Характеристика генов семейства SOD культурных (Zea mays) и дикорастущих (Larix sibirica, L. gmelinii) растений в связи с проблемой механизмов генетической регуляции

Катышев, Александр Игоревич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Характеристика генов семейства SOD культурных (Zea mays) и дикорастущих (Larix sibirica, L. gmelinii) растений в связи с проблемой механизмов генетической регуляции
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Характеристика генов семейства SOD культурных (Zea mays) и дикорастущих (Larix sibirica, L. gmelinii) растений в связи с проблемой механизмов генетической регуляции"

На права х^укописи

Катышев Александр Игоревич

ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОВ СЕМЕЙСТВА SOD КУЛЬТУРНЫХ (ZEA MAYS) И ДИКОРАСТУЩИХ (LARIXSIBIXICA, L. GMELINII) РАСТЕНИЙ В СВЯЗИ С ПРОБЛЕМОЙ МЕХАНИЗМОВ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ

03.00.12 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск - 2005

Работа выполнена в лаборатории генетической инженерии растений Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН, г. Иркутск

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Ю.М. Константинов

Официальные оппоненты: кандидат биологических наук ЕЛ. Таусон,

Сибирский институт фшиологии и биохимии растений СО РАН, г. Иркутск;

доктор биологических наук Д.Ю. Щербаков,

Лимнологический институт СО РАН, г. Иркутск

Ведущая организация: Институт цитологии и генетики СО РАН,

г. Новосибирск

Защита диссертации состоится «27» декабря 2005 г. в 14 ч на заседании диссертационного совета Д 003.047.01 при Сибирском институте фшиологии и биохимии растений СО РАН по адресу: 664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132, а/я 1243. Факс (3952) 510754; E-mail: matmod@sifibr.itk.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН.

Автореферат разослан 'J i "HcjbjtJ 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Г.П. Акимова

№>6-Y_ tl499l7

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Функционирование семейства генов, кодирующих супе роке иддисмутазы (СОД) различной внутриклеточной локализации (мигоховдрии, хлоро пласты, цитозоль, пе роке ис омы) в клетках эукариот, обеспечивает эффективную защиту организма от действия окислительного стресса. Несмотря на интенсивное изучение генов семейства СОД растений, многие аспекты эволюции структуры и функции данных генов у растений остаются пока недостаточно исследованными. С учетом важной роли ферментов ангиоксидангной защиты в жизненном цикле таких ценных в хозяйственном отношении растений, как хвойные и злаки, представляются весьма актуальными исследования, направленные на выяснение структуры, функции, регуляции и эволюции генов семейства СОД у этих организмов.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы было исследование структуры и экспрессии отдельных генов в составе семейства СОД у таксоном ически удаленных видов растений для выяснения возможных генетических механизмов регуляции их экспрессии. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучение организации кодирующих областей отдельных представителей генного семейства СОД хвойных растений Larix sibirica и Larix gmelinii путем секвенирования продуктов ПЦР и ОТ-ПЦР;

2. Изучение особенностей экзон-интронной организации генов СОД у L sibirica и L gmelinii;

3. Контекстный анализ полученных данных ло структурной организации генов и аминокислотных последовательностей СОД двух видов лиственниц методами биоинформатики;

4. Секвенирование и контекстный анализ потенциально регуляторных нетранслируемых областей мРНК генов СОД L sibirica и L gmelinii-,

5. Поиск и анализ генов, кодирующих хлоропластные СОД (РеСОД и Си/2лСОД) кукурузы.

Научная новизна. Впервые получены молекулярно-биологические доказательства экспрессии гена РеСОД кукурузы {Zea mays\ и определена частичная последовательность кДНК данного reía. Эти данные наряду с обнаружением в электронных базах данных EST высокогомологичных последовательностей кДНК РеСОД пшеницы (Triticum aesíivum) и сорго (Sorghum bicolor) позволили опровергнуть существовавшую ранее гипотезу об эволюционном замещении функции генов РеСОД у растений генами, кодирующими Си/йСОД.

Впервые определены последовательности кДНК и участков геномной ДНК генов, кодирующих хлоро пласт ные Си/ТпСОД двух видов лиственницы {Larix sibirica и L gmelinii). Результаты контекстного анализа этих последовательностей позволяют предположить существование значительных различий в регуляции экспрессии одного из генов Си/йСОД на посттранскрипционном уровне у Larix sibirica и L gmelinii.

Впервые определены последовательности к ДНК и геномной ДНК гена МпСОД двух видов хвойных растений. Анализ 3'-нетранслируемых последовательностей (HUI) мРНК гена МпСОД показал наличие в| Wt. ВДЭДЯд'ЙЯл^№12пнативных

з i библиотека i

сигналов полиаденилирования, что, по-видимому, послужило причиной обнаруженного в данной работе полиморфизма длины транекриттгов гена МпСОД Larix sibirica и L gmelinii. Обнаруженная эволюционная консервативность альтернативного полиаденилирования, выражающаяся в наличии потенциальных сигналов полиаденилирования в З'-нетранелирусмых последовательностях мРНК генов МпСОД растений и животных, свидетельствует о вероятной высокой зшчимости альтернативного полиаденилирования как механизма посттранскрипционной регуляции экспрессии данных генов.

Научная и практическая ценность работы. Настоящая работа направлена на изучение структуры и экспрессии отдельных генов в составе семейства SOD у таксономически удаленных видов растений для выяснения возможных генетических механизмов регуляции их экспрессии.

Публикации и апробация работы. Основные результаты диссертации изложены в 9 печатных работах. Материалы диссертации были доложены на V съезде ВОФР и международной научной конференции «Физиология растений -основа фигобиотехнологии» (Пенза, 2003 г), на всероссийской конференции «Стрессовые белки растений» (Иркутск, 2004), на международном симпозиуме "Физиология трансгенного растения и биобезопасность" (Москва, 2004), на международной конференции «Moscow Conference on Computational Molecular Biology» (MCCMB, Москва, 2005).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 207 работ зарубежных и отечественных авторов. Работа из ложе га га 125 страницах, содержит 20 рисунков и 4 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве объекта исследования использованы проростки кукурузы (Tea mays L. гибрид ВИР 42МВ) и долгоживущие каллусные культуры лиственницы сибирской (L sibirica Ledeb.) и Гмелина (L gmelinii Rupr.), получение и культивирование которых описано в работе Гарник с соавторами [Тарник и др., 2004].

Суммарную ДНК из каллусов L gmelinii, L sibirica, этиолированных проростков кукурузы и листьев резуховидки Таля (Arabidopsis thaliana) выделяли согласно [Devey et al., 1996]. Суммарную РНК из каллусов L gmelinii и L sibirica, этиолированных проростков кукурузы и листьев Arabidopsis thaliana выделяли по [Dong, Dunstan, 1996] без добавления ингибитора РНКаз - аурингрикарбоновой кислоты. Суммарную РНК из проростков кукурузы и листьев арабидопсиса выделяли с помощью набора RNeasy Mini Kit (QIAGEN, США) согласно инструкции производителя.

Праймеры для ПЦР и ОТ-ПЦР генов СОД подбирали с помощью программы из пакета VectoiNTI5 (Bethesda Inc, США) после выявления высоко консервативных участков в результате анализа выравнивания нуклеотцдных последовательностей генов СОД растений, представленных в электронной базе данных GenBank. В ОТ-ПЦР для синтеза первой цепи кДНК использовали в качестве матрицы 1 мкг тотальной РНК, предварительно обработанной в течение 15 мин ДНКазой I

(Fermentas, Литва) согласно инструкции производителя. Синтез первой цепи кДНК проводили с использованием в качестве олигонуклесггидной затравки олиго^Т)^ праймера с помощью обратной транскрипгазы ReveitAid™ Н Minus M-MuLV Reveise Transcriptase (Fermentas, Литва). Условия ПЦР и ОТ-ПЦР были стандартными.

Продукты ПЦР, ОТ-ПЦР и З'-RACE разделяли с помощью электрофореза в 1.2%-ном агаротном геле, содержащем бромистый этидий (0.5 мкг/мл), гели фотографировали в УФ<вете с использованием оборудования GelDoc (Bio-Rad, США). Для определения размера ПЦР-продукгов использовали 100 Ьр+1.5КЬ ДНК маркеры и 1Kb ДНК маркеры (СибЭнзим, РЬссия). Для экспериментов по клонированию и прямому секвенированию элюировали соответствующие фрагменты ДНК из агарозного геля с помощью набора NucIeoSpin Extract П (Mache rey-Nagel, Германия) согласно протоколу производителя.

Клонирование продуктов З'-RACE в составе плазмиды pBlueScriptKS(+) осуществляли по стандартной методике га [Клонирование ДНК, 1988].Выделение плазмвдной ДНК ю клеток Е coli осуществляли с использованием метода щелочного лгоиса [Маниатис и др., 1984]. Секвенирование проводили по методу Сэнгера на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 377 DNA Sequencer (Applied Biosystems, США) с использованием набора для секвенирования Thermo Sequenase И dye terminator cycle sequencing kit (USB, США) согласно инструкции производителя.

Для поиска гомологичных нуклеотидных последовательностей в электронной базе данных GenBank использовали программу BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.sov/BLAST) [McGinnis, Madden, 2004].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Получение ОТ-ПЦР-продуктов, соответствующих высококонсервативным участкам генов СОД растений

Множественное выравнивание представленных в электронной базе данных GenBank нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих различные типы СОД растений различных таксономических групп, позволило выявить относительно небольшие высококонсервативные участки в составе этих генов. Эти области были выбраны для подбора так называемых «универсальных» праймеров (isdcl, 6dc2, mncl, mnc2, chcscl, chcsc2 и chcspfi, табл. 2), предположительно позволяющих получить в результате реакции амплификации фрагменты генов Fe-, Мп- и Си/Й1СОД растений удаленных таксономических групп. Олигонуклеотидные последовательности генов СОД, которым соответствовали праймеры, являются высококонсервативными вследствие того, что соответствуют функциональным мотивам кодируемых данным и генам и белков.

Для оценки эффективности подобранных олигонуклеотидов проводили ОТ-ПЦР с использованием в качестве матрицы тотальной РНК, выделенной из проростков представителя однодольных растений - кукурузы (Z mays), двудольных -резуховидки Таля (A thalianá) и голосеменных хвойных - лиственницы Гмелина и сибирской. Продукты ОТ-ПЦР разделяли с помощью электрофореза в агарозном геле. Результат одного из таких экспериментов представлен на рис. 1 и 2. В целом

следует отметить, что использование невырожденных «универсальных» праймеров не приводило к появлению неспецифичных продуктов ОТ-ПЦР и ТТЦР в наших условиях. На рис. 2 приведены результаты оценки зависимости количества и чистоты продукта ОТ-ПЦР на мРНК лиственницы сибирской и Гмелина от использованной в реакции температуры отжига олигонуклеотидов к последовательностям кДНК генов Мп- и Си/гпСОД.

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 1. ОТ-ПЦР на мРНК эволюционно удаленных видов растений с использованием специфичных к генам СОД праймеров. 1-100 bp+1 5КЬ ДНК маркеры, 2,3 - ОТ-ПЦР на мРНК A thaliana и Zea mays, соответственно, с праймерами к гену СийпСОД, 4,5 - ОТ-ПЦР на мРНК А íhaliana и Zea mays, соответственно, с праймерами к гену МпСОД, 6,7 - ОТ-ПЦР на мРНК А thaliana и Zea mays, соответственно, с праймерами к гену МпСОД Цифрами указаны размеры продуктов ОТ-ПЦР, п н

МпСОД

L sibiríca

Cu/ZnCOfl

L. gmelinii м

Tan 48 50 53 56 58 48 50 53 56

- #41

L. sibijica L. gmelinii

^Ш^ШЖуЗЬ 50 53 Tan

Рис. 2. Оценка зависимости эффективности ОТ-ПЦР на мРНК L. sibiríca и L. gmelinii с праймерами к генам МпСОД и Си/ЖпСОД от температуры отжига. Tan - температура отжига праймеров (48°С, 50°С, 53°С, 56°С, 58°С), использованная в ОТ-ПЦР, М - 100 bp+1 5КЬ ДНК маркер, стрелками указаны продукты ОТ-ПЦР с указанием размера, п н

Положительные результаты амплификации на мРНК кукурузы с использованием праймеров к гену FeCOfl подтвердили выдвинутое нами на основе анализа литературных данных предположение о том, что генное семейство СОД данного вида должно быть представлено помимо ранее описанных генов [Fink, Scandalios, 2002] также и геном FeCOfl.

2. Секвенирование фрагмента кДНК гена РеСОД Zea mays. Получение in silico доказательств широкого распространения генов РеСОД у растений. Контекстный анализ аминокислотных последовательностей РеСОД растений

2.1. Секвенирование и сравнение кДНК гена РеСОД кукурузы с гомологичными последовательностями кДНК генов РеСОД других растений

Предполагамый фрагмент кДНК гена БеСОД кукурузы, образующийся в результате ОТ-ПЦР на мРНК кукурузы с использованием прайм еров É de 1/6 de 2, был очищен и секвенирован с использованием автоматического секвенатора. Анализ транслированной аминокислотной последовательности и исходной нуклеотвдной последовательности подтвердил соответствие секвенированного фрагмента кДНК гену БеСОД. Поиск в электронных базах данных позволил обнаружить ряд высокогомологичных нуклеотвдных последовательностей кДНК БеСОД других ввдов. Наиболее высокий уровень гомологии (85%) с секвенированной нами последовательностью демонстрировали кДНК гена БеСОД риса (Oryza sativa, GenBank accession numbeis: XM 550626, XM_493744, AK071301, AK062073, AB014056). В результате поиска также была обнаружена последовательность EST кукурузы (GenBank accession number AY112450) с еще более высокой гомологией, составлявшей 95%. Эти данные позволили нам сделать заключение, что секвенированная нами последовательность является частью кДНК гена БеСОД кукурузы, и поместить ее с соответствующей аннотацией в электронные базы данных ЕМВ1У GenBank (accession number AJ854254).

Ранее рядом исследователей высказывалось предположение о том, что эволюционно более древние гены БеСОД у большинства ввдов растений могли быть функционально замещены генами Си/7пС0Д [Van Camp et al., 1997]. Эта гипотеза была основана на том, что изначально именно гены, кодирующие Си/7пСОД хлоропластной локализации были обнаружены у многих растений, в то время как гены хлоропластных РеСОД у ряда активно изучаемых ввдов долгое время не удавалось идентифицировать. Обнаружение нами последовательностей кДНК БеСОД Zea mays, Triticum aestivum и Sorghum bicolor позволяет гам опровергнуть предположение о полном функциональном замещении генов БеСОД генами Си/2пС0Д и предложить два возможных объяснения того факта, что данные гены и кодируемых ими ферменты долгое время не удавалось выявить у ряда растений.

