Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика новых биоактивных соединений мозгового слоя надпочечников быка

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Характеристика новых биоактивных соединений мозгового слоя надпочечников быка"

АКАДЕМИЯ НАУК АРМЯНСКОЙ ССР ИНСТИТУТ БИОХИМИИ

На правах рукописи

ПАРОНЯН ЗОЯ ХАЧАТУРОВНА

УДК 577.112

ХАРАКТЕРИСТИКА НОВЫХ ШОАКШВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ МОЗГОВОГО СДОЯ НАДПОЧЕЧНИКОВ БЫКА

03.00.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ереван - 1590

Работа выполнена в Институте биохимии АН Армянской ССР (директор - академик АН Армянской ССР, профессор А.А.Галоян).

Научный руководитель: доктор биологических наук

Р.М.Срашонян

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Г.С.Хачатрян,

доктор биологических наук Р.Г.Камалян

Ведущее учрездеяие - Ереванский государственный университет.

у • /1 О О

Защита состоится " .- г" О'^г^с&пХ 1990 г. в ¡и. ч. на заседании специализированного совета Д 005.15.01 по защите . диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Институте биохимии АН АрмССР (375044, Ереван-44, ул. П.Севака 5/1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии АН АрмССР.

Автореферат разослан " У " Сг ^ г с/^/) Л990 г.

Ученый секретарь, специализированного совета, доктор биологических наук,

профессор с-с^о А.А.Симонян

_ з -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема регуляции одна из центральных в биологии, поскольку она непосредственно связана со становлением и поддержкой гомеостаза, обеспечивающего относительное постоянство организма при непрерывно меняющихся условиях его внутренней и внешней среды. Многие регуляторные процессы опосредованы пептидами - эффекторами и модуляторами соответствующих систем, контролирующих последовательность жизненно ванных событий, протекающих в организме. Последние десятилетия ознаменовались открытием множества биоактивных пептидов не только в ЦНС, но и в периферической НС. Значительно возрос интерес и к исследованию мозгового слоя надпочечников, в особенности хро-маффинных гранул, отличающихся высоким содержанием классических трансмиттеров и пептидов, обладающих функциональной гетерогенностью ( , 1980). К ним относятся нейропептид У (Сог-¿&г , 1984), вазоактивный инте^.тинальный полипептид, вещество Р ( Р$1з1ег , 1983), две низкоаьолекулярнне формы соматостатин-14 и -18-подобных пептидор (ВмгсЬ , 1981), нейротензин ( Сое-{^eг¿ , 1983), фактор, ингибирующий секрецию альдостерона (3)е. ¿еап- > 1985), натрийуретический фактор и его предшественник (7!па^лкс , 1986), несколько о-гликозилированных пептидов и ряд опиоидных пептидов ( Сгембет.^ , 1985). Последние являются наиболее изученными пептидами хромаффинной ткани.

Дале этот краткий перечень свидетельствует о перспективности и необходимости развития исследований в области изыскания и целенаправленного поиска новых физиологически активных веществ из группы природных соединений в мозговом слое надпочечников.

В этом аспекте определенный интерес представляют ранее (Га-лоян, Срапионян, 1973) обнаруженные в мозговом слое надпочечников крупного рогатого скота кардиоактивные соединения. Помимо общетеоретического значения интерес к ним, а также дальнейшие интенсивные исследования по их идентификации были обусловлены обнаруженным А.А.Галояном и сотр. феноменом - участием надпочечников в реализации коронарорасширяющего эффекта гипоталамическо-го кардиотропного нейрогормона "С". Тем не менее многие вопросы, касающиеся исследования физико-химических и биологических

свойств этих соединений оставались не изученным. Открытым оставался сопрос о возможности существования в мозговом слое надпочечников рдца неидентифицированных кардиоактивных соединений.

Цель и задачи исследований. Основной целью настоящего исследования явились поиск и изучение кардиоактивных соединений мозгового слоя надпочечников быка. В соответствии с поставленной цель» были определены следующие задачи:

1. Разработка эффективных методов получения высокоочищен-ных препаратов кардиоактивных соединений мозгового слоя надпочечников.

2. Сравнительное с гипоталамическши кардиоактивными ней-рогормонами "К", "С1',. "Г" изучение физико-химических свойств указанных соединений.

3. Изучение некоторых биохимических свойств искомых соединений мозгового слоя надпочечников на предает их участия в ряде метаболических процессов в мозгу и различных органах.

Научная новизна, и практическая ценность. В мозговом слое надпочечников быка впервые идентифицированы новые кардиоактив-ные пептидные и гликопептидные соединения. Разработка адекватной схемы выделения и очистки указанных соединений позволила отдифференцировать индивидуальные соединения (8) друг от друга. Изучены физико-химические, макромолекулярные и биологические свойства указанных соединений. Исследовано влияние рН, денатурирующих агентов на биоактивность соединений. Показано участие кардиоактивных соединений в ряде метаболических процессов в организме (регуляция внутриклеточного уровня цАМФ мозга путем ин-гибирования активности ФДЭ цАМФ, гликогенолиз, пресинаптическая регуляция высвобождения [%] НА из нервных окончаний гипоталамуса, функциональное состояние микроциркуетторного русла сердца крыс, коронарное кровообращение). Обнаружены белковые соединения, являющиеся носителями описанных соединений. На основании полученных результатов, свидетельствующих о наличии белков, связанных нековалентно с низкомолекулярными соединения!,га, сделана попытка предположить существование в мозговом слое надпочечников кардиоактивных белок-пептидных комплексов. Сравнение ряда изученных химических и биологических свойств кардиоактивных соединений мозгового слоя надпочечников с гипоталамическши кардио-шегявншз нейрогормонаг/гл, в частности, с одним из них - нС, и

