дослідження вперше отримано функціональні підтвердження наявності у ПМ секреторних клітин слинної залози личинки СЫгопотиз ріитсят Ь. потенціалозалежних кальцієвих каналів, На+-Са2+-обмінника, Са2+-помпи, а у мембрані ЕПР - ріанодинчутливих кальцієвих каналів, які забезпечують підтримання внутрішньоклітинного гомеостазу катіонів Са2' у зв’язку з їх участю у регуляції секреторного процесу, що підтверджується наступним. .

1. Блокуючий ефект верапамілу, дилтіазему, ніфедипіну і ЬаС13 на стимульоване гіперкапієвою деполяризацією мембрани збільшення вмісту сумарного Са2‘ у тканині залоз і секреції загального білка та вплив дилтіазему і ніфедипіну на зміни вмісту мембранозв’язаного Са2+ свідчать на користь факту його надходження у клітини через потенціалозалежні кальцієві канали. Під впливом хлорпромазину стимуляція гіперкалієвим розчином збільшення вмісту Са2+ у тканині залоз та секреції загального білка була менш вираженою внаслідок пригнічення пасивного транспорту Са2+ через потенціалозалежні кальцієві канали.

2. Залежність дії верапамілу на стимульоване гіперкалієвою деполяризацією мембрани збільшення вмісту Са2+ у тканині залоз і секрецію загального білка від зовнішньоклітинної концентрації катіонів К+ свідчить, що воно зумовлене, в основному, за рахунок входу Са2, через потенціалозалежні кальцієві канали.

3. Зменшення вмісту Са2+ у тканині залоз та секреції загального білка у гіпер-натрієвих умовах є доказом функціонування Ка+-Са2+-обміпника у ПМ секреторних клітин слинної залози личинки СЫгопотт ріитозт Ь. Ефекти хлорпромазину у

гіпернатрієвому розчині свідчать про значення Са2+-КМ комплексу у регуляції функціонування обмінника у прямому режимі.

4. Тканина слинних залоз характеризується Ca2+,Mg2+-AT<J>a3HOK> активністю, яка залежить від концентрації Са2+ та АТФ у середовищі інкубації, повністю блокується еозином Y, а також суттєво пригнічується окситоцином і бутилгідроксихіно-ном. Про наявність транспортної Са2‘,Мц2і-АТФази у секреторних клітинах слинних залоз свідчить і збільшення вмісту Са2+ та секреції загального білка під впливом окситоцину та бутилгідроксихінону.

5. Кофеїн у високих концентраціях, а також у низьких концентраціях при дії блокаторів транспортних Са2+-АТФаз призводить до зменшення секреції загального білка та вмісту Са2+ у тканині залоз за рахунок його вивільнення з ЕПР ріанодинчу-тливими кальцієвими каналами.

СПИСОК ПУБЛІКАЦІЙ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Король Т.В., Клевець М.Ю., Манько В.В. Вплив кофеїну на Са2+-транспортні системи секреторних клітин слинної залози личинки Chironomus plumosus L. И Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія, - 1999. -Т. 8, №4. - С. 49 -53.

2. Манько В.В., Король Т.В., Клевець М.Ю., Демків О.Т. Дослідження Са2+-транпортних систем екзокринних секреторних клітин з використанням хлортетра-цикліну // Вісн. Харк. ун-ту, № 488. Біофізичний вісник. - 2000. - Вип. 6 (1). - С. 79 -81.

3. Король Т.В., Манько В.В., Клевець М.Ю. Дослідження активного транспорту Са2+ у секреторних клітинах слинних залоз личинки Chironomus plumosus L. // Біологія тварин. - 2000. - Т. 2, №1. - С. 92-97.

4. Манько В.В., Клевець М.Ю., Федірко Н.В., Король Т.В. Вплив хлорпромази-ну на Са2+-транспортні системи плазматичної мембрани секреторних клітин слинної залози личинки Chironomus plumosus L. // Укр. біохім. журн. - 2000. - Т. 72, № 2. -С. 48-53.

5. Король Т.В., Манько В.В., Клевець М.Ю. Вплив блокаторів потенціалозале-жних капьпієвих каналів на стимульований гіперкалієвою деполяризацією вхід Са2+ у клітини екзокринних залоз та їх секреторну відповідь // Галицький лікарський вісник. - 1998. -Т. 5, №3. -С. 46-48.

6. Клевець М.Ю., Король Т.В., Манько В.В., Федірко Н.В. Докази надходження кальцію у клітини слинної залози личинки хірономуса під впливом гіперкалієвої деполяризації мембрани І Львів, ун-т. - Львів, 1997. - 25 с. - Деп. в Укр. ІНТЕІ 08. 09. 97, №524 - Уі 97.

7. Korol Т., Klevets М., Manko V. The arguments of potentialdependent calcium entry into salivaiy gland secretory cclls of Chironomus larva//XXXIII International Congress

'Physiological Sciences, St.Pctersburg, June 30 - July 5 1997: Abstracts. - S.I., 1997. -312.09.

8. Король T.B., Клевець М.Ю. Вплив верапамілу і LaCl3 на стимульований гіпер-ілієвою деполяризацією вхід Са2+ у екзокринні секреторні клітини // Тези доповіді II з'їзду Українського біофізичного товариства, 29 червня - 3 липня 1998 р., м. арків. - Харків, 1998. - С. 79.