Первое объяснение связано с возможной камбиалистической природой ферментов БеСОД растений, т.е. возможностью использовать в качестве кофактора как ионы Бе, так и Мп. Основанием для данного предположения служит как неоднородность этой группы ферментов у бактерий, которые могут быть отнесены по первичной структуре и к Бе- и к Mn-содержащим белкам, так и первые представленные в литературе данные о камбиалистичности фермента МпСОД эукариотического организма - камфорного дерева (Cinnamomum camphora) [Chen et al., 2002]. Эти факты предполагают, что камбиалистические ферменты могут быть не только эволюционно переходной формой между Бе- и МпСОД, но и могут случайным образом появляться в разных ветвях эволюционного древа в результате структурных изменений Бе- или МпСОД.

Второе возможное объяснение связано с особенностями экспрессии генов БеСОД у растений, т.е. существованием, вероятно, ткане-, стадие- и/или стрессос пе циф ич ности экспрессии данных генов на фоне конститутивной экспрессии генов, кодирующих хлоропластные Си/2!пСОД.

2.2. Контекстный анализ аминокислотных последовательностей Ре-, Мп- и камбиалистических СОД прокариот и эукариот

С целью оценки возможной камбиалистической природы Ре- и МпСОД растений было проведено множественное выравнивание представленных в электронных базах данных 190 аминокислотных последовательностей Ре- и МпСОД прокариот и эукариот, ю которых 10 соответствовали ферментам, камбиалистическая природа которых была установлена с помощью биохимических методов. На основе » сравнительного анализа данных последовательностей удалось выявить ряд высококонсервативных аминокислотных остатков, различающихся у Ре- и МпСОД. Для большей части этих аминокислот ранее уже была определена их роль в формировании четвертичной структуры белка и реализации ферментативной функции (табл. 1).

Табл. 1. Функционально-значимые консервативные аминокислотные остатки последовательностей Мп- и РеСОД, предположительно определяющие мегаллоспецифичносч ь ферментов. ____

Аминокислота, Аналоге Аналог в структуре Предполагаемая или

положениев структуре FeCOfl МпСОД нзвестиая функция

первичной

структуре*

His(H)Z7 His Iiis Координация нова металла в

Ни(Н)74 Нв His активном центре

Asp(D)157 Asp Asp

His(H)161 His His

Gin (0)70 Gin Gly В КеСОД формирует

водородную связь с молекулой

сольвента (Н20 или ОН"),

которая является пятым

лигаядом для иона металла

Gill (Q)142 Ala Gin яла His Та же функция, что и у С1п70,

по в структуре МпСОД

Tyr(Y)35 Tyr Tyr Кластер из 8 аминокислот

Tyr(Y)77 Tyr»Phe Phe>Trp одной субъедниицы к 2

His(H)31 His His (возм искл) аминокислот другой

Trp(W)78 Trjp-Phe l'rp>Phe субъедниицы, участвующих в

Trp(W)123 Trp (возм. искл ) Trp формировании сети

Phe(F)lS6 Leu>Vat>Ile>Phe Leu>Val>lle>Phe водородных связей, которая

Trp(W)159 Trp (возм искл ) Trp определяет геометрию

Tyr(Y)163 Tyi>Trp Tyr>Phe каталитического центра

Gin(E)160 Glu Gin

Tyr(Y)164 Туг Tyr

GIy(G) 155 Thr>Val>Ite>Ala Gly>Ala>Gln Структурная функция;

Asn(N)73 Asn>Leu Asn связаны водородными связями

Trp(W)125 Trp>Tyr>Val "irp>Len>Phe сгап«»70

Gly(G)69 Ala>Asn Gly>Cys Участвуют в формировании

Mel(M)24 Leu>VaMle Met>A»n>Leu структуры активного центра

Pbe(F)65 Phe l,ys>Arf>Ala

Phe(F)76 PhoLeu lk>Leu>Val

Cys(C)80 Cys>Ser>Asn не Суя

Asp(D)166 Asp (возм искл) GIn>Asn>Lys>Arg

Примечания. * Нумерация положения аминокислотных остатков в структуре белков в соответствии с положением в последовательности НеСОД Е coli Знак > соответствует большей частоте встречаемости аминокислотного остатка, вочм искл - возможны исключения

На рис. 3 приведен усеченный вариант множественного выравнивания аминокислотных последовательностей РеСОД, МпСОД и камбиалистических ферментов бактерий и растений. Анализ представленных на рис. 3 данных позволяет с высокой долей уверенности утверждать, что ферменты МпСОД и РеСОД растений не могут являться камбиалистическими, поскольку наряду с Ре- и МпСОД других организмов характеризуются строгим набором специфичных для ферментов различного типа (Ре- или Мп-содержащие) аминокислот, потенциально определяющих металлоспецифичность ферментов. В отличие от Ре- и МпСОД растений камбиалистические ферменты прокариот одновременно содержат характерные функциональные аминокислотные остатки белков обеих групп -

24 27 31 35

Fe Fe Fe

Fe Fe

Ära tha Fei QT Ära tha Fe2 ET Ära tha Fe3 RT Gly max fce Rap sat Fe Pin pin Fe Ory sat Fe Zea may Tri aes Lnl rei Syn sp Fe Esc col Fe Bact fraCAM QT Por gm САМ ЙТ Rho cap CAM ETb Sin mel CAM ST

Fe Fe >e

QT QT qt RT RT RA QT ST et

;e8 ИлВ П fl

WGKH JGFH «GF H fJGKH lEtJtiGi HIRil iGF H IRT$? JGFH iGF H iGF H

¡1»

/ 3

с n I тр EI

ч i

hat per CAM EIЙЩ^Юф Aqu pyr CAM EQIEE I Pro fre CAM ilMEt| Pyr aer CAM ElHQ>I IQftl Chi aer CAM ATHHYH IDfcp

Б 8 «GF H IRifg/D-Vptffl, fei § IDF H С 'Л 8 l GF H

fGFH

IGF H .KTjtJ/D IDI H 1DFH

QINEi fl

QT TT QT

Мус tub Mn Esc col Mn Chi rei Mn Ple bor Mn Cm cam CAM Ory sat Mnl EI Zea may Mn3 EI Pis sat Mn Nie plu Mn Kl Ära tha Mnl Е1Щ Ära tha Mn2

tili

iofi Iii!

io№

rtifihTiii ffjfl 1tf h 1dfh IQi H iqf h 1QKN IQF H iQf а

IQF H IQF H

IR? HTD-A BINS

rei % 7E-A NNA

рощ/о-Ерг 1Q1

ffiS

m-t i

IQlti TT-\|§1N;

iQi | TN-i

5QC i lQlif

1Q1

/D-FB|JNAfeb Ii ОД 3 F Г1» TE-A f. JNAß 2 П Щ DP ГИ

/:; ??:»/■.......

7d-v f той

ÜflB ifW ГЦЩГТ.. {F jQ :i fF \QTW

x s зУ ми

tk-fsfnyä ta-ETFNYM ■idftehkite td-lafnl» i.

tn-lsfhln

TT-vRffldS l

iSF H №11 7K-I \ rNI | ;

/N-1 R iNipp 7N-2 R Wl

iQi'i/т-|кш| jj;

ш f TR-t к p ш t TV-J x m| I а КЛ1 CT-J к ткЩ3 1Q1 f TT-^pNi IQf 1

TT-I к J-Ni S HV UJI! | rw Mn Mn Mn

7374/;

Ii sjfi th rw < пчй Цrw'

¡■Q-c i t «: :м-с i i»: iw-c 14 J: 3n-g | 3 г. M-t i ^ V.

®)-c m i з:

'N-clu:

|||fw!i-c oj-C I 4 v

limits ITH) I i rw

i cg-c 14 q.-fc iv-G S| ^ e: ji-ci ai-c | / jn-g « t aj-G » T J: «-с S' OJ-C N T f: iN-C Й T iN-СЭДТИ.

5-lg f| t fl -ti;-LGF|Tfil -np t-lg ;f b"LGvM|fj .-khn-lv 8| ¡t

i-dhq-i.{ j-khn-la j-nqd-lg ,-DHQ-Ll^iMii

itpnar kälqykndr ijfvdyknkr "ifknvk fkndr fqykr tknvk 'qnrr fqnrr qnrr fKHVR fknvr fknvr fknvr 'knvr 'knvr

2KKNAR Mn

&& Mn

Рис. 3. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей камбиалистических, Мп- и РеСОД. Цифрами обозначены позиции функционально значимых аминокислот в соответствии с нумерацией в последовательности РеСОД Е coli, Fe и Mn соответствуют специфичным для FeCOJl и МпСОД аминокислотам Серым цветом выделены консервативные и высококонсервативные аминокислотные остатки САМ - камбиалистические ферменты СОД Прямоугольниками выделены функционально значимые аминокислотные остатки, как обпие для Мп- и ЬеСОД, так и характерные для пептидов Мп- или РеСОД

РеСОД и МпСОД. Таким образом, следует подвергнуть сомнению полученные в работе Чена с соавторами [Chen et al., 2002] данные, свидетельствующие о

возможной камбналиетической природе имеющего характерную аминокислотную последовательность МпСОД Cinnamomum camphora.

2.3. Стрессоиндуцируемая экспрессия гена FeCOДZea mays

Другим объяснением сложностей с выявлением генов РеСОД кукурузы и пшеницы может служить специфичность их экспрессии. Это предположение основано на представленных в работе Пастори с соавторами [Pastori et al., 2000] данных, свидетельствующих о строгой тка неспецифичности распределения активности РеСОД в листьях кукурузы. Обнаруженная в клетках мезофилла активность фермента FeCOfl возрастала примерно в 4 раза в условиях роста растений при субоптимальной (15°С)температуре.

С целью изучения эффекта низкотемпературного стресса на экспрессию гена РеСОД Zea mays на уровне транскрипции был поставлен эксперимент по Нозерн-гибрвдизации мРНК, выделенной из проростков кукурузы с зондом к гену РеСОД. В данном эксперименте этиолированные проростки, из которых затем выделяли РНК, инкубировались в течение 1, 3, 7 и 24 часов при температурах: 4°С, 16°С и 27°С. Результаты данного эксперимента позволили подтвердить правомочность гипотезы о существенной стрессоиндуцируемости гена РеСОД кукурузы, поскольку инкубация проростков в условиях низкой положительной температуры (4°С) приводила к повышению количества транскрипта гена РеСОД Zea mays в течение первых трех часов, а при более продолжительной инкубации - 7 и 24 часа -транскрипция гена снижалась. Более пролонгированное (до 24 часов) возрастание уровня мРНК reía РеСОД наблюдалось при инкубации проростков в условиях субоптимальной (16°С) температуры.

3. Исследование особенностей структуры генов Си/ХпСОД лиственницы 3.1. Секвепирование и анализ кДНКгенов Си/гпСОД Larix sibirica и L. gmelinii

Олигонуклеотидные праймеры chcscl/chcspr2 были использованы для получения соответствующих фрагментов кДНК генов Cu/ZnCOfl L sibirica и L gmelinii, которые после очистки элюцией из геля были секвенированы с помощью автоматического секвенатора. Контекстный анализ нуклеогидных и транслированных по ним аминокислотных последовательностей секвенированных ОТ-ПЦР продуктов показал, что они соответствуют генам Си/2пСОД.

В дальнейшем для выявления транекригтгов отдельных генов Cu/ZnCOfl двух видов Larix было использовано два основных подхода - получение и секвенирование 3'-концевых последовательностей генов Cu/ZnCOfl с помощью методов З'-RACE и 5'-RACE, а также анализ участков геномной ДНК, содержащей вариабельные некодирующие последовательности нитронов.

3.2. Получение, секвенирование и контекстный анализ З'-концевых последовательностей кДНК генов Си^пСОД лиственницы

На основе секвенированных последовательностей фрагментов кДНК генов Си/2пСОД двух видов Larix были подобраны специфичные праймеры для использования в экспериментах, направленных на получение и клонирование З'-концевых фрагментов кДНК интересующих нас генов Cu/ZnCOfl L. sibirica и L gmelinii с использованием З'-RACE метода. В результате этих экспериментов были

получены различающиеся по размеру (-500 и -600 п.н.) З'-концевые фрагменты кДНК Си/гпСОД генов для двух видов-представителей рода Ьапх.

Для доказательства соответствия данных фрагментов искомым кДНК генов Си/гпСОД было осуществлено определение их 5'-концевой последовательности путем секвенирования. Анализ секвенированных последовательностей показал, что все продукты З'-ЫАСЕ соответствовали кДНК генов СиЖпСОД. Для определения полноразмерных последовательностей З'-НТП продукты З'-ИАСЕ после электрофоретического разделения в агарозном геле были элюированы и клонированы в составе плазмиды рВ1ие8спрЖ.8(+) по сайту рестрикции ЕсоКV.

По результатам трансформации было отобрано 11 белых колоний, которые далее были проанализированы на наличие встройки и ее ориентацию в составе плазмиды с помощью ПЦР с комбинациями специфичных и универсальных праймеров. В итоге такой оценки было отобрано четыре клона со встройкой кДНК гена Си^пСОД (рис.4). Выделенная из клонов плазмидная ДНК после очистки использовалась в экспериментах по секвенированию.

1 2345в7вМЭ

Рис. 4. ПЦР-аналнз клонированных З'-концевых последовательностей кДНК генов Си/гпСОД La rix siblrica и L. gmelinii. 1 -9 - продукты ПЦР на плазмидной ДНК клонов 1 1 - 9 1 с использованием универсальных праймеров, М - 1Kb ДНК маркер Цифрами указаны приблизительные размеры ПЦР-продуктов

Анализ с помощью выравнивания секвенированных З'-концевых последовательностей кДНК Cu/ZnCOfl двух видов лиственницы показал, что из четырех клонированных последовательностей три существенно различаются по структуре З'-НТП. Поиск высокогомологичных последовательностей в электронных базах данных позволил выявить ряд близких по структуре последовательностей EST другого вида хвойных - сосны ладанной (Pinus taedä) и кДНК генов Cu/ZnCOfl сосны обыкновенной (Pinus sylvestris). На рис. 5 приведено множественное выравнивание секвенированных последовательностей кДНК Cu/ZnCOД Larix sibirica, L gmelinii и соответствующих областей кДНК Cu/ZnCOfl Р taeda и Р sylvestris. По результатам поиска гомологичных последовательностей и приведенного на рис. 5 выравнивания только одной из трех различных последовательностей 3'-концов к ДНК генов Cu/ZnCOД Larix sibirica, L gmelinii соответствуют близкие по структуре З'-НТП кДНК Р sylvestris и Р taeda.