полученные результаты позволяли заключить о том, что соединения двух регионов являются структурно и функционально родственными. Этот факт вызывай? возможность их прикладного применения, поскольку в перспективе кардиоакгнвные соединения могут быть использованы в медицине для профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний.

Публикации и апробации. Основное содержание работы изложено в 9 печатных работах. Материалы диссертации докладывались на 3-й и 4-й республиканской молодежной конференциях по физико-химической биологии (Агверан, 1985; Севан, 1987) и на Ш Всесоюзной конференции по нейроэндокринолоиш (Харьков, 1988).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на /02 страницах машинописного текста, включая 17 рисунков и 10 таблиц. Список цитированной литературы содержит 157 наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В опытах использовали баше беспородные крысы массой 150180 г, кошки массой 3-3,5 кг и для получения кардноактивных соединений мозгового слоя надпочечников - крупный рогатый скот. Для биохимических исследований из висцеральных органов крыс взяты ткани сердечной и скелетной мышц, мозг, почки.

Ионообменную хроматографию (ИОХ) проводили на ДЭАЗ-неллюло-зе и КМ-целлшозе с применением градиентной элюции, где значительный градиент концентрации соли ЛаС1 (от 0,002 М до 0,5 И) сочетался с небольшим понижением рН фосфатного буфера от 6,5 до 5,

Гель-фильтрацию низкомолекулярных соединений осуществляли на колонке с сефадексом С-ТО, а для белковых соединения на С-100. Элюшго вели бидистиллированной водой или борно-боратным буфером рН 7,8.

Тонкослойную хроматографию (ТСХ) на пластинках "Силуфол-254" проводили в системе растворителей бутанол-пиридин-уксусная кислота-вода (42:24:4:30).

Высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) пептидов проводили на колонке Г.Т— ' 0-10 , использовали градиент

концентрации ацегонитрила от 20 до 60%. Пептида детектировали при 210 юл. Хроматографию проводили под давлением 200 атм.

Нисходящую хроматографию на бумаге Яд/ -II осуществляли в системе растворителей бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:5).

Высоковольтный электрофоре 3V на бумаге осуществляли в камере типа ЭМ-1 при силе тока 70-80 мА, в системе пиридин-уксусная кислота-вода (10:0,4:90).

Спекторы оптического поглощения записывали на спектрофотометрах: "СФ-26", регистрирующем SP "ILüc^m!' модели SP-800 и проточном — ¿КВ 2238 Uvico%cL J II.

Биологическое тестирование проводили на кошках, наркотизированных гексеналом^.в условиях in sUu..

Количество белка определяли по методу ¿ояау и сотр. (IS5I).

Кислотный и щелочной гидролизы проводили 6н HCl при 110°, 1н Ja.ОН при 22 и 90° в течение 1-24 ч.

Ферментативный гидролиз трипсином и химотрипскном проводили в аммоний-бикарбонатном буфере, pH 8 в течение 1-24 ч. Соотношение фермент/субстрат поддерживали 1:80.

Аминокислотный анализ кардаоактивных соединений определяли после гидролиза препаратов в стандартных условиях (5,7н HCl, 22 ч, 110°) на автоматическом анализаторе "difitimeat £а,£аЛгоп," (ФРГ).

Моносахаридный состав определяли после метанолиза и ре-^/-ацегилирования и превращения образующихся при гидролизе моносахаридов в (4-метилкумарин-7-ил) гликамины (АЖ-сахара) и последующего их разделения ВЭЖХ на колонках с обращенной фазой и фдуорометряческим количественным определением (Хорлин, 1986).

Гликогенфосфорилазную ("а" и "б" - формы) активность определяли по 3ttiwgwovtlv (1953), активность фосфодиэстеразы (ФДЭ) - по методу РосА- (1971), модифицированного применением микрометода Бериташвили (1975).

К+-вызванное высвобождение и захват [3Н] -норадреналина (НА) изучали суперфузионным методом {Ra,He.bl , 1974) в синапто-сомах гипоталамуса крыс.