9. Король Т.В., Клевец М.Ю., Манько В.В. Потенциалозависимость влияния грапамила на стимулированный гиперкалиевой деполяризацией вход Са2+ в экзок-инные секреторные клетки // II съезд биофизиков России, 23-27 августа 1999 г., Іосква: Тез. докл. - Т. 2.-Москва, 1999.-С. 517-518.

АНОТАЦІЯ

Король Т.В. Характеристика транспортних систем кальцію клітин слинної за-ози личинки Chironomus plumosus L. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спе-іальністю 03.00.13 - фізіологія людини і тварин. Львівський національний універ-итет імені Івана Франка, Львів, 2000.

У роботі проведено дослідження систем активного і пасивного транспорту Са2+ екзокринних секреторних клітинах слинної залози личинки Chironomus plumosus ,. Отримано функціональні підтвердження наявності потенціалозалежних кальціє-их каналів у ПМ цих клітин та їх ролі у секреторній активності залоз. Виявлено, що лорпромазин пригнічував пасивний транспорт Са2+ у ці клітини. Через ПМ дослі-жуваних клітин виявлено також Na^-залежне виведення Са2+ у позаклітинне сере-овище. Показано роль комплексу Са2+-КМ у функціонуванні системи Na'-Ca24-бміну у фізіологічних умовах. Доведено наявність системи первинно-активного ранспорту Са2+ у секреторних клітинах досліджуваних залоз та встановлено опти-іальні концентрації АТФ та Са2+ для Ca2+,Mg2f-AT®a3Ho'i активності. Виявлено ко-)еїнчутливе вивільнення Са2+з ЕПР цих клітин.

Ключові слова: секреторні клітини, слинні залози, потенціалозалежні кальціє-і канали, Ыа -Са2*-обм1нник, Ca2+,Mg2АТФаза.

АННОТАЦИЯ

Король Т.В. Характеристика транспортных систем кальция клеток слюнной <елезы личинки Chironomus plumosus L. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по пециальности 03.00.13 - физиология человека и животных. Львовский националь-[ый университет имени Ивана Франко, Львов, 2000.

В работе проведено исследование систем активного и пассивного транспорта Та2+ в экзокринных секреторных клетках слюнной железы личинки Chironomus

plumosus L. На основании анализа изменений содержания Са2+ в ткани желез и сек реции общего белка в условиях гиперкалиевой деполяризации мембраны и поi влиянием верапамила, дилтиазема, нифедипина и LaCl3 получено функциональны* подтверждения наличия потенциалозависимых кальциевых каналов в ПМ этих кле ток и их роли в секреторной активности желез. Установлено, что хлорпромазин уг нетал пассивный транспорт Са2+ в эти клетки. Через ПМ исследуемых клеток выяв лено также №+-зависимое выведение Са2+ во внеклеточную среду. Показано рол] комплекса Са2+-КМ в функционировании системы Na+-CaZf-o6Mena в физиологиче ских условиях. Потенциалозависимость блокирующего действия верапамила ш стимулированное гиперкалиевой деполяризацией мембраны увеличение содержанш Са2+ в ткани желез и секреции общего белка свидетельствует в пользу того факта что вход Са2+ в клетки в этих условиях осуществляется, в основном, потенциалоза висимыми кальциевыми каналами, а не за счет изменения режима функционирования обменника. Доказано наличие системы первично-активного транспорта Са"+ i секреторных клетках исследуемых желез и установлено оптимальные концентрацш АТФ и Са2+ для Ca2+,Mg2+-ATOa3Hovi активности. Установлено кофеинчувствитель ное освобождение Са2+ с ЭПР этих клеток.

Ключевые слова: секреторные клетки, слюнные железы, потенциалозависи мые кальциевые каналы, №+-Са2+-обменник, Ca2+,Mg2+-ATOa3a.

SUMMARY

Korol T.V. Characterisation of calcium transport systems of Chironomus plumosu• L. larvae's salivary gland cells. - Manuscript.

Thesis for receiving a degree of Candidate of Biological Sciences in the speciality

03.00.13 — Human and Animal Physiology. - Ivan Franko "National University of Lviv Lviv, 2000.

These was done a research of active and passive Ca2+ transport systems in exocrine secretory cells of Chironomus plumosus larvae’s salivary gland. One got functional confirmations of potentialdependent calcium channels presence in plasma membrane of these cells and their role in secretion activity of glands. It was established that chlorpromazinc suppressed the passive transport of Ca2+ into these cells. Through plasma membrane oi researched cells one established also Na+-dependent efflux of Ca2+ in extracellular medium. The role of the Ca2~-calmoduline complex in functioning of the Na+-Ca2+-exchange system in physiological conditions was shown. The presence of the prime-active Ca2+-transport system in secretory cells of the researched glands was proved and optimal concentrations of ATP and Ca2+ for Ca2+,Mg2+~ATPase activity was determined. The caffeine-sensitive Ca2+ release from endoplasmic rcticulum of these cells was found.

Key words: secretory cells, salivary glands, potentialdependent calcium channels. Na' -Ca2‘-exchanger, Ca2+,Mg2+-ATPase.