Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика примордиальных зародышевых клеток как векторов для генетической трансформации эмбрионов кур

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Характеристика примордиальных зародышевых клеток как векторов для генетической трансформации эмбрионов кур"

^оочь 16354 ТОМГОРОВА Евгения Константиновна

ХАРАКТЕРИСТИКА ПРИМОРДИАЛЬНЫХ ЗАРОДЫШЕВЫХ КЛЕТОК КАК ВЕКТОРОВ ДЛЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ ЭМБРИОНОВ КУР

03.02.07-Генетика 03.03.01 - Физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 9 ,-пЕН

п. Дубровицы, Московская обл. 2010

004616354

Работа выполнена в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Букаров Нурмагомед Гаджикулиевич

Ведущее учреждение: Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина.

Защита состоится 28 декабря 2010 года, в 10 часов, на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 006.013.03 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательски^ институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук.

Адрес института: 142132 Московская область, Подольский район, пос. Дубровицы, ГНУ ВИЖ, т/факс (4967) 65-11-01

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии.

Научный руководитель: доктор биологических наук

Волкова Наталья Александровна

кандидат биологических наук Покровская Мария Владимировна

Автореферат разослан «_» ноября 2010 года.

Ученый секретарь Совета Д 006.013.03

4>

И.В. Гусев

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Создание биоинженерных форм в животноводстве, в том числе в птицеводстве является одним из перспективных направлений развития современной науки. Генетическая модификация сельскохозяйственной птицы рассматривается в качестве приема улучшения генотипа уже существующих пород для придания им устойчивости к различным возбудителям инфекционных заболеваний, улучшения продуктивных показателей, а также получения биореакторов, синтезирующих рекомбинантные белки в клетках яйцевода [Rapp el al, 2003; Kamihira el al., 2005; Kawabe et al, 2006; Kwon M.S. et al., 2008; Эрнст, 2008; Сураева, 2008].

Однако несмотря на заметные успехи в области трансгенеза птиц, само создание трансгенных кур представляет сегодня определенную проблему. Особенности воспроизводства и развития кур [Petitte, Mozdziak, 2002] значительно снижают эффективность традиционного метода введения экзогенной ДНК в клетки животных - микроинъекции, что требует поиска и разработки альтернативных методов направленного переноса генов. Одним из таких направлений, интенсивно развивающихся в последние годы, является разработка методических подходов, связанных с использованием в качестве клеток-мишеней для введения рекомбинантной ДНК разных типов плюрипотентных стволовых клеток [Petitte et al, 2004; Zhu et al., 2005], в том числе примордиальных зародышевых клеток (ПЗК) - предшественников высоко дифференцированных половых клеток. Генетическая трансформация ПЗК с последующей их трансплантацией в эмбрионы кур in vivo рассматривается как перспективный метод целенаправленной генетической модификации гонад и получения трансгенной птицы. В связи с этим проведение исследований в данном направлении представляется актуальным в рамках разработки высокоэффективных трансгенных технологий с целью их дальнейшего использования в птицеводстве.

Цель и задачи исследований. Исходя из выше изложенного, целью диссертационной работы явилось изучение результативности использования примордиальных зародышевых клеток (ПЗК) как векторов для генетической трансформации эмбрионов кур in vivo.

Для достижения указанной цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Изучить факторы, влияющие на эффективность выделения и поддержания в культуре ПЗК кур.

2. Выполнить генетическую трансформацию ПЗК in vitro и in vivo.

3. Оптимизировать метод генетической трансформации ПЗК in vitro.

4. Ввести трансформированные ПЗК в эмбрионы кур in vivo и изучить эффективность колонизации данными клетками гонад эмбрионов-реципиентов.

5. Разработать методические приемы, позволяющие повысить эффективность трансгенеза. (

Научная новизна. В ходе выполнения диссертационной работы изучены факторы, влияющие на эффективность выделения и поддержания в культуре ПЗК кур. Впервые дана сравнительная оценка различных методов генетической трансформации данного типа клеток in vitro и in vivo и выполнено введение трансформированных ПЗК в эмбрионы кур in vivo. Впервые изучена эффективность колонизации донорскими ПЗК гонад эмбрионов-реципиентов, а также исследовано влияние предъинкубационной обработки эмбрионов и концентрации донорских ПЗК на эффективность трансгенеза.

Практическая значимость. Усовершенствован метод выделения ПЗК из эмбрионов кур и оптимизированы условия поддержания в культуре данного типа клеток. Предложен эффективный способ генетической трансформации ПЗК и их введения в эмбрионы кур in vivo. Оптимизированы отдельные этапы технологической цепочки генетической модификации гонад эмбрионов кур in vivo с эффективностью колонизации введенных трансформированных ПЗК до 39,1%. Предложен метод предъинкубационной обработки эмбрионов, блокирующий развитие эндогенных ПЗК в гонадах эмбрионов-реципиентов.

Основные положения, выносимые на защиту

• Способ дезагрегации ткани, стадия развития эмбрионов, разделение клеток по адгезии как факторы, влияющие на результативность получения культуры ПЗК кур.

• Электропорация как результативный способ генетической трансформации ПЗК in vitro.

• Эффективность колонизации донорскими ПЗК гонад эмбрионов-реципиентов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях: «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования, образование», Санкт-Петербург, 2007; «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», Дубровицы, 2008,2009.

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе в центральных научных журналах, рекомендованных ВАК - 4.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 103 страницах, содержит 13 таблиц, 22 рисунка, 1 схему. Библиографический список содержит 117 источников, в том числе 96 на иностранных языках.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа была выполнена в период с 2006 по 2010 гг. в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВИЖ) согласно схеме, представленной на рисунке 1.

дезагрегация эмбрионов

механическая диссоциация

ферментативная обработка

без фидерного

на фидерном слое

очистка ПЗК от других типов клеток

стадия развития эмбрионов

разделение разных типов клеток по адгезии

4 день инкубации

Культивирование ПЗК кур

ЭФК

STO

5 день инкубации

6 день инкубации

7 день инкубации

8 день инкубации

Анализ факторов, влияющих на эффективность выделения и поддержания в культуре ПЗК кур

т

Трансформация ПЗК кур

ретровирусная трансфекция

вирусный препарат

клетки-упаковщицы

500

1000

m vivo

2000

¡П УЦГО

электропорация

360В, 40 МКС

180В, 80 мкс

90В, 100 мкс

Введение ПЗК, подвергшихся трансфекции, в эмбрионы кур ш

обработка эмбрионов до инкубации

доза введения донорских ПЗК

30 минут

60 минут

90 минут

120 минут

150 минут

облучение ультрафиолетом

обработка бусульфаном

40 мкг

80 мкг

160 мкг

100 клеток

200 клеток

300 клеток

400 клеток

Анализ эффективности трансгенеза и результативности колонизации донорскими ПЗК гонад эмбрионов-реципиентов

Рис. 1. Схема исследований.

Исследования проводили на эмбрионах кросса «Птичное». Материалом для получения ПЗК служили эмбрионы с 4 по 8 день развития (инкубации). Методические приемы выделения данного типа клеток и условия их культивирования in vitro отрабатывали экспериментально. Для идентификации ПЗК использовали окраску на гликоген (ШИК-реакция).

Для трансфекции ПЗК использовали генную конструкцию pCEGFP, содержащую репортсрный ген GFP (зеленый флюоресцирующий белок). Введение рекомбинантной ДНК в клетки-мишени осуществляли методами электропорации и ретровирусной трансфекции. В последнем случае применяли конструкцию pL-GFP, полученную путем клонирования фрагмента ДНК плазмиды pCEGFP в ретровирусный вектор pLXSN и упакованную в пакующую линию GPenv-AM12 (предоставлено к.б.н. Фоминым И.К., Институт цитологии и генетики HAH Беларуси, г. Минск).

Электропорацию проводили на мультипораторе «Eppendorf» (Германия) согласно прилагаемому к нему протоколу. Режимы электропорации подбирали экспериментально.