Функциональное состояние микроциркуляторного русла сердца крыс исследовали на наркотизированных крысах. Капилляры выя^ля-л>: цстодс»! Гомори по определению активности кислой -фоофатазы'в

модификации Сисакяна (1973). Подсчет числа капилляров вели по формуле Еяинкова-Моисеева (1961). Диаметр капилляров измеряли с помощью окуляр-микрометра M0B-I5, средний диаметр выврдили из измерений 50 капилляров.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

§ I. Выделение и очистка кардиоактивных соединений мозгового слоя надпочечников

Одним из необходимых условий для решения поставленных исследовательских задач явилось получение высокоочищенных препаратов кардиоактивных соединений. В этих целях была разработана методика очистки, включающая, прежде всего процедуры уксуснокислой экстракции ткани мозгового слоя надпочечников, обезжиривания полученного после осаждения надосадочного раствора и последующей лиофилизации. 1,5 г лиофилизированного порошка растворяли в 0,005 М фосфатном буфере и подвергали ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-ц. В вытекающих фракциях были обнаружены 4 пика коронарорас-ширяющей активности, условно обозначенные как MI , М2, >МЗ и Ш. После концентрирования активные фракции подвергали поочередно гель-фильтрации на сефадексе G-I0. В .большинстве исследуемых фракций, за исключением М2, были обнаружены дополнительные активности - MIj, MI2, Ж3, M3j, М32 и M4j, М4£. В последующем, все указанные соединения поочередно подвергали ВЭЖХ на колонке с обращенной фазой (М- S>ondapa,k, Cjg), которая не приводила к появлению дополнительных активностей, но позволила получить, особенно после рехроматографии на той же колонке, индивидуальные соединения. В результате описанных процедур были получены 8 кардиоактивных соединений, выход которых в суше составлял 0,5 мг в расчете на I кг "влажной ткани мозгового слоя надпочечников (табл. I).

' § 2:1. Основные макромолекулярные и биологические характеристики кардиоактивных соединений

Согласно полученным данным, УФ-спектрьг кардиоактивных соединений мозгового слоя надпочечников характеризуются максимумом поглощения при 210 нм.

Данные по изучению параметров распределительной хроматогра-

Таблица I

Содержание белка в кардиоактивных соединениях мозгового слоя надпочечников быка на различных стадиях очистки

Стадии ' очистки

Содержание пептидов (в мг/кг влажной ткани)

Фракции

Суммарное кол-вок^ел-

Лиофилизированный порошок смеси пептидных соединений

33000

Ж

М2 МЗ

М4

ИОХ на ДЭАЭ-ц

.10,5

17,5 9,2

II,I

48,3

М1]- ш2 ш3 М2 МЗГ М32 М4

I

М42

Гель-Фильтрация

на сефадексе -10 2,2 2,2 3,7 5,8 3,0 3,0 3,1 2,5 25,5

вэжх

0,03 0,05 0,07 0,07 0,05 0,09 0,07-0,09 0,52

Белок определяли по методу Лоури и сотр.

фии позволили их сгруппировать следующим образом: в 1-ю группу соединений, которых равен 0,13, входят М3| и факторы, во П-га с Ц 0,35 - факторы М1-£, М2, М32 и М42, в Ш-ю группу с ^ 0,48 входят Ж2 и Жд. Все указанные соединения обладают кислыми свойствами, что было установлено по данным, высоковольтного электрофореза на бумаге, параметрам хроматографии на анионо-'и катио-нообменниках и, наконец, по данным анализа аминокислотного состава. Так, остатки кислых аминокислот в трех наиболее изученных факторах М2, М3| и составляют примерно 20, 33 и 38 нольД. В то время как на долю основных аминокислот приходится в том же соответствии примерно 9, 19 и 8 мольД. Обращает на себя внимание высокое содержание определенной группы' аминокислот - глацина, сери-на, глутадшновой кислоты, составляющих примерно 50% от общей суммы аминокислотных остатков. В целом аминокислотный анализ выявил различия между факторами М2, М3£ и М4£ по трем аминокислотным остаткам - пролину, метионину и цистеину. Все три аминокислоты имеются в составе фактора М4| и, наоборот, отсутствуют з аминокис-■ лотном составе фактора М2. В аминокислотном составе фактора МЗ^-отсутствуют, остатки пролина и цистеина.--Сравнение величин ароматических аминокислот, фенилаланина и тирозина, выявляемых в сос-

таве указанных факторов показало преимущественное содержание их в аминокислотном составе М4-£. ^-концевыми аминокислотами, . определяемыми у 'факторов М2, М3| и М4р оказались треонин, валин, треонин соответственно.

Значения Лг, скорректированные с помощью аминокислотного анализа, оказались примерно равными для Ж, М3| и М4-|- факторов 900, 3600 и 3800 Д. Величины Лг для указанных факторов коррелировали с определяемыми гель-фильтрашей на сефадексе С -10 значениями Мл. - 1200, 4100 и 4200 Д (рис.1).

Уе/Уо 5 1?

4

3 , Л 1 \ 1 \

2 . 1 1 \ 1 ^Ч. 1

I . 1 ! 1 и 1 и ■ - > ■ 1—«—^—, 1 ■—■—* ■

3 3,3 3,6 4

Рис.1. График определения молекулярной массы кардиоактившх

факторов М2, МЗJ и М4£ методом гель-фильтрадии на колонке с сефадексом С-10. I - адренокортикотрошш, 2 - ангио-тензин, 3 - лей-энкефалин.

Несколько заниженные значения Лг для факторов Г.12, и при "определении молекулярного веса коррекцией данных его аминокислотного анализа, монно объяснить, по-видимому, наличием не пептидных, в частности, углеводных групп в молекулах этих соединений. Так, допускаемое предположение было подтверждено при анализе МЗ^- фактора в присутствии стандартных аминосахаров, выявляющего наличие глюкозаминов. Наличие последних свидетельство-

ззало о том, что молекула этого фактора гликозилирована, чем и обусловлена, по-видимому, в определенной степени его регистент-ность к воздействию кислот, щелочей и протеолитических ферментов, Использование метода, определяющего флуорометрически АМК-производные Сахаров, позволило получить информацию о моносаха-ридном составе коронароактивных факторов М2, МЗ2 и М4]- и соотнести их к типу -лА-гликозидносвязанных гликопептидов (табл.2).

Таблица 2

Моносахаридный состав коронароактивных факторов мозгового слоя надпочечников быка

Корокароактивные факторы (нг)

Сахара Соотно- Абсо-ношение лютное Сахаров кол-во по Со^ в пробе Соотношение Сахаров по Абсолютное кол-во в пробе Соотношение Сахаров по Ш Абсолютное кол-во в пробе

ие I ' 7,77 I 27,32 I 14,278

\Мллг 0,342 2,66 1,448 30,87 1,404 20,046

0,006 0,466 0,236 5,03 - -

Ры-с 0,179 1,391 0,897 19,12 0,846 * 12,079

йШАс 0,087 0,676 - - - -

Суммарное кол-во углеводов (у) 0,130 0,823 0,464

В таблице приведены усредненные данные трех определений.

Примечательно высокое содержание ыаннозы и галактозы во всех исследуемых соединениях. Наряду со сходством отмечено отсутствие определенных аминосахаров в моносахаридно;/ составе этих соединений; так, в факторе не выявлены СьвЛАс и С^е^Ас. , а в МЗ^- отсутствует только Ой,В«/Ас. В противоположность, в составе М2 обнаружены перечисленные все сахара. Различия между ■ факторами определены также по количественному соотношению сахарных остатков в углеводном компоненте (табл.2).

§ 2.2. О некоторых биологических свойствах кардиоактив-ных соединений

Из данных по изучению действия кардиоактивных соединений

- II -

надпочечников на коронарные сосуды сердца кошки в условиях зИи- следовало, что наибольшей коронарорасширяющей активностью обладают М2 а М3| (примерно 300 и 250$ соответственно) с продолжительностью действия от'90-150 мин и с явно нарастающей динамикой эйэекта. Наибольшей длительностью действия отличается фактор Щ2 (примерно до 4-х часов), однако, без нарастания эффекта. В отличие, фактору присуща выраженная динамичность действия; аналогично действует фракция Ш^. В основном под действием этих соединений кровяное давление не претерпевает заметных изменений. Исключение составляет фактор МЗ^, после внутривенной инъекции которого отмечено некоторое снижение кровяного давления.

Учитывая вышеописанное, значительное увеличение объемной емкости крови, оттекающей из венозных сосудов сердца, а также улучшение трофики миокарда сердца представлялось целесообразным проведение морфологических исследований по изучению функционального1-состояния микроциркуляторного русла сердца крыс. Было изучено воздействие трех из вышеуказанных факторов, а именно - 1Дд, МЗ2 и Ш2 на диаметр и количество функционирующих капилляров миокарда левого желудочка и матаелудочковой перегородки, а также диаметр капилляров интрамуральных ганглиев сердца крыс. Указанные соединения вводились крысам-самцам внутривенно в дозе 0,5 мл/100 г массы, что соответствует 300 мЕ активности ФДЭ цАМФ мозга; за единицу активности принимали то количество препарата, которое ингибирует I мЕ ФДЭ цАМФ за I мин. Как оказалось, по сравнению с контролем кардиоактивные соединения ГЯд, М3| и Ш2 вызывают увеличение среднего диаметра капилляров в исследуемых отделах сердца на 44-53$ на всем протяжении эксперимента. В интрамуральных ганглиях сердца соединения М1д и МЗ^ увеличивают диаметр капилляров на 14-17$ в течение 60 мин, а фактор М^ в первые 30 мин вызывает увеличение на 14,9$, а на 60-й минуте его влияние исчезает. Исследуемые соединения неодинаково действуют на плотность функционирующих капилляров как в левом желудочке, 'гак и в меяжелудочковой*перегородке. Факторы Жд и МЗ^-в первые 30 мин после их введения увеличивают число капилляров на I кв. глм на 28-32$, а к 60-й мин проявляют тенденцию к нормализации, в противоположность, фактор М4р свое влияние на плотность капилляров сильнее проявляет к 60-й глин. Динамика изменений диаметра и плотности капилляров такова, что суммарная пло-

- 12 -

щадь сечения капилляров на I кв мм площади С rv: 5Гга ) в ходе эксперимента увеличивается в 2,5-3 раза, при этом влияние фракций Шд и M3j к 60-й минуте несколько ослабевает, в го время как фракция M4g к этому времени еще бсльше увеличивает суммарную площадь сечения капилляров, что коррелирует с данными, полученными в опытах на кошках в условиях in, siiu- по воздействию этих соединений на объемную емкость, оттекающей из венозных сосудов сердца крови.

§ 2.3.1. Действие кардиоактивных соединений на ФДЭ цАШ

мозга

Из литературныХ-данных известно, что действие большинства гормонов - АКТГ, катехоламинов, глюкагона и многих других, осуществляется путем взаимодействия с аденилатциклазой ( Wicks, 1965; Sitb^Zt , 1974), ферментом биосинтеза цА®. В отличие, кардиотропный гипоталамический нС (Галоян и др., 1977), подобно ряду лекарственных препаратов ( Pb'c/L, 1971), принимает участие в регуляпии внутриклеточного уровня циклических нуклеотидов путем ингибирования ФДЭ.

При изучении действия кардиоактивных соединений мозгового слоя надпочечников на изменение активности ФДЭ цАМФ били получены данные, свидетельствующие об определенной корреляции с коро-нарорасширявщей активностью этих соединений, особенно факторов 1Л2 и М4Т. Однако, если ингибиругащее активность фермент действие фактора М2 значительно (от 0,5 до 1,7 Е) возрастало по мере его очистки, то у фактора M4j, в противоположность, отмечалось снижение эффекта с 2,7 до 1,6 Е. По мере очистки увеличивалось также ингибирующее действие факторов MIp MIg и, наоборот, уменьшалось у факторов M3j, ГЛЗ2 и М4£ (примерно с 2,2 до 0,5 Е). Фактор ГЯ3 не претерпевает особых изменений в ингибирозании отмеченной активности ФДЭ в ходе очистки. Уместно отметить, что данные, полученные при хроматографии описанных факторов на тонком слое, выявили, кроме ингибируадих, такке наличие активирующих ФДЭ пАШ фракций. По-видимому, этот факт может объяснить увеличение инги-бкрующей активности у некоторых факторов (MIj, М12 и 112) мозгового слоя надпочечников по мере очистки, обусловленное дифференциацией от примесных фракций, активирующих ФДЭ цАМФ.

§ 2.3.2. Изменение активности гдикогенфосфорилазы под дзйстЕием кардиоактивных соединений

Факт увеличения внутриклеточного уровня цАМФ путем ингиби-рования ФДЭ, выдвинул, в свою очередь, необходимость изучения

одного из ванныйшх ферментов начального этапа гликогеноли-за. Характер сдвигов изменений двух форм активности ГФ позволяет в известной степени судить об усилении гликогенолиза в сердце и скелетной мышце под действием 1Я3 (табл.3). В то же время при изучении действия М13 фактора на активность фосфорилазы в мозговой ткани ни в соотношении ФА/ФБ, ни в тотальной фосфори-лазной активности не обнаружено существенных изменений в течение исследуемого времени.

Органом-мшепью для фактора МЗр такке являются сердечная и скелетная мышцы, причем изменение активности гликогенфосфори-лазы под действием этого соединения носит разнонаправленный характер. Значительное (на 48й) понижение тотальной фосфорилазной активности в сердечной и повышение (на &2%) в скелетной мышцах мояно сравнить з аналогичны:.'! ранее обнаруженным физиологическим эффектом гапоталачического кардиотропного нейрогормона "С" (Пар-саданян, Абеляк, 1378). Можно предположить, что ксронарорасииря-юсее действие фчктора £13]-, такяе как и нейрогормона "С", связанное с улучшением снабжения тланл сердечной мышцы кислородом, способствует эффективному-протеканию аэробной фазы гликолиза. Б этих условию: затрата резервов гликогена для энергетических нузкд пояет быть несколько замедлена, что, в частности, отражается на снижения фосфорилазной активности. В отличие от фактора Г.ГГд под действием соединения М31, отмечены сдвиги в соотношении ФА/ФБ в мозгу и почках. Причем, если в мозгу выражено увеличение активности ФА на фоне неизменяющейся тотальной фосфорилазной активности, то в почках, наоборот, выявлено уменьшение активности ФА а одновременно уменьшение общей активности глжогенфосфорилазы.

Тотальная активность гликогснфосфорилазы под действием фактора ВЙ2 пе подвергается существенным изменениям. Однако, четкие изменения активности отдальвых #орм этого фермента приводят к разнонаправленным изменениям соотношений ФА/оБ, в частности, в сердце, скелетной кшше и мозгу. При этом, в сердце и мозгу происходит значительное пошиениг активности ФА в общем балансе а;;--

Таблица 3

Влияние факторов М13, ЬК^ и М42 на-активность гликогенфосфорилазы в Е (мкА Н/

мин/г ткали)

Исследуемая ткань Общая фосгоорилаза ФА/ФБ

Контроль 1Я3' МЗХ М42 Контроль щ3 Контроль М3| Контроль Ш2

Мозг 7,0+0,9 Р=оТг 7,4+1,2 6,4+0,5 7,6+1,5 р=0,2 р>0,2 р>0,2 0,16 0,19 0,16 0,72 0,16 0,3

Сердце 15,3+1,0 р<0,05 11,4+2,1 9,6+Т,8 13,3+1,7 р<0,05 р<0,025 р>0,1 0,07 1.3 0,22 0,14 0,07 0,56

Мышца 9,15+1,0 р<0(01 5,5+0,8 14,9±0,2 10,8+0,2 р<0,01 р<0,05 рт-0,5 0,19 0,74 0,57 0,07 0,57 0,11

Почка 5,4+1,3 р>0,2 4,9+0,7 3,1±0,7 4,2+0,5 р?0,2 р>0,2 р*0,1 0,53 0,64 1,53 0,47 1,53 . 1,58

Данные 7-8 опытов.

тивностз этого фермента. Эти данные могут, по-видалому, свидетельствовать об усилении гликолиза в этих органах при введении фактора М42« 3 скелетной мышце наблюдаются противоположные сдвиги в сторону увеличения активности ФБ. Полученные данные об усилении гликолиза в сердечной мышце под действием фактора кор-релизуют с его выраженным коронарорасширяющим эффектом. Очевидно, что описанные отличные изменения: активности гликогенфосфо-рилазы, особенно в сердечной и скелетной мышцах, под действием исследуемых факторов мозгового слоя надпочечников можно объяснить их структурными различиями,

§ 2.3.3. Действие кардиоактивных факторов на захват и высвобождение [%] НА в гипоталамических си-налтосомах

При оценке возможного участия кардиоактивных соединений мозгового слоя надпочечников в специфических для нервной ткани процессах существенным является обнаружение феномена их действия на ^-вызванное высвобождение и захват норадреналина (НА) в синаптосомах гипоталамуса крыс. Было изучено влияние различных концентраций Ш^, М1д, Ш, ЬК^ и простандартизирован-шх по единицам ингзбирующей активности ФДЗ цАМФ мозга.. Исследование показали, что соединение МЗТ э концентрации 5 мЕ/мл подавляет ^-вызванное высвобождение 1°Н] НА из синаптосом на 85% (риз.2), а в концентрации 10 ыЕ/ил на А&%. При увеличении концентрации соединения М3| до 25 мК/мя статистически достоверных изменений К+-выззанного высвобождения [%] НА более не наблюдается.

Исследуемые концентрации (рис.3) фактора М2 подавляют К4"-выззанное высвобождение ["Н3 НА из синаптосом, однако, статистически достоверным оказалось влияние 10 п мЕ/'мл концентраций, при которых этот процесс блокируется на 46 и 53% соответственно. Соединения М1р Р'1ч и М42 з концентрациях 5-50 глЗ/мя не оказывают влияния на К^внзванное высвобождение £3Н] НА пз пгаэтодвии-ческих синалтосои. Некоторое (27$) тормсжензе процесса К+-выз-ванного высвобождения Г^Н] НА наблюдается в присутствии 5 иЗ/ыл соединения М1д, но эти одь^хт: статистически не доотоворжг. В противоположность, все используоыые концентрации кардтчактп;:!::.':' соединений не вызывают достосорных кзмопекиЗ процесса оахвагя [,:л]

Ü 12 13 14 15 16

мин

Рис.2. Влияние кардиоактивного соединения M3j на К^-вызванное высвобождение [%] НА из гипоталашческих синаптосом. I - контроль, 2-5 мЕ/шг M3j фактора, 3-10 гдЕ/мл МЗр . р 0,005; средние данные 4-6 опытов, стандартные отклонения не более 10,%.

НА гипотадамическиш синаптосомами.

§ 2.3.4. Влияние pH, протеолиза и температурных воздействий на биологические и химические свойства кардиоадтивных соединений

Как показали результаты исследований, изучающих зависимость коронароактивных и ФДЗ цАМФ мозга кпгибирушщх свойств исследуемых факторов мозгового слоя надпочечников от экстремальных условий pH, шесть из этих соединений оказались нерезистентными к кислотным (6н HCl) и щелочным (1н Ja-W) воздействиям, теряя пол-

мин

Рис.3. Влияние кардиоактивного соединения М2 на К^-вызв^нное высвобоздение [%] НА из гипоталамических синаптосом. I - контроль, 2 и 3 - 25 и 10 м£!/мл М2 фактора. Остальные обозначения, что и на рис.2.

ностью свою нативдую активность. Два фактора"М3| и М4-]- частично инактивируются и вызывают увеличение коронарного оттока на 60 и 20$ после кислотного гидролиза. После щелочного гидролиза указанные соединения инактивируются в большей степени, изменяют коронарный отток лишь на 25 и 10%. Инактивация препаратов заметно увеличивается при повышении температуры до 90°. В этих условиях сохраняет коронароактивность только фактор МЗ^- и то лишь на 20$. ■

Коррелирующие с изменением коронарорасширягацей активности

данные были получены при изучении изменения ингибирующего ФДЭ цАМФ мозга действия.указанных факторов, подвергнутых кислотному гидролизу, проводимому в тех же условиях. Ингибирующая ФДЭ цАМФ активность М3| и.М4-£ факторов уменьшалась от 33$ (1,1 Е) до 25$ (0,7 Е) и от 48,2$ (1,6 Е) до 44$ (1,2 Е) соответственно. При щелочном гидролизе ингибирующая ФДЭ цЛМФ активность М4| фактора заметнее понижалась до 18,2$ (0,3 Е), а у МЗ2 - до 20$ (0,5 Е).

В зависимости от продолжительности действия протеолитичес-ких ферментов (химотрипсина и трипсина) фактор Ш либо частично инактивируется (в течение I часа), либо полностью (от 5 до 24 ч) теряет способность расширять коронарные сосуды. Коронароак-тивность факторов М3£ и М4£ уменьшается вдвое через I ч после начала протеолиза, сохраняясь в такой степени в последующие 24 ч. Остальные факторы - Ш^.МЬ,» М1д, М32 и М42, полностью теряют нативную коронароактивность через I ч после начала протеолиза.

Ингибирующая ФДЭ цАМФ способность факторов М2 не изменяется в течение первого часа трипсинолиза, в последующие 5 ч она уменьшается вдвое (от 0,4 Е до 0,2 Е) и исчезает полностью к концу протеолиза (24 ч). Таким же резким изменениям подвергается фактор М4р однако, в отличие от фактора М2 исчезновение его ингибирующего ФДЭ эффекта наблюдается уже через.5 ч после начала протеолиза. В отличие, ингибирующий эффект фактора М3£ в течение всей, продолжительности трипсинолиза изменяется очень незначительно (от 0,7 Е до 0,6 Е).

При химотрипсинолизе выявились различные сдвиги в изменении ингибирующей ФДЭ активности фактора 112, которая в течение первых 5 ч незначительно изменяется (от 0,4 Е до 0,3 Е), и лишь к концу протеолиза ингибирующий эффект уменьшается вдвое. Фактор М3£ в течение I ч не подвергается изменениям, значительнее уменьшается по сравнению с фактором М2 его ингибирующий эффект в течение 5 ч и сохраняется таким до конца протеолиза. Действие химотрипсина на ингибир.ующее ФДЭ действие фактора М4| несколько слабее выражено по сравнению с трипсином в первый час после начала протеолиза. Если указанный фактор в последующие 5 ч и далее при трипсинолизе оказывается полностью нерезистентным к действию фермента, .то при химотрипсинолизе он сохраняет свою инги-

- IS -

бирующую активность на 0,5 Е, уменьшая ее к концу протеолиза до С,3 Е.

§ 2.4. Выделение-и очистка коронарораспшряющих белков мозгового слоя надпочечников

Исходя из общепринятого мнения о том, что для проявления физиологического эффекта биоактивного фактора необходимо его предварительное взаимодействие с белком, а такие учитывая полученные в лаборатории данные о связывании коронароактивных соеда-нений с белками в сердце (Срапионян, Мксиряи, 1974) представлялся целесообразным поиск белков, связывающих описанные выше коро-нарорасширяющие низкомолекулярные факторы мозгового слоя надпочечников.

Использовали ранее разработанную (Срапионян и др., 1976) и используемую схему очистки, включающую традиционные методы выделения и очистки белковых соединений: фракционирование сульфатом аммония, ИОХ и голь-фильтрацию на сефадексе. В результате использованных процедур и последующего биотестирования было установлено н&тшчие в мозговом слое надпочечников двух коронарораспшряющих белков, условно обозначенных MBj и MBg. Данные по изучению изменения объемной емкости крови, оттекающей из венозных сосудов сердца, свидетельствовали о сравнительно низкой (примерно 60$) коронарораспиряющей способности MEj, MBg выявляет значительно больную (примерно 120?) коронароактивность. Исходя из полученных данных и одновременно учитывая реальную возможность существования в мозговом слое надпочечников белков, связывающих низкомолекулярные кардиоактивные факторы, о которых говорилось выше, мы попытались путем диализа этих белков в течение 48 часов против разбавленных (0,1-1 н) растворов уксусной кислоты отдиссошшровать высокомолекулярные и низкомолекулярные компоненты друг от друга. Контролируя вышеописанным биологическим тестом, пришли к заключению о том, что указанные белки лишаются присущей им коропароактивности. В противоположность, диализат обнаруживает способность расширять коронарные сосуда. В дальнейшем, водные растворы отдиссоциярозанных от низкомолекулярных начал белков денатурировали' кипечением в течение 5 мин, после охлаждения до 37°С к раствору белка добавляли трипсин, растворенный в борно-боратном-буфере, рН-8; соотношение фермент/субстрат

поддерживали 1:80 (по весу). Лликвоты забирали через 3, 6, 20 ч, проверяя на указанный биотест. Данные показали, что в результате трипсинолиза МБр начиная с'3-х ч инкубации до 20 ч, все отобранные аликвоты обладали явно выраженной коронарорасширяю-щей активностью, увеличивая объем крови, оттекающей из венозных сосудов сердца на 75$. Данные по биотестировашго аликвотов, отобранных из триптического гядролизата Ш>,, показали наличие коронарорасширяющего фактора только в одном из них, взятом через 20 ч после начала инкубации. Указанный триптический фрагмент обладает способностью расширять коронарные сосуды сердца примерно на 100$ по сравнению с нормой. Исходя из полученных данных макно заключить, что в результате протеолиза нскошх белков - МБ| и МБ^м выявляются фрашенты, обладающие эффективной способностью расширять коронарные сосуды.

На основании этих данных можно по аналогии с ранее описанным феноменом относительно наличия специфических кардиоактивных белок-гормональных комплексов в гипоталамусе (Срашюнян, Гало-ян, 1976) и в сердце (Срапионян и др., 1975) квалифицировать их как белок-пептидные комплексы.

Думается, обнаружение этих комплексов представит определенный интерес также в плане выяснения вопроса о механизмах реализации коронароактивных эффектов гипоталамических нейрогор-монов в тканях-мишенях.

выводи

1. В мозговом слое надпочечников быка впервые идентифицированы новые кардиоактивные пептидные и гликопептидные соединения. Разработка соответствующей схеш выделения и очистки указанных соединений позволила выделить в гомогенном виде 8 кардиоактивных соединений; условно обозначенные МХ^-, М^» ^з» М2, М31, М32, М^и М42.

2. На основании исследованных некоторых физико-хншческих и биологических свойств указанные соединения по ряду сходных параметров выделены в две основные группы:' а) резистентная группа, включающая факторы М31 и Щ-р б) нарозистентная группа, охватывающая остальные 6 факторов.

3. Выяснен по параметрам хроматографии на анионо- и катио-нообменниках, по данным высоковольтного электрофореза и анализа

аминокислотного состава кислый характер всех 8-и соединений. Установлены различия между ними по аминокислотному составу, молекулярному весу, коронароактивности. Установлено, что каждый из факторов обладает характерным и индивидуально выраженным ко-ронарорасширяющим действием.

4. Обнаружено, подобно гидоталамическому нейрогормону "С", действие трех из этих факторов (MIg, M3j, M4g) на функциональное состояние микроциркуляторного русла»сердца крыс. Показано увеличение диаметра капилляров на I кв мм примерно на 28-32$.

5. Изучено участие кардиоактившх соединений мозгового слоя надпочечников быка в ряде метаболических процессов:

! а) Показано участие факторов MIg, M3j и M4j в регуляции внутриклеточного уровня цАМ-5 мозга путем ингибирозания активности ФДЭ от 20 до 78<S.

б) Обнаружено разнонаправленное действие MIg и M3j на активность гликогенфосфорилазы в сердце (понижение активности фермента на 48$) и скелетной мышне (повышение активности фермента на 62%).

в) Выяснено участие M3j и LI2 в пресинаптической регуляции выявобождепия Е4 из нервных окончаний'гипоталамуса. Сопоставление полученных данных свидетельствует о дозозависимом ингибировании описанного пропесса под действием M3j и М2: концентрация 5 мЕ/мл подавляет высвобождение [3Н] El на 86$, удвоенная их доза - на 46$, а пятикратное увеличение не изменяет процесс высвобождения НА.

6. На основании экспериментальных данных, свидетельствующих о наличии двух белков, связанных нековачентно с коронарорас-ширящими низкомолекулярными факторами, выдвинуто предположение о существовании в мозговом слое надпочечников быка кардиоактив-ных белок-пептидных комплексов.

СПИСОК 0ГОТЖК0ВАШЖ РАБОТ ПО ТЕГ,iE ДЦ-ТССЕРТАЩМ

1. Паронян З.Х., Саакян С.А. О наличии новых биоактивных соединений в мозговом слое надпочечников крупного рогатого скота. - Тез. докл. 3-й роспубл. молодея, конф. по физ.-хим. биологии, 1985 г., Агзерап, с.36-37.

2. Абрамян С.С., Срапионян P.M., Паронян З.Х., Галоян A.A. Влия-

ние кардиоактивных соединений, выделенных из мозгового слоя надпочечников крупного рогатого скота, на капилляры сердца наркотизированных крыс. - Кровообращение АН АрмССР, 1987, т.20, & 6, с.12-15.

3. Паронян З.Х., Абрамян G.G., Григорян Л.А. О кардиоактивных " соединениях мозгового слоя надпочечников крупного рогатого

скота. - Тез. докл. 4-й ресрубл. молодея, конф, по физ.-хим. биологии, 1987 г., Севан, с.32.

4. Срапионян P.M., Паронян З.Х., Абрамян С.С., Григорян Л.А., Карапетян P.O., Галоян A.A. Выделение и очистка кардиоактивных соединений из медуллы надпочечников крупного рогатого скота. - Нейрохимия, 1988, т.7, JS I, с.61-67.

■5. Арменян А.Р., Аракелян Л.Н., Паронян 3.1., Абрамян С.С., Срапионян P.M. Влияние кардиоактивных соединений мозгового слоя надпочечников на захват и высвобождение [%] норадреналива в гипотаяамических синаптосомах. - Нейрохжшя, 1988, т.7, J5 I, с.78-82.

6. Паронян З.Х., Абелт ïl.T., Срапионян P.M. Влияние кардиоактивных соединений из мозгового слоя надпочечников крупного рогатого скота на активность гликогенфосфорилазы. - Тез. докл. Ш всесоюз. конф. по нейроэндокринологии, 1988 г., Харьков, с.179.

7. Абрамян С.С., Паронян З.Х., Срапионян P.M. Действие кардио-трогаюго соединения медуллы надпочечника на шкрониркулятор-ное русло сердца. Тез. докл. Ш всесоюз. конф. по нейроэндо-кринологии, 1988 г., Харьков, с.6.

8. Абелян П.Г., Паронян З.Х., Срапионян P.M., Галоян A.A. Изучение активности гликогенфосфорилазы под действием новых кардиоактивных соединений, выделенных из мозгового слоя надпочечников. - Биол. журн. Армении, 1988 г., т.41, В II, с.928-931.

9. Паронян З.Х., Срапионян P.M., Абрамян С.С., Григорян Л.А. Характеристика кардиоактивных соединений мозгового слоя над-почечникев быка. - Нейрохиг.шя, 1989, т.8, № 3.