Характеристика токсинов и адгезинов Aggregatibacter actinomycetemcomitans и Porphyromonas gingivalis – возбудителей агрессивных форм пародонтита человека.

Вертиева, Екатерина Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Характеристика токсинов и адгезинов Aggregatibacter actinomycetemcomitans и Porphyromonas gingivalis – возбудителей агрессивных форм пародонтита человека.
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика токсинов и адгезинов Aggregatibacter actinomycetemcomitans и Porphyromonas gingivalis – возбудителей агрессивных форм пародонтита человека."

На правах рукописи

ДВОЗО*-"

Вертиева Екатерина Юрьевна

Характеристика токсинов и адгезинов Aggregatibacter асйпотусегетсотНаю и РотркуготопаБ gingivalis, возбудителей агрессивных форм пародонтита человека.

Специальность:

03.02.03 - микробиология

Автореферат

Диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 О НОЯ 2011

Москва 2011

4859620

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздравсоцразвития России).

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Ю.Ф.Белый

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор кандидат медицинских наук

В.М. Бондаренко В.В. Демкин

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова» Минздравсоцразвития России, г. Москва (ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова» Минздравсоцразвития России).

Защита состоится <<]_>> декабря 2011 г. в «О» часов на заседании диссертационного совета Д 208 130 01 в ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздравсоцразвития России (123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 18).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан «2» ноября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета (1^ доктор медицинских наук, профессор \ : ^ Е

Е. В. Русакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Заболевания пародонта являются самой распространенной патологией в стоматологической практике. По данным ВОЗ 90% населения по всему миру страдают заболеваниями этой группы. Наиболее тяжелым течением обладают агрессивные пародонтиты, доля которых, составляет 1,5-2 % от общей патологии пародонта. Агрессивный пародонтит - это полиэтиологическое заболевание тканей пародонта, приводящее к полной деструкции зубодесневого соединения и характеризующееся крайне быстрым течением (Tanner С. R., 2006). На данный момент известно, что возбудителями агрессивных форм пародонтита являются анаэробные бактерии Aggregalibacler actinomycetemcomitans и Porphyromonas gingivalis (Henderson В. с соавт., 2002; Andrian Е. с соавт., 2006).

A. actinomycetemcomitans - грамотрицательная, анаэробная палочка, относящаяся к семейству Pasteurellaceae. Патоген вызывает локализованую форму агрессивного пародонтита, которой в основном подвержены подростки и дети старшего возраста. В процессе этого заболевания происходит избирательная деструкция костной ткани, затрагивающая передние резцы и первые моляры.

P. gingivalis - грамотрицательная, анаэробная палочка, относящаяся к семейству Porphyromonadaceae. Микроб является основным возбудителем генерализованного агрессивного пародонтита. Характерным признаком этой формы заболевания является убыль костной ткани более 5 мм в области минимум восьми постоянных зубов. Генерализованным агрессивным пародонтитом наиболее часто болеют люди в возрастной группе от 20 до 40 лет, реже подростки (Tonetti М. and Mombelli А., 2003).

Исходя из современных воззрений о патогенезе инфекционных заболеваний вызванных данными возбудителями, важнейшую роль в развитии микробной патологии могут играть адгезины, принимающие участие в прикреплении микроорганизма к колонизируемой поверхности, и

токсины, нарушающие важнейшие функции эукариотических клеток. В связи с этим особый интерес представляют два недавно открытые у A. actinomycetemcomitans токсина (лейкотоксин и летальный токсин гигантских клеток), а также адгезин EmaA (Kachlany S.C. с соавт.,2000; Мао X. с соавт., 2002; Smith J. L. с соавт., 2006; Tang G. с соавт., 2007).

Лейкотоксин (LTX) является представителем RTX (repeats in the structural toxin) семейства. Это порообразующий белок, оказывающий цитотоксическое действие на клетки лимфоидного и миелоидного ряда. Токсин гигантских клеток (cytolethal distending toxin, CDT) - токсический белок, блокирующий митотический цикл эукариотической клетки. CDT обладает ДНКазной активностью. В результате расщепления двунитчатой ДНК летальный токсин гигантских клеток активирует каскад киназных реакций, которые завершаются апоптозом. EmaA - нефимбриальный, высокомолекулярный адгезин, основной функцией которого является прикрепление к компонентом внеклеточного вещества, в том числе к коллагену (Tang G. с соавт., 2007; Tang G. с соавт., 2010).

Ведущую роль в патогенезе инфекции, вызванной P. gingivalis, играют нефимбриальные адгезины и белки с токсической функцией. Основным адгезином является фимбриллин FimA - белок строго специфичный для штаммов Р. gingivalis. Токсическую функцию выполняют протеиназы (Arg-X или Lys-X), а также фосфатазы, ДНКазы, РНКазы и другие белки (Andrian Е. с соавт., 2006; Lamont J. с соавт., 1998).

Агрессивный пародонтит - серьезное заболевание, способное привести к необратимой потере зуба. Причиной отсутствия методов диагностики, профилактики и этиотропной терапии является недостаток информации об этиологии и патогенезе этой болезни. В связи с этим основной направленностью данной диссертационной работы стало изучение важнейших факторов патогенности возбудителей агрессивных форм пародонтита.

Цели и задачи исследования.

Цель работы: получение и характеристика основных факторов патогенности A. actinomycetemcomitans и P. gingivalis, как необходимое условие для изучения патогенеза и обоснования подходов к диагностике и профилактике агрессивных форм пародонтита.

В связи с этим нами были поставлены следующие задачи:

1. Клонирование генов и конструирование рекомбинантных штаммов продуцентов токсинов CDT и LTX, адгезинов ЕшаА и FimA A. actinomycetemcomitans и P. gingivalis.

2. Выделение и очистка токсинов CDT и LTX, адгезинов EmaA и FimA A. actinomycetemcomitans и P. gingivalis.

3. Исследование физико-химических и иммуно-биологических свойств токсинов CDT и LTX, адгезинов EmaA и FimA.

4. Анализ механизмов экспрессии . субъединиц цитолетального токсина гигантских клеток A. actinomycetemcomitans в гетерологичных системах.

5. Получение гипериммунных поликлональных и моноклональных сывороток к антигенам CDT, LTX, EmaA, FimA и оценка их эффективности как компонентов иммуносерологических методов для выявления токсинов и адгезинов A. actinomycetemcomitans и P. gingivalis.

Научная новизна исследования.

1. Впервые проведен анализ механизмов экспрессии субъединиц цитолетального токсина гигантских клеток A. actinomycetemcomitans в гетерологичных системах, позволивший создать генно-инженерные конструкции для продукции белков в препаративных количествах.

2. Установлено, что рекомбинантный препарат CDT обладает цитотоксической активностью и вызывает характерное увеличение размера клеток-мишеней ("distending").

3. Клонирован ген, кодирующий фрагмент токсина Ltx A. actinomycetemcomitans, обладающий высокой иммуногенностью.

4. Впервые получены поликлональные моноспецифичные антитела к адгезинам А. асЧпотусе1етсопишт и Р. gingivalis и определены их специфичность и чуствительность.

5. Получены моноклональные сыворотки к субъединице А летального токсина гигантских клеток А. асйпотусеЬетсотИат. С использованием вестерн-блота показано характерное взаимодействие этих антител с мономерными и олигомерными формами субъединиц токсина.

Практическое значение работы.

Созданы штаммы-продуценты и разработаны технологии получения препаративных количеств важных факторов патогенности А. асПпотус^етсотНапБ и Р^^паШ - токсинов СЭТ и Их, а также адгезинов ЕтаА и ИтА. Очищенные белки обладали высокой иммуногенностью, что указывает на возможность их использования в качестве компонентов вакцинных и иммунотерапевтических препаратов против агрессивных форм пародонтита.

С использованием выделенных белков были получены высокоспецифичные поликлональные и моноклональные сыворотки. В ходе исследования были получены данные о специфичности и чувствительности полученных антител. Антитела обладали высокой активностью и могут быть использованы для дальнейшей работы по выявлению белков в клиническом материале и культурах бактерий с целью дальнейшего изучения механизмов патогенности микробов А. асИпотусе1етсотИап.ч и Р. gingivalis, а также разработки современных методов диагностики заболевания.

По результатам диссертации были подготовлены методические рекомендации «Создание штаммов-продуцентов токсинов Aggregatibacter асПпотусе1етсот\1ап$ для разработки методов диагностики и лечения агрессивных форм пародонтита», утвержденные на заседания Совета по внедрению научных достижений в практику ФГБУ «НИИЭМ им Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России от 22 сентября 2011 г., протокол №16.

Апробация материалов исследований.

Материалы диссертационной работы были представлены и обсуждены на заседании отдела «Бактериальные инфекции» ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России 19.05.2011 г. и на научной конференции «Ломоносов» МГУ им. М.В. Ломоносова 2010 года. Публикации.

По результатам исследований опубликовано 7 научных работ, в том числе 2 статьи в журнале, рекомендуемом ВАК РФ. Личный вклад в работу.

Экспериментальная и теоретическая части, анализ полученной информации были выполнены автором самостоятельно. На отдельных этапах выполнения работы практическая и консультативная помощь была оказана доктором Бровко Ф.А. и доктором А.О. Шепеляковской из Пущинского филиала Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН и доктором Аннетт Витгмер из Университета Альберта-Людвига г. Фрайбурга, Германия.

Положения, выносимые на защиту.

1. Важнейшие факторы патогенности возбудителей агрессивных форм пародонтита А. actinomycetemcomitans и Р. gingivalis могут быть получены в препаративных количествах с использованием экспрессирующей системы Е. coli, которая обладает преимуществом по уровню продукции рекомбинантных белков в сравнении с В. megaterium.

2. Генно-инжнерная модификация нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих летальный токсин гигантских клеток А. actinomycetemcomitans, позволяет увеличить синтез данных белков в 10100 раз.

3. Поликлональные сыворотки, полученные, к токсинам и адгезинам А. actinomycetemcomitans и Р. gingivalis, обладают высокой активностью и эффективно реагируют с гомологичными антигенами, что указывает на

возможность их использования для создания диагностических систем и лечебно-профилактических препаратов.

Структура и объем диссертации.

Объем диссертации составляет 138 страниц и состоит из следующих разделов: оглавление, введение, обзор литературы, собственные исследования, материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, выводы и список используемых источников. Список литературы включает 233 источника. Работа содержит 20 рисунков, 11 таблиц и 1 схему.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Материалы и методы.

Материалы.

Штаммы микроорганизмов.

В работе использовались следующие штаммы: Y4 и Sunny (A. actinomycetemcomitans), W83 (P.gingivalis), DH10B (Е. coli), BL21 DE3 (£. coli), BL21 Codon Plus (£. coli), WH320 (В. megaterium).

Питательные среды.

В работе использовались следующие питательные среды: триптиказо-соевый агар (ТСА); ТСА, обогащенный глюкозой, дрожжевым экстрактом и человеческой сывороткой; триптиказо-соевый бульон (ТСБ), мозго-сердечный агар (МСА), мозго-сердечный перевар, LB - бульон, Terrific Broth(TB), Super Optimal Broth (SOB), Super Optimal Broth + глюкоза(ЗОС) и питательные среды для работы с В. megaterium (SMM, SMMP, CR5 двуслойный агар).

Лабораторные животные.

Белые беспородные мыши с массой 15-20 г, кролики породы «Шиншилла» с массой тела 1-2 кг.

Методы.

Культивирование бактериальных штаммов.

Культивирование штаммов Y4 и Sunny (A. actinomycetemcomitans) и W83 (P.gingivalis) проводилось следующих условиях: температура 37°С, 5 % С02, время инкубации 2-3 дня. Экстракция ДНК

Экстракция матричной ДНК из чистой культуры штаммов

A. actinomycetemcomitans Y4 и Sunny и P.gingivalis W83 проводилась феноловым методом (W.Wren et al., 1987).

Постановка ПЦР.

Амплификация генов CDT, Cdt-A, Cdt-B, Cdt-C, LtxA, EmaA и FimA осуществлялась в следующем режиме: денатурация 94°С - 30 сек., отжиг 50°С - 30 сек., элонгация 72°С - 2 мин., количество циклов - 25. Молекулярное клонирование фрагментов ДНК. Клонирование ДНК осуществляли, используя стандартные методики (Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis Т., 1989). Экспрессия рекомбинантных белков.