Соответствующая кДНК Р sylvestris, как было показано в работе [Karpinski et al., 1992], кодирует хлоропластный фермент, что позволяет предположить возможную хлоропластную локализацию для кодируемых обнаруженными кДНК Cu/Zn СОД Larix ферментов. В целом, группа хлоропластных Си/7пСОД может быть выделена из общей группы Cu/ZnCO/I растений, основываясь на различиях аминокислотных последовательностей данных ферментов и ферментов цитозольной или внеклеточной локализации [Fink, Scandalios, 2002]. Для подтверждения этого

предположения был проведен сравнительный анализ небольших транслированных аминокислотных последовательностей всех четырех кДНК Си/7пСОД двух видов Larix и соответствующих последовательностей ферментов различной субклеточной локализации других растений. На рис.6 приведено выравнивание данных фрагментов, согласно которому транслированные аминокислотные последовательности секвенированных к ДНК Cu/ZnCOfl лиственницы близки по структуре соответствующим последовательностям хлоропластных ферментов и существенно отличаются от последовательностей ферментов другой локализации. Таким образом, анализ нуклеотидных и соответствующих им аминокислотных последовательностей кДНК генов Cu/ZnCOfl двух видов лиственницы показал, что кДНК генов Cu/ZnCOfl L gmelinii и L sibirica, по всей вероятности, кодируют различающиеся по нескольким аминокислотам в С-концевой части ферменты хлоропластной локализации.

L sibl

L gmel

L. gme2

L. sib2

P tae

P. syl

L sibl

L. gme1

L gme 2

L sib2

P. tae

P. syl

L sibl

L. gmel

L. gme2

L. sib2

P. tae

P. syl

L. sibl

L gmel L. gme 2 L. sib2 P. tae P. syl

L. sibl L. gme1 L. sib2 P. tae P syl

Рис. 5. Множественное выравнивание З'концевых последовательностей кДНК генов хлоропластных Си/гпСОД Larix sibirica, L. gmelinii, Pinus sylvestris н Р. taeda. L gmel, L gmc2 -кДНК Cu/ZnCOfl L gmelinii, P tae - кДНК P taeda, P syl - кДНК P sylvestris Серым цветом выделены идентичные и консервативные нуклеотидные остатки Прерывистые линии соответствуют инсерциям/делециям

Дополнительные доказательства существования как минимум двух генов Cu/ZnCOfl у лиственницы были получены в экспериментах по Саузерн-гибридизации и ПЦР геномных последовательностей генов Си^пСОД, а также в

AÜAefTTGeTATCAGTT^aAAT|cfGGGGTfAGiTTCGrT®GGCGTiT#CAÄATTCCTTC

-CJM#TCCACT#CfCGGAfC®S$TTCT§ATijGCACC

тшшюхятттагшфшш—ш^ш^ттшшшт^-^

TTTGCCTCCACTGCTATGTAAGGGTGCTATAGATTTTAAG—TGAGAAGAGGä

AGTGACTCCGGCGCACGAAAACGATGAAGAATGACTATACGACTGCACCTTC,

CGTATGAT----ACCAGGGACTGCAATAATAATTGGAAAAAATATGTTTTTTi

CGTATGAT----ACCAGTGACTGCAATAATAATTCAAATATATA-GTTCTCT;

CCACAATTCfCTfTC^CiCTGCAlA^lATGCAGGCTlAC-

|cfGTT---®ÜTiAfTiTGTAi,fTC^?®AGA-T&fTfGCTAe-

гшт^шв^тжа-тршщяшю-зт^-'шт^гф:-

экспериментах по получению и секвенированию 5'-концевых последовательностей кДНК данных генов с использованием метода 5'-ЯАСЕ.

tha Chi syl chl sib 1 gme 1 gme 2 sib 2 syl cyt A tha cyt P syl ext A tha per

m ELI D05CK«WEtSLTT(3ftGG!lLACGVVG^TPT-----

Щ DLI fraK«iEMLSI«6vfLACGGHE£CSfYW---

Щ ELI ÜOi®K«!EeLST«KGSLAeGVf GlTPf-----

Щ ELI MLGKGGHEbSLSTGNAGCRLACENPLLGSKF----

P ELI DDLGKGGHKLSLYTGNAGGRIACKWGLTPI-----

vi adi dd^kgghklskstgnäggrlacgvvglcg------

W AD! Ößf^K^iEjSLAT!ÄÄiGgVA0Gl|G|,QG------

m ADI MbeRSÜEföKTTSilSGlVAeGVTGEQSAV----

^DifflM®Kag«KSiiKSTÖ«iSiVGCGliG|QSSADAKL

Рис. 6. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей Си/7.пСОД растений. Chi - хлоропластные фементы, cyt - цитозольные, ext - внеклеточные, per -пероксисомальные Серым цветом выделены идентичные и консервативные нуклеотидные остатки, прямоугольной рамкой - трипептид, различающийся у хлоропластных и нехлоропластных Си/7пСОД растений

3.3. Анализ 5'-концевыхучастков кДНК генов Си/7пСОД двух видов Larix

Для оценки полиморфности 5'-концевых участков мРНК генов хлоропластных Cu/ZnCOfl ставили синтез первой цепи кДНК с использованием специфичных 3'-праймеров с последующим разделением продуктов реакции методом электрофореза в денатурирующих условиях. В результате этих экспериментов обнаружены два различающиеся по размеру фрагмента кДНК гена Cu/ZnCOД (рис.7).

1 2

800 — 700 —

600 ■ 500 — i 400 ■

Рис. 7. Синтез первой цепи кДНК генов Си/ЖпСОД Ь. ьШпса и Ь^теИпп с использованием специфичных праймеров. 1 - 5'-концевые фрагменты первой цепи кДНК генов Си/гпСОД Ь йте1ти, 2 - 5'-концевые фрагменты первой цепи кДНК генов Си/7,г\СОД I. 51 Ыпса Слева обозначены размеры фрагментов маркера

Полученные таким образом фрагменты первой цепи кДНК далее использовались в экспериментах, направленных на получение с помощью 5'-ЯАСЕ подхода с последующим клонированием 5'-концевых фрагментов кДНК данных генов. В итоге было отобрано 4 клона со встройкой одного из искомых фрагментов и секвенирована часть соответствующих последовательностей двух клонов.

3.4. Определение количества копий генов Си^пСОДЬагЬс ьШпса и Ь. gmelinii с помощью методов Саузерн-гибридизации и ПЦР

В случае Саузерн-гибридизации в качестве зонда был использован полученный с помощью ПЦР и далее радиоактивно меченый по методу случайной затравки фрагмент гена свсО А МаНапа, содержащий полные последовательности двух высококонсервативных экзонов и фланкирующих их интронов. В результате

гибридизации данного зонда с геномной ДНК двух видов лиственницы выявлялось два и три фрагмента в случае гидролизованной ЕсиШ и НтАШ ДНК, соответственно (рис.8).

Для корректной интерпретации результатов Саузерн-гибридизации далее необходимо было определить с помощью секвенирования наличие/отсутствие сайтов рестрикции ЕсоЯ\ и Шп<Ш\ в соответствующих интронных и экзонных участках генов Си/7пСОД Ьага в областях, комплементарных использованному в качестве зонда фрагменту геномной ДНК А ¡ИаПапа. С этой целью проводили ПЦР с геномной ДНК Ь gmelimi и Ь .чШпса и теми же праймерами, которые использовались для получения гибридизационного зонда. В результате реакции зарегистрировано два продукта с размерами около 500 и 1100 п.н.

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис. 8. Саузерн-гибридизация геномной ДНК лиственницы с зондом к гену Си/ХпСОД.

1,2 - ДНК из каллусных линий si и s2 L sibirica, рестрицированная £coRI, 3,4 - ДНК из каллусных линий gl и g2 L gmelmu, рестрицированная ЕсоЮ, 5,6 - ДНК из линий si и s2, гидролизованная НтА\\\, 7,8 - ДНК из линий gl и g2, гидролизованная НтйШ Стрелками обозначены выявляемые гибридизацией фрагменты с указанием приблизительных размеров данных фрагментов, т п н

Короткий 500 п.н. фрагмент геномной ДНК был секвенирован (GenBank/EMBL accession number AJ854253). Анализ его последовательности показал, что он является частью гена хлоропластной Cu/ZnCOfl и не содержит сайтов рестрикции ЕсоШ и ///«dill. Таким образом, данному гену мог соответствовать только один из выявляемых гибридизацией фрагментов геномной ДНК (рис.8), в то время как остальные фрагменты, по всей видимости, соответствуют другому(им) гену(ам) Cu/ZnCOfl. Образующийся в результате ПЦР фрагмент размером 1100 п.н., который не секвенировали, является, вероятно, частью второго гена Cu/ZnCOfl.

Для генов, кодирующих Cu/ZnCOfl хлоропластной локализации, так же как и для генов РеСОД, характерны различия в копийности и регуляции экспрессии данных генов в разных систематических группах растений. Отметим, что описанный Karpinski с соавторами [Karpinski et al., 1992] ген, кодирующий фермент хлоропластной локализации, был представлен единственной копией. В настоящем исследовании получены результаты, свидетельствующие о том, что у L gmelinii и L sibirica гены хлоропластной Cu/ZnCOfl представлены, как минимум, двумя копиями. Важно подчеркнуть, что обнаруженные существенные структурные различия З'-нетранслируемых областей кДНК одного из генов Cu/ZnCOfl у двух видов Larix являются указанием на возможные различия в регуляции экспрессии данных генов на постгранскрипционном уровне. Эти данные вполне согласуются с данными, полученными для других видов растений и свидетельствуют о высокой значимости тонкой регуляции уровня АФК в хлоропластах, которая, по-видимому,

достигается за счет дифференциальной регуляции экспрессии нескольких генов СОД, осуществляющих метаболизм АФК в этих органеяпах [Van Camp et al., 1997; Kaminaka et al., 1999].

4. Исследование особенностей структуры генов МпСОД L. sibirica и L. gmelinii

4.1. Секеенирование и анализ кДНК гена МпСОД Larix sibirica и L. gmelinii

Олигонуклешидные праймеры mncl/mnc2 (табл.2) были использованы для получения соответствующих фрагментов кДНК генов МпСОД L sibirica и L gmelinii, которые были секвенированы с помощью автоматического секвенатора. Контекстный анализ нуклеотвдных и соответствующих им транслированных аминокислотных последовательностей продуктов ОТ-ПЦР показал, что они соответствуют генам МпСОД. Так же, как и в случае кДНК генов Cu/ZhCOfl для выявления транскриигов отдельных генов МпСОД двух видов рода Larix было использовано два основных подхода - получение и секвенирование 3'- и 5'-концевых последовательностей генов МпСОД с помощью З'-RACE и 5'-RACE методик и анализ последовательностей геномной ДНК, содержащих помимо консервативных экзонных вариабельные последовательности ингронов.

4.2. Получение, секвенирование и контекстный анализ З'-концевых последовательностей кДНК гена МпСОД Larix sibirica и L. gmelinii

На основе определения последовательностей полученного фрагмента кДНК МпСОД были подобраны специфичные праймеры для получения З'-концевых фрагментов кДНК интересующих нас генов МпСОД двух видов Larix с использованием З'-RACE метода. Как и в случае с кДНК генов Си/7пСОД, в результате этих экспериментов были получены различающиеся по размеру 3'-концевые фрагменты кДНК генов МпСОД L sibirica и L gmelinii. Продукты З'-RACE после элекгрофоретического разделения в агарозном геле были элюированы и клонированы в составе плазмвды pBlueScriptKS(+) по сайгу рестрикции £coRV.

По результатам трансформации было отобрано 46 колоний, которые далее были проанализированы на наличие встройки и ее ориентацию в составе плазм иды с помощью ПЦР с комбинациями специфичных и универсальных праймеров. По результатам данной оценки было отобрано восемь клонов со встройкой кДНК генов МпСОД. Выделенная из этих клонов плазм идная ДНК после очистки была далее секвенировапа.

Все восемь последовательностей кДНК генов МпСОД Larix sibirica и L gmelinii, как стало ясно из анализа их выравнивания, практически не различались по структуре (99% гомологии между соответствующими последовательностями кДНК для двух видов Larix), но разделялись на три группы по длине З'-НТП. Дальнейший контекстный анализ данных последовательностей позволил определить вероятную причину наблюдаемого полиморфизма длины фрагментов кДНК генов МпСОД Lara sibirica и L gmelinii. Все три типа транскрипгов различаются положением, с которого начинается полиА-тракт, при этом вблизи каждого начала участка полиаденилирования (11, 15 и 19 н., соответственно) выявляется канонический сигнал полиаденилирования ААТААА (рис. 9). Это наблюдение наряду с полным совпадением в других участках последовательностей кДНК гена МпСОД у Larix sibirica и L gmelinii позволяет предположить, что обнаруженный полиморфизм

длины З'-НТП генов МпСОД Larix объясняется, по-видимому, альтернативным полиаденилированием транскрипта данного гена in vivo.

P.tari (620)

Р tae2 (564)

1 sibl (1)

L.sib? (1)

L gmel (1 )

L 5ib3 (41)

L gme? (64)

L gme3 П1)

L qme4 (45)

L.gme5 (1)

L.sib4 (1)

L gme 6 (6)

P.tael (657)

P tae2 (6??)

L sibl (34)

L Sib2 (59)

L gmel (60)

L Sib3 (1/4)

L.gme2 131)

L.gniu3 (58)

и. qme 4 (105)

L g1-?^ (53)

L.sjM (53)

L gme 6 (66)

P.tdPl (657)

Г tae2 (677)

L sibl (94)

I, sib2 (111)

L.gme1 (120)

L S^b3 (179)

L.gmp? (138)

L дгоеЗ (113) .

L gme 4 (160)

I gme 5 (113)

L.Sib4 (108) ,

L gn\e6 (121 )

^тттсгттт^шт-т»-

AAAAAAÄ-

-ÁGCCTJ tTTT"AÄAGC"" — йЛАААА ТТЛЗАОСТТ

^mmiswmmxmm-— яддмл

;ТТТТ----ЙА

й'тшттшфшт^т:-----лл

тштттщт^ ia|agctt

---TAMA А

—Iaaaaa

rTTTGTG-TTTTCCAGAA-TATAATTlTAGTT-

ТТ1TGTG CTTTCCAGAG- TATACTTTTAGCl GCTTTAC1 TAAATAAAGATTGAGCATAA

Рис. 9. Множественное выравнивание З'-HTII кДНК генов МпСОД Larix sibirica, L. gmelinii и P. taeda. Последовательности кДНК МпСОД L gmelimi обозначены как L gmel-6, I. sibirica - L sibl-4, P tael -3 - последовательнос ти ES 1 МпСОД Pinus taeda Серым цветом выдечены консервативные нуклеотидные остатки, пунктирные линиии соответствуют инсерциям/делецияч

Поиск гомологичных кДНК генов МпСОД L sibirica и L. gmelimi последовательностей с помощью программы BLAST в электронной базе данных GenBank и базе данных EST растений позволил обнаружить 14 высокогомологичных последовательностей EST другого представителя хвойных -Pinus taeda. Множественное выравнивание найденных последовательностей показало, что все они являются З'-концевыми фрагментами одного транскрштга гена МпСОД Pinus taeda Сравнение первичной структуры «консенсусной» последовательности EST гена МпСОД P. taeda с полученными нами последовательностями З'-концевых областей кДНК генов МпСОД L sibirica и L. gmelinii позволило обнаружить высокую гомологию кДНК МпСОД данных видов хвойных растений не только в кодирующей области, но и в З'-НШ мРНК (рис.9). Интересно, что два из трех обнаруженных у транскрипгов генов МпСОД двух видов

Larix сигнала полиаденилирования представлены и в EST МпСОД P. taeda и фланкированы консервативными UG-богатыми последовательностями, которые, как полагают [Yan, Man-, 2005; Wu, Alwine, 2004], определяют эффективность распознавания сигналов полиаденилирования.

Несмотря на то, что последовательности EST Pinns taeda получены авторами с использованием другого подхода и, как следствие, во всех этих последовательностях не представлены полиА-тракты, наблюдаемый также и для них полиморфизм 3'-концевых участков может быть также следствием альтернативного полиаденилирования. Все вышеперечисленные данные предполагают, что у обоих видов Larix ген МпСОД представлен единичной копией, а полиморфизм транскриптов данного гена достигается за счет альтернативного полиаденилирования пре-мРНК. Дополнительные экспериментальные доказательства предполагаемой представленности генов МпСОД у Larix sibirica и L gmelinii единичными копиями были получены в результате ПЦР-анализа интронных последовательностей данных генов и анализа 5'-концевых последовательностей кДНК.

4.3. Определение копийности генов МпСОД JL. gmelinii и L. sibirica с использованием методов ОТ-ПЦР и ПЦР на геномной ДНК

Для оценки полиморфности 5'-концевых участков мРНК исследуемых в данной работе генов МпСОД Larix были поставлены эксперименты по синтезу первой цепи кДНК с использованием специфичных 3'-праймеров с последующим разделением продуктов реакции электрофорезом в денатурирующих условиях. В результате этих экспериментов был обнаружен единственный 5'-концевой фрагмент первой цепи кДНК гена МпСОД у обоих видов лиственницы (рис.10).

800

700

600

500

400

Рис. 10. Синтез первой цепи кДНК геиов МпСОД /.. sibirica и L. gmelinii с использованием специфичных праймеров. 1 - 5'-концевой фрагмент первой цепи кДНК гена МпСОД L gmehrui, 2 - 5'-концевой фрагмент первой цепи кДНК гена МпСОД L sibirica Слева обозначены размеры фрагментов маркера

Полученные таким образом фрагменты первой цепи кДНК далее использовались в экспериментах, направленных на получение с помощью 5'-RACE подхода с последующим клонированием 5'-концевых фрагментов кДНК данных генов. В итоге было отобрано 4 клона со встройками искомых фрагментов и секвенированы частичные последовательности 5'-ШП кДНК МпСОД L. sibirica и L gmelinii.

Для ПЦР-анализа геномной ДНК L gmelinii и L sibirica использовались праймеры к участку гена МпСОД, содержащему один ингрон и фрагменты фланкирующих его экзонов. В результате ПЦР в случае обоих Исследуемых видов

наблюдали образование двух ПЦР-продуктов размером около 300 и 600 п.н. Секвенирование и а нал ив последовательностей данных фрагментов показали, что только один ю них (300 п.н., GenBank/EMBL асс. number АМ087024) соответствует гену МпСОД. Эти данные наряду с данными ОТ-ПЦР подтверждают, что гены МпСОД у Larix sibirica и Larix gmelinii представлены единичными копиями.

4.4. Роль альтернативного полиаденилирования транскриптов генов МпСОД в

регуляции экспрессии данных генов ¡

В отличие от хлоропластов, в которых обнаруживаются кодируемые разными генами множественные юоформы Fe- и Cu/ZnCOfl, у большинства изученных в этом отношении видов растений выявлены лишь единичные копии гена МпСОД мигохондриальной локализации [Kliebenstein et al., 1998]. В то же время у риса [Kaminaka et al., 1999b] и табака [Van Camp et al., 1997] этот ген представлен двумя копиями, а у кукурузы - четырьмя копиями [Zhu, Scandalios, 1995]. Примечательно, чгго в этих работах была установлена дифференциальная экспрессия отдельных генов МпСОД. Было предположено также, что продукты экспрессии этих генов ассоциированы с различными участками генерации АФК в митохондриях [Zhu, Scandalios, 1995]. В связи с этим остается неясным, как может осуществляться тонкая энзим этическая регуляция уровня АФК в нормальных и стрессовых условиях в митохондриях растений, гене»! которых содержит только одну копию гена МпСОД. Возможным ответом на данный вопрос является обнаруженное в нашей работе альтернативное полиаденилирование транскриптов генов МпСОД у хвойных растений - L. gmelinii и L. sibirica.

В целом, явление альтернативного полиаденилирования достаточно широко распространено и может затрагивать до 49% транскриптов генов человека, 31% транскриптов мыши, 28% - у крысы [Yan, Marr, 2005], 25 % - у резуховидки Таля [Meyets et al., 2004]. Считается, что альтернативное полиаденилирование является дополнительным механизме»! постгранскрипционной регуляции экспрессии генов, поскольку изменяет структуру З'-нетранслируемых областей мРНК [Dreyfüs, Regnier, 2002]. Показано, что З'-нетранслируемые области мРНК могут содержать регуляторные элементы, определяющие стабильность соответствующих транскриптов [Knirsch, Clerch, 2000], а также информацию о внутриклеточной локализации продуктов трансляции [Kislauskis et al., 1994]. Их структура и размер определяют также эффективность трансляции мРНК [lian et al., 2005].

В настоящем исследовании впервые получены свидетельства в пользу существования механизма альтернативного полиаденилирования мРНК гена МпСОД у растений. На наш взгляд, образование различающихся in vivo в З'-НТП мРНК может служить тонким механизмом регуляции экспрессии гена МпСОД, представленного одной копией у L. sibirica и L. gmelinii, при формировании ответа растительного организма на действие стрессовых факторов различной природы.

Анализ З'-НТП кДНК генов МпСОД других растений (P. taeda (рис. 16), Т. aestivum (sod3.1 - асс. number MITAAU722), Digitalis lanata (асс. number AJ278864), Euphorbia esula (acc. number AF242310), Ipomoea batatas (acc. number L36676), Zea mays (sod3.1 acc. number X12540, sod3.2 acc. number L19461), Oryza sativa (rmsodl acc. number L34038, rmsod2 acc. number L34039), A. thaliana (msdl, acc. number AF061518) показал, что множественность сигналов

полиаденилирования характерна не только для соответствующих генов у представителей рода Larix. Поскольку альтернативное полиаденилирование гена МпСОД обнаружено также и у животных [Hurt et al., 1992; Zhu, Scandalios, 1995], где оно является важной частью посттранскрипционной регуляции, данный механизм следует, по-видимому, считать эволюционно закрепившимся способом регуляции экспрессии генов, кодирующих МпСОД митохондриальной локализации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Высокий уровень компартментализации растительных клеток и, как следствие, пространственное разобщение метаболических процессов, побочными продуктами которых являются цитотоксичные активные формы кислорода, предполагают необходимость функционирования сложной системы детоксикации АФК в растительных клетках. Так, семейства генов, кодирующих ключевые ферменты антиоксидантной защиты - супероксиддисмутазы - обычно сложно организованы и представлены генами, кодирующими ферменты разного типа, различающиеся по используемому в качестве кофактора иону металла, происхождению и внутриклеточной локализации. Несмотря на высокий интерес исследователей к изучению структуры и регуляции экспрессии генов СОД растений, на сегодняшний день наиболее полно охарактеризовано генное семейство СОД только у одного вида двудольных растений — A. thalicma.

Что касается однодольных растений, наиболее детально охарактеризованы гены семейства СОД у кукурузы (Zea mays). В то же время в данной работе нам удалось показать, что помимо ранее описанных в литературе восьми генов СОД, кодирующих цитозольные и митохондриальные ферменты, генное семейство СОД у данного вида культурных растений представлено еще как минимум двумя генами, кодирующими хлоропластные ферменты. Обнаруженные нами гены кодируют супероксиддисмутазы разного типа - Fe- и Cu/Zn-содержащие СОД, которые хотя и кодируются ядерным геномом, но, вероятно, имеют различное происхождение - ген FeCOfl по аналогии с таковыми у других видов растений был перенесен в ядро из генома предшественника хлоропластов, в то время как ген Cu/ZnCOД, по всей видимости, имеет ядерное происхождение.

Обнаружение гена железо-содержащей супероксиддисмутазы наряду с полученными in silico доказательствами представленности генов-ортологов в геноме других представителей однодольных растений - Triticum aestivum и Sorgum bicolor -позволяет нам заключить, что высказывавшееся ранее рядом авторов предположение о функциональном замещении эволюционно более древних генов хлоропластных FeCOfl генами хлоропластных Cu/ZnCOД в клетках растений не соответствует истине. На основании полученных нами данных и данных, представленных в литературе, можно сделать вывод, что вероятным объяснением трудностей, связанных с выявлением генов FeCOfl у однодольных растений, является ткане-, стрессо- и стадиеспецифичность экспрессии этих генов.

Помимо гена РеСОД нам удалось обнаружить не описанный ранее ген хлоропластной Cu/ZnCOfl. Сравнительный анализ последовательностей кДНК данного гена и гена, ранее описанного в работе Кернодля и Скандалиоса [Kernodle, Scandalios, 2001], показал, что обнаруженный нами ген более близок по структуре

нуклеотидной и кодируемой аминокислотной последовательностей белка генам хлоропластных Cu/ZnCOД других видов растений, в частности Т. aestivum.

Помимо изучения генов СОД представителя однодольных растений Z mays нами проводилось исследование генов семейства СОД двух видов хвойных растений - L. sibirica и L gmelinii. В результате нам удалось частично секвенировать и охарактеризовать геномную и кДНК последовательности трех генов СОД этих двух видов растений - одного гена мигохондриальной МпСОД и двух генов хлоропластных Си/2ЬСОД. В отличие от генов Cu/ZnCOfl молекулярно-биологических данных по структуре генов МпСОД хвойных растений в научной литературе ранее представлено не было.

Последовательность гена мигохондриальной МпСОД оказалась высококонсервативной в том числе и на уровне интронных последовательностей у обоих видов Lar ix. Анализ клонированных 3'-концевых последовательностей кДПК данного гена L sibirica и L gmelinii показал, что в структуре мРНК данного гена в З'-нетранслируемых областях содержится несколько сигналов полиаденилирования, что может приводить in vivo к образованию различающихся по длине З'-НИТ транскрипгов. Подтверждением существованию in vivo альтернативного полиаденилирования гена МпСОД у двух видов лиственницы было обнаружение идентичных по структуре, но различающихся по участку, с которого начинается полиА-тракт, последовательностей кДНК данного гена. Значимость митохондрий как одного из ключевых источников АФК в клетках очевидна, так же как и очевидна необходимость тонкой регуляции экспрессии генов, кодирующих участвующие в метаболизме АФК ферменты, в том числе супероксиддисмутазы. В случае хлоропластов, такая сложная регуляция обычно достигается не в последнюю очередь за счет представленности генов хлоропластных СОД несколькими копиями. Обнаруженное альтернативное полиаденилирование представленного единичной копией гена мигохондриальной МпСОД на наш взгляд, может служить одним из возможных механизмов компенсации на посттранскрипционном уровне недостаточности регуляции экспрессии данного единичного гена на уровне транскрипции.

Помимо генов мигохондриальной МпСОД были частично охарактеризованы два гена хлоропластных Cu/ZhCОД двух видов лиственницы. Интересно, что высококонсервативной оказалась последовательность только одного из этих генов, структура которого была схожей как у обоих видов Iwix, так и у других видов хвойных - Р sylvestris и P. taeda. Обнаруженные различия структуры З'-нетранслируемых последовательностей мРНК другого гена у L sibirica и L gmelinii могут определять различную регуляцию экспрессии данного гена у двух видов Larix на посттранскрипционном уровне. Эти отличия, в свою очередь, могут также вносить вклад и в различную стрессоустойчив ость двух данных видов хвойных растений.

выводы

1. Получены и секвенированы последовательности кДНК двух генов хлоропластной Cu/ZnCOfl и одного гена МпСОД Larix sibirica и 1мгix gmelinii.

2. З'-нетраслируемые последовательности мРНК одного из генов хлоропластной Cu/ZnCOfl существенно различаются у Larix sibirica и Larix gmelinii. Эти различия,

по всей видимости, обуславливают дифференциальную регуляцию на постгранекрипционном уровне экспрессии данного гена у L sibirica и L gmelinii в ответ на действие окислительного стресса.

3. Для кДНК всех исследованных генов СОД L sibirica и L gmelinii характерна высокая консервативность нуклеотцдных и кодируемых ими аминокислотных последовательностей.

4. Множественность транскриптов единственного гена, кодирующего мигохондриальную МпСОД у L sibirica и L gmelinii, определяется альтернативным полиаденилированием пре-мРНК. Данный вид посттранскрипционной модификации, по-видимому, играет важную роль в дифференциальной регуляции гена МпСОД лиственницы.

5. Помимо обнаруженного ранее гена хлоропластной Cu/ZnCOfl генное семейство СОД кукурузы представлено также геном, кодирующим хлоропластпую БеСОД.

6. Экспрессия гена FeCOfl Tea mays изменяется в ответ на действие низких положительных и субогггимальных температур.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Katyshev A.I., Klimenko ES., Chemikova V.V., Kobzev V.F., Konstantinov Y.M. TTie new member of superoxide dismutase gene family in maize — iron superoxide dismutase //Maize Genetics Cooperation Newsletter. - 2005. -79.

2. Катышев А.И., Константинов Ю. M., Шмаков В.Н., Пакова Н.В., Сумцова В.М., Кобзев В.Ф., Саляев Р.К. Анализ перенесенного с помощью биобаллистической трансформации гена FeSOD Arabidopsis thaliana в трансгенных каллусах лиственницы // Тезисы V съезда ВОФР и международной научной конференции «Физиология растений - основа биотехнологии» (15-21 сентября 2003 г). Пенза. -2003.-С. 488-489.

3. Konstantinov Yu.M., Sumtsova V.M., Gamik EYu., Kalyuzhnaya O.V., Klimenko ES., Kobzev V.F., Pakova N.V., Nepomnyashchikh D.V., Katyshev A.L, Salyaev R.K. Characterization of transgenic wheat plants overexpressing chloroplastic iron-superoxide dismutase //Annual Wheat News letter. - 2004. - 50. - P. 149-152.

4. Katyshev A.L, Rogozin I.B., Konstantinov Y.M. Genome-wide identification of mitochondrial DNA topoisomerase I in arabidopsis // Proceedings of Fourth International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure (BGRC'2004, Novosibiisk, July 25-30, 2004). V. 2. -Novosibiisk:Ic&G. 2004. - P. 199-201.

5. Константинов Ю.М., Катышев А.И., Гарник E. Ю., Сумцова В.М., Шмаков ВН., Брюхов А.А., Калюжная О.В., Непомнящих Д.В., Клименко Е.С., Кобзев В.Ф., Пакова Н.В., Саляев Р.К. Изучение устойчивости растений к окислительному стрессу с использованием трансгенных растений // Материалы Всеросийской конференции «Стрессовые белки растений» (Иркутск, 6-10 сентября, 2004). -Иркутск: Изд-во Института географии СО РАН, 2004. - С. 62-67.

6. Катышев А.И., Константинов Ю.М., Сумцова В.М., Пакова Н.В., Брюхов А.А., Шмаков В.Н., Кобзев В.Ф., Саляев Р.К. Получение трансгенных каллусных культур лиственницы с целью модификации признака устойчивости к окислительному стрессу // Тезисы докладов Международного симпозиума «Физиология трансгенного растения и биобезопасность» (Москва, 29 ноября - 3 декабря 2004). М., 2004. -С.42.

7. Katyshev A.I., Rogozin LB., Konstantinov Yu.M. A genome-wide identification of mitochondrial DNA topoisomerase I in arabidopsis // In: Bioinformatics of Genome Regulation and Structure П. (Eds. N. Kolchanov and R. Hofestaedt) Springer Science-tBusiness Media, Inc. 2005. - P. 141-145.

8. Katyshev A.L, Konstantinov Yu.M., Kobzev V.F. Hie contextual analysis of new plant superoxide dismutase gene products // Proceedings of the International Moscow Conference on Computational Molecular Biology (Moscow, July 18-21, 2005). 2005. - P. 162-163.

9. Katyshev A.L, Kobzev V.F., Konstantinov Y.M. Larix gmelinii var. gmelinii partial sod3 gene forMn-superoxide dismutase, exons 3-4. // The EMBL Nucleotide Sequence Database. - 2004. - GenBank/IMBL/DDBJ Accession Number AM087024.

10.Katyshev A.L, Kobzev V.F., Konstantinov Y.M. iMrix gmelinii var. gmelinii partial mRNA forCu-Zn superoxide dismutase (sodl.l gene)// Ihe EMBL Nucleotide Sequence Database. - 2004. - GenBank/EMB L/DDB J Accession Number AM087023.

1 l.Kalyshev A.L, Kobzev V.F., Konstantinov Y.M. Larixsibirica partial mRNA for Cu-Zn superoxide dismutase (sodl.2 geney/ Ihe EMBL Nucleotide Sequence Database. -2004. - GenBank/EMBL/DDBJ Accession Number AM087022.

12.Katyshev A.L, Kobzev V.F., Adelshin R.V., Konstantinov Y.M. Larix sibirica partial mRNA for Cu/Zh superoxide dismutase (sodl gene) // The EMBL Nucleotide Sequence Database. - 2004. - GenBank/IMB L/DDBJ Accession Number AJ 972408.

13.Katyshev A.I., Kobzev V.F., AdelshinR.V., Konstantinov Y.M. Larix gmelinii partial mRNA for Cu/Zn superoxide dismutase (sodl gene)// The EMBL Nucleotide Sequence Database. - 2004. - GenBank/EMBI/DDBJ Accession Number AJ972407.

14.Katyshev A.L, Kobzev V.F., Adelshin R.V., Konstantinov Y.M. Larix gmelinii partial mRNA for manganese superoxide dismutase (sod3 gene) // The EMBL Nucleotide Sequence Database. - 2004. - GenBank/EMB L/DDBJ Accession Number AJ972406.

15.Katyshev A.L, Klimenko ES., Kobzev V.F., AdelshinR., Konstantinov Y.M. Tea mays partial mRNA for iron superoxide dismutase (&dl gene)// The EMBL Nucleotide Sequence Database. - 2004. - GenBank/EMB L/DDBJ Accession Number AJ854254.

16.Katyshev A.L, Kobzev V.F., Adelshin R.V., Konstantinov Y.M. Larix gmelinii partial sodl gene forCu-Zn superoxide dismutase, exons 1-2 // The EMBL Nucleotide Sequence Database. - 2004. - GenBank/EMBIVDDBJ Accession Number AJ 854253.

17.Катышев А.И., Константинов Ю.М., Кобзев В.Ф. Характеристика транскрштгов генов Мп- и Cu/Zn-содержащих супероксиддисмутаз Larix gmelinii // Молекулярная биология - 2. - 2006 (в печати).

H23950

РНБ Русский фонд

2006-4 27326

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Катышев, Александр Игоревич

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Активные формы кислорода (АФК).

1.2. Химическая природа АФК.

1.2. Цитотоксические эффекты АФК.

1.3. Биологические источники АФК.

1.4. Метаболизм АФК в клетках.

2. Супероксиддисмутазы: различные типы, эволюция структуры и функции ферментов.

2.1. Железо-содержащие СОД.

2.2. Марганец-содержащие СОД.

2.3. Камбиалистические СОД.

2.4. Медь/цинк-содержащие СОД.

2.5. Никель-содержащие СОД.

3. Исследования клеточных функций супероксиддисмутаз.

3.1. Мутационный и комплементационный анализ.

3.2. Исследования биологической роли СОД с использованием трансгенных моделей и миметиков.

4. Характеристика генных семейств СОД растений.

4.1. Структура генных семейств СОД растений.

4.2. Регуляция экспрессии генов СОД растений.

4.3. Представления об эволюции структуры и функции генов СОД растений.

5. Состояние исследований генов СОД у хвойных растений.

6. Итоги обзора литературы.

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Объект исследования.

2. Использованные методы.

2.1. Выделение ДНК.

2.2. Выделение РНК.

2.3. Подбор праймеров для ПЦР и ОТ-ПЦР.

2.4. Условия ПЦР на геномной ДНК.

2.5. Синтез первой цепи кДНК.

2.6. Условия ОТ-ПЦР.

2.7. Условия З'ЯАСЕ.

2.8. Условия 5'11АСЕ.

2.9. Электрофоретическое разделение продуктов синтеза первой цепи кДНК в денатурирующих условиях.

2.10. Электрофоретическое разделение и очистка продуктов ПЦР, ОТ-ПЦР, З'ЯАСЕ и 5'11АСЕ.

2.11. Клонирование фрагментов кДНК.

2.12. Выделение плазмидной ДНК.

2.13. Условия секвенирования ДНК.

2.14. Саузерн-гибридизация.

2.15. Нозерн-гибридизация.

2.16. Контекстный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Получение ОТ-ПЦР-продуктов, соответствующих высококонсервативным участкам генов СОД растений.

1.1. Анализ последовательностей генов СОД растений и подбор праймеров.

1.2. ОТ-ПЦР на мРНК растений различных систематических групп.

2. Секвенирование фрагмента кДНКгена РеСОД Zea mays, доказательства широкого распространения генов РеСОД у растений и контекстный анализ аминокислотных последовательностей РеСОД.

2.1. Секвенирование и сравнение кДНК РеСОД кукурузы с высокогомологичными последовательностями других растений.

2.2. Контекстный анализ аминокислотных последовательностей Fe-, Мп- и камбиалистических СОД прокариот и эукариот.

2.3. Стрессоиндуцируемая экспрессия гена РеСОД Zea mays.

3. Исследование структуры гена хлоропластной Си/2пСОД кукурузы.

3.1. Секвенирование и анализ кДНК гена хлоропластной Си^пСОД Z. mays.

3.2. Сравнительный анализ структурных особеностей генов хлоропластных Си/гпСОД Z. mays.

4. Исследование особенностей структуры генов Си/%пСОДлиственницы.

4. 1. Секвенирование и анализ кДНК генов Си/гпСОД Larix sibirica и L. gmelinii.

4.2. Получение, секвенирование и контекстный анализ 3'-концевых последовательностей кДНК генов Cu/ZnCOД лиственницы.

4.3. Анализ 5'-концевых участков кДНК двух видов Larix.

4.4. Определение количества копий генов Си/гпСОД Larix sibirica и L. gmelinii с помощью методов Саузерн-гибридизации и ПЦР.

5. Исследование особенностей структуры генов МпСОД Larix sibirica и L. gmelinii.41 5 1. Секвенирование и анализ кДНК гена МпСОД Larix sibirica и L. gmelinii.

5.2. Получение, секвенирование и контекстный анализ З'-концевых последовательностей кДНК гена МпСОД Larix sibirica и L. gmelinii.

5.3. Определение копийности генов МпСОД L. gmelinii и L. sibirica с использованием методов ОТ-ПЦР и ПЦР на геномной ДНК.

5.4. Роль альтернативного полиаденилирования транскриптов генов МпСОД в регуляции экспрессии данных генов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Характеристика генов семейства SOD культурных (Zea mays) и дикорастущих (Larix sibirica, L. gmelinii) растений в связи с проблемой механизмов генетической регуляции"

Супероксид-радикал, образующийся в клетке в нормальных и стрессовых условиях как побочный продукт метаболических процессов, способен оказывать токсическое воздействие на клетку как напрямую, так и выступая в роли предшественника более цитотоксичной АФК -гидроксильного радикала. Неудивительно, что ферменты, осуществляющие элиминацию супероксидного радикала в живых системах -супероксиддисмутазы (СОД) - привлекают пристальное внимание исследователей, изучающих механизмы клеточных систем защиты от действия стрессовых факторов. У животных и человека интерес к изучению функции и роли данных ферментов связан с тем фактом, что мутагенный эффект АФК может служить причиной ряда заболеваний и являться одним из факторов старения. Что касается растений, то исследование антиоксидантной системы клетки было в большей степени связано с изучением возможности модификации устойчивости растений к неблагоприятным внешним воздействиям. В последнее время интерес к изучению СОД, как ферментов, участвующих в метаболизме АФК, снова возрос в связи с открытием сигнальной функции АФК.

В то же время, несмотря на интенсивное изучение генов семейства СОД растений, многие аспекты эволюции структуры и функции данных генов у растений остаются пока недостаточно исследованными. Так, например, с учетом завершения проекта по секвенированию генома модельного растения АгаЫЗорБ'гБ (ИаИапа более-менее становится ясной структура генных семейств СОД и функциональное разделение генов данного семейства в клетке двудольных растений. Аналогичные данные по генам СОД растений других таксономических групп, таких как однодольные и голосеменные растения, очевидно, являются недостаточными для формирования адекватных представлений о структуре генных семейств СОД у растений этих систематических групп. Без этих данных, в свою очередь, невозможно внести большую ясность в представления о структуре, функции, регуляции и эволюции генов семейства СОД растений в целом.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось исследование структуры и экспрессии отдельных генов семейства СОД у таксономически удаленных видов растений для выяснения возможных механизмов регуляции их экспрессии.

Для достижения этой цели были сформулированы следующие задачи:

- изучение организации кодирующих областей отдельных представителей генного семейства СОД хвойных растений Larix sibirica и Larix gmelinii путем секвенирования продуктов ПЦР и ОТ-ПЦР;

- изучение особенностей экзон-интронной организации генов СОД у Larix sibirica и Larix gmelinii\

- контекстный анализ полученных данных по структурной организации генов и аминокислотных последовательностей СОД двух видов лиственниц методами in silico;

- секвенирование и контекстный анализ потенциальных регуляторных нетранслируемых областей мРНК генов СОД L. sibirica и L. gmelinii;

- поиск и анализ генов, кодирующих хлоропластные СОД (РеСОД и Си/2пС0Д) кукурузы {Zea mays).

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые получены молекулярно-биологические доказательства экспрессии гена РеСОД кукурузы и определена частичная последовательность кДНК данного гена. Эти данные наряду с обнаружением в электронных базах данных EST высокогомологичных последовательностей кДНК РеСОД пшеницы (Triticum aestivum) и сорго (Sorghum bicolor) позволили опровергнуть существовавшую ранее гипотезу об эволюционном замещении функции генов РеСОД у растений генами, кодирующими СиУ2пС0Д.

Впервые были определены последовательности кДНК и участков геномной ДНК генов, кодирующих хлоропластные Си/гпСОД у двух видов лиственницы. Результаты контекстного анализа этих последовательностей предполагают существование различий в регуляции экспрессии на посттранскрипционном уровне одного из обнаруженных генов у лиственниц двух видов.

Впервые секвенированы последовательности кДНК и геномной ДНК генов МпСОД двух видов хвойных растений. Анализ З'НТП мРНК данных генов показал наличие в их структуре альтернативных сигналов полиаденилирования, что по-видимому, послужило причиной обнаруженного в данной работе полиморфизма длины трансриптов гена МпСОД лиственницы сибирской и Гмелина. Обнаруженная эволюционная консервативность альтернативного полиаденилирования, выражающаяся в представленности потенциальных сигналов полиаденилирования в З'НТП мРНК генов МпСОД растений разных систематических групп и животных, свидетельствует о вероятной высокой значимости альтернативного полиаденилирования как механизма посттранскрипционной регуляции экспрессии данных генов.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на V съезде ВОФР и международной научной конференции «Физиология растений

- основа фитобиотехнологии» (Пенза, 2003 г), на всероссийской конференции «Стрессовые белки растений» (Иркутск, 2004), на международном симпозиуме "Физиология трансгенного растения и биобезопасность" (Москва, 2004), на международной конференции «Moscow Conference on Computational Molecular Biology» (MCCMB, Москва, 2005).

Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 8 печатных работах. Одна работа находится в печати (Молекулярная биология.

- 2006. - 2.)

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 207 работ зарубежных и отечественных авторов. Работа изложена на 124 страницах, содержит 20 рисунков и 4 таблицы.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Катышев, Александр Игоревич

выводы

1. Получены и секвенированы последовательности кДНК двух генов хлоропластной Си/гпСОД и одного гена МпСОД Larix sibirica и Larix gmelinii.

2. З'-нетраслируемые последовательности мРНК одного из генов хлоропластной CuJZwCOJX существенно различаются у Larix sibirica и Larix gmelinii. Эти различия, по всей видимости, обусловливают дифференциальную регуляцию на посттранскрипционном уровне экспрессии данного гена у L. sibirica и L. gmelinii в ответ на действие окислительного стресса.

3. Для кДНК всех исследованных генов СОД L. sibirica и L. gmelinii характерна высокая консервативность нуклеотидных и кодируемых ими аминокислотных последовательностей.

4. Множественность транскриптов единственного гена, кодирующего митохондриальную МпСОД у L. sibirica и L. gmelinii, определяется альтернативным полиаденилированием пре-мРНК. Данный вид посттранскрипционной модификации, по-видимому, играет важную роль в дифференциальной регуляции гена МпСОД лиственницы.

5. Помимо обнаруженного ранее гена хлоропластной CvJZnCOJX генное семейство СОД кукурузы представлено также генами, кодирующими хлоропластные РеСОД и CvJZnCOJ\.

6. Экспрессия гена РеСОД Zea mays изменяется в ответ на действие низких положительных и субоптимальных температур.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Высокий уровень компартментализации растительных клеток и, как следствие, пространственное разобщение метаболических процессов, побочными продуктами которых являются цитотоксичные активные формы кислорода, предполагают необходимость функционирования сложной системы детоксикации АФК в растительных клетках. Так, семейства генов, кодирующих ключевые ферменты антиоксидантной защиты — супероксиддисмутазы — обычно сложно организованы и представлены генами, кодирующими ферменты разного типа, различающимися по используемому в качестве кофактора иону металла, происхождению и внутриклеточной локализации. Несмотря на высокий интерес исследователей к изучению структуры и регуляции экспрессии генов СОД растений, на сегодняшний день более-менее полно охарактеризовано генное семейство СОД только у одного вида двудольных растений —Arabidopsis thaliana.

Что касается однодольных растений, наиболее полно охарактеризованы гены семейства СОД у кукурузы {Zea mays). В то же время в данной работе нам удалось показать, что помимо ранее описанных в литературе восьми генов СОД, кодирующих цитозольные и митохондриальные ферменты, генное семейство СОД у данного вида культурных растений представлено еще как минимум двумя генами, кодирующими хлоропластные ферменты. Обнаруженные нами гены кодируют супероксиддисмутазы разного типа -Fe- и Cu/Zn-содержащие СОД, которые кодируются ядерным геномом, но, вероятно, имеют различное происхождение — ген РеСОД по аналогии с таковыми у других видов растений был перенесен в ядро из генома предшественника хлоропластов, в то время как ген Си/2пС0Д, по всей видимости, имеет ядерное происхождение.

Обнаружение гена железо-содержащей супероксиддисмутазы наряду с биоинформатическими доказательствами представленности генов-ортологов в геноме других представителей однодольных растений - Triticum aestivum и Sorgum bicolor - позволяет нам заключить, что высказывавшееся ранее рядом авторов предположение о функциональном замещении эволюционно более древних генов хлоропластных РеСОД генами хлоропластных Си/7пСОД в клетках растений не соответствует истине. На основании полученных нами данных и данных, представленных в литературе, можно сделать вывод, что вероятным объяснением трудностей, связанных с выявлением генов РеСОД у однодольных растений, является ткане-, стрессо- и стадиеспецифичность экспрессии этих генов.

Помимо гена РеСОД нам удалось обнаружить не описанный ранее ген хлоропластной Си^пСОД. Сравнительный анализ последовательностей кДНК данного гена и гена, ранее описанного в работе Kernodle и Scandalios [Kernodle, Scandalios, 2001], показал, что обнаруженный нами ген более близок по структуре нуклеотидной и кодируемой аминокислотной последовательностей белка генам хлоропластных Си/2пСОД других видов растений, в частности Т. aestivum.

Помимо изучения генов СОД представителя однодольных растений Z. mays нами проводилось исследование генов семейства СОД двух видов хвойных растений - L. sibirica и L. gmelinii. В результате нам удалось частично секвенировать и охарактеризовать геномную и кДНК последовательности трех генов СОД этих двух видов растений — одного гена митохондриальной МпСОД и двух генов хлоропластных Cu/ZnCOД. В отличие от генов Си/2пСОД молекулярно-биологических данных по структуре генов МпСОД хвойных растений в научной литературе ранее представлено не было.

Последовательность гена митохондриальной МпСОД оказалась высококонсервативной в том числе и на уровне интронных последовательностей у обоих видов Larix. Анализ клонированных 3'-концевых последовательностей кДНК данного гена L. sibirica и L. gmelinii показал, что в структуре мРНК данного гена в З'-нетранслируемых областях содержится несколько сигналов полиаденилирования, что может приводить in vivo к образованию различающихся по длине З'НТП транскриптов.

Подтверждением существованию in vivo альтернативного полиаденилирования гена МпСОД у двух видов лиственницы было обнаружение идентичных по структуре, но различающихся по участку, с которого начинается полиА-тракт, последовательностей кДНК данного гена. Значимость митохондрий как одного из ключевых источников АФК в клетках очевидна, так же как и очевидна необходимость тонкой регуляции экспрессии генов, кодирующих участвующие в метаболизме АФК ферменты, в том числе супероксиддисмутазы. В случае хлоропластов, такая сложная регуляция обычно достигается не в последнюю очередь за счет представленности генов хлоропластных СОД несколькими копиями. Обнаруженное альтернативное полиаденилирование представленного единичной копией гена митохондриальной МпСОД, на наш взгляд, может служить одним из возможных механизмов компенсации на посттранскрипционном уровне недостаточности регуляции экспрессии данного единичного гена на уровне транскрипции.

Помимо генов митохондриальной МпСОД были частично охарактеризованы два гена хлоропластных Си/^пСОД двух видов лиственницы. Интересно, что высококонсервативной оказалась последовательность только одного из этих генов, структура которого была схожей как у обоих видов Larix, так и у других видов хвойных — Р. sylvestris и Р. taeda. Обнаруженные различия структуры З'-нетранслируемых последовательностей мРНК другого гена у L. sibirica и L. gmelinii могут определять различную регуляцию экспрессии данного гена у двух видов Larix на посттранскрипционном уровне. Эти отличия, в свою очередь, могут также вносить вклад и в различную стрессоустойчивость двух данных видов хвойных растений.

101

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Катышев, Александр Игоревич, Иркутск

1. Гарник Е.Ю., Лазарева Е.В., Константинов Ю.М. Особенности изоферментных спектров анионных пероксидаз и супероксиддисмутазы в каллусной культуре Larix sibirica Ledeb. и Larix gmelinii Rupr. Rupr. // Физиология растений. 2004. - 53. - С. 429-434.

2. Клонирование ДНК. / Под ред. Д. Гловера. // М.: Мир. 1988. - 538 с.

3. Лущак В.И. Окислительный стресс и механизмы защиты от него у бактерий // Биохимия. 2001. - 66. - Р. 592-609.

4. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. // М.: Мир. 1984. - 480 с.

5. Abarca D., Roldan М., Martin М., Sabater В. Arabidopsis ecotype Cvi shows an increased tolerance to photo-oxidative stress and contains a new chloroplastic copper/zinc superoxide dismutase isoenzyme // J. Exp. Bot. 2001. - 52. — P. 1417-1425.

6. Allan A.C., Fluhr R. Two distinct sources of elicited reactive oxygen species in tobacco epidermal cells // Plant Cell. 1997. - 9. - P. 1559-1572.

7. Allen R.D., Webb R.P., Schake S.A. Use of transgenic plants to study antioxidant defences // Free Radic. Biol. Med.- 1997. 23. - P. 473-479.

8. Alscher R.G. Biosynthesis ana antioxidant function of glutathione in plants // Physiol. Plant. 1989. - 77. - P. 457-464.

9. Alscher R.G., Erturk N., Heath L.S. Role of superoxide dismutases (SODs) in controlling oxidative stress in plants // J. Exp. Bot. 2002. - 53. - P. 1331-1341.

10. Babior B.M. Superoxide: a two-edged sword // Braz. J. Med. Biol. Res. -1997. -30.-P. 141-155.

11. Banfi B., Tirone F., Durusse I., Knisz J., Moskwa P., Molnar G.Z., Krause K.-H., CoxJ.A. Mechanism of Ca2+activation of the NADPH oxidase 5 (NOX5)// J. Biol.Chem. 2004. - 279. - P. 18583-18591.

12. Basu U., Good A.G., Taylor G.J. Transgenic Brassica napus plants overexpressing aluminium-induced mitochondrial manganese superoxide dismutase cDNA are resistant to aluminium // Plant Cell Envir. 2001. - 24. - P. 1269-1278.

13. Battistoni A., Rotilio G. Isolation of an active and heat-stable monomeric form of Cu,Zn superoxide dismutase from the periplasmic space of Escherichia coli 11 FEBS Lett. 1995. - 374. - P. 199-202.

14. Beckman K.B., Ames B.N. The free radical theory of aging matures // Physiol. Reviews. 1998. - 78. - P. 547-581.

15. Birnboim H.C., Kanabus-Kaminska M. The production of DNA strand breaks in human leukocytes by superoxide anion may involve a metabolic process // Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 1985. - 82. - P. 6820-6824.

16. Bouton C., Hirling H., Drapier J.-C. Redox modulation of iron regulatory proteins by peroxynitrite // J. Biol. Chem. 1997. - 272. - P. 19969-19975.

17. Bowler C., Slooten L., Vandenbranden S., De Rycke R., Botterman J. Sybesma C., Van Montague M., Inze' D. Manganese superoxide dismutase can reduce cellular damage mediated by oxygen radicals in transgenic plants // EMBO J. -1991.- 10.-P. 1723-1732.

18. Brown-Peterson N.J., Salin M.L. Purification and characterization of a mesohalic catalase from the halophilic bacterium Halobacterium halobium II J. Bacteriol. 1995. - 177. - P. 378-384.

19. Bunkelmann J.R., Trelease N.R. Ascorbate peroxidase: a prominent membrane protein in oilseed glyoxysomes II. Plant Physiol. 1996. - 110. - P. 589-598.

20. Cannon R.E., White J. A., Scandalios J.G. Cloning of cDNA for maize superoxide dismutase 2 (SOD2) // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. - 84. - P. 179-183.

21. Carlioz A., Touati D. Isolation of superoxide dismutase mutants in E. coli: is superoxide dismutase necessary for aerobic life? // EMBO J. 1986. - 5. - P. 623630.

22. Carlsson L. M., Jonsson J., Edlund T., Marklund S.L. Mice lacking extracellular superoxide dismutase are more sensitive to hyperoxia // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995. - 92. - P. 6264-6268.

23. Chanock S.J., El Benna J., Smith R.M., Babior B.M. The respiratory burst oxidase // J. Biol. Chem. 1994. - 269. - P. 24519-24522.

24. Chung D J., Wright A.E., Clerch L.B. The 3' untranslated region of manganese superoxide dismutase RNA contains a translational enhancer element // Biochem. -1998.-37.-P. 16298-16306.

25. Clerch L.B., Wright A., Chung D.J. Evidence that glutathione peroxidase RNA and manganese superoxide dismutase RNA bind the same protein // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. - 222. - P.590-594.

26. Dat J.F., Pellinen R., Beeckman T., Van De Cotte B., Langebartels C., Kangasjarvi J., Inze D., Van Breusegem F. Changes in hydrogen peroxide homeostasis trigger an active cell death process in tobacco // Plant J. 2003. - 33. -P. 621-632.

27. Descheneau A.T., Newton K. Maize mitochondrial DNA binding proteins // International Congress on Plant Mitochondrial Biology. Obernai, France, May 28 -June 2, 2005.-P. 23.

28. Desikan R., Hancock J.N., Coffey M.J., Neill S.J. Generation of active oxygen in elicited cells of Arabidopsis thaliana is mediated by a NADPH oxidase-Iike enzyme//FEBS Letts. 1996. -382. - P. 213-217.

29. Devey M.E., Bell J.C., Smith D.N., Neale D.B., Moran G.F. A genetic linkagemap for Pinus radiata based on RFLP, RAPD, and microsatellite markers // Theor. Appl. Genet. 1996.-92.-P. 673-679.

30. Dhaunsi G.S., Gulati S., Singh A.K., Orak J.K., Asayama K., Singh I. Demonstration of Cu-Zn superoxide dismutase in rat liver peroxisomes. Biochemical and immunochemical evidence // J. Biol. Cmem. 1992. — 267. - P. 6870-6873.

31. Dietz K.J., Horling F., Konig J., Baier M. The function of the chloroplast 2-cysteine peroxiredoxin in peroxide detoxification and its regulation // J. Exp. Bot. -2002.-53.-P. 1321 1329.

32. Dong J.-Z., Dunstan D.I. A realible method for extraction of RNA from various conifer tissues // Plant Cell Rep. 1996. - 15. - P. 516-521.

33. D'Orazio M., Folcarelli S., Mariani F., Colizzi V., Rotilio G., Battistoni A. Lipid modification of the Cu,Zn superoxide dismutase from Mycobacterium tuberculosis. II Biochem. J. 2001. - 359. - P. 17-22.

34. Dreyfus M., Regnier P. The poly(A) tail of mRNAs: bodyguard in eukaryotes, scavenger in bacteria // Cell. 2002. - 111. - P. 611-613.

35. Droillard M.-J., Paulin A. Isozymes of superoxide dismutase in mitochondria and peroxisomes isolated from petals of carnation (Dianthus caryophillus) during senescence // Plant Physiol. 1990. - 94. - P. 1187-1192.

36. Duttaroy A., Paul A., Kundu M., Belton A. A Sod2 null mutation confers severely reduced adult life span in Drosophila II Genetics. 2003. - 165. - P. 2295-2299.

37. Edwards R.A., Baker H.B., Whitteker M.M., Whitteker J.W., Jameson G.B, Baker E.N. Crystal structure of Escherichia coli manganese superoxide dismutase at 2.1 A resolution II J. Biol. Inorg. Chem. 1998. - 3. - P. 161 -171.

38. Emanuelsson O., Nielsen H., von Heijne G. ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites // Protein Sci. 1999.-8.-P. 978-984.

39. Emanuelsson O., Nielsen H., Brunak S., von Heijne G. Predicting subcellular localization of proteins based on their N-terminal amino acid sequence // J. Mol. Biol.-2000.- 300.-P. 1005-1016.

40. Feinberg A.P., Vogelstein B. A technique for radiolabelling DNA restriction endonuclease fragments to high specific activity // Anal. Biochem. 1983. - 132. -P. 6-13.

41. Floyd R.A. Antioxidants, oxidative stress, and degenerative neurological disorders // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1999. - 222. - P. 236-245.

42. Fridovich I. Superoxide anion radical (O2-), superoxide dismutases, and related matters//J. Biol. Chem. 1997.-272.-P. 18515-18517.

43. Fridovich I. Oxygen toxicity: a radical explanation // J. Exp. Biol. 1998. - 201. -P. 1203-1209.

44. Gardner P.R., Raineri I., Epstein L.B., White C.W. Superoxide radical and iron modulate aconitase activity in mammalian cells // J. Biol. Chem. -1995. 270. - P. 13399-13405.

45. Gaymard, F., Boucherez, J. and Briat, J.F. Characterization of a ferritin mRNA from Arabidopsis thaliana accumulated in response to iron through an oxidative pathway independent of abscisic acid // Biochem. J. 1996. - 318. - P. 67-73.

46. Guan L., Scandalios J.G. Two structurally similar maize cytosolic superoxide dismutase genes, Sod4 and Sod4A, respond differentially to abscisic acid and high osmoticum // Plant Physiol. 1998. - 117. - P. 217-224.

47. Hassan H.M., Scandalios J.G. Superoxide dismutases in aerobic organisms // Stress responses in plants: adaptation and acclimation mechanisms. 1990. Wiley-Liss, Inc. P. 175-199.

48. Hawkins C.L., Rees M.D., Davies M.J. Superoxide radicals can act synergistically with hypochlorite to induce damage to proteins // FEBS Lett. -2002.-510.-P. 41-44.

49. Herouart D.M., Van Montagu M.M., Inze D.M. Redox-activated expression of the cytosolic copper/zinc superoxide dismutase gene in Nicotiana II Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1993. - 90 - P. 3108-3112.

50. Hiraoka B.Y., Yamakura F., Sugio S., Nakayama K. A change of the metal-specific activity of a cambialistic superoxide dismutase from Porphyromonas gingivalis by a double mutation of Gln-70 to Gly and Ala-142 to Gin // Biochem. J.-2000.-345.-P. 345-350.

51. Hopkin K.A., Papazian M.A., Steinman H.M. Functional differences between manganese and iron superoxide dismutases in Escherichia coli K-12 // J. Biol. Chem. 1992. - 267. - P. 24253-24258.

52. Hu X., Bidney D.L., Yalpani N., Duvick J.P., Crasta O., Folkerts O., Lu G. Overexpression of a gene encoding hydrogen peroxide-generating oxalate oxidase evokes defense responses in sunflower // Plant Physiol. 2003. -133. - P. 170-181.

53. Hurt J., Hsu J.-L., Dougall W.C., Visner G.A., Burr I.A., Nick H.S. Multiple mRNA species generated by alternate polyadenylation from the rat manganese superoxide dismutase gene // Nucl. Acids Res. 1992. - 20. - P. 2985-2990.

54. Ibrahim W., Lee U.-S., Yen H.-C., St.Clair D.K., Chow C.K. Antioxidant and oxidative status in tissues of manganese superoxide dismutase transgenic mice // Free Radic. Biol. Med. 2000. - 28. - P. 397-402.

55. Imlay K.R.C., Imlay J.A. Cloning and analysis of sodC, encoding the copper-zinc superoxide dismutase of Escherichia coli II J. Bacteriol. 1996. — 178. - P. 2564-2571.

56. Ishikawa T., Takeda T., Shigeoka S. Purification and characterization of cytosolic ascorbate peroxidase from Komatsuna (Brassica rapa) // Plant Sci. -1996.-120.-P. 11-18.

57. Ishikawa T., Yoshimura K., Tamoi M., Takeda T., Shigeoka S. Alternative mRNA splicing of 3'-terminal exons generates ascorbate peroxidase isoenzymes in spinach chloroplasts // Biochem. J. 1997. - 328. - P. 795-800.

58. Jabs T. Reactive oxygen intermediates as mediators of programmed cell death in plants and animals // Biochem. Pharmacol. 1999. - 57. - P. 231-245.

59. Jackson S.M.J., Cooper J.B. An analysis of structural similarity in the iron and manganese superoxide dismutases based on known structures and sequences // BioMetals. 1998. - 11. - P. 159-173.

60. Jung C., Rong Y., Doctrow S., Baudry M., Malfroy B., Xu Z. Synthetic superoxide dismutase/catalase mimetics reduce oxidative stress and prolong survival in a mouse amyotrophic lateral sclerosis model // Neurosci. Lett. 2001. — 304.-P. 157-160.

61. Kaminaka H., Morita S., Yokoi H., Masumura T., Tanaka K. Molecular cloning and characterization of a cDNA for plastidic copper/zinc-superoxide dismutase in rice {Oryza sativa L.) // Plant Cell Physiol. 1997. - 38. - P. 65-69.

62. Kaminaka H., Morita S., Tokumoto M., Yokoyama H., Masumura T, Tanaka K. Molecular cloning and characterization of a cDNA for an iron-superoxide dismutase in rice {Oryza sativa L.) // Biosci. Biotechn. Biochem. 1999a. - 63. -P. 302-308.

63. Kaminaka H., Morita S., Tokumoto M., Masumura T, Tanaka K. Differential gene expressions of rice superoxide dismutase isoforms to oxidative and environmental stresses // Free Radic. Res. 1999b. - 31 Suppl. - S219-225.

64. Kanematsu S., Asada K. CuZn-superoxide dismutases in rice: occurrence of an active monomeric enzyme and two types of isozymes in leaf and non-photosynthetic tissues // Plant Cell Physiol. 1989. - 30. - P. 381-391.

65. Karpinski S., Escobar C., Karpinska B., Creissen G., Mullineaux P.M. Photosynthetic electron transport regulates the expression of cytosolic ascorbate peroxidase genes in Arabidopsis during excess light stress // Plant Cell. 1997. - 9. - P. 627-640.

66. Karpinski S., Wingsle G., Olsson O., Haellgren J.E. Characterisation of cDNAs encoding CuZn-superoxide dismutases in Scots pine // Plant Mol. Biol. -1992.- 18.-P. 545-555.

67. Keller T., Damude H.G., Werner D., Doerner P., Dixon R.A., Lamb C. A plant homolog of the neutrophil NADPH oxidase gp91phox subunit gene encodes a plasma membrane protein with Ca2+ binding motifs // Plant Cell. 1998. - 10. - P. 255-266.

68. Kernodle S.P., Scandalios J.G. Structural organization, regulation, and expression of the chloroplastic superoxide dismutase Sodl gene in maize // Arch. Biochem. Biophys. 2001. - 391. - P. 137-147.

69. Keyer K., Imlay A.J. Superoxide accelerates DNA damage by elevating free iron levels // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996.-93. - P. 13635-13640.

70. Khan A.U., Kasha M. Singlet molecular oxygen in the Haber-Weiss reaction // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. -91. - P. 12365-12367.

71. Khan A.U., Kovacic D., Kolbanovskiy A., Desai M., Frenkel K., Geacintov N.E. The decomposition of peroxynitrite to nitroxyl anion (NO- and singlet oxygen in aqueous solution // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - 97. - P.2984-2989.

72. Kislauskis E.H., Zhu X., and Singer R.H. Sequences responsible for intracellular localization of P-actin messenger RNA also affect cell phenotype // J. Cell. Biol. 1994. - 127. - P. 441-451.

73. Klein J.A., Ackerman S.L. Oxidative stress, cell cycle, and neurodegeneration // J. Clin. Invest. 2003. - 111. - P. 785-793.

74. Kliebenstein D.J., Monde R.A., Last R.L. Superoxide dismutase in Arabidopsis: an eclectic enzyme family with disparate regulation and protein localization // Plant Physiol. 1998. - 118. - P. 637-650.

75. Knirsch L., Clerch L.B. A region in the 3'UTR of MnSOD RNA enhances translation of a heterologous RNA // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. -272.-P. 164-168.

76. Konig J., Lotte K., Plessow R., Brockhinke A., Baier M., Dietz K.-J. Reaction Mechanism of Plant 2-Cys Peroxiredoxin. Role of the C terminus and the quaternary structure // J. Biol. Chem. 2003. - 278. - P. 24409-24420.

77. Kono Y., Fridovich I. Superoxide radical inhibits catalase // J. Biol. Chem. -1982.-257.-P. 5751-5754.

78. Kreuz K., Tommasini R., Martinoia E. Old enzymes for a new job. Herbicide detoxification in plants // Plant Physiol. 1996. - 111. - P. 349-353.

79. Kroniger W., Rennenberg H., Tadros M.H., Polle A. Purification and properties of manganese superoxide dismutase from Norway spruce (Picea abies L. Karst) // Plant Cell Physiol. 1995. - 36. - P. 191-196.

80. Kuo C.F., Mashino T., Fridovich I. a,p-Dihydroxyisovalerate dehydratase: a superoxide-sensitive enzyme // J. Biol. Chem. 1987. - 262. - P. 4724-4727.

81. Kwon S.Y., Ahn Y.O., Lee H.S., Kwak S.S. Biochemical characterization of transgenic tobacco plants expressing a human dehydroascorbate reductase gene // J. Biochem. Mol. Biol. 2001. -34. - P. 316-321.

82. Lah M.S., Dixon M.M., Pattridge K.A., Stallings W.C., Fee J.A., Ludwig M.L. Structure-function in Escherichia coli iron superoxide dismutase: comparisons with the manganese enzyme from Thermus thermophilus II Biochem. 1995.-34.-P. 1646-1660.

83. Lancaster V.L., LoBrutto R., Selvaraj F.M., Blankenship R.E. A cambialistic superoxide dismutase in the thermophilic photosynthetic bacterium Chloroflexus aurantiacus II J. Bacteriol. 2004. - 186. - P. 3408-3414.

84. Lara-Ortiz T., Riveros-Rosas T., Aguirre J. Reactive oxygen species generated by microbial NADPH oxydase NoxA regulated sexual development in Aspergillus nidulans // Mol. Microbiol. 2003. - 50. - P. 1241-1255.

85. Lenaz G., D'Aurelio M., Merlo Pich M., Genova M.L., Ventura B., Bovina C., Formiggini G., Parenti Castelli G. Mitochondrial bioenergetics in aging // Biochim. Biophys. Acta. 2000. - 1459. - P. 397-404.

86. Leonardis S.D., Dipierro N., Dipierro S. Purification and characterization of an ascorbate peroxidase from potato tuber mitochondria // Plant Physiol. Biochem. -2000.-38.-P. 773-778.

87. Li Z., Khaletskiy A., Wang J., Wong J.Y.C., Oberley L.W., Li J.-J. Genes regulated in human breast cancer cells overexpressing manganese-containing superoxide dismutase // Free Radic. Biol. Med. 2001. - 30. - P. 260-267.

88. Lledias F., Rangel P., Hansberg W. Oxidation of catalase by singlet oxygen // J. Biol. Chem. 1998. - 273. - P. 10630-10637.

89. Luwe M.W.F, Takahama U., Heber U. Role of ascorbate in detoxifying ozone in the apoplast of spinach (Spinacia oleracea L.) leaves // Plant Physiol. -1993.- 101.- P. 969-976.

90. Malfroy B., Doctrow S.R., Orr P.L., Tocco G., Fedoseyeva E.V., Benichou G. Prevention and suppression of autoimmune encephalomyelitis by EUK-8, a synthetic catalytic scavenger of oxygen-reactive metabolites // Cell, Immunol. -1997.- 177.-P. 62-68.

91. Markesbery W.R. Oxidative stress hypothesis in Alzheimer's disease // Free Radic. Biol. Med. 1997. - 23. - P. 134-147.

92. Marklund S.L. Human copper-containing superoxide dismutase of high molecular weight II Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1982. - 79. - P. 7634-7638.

93. Martin M.E., Byers B.R., Olson M.O., Salin M.L., Arceneaux J.E.L., Tolbert C. A Streptococcus mutatis superoxide dismutase that is active with either manganese or iron as a cofactor // J. Biol. Chem. 1986. - 261. - P. 9361-9367.

94. May M.J., Vernoux T., Leaver C., Van Montagu M., Inze D. Glutathione homeostasis in plants: implications for environmental sensing and plant development // J. Exp. Bot. 1998. - 49. - P. 649-667.

95. McClung C. R. Regulation of catalases in Arabidopsis II Free Radic. Biol. Med.-1997.-23.-P. 489^196.

96. McGinnis S., Madden T.L. BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools // Nucl. Acids Res. 2004. - 32(Web Server issue). -W20-5.

97. McKersie B.D., Bowie, S.R., Harjanto E., Leprince O. Water-deficit tolerance and field performance of transgenic alfalfa overexpressing superoxide dismutase // Plant Physiol. 1996. - 111.-P. 1177-1181.

98. McKersie B.D., Bowley S.R., Jones K.S. Winter survival of transgenic alfalfa overexpressing superoxide dismutase // Plant Physiol. 1999. - 119. - P. 839-847.

99. McKersie B.D., Chen Y., De Beus M., Bowley S.R., Bowler C. Superoxide dismutase enhances tolerance of freezing stress in transgenic alfalfa (Medicago sativa L.) // Plant Physiol. 1993. - 103. - P. 1155-1163.

100. Meyers B.C., Vu H.T., Tej S.S., Ghazal H., Matvienko M., Agrawal V., Ning J., Haudenschild C.D. Analysis of the transcriptional complexity of Arabidopsis thaliana by massively parallel signature sequencing // Nature Biotech. 2004. - 22. -P. 1006-1011.

101. Miesel R., Kurpisz M., Kroger H. Suppression of inflammatory arthritis by simultaneous inhibition of nitric oxide synthase and NADPH oxidase // Free Radic. Biol. Med. 1996. - 20. - P. 75-81.

102. Mittler R. Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance // Trends Plant Sci.-2002.-7.-P. 405-410.

103. Mittler R., Vanderauwera S., Golery M., Van Breusegem F. Reactive oxygen gene network of plants // Trends Plant Sci. 2004. - 9. - P. 490-498.

104. Moran J.F., James E.K, Rubio M.C, Sarath G., Klucas R.V., Becana M. Functional characterization and expression of a cytosolic iron-superoxide dismutase from cowpea root nodules // Plant Physiol. 2003. - 133. - P. 773-782.

105. Muller-Moule P., Havaux M., Niyogi K.K. Zeaxanthin deficiency enchances the high light sensitivity of an ascorbate-deficient mutant in Arabidopsis. 2003. -Plant Physiol. 133. - P. 748-760.

106. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture // Physiol. Plant. 1962. - 15. - P. 473-479.

107. Obinger C., Regelsberger G., Pircher A., Strasser G., Peschek G.A. Scavenging of superoxide and hydrogen peroxide in blue-green algae (cyanobacteria) // Physiol Plant. 1998. - 104. - P. 693-698.

108. Ogawa K., Kanematsu S., Asada K. Intra- and extracellular localization of 'cytosolic' CuZn superoxide dismutase in spinach leaf and hypocotyls // Plant Cell Physiol. 1996. - 37. - P. 790-799.

109. Ogawa K., Kanematsu S., Asada K. Generation of superoxide anion and localization of Cu-Zn superoxide dismutase in the vascular tissues of spinach hypocotyls: their association with lignification // Plant Cell Physiol. 1997. - 38. — P. 1118-1126.

110. Oury T. D., Day B.J., Crapo J.D. Extracellular superoxide dismutase in vessels and airways of humans and baboons // Free Radie. Biol. Med. 1996. - 20. -P. 957-965.

111. Pak J.H., Manevich Y., Kim H.S., Feinstein S.I., Fisher A.B. An antisense oligonucleotide to 1-cys peroxiredoxin causes lipid peroxidation and apoptosis in lung epithelial cells // J. Biol. Chem. 2002. - 277. - P. 49927-49934.

112. Palmer J.D. Mitochondrial DNA in plant systematics: applications and limitations // Molecular systematics of plants / Soltis P.S., Soltis D.E., Doyle J. J. eds.. NY:Chapman & Hall. 1992. - P. 36-49.

113. Parker M. W., Blake C.C.F. Iron- and manganese-containing superoxide dismutases can be distinguished by analysis of their primary structures // FEBS Lett. 1988. - 229. - P. 377-382.

114. Pastori G., Foyer C.H., Mullineaux P. Low temperature-induced changes in the distribution of H202 and antioxidants between the bundle sheath and mesophyll cells of maize leaves // J. Exp.Bot. 2000. - 51. - P. 107-113.

115. Pekker I., Tel-Or E., Mittler R. Reactive oxygen intermediates and glutathione regulate the expression of cytosolic ascorbate peroxidase during iron-mediated oxidative stress in bean // Plant Mol. Biol. 2002. - 49. - P. 429-438.

116. Pellinen R., Palva T., Kangasjarvi J. Subcellular localization of ozone-induced hydrogen production in birch (Betula pendula) leaf cells // Plant J. 1999. - 20. -P. 349-356.

117. Perl A., Perl-Treves R., Galili S., Aviv D., Shalgi E., Malkin S., Galun E. Enhanced oxidative stress defence in transgenic potato expression tomato Cu,Zn superoxide dismutases // Theor. Appl. Genet. 1993. - 85. - P. 568-576.

118. Pitcher L.H., Brennan E., Hurley A., Dunsmuir P., Tepperman J.M., Zilinskas B.A. Overproduction of petunia copper/zinc superoxide dismutase does not confer ozone tolerance in transgenic tobacco // Plant Physiol. 1991. — 97. — P. 452-455.

119. Pitcher L.H., Zilinskas B.A. Overexpression of copper/ zinc superoxide dismutase in the cytosol of transgenic tobacco confers partial resistance to ozone-induced foliar necrosis // Plant Physiol. 1996. - 110. - P. 583-588.

120. Polidoros A.N., Scandalios J.G. Responses of the maize catalases to light // Free Radic. Biol. Med. 1997. - 23. - P. 497-504.

121. Porfirova S., Bergmuller E., Tropf S., Lemke R., Dormann P. Isolation of an Arabidopsis mutant lacking vitamin E and identification of a cyclase essential for all tocopherol biosynthesis // Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 2002. - 99. - P. 1249512500.

122. Prochazkova D., Sairam R.K., Srivastava G.C., Singh D.V. Oxidative stress and antioxidant activity as the basiss of senescence in maize leaves // Plant Sci. -2001.-161.-P. 765-771.

123. Radi R., Beckman J.S., Bush K.M., Freeman B.A. Peroxynitrite oxidation of sulfhydryls. The cytotoxic potential of superoxide and nitric oxide // J. Biol. Chem. 1991.-266.-P. 4144-4250.

124. Rizhsky L., Liang H., Mittler R. The Water-water cycle is essential for chloroplast protection in the absence of stress // J. Biol. Chem. 2003. — 278. - P. 38921-38925.

125. Rong Y., Doctrow S.R., Tocco G., Baudry M. EUK-134, a synthetic superoxide dismutase and catalase mimetic, prevents oxidative stress and attenuates kainate-induced neuropathology // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. -96. - P. 9897-9902.

126. Rosen H., Crowley J.R., Heinecke J.W. Human neutrophils use the myeloperoxidase-hydrogen peroxide-chloride system to chlorinate but not nitrate bacterial proteins during phagocytosis // J. Biol. Chem. 2002. - 277. - P. 3046330468.

127. Sakamoto A., Ohsuga H., Tanaka K. Nucleotide sequences of two cDNA clones encoding different Cu/Zn-superoxide dismutases expressed in developing rice seed (Oryza sativa L.) // Plant Mol. Biol. 1992. - 19. - P. 323-327.

128. Samis K., Bowley S., McKersey B. Pyramiding Mn-superoxide dismutase transgenes to improve persistence and biomass production in alfalfa // J. Exp. Bot. -2002.-53.-P. 1343-1350.

129. Sandalio L.M., Lopez-Huertas E., Bueno P., del Rio L.A. Immunocytochemical localization of copper,zinc superoxide dismutase inperoxisomes from watermelon (Citrullus vulgaris Schrad.) cotyledons // Free Radic. Res. 1997.-26.-P. 187-194.

130. Santos R., Bocquet S., Puppo A., Touati D. Characterization of an atypical superoxide dismutase from Sinorhizobium meliloti II J. Bacteriol. 1999. — 181. — P. 4509-4516.

131. Schinkel H., Hertzberg M., Wingsle G. A small family of novel CuZn superoxide dismutases with high isoelectric points in hybrid aspen // Planta. -2001.-213.-P. 272-279.

132. Schmidt M. Manipulating the coordination number of the ferric iron within the cambialistic superoxide dismutase of Propionibacterium shermanii by changing the pH-value. A crystallographic analysis // Eur. J. Biochem. 1999. -262.-P. 117-126.

133. Sen Gupta A., Heinen J., Holaday A.S., Burke J J., Allen R. D. Increased resistance to oxidative stress in transgenic plants that overexpress chloroplastic Cu/ Zn superoxide dismutase II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - 90. - P. 16291633.

134. Shigeoka S., Ishikawa T., Tamoi M., Miyagawa Y., Takeda T., Yabuta Y., Yoshimura K. Regulation and function of ascorbate peroxidase isoenzymes // J. Ex. Bot. -2002.-53.-P. 1305-1319.

135. Siemankowski L.M., Morreale J., Briehl M.M. Antioxidant defensesein the TNF-treated MCF-7 cells: selective increase in MnSOD II Free Radic. Biol. Med. -1999.-26.-P. 919-924.

136. Small I., Peeters N., Legeai F., Lurin C. Predotar: A tool for rapidly screening proteomes for N-terminal targeting sequences // Proteomics. 2004. - 4. - P. 1581-1590.

137. Srivalli B., Khanna-Chopra R. Induction of new isoforms of superoxide dismutase and catalase enzymes in the flag leaf of wheat during monocarpic senescence // Biochem Biophys Res Commun. 2001. - 288. - P. 1037-1042.

138. Streller S., Kromer S., Wingsle G. Isolation and purification of mitochondrial Mn-superoxide dismutase from the Gymnosperm Pinus sylvestris L. // Plant Cell Physiol. 1994. - 35. - P. 859-867.

139. Streller S., Wingsle G. Pinus sylvestris L. needles contain extracellular Cu/Zn superoxide dismutase // Planta. 1994. - 192. - P. 195-201.

140. St. John, G., Steinman H. M. Periplasmic copper-zinc superoxide dismutase of Legionella pneumophila: role in stationary-phase survival // J. Bacteriol. 1996. - 178.-P. 1578-1584.

141. Sugio S., Hiraoka B.Y., Yamakura F. Crystal structure of cambialistic superoxide dismutase from Porphyromonas gingivalis II Eur. J. Biochem. — 2000. -267.-P. 3487-3495.

142. Tabares L.C., Bittel K., Carrillo N., Bortolotti A., Cortez N. The single superoxide dismutase of Rhodobacter capsulatus is a cambialistic, manganese-containing enzyme // J. Bacteriol. 2003. - 185. - P. 3223-3227.

143. Taub J. J., Rothblatt J. A. Regulation of peroxisome biogenesis and function in C. elegans//Mol. Biol. Cell. 1995. - 6 Suppl. - P. 107.

144. Tenhaken R., Levine A., Brisson L.F., Dixon R.A., Lamb C. Function of the oxidative burst in hypersensitive disease resistance // Proc. Nati. Acad. Sci. USA. -1995.-92.-P. 4158-4163.

145. Tepperman J.M., Dunsmuir P. Transformed plants with elevated levels of chloroplastic SOD are not more resistant to superoxide toxicity // Plant Mol. Biol. -1990.- 14-P. 501-511.

146. Tian B., Hu J., Zhang H., Lutz C.S. A large-scale analysis of mRNA polyadenylation of human and mouse genes // Nucl. Acids Res. 2005. - 33. - P. 201-212.

147. Torres M.A., Dangl J.L., Jones J.D.G. Arabidopsis gp91 phox homologues AtrbohD and AtrbohF are required for accumulation of reactive oxygenintermediates in the plant defense response // Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 2002. -99.-P. 517-522.

148. Turrens J.F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species // J. Physiol. -2003.-552.-P. 335-344.

149. Ursby T., Adinolfi B.S., Al-Karadaghi S., De Vendittid E., Bocchini V. Iron superoxide dismutase from the archaeon Sulfolobus solfataricus: analysis of structure and thermostability // J. Mol. Biol. 1999. - 286. -P. 189-205.

150. Vanaker H., Harbinson J., Ruisch J., Carver T.L.V., Foyer C.H. Antioxidant defences of the apoplast // Protoplasma. 1998. - 205. - P. 129-140.

151. Van Breusegem F., Slooten L., Stassart J.M., Moens T., Botterman J., Van Montagu M., Inze D. Overproduction of Arabidopsis thaliana FeSOD confers oxidative stress tolerance to transgenic maize // Plant Cell Physiol. 1999. - 40. -P. 515-523.

152. Van Camp W., Capiau K., Van Montagu M, Inze D., Slooten L. Enhancement of oxidative stress tolerance in transgenic tobacco plants overproducing Fe-superoxide dismutase in chloroplasts // Plant Physiol. 1996. — 112.-P. 1703-1714.

153. Van Camp W., Inze D., Van Montagu M. The regulation and function of tobacco superoxide dismutases // Free Radic. Biol. Med. 1997. - 23. - P. 515— 520.

154. Van Loon A.P.G.M., Pesolt-Hurt B., Schatz G. A yeast mutant lacking mitochondrial manganese superoxide dismutase gene is hypersensitive to oxygen // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1986. - 83. - P. 3820-3824.

155. Ventura B., Genova M.L., Bovina C., Formiggini G., Lenaz G. Control of oxidative phosphorylation by Complex I in rat liver mitochondria: implications for aging // Biochim. Biophys. Acta. 2002. - 1553. - P. 249-260.

156. Welsh J., Liu J.-P., Efstratiadis A. Cloning of PCR-amplified total cDNA: construction of a mouse oocyte cDNA library // Genet. Anal. Techn. Appl. 1990. -7.-P. 5-17.

157. Whittaker J.W. The irony of manganese superoxide dismutase // Biochem. Soc. Transact. 2003. - 31. - P. 1318-1321.

158. Whittaker M.M., Whittaker J.W. Recombinant superoxide dismutase from a hyperthermophilic archaeon, Pyrobaculum aerophilium II J. Biol. Inorg. Chem. -2000.-5.-P. 402^08.

159. Willekens H., Langebartels C., Tire C., Van Montagu M., Inze' D., Van Camp W. Differential expression of catalase genes in Nicotiana plumbaginifolia L.) // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994.-91.-P. 10450-10454.

160. Wiseman H., Halliwell B. Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer // Biochem. J. -1996.-313.-P. 17-29.

161. Wu C., Alwine J.C. Secondary structure as a functional feature in the downstream region of mammalian polyadenylation signals // Mol. Cell. Biol. -2004. 24. - P. 2789-2796.

162. Xiang C., Oliver D.J. Glutathione metabolic genes coordinately respond to heavy metals and jasmonic acid in Arabidopsis // Plant Cell. — 1998. 10. - P. 1539-1550.

163. Yamaguchi K., Mori H., Nishimura M. A novel isoenzyme of ascorbate peroxidase localized on glyoxysomal and leaf peroxisomal membranes in pumpkin // Plant Cell Physiol. 1995. - 36. - P.l 157-1162.

164. Yamakura F., Rardin R.L, Petsko G.A., Ringe D., Hiraoka B.H., Nakayama K, Fujimura T., Taka H., Murayama K. Inactivation and destruction of conserved

165. Trpl59 of Fe-superoxide dismutase from Porphyromonas gingivalis by hydrogen peroxide II Eur. J. Biochem. 1998. - 253. - P. 49-56.

166. Yamano S., Sako Y., Nomura N., Maruyama T. A cambialistic SOD in a strictly aerobic hyperthermophilic archaeon, Aeropyrum pernio II J. Biochem. -1999.-126.-P. 218-225.

167. Yan J., Marr T.G. Computational analysis of 3'-ends ofESTs shows four classes of alternative polyadenylation in human, mouse, and rat // Genome Res. -2005.- 15.-P. 369-375.

168. Yoneyama H., Yamamoto A., Kosaka H. Neuronal nitric oxide synthase generates superoxide from the oxygenase domain // Biochem. J. 2001. - 360(Pt 1).-P. 247-253.

169. Youn H.-D., Kim E.-J., Roe J.-H., Hah Y.C., Kang S.-O. A novel nickel-containing superoxide dismutase from Streptomyces spp. // Biochem. J. 1996. -318.-P. 889-896.

170. Yoshida K., Kaothien P., Matsui T., Kawaoka A., Shinmyo A. Molecular biology and application of plant peroxidase genes // Appl. Microbiol. Biotechnol. -2003.-60.-P. 665-670.

171. Zhu D., Scandalios J. Expression of the maize MnSod (Sod3) gene in MnSOD-deficient yeast rescues the mutant yeast under oxidative stress // Genetics. 1992.- 131.-P. 803-809.

172. Zhu D., Scandalios J.G. The maize mitochondrial MnSODs encoded by multiple genes are localized in the mitochondrial matrix of transformed yeast cells // FreeRadic. Biol. Med. 1995. - 18. - P. 179-183.

173. Zhu E P.-S.E., Tarun A.S., Weber S.U., Jouanin L., Terry N. Cadmium tolerance and accumulation in Indian mustard is enhanced by overexpressinggamma-glutamylcysteine synthetase // Plant Physiol. 1998. - 121. - P. 11691178.

Информация о работе

Катышев, Александр Игоревич
кандидата биологических наук
Иркутск, 2005
ВАК 03.00.12

Диссертация

Характеристика генов семейства SOD культурных (Zea mays) и дикорастущих (Larix sibirica, L. gmelinii) растений в связи с проблемой механизмов генетической регуляции - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы