Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика токов потенциалозависимых кальциевихканалов мембраны секреторных клеток

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика токов потенциалозависимых кальциевихканалов мембраны секреторных клеток"

КИЇВСЬКИЙ УНШЬРСЯТЕТ імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

РГ6 од

На правах рукопису

і з і;іон Ш5

МАНЬКО Володимир Васильович

УДК 612.014.1?:612.31

ХАРАКТЕРИСТИКА СТРУМІВ П(УГШ(ІАЛ03ЛЛШШ КАЛЬЦІЄВИХ КАНАЛІВ №ШРАШ СЕКРЕГОРІІНХ КЛ1ТНН

03.00.13 - фізіологія людини і тварин

Автореферат на здобуття наукового ступеня кандидата біологічні« наук

№

К

Київ - 1995

Дисертаційні в рукопис Робота виконана на кафедрі фізіології людини і ів.ірнн Львівською Рівного уніиеіклпету ім. Івана Франка

Науковий керівник:

доктор біологічних наук

М.Ю.Клевець

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор доктор медичних наук, професор

Д.Г.Наливайко

В.К.Рибальченко

Провідна установа - •

Інститут біоорганічної кімії та нафтохімії НАН Україні!

Захист дисертації відбудеться "3_" лицкд ІОЗ^Гр.

о іуво годині на засіданні спеціаліаованої вченої ради Д.01.01.10 при Київському університеті ім. Тараса Шевченка

Адреса: 2БС0Й2, Киій-22, ьул. Гдушкгжа, 2

З дисертацією можна 'ознайомитись' у бібліотеці Київського університету ім. Тараса Шевченка, м. Київ, вул.' Володимирсь-ка, 60 .

Автореферат розісланий '¿О" Тра.&*ІА 199£р.

Вчений секретар

спеціалівопаної вченої ради

о+

Актуальність проблеми. Дослідження ролі Са" як вторинного посередника у нейро-гуморальній регуляції секреторного процесу є актуальною проблемою сучасної фізіології. На сьогодні відомо, що іони Са2+ беруть участь у активації секреції клітинами травних залоз. Причому, в спряженні стимул- секреція оере участь як внутрішньоклітинний, так і зон-нішньоклітинний Са21- (Hokin, 1966-, Schulz, 1975; Petersen, Ueda, 1076; Kanno, Mishimura, 1976; Yoshida, Kanno, 1087; Гринькив, Клевец, Шостакопская, 1988; Дубинь кий, Шостаковсь-ка, 1Ö-J2; Шевчук, Магура, 1992), Проте питання про шляхи проникнишя іонів Са21 в міжклітинного середовища через плазматичну мембрану залишається невирішеним.

Магура і співроб. (1987) вважають, що збудники секреції викликають активацію хемочутливич. кальцієвих каналів секреторних клітин шлунку ссавців. Згідно даних інших дослідників (Maruyaina, Petersen, 198Ü; Наливайко, Чепилко, 1988) ватиіиве значення у проникненні Оа2*- в ацинарні клітини підшлункової залози мають малоселективні Ca-провідні і«шлди для монова-леніних катіонів. На підставі пригнічення секреції амілази клітинами диспергованих анинусів підшлункової залози верзла-мілом і Мп2+ і стимуляції її гіперкадієвою деполяризаціє:*» постулюється наявність потенціалозавежни:; кальцієвих каналів у мембрані цих клітин (Гринькив. Клевец, Шосгнковская,

1988). Вільга вагомі докази цього отримано на основі дослідження амін tCa2+]B під впливом гіперкалієвої деполяризації, які реєстрували 8а допомогою екворину (Persliaclsirigh et al.»

1989). Але поки що тільки через мембрану клітин слинної ва-лози личинки хірономуса зареєстровано струм потенціаловалеж-иих кальцієвих каналів (Клсвец, Гураль, 1909), дослідженим

_ о _

характеристики якого і присвячена дана робота.

Мета і завдання досліджень. Мета роботи полягала в комплексному дослідженні струмів потєнціалозалежних кальцієві« каналів мембрани клітин слинної залози личинки СЬігопоіпиз р1итозіі5 І., на підставі чого можна з’ясувати властивості і структурно-функціональну організацію цих каналів. Для досягнення мети необхідно було: 1; встановити умови оптимальної реєстрації струмів через інтактні кальцієві канапи; 2) з’ясувати потеиціалооалежність, фармакологічну чутливість, залежність від рівня внутрішньоклітинного метаболізму, рН і температури середовища амплітуди струмів, кінетичні параметри їх інактивації та селективні властивості Інтактних каналів; 3) вияснити здатність кальцієеих каналів модифікуватися у беакальцієвому середовищі під впливем Са-«зв'язуючих речовин та селективність модифікованих глна-лів;.4) дослідити залежність амплітуди струмів через досліджувані канали від натрієвого градієнту.