В работе использовались две экспрессирующие системы: -Е. coli и

B. megaterium. Очистка белка проводилась методом никель-афинной хроматографии при помощи прибора АКТА Explorer purification system.

Электрофорез в полиакриламидном геле.

Постановка электрофореза в полиакриламидном геле осуществлялась по методике Лэммли (Leammli U.K., 1970). Гели окрашивали с использованием нитрата серебра (Nesterenko M.V. et al., 1994).

Постановка нолимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).

Постановка Real-time ПЦР осуществлялась с применением QuantiTect SYBR Green PCR Kit (Qiagen) на приборе МхЗОООР (Stratagene, Amsterdam, Netherlands).

Получение иммунных специфических сывороток.

Очищенный рекомбинантный препарат вводился мышам трехкратно в количестве 20 мкг каждые 5 дней. Кроликам белок вводился трехкратно каждые 3 недели в количестве 0,5 мг белка на инъекцию.

Получение моноклоиальных антител.

Мышиные моноклональные сывортки были получены в сотрудничестве с коллегами из Пущинского филиала НИИ ИБХ РДН.

Иммуноблотинг.

Идентификацию рекомбинантных белков проводили при помощи постановки Вестерн-блот анализа методом полусухого переноса.

Работа с культурами клеток.

Токсическое действие летального токсина гигантских клеток и протективное действие моноклоиальных антител тестировали на культуре эмбриональных клеток бычьего легкого (EBL). Для этого клетки выращивали при 5% С02, при температуре 37°С на среде Eagle (MEM) с добавлением антибиотиков и 15% телячьей сыворотки. После этого клетки обрабатывали различными концентрациями токсина. Выживаемость и морфологические изменения регистрировали, используя фазово-контрастную микроскопию.

Постановка твердофазного иммуноферментного анализа.

Для проведения данного исследования нами были созданы конъюгаты антител с пероксидазой хрена. Для постановки ИФА использовали «сэндвич» метод.

Статистическая обработка данных.

Обработку данных проводили статистическими методами. Достоверность значений определяли по t-критерию Стьюдента.

Результаты исследований.

Получение рекомбинантного летального токсина гигантских клеток (CDT) A. actinomycetemcomitans.

Подбор питательных сред. Стандартной средой для культивирования клеток A. actinomycetemcomitans принято считать триптиказо-соевый агар.

Однако микроб характеризуется крайне низким и медленным ростом в лабораторных условиях. Одним из путей решения этой проблемы было введение различных добавок и применение других питательных сред. К сожалению, обогащение ТСА человеческой сывороткой и глюкозой, а также замена питательной среды на мозго-сердечный перевар не привела к значительному увеличению числа колоний и наращиванию биомассы. Это указывало на необходимость проведения молекулярно-биологических экспериментов по клонированию соответствующих генов и очистки токсинов из рекомбинантных штаммов-продуцентов.

Получение рекомбинантного CDT с использованием экспрессирующей системы Е. coli. В начале нашей исследовательской деятельности была поставлена задача клонирования цельного гена CDT, а также его отдельных субъединиц: Cdt-A, Cdt-B и Cdt-C. Нуклеотидная последовательность токсина была получена из базы данных GenBank . Для клонирования соответствующих генов, с использованием программы Vector NTI были созданы генетические конструкции и подобраны праймеры. Участки гена, содержащие токсин гигантских клеток и его отдельные субъединицы амплифицировали методом ПЦР. В результате лигирования фрагментов генов cdt-ABC, Cdt-A, Cdt-B, Cdt-A с векторами серии рЕТ были получены следующие плазмиды: р513 (CDT), р498 (Cdt-A), р359 (Cdt-B), р396 (Cdt-C).

Вышеперечисленные плазмиды трансформировали в клетки Е. coli BL21 (DE3). Для увеличения продукции белка мы протестировали несколько питательных сред: LB, ТВ, SOB и SOC. Увеличение биомассы мы наблюдали при использовании питательный среды SOC, однако к существенному увеличению экспрессии белка это не привело. После очистки стало очевидно, что токсин гигантских клеток синтезировался очень плохо. Количество белка составляло приблизительно 0,016 мг на 100 мл культуры в растворимой фракции, и 0,045 мг на 100 мл культуры в нерастворимой фракции. Другой проблемой возникшей в результате эксперимента, стала недостаточная степень очистки полученного препарата (рис.1).

кй

72 55

36 28

1 2 3 4 5 6 7 8

Рисунок 1. Анализ экспрессии очищенных рекомбинантных белков СОТ и огдельньных субъединиц СОТ-А, СЭТ-В, СЭТ-С.

Электрофорез в 15% ПААГ. Дорожки I, 3, 5 и 7 предсташшют собой растворимые формы токсического комплекса СОТ (р513), СОТ-А (р498), СОТ-В (р359), СОТ-С (р396) соответственно. Дорожки 2, 4, 6 и 8 представляют собой нерастворимые белки в том же порядке, «Звездочкой» отмечены позиции компонентов с ожидаемой молекулярной массой.

Действие летального токсина гигантских теток на культуру клеток. Для подтверждения цитотоксического действия СОТ мы использовали культуру клеток ЕВЬ. Клетки обрабатывались очищенным препаратом токсина в различных концентрациях и инкубировались в течение трех дней. В результате, мы наблюдали типичное для СБТ увеличение/расширение клеток и их органелл с последующей деструкцией монослоя при концентрации токсина более 400 нг/мл. В контрольной группе клеток морфологических изменений не наблюдалось. Результат доказывал, что токсин продуцировался, но в небольшом количестве (рис.2).

Рисунок 2. Цитотоксическое действие легального токсина гигантских клеток.

Клетки ЕВЬ, обработанные рекомбинантным очищенным токсином после 3-х суток инкубации (а). Контрольная группа клеток, без добавления СОТ после 3-х суток инкубации (Ь). Фазово-контрастная микроскопия.

Сиквенирование Cdt-A, Cdt-B, Cdt-C токсина гигантских клеток. Для исключения ошибки в составе синтезированных генов, кодирующих отдельные субъединицы CDT, мы решили сравнить сиквенс полученных нами генов с сиквенсом из базы данных GenBank. В результате была выявлена высокая гомология последовательностей. Мы обнаружили наличие четырех нуклеотидных замен в начале Cdt-A и по одной - в Cdt-B и Cdt-C, которые могли быть связаны с межштаммовыми различиями генов (рис 3).

(1129) 1129_.1140_,1150_,1160_.1170_.1180_.1190 1200

AeLCDT-A.seq (1) AAGGAGAGGTACAATGAAAAAGTTTTTACCTGGTCTTTTATTG^TGGGCTTAGTGGCTTGTTCGTCAAATCA Aact_QÄABC_AF102554(1129) AAGGAGAGATATAATGAAGAAGTTTTTACCrQjTCTrTTArrG^TGGjTTTAGTGGCrTGTTCGrCAAATCÄ Consensus(1129) AAGGAGAG TA AATGW AAGTTTTTACCIGGTCTITTATTGATGGG TTAGTGGCTTGTTCGTCAAATCA

(2519) 2519_¿530_¿540_¿550_¿5Ó0_¿570_,2580 2590

¿a_CDT-B_seq (697) AGTCCGGTMTATTTTAGATrATlÄGATTTTACÄTGAC<racaTTTACCAOSTCGÄGAGCA»GTACGTGWC AacLCdtABCAPI 02554 (2519) GGTCCGGTAATATTTTAGATTATGCGATTTTACATGACGCACÄTTTACCACGTCGAGAGCAAGCACGTGAAC Consensus (2519) GTCCGGTAATATTTTAGATTATG33ArTTTACAT®CGCAC«TTTACCACCTCGAGAGCAAG ACGTGSAC

(3173) 3173 ,3180_¿150_,3200 ,3210 .3220_¿230_3244

Aa_CDT-C_seq (508) CAATGGGGAATATTACCTCCTTTTGGGCCAAGTAAAATTTTAAGACCACCGGTGGGGAGAAATCAGGGTAGC Aact_CaWSC_AF102554 (3173) CAATGGGGAArArrACCTOCTTTTGGGTCAAGTAAAATTTTAAGACCACCGGTGGGGAGAAATCAGGGTAGC Consensus(3173) CAATGGGGAATATTACCTCCTTTTGGG CAÄGTAAAATTTTAAGACCACCGGTGGGGAGAAATCAGGGTAGC

Рисунок 3. Сравнительный анализ генов рекомбинантиых Cdt-A, Cdt-B, Cdt-C с геном CDT, полученным из базы данных GenBank (фрагменты гена).

Получение рекомбинантного CDT с использованием экспрессирующей системы Е. coli штамм BL21 Codon Plus. В некоторых случаях низкий уровень продукции белков в экспрессирующей системе Е. coli связан с недостаточностью синтеза некоторых тРНК, что в конечном итоге приводит к остановке трансляции. Свою гипотезу мы решили проверить, используя клетки Е. coli штамм BL21 Codon Plus, содержащий дополнительные копии генов тРНК (argU, Не Y. leuW), редких для кишечной палочки. Смена штамма-продуцента не привела к увеличению продукции рекомбинантиых белков.

Получение рекомбинантного CDT с использованием экспрессирующей системы В. megaterium. Экспрессирующая система В. megaterium Protein Expression System фирмы MoBiTec используется для синтеза белков, секретирующихся в окружающую среду. Это связано с тем, что трансформации производится в протопласты. Для клонирования генов токсина мы использовали плазмиду pHisl522, содержащую сильный xylA

промотор, синтез белка с которого индуцируется ксилозой. Очистка белка осуществлялась методом никель-афинной хроматографии. Продукция белка была очень низкой и не превышала 0,1-0,2 мг на 100 мл культуры.

Анализ гидрофобности молекул летального токсина гигантских клеток. Известно, что снижение эффективности процессов транскрипции и трансляции и усиление процесса белковой деградации внутри бактериальной клетки могут быть связаны с особенностями нуклеотидной и аминокислотной последовательностей. Одним из ключевых черт, присущих молекуле белка, является гидрофобность. С помощью протокола Ку1е и ОооНШе (http://www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl?!) мы провели анализ гидрофобности аминокислотной последовательности СЭТ и выявили черты сигнального пептида в каждой из субъединиц. Ближе к ]МНг концу в СЛ-А, СЛ-В и СЛ-С был выявлен участок, состоящих из гидрофобных аминокислот, обилие которых могло создавать трудности на этапе трансляции (рис. 4).

о -1

О 50 100 150 200

Рисунок 4. Анализ гидрофобности молекул CDT-A, CDT-B, CDT-C.

На основании этих данных, было решено провести генно-инженерную модификацию клонированных последовательностей путем делеции 5'-концевой части генов CDT-A, -В и -С. Полученные в результате конструкции включали в себя следующие последовательности аминокислот: 134-NWL...AVN-260 (Cdt-A - плазмида р503), 167-AFI...RDR-319 (Cdt-B -плазмида р511), 58-TSH.. .QGS-227 (Cdt-C - плазмида р504).

Для получения белка мы использовали клетки Е. coli BL21 (DE3).

CDT-C

CDT-A

О 50 100 ISO COQ 250 ->

Нумерация аминокислот

CDT-

После очистки белка, стало очевидно, что деления МН2-концевого фрагмента привела к резкому увеличению экспрессии белка. Молекулярная масса белков составляла 18 кДа, 21 кДа, 23 кДа соответственно. Выход полученных препаратов со 100 мл культуры составил 8 мг, 14 мг, 3 мг для , СОТ-А, СОТ-В, СОТ-С соответственно (рис.5).

ко

11— •

1 2 3 4 5 6 7 8

Рисунок 5. Анализ рекомбннантных СГ)Т-Л, СИТ-В, СЭТ-С, содержащих делению \Н,-концевого фрагмента.

Дорожки 1, 3, 5 и 7 представляют собой растворимую фракцию СЭТ-А (р503), СОТ-В (р511), СОТ-С (р504), содержащих модифицированный ЫН2-концевой фрагмент и СОТ-А (р593), содержащей делецию СООН-концевого фрагмента. Дорожки 2, 4, 6 и 8 представляют нерастворимую фракцию белков в той же последовательности.