Метод ретровирусной трансфекции использовали in vitro и in vivo. Введение рекомбинантной ДНК в ПЗК in vitro осуществляли путем совместного культивирования с клетками-упаковщицами и добавления вирусного препарата (среды культивирования клеток-упаковщиц, содержащей рекомбинантный ретровирус). В первом случае клетки-упаковщицы использовали в качестве фидерного слоя, на который высевали ПЗК, во втором - ПЗК культивировали на эмбриональных фибробластах кур в вирусном препарате. Экспрессию репортерного гена в трансфецированных клетках изучали на 3-5 день культивирования в зависимости от метода трансфекции. Частоту генетической трансформации определяли как процентное отношение числа трансформированных клеток к общему числу клеток, взятых для эксперимента.

Введение генной конструкции pL-GFP в эмбрионы кур in vivo осуществляли на 60-м часу инкубации в дорсальную аорту. Для инъекций использовали суспензию клеток-упаковщиц (в DMEM) и вирусный препарат.

Трансфецированные ПЗК вводили в дорсальную аорту 2,5-дневных эмбрионов кур в виде суспензии в среде DMEM. Для снижения эндогенных ПЗК проводили предъинкубационную обработку эмбрионов бусульфаном и облучали ультрафиолетом (УФ). Дозы вводимого препарата и режимы обработки эмбрионов подбирали экспериментально.

Экспрессию GFP в трансфецированных клетках и эмбрионах кур оценивали под люминесцентным микроскопом в ультрафиолетовом свете и методом иммуногистохимии с применением специфических антител к изучаемому белку. Гистологические препараты готовили по общепринятой методике [Ромейс, 1953]. Микроскопирование цитологических и гистологических препаратов осуществляли с использованием компьютерной программы Image Scope (г. Москва, ООО «Системы для микроскопии и анализа»).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Изучение факторов, влияющих на эффективность выделения ПЗК из эмбрионов кур

На первом этапе было изучено влияние на эффективность выделения ПЗК из эмбрионов кур таких факторов как (1) способ дезагрегации эмбрионов, (2) очистка ПЗК от других типов клеток и (3) возраст эмбрионов, используемых для получения ПЗК.

Влияние способа обработки эмбрионов кур на эффективность дезагрегации ткани. Для дезагрегации эмбрионов кур использовали механическую диссоциацию клеток и ферментативную обработку ткани. В первом случае диссоциацию клеток проводили путем измельчения эмбрионов с помощью пипетирования в среде ОМЕМ в течение 5 минут, во втором - в качестве протеолитического фермента использовали раствор трипсина разной концентрации (0,05,0,10,0,15 и 0,25%).

При механической диссоциации эмбрионов кур полученная суспензия состояла как из отдельно разобщенных, так и объединенных в группы клеток. Количество отдельных клеток в суспензии достигало 69%, объединенных в группы - 31%. Вместе с тем, не смотря на неполную дезагрегацию ткани при механической обработке эмбрионов влияние на жизнеспособность клеток было минимальным: количество мертвых клеток не превышало 1%.

Использование ферментативной обработки эмбрионов позволило получить суспензию, состоящую, преимущественно, из отдельных клеток. Наличия клеточных агрегатов практически не наблюдалось. Единичные группы клеток (до 0,1%) были выявлены только при использовании 0,05 и 0,10% трипсина. Однако выход жизнеспособных клеток был ниже, чем при механической диссоциации. Максимальная доля таких клеток в суспензии была получена при использовании 0,05% трипсина - 95%, что было незначительно ниже (на 4%) аналогичных показателей при механической обработке тканей. Учитывая это, а также возможность получения суспензии, представленной практически на 100% разобщенными клетками, в своих дальнейших исследованиях для выделения ПЗК использовали раствор трипсина в данной концентрации.

Влияние возраста эмбрионов кур на эффективность выделения ПЗК. Анализ цитологических препаратов, полученных от эмбрионов кур на 4-8 дни инкубации, выявил изменение количества ПЗК в гонадах с возрастом. Если у 4-дневных эмбрионов количество ПЗК составляло лишь 302±18, то к 6 дню инкубации эмбрионов данный показатель возрастал до 4080±70 (р<0,001). В последующие дни эмбриогенеза количество ПЗК резко снижалось. К 7-му и 8-му дням инкубации число данных клеток в гонадах сократилось в 3,2-4,3 раза и составило, соответственно, 1217±76 и 940±37, что можно объяснить началом дифференцировки ПЗК в гонадах в этот период эмбриогенеза и обусловленной этим частичной потерей их морфологических признаков, в частности, отсутствием в некоторых клетках специфической окраски на гликоген.

Очистка ПЗК кур от других типов клеток. При изоляции ПЗК из эмбрионов кур полученная популяция клеток является, как правило, неоднородной из-за наличия других клеточных типов, что требует проведения дополнительных манипуляций по увеличению количества данного типа клеток в культуре. Одним из таких подходов является разделение клеток по адгезии.

С целью изучения адгезирующей способности ПЗК кур по отношению к другим типам эмбриональных клеток была поставлена серия экспериментов с краткосрочным культивированием данных клеток от 15 до 120 минут. По окончании инкубации супернатант с неприкрепившимися клетками осторожно переливали из чашек Петри в центрифужные пробирки, центрифугировали и ресуспензировали осадок в среде ЭМЕМ в конечной концентрации 240 клеток/мкл. 50 мкл суспензии наносили на предметное стекло, делали мазок, высушивали и окрашивали на гликоген (ШИК-реакция) для идентификации ПЗК. На основании полученных результатов рассчитывали процент окрашенных клеток (ПЗК) от общего числа исследованных клеток.

В первичной популяции клеток, выделенных из эмбрионов кур, количество ПЗК в суспензии не превышало 5,0±0,1% (рис.2). Разделение клеток по адгезии позволило повысить процент данных клеток в клеточной популяции. Высокая однородность клеточной популяции была достигнута при разделении клеток после 75-90 минут культивирования: количество ПЗК в суспензии достигало 80,7±3,4% (р<0,001). Инкубация изолированных клеток в ростовой среде менее 75 минут с последующим разделением, позволила сформировать популяцию клеток только на 26,5-67,9% представленную ПЗК.

Рис. 2. Суспензия эмбриональных клеток кур, полученная (1) до и (2) после разделения клеток по адгезии. Окраска на гликоген.

Примечание: ПЗК показаны стрелками. Ув. Х400.

3.2. Культивирование ПЗК кур

Оптимизация условий выделения ПЗК из эмбрионов кур позволила получить популяцию клеток, состоящую, преимущественно, из ПЗК. Для поддержания в культуре данного типа клеток использовали среду ЭМЕМ с

6

высоким содержанием глюкозы (4,5 г/л) и сыворотки плода коровы (15%) с добавлением глутамина (2 мМ), 2-меркаптоэтанола (Ю-6 мМ), гентамицина (50 мкг/мл). Была изучена продолжительность культивирования ПЗК в зависимости от используемого слоя фидерных клеток.

Суспензию клеток, полученную из каудальной части 6-дневного эмбриона, высевали в чашки Петри (<1=100мм) и культивировали в течение 18-24 часов, после чего супернатант, содержащий, преимущественно, клетки крови, сливали, а клетки, адгезированные на поверхности чашки Петри снимали 0,25% раствором трипсина и высевали на новые культуральные чашки. Через 90 минут культивирования, необходимого для адгезии эмбриональных фибробластов, супернатант, содержащий ПЗК, переносили на новые чашки Петри с фидерным слоем и без фидерного слоя.

При культивировании в чашках Петри без фидерного слоя ПЗК практически не адгезировались на поверхности культуральной чашки, однако сохраняли свою жизнеспособность в течение 1-2 суток, что было подтверждено окрашиванием 0,5% трипаным синим (рис. 3).

Рис. 3 Продолжительность культивирования ПЗК в зависимости от типа клеток, используемых для получения фидерного слоя.

Примечание: ЭФК- эмбриональные фибробласты кур.

При инкубации ПЗК на фидерном слое жизнеспособность клеток сохранялась более длительное время. Продолжительность их культивирования варьировала от 5 до 7 дней в зависимости от типа клеток, используемых в качестве фидерного слоя: (1) перевиваемой клеточной линии БТО, (2) свежеизолированных и (3) культивируемых в течение нескольких пассажей эмбриональных фибробластов кур.

Максимальная продолжительность культивирования ПЗК (7 дней) была установлена при использовании в качестве фидерного слоя свежеизолированных эмбриональных фибробластов кур. В данном случае первично выделенную из эмбрионов суспензию клеток высевали в чашки Петри (с!= 100мм) и культивировали в течение нескольких дней без их разделения по типам

1

клеток. При этом фибробласты образовывали фидерный слой, на котором адгезировались ПЗК (рис. -/). При формировании фибробластами монослоя ПЗК переносили на новый фидерный слой, представленный культивируемыми эмбриональными фибробластами кур, обработанными митомицином С. После пересева на новый фидерный слой ПЗК прикреплялись к клеткам фидера, однако через 18-24 часа инкубации они откреплялись от фидерного слоя и в дальнейшем культивировались в суспензии, сохраняя свою жизнеспособность в течение 1-2 суток.

Рис. 4. Культивирование ПЗК на разных фидерных слоях.

Примечание: 1 - эмбриональные фибробласты кур, 2 - линия STO.. ПЗК показаны стрелкой. У в. Х400.

При инкубации ПЗК на культивируемых куриных эмбриональных фибробластах и STO жизнеспособность ПЗК в культуре сохранялась не более 5 дней. При этом не было установлено существенных различий по продолжительности культивирования ПЗКч-в зависимости от используемого фидерного слоя. К тому же во всех случаях наблюдалась практически аналогичная тенденция. После переноса на фидерный слой ПЗК садились на клетки фидера и через 36-48 часов инкубации откреплялись. Дальнейшее их культивирование происходило в суспензии в течение 2-3 суток.

3.3. Генетическая трансформация ПЗК кур

С целью отработки эффективного метода генетической трансформации ПЗК был проведен ряд экспериментов по переносу рекомбинантной ДНК в данные клетки-мишени. Была изучена эффективность генетической модификации ПЗК кур с использованием двух методов: ретровирусной трансфекции и электропорации.

3.3.1. Трансфекция ПЗКретровирусными векторами

Исследования, проведенные ранее, по переносу рекомбинантной ДНК в эмбриональные клетки кур показали эффективность использования ретровирусных векторов для генетической модификации клеток кур [Волкова H.A. и др., 2008; Туликова А.О., 2010]. В этой связи данная система направленного переноса генов была выбрана и для трансфекции ПЗК кур.

Трансфекция ПЗК in vitro. При введении генной конструкции pL-GFP в ПЗК кур in vitro максимальная эффективность переноса рекомбинантной ДНК в данные клетки-мишени была установлена при совместном культивировании с клетками-упаковщицами - 0,08±0,002%. При трансфекции ПЗК вирусным препаратом данный показатель не превышал 0,04±0,001%.

Перенос рекомбинантной ДНК в ПЗК кур in vivo. Как и в экспериментах in vitro, высокая эффективность трансформации ПЗК in vivo была установлена при использовании в качестве источника генной конструкции клеток-упаковщиц (табл.1).

Таблица 1

Трансформация ПЗК кур генной конструкцией pL-GFP in vivo

Показатель Источник генной конструкции

вирусный препарат, КОЕ/мл клетки-упаковщицы, кл/эмбрион

1*105 1*10' 500 1000 2000

Проинъецировано эмбрионов, шт 50 50 50 50 50

Число развившихся эмбрионов до 9-го дня инкубации, п (%) в т.ч. с трансформированными гонадами, п 48 (96,0) 10 46 (92,0) 13 47 (94,0) 13 45 (90,0) 16 43 (86,0) 16

Частота интеграции*, % 20,8 28,3 27,7 35,6 37,2

Эффективность трансгенеза", % 20,0 26,0 26,0 32,0 32,0

Эффективность трансформации клеток гонад *, % 1,8± 0,17е 2,2± 2,5± 0,15е | 0,14Ь 3,2± 0,2a 3,1± 0,15

Примечание: * отношение числа эмбрионов с трансформированными гонадами к общему числу развившихся эмбрионов, выраженное в процентах;

** отношение числа эмбрионов с трансформированными гонадами к общему числу проинъецированных эмбрионов, выраженное в процентах;

*** отношение числа трансформированных клеток к их общему числу в гонадах одного эмбриона, выраженное в процентах (при расчете показателя учитывали только эмбрионы с трансформированными гонадами). Достоверные различия: а Ьр<0,005, аср<0,001.

Максимальная частота интеграции генной конструкции наблюдалась при введении в эмбрионы кур суспензии клеток-упаковщиц в количестве 1000-2000 клеток - 35,6-37,2%. При этом доля трансформированных клеток (ПЗК) в гонадах эмбрионов достигала 3,2±0,2%. При использовании для трансформации ПЗК вирусного препарата и клеток-упаковщиц в

количестве 500 клеток частота интеграции генной конструкции была на 14,2-16,1% ниже и не превышала 28,3% при эффективности трансформации клеток гонад до 2,5±0,14 %.

3.3.2. Введениерекомбинантной ДНК в ПЗКэлектропорацией

Перед подбором оптимальных режимов электропорации была изучена толерантность ПЗК кур к гипоосмолярным условиям и определен размер данного типа клеток при инкубации в этих условиях для расчета напряжения и продолжительности электрического разряда.

Инкубация ПЗК в гипосмолярном буфере (Eppendorf, Германия) в течение 30 минут не выявила существенного снижения их жизнеспособности: доля лизированных клеток не превышала 1,5%. При этом размер ПЗК в диаметре составил 29,5±1,1 мкм, исходя из чего, были выбраны напряжение и продолжительность электрического разряда в пределах 90360В и 40-100 мкс, соответственно.

Максимальная эффективность трансформации ПЗК генной конструкцией pCEGFP наблюдалась при действии электрического разряда напряжением 180В в течение 80 мкс: экспрессия рекомбинантного гена была установлена в 61,1±6,3% клеток. При использовании для трансформации ПЗК режимов электропорации 90В, 100мкс и 360В, 40мкс данный показатель был ниже и составил 39,2±3,4 и 57,5±5,9%, соответственно.

Сопоставляя полученные результаты с данными о результативности трансформации ПЗК генной конструкцией pL-GFP, следует отметить явное преимущество электропорации по сравнению с ретровирусной трансфекцией ПЗК как in vitro, так и in vivo (рис. 5).

о > •

ретрови-русная транс-фекция

мккгро-порация

2000 кл/э«б «ООкгЛмб 500 кл/эмб ВП

I Г ВП КК

360В, 40 мкс 160В, 80 мкс 90В, 100 икс

т з,1 ¡'Ч

Я 3,2

В 2.5 !

В 2.2 i

0,04 i

0,08 1

i

...................i................. 39,2 !

10 20 30 40 50 60 70 Частота генетической трансформации, %

Рис. 5 Эффективность генетической трансформации ПЗК в зависимости

от метода трансфекции. Примечание: ВП - вирусный препарат, КК - культура клеток-упаковщиц.

Эффективность введения рекомбинантной ДНК в ПЗК электрическим пробоем была выше в первом случае в 61 раз (р<0,05), во втором - в 5 раз. Учитывая это, для трансформации ПЗК в дальнейшем был использован метод электропорации с режимом воздействия электрического разряда на клетки-мишени 180В, 80мкс.

3.4. Введение ПЗК, подвергшихся трансфекции, в эмбрионы

кур in vivo

ПЗК после генетической трансформации вводили в эмбрионы кур ¡n vivo в количестве 100 клеток на эмбрион. Развитие до 9 дня инкубации было установлено у 45 эмбрионов из 50 проинъецированных. Эффективность трансгенеза (число эмбрионов с трансформированными гонадами от общего числа проинъецированных эмбрионов, выраженное в процентах) составила при этом 42,0% при результативности переноса донорских ПЗК в гонады эмбрионов-реципиентов 4,3±0,1%.

Сопоставляя полученные данные с результатами трансформации ПЗК генной конструкцией pL-GFP in vivo, следует отметить, незначительное преимущество в эффективности генетической модификации гонад при использовании метода электропорации - 1,2%.

3.5. Разработка методических приемов, направленных на повышение эффективности трансгенеза эмбрионов кур

С целью повышения эффективности трансгенеза были проведены опыты по уменьшению количества эндогенных (собственных) ПЗК в эмбрионе и оптимизации дозы вводимых (донорских) ПЗК. Для снижения доли эндогенных ПЗК эмбрионы до инкубации были обработаны (1) ультрафиолетом путем облучения и (2) бусульфаном с помощью инъекции в область зародышевого диска.