Наукова новизна отриманих даних. Методом фіксації потенціалу на мембрані вперше проведено всебічне дослідження струму пот?ні’іаію«ал‘;жних кальцієвих канал іе мем5ргня секреторних клітин, в результаті чого отримано такі нові факти: 1) функціональний стан даних кальцієвих каналів контролюється адеиілагциклаоною системою; 2) інтактні кальцієві канали цих клітин пропускають крім Са2+ деякі інші двовалентні катіони (Ва?+ і Бг"*') і блокуються Ьа3+, Мі2+, ' Ссі2+ та 2пг+;

3) дані канали практично непроникні для одновалентних катіонів; у безкальціввому переповиті із додаванням різних Са~вв'язуючих речовин вони стають проникними для одновалентних катіонів, при цьому вберігається їх метаболічна залежність; 4) кінетика інактивації інтегральних струмів через

інтактні кальцієві канали секреторних клітин є струмоаалеж-ною і майже не залежить від типу проникаючого катіона; інактивація ЦЦТА-індукованого натрієвого струму вберігається, хоча дещо і сповільнюється;. 5) амплітуда струмів черев кальцієві канали залежить від наявності натрієвого градієнту, що свідчить про функціональний зв'язок каналів і На-Са-обмінного механізму. .

На основі результатів власних досліджень і даних літератури запропоновано модель стуктурно-функціональної організації потенціадоаалежного кальцієвого каналу мембрани секреторних клітин слинної залози личинки хірономуса та його зв'язку в Ма-Са-обмінником. Крім того, теоретично обгрунтовано можливість реєстрації струму №-Са-обміну мембрани секреторних клітин у відповідь на гіперполяризацію мембрани і єкпериментааьно його зареєстровано.

Науково-практична цінність роботи. Отримані дані аначно розширюють уявлення про властивості і структурно-функціональну організацію потеиціалоаапелших кальцієвих каналів мембрани секреторних клітин, залежність їх функціонування від клітинного метаболізму і Иа-Са-обміну. Це може стати теоретичним обгрунтуванням медико- клі нічних досліджень з метеш розробки методів корекції секреції травних ферментів.

Апробація роботи. На основі матеріалів дисертації були зроблені доповіді: на П з'їзді фізіологів Західного регіону України (1993 р., Львів); ва 1-му а'ївді Українського біофізичного товариства (1994 р., Київ), на XIV з'їзді Українського фізіологічного товариства (1994 р., Львів-Київ), ва «щорічних наукових конференціях Львівського університету (1993-1395 рр., Львів), ва засіданні кафедри фівіояогії людини і гварин Львівського університету в листопаді 1994 р.

' - 4 “ . .

Матеріали дисертації висвітлені у >3 публікаціях. Структура дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису об’єкта і методів досліджень, викладення отриманих реьультатів та іх обговорений, висновків і списку літератури (256 назв). Робота викладена на 1Й4 сторінках, містить 8 таблиць та ілюстрована 21 малюнком.

Декларація особистого внеску дисертанта. Робота виконана дисертантом повністю і самостійно.

ОБ'ЄКТ І-МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ Досліди проведені на івольованих за допомогою мініатюрних ріжучих інструментів клітинах слинної аалови личинки хі-рономуса а використанням методу фіксації потенціалу в умовах внутрішньоклітинної перфуаіі. Розчин для внутрішньоклітинної перфувії був такого складу (ммоль/л): тріс.-СІ - 146,14, НаСІ

- 16, АТФ - 1,0, МгС12 - 2,0, ЕГТЛ - 0,1, глюкова 5,55; pH

7,0. Вихідний еовніщньоклітинний розчин містив (ммоль/л): НаСІ - 136,9, КС1 - 5,55, СаС12 - 1,76, Ме304 0,49, МєС12

- 0,46, МагНР04 - 0,35, КИ2РО4 - 0,44, глюкоаа 5,55; pH 7,2. В йоді досліджень-використовували ріані модифікації цж розчинів. МІІ контролювали за допомогою універсального вольтает-ра В7-16. Для деиоляриваційних зміщень МП використовували прямокутні імпульси тривалістю 1,5 - 3,5 с. Струми, що виникали у відповідь на деполяризацію або гіперполяризацш мембрани, підсилювали за допомогою підсилювача УВІІ2-03 і подавали на вхід цифрово-аналогового перетворювача електрокардіо-метра ЕКМ-01, лким і вимірювали іх амплітудні і часові параметри. Результати досліджень опрацьовували за загальновизнаними статистичними методиками. Для розрачунків використовували програми для персональних комп'ютерів.

- 5 -

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

1. Характеристика інтегрального потенціалояажтюго . кальцієвого ігфуму мембрани секреторних luii-nm

Перші вимірювання Іса (Клєвец, Гураль, WQ9) провадились при наявності тільки кальцієвого градієнту. В рег-льта-ті иааих досліджень з'ясувалось, що при наявності фенологічних концентрацій Na4 і Саг+ через мембрану клітин слинної залози реєструється значно більший струм. Оскільки концентрація СІ ' є зрівноваженою, цей струм може створюватись Са?+ або Na+. Внаслідок егаїімолярної заміни зовніиньоклітинного На+ на холін+ ампітуда зареєстрованого струму практично не змінювалась, а внаслідок заміни на сахарозу - вменшувалась. Тому усі наступні дослідження ми провадили при наявності натрієвого градієнту або при заміні NaCl на холін-С1.

В ході досліджень з'ясувалось, що амплітуда Іса клітин верхньої і нижньої долей залози є різною. Густина струму клітин верхньої долі більша і становить 1,17*0,12 х ю~6 А/см2, а клітин нижньої долі - 0,88і0,08 х 10_е А/сіл''. Отже, амплітуда Іса клітин верхньої долі залози є більша, що може бути вумовлено або більшою густиною кальцієвих каналів,• або ж- вищою їх провідністю.

У зв'язку 8 виявленими відмінностями ми провели дослідження ВАХ Іса клітин обидвох долей залози. Виявилося, що пороги активації Іса клітин нижньої і верхньої долей залози лежать негативніше -60 мВ. Збільшення амплітуди Іса клітин верхньої долі внаслідок подальшої деполяризації мембрани є значнішим, ніж клітин нижньої долі залози, і максимальний значення він досягає при ТП -20 мВ (0,78±0,08 нА), після чого зменшується. У той же час амплітуда Іса клітин нижньої долі залози стас максимальною при ТП -10 мВ (0,63±0,03 нА),

. ’ - 6 - ■ після чого теж зменшується. Отже, максимум ІСа клітин верхньої долі аміщений відносно максимуму ІСа клітин нижньої долі валоаи на 10 мВ у негативний бік.

ІмА

ІнЛ

0,5 с

Мал. 1, Зміна амплітуди Іса «клітин нижньої (А) і верхньої (Б) А долей залози під впливом введення в клітину цАМФ, АТФ і Mg2+.

1 - ІСа У контролі; 2 - Іса Після додавання до внутрішнього Б розчину суміші цАМФ, АТФ і Mg2+. ФП - ‘-60 мВ, ТП - -10 мВ.

Кальцієві канали клітин верхньої і нижньої долей валоаи відрізняються 1 метаболічною залежністю (мал. 1). Внаслідок додавання до внутрішнього розчину необхідної для запуску і підтримання цАМЕ~ залежного фосфорилювания регуляторних доменів каналів суміші (цАМ$ - Ю""4 моль/л, АТФ - 2 ммоль/л, Mgz+ - 3 ммоль/л) на клітинах нижньої долі слинної валози спостерігалось збільшення Іса на 84,28±24,89 %. Контрольне введення у клітинний перфузат тільки цАМФ викликало незначне зростання Іса на ¿1,3б±8,97 X. Отже, кальцієві канали клітин нижньої долі залози мають виражену метаболічну залежність.

При введенні цієї ж суміші у клітини верхньої долі залови спостерігається зменшення амплітуди Іса на 16,51* 2,62 X. Контрольне введення тільки uAMD призвело до вменшеная струму на 10,0412,23 Z. ■ .

Наступні дослідження ми провели на клітинах нижньої долі валоаи, оскільки кальцієві канали цих клітин мають вира-

жену метаболічну залежність. Амплітуда lea них каналій (1U -10 мВ) зменшувалася внаслідок дії на зовнішню поверхню мембрани 10'4 моль/л верапамілу на 53,8016,14 7., а 10'6 моль/л нітрендипіну - на 33,05±4,Й1 %. Отже, кальцієві канали досліджувати клітин о помірно чутливими до органічних блокаторів кальцієвих каналів L-типу збудливих мембран. Помірне зменшення амплітуди Іса ми отримали і при додаванні до зовнішнього розчину у концентрації 5 ммоль/л полівалентих катіонів. При додаванні La3+ амплітуда Іса при ТП -гО мВ вменшувалась на 53,28+5,41 І, Niz+ - на 49,56*5,42 %, Cá2+ -на 47,63+5,03 %, Zn2+ - на 38,40±3,42 %, а при додаванні Ва2+ - зменшення (7,58+4,72 %) було статистичио недостовірним. При закисленні середовища до рН 4 амплітуда Іса (ТП -10 мВ) вменшувалась на І4,76±2,88 X, що свідчить про наявність канальних фіксованих зарядів і про роль взаємодії проникаючих іонів а ними. Зниження температури на 10°С виникає зменшення амплітуди Іса на 28,52±2,68 %. Qio становить 1,42+0,05, а енергія активації - 24 кДж/моль, ідо свідчить про невисоку температурну залежність Іса та низький енергетичний бар’єр кальцієвих каналів цих клітин.

•Крива стаціонарної інактивації (мап. 2) задовільно описується рівнянням: h» '

ни досліджуваних клі- вації Іса клітин нижньої долі слин

тин є незначна кру- ної валози. ТП - -25 мВ.

h - (і + exp ((Ym - 1-0

кою риссю Іса мечбра- Мал. 2. Крива стаціонарної іпакти-

■ ; - . е . тість наростання стаціонарної інактивації із деполнризацій-иим зміщенням фіксованого МП. .

2. Порівняння інтеграіьииж струмів двовалентних катіонів * .

через іютенціиоаалемиі кальцієві канали

При дослідженні ВАХ Іва і І$г через кальцієві канали мембрани клітин нижньої долі залози замінювали фізіологічну

Май. 3. Порівняння ВАХ 1в^(1), Isr(2) та ІСа(З) клітин нижньої долі залози. Концентрація проникаючого іона 1,76 ммоль/л. ФІ1 --65 мВ.

концентрацію СаСІг У зовнішньому розчині, шр не містив інших двовалентних катіонів, на еквімолярну кількість BaClg або БгСІг. З’ясувалося, ідо I&d є близький за амплітудно-часовими параметрами до Іса- Співвідношення Іва і Іса. ШР розвиваються при вміщенні МИ’від -66 до -55 мВ, становить 1,29*0,19. Крутість вростання Іва (мал. 3) при подальших деполяризацій-них вміщеннях МЛ є більшою за крутість зростання І&а- Максимум ВАХ Іва припадає на -35 мВ (0,38*0,05 нА), а 1са - на -25 мВ (0,32*0,03 нА). Крутість зменшення амплітуди .Іва при деполяризуючому вміщенні МП після її максимального значення е більшою, нік Іса» а при ТП +5 мВ середне значення амплітуд сбидвох струмів становить 0,12*0,04 нА. Оме, ВАХ Іва цих клітин, як і збудливих клітин (Byрий, Гордиенко, Шуба,

1989), всунута в бік негативніших значень МП, що може бути

1 9 - .

зумовлено як зміною поверхневого потенціалу внаслідок нерівнозначної заміни Са?+ на Ва2+, так і наявністю в мембрані каналів в рівною селективністю..

Амплітудно-часові параметри Гдг і Іса в теж близькими. Крутість зростання амплітуди Isr (мал. 3) внаслідок збільшення ступеня деполяризації мембрани є дещо більшою, . ніж Гса- Максимуми ВАХ обидвох струмів вбігаються 1 припадають на -25 мВ, а достовірної різниці між амплітудами Іса (0,30*0,04 нЛ) і Isr (0,30±0,05 нА) при цьому немае. Крутість зменшення Іся і Isr внаслідок подальших деноляризуючих вміщень МП є приблиано однаковою, хоча існує певна тенденція до перевищення амплітуди Isr- Таким чином, ВАХ Isr і ка є близькі між собою. . ■

Селектвність. Оскільки струми реверсії через інтактні кальцієві канали не можна зареєструвати (Дорошенко и др., 1970), встановлення їх відносної проникності для Ва2+ і Sr2+ здійснювали порівнянням пікових вивчень амплітуд Іва і Isr та Іса при ТП, що відповідає максимумам їх ВАХ. В результаті обчислень виявилось, щр- співвідношення Іва : Іса при маїази-мумах ВАХ становить 1,24*0,07, a Isr • Іса - 1,0В+0,05. Отримані дані дозволяють стверджувати, що в основі проведення двовалентних катіонів через досліджувані канапи лежить їх взаємодія з внутрішньоканальним Са-зв'язуючим центром.

Часові параметри інактивації. В ході вимірювань з'ясувалось, що інактивація Іса. Іва та Isr при різних значеннях ТП у всіх досліджених випадках (п > 112) задовільно апрокей-мується ОДНОЮ експонентою . 8 сталою часу (th) в мєжех він 0,6 до 2 с. Виявилось також, що достовірної рівниці між кінетикою інактивації Іса і Іва чи Isr немає. Лише th Isr статистично вірогідно перевищує th Ico при максимумах їх ВАХ. Для

- 10 -

Іва аналогічної закономірності виявити не вдаюсь.

Встановлено також, ідо для Іса характерна тенденція до зростання Хн в обидва боки від значення Мїї, ідо відповідає максимум1/ ВАХ. Це вказує на можливість існування зв'язку між амплітудою Іça та Його інактивацією, про що свідчить і коефіцієнт кореляції між піковими значеннями амплітуди Іса і хь (г - -0,67, п - 56). Струмозалежність може бути зумовлена наявністю Са-залежного механізму інактивації (Eckert, Chad,. 1986). Проте цьому суперечить залежність Tj, Іва і Isr від пікових вначень амплітуд цих струмів - кофіцієати кореляції становлять відповідно -0,68 (п - 24) і -0,63 (п - 02). А для Са-залежного механізму інактивації залежність q-, !ьа і Isr від їх амплітуди є нехарактерною (Eckert, Chad, 1986). Тобто, вгідно наших даних у досліджуваних каналах немає Са-залежного механізму інактивації, аналогічного такому, що є у кальцієвих каналах збудливих клітин.

3. Модифікація кальцієвих каналів в безкальціешшу середовищі з додаванням Са-ав’язукчих речовин

Внаслідок проьедення однофактарного дисперсійного аналізу виявилося, що амплітуда Іса статистично достовірно залежить від [Са2+За ь межах від 0,1 до 1,76 ммоль/л. При подальшому збільшенні ССа2+]3 (до 5 ммоль/л) спостерігається неістотне зростання Іса. що свідчить про насичення, в основі якого лежить взаємодія Са2+ з певними канальними структурами. Якщо до зовнішнього розчину не додавали Са?+ і не використовували Са-зв’язуючі речовини, то тільки у 3 клітинах в 7 вхідний отрум був відсутній. Оберекення вхідного струму у решти клітин можна пояснити- або наявностю слідів Са2+ у зов-нівньоиу ровчині, або ж появою за цих умов струму іншої іон*

НОІ Природи.

Для перевірки останнього припущенна до зотиі'ші.ого розчину бен двовалентних катіонів додаванії її ммоль/л ВДТА. Ири наявності лишк натрієвого градієнту реєструвався вхідний струм, який «а кінетикою близький до Іса> а sa амплітудою перевищував ного у 2,2?Ю,й6 рази. При заміні у зовнішньому . розчині половини На’ па катіони тріо*' амплітуда струму ¡чмен-шукалась на 5?, 41 «-й, 12 %-, коли позаклітинний розчин ііс містив На*, струм був відсутній. Амплітуда цього струму вменшувалась внаслідок Ді ї на зовнішню поверхню мембрани 10“4 моль/д вершіамілу (на 41,39±0,35 X) та при підвищенні [Са21"];, ;;а допомогою Са-ЕГТА-буферу. Отримані, результати свідчать, що вхідний струм при використанні безкальцієвого роачину з додаванням хелатуючих речовин переноситься іонами Na+ через модифіковані кальцієві канали.

Незначна деполяризація мебрани від <Ш -йО мВ (<•> 1 мВ) супроводжується виникненням ¡Na- ІСа sa таких умов ще не ре еструється. Іа збільшенням деполяризації Іца зростає різкі те, і досягає свого максимуму в проміжку від -Ш до -40 мВ, що на 10 - 15 мВ пегатиЕніше максимуму Іса- Отже, поріг активації і максимум амплітуди ЕДТА-індукованого Іца досліджуваних клітин зміщений в бік негативних значень Ш1, правда, не так різко, як у нервових клітинах (Шуба, 1983).

В процесі модифікації кальцієвих каналів клітин нижньої долі залози зберігається їх метаболічна залежність: амплітуда індукованого ¡Na ири додаванні суміші цАМФ (10~4 моль/л), АТФ (2 ммоль/л) і іонів. Mg2f (3 ммоль/л) до внутрішнього розчину вростала на !56,13110,20 %. При цьому різниці між зростанням Іса через інтактні канали і Іца через модифіковані канали за критерієм Отьюдента немає. А інакнівуеться

. - 12 - '

ЕДТА-індукований Іиа статистично достовірно повільніше, ніж ІСа: при ТП -40 мВ Th відповідно становлять 848 і 712 мс.

При дослідженні залежності амплітуди 1« і Іна від pH середовища для вв’язування Са2+ використовували аніони SO42', константа комплексоутворення яких а Са2* не змінюється при pH > 4 (Досон и др., 1991). Засувалось, що при pH 4

амплітуда ік вменшується на 12,21±1,08 %, INa - на 12,79± 4,10 %. Це свідчить про збереження канальних фіксованих зарядів в процесі модифікації і про роль взаємодії проникаючих катіонів в ними.

Відносна селективні(ш> модифікованих кальцієвих каналів. Амплітуда Ік і їй через модифіковані кальцієві канали статистично'достовірно е більшою, ніж Іца- А амплітуда струмів, іцо переносяться органічними катіонами, у всіх випадках є меншою за амплітуду INa- Проте закономірності, відомої для натрієвих потенціалозалежних каналів збудливих клітин (Хилле, 1981; Шуба, 1983), виявити не вдалось. Зокрема, через модифіковані кальцієві канали найкраще з органічних катіонів проникають холін4 і СНзИНз+, дещо гірше - 0HNH3+, а НН2Ш!з+ практично не проникає черев них. Ряд селективності модифікованих кальцієвих каналів має такий вигляд: Ік : Ili '• ІНа :

Іхолін : ІСН NH : loHNH - Inh NH ” 1.65 : 1,36 : 1 : 0,80 3 3 3 2 3

: 0,79 : 0,64 : 0,07.

Для встановлення ступеня кодифікації кальцієвих каналів мембрани секреторних кяітя під впливом рівних Са-вв'явутия речовин знаходили співвідношення між амплітудами індукованого цими речовинами Іна і ІСа через інтактні канали при максимумі ВАХ (ТП -25 мВ). З’ясувалось, що при додаванні почергово до вовнішнього беекальцієвого роачину 1 ммоль/л ЕДТА, ЕГТА, цитрату, пірофосфату, фосфату і оксалату натрію дане

співвідношення становило відповідно 1,58і0,11, 1,44*0,16,

модифікуючого впливу Са- зв'язуючих речовин пояснюють (Шуба, 1983) різною константою комшіексау творе ніш; чим більша спорідненість речовини до Саг\ тим більший Іиа вона, індукує. Отримані нами дані не зовсім узгоджуються з такий поясненням. Ми.припустили, що існує зв’язок між розмірами молекул Са-ав'язуючих речовин та їх модифікуючою здатністю. Не маючи змоги оцінити розміри молекул цих речовин, ми порівнювали маси іх лігандів і кількість атомів у них. У ревультаті об-

Мал. 4. Ісп (1) через ін- вати кальцієві канали має нелі-тактні і Іца (2) через нійний характер. Ця залежність модифіковані аа допомогою задовільно апроксимується гіпер-ЕГТА (А), оксалату (Б) і болою, що зумовлено, мабуть, веа-фасфату (В) натрію кань- ємодією двох факторів - спорідне-цієві канали клітин ністю до Са2* і доступністю до нижньої долі залози. його зв'язування у аовнішньоклі-

і,39±0,18, 5,44±0,90, 5,02і0,34 і 3,95±0,£9. Різну ступінь

числень з’ясувалось, що коефіцієнт кореляції між масою ліганда і співвідношенням Іца : ІСа стано-

Д

А

вить -0,7БЗ, а мі* кількістю ато-

0,5 н А

В

Б мів у ліганді та його модифікую-'

=■=- чою здатністю - -0,816. На основі

цього можна стверджувати, шр ре-

1 с

човини з меншими розмірами молекул краще модифікують кальцієві канали цих клітин. Залеклість між розмірами молекул Са-зв’яауючих речовин і їх здатністю модифіку-

тинному примембранному просторі.

- u -

4. Дослід,«ения значення нзтріевото градіситу для проникнення кальцію через кальціьтві канали

. З м"Тою вияснення значення натрієвого градієнту для функціонування кальцієвих каналів ми досліджували зміну амплітуди їСв при єквімолярній заміні зознішньоклітинного NaOl ва тріс-СІ. 'З’ясувалось, що внаслідок гако'і гаміии амплітуда Ісз значно вменшуються і це зменшення суттєво залежить від ріння ffl. На умови, що в амплітуду вхідного інтегрального струму вносить вклад Na+, то її зменшення внаслідок ліквідації натрієвого градієнту при деполяризації мембрани від .різних значень ФІІ до -25 мВ було б однаковим.

З’ясувалось, що амплітуда Іса, зумовленого деполяризацією мембрани від ФП -85, -65 і -45 мВ до -25 мВ, відповідно зменшується як при наявності натрієвого градієнту, так і при його ліквідації, що пов'язано, очевидне, в розвитком стаціонарної інактивації. Але оскільки існує залежність зменшення амплітуди Іса внаслідок ліквідації натрієвого градієнту від вначення Сії, то в основі стаціонарної інактивації при наявності натрієвого градієнту і при його .відсутності лежить, мабуть, не потениіалозалежний, а Са-залежний механізм. Встановлення на мембрані певного ФП супроводжується зміною ДПца

- чим менший ФП, тим менше значення ЛЕца. Але оскільки виведення Na-Ca-обмінком Са2+ з клітин залежить від &Еца (Косте-рин, 1990), то її зменшення призводить до вростання ССа2+]в

1 блокування кальцієвих каналів останніми. Внаслідок цього при ФП -45 м8 і при наявності натрієвого градієнту значна частила кпзьціє&их каналів s вже заблокованими. Тому ліквідація натрієвого градієнту в цих умовах наймекие відбиваються на амплітуді Ice- І дійсно, при стабілізації [Са2+]в за допомогою Ca-S/íg-ЕГТА-буферу на рівні 10~5 моль/і дане вмен-

. 16 -

шення є однаковим при деполяризації мембрани від рівних вна-чень ФП. .

Підсумовуючи сказане, можна стверджувати, що ліквідація натрієвого градієнту призводить до вменшення Іса за рахунок нагромадження в клітинах Са2+ внаслідок аміни функціонування Na-Ca-обміну. При наявності натрієвого градієнту підтримується низька [Саг+]в і, очевидно, фівіологічний функціональний стан кальцієвих каналів.

В ході дослідження з’ясувалось, що внаслідок ліквідації натрієвого градієнту значно вменшуються також та isr-Амплітуда Іва при максимумі ВАХ (Тії -35 мВ) зменшується на 71,96±10,66 Z, a Isr - на 71,34*5,08 Z. Очевидно, внаслідок ліквідації натрієвого градієнту підвищується і

[Sr2+IB і ці катіони теж блокують кальцієві канали. Це можливо за умови, що Ваг+ 1 Згг+ транспортуються Na-Ca-обмінни-ком приблизно в такій же мірі, як і Са2+. .

Дослідження залежності амплітуди Іса ЕІД типу одновалентних катіонів, якими замінювали катіони Na+ у зовнішньок-літинному середовищі, може служити непрямим методом виявлення специфічності На-Са-обмінника до цих катіонів. Внаслідок еквімолярної заміни зовиішньоклітинного Ма+ на К+ амплітуда ІСа (ТП - -25 мВ) зросла на 63,12*6,13 %, а на Li+, WbNH.V, OHNH34 - зменшилась відповідно на 58,11*3,15%, 55.70*3,30 %, 36,24+4,13 %. Наведені факти свідчать, що Na-Ca-обмінник мембрани цих клітин не характеризується, мабуть, абсолютною специфічністю до Na+. .

Для підтвердження наявності Na-Ca-обміну в мемОролі досліджуваних клітин ми спрямували зусилля на виявлення та ідентифікацію його струму у відповідь на гіперполяриааційні вміщення МІІ. Виявилось, що при наявності фізіологічних гра-

дієнтів fia2* і Na+ внаслідок, гілерполяривуючого зміщення МП від рівня ФГІ (-20 мВ) розвивається вхідний отрум, який повільно досягає свого максимуму і не вменшується протягом гі-перполяризаці( мембрани (3 с). Струн, що розгивається у відповідь на гіперполярнааціи'мпмбраші, залежить від натрієвого градієнту: внаслідок зменшення Енл до 0 мВ Його амплітуда є

значно меншою, а при - - 45 мВ струм має вихідний напрям. Напрям струму визначається зніжом ДЕца при ФП: негативному значенню ДЕна при ФГІ відповідає гаідішй струм, а позитивному - вихідний. При подальшій зміні знаку ДЕна но змінюється ні напрям, ні характер залежності його амплітуди від №ца. Це свідчить, що даний струм є не канальний, а відображає електрогенний ефект Na-Ca-обміну.

Структурно-функціональна організація кальцієвих каналів мембрани секретарю«: клітин

Таким чином, потенціаловалежні кальцієві капали клітин нижньої долі залови суттєво не відрізниться від кальцієвих канатів збудливих клітин. Вони органівовані за принципом мембранної пори і містять активаційні ворота, які відкриваються у відповідь на деполяризацію мембрани. Біля зовнішнього отвору розміщений Са-вв’язуючий регуляторний центр, вилучення Са2+ 8 якого еа допомогою Са:зв’язуючих речовин призводить до втрати селективності. Діаметр пори модифікованих кальцієвих каналів перевищує 0,26 нм, але є менший 2 нм. Відбір проникаючих одновалентних катіонів здійснюється sa принципом стерігшої відповідності 1 електростатичної взаємодії в від’ємними фіксованими зарядами, які відіграють роль, очевидно, внутрішньоканального Са-зв'язуючого центру. Ступінь спорідненості Са-вв’язуючих угрупувань до двовалентних

катіонів визначав їх вдатність до проникнення або блокувати каналів. З цитоплазматичного боку досліджувані кальцієві канали мають ділянку, фосфориюовання якої цЛМФ-залежною проте-їнкіназою призводить до зростання ймовірністі їх активації. Причому, метаболічна залежність даних каналів не втрачається в процесі їх модифікації беакальцієвим середовищем. Передбачається також існування а цитоплазматичного боку каналів ще одного Са-ав’язуючого центру, через який за принципом негативного uBopoTiiLoro зв'язку здійснюється блокування кальцієвої провідності. Такий ефект спостерігається при зміщеннях ФП у позитивному напрямку або ліквідації натрієвого градієнту, що призводить до зміни функціонування Na-Ca-обміну.

. ВИСНОВКИ

1. Потенціаловалелиі кальцієві канали клітин ншшьоі і верхньої долей слинної ваюзи личинки Chirononnus pliunosus е низмюпораговши. Амплітуда кальцієвого струму протягом де-поляризуючсго зміщення черев ці канали повільно зменшуються.

?.. іЗзедення в клітини нижньої долі цАМФ на і{юні АТФ і Klg24 супроводжується збільшенням амплітуди кальцієвого струму, а в клітини верхньої долі - вменшанням.

.'і. Кальцієвий струм каналів клітин нижньої долі залози помірно анексується при дії на ьовнішіда поверхню мембрани полівалентних катіонів (1.<т’+ > Ni2t > Cd2+ > Zn2'), верала-мілу і нітрендипіну, під впливом зниження температури і закислення середонища. .

4. При збільшенні i.0a2,]a спостерігається насичення амплітуди ісальціввого струму кальцієві« ¡ошалів клітин нижньої долі замоаи. Крім і^иіьцш через дані канали проникать катіони барію та стронцію (Ва2*’ > Sr2+ ) Са2+),

вольт-амперні характеристики їх струмів є близькими. Зменшення амплітуди струмів двовалентних катіонів протягом деполяризації мембрани описується одною експонентою, є струмоза-лежним і майже не валежить від типу проникаючого катіона.

• '

5. Кальцієві канали клітин нижньої долі занози стають проникними для одновалентних катіонів у безкальцієвому середовищі іа додаванням рівних кальЦійав’язуючих речовин (ЕДТА, EFTA, цитрату, оксалату, пірофосфату і ортофосфату натрію). . При цьому вберігається їх метаболічна залежність і - одноекс-поненціальність зменшення струму протягом деполяризуючого вміщення. Максимум вольт-амперної характеристики індукованого натрієвого струму незначно вміщений у негативному напрямку відносно максимуму кальцієвого струму. Виявлена також гіперболічна валежяість між розмірами молекул кальцінав'язуючих речовин і їх модифікуючою вдатністю.

6. Модифіковані беакальцієвим середоващем кальцієві ка-Н“,"ч проникні для одновалентних катіонів у такій послідовності: К+ > Li+ > Na+ > холін+ > CH3NHa+ > 0НШ1з+ > МН2МН3*. Внаслідок закислення середовища незначно зменшується амплітуда як калієвого, так і натрієвого індукованих струмів. Це свідчить, ічо відбір проникаючих катіонів здійснюється за принципом стеричноі відповідності і електростатичної взаємодії в від'ємно зарядженими угрулунаннями.

7. Амплітуда кальцієвого струму збільшується при заміні оовнішньоклітинного Na+ на К+ і вменшується - при заміні на інві одновалентні катіонну послідовності: ОН!<Нз+ > ШІ2ЬІНз+ > Ui+ > Tpicf. Таке вмениення пов’язане, мабуть, в нагромадженням в клітині Са2+ внаслідок бміни режиму функціонування Na-Са-обмінника.

. IS -

Список публікацій за темо» дисертації:

1. Клевець М.Ю., Мянько в. В. Характеристика лотеиціалозалеж-

ного кальцієвого струму мембрани секреторних клітин /' Физиол. журн. - ЮТИ. - Гв, N3. - С. 70 - 75.

2. Клевець М.Ю., • Мальто В. В., Полуйко В.Ю. Значення позаклі-

тинного кальцію в підтриманні функціонатьного стану по-тенціатозалежшіх кальцієвих каналів мембрани секреторних клітин // Науково-методичні аспекти Фізіології. - Львів, 1993. - С. 08 - 39. .

3. Манько із.в., Клевець М.Ю. Селективність модифікованих

беакальцієвим середовищем кальцієвих каналів мембрани секреторних клітин / Львів, ун-т.- Львів, 1994. - 12 с.: 5л. О - Бібліогр. 11 наяв. - Укр. - Деп. в ДИТВ України EFj.08.94, М 1789 - Ук 94.

4. Манько В.В. Дослідження ступеня модифікації иотенціалоза-лежних кальцієвих каналів мембрани секреторних клітин під впливом різних тальці нав'язуючих речовин / Львів, vh-t. -Львів. 1994. - 12 о.: .ІЛ. 7 - Бібліогр. 7 НШ»В. - Укр. -Деп. в ДНТВ України 2Р.00.94, N 1767 - Ук 94.

5. Клепець М.Ю.. Манько P.P. Порівняння кальцієвого, Саріе-вбго і стронцієвого потенціаловалежних струмів мембрани секреторних клітин // Матеріали 1-го з'їзду Українського біофізичного товариства, м. Київ, £0 - 24 червня 1994 р.

, - Київ, 1994. - С. 114 - 115.

6. Клевець М.Ю., Манько В.В. Значення натрієвого градієнта для реєстрації струму через кальцієві лотенціалозалежні канали мембрани секреторних клітин // XIV з’ївд Українського фізіологічного товариства, м.Київ, 1-4 листопада 1994 р. Тез. доп. - Київ, 1994. ~ С. 10 - 11.

Манько В.В. Характеристика токов потенциалоэаыюимых кальциевых кацапов мембраны секреторных ¡меток. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15 - физиология человека и животных, Киевский университет имени Тараса Шевченко, Киев, 1SS5.

Защищается 6 научных работ, содержащих экспериментальные исследования. . Установлено, что функциональное состояние кальциеьих каналов мембраны клеток слюнной желеви личинки хирономуса контролируется аденилатциклазной системой. Проведены исследования селективности этих каналов и покаеано, что они непроницаемы для одновалентных катионов; в бескальциевой среде с добавлением разных Са-звявыаащих веществ они теряют свою селективность, сохраняя метаболическую зависимость; кинетика инактивации интегральных токов через эти каналы тско-вависима и почти не зависит от типа проникающего кагиона. Предложена модель стуктурно-функциональной организации этих каналов и их зависимости от Na-Ca-обмена.

Manko V.V. Characteristic of the currents of the potential-dependent calcium'Channels of the secretory cell membrane. Thesis for Ph.D. degree in biological sciences by speciality: 03.00.13 - Man and Animals Physiology. Taras Shevchenko University, Kiyv, 109b.

There are defence of 6 scientific publications containing experimental researches. It have been shown that functional state of the Ca channels of tho cell membrane of the salivary glands in Chironomus larvas is controled by adenilatcycla.se system. Selectivity of these channels have been devised and it was shown that they are not permeable

- ?л -

for monovalent, cations; in the Ca-free medium containing different Ca-binding substances they lost selectivity but keeps unchanged the metabolic dependence; inactivation kinetic of currents through these channels ir> current-dependent, but it is almost not dependent on the type' of permeated cation. It yihs proposed the model of structural-functional organization of these channels and their dependence on the Na-Ca exchange.

Ключові слова: потенціаловалежні кальцієві канапи,

Na-C'a-обмін, мембрана секреторних клітин.