Исследование содержания мРНК в бактериальной культуре. Для установления уровня, на котором происходит ингибирование синтеза клонированных генов СОТ (транскрипция или трансляция), было решено исследовать количество мРНК в бактериальной культуре. Для этого применялся метод ОТ-ПЦР. В результате эксперимента стало ясно, что для конструкции р593, содержащей ЫН2-концевой фрагмент СОТ-А, уровень мРНК был предельно низкий. Уровень мРНК, полученной с р503 плазмиды, регистрировался высокий, даже без индукции белкового синтеза. Добавление 1шМ ИПТГ увеличивало ОТ-ПЦР сигнал более чем в 1,000 раз (рис.6).

Полученные результаты указывали на то, что разница в продукции исследуемых белков связана с разницей уровня специфической мРНК, что может быть объяснено повышенным уровнем транскрипции соответствующего гена или нестабильностью и ускоренным гидролизом образовавшейся мРНК.

10000

1000

100

р503 р503 р593 р593 р503 р503 р593 р593 ИПТГ ИПТГ ИПТГ ИПТГ

ИПТГ

1 час

3 часа

Рисунок 6. Детекция мРНК в клетках Е. coli, экспрессиругащих СООН фрагмент CDT-A (р503) и NH2 фрагмент CDT-A (р593). Результат постановки ПЦР с обратной транскрипцией.

Получение рекомбинантного иммунодоминантного фрагмента лейкотоксина A. actinomycetemcomitans.

Для получения лейкотоксина при помощи программы Vector NTI была создана конструкция, содержащая иммунодоминантный фрагмент токсина (р519). Синтез белка осуществлялся в экспрессирующей системе Е. coli, после очистки белок находился в нерастворимой фракции, в тельцах включений. Молекулярная масса фрагмента Ltx составляла 51 кДа. Выход белка со 100 мл культуры составил 0,5 мг.

Получение рекомбинантных адгезинов ЕшаА

(A. actinomycetemcomitans) и FimA (P. gingivalis).

Нами были успешно клонированы гены, кодирующие FimA (р533) и ЕтаА (р611). После очистки методом никель-афинной хроматографии белки находились в растворимой фракции. Выход полученных препаратов со 100 мл культуры составил 0,5 мг. В результате были получены чистые препараты, не содержащие примесей и мигрирующие при постановке электрофореза в ПААГ четкими полосами. Размер синтезированных молекул | ЕшаА и FimA составил 38 кДа и 43,5 кДа соответственно. При постановке электрофореза в ПААГ без добавления ß-меркаптоэтанола, была выявлена

склонность белка ИнлА к образованию олигомеров, что свидетельствует о наличии в структуре сульфидных групп.

Характеристика физико-химических свойств токсинов СОТ и ЬТХ, а также адгезинов ЕтаА и Р1тА.

На этом этапе исследований анализу подверглись очищенные белковые препараты и сиквенированные кодирующие нуклеотидные последовательности. Стоит отметить некоторые особенности полученных свойств. Так, для компонентов токсина гигантских клеток взаимосвязь между долей гидрофобных аминокислот и способностью белков выпадать в осадок отсутсвовала. Из свойств, важных с практической точки зрения, стоит отметить неспособность фрагментов токсинов А.асПпотусе1етсотИап$ подвергаться эффективному рефолдингу. В остальном, существенных отличий в характеристике полученных белков от описанных в литературе выявлено не было (таблица 1).

щЁШшшгшт tmm мшт......i.'^ . -------¿¿ш&х------------•

Мол. масса 18,3 кД 21,2 22,7 кД 50,6 кД 36,0 КД 43 ,ъ КД

Кол-во аминокислотных 164 аа 192 аа 207 аа 465 аа 370 аа 409 аа

остатков

Изоэлектрическа я точка 7,26 10,55 6,50 5,87 9,37 6,01

Молярный 33480 9530 19540 32570 19770 38860

зкстинции

до™ 28,66% 26,04% 29,95% 34,41% 25,41% 25,16%

аминокислот

Доля «кислых» 7,93% 7,81% 10,14% 14,41% 8,11% 8,80%

Доля 7,93% 9,90% 8,70% 12,26% 10,27% 7,33%

32,93 26,56% 28,02% 30,11% 31,08% 32,03%

Дф0бНЪ1Х аминокислот 28,66% 32,81% 26,57% 23,44% 28,92% 33,74%

Склонность к Высокая Низкая Высокая Низкая Низкая Высокая

Локализация 6 Тельца Тельца Тельца Тельца [Цитоплазма Цитоплазма

бактериальной клетке включении включений включений включений

Подверженность «рефолдинг/» Низкая Низкая Низкая Высокая Не требуется Не требуется

Таблица 1. Физико-химические свойства летального токсина гигантских клеток, лейкотоксина и адгезинов ЕтаА и р1тА.

Получение моноспецифических сывороток.

Мы получили мышиные моноспецифические сыворотки к СОТ, ЬТХ, ЕтаА и РтА. Мышиные сыворотки к отдельным субъединицам летального токсина гигантских клеток, показали хорошую реакцию с гомологичными антигенами. Вестерн-блот, поставленный с цельным геном СОТ и субъединичными антителами, не выявил перекрестной реакции между различными субъединицами. Минимальные дозы токсина, выявляемые данной методикой, составили: 40 нг для Сск-А и Сск-С и 200 нг для Сс11>В (рис.7).

а) 6) а-СОТ-

кДа кДа А В С

66 — —»а

1 2 3 4 1 2 3 4

Рисунок 7. Вестерн-блот анализ мышиных сывороток, полученных к рекомбинантным антигенам СйТ, содержащим делецию МН2-концевого фрагмента.

а. Дорожка 1 содержит маркер молекулярной массы. Дорожки 2, 3 и 4 показывают реакцию сывороток анти-СОТ-А, анти-СОТ-В и анти-СОТ-С с гомологичными антигенами.б. Дорожки 2, 3, 4 демонстрируют реакцию анти-СОТ-А, анти-СОТ-В, анти-СОТ-С соответственно с препаратом очищенного токсического комплекса СОТ.

Нами были получены также сыворотки к иммунодоминантному фрагменту лейкотоксина и специфическим адгезинам ЕтаА, Р1тА. Сыворотки к данным белкам так же показали высокую специфичность в реакции с гомологичными антигенами. Титр полученных антител в иммуноблоте составил 1/1 ООО ООО.

Получение моноклональных антител к А субъединице СОТ. Благодаря помощи наших коллег (доктор Бровко Ф.А. и доктор А.О. Шепеляковская) из Пущинского филиала НИИ ИБХ РАН были получены четыре группы антител к Сс11-А токсина, три из которых относились к классу 1§0 (подкласс 1§С2) и одна - к ^М. Вестерн-блот анализ продемонстрировал

высокую специфичность полученных антител и отсутствие перекрестной реакции между МА и другими субъединицами токсина (Сс11-В и Сск-С). Так же были получены данные об избирательной способности МА класса ^М связываться с олигомерами С<К-А, а класса взаимодействовать с

мономерами (рис.9).

МА 3 МА 11 МА 12

0.1 мг/мл 0.1 мг/мл 0.1 мг/мл

50 Зр

Рисунок 9. Вестерн-блот анализ специфичности связывания анти-С(11-А моноклональных антител с С<И-А, С(И-В, СсП-С компонентами токсина гигантских клеток.

Реакция взаимодействия СсИ-А (р503), СсК-В (р511), СсП-С (р504) с моноклональными антителами (Мпс!3,Мпс1 11, Мпс1 12).

Полученные антитела не обладали протективным антитоксическим эффектом при их тестировании на культуре клеток. Это может быть связано с особенностями взаимодействия иммуноглобулинов с антигенными эпитопами, а также локализацией этих эпитопов в структуре токсина.

Разработка иммуноферментного метода для идентификации токсинов и адгезинов.

Завершающим этапом работы было создание иммуносерологической тест системы, направленной на выявление основных факторов патогенности А. асИпотусе1етсотиап5 или Р. gingivalis.

С этой целью нами были получены кроличьи сыворотки к СЭТ, ЬТХ, ЕтаА, Р1тА. Фракцию иммуноглобулинов выделяли при помощи колонок, содержащих протеин После чего, с антителами были созданы пероксидазные конъюгаты.

Для создания иммуносерологической тест-системы применялся «сэндвич» метод. Чувствительность данной методики составляла около 60 нг/мл для адгезинов FimA P.gingivalis и Erna A. actinomycetemcomiíans, но не превышала 1 мкг/мл для токсинов CDT и LTX. Возможной причиной низкой чувствительности метода может быть денатурация антигенов и их неэффективный рефолдинг. Однако, несмотря на это, разработанная система пригодна для выявления факторов патогенности A. actinomycetemcomiíans или Р. gingivalis в лабораторных условиях с целью дальнейшего изучения механизмов патогенности данных бактерий. Однако для создания более чувствительной методики требуется проведение дальнейших исследований.

ВЫВОДЫ.

1. Показано, что использование генно-инженерных технологий молекулярного клонирования и экспрессии генов токсинов и адгезинов A. actinomycetemcomiíans и Р. gingivalis в гетерогенном хозяине (£. coli) имеет явные преимущества по сравнению с выделением белков из нативных культур возбудителя в отношении уровня продукции веществ, простоты очистки и выхода очищенного соединения.

2. Установлено, что 5'-концевые нуклеотидные последовательности в генах Cdt-A, Cdt-B и Cdt-C, кодирующие фрагменты белков со свойствами сигнальных пептидов, снижают уровень специфичных мРНК в цитоплазме рекомбинантных экспрессирующих штаммов Е. coli и, тем самым, контролируют продукцию соответствующих веществ.

3. Выявлено, что нуклеотидные последовательности генов, кодирующих СООН-концевой фрагмент молекулы лейкотоксина A. actinomycetemcomiíans, а также адгезины Erna A. actinomycetemcomiíans и FimA Р. gingivalis демонстрируют высокий уровень экспрессии при клонировании в Е. coli. Полученные белки обладает высокой иммуногенностью при введении лабораторным животным и, в связи с этим, могут быть использованы в

качестве антигенов при получении специфичных сывороток и других иммунопрепаратов.

4. Полученные в настоящей работе рекомбинантные препараты токсинов и адгезинов A. actinomycetemcomitans и P. gingivalis по своим физико-химическим свойствам (молекулярная масса, склонность к SH-зависимой олигомеризации молекул) соответствуют сведениям описанным в литературе. Рекомбинантный токсин Cdt A. actinomycetemcomitans обладает типичной цитотоксической активностью и вызывает характерное увеличение размеров эукариотических клеток.

5. Получены поликлональные и моноклональные сыворотки к токсинам и адгезинам A. actinomycetemcomitans и P. gingivalis, которые обладают, по данным вестерн-блота, высокой активностью и эффективно реагируют с гомологичными антигенами, что указывает на возможность их использования в качестве компонентов диагностических систем.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Вертиева Е.Ю. Получение рекомбинантных белковых антигенов для диагностики локализованного агрессивного пародонтита, вызываемого Aggregatibacter actinomycetemcomitans. II Медицинский академический журнал 2010: труды научно-практической конференции. - 2010. - С.81-82.

2. Вертиева Е.Ю., Белый Ю.Ф. Разработка иммуно-серологической тест-системы для диагностики агрессивных форм пародонтитов, вызываемых Aggregatibacter actinomycetemcomitans и Porphyromonas gingivalis. II Молекулярная диагностика 2010: сборник трудов VII всероссийской научно-практической конференции с международным участием. - Москва. - 2010. -С.426-427.

3. Vertieva Ekaterina., Kobozev Michail, Tartakovskaya Dina, Araslanova Vera, Belyi Yuri. Genetic constructions, hyperexpressing recombinant fragments of cytolethal distending toxin of Aggregatibacter

actinomycetemcomitans. // World Journal of Microbiology and Biotechnology - Springer Science - 2010.

4. Белый Ю.Ф., Арасланова B.A., Вертиева Е.Ю. Бактериальные токсины: многообразие структур и мишеней.// 150 лет со дня рождения Николая Федоровича Гамалеи: сборник научных трудов - Москва. - 2010. - С. 79-91.

5. Вертиева Е. Получение рекомбинантных белковых антигенов для диагностики локализованного агрессивного пародонтита, вызываемого Aggregatibacter actinomycetemcomitans. // XVII Международная научная конференция «Ломоносов 2010» - Москва. - 2010. - С. 162.

6. Флуер Ф.С., Кудрявцева А.В., Прохоров В.Я., Котосова Л.К., Лазарева А.В., Вертиева Е.Ю. Влияние энтеротоксинов Staphylococcus aureus и epidermidis на течение атопического дерматита у детей.// Журнал Педиатрия. - 2009. - 87. -с.43-48.

7. Вертиева Е.Ю., Кобозев М.И., Белый Ю.Ф. Получение рекомбинантных белковых антигенов для диагностики тяжелых форм пародонтита, вызываемых Aggregatibacter actinomycetemcomitans.// II Ежегодный Всероссийский Конгресс по инфекционным болезням - Москва. -2009.-с. 62.

Подписано в печать: 20.10.11

Объем: 1 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ №732 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, Ленинградский пр-к, д.74, корп.1 (495) 790-47-77; www.reglet.ru

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Вертиева, Екатерина Юрьевна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Анатомия зуба. Анатомические изменения при пародонтите.

2. Этиопатогенетические теории развития пародонтитов.

3. Классификация пародонтитов.

4. Клиническая картина и лечение.

5. А. actinomycetemcomitans — основной возбудитель локализованного агрессивного пародонтита.

5.1. Таксономия.

5.2. Морфология.

5.3. Серологические свойства.

5.4. Факторы патогенности А. actinomycetemcomitans.

Летальный токсин гигантских клеток (CDT).

Лейкотоксин (LTX).

5.5. Роль биомолекул в патогенезе ЛАП.

6. Porphyromonas gingivalis — возбудитель генерализованной формы агрессивного пародонтита.

6.1. Таксономия.

6.2. Морфология.

6.3. Серологические свойства.

6.4. Факторы патогенности.

6.5. Роль биомолекул в патогенезе ГАП.

7. Взаимосвязь стоматологических и системных заболеваний.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Характеристика токсинов и адгезинов Aggregatibacter actinomycetemcomitans и Porphyromonas gingivalis – возбудителей агрессивных форм пародонтита человека."

В настоящее время проблемы, связанные со стоматологическими заболеваниями, остаются по-прежнему актуальными. Каждый год болезни этой группы поражают миллионы людей во всем мире. К наиболее встречающейся патологии в стоматологической практике относятся заболевания пародонта - морфофункционального комплекса тканей, удерживающего зуб в альвеоле. К ним относятся гингивиты, пародонтиты и пародонтозы. По статистике болезни пародонта являются наиболее частой причиной потери зуба. Неуклонный рост заболеваемости вызван отсутствием надежных методов диагностики и лечения. Получение новой информации об этиологии и патогенезе заболеваний пародонта способствовало бы решению этих задач. Именно поэтому, данная диссертационная работа посвящена изучению молекулярных факторов патогенности бактерий, вызывающих пародонтиты, в частности, их агрессивные формы.

Агрессивный пародонтит — это полиэтиологическое заболевание тканей пародонта, характерной особенностью которого, является быстрое возникновение необратимых изменений, приводящих к потере зуба. На данный момент известно, что возбудителями этого заболевания служат анаэробные бактерии Aggregatibacter асйпотусе1етсотИат и РогркуготопаБ gingivalis.

А. асНпотусе1етсотиат — грамотрицательная, анаэробная палочка, относящаяся к семейству Ра81еиге11асеае (74). Данный патоген вызывает локализованную формы болезни. Ей подвержены подростки и дети старшего возраста. Для заболевания характерна избирательная деструкция костной ткани, затрагивающая передние резцы и первые моляры (15, 73).

Р. gingivalis — грамотрицательная, анаэробная палочка, относящаяся к семейству РогрНуготопайасеае (14, 160). Микроб является основным возбудителем генерализованного агрессивного пародонтита. Характерным признаком этой формы заболевания является убыль костной ткани более 5 мм в области минимум восьми постоянных зубов. Генерализованным 5 агрессивным пародонтитом наиболее часто болеют люди в возрастной группе от 20 до 40 лет, реже подростки.

Исходя из современных воззрений о патогенезе инфекционных заболеваний, важнейшую роль в развитии микробной патологии могут играть адгезины, принимающие участие в прикреплении микроорганизма к колонизируемой поверхности, и токсины, нарушающие жизненно важные функции эукариотических клеток. В связи с- этим особый интерес представляют два токсина A. actinomycetemcomitans — лейкотоксин и летальный токсин гигантских клеток. Оба белка относятся к группе мало изученных соединений.

Лейкотоксин (LTX) является представителем, так называемого RTX (repeats in the structural toxin) семейства. Это порообразующий белок, оказывающий цитотоксическое воздействие на лимфоцитарные клетки (142). Токсин гигантских клеток (cytolethal distending toxin, CDT) — токсический белок, блокирующий митотический цикл эукариотической клетки. Доказано, что CDT обладает ДНКазной активностью. В результате расщепления двунитчатой ДНК летальный токсин гигантских клеток активирует каскад киназных реакций, которые завершаются апоптозом (129). Особая роль в патогенезе инфекций, вызванных A. actinomycetemcomitans, отводится белку EmaA. Это нефимбриальный адгезин, ответственный за прикрепление к компонентам внеклеточного вещества (201).

Ведущую роль в патогенезе инфекции, вызванной P. gingivalis, играют нефимбриальные адгезины и белки с токсической функцией. Прикрепление микроба осуществляется за счет фимбрий и многочисленных гемагглютининов. Однако основным адгезином является фимбриллин FimA — белок строго специфичный для штаммов P. gingivalis. Токсическую функцию выполняют протеиназы (Arg-X или Lys-X), а также фосфатазы, ДНКазы, РНКазы и другие белки (14).

Агрессивный пародонтит — серьезное заболевание, способное привести к необратимой потере зуба. Причиной отсутствия методов диагностики, б профилактики и лечения является недостаток информации об этиологии и патогенезе этой болезни. В связи с этим основной направленностью данной диссертационной работы стало изучение важнейших факторов патогенности возбудителей агрессивных форм пародонтита.

Цели и задачи.

В связи с этим нами были поставлены следующие задачи:

1. Клонирование генов и конструирование рекрмбинантных штаммов продуцентов токсинов CDT и LTX, адгезинов EmaA и FimA A. actinomycetemcomitans и P. gingivalis.

2. Выделение и очистка токсинов CDT и LTX, адгезинов EmaA и FimA A. actinomycetemcomitans и P. gingivalis.

3. Исследование физико-химических и иммуно-биологических свойств токсинов CDT и LTX, адгезинов EmaA и FimA.

4. Анализ механизмов экспрессии субъединиц цитолетального токсина гигантских клеток A. actinomycetemcomitans в гетерологичных системах.

5. Получение гипериммунных поликлональных и моноклональных сывороток к антигенам CDT, LTX, EmaA, FimA и оценка их эффективности, как компонентов иммуносерологических методов для выявления токсинов и адгезинов A. actinomycetemcomitans и P. gingivalis.

Научная новизна работы.

3. Клонирован ген, кодирующий фрагмент токсина Ltx A. actinomycetemcomitans, обладающий высокой иммуногенностью.

4. Впервые получены поликлональные моноспецифичные антитела к адгезинам A. actinomycetemcomitans и P. gingivalis и определены их специфичность и чуствительность.

5. Получены моноклональные сыворотки к субъединице А летального токсина гигантских клеток A. actinomycetemcomitans. С использованием вестерн-блота показано характерное взаимодействие этих антител с мономерными и олигомерными формами субъединиц токсина.

Практическое значение.

Созданы штаммы-продуценты и разработаны технологии получения препаративных количеств важных факторов патогенности A. actinomycetemcomitans и P.gingivalis — токсинов CDT и Ltx, а также адгезинов EmaA и FimA. Очищенные белки обладали высокой иммуногенностью, что указывает на возможность их использования в качестве компонентов вакцинных и иммунотерапевтических препаратов против агрессивных форм пародонтита.

С использованием выделенных белков были получены высокоспецифичные поликлональные и моноклональные сыворотки. В ходе исследования были получены данные о специфичности и чувствительности полученных антител. Антитела обладали высокой активностью и могут быть использованы для дальнейшей работы по выявлению белков в клиническом материале и культурах бактерий с целью дальнейшего изучения механизмов патогенности микробов А. асіїпотусеґетсотіїат и Р. gingivalis, а также разработки современных методов диагностики заболевания.

По результатам диссертации были подготовлены методические рекомендации «Создание штаммов-продуцентов токсинов Aggregatibacter асіїпотусеіетсотіїат для разработки методов диагностики и лечения агрессивных форм пародонтита», утвержденные на заседания Совета по внедрению научных достижений в практику ФГБУ «НИИЭМ им Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России от 22 сентября 2011 г., протокол №16.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Вертиева, Екатерина Юрьевна

выводы.

1. Показано, что использование генно-инженерных технологий молекулярного клонирования и экспрессии генов токсинов и адгезинов A. actinomycetemcomitans и Р. gingivalis в гетерогенном хозяине (Е. coli) имеет явные преимущества по сравнению с выделением белков из нативных культур возбудителя В' отношении уровня продукции веществ, простоты, очистки и выхода очищенного соединения.

3. Выявлено, что нуклеотидные последовательности генов, кодирующих СООН-концевой фрагмент молекулы лейкотоксина А. actinomycetemcomitans, а также адгезины Erna A. actinomycetemcomitans и Firn А Р. gingivalis демонстрируют высокий уровень экспрессии при клонировании в Е. coli. Полученные белки обладает высокой иммуногенностью при введении лабораторным животным и, в связи с этим, могут быть использованы в качестве антигенов при получении специфичных сывороток и других иммунопрепаратов.

4. Полученные в настоящей работе рекомбинантные препараты токсинов и адгезинов А. actinomycetemcomitans и Р. gingivalis по своим физико-химическим свойствам (молекулярная масса, склонность к SH-зависимой олигомеризации молекул) соответствуют сведениям описанным в литературе. Рекомбинантный токсин Cdt A. actinomycetemcomitans обладает типичной цитотоксической активностью и вызывает характерное увеличение размеров эукариотических клеток.

5. Получены поликлональные и моноклональные сыворотки к токсинам и адгезинам А. actinomycetemcomitans и Р. gingivalis, которые обладают, по данным вестерн-блота, высокой активностью и эффективно реагируют с гомологичными антигенами, что указывает на возможность их использования в качестве компонентов диагностических систем.

8. Заключение.

Стоматологические болезни являются одной из важнейших проблем медицины. Наибольшую опасность для людей представляют агрессивные формы заболеваний полости рта, в частности, агрессивный пародонтит. Заболевание быстро прогрессирует, характеризуется развитием необратимых изменений и приводит к потере зубов. Причиной этого является отсутствие методов профилактики, своевременной диагностики и специфического лечения.

Важнейшим условием для решения проблемы заболеваний полости рта агрессивного характера является получение детальной информации о факторах патогенности, продуцируемых А. асйпотусегетсотиат и Р. gingivalis. Это определило постановку цели настоящего исследования, включающей в себя детальное изучение свойств патогенетически-значимых белков возбудителей. При этом получение охарактеризованных белковых препаратов, а также высокоспецифичных сывороток явилось ключевыми задачами нашей работы.

Исходя из данных литературы наибольший интерес представляли два токсина, продуцируемых А. асйпотусе1етсотиап8: летальный токсин гигантских клеток и лейкотоксин, а также адгезины А. асИпотусе1етсот'йат и Р. gingivalis . Вышеперечисленные факторы, по-нашему мнению, играют ведущую роль в патогенезе заболевания и вызывают интерес ученых по всему миру.

Основной, проблемой связанной с токсинами, синтезируемыми А. actinomycetemcomitans, является сложность их получения и очистки. Подходы и методики получения рекомбинантных форм этих соединений в лабораторных условиях не найдены. Поиск причин, приводящих к отсутствию синтеза лейкотоксина и токсина гигантских клеток, позволят синтезировать эти белки в условиях in vitro. Полученные в ходе предстоящей работы очищенные препараты токсинов (CDT, LTX), адгезина ЕшаА A. actinomycetemcomitans и адгезина FimA P.gingivalis дадут возможность получить новые данные о функциях белков и пролить свет на их роль в патогенезе тяжелых заболеваний пародонта.

Полученные сыворотки будут использованы для выявления основных антигенов A. actinomycetemcomitans и P.gingivalis с целью их дальнейшего изучения. Создание иммуносерологических тест-систем на основе антител к факторам патогенности A. actinomycetemcomitans и P.gingivalis в дальнейшем будет способствовать ранней диагностике и профилактике агрессивного пародонтита и, как следствие, к снижению заболеваемости этим недугом.

Глава П. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Материалы.