Влияние инъекции бусульфана на развитие ПЗК кур. Бусульфан вводили в концентрации от 40 до 160 мкг/эмбрион. Во всех случаях наблюдалась высокая эмбриональная смертность - от 50 до 70% в зависимости от концентрации вводимого препарата, что свидетельствует о сильном негативном влиянии данного препарата на эмбриогенез кур. Кроме того гистологический анализ развившихся эмбрионов выявил значительные отклонения в гистоструктуре как самого эмбриона, так и изменения в гонадах: в опытных группах по сравнению с контролем отмечалось уменьшение размеров гонад более чем в 3 раза {рис. 6). Данный эффект мог быть вызван как действием непосредственно используемого препарата (бусульфана), так и растворителя, применяемого для разведения бусульфана, в частности ДМСО (диметилсульфоксида), который в высоких концентрациях является токсичным для клеток. Учитывая выраженное негативное влияние инъекции бусульфана на развитие эмбрионов кур, данный способ обработки эмбрионов в дальнейшем не использовался.

О(контроль)

9 (90,0)

4080±70

13 (86,7)

2714±62*

Примечание: * - достоверные различия в сравнении с контролем р<0,001.

Рис. 6. Гонады эмбрионов (1) до и (2) после их обработки бусульфаном. Ув. х400.

Влияние на развитие ПЗК кур предъинкубационной обработки эмбрионов ультрафиолетом (УФ). Обработку эмбрионов УФ проводили непосредственно перед инкубацией в течение 30-150 минут (табл. 3). Эффективность действия УФ на развитие эндогенных ПЗК изучали через 6 дней после обработки: свежеизолированную суспензию эмбриональных клеток (от 1 эмбриона) наносили на предметное стекло, фиксировали и окрашивали на гликоген для подсчета ПЗК.

Таблица 3

Развитие ПЗК после предъинкубационной обработки эмбрионов УФ

Время обработки УФ, мин

Обработано эмбрионов, п

Число эмбрионов, развившихся до 6-го дня инкубации, п (%)

Количество ПЗК в гонадах 1 эмбриона, п

12(80,0)

676±75*

10(66,7)

50±3,1*

7(46,7)

42±2,5*

12 (80,0)

166±28*

С увеличением времени обработки эмбрионов УФ наблюдалось уменьшения количества ПЗК в гонадах. Так, при облучении эмбрионов в течение 30 минут число ПЗК снижалось по сравнению с контролем в 1,5 раза, в то время как при максимальном времени обработки - более чем в 90 раз (р<0,001). Вместе с тем, с удлинением периода воздействия УФ на эмбрионы наблюдалось более выраженное негативное влияние на их развитие - повышенная эмбриональная смертность (до 53,3%) и нарушение гистоструктуры эмбриональных тканей, в том числе гонад. Учитывая это, в качестве оптимального режима предъинкубационной обработки эмбрионов была выбрана продолжительность воздействия УФ на эмбрионы в течение 90 минут. Действие УФ в данном режиме не оказывает сильно

выраженного влияния на эмбриогенез, однако блокирует развитие ПЗК, достоверно снижая их количество в гонадах к шестому дню инкубации в 24,6 раз (р<0,001).

Влияние дозы вводимых ПЗК на эффективность генетической трансформации эмбрионов кур in vivo. Трансформированные ПЗК вводили в дозе 100, 200, 300 и 400 клеток на эмбрион. Перед введением донорских клеток проводили предъинкубационную обработку эмбрионов УФ в течение 90 минут.

Проведенные исследования не выявили влияния количества вводимых ПЗК на эмбриогенез кур: процент развившихся эмбрионов от общего числа проинъецированных варьировал от 82,0 до 88,0% не зависимо от дозы донорских клеток. Не было установлено и существенных различий по эффективности трансгенеза и частоте интеграции генной конструкции в зависимости от концентрации вводимых клеток: данные показатели составили 58,0-64,0% и 65,9-73,8%, соответственно (табл. -/).

Таблица 4

Эффективность введения трансформированных ПЗК в

эмбрионы кур in vivo

Показатель Доза вводимых ПЗК, клеток/эмбрион

100 200 300 400

Проинъецировано эмбрионов, шт 50 50 50 50

Число развившихся эмбрионов до 9-го дня инкубации, п (%) в т.ч. с трансформированными гонадами, п 43 (86,0) 30 44 (88,0) 29 41 (82,0) 32 42 (84,0) 31

Частота интеграции', % 69,8 65,9 78,1 73,8

Эффективность трансгенеза", % 60,0 58,0 64,0 62,0

Эффективность трансформации клеток гонад "*, % 16,3 ±1,3Ь 20,1 ±3,7Ь 36,3 ±2,9 39,1 ±3,4а

Примечание: * отношение числа эмбрионов с трансформированными гонадами к общему числу развившихся эмбрионов, выраженное в процентах;

** отношение числа эмбрионов с трансформированными гонадами к общему числу проинъецированных эмбрионов, выраженное в процентах;

*** отношение числа трансформированных клеток к их общему числу в гонадах одного эмбриона, выраженное в процентах.

Достоверные различия: а Ьр<0,001.

Вместе с тем, наблюдалось значительное увеличение доли трансформированных клеток в гонадах эмбрионов при увеличении дозы вводимых ПЗК. Максимальный процент клеток гонад с экспрессией репортерного гена ОРР был установлен при введении донорских ПЗК в количестве 300-400 клеток на эмбрион - 39,1±3,4 (рис. 7). При введении ПЗК

в меньшей концентрации доля трансформированных клеток в гонадах не превышала 16,3-20,1% (р<0,001).

Рис. 7. Гонады 9-дневных эмбрионов кур. Иммуногистохимия на экспрессию репортерного гена GFP

Примечание: 1 ~ опыт; 2 - контроль. Стрелками показаны трансформированные ПЗК.

Таким образом, проведенные исследования позволили оптимизировать и разработать методические подходы по выделению, генетической трансформации и переносу трансформированных ПЗК в эмбрионы кур in vivo с эффективностью трансформации клеток гонад до 39,1%. Условия, определяющие высокую результативность генетической трансформации эмбрионов кур in vivo с использованием ПЗК в качестве вектора для переноса рекомбинантной ДНК, суммированы в таблице 5.

Таблица 5

Условия, определяющие результативность трансгенеза эмбрионов кур in

vivo при использовании ПЗК в качестве вектора для переноса генов

Показатель Условия

1 .Выделение ПЗК из эмбрионов: метод дезагрегации эмбрионов возраст эмбрионов очистка ПЗК от других типов клеток ферментативный, с использованием 0,05% трипсина 6 день инкубации культивирование клеток в течение 90 минут с последующим разделением по адгезии

2. Генетическая трансформация ПЗК метод трансформации условия трансформации электропорация 180 В, 80 мкс

3. Введение ПЗК в эмбрионы метод введения ПЗК метод предъинкубационной обработки эмбрионов доза вводимых ПЗК в дорсальную аорту 2,5-дневных эмбрионов обработка УФ в течение 90 минут 300-400 клеток на эмбрион

выводы

1. Эффективность выделения ПЗК из эмбрионов кур зависит от способа дезагрегации ткани, метода очистки от других типов клеток и стадии развития используемого для выделения эмбриона. Максимальное количество ПЗК в гонадах эмбрионов установлено на шестой день инкубации - 4080±70. Показано, что при дезагрегации 6-дневных эмбрионов в растворе 0,05% трипсина с последующим разделением эмбриональных клеток по адгезии после 90 минут культивирования доля ПЗК в полученной суспензии клеток достигает 80,7±3,4% (р<0,001).

2. На продолжительность культивирования ПЗК кур влияет наличие и тип фидерного слоя. Максимальный период поддержания ПЗК в культуре установлен при их инкубации на фидере, представленном свежеизолированными эмбриональными фибробластами кур -7 дней. При использовании в качестве фидерного слоя культивируемых эмбриональных фибробластов кур и линии клеток STO данный показатель не превышал 5 дней, а при отсутствии фидерного слоя - 2 дней.

3. Высокая результативность переноса рекомбинантной ДНК в ПЗК кур выявлена при использовании метода электропорации - 61 ±6%. При применении ретровирусной трансфекции доля трансформированных клеток была достоверно ниже и не превышала в условиях in vitro 0,08±0,002%, in vivo -3,2±0,2% (р<0,005).

4. Максимальная эффективность трансфекции ПЗК in vitro установлена при действии на клетки-мишени электрического разряда напряжением 180В в течение 80 мкс.

5. Введение трансформированных ПЗК в дорсальную аорту 2,5-дневных эмбрионов способствует колонизации донорскими клетками гонад эмбрионов-реципиентов с результативностью 4,3±0,1% и эффективностью трансгенеза 42,0%.

6. Обработка эмбрионов кур до инкубации УФ в течение 90 минут достоверно снижает количество эндогенных ПЗК в гонадах в 24,6 раз (до 166±28 при 4080±70 в контроле, р<0,001). Введение трансформированных ПЗК в количестве 300-400 клеток на эмбрион после предъинкубационной обработки эмбрионов-реципиентов УФ достоверно повышает результативность генетической модификации клеток гонад до 39,1±3,4% (р<0,001) при эффективности трансгенеза 62,0-64,0%.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Лабораториям, занимающимся генной и клеточной инженерией животных, рекомендуем для эффективной трансформации ПЗК кур in vitro использовать метод электропорации.

Для эффективной генетической трансформации гонад эмбрионов кур рекомендуем осуществлять введение трансформированных ПЗК в дорсальную аорту 2,5-дневных эмбрионов в концентрации 300-400 клеток на

эмбрион после предъинкубационной обработки эмбрионов-реципиентов УФ в течение 90 минут.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) Волкова, Н. А. Изучение эффективности переноса экзогенной ДНК в клетки эмбрионов кур in vitro и in vivo с использованием ретровирусных векторов / H.A. Волкова, А. О. Тулякова, Е. К. Томгорова, Н. А. Зиновьева, Л. К. Эрнст // Доклады РАСХН. - 2007. - №3. - С. 37-39.

2) Эрнст, JI.K. Некоторые аспекты клеточной инженерии животных / JI.K. Эрнст, В.А. Багиров, Е.К. Томгорова, Г.Н. Сингина, H.A. Волкова, H.A. Зиновьева, И.Н. Чаушев, А.И. Чаушева // Достижения науки и техники АПК. -2008.-№12.-С. 39-41.

3) Эрнст, JI.K. Некоторые аспекты переноса генов в половые клетки самцов сельскохозяйственных животных / JI.K. Эрнст, Е.В. Белоглазова, Е.К. Томгорова, Волкова H.A., Багиров В.А., Зиновьева H.A., Волкова JI.A. // Достижения науки и техники АПК. - 2009. -Ks 10. - С. 71-73.

4) Волкова, Н. А. Генетическая трансформация клеток кур in vitro и in vivo с использованием ретровирусных векторов / H.A. Волкова, Е.К. Томгорова, В.А. Багиров, Д.В. Белоглазов, H.A. Зиновьева, Л.А. Волкова, Л.К. Эрнст// Сельскохозяйственная биология. - 2009. -№6. - С. 44-48.

5) Волкова, H.A. Эффективность создания трансгенных кур методом опосредованного ретровирусами переноса генов / H.A. Волкова, Е.К. Томгорова, Л.А. Волкова, H.A. Зиновьева, Л.К. Эрнст // Материалы 4-й международной конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования, образование», 02-05.10.2007, Санкт-Петербург. -2007.-С.176-177.

6) Томгорова Е.К. Эффективность использования ретровирусных векторов для получения трансгенных кур / Е.К. Томгорова, Д.В. Белоглазов, А.О. Тулякова, H.A. Волкова, Л.А. Волкова, H.A. Зиновьева, Л.К. Эрнст // Материалы 7-ой международной научной конференции-школы «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных: роль нанотехнологий в реализации приоритетных задач биотехнологии». Дубровицы. - 2008. - С. 224-227.

7) Томгорова Е.К. Разработка способа генетической модификации примордиальных зародышевых клеток как основы инновационной технологии создания трансгенных кур / Е.К. Томгорова // Материалы 8-й международной научной конференции-школы «Современные достижения и проблемы генетики и биотехнологии сельскохозяйственных животных». Дубровицы. - 2009. - С. 193-194.

Издательство ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии Тел. (8-4967)65-15-97

Сдано в набор 23.11.2010. Подписано в печать 23.11.2010 _ Заказ №38. Печ. л. 1,0. Тираж 100 экз._

Отпечатано в типографии ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Томгорова, Евгения Константиновна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Особенности эмбриогенеза кур.

1.2. Генетическая трансформация эмбрионов кур.

1.2.1. Методы направленного переноса генов в эмбрионы кур in vivo.

1.2.1.1. Использование вирусных векторов.

1.2.1.2. Перенос рекомбинантной ДНК в эмбрионы посредством плюрипотентных клеток.

1.2.2. Культивирование эмбрионов кур после генно-инженерных манипуляций.

1.3. Характеристика примордиальных зародышевых клеток (ПЗК) как вектора для доставки рекомбинантной ДНК.

1.3.1. Развитие и миграция ПЗК в ранний период эмбриогенеза.

1.3.2. Особенности культивирования ПЗК.

1.3.3. Методы генетической модификации ПЗК.

1.4. Перспективы использования трансгенных технологий в птицеводстве.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Характеристика примордиальных зародышевых клеток как векторов для генетической трансформации эмбрионов кур"

Актуальность темы.

Создание биоинженерных форм в животноводстве, в том числе в птицеводстве является одним из перспективных направлений развития современной науки. Генетическая модификация сельскохозяйственной птицы рассматривается в качестве приема улучшения генотипа уже существующих пород для придания им устойчивости к различным возбудителям инфекционных заболеваний, улучшения продуктивных показателей, а также получения биореакторов, синтезирующих рекомбинантные белки в клетках яйцевода [Rapp et al., 2003; Kamihira et al., 2005; Kawabe et al., 2006; Kwon M.S. etal., 2008; Эрнст, 2008; Сураева, 2008].

Однако несмотря на заметные успехи в области трансгенеза птиц, само создание трансгенных кур представляет сегодня определенную проблему. Особенности воспроизводства и развития кур [Petitte, Mozdziak, 2002] значительно снижают эффективность традиционного метода введения экзогенной ДНК в клетки животных - микроинъекции, что требует поиска и разработки альтернативных методов направленного переноса генов. Одним из таких направлений, интенсивно развивающихся в последние годы, является разработка методических подходов, связанных с использованием в качестве клеток-мишеней для введения рекомбинантной ДНК разных типов плюрипотентных стволовых клеток [Petitte et al., 2004; Zhii et al., 2005], в том числе примордиальных зародышевых клеток (ПЗК) - предшественников высоко дифференцированных половых клеток. Генетическая трансформация ПЗК с последующей их трансплантацией в эмбрионы кур in vivo рассматривается как перспективный метод целенаправленной генетической модификации гонад и получения трансгенной птицы. В связи с этим проведение исследований в данном направлении представляется актуальным в рамках разработки высокоэффективных трансгенных технологий с целью их дальнейшего использования в птицеводстве.

Цель и задачи исследований.

Исходя из выше изложенного, целью диссертационной работы явилось изучение результативности использования примордиальных зародышевых клеток (ПЗК) как векторов для генетической трансформации эмбрионов кур in vivo.

Для достижения указанной цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Изучить факторы, влияющие на эффективность выделения и поддержания в культуре ПЗК кур.

2. Выполнить генетическую трансформацию ПЗК in vitro и in vivo.

3. Оптимизировать метод генетической трансформации ПЗК in vitro.

4. Ввести трансформированные ПЗК в эмбрионы кур in vivo и изучить эффективность колонизации данными клетками гонад эмбрионов-реципиентов.

5. Разработать методические приемы, позволяющие повысить эффективность трансгенеза.

Научная новизна.

В ходе выполнения диссертационной работы изучены факторы, влияющие на эффективность выделения и поддержания в культуре ПЗК кур. Впервые дана сравнительная оценка различных методов генетической трансформации данного типа клеток in vitro и in vivo и выполнено введение трансформированных ПЗК в эмбрионы кур in vivo. Впервые изучена эффективность колонизации донорскими ПЗК гонад эмбрионов-реципиентов, а также исследовано влияние предъинкубационной обработки эмбрионов и концентрации донорских ПЗК на эффективность трансгенеза.

Практическая значимость.

Усовершенствован метод выделения ПЗК из эмбрионов кур и оптимизированы условия поддержания в культуре данного типа клеток. Предложен эффективный способ генетической трансформации ПЗК и их введения в эмбрионы кур in vivo. Оптимизированы отдельные этапы технологической цепочки генетической модификации гонад эмбрионов кур in vivo с эффективностью колонизации введенных трансформированных ПЗК до 39,1%. Предложен метод предъинкубационной обработки эмбрионов, блокирующий развитие эндогенных ПЗК в гонадах эмбрионов-реципиентов.

Основные положения, выносимые на защиту

• Способ дезагрегации ткани, стадия развития эмбрионов, разделение клеток по адгезии как факторы, влияющие на результативность получения культуры ПЗК кур.

• Электропорация как результативный способ генетической трансформации ПЗК in vitro.

• Эффективность колонизации донорскими ПЗК гонад эмбрионов-реципиентов.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на международных конференциях: «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования, образование», Санкт-Петербург, 2007; «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», Дубровицы, 2008, 2009.

Публикация результатов исследований.

По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе в центральных научных журналах, рекомендованных ВАК - 4.

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на 103 страницах, содержит 13 таблиц, 22 рисунка, 1 схему. Библиографический список содержит 117 источников, в том числе 96 на иностранных языках.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Томгорова, Евгения Константиновна

5. ВЫВОДЫ

1. Эффективность выделения ПЗК из эмбрионов кур зависит от способа дезагрегации ткани, метода очистки от других типов клеток и стадии развития используемого для выделения эмбриона. Максимальное количество ПЗК в гонадах эмбрионов установлено на шестой день инкубации - 4080±70. Показано, что при дезагрегации 6-дневных эмбрионов в растворе 0,05% трипсина с последующим разделением эмбриональных клеток по адгезии после 90 минут культивирования доля ПЗК в полученной суспензии клеток достигает 80,7±3,4% (р<0,001).

2. На продолжительность культивирования ПЗК кур влияет наличие и тип фидерного слоя. Максимальный период поддержания ПЗК в культуре установлен при их инкубации на фидере, представленном свежеизолированными эмбриональными фибробластами кур -7 дней. При использовании в качестве фидерного слоя культивируемых эмбриональных фибробластов кур и линии клеток STO данный показатель не превышал 5 дней, а при отсутствии фидерного слоя - 2 дней.

3. Высокая результативность переноса рекомбинантной ДНК в ПЗК кур выявлена при использовании метода электропорации - 61,1±6,3%. При применении ретровирусной трансфекции доля трансформированных клеток была достоверно ниже и не превышала в условиях in vitro 0,08±0,002%, in vivo -3,2±0,2% (р<0,005).

4. Максимальная эффективность трансфекции ПЗК in vitro установлена при действии на клетки-мишени электрического разряда напряжением 180В в течение 80 мкс.

5. Введение трансформированных ПЗК в дорсальную аорту 2,5-дневных эмбрионов способствует колонизации донорскими клетками гонад эмбрионов-реципиентов с результативностью 4,3±0,1% и эффективностью трансгенеза 42,0%.

6. Обработка эмбрионов кур до инкубации УФ в течение 90 минут достоверно снижает количество эндогенных ПЗК в гонадах в 24,6 раз (до 166±28 при 4080±70 в контроле, р<0,001). Введение трансформированных ПЗК в количестве 300-400 клеток на эмбрион после предъинкубационной обработки эмбрионов-реципиентов УФ достоверно повышает результативность генетической модификации клеток гонад до 39,1±3,4% (р<0,001) при эффективности трансгенеза 62,0-64,0%.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Лабораториям, занимающимся генной и клеточной инженерией животных, рекомендуем для эффективной трансформации ПЗК кур in vitro использовать метод электропорации.

Для эффективной генетической трансформации гонад эмбрионов кур рекомендуем осуществлять введение трансформированных ПЗК в дорсальную аорту 2,5-дневных эмбрионов в концентрации 300-400 клеток на эмбрион после предъинкубационной обработки эмбрионов-реципиентов УФ в течение 90 минут.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Томгорова, Евгения Константиновна, п. Дубровицы Московской обл.

1. Бессарабов Б. Ф. Инкубация яиц с основами эмбриологии сельскохозяйственной птицы / М.: КолосС. 2006. С.248.

2. Волкова Н. А. Фенотипический эффект экспрессии рекомбинантных генов в организме трансгенных животных: автореф. дисс. доктора биол. наук.- Дубровицы. 2008. С. 36.

3. Волкова Н. А., Зиновьева Н. А., Эрнст JI. К. Оптимизация отдельных элементов технологии создания трансгенной птицы // Боровск. 2006. С. 229. ,

4. Вракин В. Ф., Сидорова М. В., Панов В. П. Морфология сельскохозяйственных животных. Анатомия и гистология с основами цитологии и эмбриологии / М.: Гринлайт. 2008. С. 510-516.

5. Гистология / Под ред. Ю.И. Афанасьева, H.A. Юрина М.: Медицина, 2002. - 695с.

6. Гривенников И.А. Эмбриональные стволовые клетки и проблема направленной дифференцировки // Успехи биологической химии, т. 48, 2008. С. 181-220.

7. Зиновьева Н. А., Эрнст JI.K. Проблемы биотехнологии и селекции сельскохозяйственных животных // Дубровицы: ВИЖ. 2004. С. 316.

8. Зиновьева Н. А., Эрнст JI.K. Эффективность использования ретровирусных векторов для получения трансгенных кур // Дубровицы: ВИЖ. 2008. С. 224.

9. Зиновьева Н. А., Попов А. Н., Эрнст JI. К., Марзанов Н. С. Методические рекомендации по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве // Дубровицы: ВИЖ. 1998. С. 47.

10. Животная клетка в культуре (Методы и применение в биотехнологии) / Под ред. Проф. Л.П. Дьяконова, проф. В.И. Ситькова. М.: Компания Спутник+, 2000. - 400 с.

11. Микроскопическая техника: Руководство / под ред. Д.С. Саркизова, Ю.П. Перова. М.: Медицина, 1996. - 544 с.

12. Ромейс, Б. Микроскопическая техника / Б. Ромейс. Пер. с нем.

13. B.Я. Александрова, З.И. Кроковой -М.: Изд.-во иностр. лит.-ры, 1953. 718с.

14. Приданцева Т.А., Савченкова И.П., Сергеев Н.И., Эрнст Л.К. Выделение примордиальных половых клеток из зародышей мышей и их очистка // С-х биол. 2000. №2. С. 119—122.

15. Савченкова И.П. Эмбриональные стволовые клетки в биологии: настоящее и будущее // Дубровицы 1999. С. 93.

16. Сураева Н. М., Бырышников А. Ю., Фисинин В. П., Прокофьев М. И. Изучение эффективности различных способов трансфекции репортерного гена в эмбриональные клетки кур // Известия РАН. 2008. № 1.1. C. 18-23.

17. Сураева Н. М., Самойлов А. В. Получение фармацевтических белков с помощью трансгенной птицы // Вестник РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН. 2009. Т. 20, №4. С. 19-23.

18. Титова В. А., Зиновьева Н. А., Волкова Н. А. Использование ретровирусных векторов для переноса генов в органы-мишени у сельскохозяйственных животных // Международная конференция. 2001. С. 90.

19. Тулякова А.О. Генетическая трансформация эмбриональных клеток кур с использованием ретровирусных векторов: автореф. дисс. канд. биол. наук.- Дубровицы. 2010. С. 18.

20. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия / Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2004. 496 с.

21. Эрнст Л. К., Прокофьев М. И. Биотехнология сельскохозяйственных животных/М.: Колос, 1995. 192с.

22. Эрнст JI. К., Зиновьева Н. А., Брем Г. Современное состояние и перспективы использования трансгенных технологий в животноводстве / М.: РАСХН, 2002. 341с.

23. Bednarczyk М., Lakota P., Siwek М. Improvement of hatchability of chicken eggs injected by blastoderm cells // Poult. Sci. 2000. 79, 1823-1828.

24. Borwornpinyo S. Optimal hatchability of cultured chicken embryos from freshly laid eggs in surrogate eggshells // MS thesis, North Carolina State University. 2000. 85, 189-205.

25. Borwornpinyo S., Brake J., Mozdziak P., Petitte J. Culture of chicken embryos in surrogate eggshells // Poult. Sci. 2005. 84, 1477-1482.

26. Bosselman R., Hsu R., Boggs Т., Hu S., Bruszewski J. 1989. Germline transmission of exogenous genes in the chicken // Science. 1989. 243, 533-535.

27. Bradley A., Evans M., Kaufman M., Robertson E. Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines // Nature. 1984. 309, 255-256.

28. Brazolot C., Petitte J., Etches R. Efficient transfection of chicken cells by lipofection, and introduction of transfected blastodermal cells into the embryo // Mol. Reprod. 1991. 30, 304-312.

29. Capecchi M. Altering the genome by homologous recombination // Science. 1989. 244, 1288-1292.

30. Capecchi M. Generating mice with targeted mutations // Nat. Med. 2001. 7, 1086-1090.

31. Carsience R., Clark M., Verrinder Gibbins, A., Etches, R. Germline chimeric chickens from dispersed donor blastodermal cells and compromised recipient embryos // Development. 1993. 117, 669-675.

32. Chambers I., Colby D., Robertson M., Nichols J., Lee S. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells // Cell. 2003. 113, 643-655.

33. Chang I., Tajima A., Chikamune T., Ohno T. Proliferation of chick primordial germ cells cultured on stroma cells from the germinal ridge // Cell Biol. Int. 1995a. 19, 143-149.

34. Chang I., Yoshiki A., Kusakabe M., Tajima A., Chikamune T. 1995b. Germ line chimera produced by transfer of cultured chick primordial germ cells // Cell Biol. Int. 1995b. 19, 569-576.

35. Chang I., Jeong D., Hong Y., Park T., Moon Y., Ohno T. Production of germline chimeric chickens by transfer of cultured primordial germ cells // Cell Biol. Int. 1997. 21,495-499.

36. Chapman, Hu W., Ivarie R. Rapid and improved method for windowing eggs accessing the stage x chicken embiyo // Mol. Reprod. 2005. 69, 31-34.

37. Conover J., Ip N., Poueymirou W., Bates B., Goldfarb M., DeChiara T. Ciliary neurotrophic factor maintains the pluripotentiality of embryonic stem cells//Development. 1993. 119, 559-565.

38. Du L., Jing A. The investigation of cell culture conditions to maintain chicken embryonic stem cells as totipotent cells // Asian-Aus. J. Anim. Sci. 2003. 16, 1102-1107.

39. Etches R., Clark M., Toner A., Liu G., Gibbins A. Contributions to somatic and germline lineages of chicken blastodermal cells maintained in culture //Mol. Reprod. 1996. 45, 291-298.

40. Evans M., Kaufman M. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos //Nature. 1981. 292, 154-156.

41. Eyal-Giladi H., Kochav S. From cleavage to primitive streak formation: a complementary normal table and a new look at the first stages of the development of the chick // Developmental Biology. 1976. 49, 321-337.

42. Eyal-Giladi H., Ginsburg M., Farbarov A. Avian primordial germ cells are of epiblastic origin // J. Embryol. Exp. Morphol. 1981. 65, 139-147.

43. Fraser R., Carsience R., Clark M., Etches R., Gibbins A. Efficient incorporation of transfected blastodermal cells into chimeric chicken embryos // Int. J. Dev. Biol. 1993. 37, 381-385.

44. Joyner A. IRL PRESS at Oxford University Press. 2003. P. 109.

45. Gajovic S., Gruss P. Differentiation of the mouse embryoid bodies grafted on the chorioallantoic membrane of the chick embryo // Int. J. Dev. Biol. 1993. 42, 225-228.

46. Ha J., Park T., Hong Y., Jeong D., Kim J., Kim K. Production of germline chimeras by transfer of chicken gonadal primordial germ cells maintained in vitro for an extended period // Theriogenology. 2002. 58, 1531-1539.

47. Harvey A., Speksnijder G., Bough L., Morris J. Consistent production of transgenic chickens using replication-deficient retroviral vectors and high throughput screening procedures // Poult Sci. 2002a. 81, 202-212.

48. Harvey A., Speksnijder G., Bough L., Moms J. Expression of exogenous protein in the egg white of transgenic chickens // Nat Biotechnol. 2002b. 20, 396-399.

49. Horiuch H., Tategaki A., Yamashita Y., Hisamatsu H., Ogawa M. Chicken leukemia inhibitory factor maintains chicken embryonic stem cells in the undifferentiated state // J. Biol. Chem. in press. 2004. 75, 148-157.

50. Illmensee K., Mintz B. Totipotency and normal differentiation of single teratocarcinoma cells cloned by injection into blastocysts // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1976. 73,549-553.

51. Kamihira, Pain S., Leibo M., Cochran M. Production of chicken chimeras from injection of frozen-thawed blastodermal cells // Poult. Sci. 2005. 76, 753-760.

52. Karagenc L., Petitte J. Soluble factors and the emergence of chick primordial germ cells in vitro // Poul. Sci. 2000. 79, 80-85.

53. Karagenc L., Cinnamon Y., Ginsburg M., Petitte J. Origin of primordial germ cells in the prestreak chick embryo // Dev. Genet. 1996. 19, 290301.

54. Kawaguchi T., Nomura K., Hirayama Y., Kitagawa T. Establishment and characterization of a chicken hepatocellular carcinoma cell line, LMH // Cancer Res. 1987. 47, 4460-4464.

55. Kawabe Y. Production of scFv-Fc Fusion Protein Using Genetically manipulated Quails // Biosciens and Bioengineering. 2006. Vol. 102. P. 297-303.

56. Kwon M., Koo B., Choi B., Lee H., Kim Y., Shim H., Kim J.-H. Development of transgenic chickens expressing enhanced green fluorescent protein // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2004. 320, 442-^148.

57. Koo B., Koo B., Choi B., Lee H. Development of transgenic chickens expressing enhanced green fluorescent protein // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2006. 320, 442^148.

58. Le Douarin N., McLaren A. Chimeras in Development Biology // Academic Press, London; Orlando. 1984. P. 456.

59. Liu G. 1995. Targeted modification of the genome in chicken blastodermal cells//PhD thesis, University ofGuelph. 1995. 145, 125-128.

60. Martin G. Teratocarcinomas and mammalian embryogenesis // Science. 1980. 209, 768-776.

61. Martin G. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1981. 78, 7634-7638.

62. Martin G., Evans M. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1975. 72, 1441-1445.

63. Marzullo G. Production of chick chimaeras 11 Nature. 1970. 225, 7273.

64. Matsui Y., Zsebo K., Hogan B. Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture // Cell. 1992. 70, 841-847.

65. McLachlan J. A simple method of preparing chick eggs for chorioallantoic grafts //Experientia. 1982. 38, 141-142.

66. Mintz B., Illmensee K. Normal genetically mosaic mice produced from malignant teratocarcinoma cells // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1975. 72, 3585-3589.

67. Mitsui K., Tokuzawa Y., Itoh H., Segawa K., Murakami M. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells // Cell. 2003. 113, 631-642.

68. Mozdziak P., Angerman-Stewart J., Rushton B., Pardue S. Isolation of chicken primordial germ cells using fluorescence-activated cell sorting // Poult. Sci. 2005. 84, 594-600.

69. Mozdziak P., Borwornpinyo S., McCoy D., Petitte J. Development of transgenic chickens expressing bacterial beta-galactosidase // Dev. Dyn. 2003a. 226, 439-445.

70. Mozdziak P., Pophal S., Borwornpinyo S., Petitte J. Transgenic chickens expressing beta-galactosidase hydrolyze lactose in the intestine // J. Nutr. 2003b. 133, 3076-3079.

71. Muramatsu T., Mizutani Y., Ohmori Y., Okumura J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. 230, 376-380.

72. New D. A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro // J. Embryol. Exp. Morphol. 1995. 193, 320-331.

73. Nichols J., Evans E., Smith A. Establishment of germ-linecompetent embryonic stem (ES) cells using differentiation inhibiting activity // Development. 1990. 110, 1341-1348.

74. Nichols J., Chambers I., Smith A. Derivation of germline competent embryonic stem cells with a combination of interleukin-6 and soluble interleukin-6 receptor // Exp. Cell Res. 1994. 215, 237-239.

75. Nieuwkoop P., Sutasurya L. Primordial germ cells in the chordates: embryogenesis and phylogenesis // Cambridge University Press, Cambridge Eng.; New York. 1989. P.187.

76. Nolan C., Killian J., Petitte J., Jirtle R. Imprint status of M6P/IGF2R and IGF2 in chickens // Dev. Genes Evol.2001. 211, 179-183.

77. Pain B., Clark M., Shen M., Nakazawa H., Sakurai M., Samarut J. Long-term in vitro culture and characterisation of avian embryonic stem cells with multiple morphogenetic potentialities // Development. 1996. 122, 2339-2348.

78. Pain B., Chenevier P., Samarut J. Chicken embryonic stem cells and transgenic strategies // Cells Tissues Organs. 1999. 165, 212-219.

79. Park T., Han J. Derivation and characterization of pluripotent embryonic germ cells in chicken // Mol. Reprod. 2000. 56, 475^482.

80. Park T., Hong Y., Kwon S., Lim J., Han J. Birth of germline chimeras by transfer of chicken embryonic germ (EG) cells into recipient embryos // Mol. Reprod. 2003. 65, 389-395.

81. Perry M. A complete culture system for the chick embryo // Nature. 1998. 331, 70-72.

82. Pittoggi C., Beraldi R. Complete culture system for the chick embryo //Nature. 2006. Vol. 331. P. 70-72.

83. Petitte J., Yang Z. Method of producing an avian embryonic stem cell culture and the avian embryonic stem cell culture produced by the process // In US patent. 1994. 53, 42-45.

84. Petitte J., Kegelmeyer A. Rapid sex determination of chick embryos using the polymerase chain reaction //Anim. Biotechnol. 1995. 6, 119-130.

85. Petitte J., Liu G., Yang Z. Avian pluripotent stem cells // Mechanisms of Development. 2004. 121, 1159-1168.

86. Petitte J.5 Mozdziak P. Production of transgenic poultry // In: Pinkert, C.A., (Ed.), Chapter 11 in Transgenic Animal Technology, A Laboratory Handbook, Academic Press, New York. 2002. P. 525.

87. Petitte J., Clark M., Liu G., Verrinder Gibbins A., Etches R. Production of somatic and germline chimeras in the chicken by transfer of early blastodermal cells//Development. 1990. 108, 185-189.

88. Prelle K., Zink N., Wolf E. Pluripotent stem cells—model of embryonic development, tool for gene targeting, and basis of cell therapy //Anat. Histol. Embryol. 2002. 31, 169-186.

89. Raveh D., Friedlander M., Eyal-Giladi H. Nucleolar ontogenesis in the uterine chick germ correlated with morphogenetic events // Exp. Cell Res. 1996. 100, 195-203.

90. Resnick J., Bixler L., Cheng L., Donovan P. Long-term proliferation of mouse primordial germ cells in culture // Nature. 1992. 359, 550-551.

91. Ricks C., Mendu N., Phelps P. The embryonated egg: a practical target for genetic based advances to improve poultry production // Poult. Sci. 2003. 82, 931-938.

92. Rose T., Weiford D., Gunderson N., Bruce A. Oncostatin M.(OSM) inhibits the differentiation of pluripotent embryonic stem cells in vitro // Cytokine. 1994. 6, 48-54.

93. Rosenblum C., Chen H. In ovo transfection of chicken embryos using cationic liposomes //Transgenic Res. 1995. 4, 192-198.

94. Rowlett K., Simlciss K., 1987. Explanted embryo culture: in vitro and in ovo techniques for the domestic fowl // Br. Poult. Sci. 1997. P. 28.

95. Salter D., Smith E., Hughes S., Wright S., Crittenden L. Transgenic chickens: insertion of retroviral genes into the chicken germ line // Virology. 1992. 157, 236-240.

96. Sang H. Prospects for transgenesis in the chick // Mech. Dev. 2004. 121, 1179-1186.

97. Selleck M. Culture and microsurgical manipulation of the early avian embryo // Methods Cell Biol. 1996. 51,1-21.

98. Shamblott M., Axelman J., Wang S., Bugg E., Littlefield J. Derivation of pluripotent stem cells from cultured human primordial germ cells // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1998. 95, 13726-13731.

99. Smith A., Hooper M. Buffalo rat liver cells produce a diffusible activity which inhibits the differentiation of murine embryonal carcinoma and embryonic stem cells // Dev. Biol. 1987. 121, 1-9.

100. Soodeen-Karamath S., Gibbins A. Apparent absence of oct % from the chicken genome // Mol. Reprod. Dev. 2001. 58, 137-148.

101. Speksnijder G. Flourescence activated cell sorting of transfected chicken blastodermal cells prior to injection into recipient embryos // MS thesis, University of Guelph, Guelph, Ont. 1996. P. 165.

102. Speksnijder G., Ivarie R. A modified method of shell windowing for producing somatic or germline chimeras in fertilized chicken eggs // Poult. Sci. 2000. 79, 1430-1433.

103. Song Y., D'Costa S., Pardue S., Petitte J. Production of germline chimeric chickens following the administration of a busulfan emulsion // Mol. Reprod. Dev. 2005. Vol. 70. P. 438-444.

104. Swift C. Origin and early history of primordial germ cells in the chick //Am. J. Physiol. 1914. 15,483-516.

105. Tada T., Tada M., Hilton K., Barton S., Sado T., Takagi N. Epigenotype switching of imprintable loci in embryonic germ cells // Dev. Genes Evol. 1998. 207, 551-561.

106. Thomson J., Marshall V. Primate embryonic stem cells // Curr. Top. Dev. Biol. 1998.38, 133-165.

107. Thomson J., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S., Waknitz M., Swiergiel J. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts // Science. 1998. 282, 1145-1147.

108. Thoraval P., Afanassieff M., Cosset F., Lasserre F., Verdier G. Germline transmission of exogenous genes in chickens using helper-free ecotropic avian leukosis virus-based vectors // Transgenic Res. 1995. 4, 369-377.

109. Tsunekawa N., Naito M., Sakai Y., Nishida T., Noce T. Isolation of chicken vasa homolog gene and tracing the origin of primordial germ cells // Development. 2000. 127, 2741-2750.

110. Watt J., Petitte J., Etches R. Early development of the chick embryo // Journal of Morphology. 1993. 215, 165-182.

111. Weaver J. Electroporation of cells and tissues // IEEE Trans. Plasma Sci. 2000. 28, 24-33

112. Wei Q., Croy B., Etches R. Selection of genetically modified chicken blastodermal cells by magnetic-activated cell sorting // Poult. Sci. 2001. 80, 16711678.

113. Wolf E., Kramer R., Polejaeva I., Thoenen H., Brem G. Efficient generation of chimaeric mice using embryonic stem cells after longterm culture in the presence of ciliary neurotrophic factor // Transgenic Res. 1994. 3, 152-158.

114. Yang Z., Petitte J. Use of avian cytokines in mammalian embryonic stem cell culture // Poult. Sci. 1994. 73, 965-974.

115. Yasuda Y., Tajima A., Fujimoto T., Kuwana T. A method to obtain avian germ-line chimaeras using isolated primordial germ cells // J. Reprod. Fertil. 2001. Vol. 96. P. 521-528.

116. Zhao D., Kuwana T. Purification of avian circulating primordial germ cells by nycodenz density gradient centrifugation // Br. Poult. Sci. 2003. Vol. 44. P. 30-35.

117. Zhu L., van de Lavoir M., Albanese J., Beenhouwer P. Production of human monoclonal antibody in eggs of chimeric chickens // Nat. Biotechnol. 2005. Vol. 23. P.115-119.