1.1. Штаммы

Штаммы Производитель

Е. coli DH10B Life Technologies, США

Е. coli BL21 DE3 Stratagene, США

Е. coli BL21 Codon Plus Stratagene, США

В. megaterium WH320 Molecular Biologisch technologies, Германия

A. actinomycetemcomitans Y4 Университет Альберта-Людвига г. Фрайбург.

A. actinomycetemcomitans Sunny Университет Альберта-Людвига г. Фрайбург.

P. gingivalis W83 Университет Альберта-Людвига г. Фрайбург.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Вертиева, Екатерина Юрьевна, Москва

1. Aebi, C., Lafontaine E.R., Cope L.D., Latimer J.L. Phenotypic effect of isogenic uspAl and uspA2 mutations on Moraxella catarrhalis 03 5E// Infect. Immun. 1998. - Vol. 66. - p. 3113-3119.

2. Akifusa S., Heywood W., Nair S.P., Stenbeck G. Mechanism of internalization of the cytolethal distending toxin of Actinobacillus actinomycetemcomitansll J. Microbiology. — 2005. — Vol. 151. — p. 1395— 1402.

3. Almas K., Babay N. The prevalence and severity of localized juvenile periodontitis in a female Saudi population//.!. Odonto-Stomatologie Tropicale. 1999. - p. 1-4.

4. Amano A., Akamura T., Kimura S., Morisaki I. Molecular Interactions of Porphyromonas gingivalis Fimbriae with Host Proteins: Kinetic Analyses Based on Surface Plasmon Resonance// J. infection and immunity. 1999. -Vol.67 (5). - p. 2399-2405.

5. Amano A., Fujiwara T., Nagatal H., Kuboniwa M. Porphyromonas gingivalis Fimbriae Mediate Coaggregation with Streptococcus oralis through Specific Domains// J Dent Res. 1997. - Vol. 76(4). - p. 852-857.

6. Amano A., Kataoka K., Raj A., Genko RJ. Binding Sites of Salivary Statherin for Porphyromonas gingivalis Recombinant Fimbrillin// J. infection and immunity. 1996. - Vol. 64 (10). - p. 4249 - 4254.

7. Amano A., Kuboniwa M., Kataoka K., Tazaki K. Binding of hemoglobin by Porphyromonas gingivalis!IFEMS Microbiology Letters. — 1995. — Vol. 134 (l).-p. 63-67.

8. Amano A., Nakagawa I., Okahahi N. Variations of Porphyromonas gingivalis fimbriae in relation to microbial pathogenesis//Journal of Periodontal Research. 2004. - Vol. 39 (2). - p. 136-142.

9. Amano A., Sharma A., Lee J.Y., Sojar H.T., Raj P.A. Structural domains of Porphyromonas gingivalis recombinant fimbrillin that mediate binding to salivary proline-rich protein and statherin// J. Infect Immun. 1996. — Vol. 64(5).-p. 1631-1637.

10. Amano A., Sojar T., Lee J.-Y. Salivary Receptors for Recombinant Fimbrillin of Porphyromonas gingivalis// J. infection and immunity. — 1994. -Vol. 62 (8).-p. 3372-3380.and nonreversible insertion of Escherichia coli a-hemolysin into lipid

11. Andrian E., Grenier D., Rouabhia M. Porphyromonas gingivalis-epithelial cell interactions in periodontitis// J. Dental Research. 2006. - Vol. 85(5). — p. 391-403.

12. Armitage C. Development of a Classification System for Periodontal Diseases and Conditions//J. Ann. Periodontol. 1999. - Vol. 4(1). - p. 1-6.

13. Armitage G.C., Cullinan M.P. Comparison of the clinical features of chronic and aggressive periodontitis//.!. Periodontology. 2000. — Vol. 53. -p. 12-27.

14. Asahi Y., Noiri Y., Igarashi J., Asai H., Suga H., Ebisu S. Effects of N-acyl homoserine lactone analogues on Porphyromonas gingivalis biofilm formation// J. Periodontal Res. 2010 - Vol. 45(2). - p. 255-261.

15. Asakawa, R., Komatsuzawa H., Kawai T., Yamada S., Goncalves R.B. Outer membrane protein 100, a versatile virulence factor of Actinobacillus actinomycetemcomitansll J. Mol. Microbiol. — 2003. — Vol. 50. — p. 1125— 1139.

16. Avenaud P., Castroviejo M., Claret S., Rosenbaum J. Expression and activity of the cytolethal distending toxin of Helicobacter hepaticus//J. Biochem Biophys Res. 2004. - Vol. 318(3). - p.739-745.

17. Bakas L., Ostolaza H., Vaz W.L., Goni F.M. Reversible adsorptionand nonreversible insertion of Escherichia coli a-hemolisin into lipid bilayers//BiophysJ. — 1996.- Fol.71.-p. 1869-1876.

18. Barua P.K., Dyer D.W., Neiders M.E. Effect of iron limitation on Bacteroides gingivalis// Oral Microbiol Immunol. 1990. - Vol. 5(5). — p. 8 -263.

19. Bassler B.L., Wright M., Silverman M.R. Multiple signalling systems controlling expression of luminescence in Vibrio harveyi: sequence and function of genes encoding a second sensory pathway// Mol Microbiol. -1994. Vol. 13(2). - p. 273-286.

20. Burger S., Tatge H., Hofmann F., Genth H., Just I. Expression of recombinant Clostridium difficile toxin A using the Bacillus megaterium system// Biochem Biophys Res Commun. 2003. - Vol. 307(3). - p. 584588.

21. Burrows L.L., Lo R.Y. Molecular characterization of an RTX toxin determinant from Actinobacillus suis/fS. Infect. Immun. 1992. — Vol. 60. — p. 2166-2173.

22. Cao: L., Volgina A., Huang C., Korostoff J. Characterization of point mutations in, the cdtA gene of the cytolethal distending toxin of Actinobacillus actinomycetemcomitansHJ. Molecular Microbiology. — 2005. -Vol. 58 (5).-p. 1303-1321.

23. Casutt-Meyer S., Renzi F., Schmaler M., Jann N.-J. Oligomeric Coiled-Coil Adhesin YadA Is a Double-Edged Sword// PLoS. 2010. - Vol. 5 (12).- p. 151-159.

24. Ceelen L. M., Haesebrouck F., Favoreel H., Ducatelle R., Decostere A. The cytolethal distending toxin among Helicobacter pullorum strains from human and poultry origin// Veterinary Microbiology. 2006. - Vol: 113(1-2).-p. 45-53:

25. Cortelli J.R., Aquino D., Cortelli S. C. Etiological Analysis of Initial Colonization of Periodontal Pathogens in Oral Cavity// J. Clinical Microbiology. 2008. - Vol. 46(4). - p. 1322-1329.

26. Cortes-Bratti X., Chaves-Olarte E., Lagergard T. Cellular Internalization of Cytolethal Distending Toxin from Haemophilus ducreyi!! J. Infection and Immunity. 2000. - Vol. 68 (12). - p. 6903-6911.

27. Daep C. A., Lamont R. J., Demuth D. R. Interaction of Porphyromonas gingivalis with Oral Streptococci Requires a Motif That Resembles the115

28. Eukaryotic Nuclear Receptor Box Protein-Protein Interaction Domain// J. Infection and immunity. 2008. - Vol. 76 (7). - p. 3273-3280.

29. Darveau P. Periodontitis: a polymicrobial disruption of host homeostasis// Nature Reviews Microbiology. 2010. - Vol.8. - p. 481-490.

30. Das M., Badley A.D., Cockerill F.R., Steckelberg J.M. Infective endocarditis caused by HACEK microorganism//Annual Review of Medicine. 1997. - Vol. 48. - p. 25-33.

31. Davey M.-E., OToole A.G. Microbial Biofilms: from Ecology to Molecular Genetics // J. Microbiology and Molecular Biology Reviews. — 2000. Vol. 64(4). - p. 847-867.

32. De Lancey Pulcini E. Bacterial biofilms: a review of current research// J. Nephrologie. 2001. - Vol. 22(8). - p. 439-441.

33. Deng K., Latimer J. L., Lewis D. A., Hansen, E. J. Investigation of the interaction among the components of the cytolethal distendingtoxin of Haemophilus ducreyill J. Biochem Biophys Res. — 2001. Vol. 285. -p. 609-615.

34. Dinh T., Paulsen I.T., Saier M.H. A family of extracytoplasmic proteins that allow transport of large molecular across the outer membranes of Gramnegative bacteria//J. Bacteriol. 1994. - Vol. 176. - p. 3825-3831.

35. Dlakic M. Is CdtB a Nuclease or a Phosphatase?//!. Science. 2001. - Vol. 291.-p.547.

36. Dunny G.M., Leonard B.A. Cell-cell communication in gram-positive bacteria// Annu Rev Microbiol. 1997 - Vol. 51. - p. 527-564.

37. Elwell C. A., Dreyfus L. A. DNase I homologous residues in CdtB are critical for cytolethal distending toxin-mediated cell cycle arrest//J. Mol Microbiol. 2000. - Vol. 37. - p. 952-963.

38. Emody, L., Heesemann J., Wolf-Watz H., Skurnik M., Kapperud G. Escherichia coli cytolethal distending toxin CdtB subunit//J. Cellular Microbiology. 2004. - Vol. 6(5). - p. 447-458.

39. Falnes P. O., Sandvig K. Penetration of protein toxins into cells//J. Curr Opin Cell Biol. 2000. - Vol. 12. - p. 407-413.

40. Fine., Furgang D., Kaplan J., Charlesworth J. Tenacious adhesion of Actinobacillus actinomycetemcomitans strain CU1000 to salivary-coated hydroxyapatite// J. Infection and immunity. 1999. — Vol. 44(12). — p. 1063-1076.

41. Frisan T., Cortes-Bratti X., Chaves-Olarte E. The Haemophilus ducreyi cytolethal distending toxin induces DNA double-strand breaks and promotes

42. ATM-dependent activation of RhoA// Cellular Microbiology. 2003. - Vol. 10.-p. 696-707.

43. Frisk, A. The role of different protein components from the Haemophilus ducreyi cytolethal distending toxin in the generation of cell toxicity//.!. Microb. Pathog. — 2001. Vol. 30.-p. 313-324.

44. Fujimura S., Shibata Y., Hirai K. Nakamura T. Binding of Hemoglobin to the Envelope of Porphyromonas gingivalis and/Isolation of the Hemoglobin-Binding Protein // J. Infection and immunity. — 1996.- — Vol. 64 (6). p. 2339-2342.

45. Fujiwara T., Morishima S., Takahashi I., Hamada S. Molecular cloning and sequencing of the fimbrilin gene of Porphyromonas gingivalisstrains and characterization of recombinant proteins//J. Biochem. Biophys.

46. Res; Commun: 1993: - Voh 197. - p. 241-247.

47. Ge Z., Feng Y., Whary M.T., Nambiar P.R., Xu S. Cytolethal Distending Toxin Is Essential for Helicobacter hepaticus Colonization in'Outbred Swiss Webster Mice//J: Infection and Immunity. 2005. - Vol. 73 (6). - p. 35593567.

48. Ge Z., Schauer D.B., Fox J. G. In vivo virulence properties of bacterial cytolethal-distending toxin//Cellular Microbiology. 2008. - Vol. 10 (8). -p. 1599-1607.

49. Genco, C.A., Odusanya, B.M., Brown, G. Binding and accumulation of hemin in Porphyromonas gingivalis are induced by hemin// J. Infect. Immun. 1994. - Vol. 62. - p. 2885-2892.

50. Genko C.A. Regulation of hemin and iron transport in Porphyromonas gingivalisII Adv Dent Res. 1995. - Vol. 9(1). - p. 41-47.

51. Gmür R., McNabb H., van Steenbergen T.J., Baehni P., Mombelli A. Seroclassification of hitherto nontypeable Actinobacillus actinomycetemcomitans strains: evidence for a new serotype e // Oral Microbiol Immunol. 1993. - Vol: 8(2). - p. 116-120.

52. Goulbourne P.A., Ellen R.P. Evidence that Porphyromonas (Bacteroides) gingivalis Fimbriae Function in Adhesion to Actinomyces viscosusll J. Bacteriology. 1991. - Vol. 173 (17). - p. 5266-5274."

53. Griffen A.L., Becker R., Lyons R., Melvin L. Prevalence of Porphyromonas gingivalis and Periodontal Health Status// J. Clinical Microbiology. 1998. - Vol.36 (11). - p. 3239-3242.

54. Guerra L., Teter K., Lilley B.N., Stenerlow B. Cellular internalization of cytolethal distending toxin: a new end to a known pathway//J. Cellular Microbiology. 2005. - Vol. 7(7). - p. 921-934.

55. Guthmiller J.M., Lally E.T., Korostoff J. Beyond the specific plaque hypothesis: are highly leukotoxic strains of Actinobacillus actinomycetemcomitans a paradigm for periodontal pathogenesis?//Crit Rev Oral Biol Med. 2001. - Vol; 12(2). - p. 116-124.

56. Haghjoo E, Galán J.E. Salmonella typhi encodes a functional cytolethal distending toxin that is delivered into host cells by a bacterial-internalization pathway//Proc Natl Acad Sci USA.- 2004. Vol. 101(13). - p. 46144690.

57. Hamada N., Watanabe K., Sasakawa C., Yoshikawa M. Construction and Characterization of a fimA Mutant of Porphyromonas gingivalis// J. infection and immunity. 1994. - Vol. 62 (5). - p. 1696-1704.

58. Hamada S., Fujiwara T., Morishima S., Takahashi I. Molecular and immunological characterization of the fimbriae of Porphyromonas gingivalis// J. Microbiol Immunol. 1994. - Vol. 38 (12). - p. 921-930.

59. Han N., Whitlock J., Progulske-Fox A. The hemagglutinin gene A (hagA) of Porphyromonas gingivalis 381 contains four large, contiguous, direct repeats// J. Infect Immun. 1996. - Vol. 64(10). - p. 4000-4007.

60. Haraszthy V.l., Zambon J.J., Trevisan M., Zeid M. Identification of periodontal pathogens in atheromatous plaques// J. Periodontal. — 2000. -Vol. 71.-p. 1554-1560.

61. Haubek D., DiRienzo J. M., Tinoco M.B., Westergaard J. Racial Tropism of a Highly Toxic Clone of Actinobacillus actinomycetemcomitans Associated with Juvenile Periodontitis// Journal of Clinical Microbiology. — 1997. — Vol. 35 (12).-p. 3037-3042.

62. Havemose-Poulsen A., Holmstrup P. Factors affecting IL-l-mediated collagen metabolism by fibroblasts and the pathogenesis of periodontal disease: a review of the literature// Crit Rev Oral Biol Med. 1997. - Vol. 8(2).-p. 217-36.

63. Henderson B., Sean P., Ward M., Wilson M. Molecular pathogenicity of oral opportunistic pathogen Actinobacillus!I Annu.Rev.Microbiol. — 2003 -Vol.57.-p. 29-55.

64. Henderson B., Wilson M., Sharp L. Actinobacillus actinomycetemcomitans// J. Med. Microbiol. 2002. - Vol. 51 - p. 1013-1020.

65. Henderson, I. R., Nataro J.P. Virulence functions of autotransporter proteins//J.infect.Immun. 2001. - Vol.69. - p. 1231-1243.

66. Hendrixson, D. R., St. Gerne J.W. The Haemophilus influenza Hap serine protease promotes adherence and microcolony formation, potentiated

67. Heywood W., Henderson B., Nair S.P. Cytolethal distending toxin: creating a gap in the cell cycle//J Med Microbiol. 2005. - Vol. 54. - p. 207-216.

68. Higgins, C.F. ABC transporters: From micro-organisms to man//Annu. Rev. Cell. Biol. 1992. - Vol.8. - p. 67-113.

69. Hoiczyk E., Roggenkamp A., Reichenbecher M., Lupas A., Heesemann J. Structure and sequence analysis of Yersinia YadA and Moraxella UspAs reveal a novel class of adhesins//The EMBO Journal. 2000. - Vol. 19(22).- p. 5989-5999.

70. Holt S.C., Bramanti T.E. Factors in virulence expression and their role in periodontal disease pathogenesis//J. Crit Rev Oral Biol Med. — 1991. Vol. 2 (2).-p. 177-281.

71. Hu X., Nesic D., Stebbins S.E. Comparative Structure-Function Analysis of Cytolethal Distending Toxins// J. PROTEINS: Structure, Function, and Bioinformatics. 2006. - Vol. 62. - p. 421-434.1. A T

72. Hu X., Stebbins C.E. Dynamics and Assembly of the Cytolethal Distending Toxin//J. PROTEINS: Structure, Function, and Bioinformatics. 2006. -Vol. 65.-p. 843-855.

73. Hultgren S. J., Abraham S., Caparon M., Falk P. Pilus and nonpilus bacterial adhesins: assembly and function in cell recognition//Mol. Microbiol. 1993. - Vol. 37. - p. 192-206.

74. Inoshita E., Iwakura K., Amano A. Effect of Transferrin on the Growth of Porphyromonas gingivalis// J Dent Res. 1991. - Vol. 70(9). - p. 12581261.

75. Inoue T., Tanimoto I., Tada T., Ohashi T. Fermentable-sugar-level-dependent regulation of leukotoxin synthesis in a variably toxic strain of Actinobacillus actinomycetemcomitans// J.Microbiology. — 2001. — Vol. 147.- p. 2749-2756.

76. Isogai E., Hirose K., Fujii N., Isogai H. Three types of binding by Porphyromonas gingivalis and oral bacteria to fibronectin, buccal epithelial cells and erythrocytes // J. Archives of Oral Biology. 1992. - Vol. 37 (8). -p. 667-670.

77. J. Sambrook, E.F. Fritsch., T. Maniatis. Molecular cloning: A laboratory manual//Cold spring harbor laboratory press.- 1989.

78. Johnson W.N., Lior H. A new heat labile cytolethal distending toxin (CDT) produced by Escherichia coli isolated from clinical material// Microb Pathog. 1988. - Vol.4. - p. 103-113.

79. Johnson W.N., Lior H. A new heat labile cytolethal distending toxin (CDT) produced by Campylobacter spp/ZMicrob Pathog. — 1988. — Vol.4. — p. 115116.

80. Johnson W.N., Lior H. Production of Shiga toxin and a cytolethal distending toxin (CDT) by serogroups of Shigella sppll FEMS Microbiol Lett. 1987. - Vol. 48. - p. 235-238.

81. Kachlany S. C., Planet P. J., Bhattacharjee K., Kollia E. Nonspecific Adherence by Actinobacillus actinomycetemcomitans Requires Genes Widespread in Bacteria and Archaeall J. Bacteriology. 2000. — Vol. 182 (21).-p. 6169-6176.

82. Kachlany S.C., Fine D.H:, Figurski D.H. Secretion of RTX Leukotoxin by Actinobacillus actinomycetemcomitans// J. Infection and Immunity. — 2000. Vol. 68 (11). - p. 6094-6100.

83. Kadowaki T., Nakayama K., Okamoto K., Abe N. Porphyromonas gingivalis Proteinases as Virulence Determinants in Progression of Periodontal Diseases// JB Review J. Biochemistry. 2000. - Vol. 128. - p. 159-163.

84. Kagermeier S., London J. Actinobacillus actinomycetemcomitans Strains Y4 and N27 Adhere to Hydroxyapatite by Distinctive Mechanisms// J. Infection and immunity. 1985. - Vol. 47(3). - p. 654-658.

85. Kaplan B., Perry M.B., McClean L.L., Furgang D. Structural and Genetic Analyses of O Polysaccharide from Actinobacillus actinomycetemcomitans Serotype f // J. Infection and Immunity. 2001. - Vol. 69(9). - p. 53755384. '

86. Kaplan J. B., Schreiner H. C., Furgang D. Population Structure and Genetic Diversity of Actinobacillus actinomycetemcomitans Strains Isolated from Localized Juvenile Periodontitis Patients//!. Clinical Microbiology. — 2002. -Vol.40 (4).-p. 1181-1187.

87. Karamitsu H. K., Yoneda M., Madden T. Proteases and collagenases of Porphyromonas gingivalis// J. Adv Dent Res. 1995. - Vol: 9(1) - p. 37-40.

88. Karkelian D., Lear J.D., Lally E.T., Tanaka J.C. Characterization of Actinobacillus actinomycetemcomitans leukotoxin pore formation in HL60 cells// J. Biochim. Biophys. Acta. 1998. - Vol. 140(6). - p. 175-187.

89. Kawata Y., Hanazava S., Amano. S., Murakami' Y. Porphyromonas gingivalis Fimbriae Stimulate Bone Resorption In Vitro// J; Infection and immunity. 1994. - Vol. 62 (7). - p. 3012-3016.

90. Kinder S.A., Holt S.C. Characterization of Coaggregation between Bacteroides gingivalis T22 and Fusobacterium nucleatum T18// J. infection and immunity. 1989. - Vol.57 (11). - 3425-3433.

91. Koehler A., Karch H., Beikler T. Multilocus sequence analysis of Porphyromonas gingivalis indicates frequent recombination// J. Microbiology. 2003. - Vol. 149. - p. 2407-2415.

92. Kolenbrander P. K., Andersen R. N., Blehert D.S. Communication among Oral Bacteria// J. microbiology , and molecular biology reviews. — 2002, Vol. 66 (3). p. 486-505.

93. Kolenbrander P. E., London J. Adhere today, here tomorrow: oral bacterial adherence// J. Bacteriology. 1993. - Vol. 175(11). - p. 32473252.

94. Komatsuzawa H., Asakawa R., Kawai T., Ochiai K. Identification of six major outer membrane proteins from Actinobacillus actinomycetemcomitans // J. Gene. — 2002. — Vol. 288 (1-2). — p. 195-201.

95. Kroes I., Lepp P.W., Reiman D.A. Bacterial diversity within the human subgingival crevice//Proc Natl Acad Sci USA. 1999. - Vol. 96(25). - p.14547-14552.

96. Kuhnert P., Heyberger-Meyer B., Burnens A.P., Nicolet J., Frey J. Detection of RTX toxin genes in gram-negative bacteria with a set of specific probes// Applied and environmental microbiology. - 1997. - Vol. 63(6).-p. 2258-2265.

97. Kurita-Ochiai T., Fukushima K., Ochiai K. Butyric acid-induced apoptosis of murine thymocytes, splenic T cells, and human Jurkat T cells//J. Infect. Immun. 1997. - Vol. 65 (1). - p. 35-41.

98. Kurita-Ochiai T., Seto S., Suzuki N. Butyric Acid Induces Apoptosis in Inflamed Fibroblasts// J Dental Research. 2008. -Vol. 87(1). - p. 51-55.

99. Laemmli U.K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4//Nature.-.1970.- Vol. 227. 680-685.

100. Lafontaine, E. R., Cope L.D., Aebi C., Latimer J.L., McCracken G.H. The UspAl protein and a second type of UspA2 protein mediate adherence of Moraxella catarrhalis to human epithelial cells in vitro// J. Bacteriology. — 2000. Vol. 182. - p. 1364-1373.

101. Laine M.L., Appelmelk B.J., van Winkelhof A.J. Prevalence and distribution of six capsular serotypes of Porphyromonas gingivalis in periodontitis patients//J. Dental Research. 1997. - Vol. 76(12). - p. 18401844.

102. Laine M.L., van Winkelhof A. J. Virulence of six capsular serotypes of Porphyromonas gingivalis in a mouse model// J. Oral Microbiology and Immunology. 1998. - Vol. 13(5). - p. 322-325.

103. Lamont J., Howard F Jenkison. Life below the Gum Line: Pathogenic Mechanisms of Porphyromonas gingival is//Microb io logy and molecular biology reviews. 1998. - Vol. 62 (4). - p. 1244-1263.

104. Lamont R. J., Gil S., Demuth D. R., Malamud D. Molecules of Streptococcus gordonii that bind to Porphyromonas gingivalis// J. Microbiobgy. 1994. - Vol. 140. - p. 867-8720.

105. Lamont, R.J., Chan, A., Belton, C.M., Izutsu, K.T. Porphyromonas gingivalis invasion of epithelial cells// J. Infect. Immun. — 1995. Vol. 63. -p. 3878-3885.

106. Lara-Tejero M., Galán J.E. Cytolethal distending toxin: limited damage as a strategy to modulate cellular functions //J. Trends in Microbiology. 2002. - Vol. 10 (3). - p. 147-152.

107. Lara-Tejero M., Galan, J. E. A bacterial toxin that controls cell cycle progression as a deoxyribonuclease I-like protein// J. Science. 2000. - Vol. 290.-p. 354-357.

108. Lara-Tejero M.A., Galan J.E. CdtA, CdtB, and CdtC Form a Tripartite Complex That Is Required for Cytolethal Distending Toxin Activity//.!. Infection and Immunity. 2001. - Vol. 69(7). - p. 4358-4365.

109. Lee R. B., Hassane D. C., Cottle D. L.,Pickett C. L. Interactions of Campylobacter jejuni cytolethal distending toxin subunits CdtA and CdtC with HeLa cells//J. Infect Immun. 2003. - Vol. 71. - p. 4883^1890.

110. Lepine G., rProgulske-Fox A. Duplication and differential expression of hemagglutinin genes in Porphyromonas gingivalis/I J. Oral Microbiol Immunol. 1996. - Vol. 11. - p. 65-78.

111. Li X., Kolltveit K.M., Tronstad L., Olsen I. Systemic Diseases Caused by Oral Infection//J. Clinical Microbiology Review. 2000. - Vol. 13(4).-p. 547-558.

112. Linke D., Riess T., Autenrieth B., Lupas A. Trimeric autotransporter adhesins: variable structure, common function // Trends in Microbiology. — 2006. Vol. 14 (6). - p. 264-270.

113. Loesche J., Grossman S. Periodontal Disease as a Specific, albeit Chronic, Infection: Diagnosis and Treatment//.!. Clinical Microbiology. — 2001. Vol. 14(4). - p. 727-752.

114. Lord J.M., Roberts L.M., Robertus J.D. Ricin: structure, mode of- action, and some current applications// The FASEB Journal. — 2008. Vol.8.-p. 201-208.

115. Lu Q., Jin L., Darveau P.R., Samaranayake P: Expression of human (3-defensins-l and -2 peptides in unresolved chronic periodontitis//J. Periodontal Research. 2004. - Vol. 39 (4). - p. 221-227.

116. Mao X., DiRienzo J.M. Functional studies of the recombinant subunits of a cytolethal distending holotoxin// J. Cell Microbiology. 2002. -Vol. 4.-p. 245-255.

117. Max A. Listgarten. Pathogenesis of periodontitis// Journal of Clinical Periodontology. 1998. - Vol'. 13 (5). - p. 336-549.

118. McGhee J.R., Michalek S.M., Cassell G.H. Systemic disease: manifestations of oral bacteria// Dental microbiology. 1982. - p. 832-838.

119. McSweeney L.A., Dreyfus L.A. Nuclear localization of the Esherichia coli cytolethal distending toxin CdtB subunit//J. Cellular Microbiology. 2004. - Vol.6 (5). - p. 447-458.

120. Meghji S., Henderson B., Nair S., Wilson M. Inhibition of bone DNA and collagen production by surface associated material from bacteria implicated in the pathology of periodontal disease// J Periodontol. 1992. — Vol. 63(9) - p.736-742.

121. Mi-Hwa Jung, Jin-Woo Park, Jo-Young Suh, Jae-Mok Lee. Clinical -case report on treatment of generalized aggressive periodontitis of specificpathogenic bacteria. // J Periodontal Implant Science. — 2010. Vol. 40. - p. 249-253.

122. Mikolajczyk-Pawlinska J.,Pavloff N., Pemberton P. A. Genetic variation of Porphyromonas gingivalis genes encoding gingipains, cysteine proteinases with arginine or lysine specificity//Biological Chemistry. — 1998. -Vol. 379 (2).-p. 205-211.

123. Mintz, K. P. Identification of an extracellular matrix protein adhesin, EmaA, which mediates the adhesion of Actinobacillus actinomycetemcomitans to collagen//J. Microbiology. — 2004. — Vol. 150. — p. 2677-2688.

124. Moncla B. J., Braham P., Hillier S.L. Sialidase (Neuraminidase) Activity among Gram-Negative Anaerobic and Capnophilic Bacteria// J. Clinical Microbiology. 1990. - Vol. 28 (3). - p. 422-425.

125. Murakami Y., Iwahashi H., Yasuda H., Umemoto T. Porphyromonas gingivalis fimbrillin is one of the fibronectin-binding proteins // J. Infect. Immun. 1996. - Vol. 64 (7). - p. 2571- 2576.

126. Nagayama M., Sato M., Yamaguchi R., Tokuda C., Takeuchi H. Evaluation of co-aggregation among Streptococcus mitis, Fusobacterium nucleatum and Porphyromonas gingivalis// Letters in Applied Microbiology. 2001.- Vol. 33. -p. 122-125.

127. Nakamura S., Takeuchi A., Masamoto Y., Abiko Y. Cloning of the gene encoding a glycylprolyl aminopeptidase from Porphyromonas gingivalis II Archives of Oral Biology. 1992. - Vol. 37 (10). - p. 807-812.

128. Narayanan K., Nagaraja T., Chengappa M., Stewart C. Leukotoxins of gram-negative bacteria// J. Veterinary Microbiology. — 2002. — Vol. 84. — p. 337-356.

129. Nesic D., Hsu Y., Stebbins C. E. Assembly and function of a bacterial genotoxin// J. Nature. 2004. - VoK 429. - p. 429^33.

130. Nesic D., Stebbins S.E. Mechanisms of Assembly and Cellular Interactions for the Bacterial Genotoxin CDTII PLoS Pathog. 2005. - Vol. 1(3).-p. 28.

131. Nesterenko, M.V. A simple modification of Blum's silver stain method allows for 30 minute detection of proteins in Polyacrylamide gels / M.V. Nesterenko, M. Tilley, S J. Upton // Biochem. Biophys. Meth. 1994. -Vol. 28, №3. P. 239—242.

132. O'Brien-Simpson N. M., Paolini R.A., Hoffmann B., Slakeski N., Dashper S.G. Role of RgpA, RgpB, and Kgp proteinases in virulence of

133. Porphyromonas gingivalis W50 in a murine lesion model//J. Infect Immun. -2001.-Vol. 69(12).-p. 7527-34.

134. Offenbacher S. Periodontal diseases: pathogenesis//Ann Periodontol. — 1996.-Vol. 1 (l).-p. 821-878.

135. Ohara M., Oswald E., Sugai M. Cytolethal Distending Toxin: A Bacterial Bullet Targeted to Nucleus// J. Biochem. 2004. - Vol. - p. 409413.

136. Ohta H., Fukui K., Kato K. Effect of bicarbonate on the growth of Actinobacillus actinomycetemcomitans in anaerobic fructose-limited chemostat cultures// J Gen Microbiol. 1989. - Vol. 135. - p. 3485-3495.

137. Orth D., Grif K., Dierich M.P. Cytolethal distending toxins in Shiga toxin producing Escherichia coli: alleles, serotype distribution and biological effects// Journal of Medical Microbiology. 2006. - Vol. 55. - p. 1487-1492.

138. Otogoto J.-I., Kuramitsu H. K. Isolation and Characterization of the Porphyromonas gingivalis prtT Gene, Coding for Protease Activity// J. Infection and immunity. 1993. - Vol. 61 (1). - p. 117-123.

139. Parahitiyawa N.B., Jin L.J., Leung W.K., Yam W.C. Microbiology of Odontogenic Bacteremia: beyond Endocarditis//J. Clinical Microbiology Review. 2009. - Vol. 22( 1). - p. 46^64.

140. Paraje M.G., Eraso A.J., Albesa I. Pore formation, polymerization, hemolytic and leukotoxic effects of a new Enterobacter cloacae toxin neutralized by antiserum// J. Microbiological Research. 2005. - Vol. 160(2).-p. 203-211.

141. Park Y., McBride В. C. Characterization of the tpr Gene Product and Isolation of a Specific Protease-Deficient Mutant of Porphyromonas129gingivalis W83 // J. Infection and immunity. 1993. - Vol. 61 (10). — p. 4139-4146.

142. Parsek R., Greenberg E.-P. Acyl-homoserine lactone quorum sensing in Gram-negative bacteria: A signaling mechanism involved in associationswith higher organisms//PNAS. 2000. - Vol. 97(16) - p. 8789-8793.i

143. Passanezi E., Janson M., Janson G., Passanezi A. Interdisciplinary treatment of localized juvenile periodontitis: A new perspective to an old problem// Am J Orthod Dentofacial Orthop. 2007. - Vol. 131(2). - p. 268276.

144. Patrie R. Murray. Manual of clinical Microbiology/Murray P.R., Jo Baron E. -2003.-p. 1212.

145. Pérès S.Y., Marchés O., Daigle F., Nougayrède J.-P. A new cytolethal distending toxin (CDT) from Escherichia coli producing CNF2 blocks HeLa cell division in G2/M phase/ZMolecular Microbiology. 1997. - Vol. 24(5). -p. 1095-1107.

146. Perry M.B., MacLean L.L., Gmur R., Wilson M.E. Characterization of the O-polysaccharide structure of lipopolysaccharide from Actinobacillus actinomycetemcomitans serotype b// J. Infection and immunity. — 1996. — Vol. 64(4).-p. 1215-1309.

147. Pesci E.-C., Milbank B.J., Pearson P., McNight S. Biochemistiy Quinolone signaling in the cell-to-cell communication system of

148. Pseudomonas aeruginosa// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1999. — Vol. 96. — p. 11229-11234.

149. Pickett C.L., Pesci E.C., Cottle D.L., Russel G. Prevalence of Cytolethal Distending Toxin Production in Campylobacter jejuni and Relatedness of Campylobacter sp. cdtB Genes// J. Infection and Immunity. — 1996. Vol. 64 (6). - p. 2070-2078'.

150. PlanEak D., JorgiE-Srdjak K. New Classification of Periodontal Diseases // J. Acta Stomatol Croat. 2001. - Vol. 35 (1). - p. 89-93.ou

151. Potempa J., Pavloff N., Travis J. Porphyromonas gingivalis: a proteinase/gene accounting audit //J. Trends in Microbiology. 1995. - Vol. 3(11).-p. 430-434.

152. Poulsen K., Theilade E., Demuth R. Population structure of Actinobacillus actinomycetemcomitans : a framework for studies of disease-associated properties //Microbiology. 1994. - Vol. 140. - p. 2049-2060.

153. Pratt J. S., Sachen K.L., Wood H.D. Modulation of Host Immune Responses by the Cytolethal Distending Toxin of Helicobacter hepaticusll J. Infection and Immunity. 2006. - Vol. 74 (8). - p. 4496^1504.

154. Ranney R.R. Diagnosis of periodontal diseases// Adv Dent Res. -1991.-Vol.5.-p. 21-36.

155. Rav Tyagi S., Uhlinger J., Lambeth D., Champagne C. Altered Diacylglycerol Level and Metabolism in Neutrophils from Patients with Localized Juvenile Periodontitis//J. infection and immunity. — 1992. — Vol. 60 (6).-p 2481-2487.

156. Ren L., Jin L., Keung Leung W. Local expression of lipopolysaccharide-binding protein in human gingival tissues//J. Periodontal Research. 2004. - Vol. 39 (4). - p. 242-247.

157. Riess, T., Andersson S. G., Lupas A., Schaller M., Schafer A. Bartonella adhesin a mediates a proangiogenic host cell response// J. Exp. Med. 2004 - Vol. 200 (10). - p. 1267-1278.

158. Rosan B., Slots J1., Lamont R.J., Listgarten A. Actinobacillus actinomycetemcomitans fimbriae//Oral Microbiology and Immunology. — 2001.-Vol 3(2).-p. 47-96.

159. Rose, J. E., Meyer D.H., Fives-Taylor P.M. Aae, an autotranspoilerinvolved in adhesion of Actinobacillus actinomycetemcomitans to epithelial cells// J. Infect. Immun. 2003. - Vol. 71. - p. 2384-2393.

160. Rudek W., ' Haque R.-U. Extracellular Enzymes of the Genus Bacteroides// J. Clinical Microbiology. 1976. - Vol. 4 (5). - p. 458-460.

161. Rygus T., Hillen W. Inducible high-level expression of heterologous genes in Bacillus megaterium using the regulatory elements of the xylose-utilization operon// Appl. Microbiol. Biotechnol. — 1991. — Vol. 35. p. 594-599.

162. Saarela M., Asikainen S., Alaluusua S., Pyhâlà L. Frequency and stability of mono- or poly-infection by Actinobacillus actinomycetemcomitans serotypes a, b, c, d or e// Oral Microbiol Immunol.1992. Vol. 7(5). - p. 277-279.

163. Saiki K., Konishi K., Gomi T., Nishihara T., Yoshikawa M. Reconstitution and purification of cytolethal distending toxin of Actinobacillus actinomycetemcomitans!'/J. Microbiol Immunol. — 2001. — Vol. 45. p. 497-506.

164. Schauder S., Shokat K., Surette M.G., Bassler B.L. The LuxS family of bacterial autoinducers: biosynthesis of a novel quorum-sensing signal, molecule// J. Mol. Microbiol. 2001. - Vol. 41(2). - p. 463-476.

165. Schreiner H.C., Sinatra* K., Kaplan B., Furgang D. Tight-adherence genes of Actinobacillus actinomycetemcomitans are required for virulence in a rat model// Proc Natl Acad Sci USA.- 2003. Vol. 100 (12). - p. 72957300.

166. Sculley V., Langley-Evans C. Salivary antioxidants and periodontal disease status// J. Proceedings of the Nutrition Society. 2002. - Vol. 61. -p. 137-143.

167. Shao H., Lamont R.J., Demuth D.R. Autoinducer 2 Is Required for Biofilm Growth of Aggregatibacter (Actinobacillus)actinomycetemcomitansll J. Infection and Immunity. 2007. - Vol. 75(9). — p. 4211-4218.

168. Sheahan K.-L., Cordero C.L., Fullner Satchell K. Autoprocessing of the Vibrio cholerae RTX toxin by the cysteine protease domain// The EMBO Journal 2007. - Vol. 26. - p. 2552 - 2561.

169. Shibata Y., Hayakawa M., Takiguchi H., Shiroza T. Determination and Characterization of the Hemagglutininassociated Short Motifs Found in Porphyromonas gingivalis Multiple Gene Products// J. Biological Chemistry. 1998. - Vol. 274 (8). - p. 5012-5020.

170. Singer E.R., Buckner B.A. Butyrate and Propionate: Important Components of Toxic Dental Plaque Extracts// J. Infection, and Immunity. — 1981. Vol. 32 (2). - p. 458-463.

171. Slots J. Selective Medium for Isolation of Actinobacillus actinomycetemcomitans/7J. Clinical Microbiology. 1982. - Vol. 15 (4). — p. 606-609.

172. Slots J. Subgingival Microflora and Periodontal Disease//J. Clinical Periodontology. 1979. - Vol. 6. - P. 351-382.

173. Slots J., Ting M. Actinobacillus actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis in human periodontal disease: occurrence and treatment//! Periodontology. 1999. - Vol. 20(1). - p. 82-121.

174. Smith J. L., Bayles. The Contribution of Cytolethal Distending Toxin to Bacterial Pathogenesis//Critical Reviews in Microbiology. 2006. - Vol. 32(4).-p. 227-248.

175. Socransky S.S., Haffajee A.D., Goodson J.M., Lindhe J. New concepts of destructive periodontal disease// J Clin Periodontol. — 1984. — Vol. 11(1).-p. 21-32.

176. Sreenivasan P.K., Meyer D.H., Fives-Taylor P.M. Factors influencing the growth and viability of Actinobacillus actinomycetemcomitans//OvdX Microbiology and Immunology. — 1993. — Vol. 8(6). — p. 361-369.

177. St. Gerne J. W., Cutter D. The Haemophilus influenzae Hia adhesin is an autotransporter protein that remains uncleaved at the C terminus and fully cell associated// J. Bacteriology. 2000. - Vol. 182. - p. 6005-6013.

178. Stinson M.W., Safulko K., Levine M.J. Adherence of Porphyromonas (Bacteroides) gingivalis to Streptococcus sanguis In Vitro// J. infection and immunity. 1991. - Vol. 59 (1). - p. 102-108.

179. Sugai M., Kawamoto T., Peres Y., Ueno Y. The Cell Cycle-Specific Growth-Inhibitory Factor Produced by Actinobacillus actinomycetemcomitans Is a Cytolethal Distending Toxin// J. Infection and Immunity. 1998. - Vol. 66 (10): - p. 5008-5019.

180. Sundqvist G. Pathogenicity and virulence of black-pigmented gramnegative anaerobes// FEMS Immunol Med Microbiol. 1993. - Vol. 6 (2-3). -p 37-125.

181. Svensson L.A., Henning P., Lagergard T. The Cytolethal Distending Toxin of Haemophilus ducreyi Inhibits Endothelial Cell Proliferation// J. Infection and Immunity. 2002. - Vol. 70 (5). - p. 2665-2669.

182. Tang G., Kitten T., Munro C.L., Wellman G:C. EmaA, a Potential Virulence Determinant of Aggregatibacter actinomycetemcomitans in Infective Endocarditis// J. Infection and Immunity. 2008. — Vol. 76(6). - p. 2316-2324.

183. Tang G., Mintz K. P. Glycosylation of the Collagen Adhesin EmaA of Aggregatibacter actinomycetemcomitans Is Dependent upon the Lipopolysaccharide Biosynthetic Pathway// J. Bacteriology. 2010. - Vol. 192 (5).-p. 1395-1404.

184. Tang G., Ruiz T., Barrantes-Reynolds R. Molecular heterogeneity of EmaA, an oligomeric autotransporter adhesin of Aggregatibacter (Actinobacillus) actinomycetemcomitansH J. Microbiology. — 2007. — Vol. 153.-p. 2447-2457.

185. Tanner C. R., Paster B. J., Lu S. C. Subgingival and Tongue Microbiota durin early Periodontitis//! Dental Research. 2006. - Vol. 85 (4).-p. 318-323.

186. Taylor N.S., Fox J.G. Yan L. In-vitro hepatotoxic factor in Helicobacter hepaticus, H. pylori and other Helicobacter species!/1 Med Microbiol. 1995. - Vol. 42. - p. 48-52.

187. Thoden van Velzen S.K., Abraham-Inpijn L., Moorer W.R. Plaque and systemic disease: a reappraisal of the focal infection concept// J Clin Periodontol. 1984. - Vol. 11(4). - p. 209-220.

188. Thomas E. Van Dyke., Role of the Neutrophil in. Oral Disease: Receptor Deficiency in Leukocytes from Patients with Juvenile Periodontitis//Reviews of infectious diseases. — 1985. Vol. 7(3). — p. 419425.

189. Tokuda M., Chen W., Karunakaran T. Regulation of Protease Expression in Porphyromonas gingivalis/f J. Infection and immunity. — 1998. Vol. 66 (11). - p. 5232- 5237.

190. Tokuda M., Dunkan M., Cho M.-I., Kuramitsu K. Role of Porphyromonas gingivalis Protease Activity in Colonization of Oral Surfaces// J. Infection and immunity. 1996. - Vol. 64 (10). - p. 4067-4073.

191. Tomás I., Pereira F., Llucián R., Poveda R. Prevalence of bacteraemia following third molar surgery// Oral Diseases. — 2008. vol. 14(1). - p. 194.

192. Tonetti M.S., Imboden M.A., Lang N.P. Neutrophil migration into the gingival sulcus is associated with transepithelial gradients of interleukin-8 and ICAM-1// J Periodontology. 1998. - Vol. 69(10). - p. 1139-47.

193. Tonetti S., Mombelli A. Early-Onset Periodontitis//Annals of Periodontology. 1999. - Vol. 4 (1) - p. 39-52.

194. Travis J.,Potempa J. Porphyromonas gingivalis proteinases as virulence factors in the development of periodontitis// Journal of Periodontal Research. 1997. - Vol. 32 (1). - p. 120-125.

195. Ueno Y., Ohara M., Kawamoto T., Fujiwara T. Biogenesis of the Actinobacillus actinomycetemcomitans Cytolethal Distending Toxin Holotoxin//J.„Infection and Immunity. 2006. - Vol. 74(6). - p. 3480-3487.

196. Viallard J.-F., Bonnet S., Couzi L., Deminiere C. Glomerulonephritis caused by Actinobacillus actinomycetemcomitans mimicking c-ANCA-positive vasculitis// Nephrol. Dial. Transplant. 2002. - Vol. 17(4). - p: 663-665.

197. W.Wren., S.Tabaqchali. Restriction Endonuclease DNA Analysis of Clostridium difficile//JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY -1987.-Vol.25(12).- p. 2402-2404.

198. Winzer K., Hardie R., Burgess N., Doherty N., Kirke D. LuxS: its role in central metabolism and the in vitro- synthesis of 4-hydroxy-5-methyl-3(2H)-furanone //Microbiology. 2002. - Vol. 148. - p. 909-922.

199. Wohlfeil M., Tabakci O., Arndt R. Parameter on Aggressive Periodontitis// J Periodontol. 2000. - Vol.71. - p. 867-869.

200. Xavier K.B., Bassler B.L. LuxS quorum sensing: more than just a numbers game// Curr Opin Microbiol. 2003. - Vol. 6(2). - 191-207.

201. Yamada T., Komoto J., Saiki K., Konishi K. Variation of loop sequence alters stability of cytolethal distending toxin (CDT): crystalstructure of CDT from Actinobacillus actinomycetemcomitans // J. Protein Sci. 2006. - Vol. 15. - p. 362-372.

202. Yamada T., Komoto J., Saiki K., Konishi K., Takusagawa F. Actinobacillus toxin (CDT): Crystal structure of CDT from Variation of loop sequence alters stability of cytolethal distending// J. Protein Sci. 2006. -Vol. 15.-p. 362-372.

203. Yao E. S., Lament R. J., Leu S. P.,Weinberg A. Interbacterial binding among strains of pathogenic and commensal oral bacterial species //J. Oral Microbiology and Immunology. 1996. - Vol. 11 (1). - p. 35-41.

204. Yoshimura F., Murakami Y., Nishikawa K. Surface components of Porphyromonas gingivalisll Journal of Periodontal Research. 2008. — Vol. 44(1).-p. 1-140.

205. Yoshino Т., Laine M.L., van Winkelhof A. J., Dahl G. Genotype variation and capsular serotypes of Porphyromonas gingivalis from chronic periodontitis and periodontal abscesses//FEMS Microbiology Letters. — 2007. Vol. 270(1). - p. 75-81.

206. Yoshino T. Genotypic and phenotypic characterization, of P. gingivalis in relation to virulence// Department of oral microbiology. Institute of odontology. Goteborg 2007.

207. Young V.B., Knox K.A., Schauer D.B. Cytolethal Distending Toxin Sequence and Activity in the Enterohepatic Pathogen Helicobacter hepaticusll J. Infection and Immunity. 2000. - Vol. 68 (1). - p. 184-191.

208. Yu C., Ruiz Т., Lenox C., Mintz P. Functional Mapping of an Oligomeric Autotransporter Adhesin of Aggregatibacter actinomycetemcomitansH J. Bacteriology. — 2008. — Vol. 190 (9). — p.3098-3109.

209. Yuan A., Yang P.S., Lee L.N., Chang D.B. Actinobacillus actinomycetemcomitans pneumonia with chest wall involvement and rib destruction//CHEST. 1992. - Vol. 101.-p. 1450-1452.

210. Zambon J.J., Christersson L. A., Genco R.G. Diagnosis and treatment of localized juvenile periodontitis// Journal of the American Dental Association. 1986. - Vol. 113 (2). - p. 295-299.

211. Афанасьев Ю.И., Юрина H.A., Котовский Е.Ф. Гистология/ Под ред. Афанасьева Ю.И. М.: Медицина, 2002. - 744 с.

212. Безрукова И. В., Грудянов А.И. Агрессивные формы пародонтита/ Безрукова И. В. — М.: Медицинское информационное агентство, 2002. 127 с.

213. Мюллер Х.-П. Пародонтология/ Ханс Петер Мюллер. — М.: ГалДент, 2004. 256 с.

214. Сапин М.Р., Никитюк Д.Б., Ревазов B.C. Анатомия человека/Под редакцией М.Р. Сапина. М.: Медицина, 2001. - 640.

215. Улумбекова Э.Г., Челышева Ю.А. Гистология/ Под ред. Улумбекова Э.Г., Челышева Ю.А. М.: ГЭОТАР-МЕД, 2001. - 672 с.

Информация о работе

Вертиева, Екатерина Юрьевна
кандидата медицинских наук
Москва, 2011
ВАК 03.02.03

Диссертация

Характеристика токсинов и адгезинов Aggregatibacter actinomycetemcomitans и Porphyromonas gingivalis – возбудителей агрессивных форм пародонтита человека. - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы