Изучение меж- и внутривидовых различий по устойчивости к действию фтора у сибирских видов лиственниц методом культуры in vitro

Шмаков, Владимир Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение меж- и внутривидовых различий по устойчивости к действию фтора у сибирских видов лиственниц методом культуры in vitro
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Изучение меж- и внутривидовых различий по устойчивости к действию фтора у сибирских видов лиственниц методом культуры in vitro"

На правахрукописи

ШМАКОВ ВЛАДИМИР НИКОЛАЕВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ МЕЖ- И ВНУТРИВИДОВЫХ РАЗЛИЧИЙ ПО УСТОЙЧИВОСТИ К ДЕЙСТВИЮ ФТОРА У СИБИРСКИХ ВИДОВ ЛИСТВЕННИЦ МЕТОДОМ КУЛЬТУРЫ IN VITRO

03.00.12 - физиология в биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск -2004

Работа выполнена в Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН, г. Иркутск

Научный руководитель:

доктор биологических наук Ю.М. Константинов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук А.С. Плешанов, Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, г.Иркутск

кандидат биологических наук В.И. Чемернлова, Иркутский государственный университет, г. Иркутск

Ведущая организация:

Институт леса им. В.Н. Сукачева СО РАН, г. Красноярск

Защита диссертации состоится " 28 апреля 2004 г. в 14 ч на заседании диссертационного совета Д 003.047.01 при Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН по адресу: 664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132, а/я 1243. Факс. (3952). 510754; E-mail:matmod@sifibг.гu

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН.

Автореферат разослан " 18 " марта 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность_проблемы. Антропогенная деятельность

сопровождается образованием многочисленных токсических соединений, среди которых к числу наиболее агрессивных относятся производные фтора. В результате этого происходит деградация биогеоценозов и появляется реальная угроза серьезных нарушений в биосфере. Наиболее подвержены воздействию токсикантов хвойные леса (Бельчинская, 2000). Наблюдаются усыхание и гибель хвойных, наиболее выраженные в промышленно развитых регионах. Столь критическая ситуация объясняет значительный интерес, проявляемый к изучению влияния промышленных выбросов на представителей видов хвойных и образуемые ими биоценозы, исследованию механизмов устойчивости к токсикантам, поиску и созданию форм, толерантных к загрязнителям. К настоящему моменту накопился большой объем информации в области экологических и физиолого-биохимических исследований действия фторсодержащих соединений, а также механизмов устойчивости к ним, начиная с уровня растительных сообществ, и заканчивая уровнем целого организма или отдельных его частей и органов (Тарчевский, 1964; Негруцкая, 1970; Bucher-Wallin, 1976; Braun, 1977; Соков, 1979; Рожков, Михайлова, 1989; Бабушкина и др., 1993; Ярмишко и др., 1995; Харук и др., 1996; Pukacki, 1998; Михайлова и др., 1998; Mikhailova, 2000; Осколков, Воронин, 2003). Только применение комплексного подхода с привлечением различных методов исследования на всех уровнях организации биологической системы позволяет получить исчерпывающую информацию о состоянии лесных экосистем и выработать способы выхода из сложившейся негативной ситуации (Mikhailova, 2000). В этой связи большие перспективы открываются при использовании различных методов культуры клеток, органов и тканей in vitro (Бутенко, 1985; Носов, 1999). Эти методы успешно используются для изучения влияния тяжелых металлов (Гуральчук, 1994), гербицидов (Diaz-Cacho et al., 1999; Encina, 2001), солевого стресса и стресса обезвоживания (Костюк и др., 1994) на растительные клетки и получения или отбора устойчивых к засолению, затоплению, засухе, тяжелым металлам и ркстремальным температурам организмов (Tyagi et al., 1981; Sumaryati et al., 1992; Харинарайн и др., 1996; Winicov, 1996; Samantaray et al., 1999; Rout et al., 1999; Сергеева, 2000). Подавляющее большинство исследований в данной области проводится на культуре in vitro травянистых растений, и ни в одном случае не использовался растительный материал хвойных. Кроме того, до настоящего момента не изучалась реакция культивируемых растительных клеток на действие таких высоко агрессивных и повсеместно распространенных промышленных загрязнителей, какими являются производные фтора. С учетом недостаточной изученности действия фторсодержащих соединений на физиолого-биохимические процессы у

РОС/НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

представителей хвойных пород значительную актуальность представляет использование для этих целей современных методов клеточной биологии и биохимии растений.

Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в оценке возможности меж- и внутривидовой дифференциации лиственницы сибирской {Larix sibirica Ledeb.) и лиственницы Гмелина {Larix gmelinii (Rupr.) Rupr.) no их устойчивости к фтору на основе каллусной культуры in vitro.

В рамках работы были поставлены следующие задачи:

- подобрать исходный растительный материал и оптимальные условия культивирования для получения и стабильного поддержания долгоживущей каллусной культуры лиственницы сибирской и лиственницы Гмелина. Исследовать характеристики каллусогенеза у двух видов лиственниц;

- изучить возможность использования характеристик каллусогенеза для оценки генотипического разнообразия лиственниц;

- оценить действие различных концентраций фторида натрия на рост каллусной культуры двух видов лиственниц in vitro;

- исследовать возможность использования характеристик каллусогенеза для оценки устойчивости каллусной культуры к фтору в условиях in vitro;

- изучить возможность дифференциации видов и экотипов лиственницы сибирской и лиственницы Гмелина по устойчивости к фтору с использованием каллусной культуры in vitro.

Научная новизна. В результате проведенных исследований разработана модельная система, позволяющая оценить реакцию растительных клеток лиственниц на действие фтора в условиях in vitro. Впервые показано, что долгоживущая каллусная культура дает возможность эффективно дифференцировать генотипы сибирских видов лиственниц по признаку фторустойчивости in vitro. На основе реакции ростовой активности каллусных штаммов на присутствие различных концентраций фтора в среде культивирования проведена их классификация по степени устойчивости к галогену в условиях in vitro.

Научная и практическая ценность работы. С использованием долгоживущей каллусной культуры лиственниц разработана система клеточной селекции генотипов разных видов хвойных по устойчивости к фтору в условиях in vitro. Установлено, что такие характеристики каллусогенеза, как ростовая активность культуры, сроки появления первых участков некротизации и степень некротизации каллуса на фторсодержащих средах в учетные даты эксперимента являются штаммоспецифическими признаками и зависят от генотипа. исходного растения. Отбор наиболее устойчивых к действию фтора в условиях in vitro каллусных штаммов позволяет получить растительньщ материал для изучения конкретных механизмов фторустойчивости на уровне клетки. Применение методовмикроклональногоразмножения, генной и клеточной

инженерии в сумме с данными по изучению механизмов фторустойчивости даст возможность в будущем получить растительные формы с повышенной устойчивостью к токсиканту с целью дальнейшего их использования в программах лесовосстановления и создания санитарно-защитных насаждений вокруг промышленных предприятий.

Защищаемые положения.

1. Долго живущая каллусная культура, поддерживаемая на содержащих фторид натрия средах, позволяет эффективно дифференцировать генотипы сибирских видов лиственниц по их устойчивости к действию фтора in vitro.

2. Исследуемые каллусные штаммы Larix sibirica и Larix gmelinii по их устойчивости к действию фтора in vitro подразделяются на 5 классов: высокоустойчивые, устойчивые, среднеустойчивые, слабоустойчивые, неустойчивые.

3. Каллусные штаммы лиственниц с повышенной устойчивостью к действию фтора in vitro характеризуются снижением уровня перекисного окисления липидов.

Апробация работы. Основные материалы диссертации были представлены и докладывались на следующих региональных, всероссийских и международных конференциях: Международная конференция "Состояние и перспективы развития биотехнологии растений" (Алматы, 1997), Научно-практическая конференция "Проблемы экологии". Чтения памяти профессора М.М. Кожова" (Иркутск, 1997), Межотраслевой симпозиум IUFRO «Larix-98: World Resources of Breeding, Resistance and Utilization» (Красноярск, 1998), I международная конференция «Biodiversity and Dynamics of Ecosystems in North Eurasia» (BDENE-2000) (Новосибирск, 2000), 6 международная конференция «Acid rain 2000» (Tsukuba, Japan, 2000), I международное рабочее совещание "Биоразнообразие и динамика экосистем Северной Евразии: информационные технологии и моделирование" (WITA-2001) (Новосибирск, 2001), XI международная конференция IBFRA «Boreal forests and environment: local, regional and global scales» (Красноярск, 2002), V съезд Общества физиологов растений «Физиология растений - основа фитобиотехнологии» (Пенза, 2003), Всероссийская научно-практическая конференция «Развитие физико-химической биологии и биотехнологии на современном этапе» (Иркутск, 2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 342 источника, в том числе 236 зарубежных авторов. Работа изложена на 172 страницах, содержит 10 рисунков и 33 таблицы.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использован растительный материал от 80 деревьев Larix sibirica Ledeb. и 20 деревьев L gmelinii Rupr. Rupr. Исходным материалом для получения каллусной культуры лиственниц служили мегастробилы, верхушечные ауксибласты и длинные побеги боковых ветвей, хвоя, зародыши и проростки семян 8-30-и летних деревьев.

Эксплаиты, независимо от происхождения, помещали в пеиициллиновые флаконы (70 х 26 мм) с 8 мл питательной среды.

В работе по оптимизации условий культивирования in vitro каллусов лиственниц в качестве опытных были использованы среды на основе солевых составов, предложенных Мурасиге и Скугом (Murashige, Scoog, 1962), Кемпбелом и Дурзаном (Campbell, Durzan, 1975), Шенком и Хильдебрандтом (Schenk, Hildebrandt, 1972) с добавлением 2-5% сахарозы; 1,0 мг/л тиамина; 0-1,0 мг/л пиридоксина, никотиновой кислоты; 0-2,5 мг/л пантотената кальция; 0-320,0 мг/л инозита; 0-500,0 мг/л гидролизата казеина; 0-1,0 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты, 1-нафтилуксусной кислоты; 0-2,0 мг/л 6-бензиладенина.

Экспланты и полученные каллусные культуры инкубировали в условиях 16 часового светового дня с интенсивностью освещения, 1500 люкс при температуре окружающей среды 23,5-24°С. Цикл выращивания культур составлял 28 дней.

Частоту каллусообразования рассчитывали как процентное отношение числа эксплантов, на которых формировался каллус, к общему числу эксплантов, использованных в эксперименте (Мишарина и др., 1999).

Рост каллусных культур оценивали с применением индекса роста, рассчитываемого по формуле: I = (т, — то)/шо, где то - исходная сырая масса каллуса; т, - сырая масса каллуса к моменту пересадки (Liu, van Staden,2001).

Морфологические характеристики каллусных штаммов (окраска, консистенция и структура, наличие опушения, характер поверхности) оценивали согласно классификации, предложенной Л.А. Кучеренко (1993)

В экспериментах по оценке жизнеспособности каллусных культур лиственниц на фторсодержащих средах использовали штаммы одной популяции лиственницы сибирской и двух популяций лиственницы Гмелина. Контрольные культуры поддерживали на оптимизированной нами среде. Опытные среды, помимо основного состава, содержали фторид натрия в концентрациях: 0,25; 0,5; 0,75; 2,5 и 7,5 мМ. В качестве второго контроля использовали питательную среду, содержащую хлорид натрия в тех же концентрациях, что и фторид натрия. Каллусы инкубировали в условиях ,16 часового светового дня с интенсивностью освещения 1500 люкс при температуре окружающей среды 23,5-24°С. Длительность каждого эксперимента соответствовала одному циклу

выращивания и составляла 28 дней. Опыты проводились в 4-10 биологических повторностях по каждому штамму.

Основным параметром каллусогенеза для оценки действия фтора на растительные клетки выбрана активность роста каллусных культур на фторсодержащих средах. Дополнительно определяли сроки появления первых участков некроза на поверхности каллуса и степень некротизации культуры на 10-е, 20-е и 28-е сутки культивирования на средах, содержащих различные концентрации фторида натрия.

Классификацию штаммов лиственниц по их устойчивости к действию фтора in vitro проводили с использованием t-критерия Стьюдента и методов кластерного анализа (метод иерархической кластеризации Уорда с метриками Евклидова расстояния и метод К-средних).

Определение ТБК-активных продуктов проводили по модифицированной методике (Современные методы в биохимии, 1977, С. 66-68). Количество диеновых конъюгатов определяли. по модифицированному методу И.Д. Стальной (Современные методы в биохимии, 1977, С. 63-64).

Результаты всех экспериментальных исследований подвергали статистической обработке с использованием t-критерия Стьюдента после предварительной трансформации абсолютных значений в нормальные ряды распределения путем их логарифмирования (Глотов и др. 1982). Зависимость скорости роста каллусных штаммов от концентрации фторида натрия определяли с помощью коэффициента линейной корреляции Пирсона (Лакин, 1980).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Характеристика каллусогенеза у лиственницы сибирской и

лиственницы Гмелина 1.1. Получение долгоживущей каллусной культуры лиственниц при использовании различных типов эксплантов Материалом для получения культуры in vitro могут служить различные ткани, взятые из разных частей растения. Одной из основных характеристик таких тканей должна быть способность клеток, их формирующих, к быстрому делению и росту. Выбор экспланта в значительной степени определяется задачами исследования. В нашем случае к исходному растительному материалу предъявлялись следующие требования: высокая частота инициации каллусогенеза на эксплантах, достаточно высокая активность роста и большая длительность поддержания полученного каллуса в культуре in vitro, возможность использования материала от растений, генетический потенциал которых уже проявился фенотипически (взрослые деревья). Наиболее интенсивно процесс каллусогенеза, так же как морфогенеза и эмбриогенеза in vitro, происходит при использовании в качестве исходного материала ювенильных тканей или органов растений, т.е. тканей эмбрионов, семян и

проростков (Картель, Манешина, 1977; Чуб и др., 1994). Применение такого растительного материала неприемлимо при необходимости получения, изучения и использования культуры in vitro индивидуальных растений со строго определенными характеристиками, такими как интенсивность роста, сформированность габитуса растения, плодовитость растения, его устойчивость к неблагоприятным факторам и др. В данном случае необходимо использовать материал взрослых деревьев, желательно не уступающий по характеристикам каллусогенеза ювенильным тканям (Bonga, 1984; Bonga, Pond, 1991). Исходя из задач исследования, предполагающего сопоставление поведения каллусной культуры in vitro с растением - донором этой культуры, было проведено сравнение каллусообразующего потенциала различных типов эксплантов, полученных от взрослых деревьев и ювенильного растительного материала представителей двух видов лиственницы (Larix sibirica, L. gmelinii). Оценивали такие характеристики каллусогенеза, как частота инициации каллусов на эксплантах, ростовая активность полученных каллусных штаммов, длительность поддержания культуры в условиях in vitro.

В результате экспериментальной работы не было выявлено значительного преимущества в частоте и времени инициации каллусогенеза на эксплантах, выделенных из ювенильного материала исследуемых видов хвойных, перед тканями взрослых деревьев. Ростовая активность каллусов, полученных на эксплантах ауксибластов и мегастробилов лиственниц, также не уступала росту каллусных штаммов -производных ювенильного растительного материала (зародыши, проростки семян). Установлено, что варьирование по характеристикам каллусогенеза в большей степени выражено внутри каждого типа эксплантов и связано либо с генотипом растения - донора экспланта, либо с естественным расположением экспланта в структуре органа или образования, из которого он был выделен: различные зоны проростков семян или мегастробилов.

1.2.Оптимнзация питательной среды

На рост и развитие каллусной культуры хвойных, в том числе представителей рода Larix, сильное влияние оказывает состав питательной среды. Выбор солей (микро- и макроэлементов) и органических составляющих, коррекция их баланса и концентраций играют важную роль как в инициации каллусогенеза, так и в дальнейшем поддержании полученной культуры in vitro (Chalupa, 1991). Компоненты среды для выращивания каллусных и суспензионных культур растений можно разделить на 6 групп: основные неорганические питательные вещества (макроэлементы), микроэлементы неорганической природы, источник железа, органические добавки (витамины), источники углерода, регуляторы роста растений.

В данной работе с целью оптимизации питательной среды для длительного культивирования двух видов лиственниц использованы солевые составы, предложенные Мурасиге и Скугом (MS); Кемпбелом и Дурзаном (CD); Шенком и Хильдебрандтом (SH). Результаты исследований по каллусогенезу штаммов, полученных из ауксибластов взрослых деревьев лиственниц, на средах различного солевого состава позволили сделать вывод, что наилучшими из используемых являются среды на основе солевого состава, предложенного Мурасиге и Скугом. Уменьшение концентрации макро- и микросолей MS в среде культивирования в два раза привело к усилению ростовой активности каллусов, в зависимости от штамма, на 13-40% по сравнению со средой оригинального солевого состава.

В экспериментах по подбору оптимального состава органических добавок в среде культивирования было установлено, что введение в среду гидролизата казеина в концентрациях до 500 мг/л не влияло на ростовые характеристики каллусных штаммов лиственниц. Не было выявлено статистически значимых различий в росте культур в зависимости от присутствия витаминов. Так, на питательной среде, содержащей по 1 мг/л пиридоксина и никотиновой кислоты и 2,5 мг/л пантотената кальция, индекс роста каллусных штаммов составил 26,2±0,49, а на среде без витаминов - 27,3±0,74. Не было установлено преимущества использования для длительного культивирования штаммов двух видов лиственниц какой-либо одной концентрации сахарозы (2%, 3%, 5%). В то же время, доказана необходимость использования инозита в качестве основного компонента питательной среды для поддержания каллусных культур лиственниц in vitro. Интенсивность роста у всех используемых штаммов в отсутствие инозита составляла 22-50% от ростовой активности культур, поддерживаемых на инозитсодержащей среде.

В экспериментальной работе по подбору оптимальных концентраций регуляторов роста для культивирования каллусных штаммов двух видов лиственниц было выявлено, что рост культур наиболее активен при добавлении в питательную среду 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4Д) или 1 -нафтилуксусной кислоты (НУК) до конечной концентрации 0,50-1,0 мг/л и 6-бензиладенина (БАЛ) до конечной концентрации 0,1-0,5 мг/л. В дальнейшем установлено, что при длительном использовании в пассажах в качестве ауксина 2,4-Д, это соединение отрицательно влияет на состояние каллусной культуры лиственниц, и, поэтому, была заменена на 1-нафтилуксусную кислоту.

На основании результатов всей экспериментальной работы по оптимизации питательной среды для поддержания каллусных культур Larix sibirica и L. gmelinii был подобран следующий состав питательной среды: 0,5 нормы минеральных солей по Мурасиге и Скугу, 20 г/л сахарозы, 1 мг/л тиамина, 80 мг/л инозита, 1 мг/л НУК, 0,2 мг/л БАП, 7 г/л агара. Такая среда успешно использовалась для длительного (до 60

мес.) поддержания в культуре in vitro каллусов из семенных проростков, зародышей и ауксибластов лиственниц. В качестве среды для инициации каллусогенеза применялся тот же оптимизированный состав, в котором 1-нафтилуксусная кислота заменялась на 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту в концентрации 1 мг/л.

13. Зависимость характеристик каллусогенеза на

оптимизированной среде от генотипа исходного растительного

материала

Способность к каллусообразованию, темп и тип роста культуры клеток зависят не только от состава среды, условий выращивания, физиологического состояния растений - доноров и типа экспланта (Wernicke, Milkoqts, 1984; Кунах, 1997; Gonzalez, Friero, Jouve, 2001). Одинаковые по возрасту и тканевой принадлежности первичные экспланты, выращиваемые в одинаковых условиях, в зависимости от исходного генотипа (сорта, линии) растения, отличаются по частоте каллусообразования и интенсивности роста клеточной культуры (Izumi, Fumio, Hyoji, 1991; Чуб, Власова, Бутенко, 1994; Мигранова и др., 2001; Schween, Schwenkel, 2003). Это характерно для исходного материала, взятого от растений разной видовой принадлежности.

Значение генотипа в процессе каллусогенеза было показано в экспериментальной работе на растительном материале лиственницы сибирской и лиственницы Гмелина. При этом выявлены различия в частоте каллусообразования, интенсивности роста первичного каллуса в первые недели культивирования, в сроках появления первых участков некротизации, продолжительности культивирования на питательной среде штаммов, полученных на эксплантах зародышей, проростков семян, мегастробил и ауксибластов обоих видов лиственниц.

2. Использование каллусной культуры in vitro для изучения

устойчивости лиственниц к фтору 2.1. Действие фторида натрия на рост каллусной культуры лиственниц

2.1.1. Эффект различных концентраций фторида натрия на рост каллусной культуры лиственниц

На основании результатов экспериментальной работы по подбору исходного растительного материала, оптимизации условий получения каллусных культур и их длительного поддержания в условиях in vitro, оценки возможности использования различных характеристик каллусогенеза для дифференциации отдельных генотипов - доноров каллусных штаммов лиственницы сибирской и лиственницы Гмелина была разработана система для изучения устойчивости хвойных к фтору в условиях in vitro и исследовано варьирование данного признака между штаммами, полученными от разных генотипов.

В работе использовали каллусные штаммы двух видов лиственниц, полученные из ауксибластов взрослых деревьев.

По результатам экспериментов не было выявлено эффекта низких концентраций хлорида натрия (0,25 - 0,75 тМ) на ростовые показатели каллусов лиственниц. В то же время, на основе статистического анализа, установлены значительные различия в активности роста культур на средах с более высоким его содержанием. Использование хлорида натрия в среде культивирования в концентрациях 2,5 тМ и выше позволило провести дифференциацию каллусных штаммов, полученных от разных генотипов лиственниц, по признаку их устойчивости к NaCl в условиях in vitro (табл.

Таблица 1.

Относительный прирост каллусных штаммов Ь sibirica в присутствии различных концентраций хлорида натрия в среде культивирования

Каллусный штамм Концентрация хлорида натрия в среде культивирования

Контроль 0,25 тМ 0,75 тМ 2,5 шМ 7,5 шМ

Is 100±23 93±18 89±17 87±16 81±14*

2s 100±11 104±7 113±4 94±9 72±12**

3s 100±8 88±4 87±6 85±5* 66±10*»

4s 100±15 102±14 89±15 86±4* 79±11**

5s 100±9 92±9 88±6 89±3 88±10

6s 100±7 99±11 97±11 91±13 91±11

* Отличие от контроля достоверно при Р < 0,05; достоверно при Р < 0,01.

отличие от контроля

В отношении фторида натрия было установлено его достоверное действие на ростовую активность каллусной культуры лиственниц во всех используемых нами концентрациях химического агента (табл. 2).

Таблица 2.

Относительный прирост каллусных штаммов Ь. &Шпса в присутствии различных концентраций фторида натрия в среде культивирования_

Концентрация фторида натрия в среде культивирования

штамм Контроль 0,25 mM 0,75 mM 2,5 mM 7,5 mM

Is 100±23,1 72±4,1* 67±9,3** 15±1,3*** 8±0,5***

2s 100±11,2 87±16,3 22±3,0*** 14±2,1*** 8±0,5***

3s 100±8,0 105±5,2 26±3,2*** 16±2,0*** 7±1,0***

4s 100±15,2 112±9,0 35±3,1*** 15±2,3*** 7±0,6***

5s 100±9,1 53±6,4»* 25±3,2*** 14±1,1*** 7±0,6***

6s 100±7,3 78±5,1* 39±11,1*** 15±1,0*** 7±0,3***

* Отличие от контроля достоверно при Р < 0,05; ** отличие от контроля достоверно при Р < 0,01; *** отличие от контроля достоверно при Р < 0,001.

При увеличении содержания фторида натрия в среде культивирования относительный прирост каллусной культуры уменьшался. Применение коэффициента линейной корреляции Пирсона показало строгую отрицательную зависимость между концентрацией фторида натрия и изменением скорости роста. Численное значение коэффициента корреляции для лиственницы сибирской составило -0,95, а для лиственницы Гмелина -0,99.

Анализ усредненных данных ростовой активности по всем штаммам на средах, содержащих фтор, показал, что негативное действие фторида натрия на рост каллусных культур проявляется уже в присутствии в концентрации 0,25 тМ и сопоставимо с таковым действием хлорида натрия в концентрации 2,5 - 7,5 тМ. С увеличением содержания фторида натрия в питательной среде его отрицательный эффект на состояние каллусов лиственниц возрастает. В присутствии в концентрации 0,75 тМ ростовая активность подавляющего большинства штаммов снижалась более чем на 60%, а на среде, содержащей 7,5 тМ фторида натрия, роста каллусных культур выявлено не было, ткань некротизировала и погибала в течение двух недель инкубации.

2.1.2. Определение концентраций фторида натрия, вызывающих дифференцированную ростовую реакцию каллусных культур лиственниц.

Анализ результатов по оценке реакции отдельных каллусных культур лиственницы сибирской на присутствие в среде различных концентраций фторида натрия показал, что в концентрации 0,25 тМ вызывал статистически значимое понижение активности роста у трех из шести исследуемых штаммов: 18, 58, 68 на 28%, 47% и 22%, соответственно. Присутствие фторида натрия в среде культивирования в концентрации 0,75 тМ вызывало снижение ростовой активности всех каллусов от 33% у штамма 18 до 78% у штамма 28. Относительный прирост каллусных культур в присутствии 2,5 тМ составлял 14-16% от контроля и статистически не различался между штаммами. Также не было выявлено различий в реакции используемых штаммов на присутствие в среде культивирования 7,5 тМ фторида натрия.

Суммируя и анализируя полученные результаты, можно выделить следующие диапазоны концентраций фторида натрия по их действию на каллусогенез лиственницы сибирской: (1) концентрации не

оказывающие или слабо оказывающие влияние на рост штаммов (до 0,25 мМ), (2) концентрации фторида натрия, ингибирующие рост каллусных клеток без потери их жизнеспособности (0,25 - 0,75 тМ), (3) сублетальные концентрации приводящие к остановке роста клеток (0,75 - 2,5 тМ), (4) летальные концентрации фторида натрия (выше 2,5 тМ).

Достаточно большое варьирование темпов роста отдельных каллусных штаммов лиственниц наблюдалось в ответ на присутствие

фторида натрия в среде культивирования в концентрациях от 0,25 до 0,75 тМ. Использование такого диапазона концентраций NaF позволяет довольно четко дифференцировать культуры, полученные от различных генотипов лиственницы сибирской. Тот же вывод сделан по результатам аналогичного исследования на штаммах лиственницы Гмелина.

Следовательно, можно сделать заключение о том, что система клеточной селекции позволяет установить индивидуальные различия в отношении устойчивости лиственниц к фториду натрия in vitro. Данный подход уже был нами использован для дифференциации каллусных штаммов лиственницы сибирской и лиственницы Гмелина по признаку устойчивости к окислительному стрессу, инициируемому низкими концентрациями (0,1-100 пМ) прооксиданта параквата (Гарник, Константинов, Шмаков, 2003).

Далее была сделана попытка применения разработанной нами системы для оценки межвидового и внутривидового разнообразия лиственниц по реакции их на действие фтора в пробирочных условиях.

2.2.Реакция каллусных штаммов разных видов и популяций лиственниц на действие фтора в культуре in vitro

Анализ усредненных данных, полученных в результате изучения эффекта фторида натрия на рост каллусных культур лиственницы сибирской и лиственницы Гмелина, не обнаружил статистически достоверных различий в реакции штаммов одного вида по отношению к другому в пределах используемых концентраций токсиканта. В то же время, основываясь на результатах определения относительного прироста отдельных каллусных культур в присутствии различных концентраций фторида натрия и их статистического анализа, установлена высокая вариабельность по изучаемому признаку как среди штаммов лиственницы сибирской (рис. 1а), так и среди культур лиственницы Гмелина (рис. 16).

Относительный прирост каллусных штаммов лиственницы сибирской в присутствии в среде культивирования 0,25 mM NaF находился в пределах 53-112%, а при концентрации 0,75 mM NaF составлял 22-67%. Аналогичные значения для каллусных культур лиственницы Гмелина составили 51-101% и 19-74%, соответственно. Установлено, что варьирование ростовой реакции штаммов на присутствие в культуральной среде фторида натрия, особенно в более высоких его концентрациях, значительно выше у каллусов лиственницы Гмелина.

О 0,25 0,75

Концентрация фторида натрия, тМ

Рис. 1. Ростовая активность каллусных штаммов L. sibirica (а) и L. gmehnii (б) в присутствии двух концентраций фторида натрия в питательной среде. Is, 2s, 3s, 4s, 5s, 6s - штаммы L. sibirica, lgf, 5gf, lgc, 3gc, 4gc - штаммы L. gmelinii.

Для исследования межпопуляционного полиморфизма признака устойчивости к действию фтора в условиях in vitro были использованы каллусные штаммы, полученные от представителей двух популяций лиственницы Гмелина с различной реакцией в отношении фтора на уровне целого организма. Одна из этих популяций - «флюоритовая» -

произрастает в биогеохимической провинции с высоким естественным содержанием фторидов в почве (Рожков, Михайлова, 1989).

, 0,25 0,5 0,75

Концентрация фторида натрия, тМ

Рис. 2. Еостовая активность каллусных культур, полученных от представителей «флюоритовой» (а) и контрольной (б) популяций L gmehnii в присутствии трех концентраций фторида натрия в питательной среде, 8gf- штаммы, полученные от представителей «флюоритовой» популяции, ^ - 6gc - штаммы, полученные от представителей контрольной популяции.

Усреднение результатов по данной серии экспериментов и их статистическая обработка не выявили значимых различий между популяциями по относительному приросту каллусных культур на используемых концентрациях фторида натрия. В то же время, сравнительный анализ данных, полученных по отдельным каллусным культурам Larix gmelinii, показал значительные различия по признаку устойчивости к действию фтора in vitro как для производных «флюоритовой» популяции (рис. 2а), так и для производных контрольной популяции (рис. 26).

Относительный прирост каллусных штаммов лиственницы Гмелина «флюоритовой» популяции в присутствии в среде культивирования 0,25 mM NaF находился в пределах 51-101%, при концентрации 0,50 mM NaF составлял 38-88%, а при 0,75 mM NaF - 27-74%. Аналогичные значения для каллусных культур лиственницы Гмелина контрольной популяции составили 62-89%, 34-85% и 19-49%, соответственно. При этом более высокой вариабельностью реакции каллусных культур на действие фтора в минимальной и максимальной концентрациях характеризовались штаммы - производные генотипов «флюоритовой» популяции. Этот феномен вполне может являться проявлением высокой фенотипической дисперсии (Айала, Кайгер, 1988), несомненно, имеющей место в популяции, находящейся в неблагоприятных по содержанию почвенного фтора условиях существования.

В дальнейшем были обобщены и проанализированы результаты, полученные по всем исследованным штаммам лиственницы сибирской (6 штаммов) и лиственницы Гмелина (20 штаммов). Анализ данных по ростовой активности каллусов на фторсодержащих средах в пределах конкретных концентраций фторида натрия позволил определить средние значения относительного прироста для устойчивых' и неустойчивых штаммов, и культур со средним показателем устойчивости (табл. 3).

Таблица 3.

Средние значения относительного прироста для устойчивых и неустойчивых штаммов и культур со средним показателем устойчивости к

действию фтора in vitro

Концентрация NaF, mM Значения относительного прироста, %

Устойчивый штамм Неустойчивый штамм Штамм со средней устойчивостью

0,25 >86 <70 78,4

0,50 >64 <48 56,2

0,75 >48 <34 41,2

На основе экспериментальных данных с учетом средних значений относительного прироста для устойчивых и неустойчивых каллусных

культур установлено, что все штаммы могут быть отнесены к 5 классам устойчивости к действию фтора in vitro (табл. 4).

Таблица 4.

Классификация исследованных в работе каллусных штаммов Larix sibirica и L. gmelinii по ростовой активности на фторсодержащих средах_

Класс

Характеристика

Каллусные штаммы

Высокоустойчивые

igf

Устойчивые

3gc, 5gc, 12gc, 2gf

III

Tv~

Среднеустойчивые

Is, 4s, 6s, 2gc, 7gc, 10gc, 1 lgc, 4gf, 5gf

Слабоустойчивые

2s, 3s, lgc, 4gc, 6gc, 3gf, 6gf, 8gf

Неустойчивые

5s, 8gc, 9gc, 7gf

Класс высокоустойчивых каллусных культур включает 1 штамм лиственницы Гмелина (lgf) - производный генотипа «флюоритовой» популяции. Неустойчивые к действию фторида натрия in vitro штаммы представлены одной культурой лиственницы сибирской (5s) и тремя -лиственницы Гмелина. Две из последних получены от генотипов контрольной популяции (8gc, 9gc), а одна - от дерева из «флюоритовой» популяции (7gf).

Достоверность различий между классами штаммов, дифференцируемых по характеру ростовой активности на фторсодержащих средах, была подтверждена нами статистическими методами с использованием t-критерия Стьюдента.

На основании классификации показано, что ростовая активность каллусных штаммов L sibirica и L. gmelinii, культивируемых на среде в присутствии фторида натрия, существенно разлигчается. Все исследованные штаммы L. sibirica были отнесены к трем классам, отличающимся относительно низкой устойчивостью к фтору in vitro (среднеустойчивые, слабоустойчивые, неустойчивые). В то же время каллусные культуры L. gmelinii проявляли весь спектр характеристик в соответствии с предложенной нами классификацией и, таким-образом, демонстрировали более высокую по' сравнению с L sibirica вариабельность ростовой активности в присутствии используемых концентраций фторида натрия. Данный факт вполне согласуется с результатами исследований, выполненных на уровне целого организма и указывающими на более высокую экологическую пластичность и изменчивость Larix gmelinii по сравнению с L sibirica (Поздняков, 1975; Пешкова, 1985).

Многомерный анализ на основе методов кластеризации позволил нам провести классификацию каллусных штаммов двух видов лиственниц по их устойчивости к фтору в условиях in vitro с учетом, дополнительно к основному критерию - активность роста на фторсодержащих средах, таких

характеристик, как сроки появления первых участков некроза на поверхности каллуса и степень некротизации культуры на 10-й, 20-й и 28-й день культивирования на средах, содержащих различные концентрации фторида натрия.

На основе метода Уорда с метриками Евклидова расстояния была построена дендрограмма (рис. 3).

Каллусные штаммы

Рис. 3. Дендрограмма сходства каллусных штаммов по признаку устойчивости к фтору in vitro.

Как видно из дендрограммы, все штаммы достаточно отчетливо разделяются на 2 основных кластера

I. 5s, 8gc, 9gc, 7gf, 2s, 3s, Ige, 4gc, 6gc, 3gf, 6gf, 8gf;

II. lgf, 12gc, 3gc, 5gc, 2gf, Is, 4s, 6s, 7gc, lOgc, 1 Ige, 2gc, 4gf, 5gf. При этом первый кластер далее делится на 2 группы штаммов:

Основываясь на результатах иерархической кластеризации, можно говорить о возможности разделения всех штаммов на 5 хорошо дифференцируемых групп, объединяющих все каллусные культуры L sibirica и L gmelinii.

Класс №1 12gc, 3gc, 5gc, 2gf;

№2 2s, 3s, Ige, 4gc, 6gc, 3gf, 6gf, 8gf;

№3 lgf;

№4 ls, 4s, 6s, 7gc, lOgc, 1 lg, 2gc, 4gf, 5gf;

№5 5s, 8gc, 9gc, 7gf.

Аналогичные результаты получены при использовании другого метода кластерного анализа - метода К-средних, где К равнялось 5.

Анализируя данные, полученные при статистическом сравнении используемых 26 штаммов лиственницы сибирской и лиственницы Гмелина по ростовой активности на фторсодержащих средах и сопоставляя их с конкретными величинами относительного прироста каллусов на средах, содержащих различные концентрации фторида натрия, можно выделить уникальные каллусные культуры. Использование таких штаммов в дальнейших исследованиях, на основе изучения их реакции на присутствие активного фтора в среде культивирования, позволит более детально разобраться в природе действия галогена на клеточном уровне и физиолого-биохимических механизмах ответа растительных клеток на вызываемые токсикантом негативные явления.

2.3.Физиолого-биохимическая характеристика каллусных штаммов лиственниц с различной степенью устойчивости к действию

фтора in vitro

В предыдущих разделах диссертации рассмотрены такие важные физиологические параметры культуры клеток лиственниц, как частота и сроки появления каллуса на эксплантах, ростовая активность штаммов в зависимости от условий культивирования и исходного растительного материала, сроки появления участков некротизации и длительность поддержания каллусов до момента остановки их роста и гибели основной массы клеток.

В то же время одной из важных физиологических характеристик при оценке негативных последствий влияния различных факторов среды на организм, в том числе в результате действия таких мощных токсикантов, как производные фтора, является уровень перекисного окисления липидов (ПОЛ) клеточных мембран (Николаевский, 1969; De Vos, 1989; Гуральчук, 1994; Schttitzendilbel, Polle, 2002). В связи с этим нами исследована активность ПОЛ в клетках каллусных штаммов лиственницы Гмелина, различающихся по признаку устойчивости к действию фтора in vitro. Определение активности ПОЛ в двух контрастных по своей чувствительности к действию фторида натрия, в используемых концентрациях, каллусных штаммах лиственницы Гмелина (lgf^ 7gf, табл. 4) показало, что клетки культуры с повышенной устойчивостью к действию фтора in vitro (lgf) характеризуются достоверно более низким уровнем продуктов перекисного окисления мембранных липидов (табл. 5).

Таблица 5.

Содержание продуктов перекисного окисления липидов в каллусных штаммах L gmelinii, различающихся по устойчивости к фтору в культуре in vitro

Каллусный штамм Исследуемый продукт ПОЛ Содержание продуктов ПОЛ, цМ/г сырой массы Содержание продуктов ПОЛ, % от контроля

7gf Диеновые конъюгаты 2,2 ±0,14 100

Igf 1,7 ±0,05 77

7gf ТБК-активные продукты 14,5 ± 0,84 100

Igf 12,5 ± 0,35 86

Содержание диеновых конъюгатов в клетках устойчивой каллусной культуры было на 23% ниже по сравнению с неустойчивым штаммом, тогда как содержание ТБК-активных продуктов снижено на 14%. Таким образом, можно предположить, что повышенная устойчивость каллусных клеток лиственницы к действию фтора in vitro и, вероятно, in vivo обеспечивается, в том числе, и наличием мощной антиоксидантной системы, отражением работы которой является низкий уровень продуктов ПОЛ в клетках устойчивой каллусной культуры. В пользу такого предположения, в принципе, свидетельствуют и результаты определения активности ПОЛ в каллусных штаммах «флюоритовой» (8 штаммов) и контрольной (7 штаммов) популяций лиственницы Гмелина (табл. 6).

Таблица 6.

Содержание продуктов перекисного окисления липидов в клетках каллусных штаммов Ьапх gmelinii, полученных от деревьев «флюоритовой» и контрольной популяций_

Популяция

Исследуемый продукт ПОЛ

Содержание продуктов ПОЛ, рМ/г сырой массы

Содержание продуктов ПОЛ, % от контроля

Контрольная

«Флюоритовая»

Диеновые конъюгаты

2,3 ±0,12

100

1,5 ±0,05

Контрольная

«Флюоритовая»

ТБК-активные продукты

10,7 ±0,48

100

9.7 ±0,26

Обнаружено, что уровень диеновых конъюгатов в клеточной биомассе каллусных культур, полученных от деревьев флюоритовой популяции на 33% ниже, чем в контрольной популяции. Содержание ТБК-активных продуктов было также снижено на 9% для клеток каллусов «флюоритовой» популяции. Аналогичное пониженное содержание

продуктов ПОЛ в результате активной работы системы антиоксидантной защиты характерно для растений, устойчивых к различным токсическим, температурным и другим неблагоприятным факторам (Жиров, Мерзляк, Кузнецов, 1988; Бабушкина и др., 1993; Gossett, Millhollon, Lucas, 1994; Харукидр., 1996).

Таким образом, на основании определения уровня ПОЛ в калдусных штаммах лиственницы Гмелина с различной устойчивостью к действию фтора in vitro и изучения активности ПОЛ в культуре, полученной от деревьев «флюоритовой» и контрольной популяций, можно заключить, что устойчивость к фтору в системе in vitro отрицательно коррелирует с уровнем перекисного окисления липидов.

ВЫВОДЫ

1. Экспланты, полученные из ауксибластов Larix sibirica и Larix gmelinii, по характеристикам каллусогенеза не уступают растительному материалу ювенильного происхождения (зародыши, проростки семян) и являются наиболее подходящими для получения и стабильного поддержания долгоживущей каллусной культуры взрослых деревьев двух видов лиственниц.

2. Длительное (до 60 мес.) культивирование каллусных штаммов лиственницы сибирской и лиственницы Гмелина возможно на среде, содержащей 0,5 нормы минеральных солей по Мурасиге и Скугу, 20 г/л сахарозы, 1 мг/л тиамина, 80 мг/л инозита, 1 мг/л 1-нафтилуксусной кислоты, 0,2 мг/л 6-бензиладенина, 7 г/л агара.

3. Выявление межиндивидуальных различий у деревьев двух видов лиственниц in vitro можно проводить с использованием следующих параметров каллусогенеза: (1) частота и (2) сроки образования каллуса на эксплантах, (3) ростовая активность каллуса в процессе культивирования, (4) время появления некротических участков и (5) длительность культивирования штаммов до момента необратимой остановки роста каллуса.

4. Фторид натрия, вносимый в среду культивирования, угнетает рост каллусных штаммов двух видов лиственниц в концентрациях от 0,25 до 2,5 тМ. При концентрациях выше 2,5 тМ он вызывает остановку роста каллусов и гибель растительных клеток.

5. Использование фторида натрия в среде культивирования в концентрациях от 0,25 до 0,75 тМ позволяет эффективно проводить внутривидовую дифференциацию каллусных штаммов, полученных от различных генотипов Larix sibirica и Larix gmelinii.

7. Клетки каллусных штаммов Larix gmelinii с повышенной устойчивостью к действию фтора in vitro характеризуются достоверным снижением уровня перекисного окисления мембранных липидов, что предполагает наличие в них более мощной системы антиоксидантной защиты, препятствующей развитию окислительного стресса и вызываемых им нарушений клеточного метаболизма.

Публикации по материалам диссертации

1. Константинов Ю.М., Шмаков В.Н. Получение каллусных культур Larix sibirica и Pinus sibirica как модельных систем для переноса генов хвойных // Международная конференция "Состояние и перспективы развития биотехнологии растений", Алматы, 20-22 октября, 1997, Тезисы докл. - Алматы: Изд-во КазГУ, 1997. - С. 101.

2. Шмаков В.Н., Константинов Ю.М., Васильева О.А. Клеточные технологии как основа изучения генетического разнообразия хвойных Прибайкалья // Конференция "Проблемы экологии", Иркутск, 28-30 октября, 1997, Материалы. - Новосибирск: Наука, 1998. - С. 193-195.

3. Константинов Ю.М., Шмаков В.Н. Исследование морфогенных и неморфогенных каллусных культур у представителей хвойных Прибайкалья // Конференция "Проблемы экологии", Иркутск, 28-30 октября, 1997,Материалы.-Новосибирск: Наука, 1998. - С. 196-197.

4. Konstantinov Yu.M., Shmakov V.N., Vasilieva O.A. et al. Cell Biology and molecular biology studies of genetic variability in Larix sibirica of Pribaikalie // IUFRO Interdivisional Symposium «Larix-98: World Resources of Breeding, Resistance and Utilization», Krasnoyarsk, September 1-5, 1998, Abstr. - Красноярск: РИЦ КрасГУ. - P. 52-53.

5. Konstantinov Yu.M., Shmakov V.N., Verkhoturov V.V. Ecological-genetic studies of conifers of Baikal Siberia based on cell culture methods // International Conference «Biodiversity and Dynamics of Ecosystems in North Eurasia», Novosibirsk, August 21-26, 2000, Proc, V. 4, Forest and Soil ecosystems ofNorth Eurasia - Новосибирск: ИЦИГ, 2000. - P. 156-158.

6. Konstantinov Yu., Shmakov V., Mikhailova Т., Verkhoturov V. Application of cell culture method in selection of fluoride-resistant genotypes in different species of Larix genus // VI International Conference on Acidic Deposition «Acid rain 2000», Tsukuba, Japan, December 10-16, 2000, Abstr. -Tsukuba: ICS Inc., 2000. - P. 252.

7. Konstantinov Yu.M., Matyashenko G.V., Shmakov V.N. et al. Modeling of the mechanism of tolerance to oxidative stress of Larix sibirica Ledeb., L. gmelinii (Rupr.) Rupr. as the basic structural unit of East Siberian forests ecosystems // First Workshop on Information Technologies Application to Problems of Biodiversity and Dynamics of Ecosystems in North Eurasia (WITA-2001), Novosibirsk, July 9-14, 2001, Abstr. - http://www-sbras.nsc.ru/ws/show abstract.dhtml?en+27+2109.

8. Konstantinov Yu.M., Bashalkhanov S.I., Shmakov V.N., Verbitski D.S. Inter- and intraspecies differentiation of the Siberian Larix species based on molecular and cell biology approaches // XI International Conference IBFRA Workshop GOFC «Boreal forests and environment: local, regional and global scales», Krasnoyarsk, August 5-9, 2002, Abstr. - Красноярск: УОП ИЛ СО PAH, 2002. - P. 43.

9. Гарник Е.Ю. Константинов Ю.М., Шмаков В.Н. Различная реакция каллусных линий лиственницы на окислительный стресс, индуцированный паракватом // Биополимеры и клетка. - 2003. - Т. 19, № 3. - С. 247-251.

Ю.Шмаков В.Н., Рудиковская Е.Г., Константинов Ю.М. Снижение уровня перекисного окисления липидов в клетках каллусных линий лиственницы {Larix gmelinii Rupr.) с повышенной устойчивостью к действию фтора in vitro II Общество физиологов растений, V съезд, Международная конференция «Физиология растений - основа фитобиотехнологии», Пенза, 15-21 сентября, 2003, Тезисы докл. - Пенза, 2003.-С. 361-362.

П.Шмаков В.Н., Константинов Ю.М. Культура клеток in vitro в исследованиях генетического полиморфизма лиственницы в отношении устойчивости к фтору // Всероссийская научно-практическая конференция" «Развитие физико-химической биологии и биотехнологии на современном этапе», Иркутск, 23-25 октября, 2003, Материалы. - Иркутск, 2004. - в печати.•

Заказ № 98. тираж 100 экз. Лицензия ПЛД № 40-61 от 31.05.98 Ризограф ИСЭМ СО РАН 664033, Иркутск, Лермонтова, 130

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шмаков, Владимир Николаевич

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.и

1. Действие промышленных загрязнителей на физиологобиохимические процессы у высших растений.

1.1. Действие газообразных промышленных загрязнителей на растения. Фтор как загрязнитель и токсикант.

1.2. Влияние промышленных загрязнителей на метаболические процессы у растений.

1.3. Изучение действия промышленных загрязнителей на физиолого-биохимические процессы у растений с использованием культуры in vitro.

2. Различия растительных организмов по их устойчивости к действию промышленных эмиссий.

3. Культура клеток, органов и тканей растений.

3.1. Культура клеток высших растений.

3.2. Культура клеток, органов и тканей хвойных.

3.3. Исследования культуры in vitro у представителей рода Larix.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение меж- и внутривидовых различий по устойчивости к действию фтора у сибирских видов лиственниц методом культуры in vitro"

Актуальность проблемы. Антропогенная деятельность сопровождается образованием огромного количества твердых, жидких, газообразных отходов, включающих токсические соединения, среди которых к числу наиболее агрессивных загрязнителей относятся производные фтора. В результате этого происходит деградация веками складывающихся биогеоценозов и появляется реальная угроза серьезных нарушений в биосфере. Загрязнение атмосферы имеет особенно губительное действие на лесные экосистемы. При этом наиболее подвержены воздействию токсикантов хвойные леса, и, в первую очередь, представители семейства Pinaceae (Рожков и Михайлова, 1989; Бельчинская, 2000; Осколков и Воронин, 2003). Наблюдаются усыхание и гибель хвойных, наиболее выраженные в промышленно развитых регионах. Столь критическая ситуация объясняет значительный интерес, проявляемый к изучению влияния промышленных выбросов на представителей видов хвойных и образуемые ими биоценозы, исследования механизмов устойчивости к токсикантам, поиску и созданию форм, толерантных к загрязнителям. К настоящему моменту накопился большой объем информации в области экологических и физиолого-биохимических исследований действия промышленных выбросов, а также механизмов устойчивости к загрязнителям, начиная с уровня растительных сообществ, и заканчивая уровнем целого организма или отдельных его частей и органов. Значительная часть этих исследований посвящена изучению действия фторсодержащих соединений (Тарчевский, 1964; Негруцкая, 1970; Соков и Рожков, 1975; Bücher-Wallin, 1976; Keller, 1976; Braun, 1977; Соков, 1979; Рожков и Михайлова, 1989; Бабушкина и др., 1993; Воробейчик и Хантемирова, 1994; Третьякова и Бажина, 1994; Ярмишко и др., 1995; Харук и др., 1996; Pukacki, 1998; Михайлова и др., 1998; Mikhailova, 2000; Михайлова и Бережная, 2002;

Осколков и Воронин, 2003). Только использование комплексного подхода с привлечением различных методов исследования на всех уровнях организации биологической системы позволяет получить исчерпывающую информацию о состоянии лесных экосистем и выработать способы разрешения сложившейся негативной ситуации (Mikhailova, 2000). В этой связи большие перспективы открываются при использовании, в дополнение к традиционно применяемым приемам, методов культуры клеток, органов и тканей in vitro. Такой подход позволяет достаточно детально изучить действие какого-либо конкретного фактора или агента, в частности токсиканта, на растительную клетку и ее реакции на это воздействие, в строго контролируемых условиях, максимально устраняя влияние других сопутствующих факторов. Кроме того, используя эти методы, можно четко разделить устойчивость и адаптацию растений на уровне организма и клеточный уровень устойчивости; на основе клеточной селекции отобрать устойчивые к токсиканту клоны или линии, а далее и целые растения. Применение генно-инженерных подходов позволяет получить растения с повышенной устойчивостью к негативному фактору. Методы культуры клеток, тканей и органов успешно используются для изучения влияния тяжелых металлов (Гуральчук, 1994), гербицидов (Diaz-Cacho et al., 1999; Encina, 2001), солевого стресса и стресса обезвоживания (Костюк и др., 1994) на растительные клетки и получения или отбора организмов устойчивых к засолению, затоплению, засухе, тяжелым металлам и экстремальным температурам (Tyagi et al., 1981; Sumaryati et al., 1992; Харинарайн и др., 1996; Winicov, 1996; Samantaray et al., 1999; Rout et al., 1999; Сергеева, 20006, 2000в). Подавляющее большинство исследований в данной области проводилось на культуре in vitro травянистых растений, и ни в одном случае не использовался растительный материал хвойных. Кроме того, до настоящего момента не изучалась реакция культивируемых растительных клеток на действие таких высоко агрессивных и повсеместно распространенных промышленных загрязнителей, какими являются производные фтора. С учетом недостаточной изученности действия фторсодержащих соединений на физиолого-биохимические процессы у представителей хвойных пород значительную актуальность представляет использование для этих целей современных методов клеточной биологии и биохимии растений.

Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в оценке возможности меж- и внутривидовой дифференциации лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.) и лиственницы Гмелина {Larix gmelinii (Rupr.) Rupr.) по их устойчивости к фтору на основе каллусной культуры in vitro.

Для этого необходимо было решить следующие задачи:

1. Подобрать исходный растительный материал и оптимальные условия культивирования для получения и стабильного поддержания долгоживущей каллусной культуры лиственницы сибирской и лиственницы Гмелина. Исследовать характеристики каллусогенеза у лиственниц.

2. Изучить возможность использования характеристик каллусогенеза для оценки генотипического разнообразия у двух видов лиственниц.

3. Оценить действие различных концентраций фторида натрия на рост каллусной культуры лиственницы сибирской и лиственницы Гмелина in vitro.

4. Исследовать возможность использования характеристик каллусогенеза для оценки устойчивости каллусной культуры лиственниц к фтору в условиях in vitro.

5. Изучить возможность дифференциации видов и экотипов лиственницы сибирской и лиственницы Гмелина по устойчивости к фтору с использованием каллусной культуры in vitro.

Научная новизна. В результате проведенных исследований разработана модельная система, позволяющая оценить реакцию растительных клеток лиственниц на действие фтора в условиях in vitro. Впервые показано, что долгоживущая каллусная культура позволяет эффективно дифференцировать генотипы сибирских видов лиственниц по признаку фторустойчивости in vitro. Изучение реакции каллусных штаммов на присутствие различных концентраций фтора в среде культивирования по изменению ростовой активности культур позволило провести их классификацию по степени устойчивости к галогену.

Научная и практическая ценность работы. На основе долгоживущей каллусной культуры лиственниц разработана система клеточной селекции генотипов у разных видов хвойных на устойчивость к фтору в условиях in vitro. Такие характеристики каллусогенеза, как ростовая активность культуры, сроки появления первых участков некротизации и степень некротизации каллуса на фторсодержащих средах в учетные даты эксперимента зависят от генотипа исходного растения. Отбор наиболее устойчивых к действию фтора в условиях in vitro каллусных штаммов позволяет получить растительный материал для изучения конкретных механизмов фторустойчивости на уровне клетки. Применение методов микроклонального размножения, генной и клеточной инженерии в сумме с данными по изучению механизмов фторустойчивости позволит в будущем получить растительные формы с повышенной устойчивостью к токсиканту для целей их использования в программах лесовосстановления и создания санитарно-защитных насаждений вокруг промышленных предприятий.

Защищаемые положения.

I. Долгоживущая каллусная культура, поддерживаемая на содержащих фторид натрия средах, позволяет эффективно дифференцировать генотипы сибирских видов лиственниц по устойчивости к действию фтора in vitro.

2. Исследуемые каллусные штаммы L. sibirica и L. gmelinii по их устойчивости к действию фтора in vitro подразделяются на 5 классов: высокоустойчивые, устойчивые, среднеустойчивые, слабоустойчивые, неустойчивые.

3. Каллусные штаммы лиственниц с повышенной устойчивостью к действию фтора in vitro характеризуются более низким уровнем перекисного окисления липидов.

Апробация работы. Основные материалы диссертации были представлены и докладывались на следующих региональных, всероссийских и международных конференциях: Международная конференция "Состояние и перспективы развития биотехнологии растений" (Алматы, 1997), Научно-практическая конференция "Проблемы экологии". Чтения памяти профессора М.М. Кожова" (Иркутск, 1997), Межотраслевой симпозиум IUFRO «Larix-98: World Resources of Breeding, Resistance and Utilization» (Красноярск, 1998), I международная конференция «Biodiversity and Dynamics of Ecosystems in North Eurasia» (BDENE-2000) (Новосибирск, 2000), 6 международная конференция «Acid rain 2000» (Tsukuba, Japan, 2000), I международное рабочее совещание "Биоразнообразие и динамика экосистем Северной Евразии: информационные технологии и моделирование" (WITA-2001) (Новосибирск, 2001), XI международная конференция IBFRA «Boreal forests and environment: local, regional and global scales» (Красноярск, 2002), V съезд Общества физиологов растений «Физиология растений — основа фитобиотехнологии» (Пенза, 2003), Всероссийская научно-практическая конференция «Развитие физико-химической биологии и биотехнологии на современном этапе» (Иркутск, 2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Шмаков, Владимир Николаевич

выводы

4. Фторид натрия, вносимый в среду культивирования, угнетает рост каллусных штаммов двух видов лиственниц в концентрациях от 0,25 до 2,5 шМ. При концентрациях выше 2,5 шМ он вызывает остановку роста каллусов и гибель растительных клеток.

5. Использование фторида натрия в среде культивирования в концентрациях от 0,25 до 0,75 шМ позволяет эффективно проводить внутривидовую дифференциацию каллусных штаммов, полученных от различных генотипов Larix sibirica и Larix gmelinii.

6. Каллусные штаммы лиственницы Гмелина проявляют более высокую вариабельность по устойчивости к действию фтора in vitro, чем штаммы лиственницы сибирской. При этом все каллусы лиственницы сибирской относятся к культурам с относительно низкой устойчивостью к фтору в условиях in vitro. Клетки каллусных штаммов Larix gmelinii с повышенной устойчивостью к действию фтора in vitro характеризуются достоверным снижением уровня перекисного окисления мембранных липидов, что предполагает наличие в них более мощной системы антиоксидантной защиты, препятствующей развитию окислительного стресса и вызываемых им нарушений клеточного метаболизма.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Как показали результаты работы по подбору оптимальных типов эксплантов для получения каллусной культуры лиственницы сибирской и лиственницы Гмелина (Шмаков, Константинов, Васильева, 1998), значимых различий в частоте инициации каллусогенеза на эксплантах, взятых от ювенильного материала и тканей взрослых деревьев, выявлено не было. В то же время установлено, что варьирование по характеристикам каллусогенеза в большей степени выражено внутри каждого типа эксплантов и связано либо с генотипом растения - донора, либо с естественным расположением экспланта в структуре органа или образования, из которого он выделен. На основании проведенных исследований в качестве эксплантов для получения каллусной культуры лиственниц, наиболее отвечающих требованиям дальнейшей работы, были отобраны поперечные диски средней части ауксибластов.

На основании результатов экспериментальной работы по оптимизации питательной среды для поддержания каллусных культур Ьапх БШпса и Ь. gmelinii (Константинов, Шмаков, 1998; Коп81аШтоу е1 а1., 1998) был подобран следующий состав питательной среды: 0,5 нормы минеральных солей по Мурасиге и Скугу, 20 г/л сахарозы, 1 мг/л тиамина, 80 мг/л инозита, 1 мг/л НУК, 0,2 мг/л БАЛ, 7 г/л агара.

Нами установлена возможность использования каллусообразующей способности у Ьапх ягЫпса и Ь. %теИпи в качестве характеристики генотипа (Ко1Шап1:тоу, 8Ьшакоу, УегкИоШгоу, 2000). Анализ полученных результатов позволяет сделать вывод, что такие характеристики каллусогенеза, как частота и сроки образования каллуса на эксплантах, ростовая активность каллуса в процессе культивирования, время появления некротических участков в культуре и длительность культивирования штаммов до момента необратимой остановки роста каллуса и гибели основной массы клеток могут служить достаточно информативными параметрами для дифференциации генотипов хвойных.

На основании результатов экспериментальной работы по подбору исходного растительного материала, оптимизации условий получения каллусных культур и их длительного поддержания в условиях in vitro, оценки возможности использования различных характеристик каллусогенеза для дифференциации отдельных генотипов - доноров каллусных штаммов лиственницы сибирской и лиственницы Гмелина разработана система для изучения устойчивости хвойных к фтору в условиях in vitro и исследовано варьирование данного признака между штаммами, полученными от разных генотипов. Данный подход основан на выявлении различий в реакции каллусных штаммов двух видов лиственниц на действие нескольких концентраций фторида натрия, вносимого в среду культивирования.

В отношении фторида натрия было установлено, что его негативное действие на рост каллусных культур Larix sibirica и L. gmelinii проявляется уже в присутствии NaF в концентрации 0,25 шМ. С увеличением содержания фторида натрия в питательной среде его отрицательный эффект на состояние каллусов возрастает. В присутствии NaF в концентрации 0,75 шМ ростовая активность подавляющего большинства используемых штаммов снижалась более чем на 60%, а на среде, содержащей 7,5 шМ фторида натрия, рост всех каллусных культур прекращался полностью, ткань некротизировала и погибала в течение двух недель от начала инкубации.

Показано, что использование NaF в концентрациях от 0,25 до 0,75 шМ позволяет достаточно четко дифференцировать культуры, полученные от различных генотипов двух видов лиственниц, по их ростовой активности (Konstantinov, Shmakov, Mikhailova, Verkhoturov, 2000; Konstantinov et al., 2001; Konstantinov et al., 2002; Шмаков, Рудиковская, Константинов, 2003). Использование более высоких концентраций фторида натрия (выше 0,75 mM) приводит к исчезновению различий в действии фтора на ростовую активность отдельных штаммов обоих видов.

На основании результатов кластеризации и данных, полученных с использованием t-критерия Стьюдента, все штаммы были разделены на 5 хорошо дифференцируемых классов по реакции культур на присутствие в среде культивирования фторида натрия. Установлено, что ростовая активность каллусных штаммов L. sibirica и L. gmelinii, культивируемых на фторсодержащих средах, существенно различается. Все исследованные штаммы L. sibirica были отнесены к трем классам, отличающимся относительно низкой устойчивостью к фтору in vitro (среднеустойчивые, слабоустойчивые, неустойчивые). В то же время, каллусные культуры L. gmelinii проявляли весь спектр характеристик в соответствии с предложенной нами классификацией и, таким образом, демонстрировали более высокую по сравнению с L. sibirica вариабельность ростовой активности в присутствии используемых концентраций фторида натрия.

Исследование активности перекисного окисления липидов в каллусных культурах с различной реакцией на действие фторида натрия в среде культивирования показало, что проявление устойчивости к фтору в клетках лиственницы in vitro отрицательно коррелирует с уровнем ПОЛ. Предполагается, что повышенная устойчивость каллусных клеток лиственницы к действию фтора in vitro и, вероятно, in vivo обеспечивается, в том числе, и наличием мощной антиоксидантной системы, отражением работы которой является низкий уровень продуктов ПОЛ в клетках устойчивой каллусной культуры (Шмаков, Рудиковская, Константинов, 2003; Шмаков, Константинов, 2004).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шмаков, Владимир Николаевич, Иркутск

1. Абрамашвилли Г.Г. Влияние загрязнений атмосферного воздуха на хвойные насаждения // Гигиена и санитария. 1957. - № 4. - С. 67-69.

2. Айала Ф., Кайгер Дж., Современная генетика, 3 т., Т. 3 М.: Мир, 1988.-335 с.

3. Антипов В.Г. Устойчивость видов сосны к промышленным газам // Ботаника: Исследования, № 17. Минск: Наука и техника, 1975. - С. 215-221.

4. Антипов В.Г. Устойчивость видов ели к промышленным газам // Ботаника: Исследования, № 18. Минск: Наука и техника, 1976. - С. 204-208.

5. Антипов В.Г. Устойчивость видов лжетсуги, тсуги и лиственницы к промышленным газам // Ботаника: Исследования, № 20. Минск: Наука и техника, 1978. - С. 224-228.

6. Антипов В.Г., Болотов H.A. Отношение видов пихты к загрязнению воздуха промышленными газами // Защитное лесоразведение и лесные культуры, Вып. 4. Воронеж: Изд-во Воронежского университета, 1977. -С. 15-21.

7. Бабаева Ж.А., Бутенко Р.Г., Строгонов Б.П. Влияние засоления питательной среды на рост изолированных тканей моркови // Физиология растений. 1968. - Т. 15, № 1. - С. 93-102.

8. Бабушкина Л.Г., Зуева Г.В., Луганский H.A. и др. Экологическое состояние лесных насаждений в зоне фторсодержащих промышленных выбросов // Экология. 1993. - № 1. - С. 26-35.

9. Белозерова Л.С. Влияние фтористого натрия на фотосинтез, дыхание и превращение органических кислот у суккулентов на свету // Вести Ленинградского университета, Серия биологическая. 1964. - Вып. 4, № 21. -С. 116- 121.

10. Ю.Бельчинская Л.И. Биоиндикация промышленных токсикантов древесными растениями. Воронеж: Из-во Воронежской государственной лесотехнической академии, 2000. - 93 с.

11. Бессонова В.П. Состояние пыльцы как показатель загрязнения среды тяжелыми металлами // Экология. 1992. - № 4. - С. 45-50.

12. Биотехнология растений: культура клеток / Ред. Бутенко Р.Г. М.: Агропромиздат, 1989. - 280 с.

13. Бретшнайдер Б., Курфюрст И. Охрана воздушного бассейна от загрязнений / Пер. с англ. Ред. Туболкина А.Ф. Л.: Химия, 1989. - 288 с.

14. Булгаков В.П., Журавлев Ю.Н. Культуры трансформированных клеток растений как новый источник получения продуктов вторичного метаболизма // Успехи современной биологии. 1992. - Т. 112, Вып. 3. - С. 342-350.

15. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М.: Наука, 1964. - 272 с.

16. Быченкова Э.А. Исследование каллусообразования у некоторых древесных и кустарниковых пород методом культуры ткани in vitro II Доклады АН СССР. 1963. - Т. 151, № 3. - С. 732-736.

17. Власюк П. А. Биохимические элементы в жизнедеятельности растений. Киев: Наукова Думка, 1969. - 409 с.

18. Власюк П.А., Мицко В.Н. Влияние фторидов на активность некоторых ферментов гороха // Микроэлементы в сельском хозяйстве и медицине, Вып. 3. Киев: Наукова Думка, 1967. - С. 46-49.

19. Воробейчик Е.Л., Хантемирова Е.В. Реакция лесных фитоценозов на техногенное загрязнение: зависимость доза эффект // Экология. - 1994. -№3.-С. 31-43.

20. Гамбург К.З., Рекославская Н.И., Швецов С.Г. Ауксины в культурах тканей и клеток растений. Новосибирск: Наука, 1990. - 243 с.

21. Гарник Е.Ю., Константинов Ю.М., Шмаков В.Н. Различная реакция каллусных линий лиственницы на окислительный стресс, индуцируемый паракватом // Биополимеры и клетка. 2003. - Т. 19, № 3. - С. 247-251.

22. Гетко Н.В., Кулагин Ю.З., Яфаев Э.М. О газопоглотительной способности хвойных // Экология хвойных. Уфа: Изд-во БФАН СССР, 1978. -С. 112-120.

23. Глотов Н.В., Животовский Л.А., Хованов Н.В., Хромов-Борисов H.H. Биометрия. Л.: Изд-во Ленинградского университета, 1982. - 264 с.

24. Грешта Я. Влияние промышленной загрязненности воздуха на сосновые и еловые древостой // Растительность и промышленные загрязнения. Свердловск: Изд-во УФАН СССР, 1970. - С. 20-25.

25. Гришко В.Н., Сыщиков Д.В. Перекисное окисление липидов и функционирование некоторых антиоксидантных ферментных систем у кукурузы и овса при остром поражении фтористым водородом // Украинский ботанический журнал. 1999а. - Т. 71, №3. - С. 51-57.

26. Гришко В.Н., Сыщиков Д.В. Влияние фтористого водорода на активность ферментного цикла глутатиона в листьях некоторых древесных растений // Доп. Нац. АН Украши. 2000. - № 12. - С. 178-184.

27. Гуральчук Ж.З. Механизмы устойчивости растений к тяжелым металлам И Физиология и биохимия культурных растений. 1994. - Т. 26, № 2.-С. 107-117.

28. Дерябин А.Н., Орешников A.B., Юрьева Н.О., Бутенко Р.Г. Рост столонов и индукция микроклубней картофеля in vitro при разных типах культивирования // Доклады РАН. 1997. - Т. 355, № 6. - С. 841-843.

29. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты, 3 т. М.: Мир, 1982. - 1120 с.

30. Добровольский В.В. География микроэлементов. М.: Мысль, 1983. -272 с.

31. Железнов A.B. О селекции растений на устойчивость к «загрязнителям» окружающей среды // Вестник ВОГиС. 1999. - № 8. -С. 7-9.

32. Жиров В.К., Мерзляк М.Н., Кузнецов JI.B. Перекисное окисление мембранных липидов холодоустойчивых растений при повреждении отрицательными температурами // Физиология растений. 1988. - Т. 29, № 6. -С. 1045-1053.

33. Жук Е.Е., Харин Ю.С. Устойчивость в кластер-анализе многомерных наблюдений. Минск: Изд-во Белгосуниверситета, 1998. - 240 с.

34. Илькун Г.М. Газоустойчивость растений. Киев: Наукова Думка, 1971а.-С.1-135.

35. Илькун Г.М. Влияние токсических газов на растения // Физиология и биохимия культурных растений. Т. 3, № 1. - 19716. - С. 87-92.

36. Илькун Г.М., Буколова Т.П. Изменение структуры хвои под действием фтора и хлора // Украинский ботанический журнал. 1974. - Т. 31, № 5. - С. 624-629.

37. Илькун Г.М., Миронова A.C., Михайленко JI.A. Повреждение тканей листьев токсическими газами // Украинский ботанический журнал. 1969. -Т. 26, № 1.-С. 72 -77.

38. Костюк А.Н., Остаплюк А.Н., Левенко Б.А. Ответная реакция растений на солевой стресс // Физиология и биохимия культурных растений. 1994. - Т. 26, № 6. - С. 525-545.

39. Красинский Н.П. Значение изучения дымо- и газоустойчивости растений для озеленения промышленных площадок и населенных пунктов // Дымоустойчивость растений и дымоустойчивые ассортименты. Москва-Горький, 1950.-С. 14-20.

40. Кривохарченко A.C., Черняк Н.Д., Носов A.M. Криосохранение суспензионных культур клеток растений с использованием метода замораживания эмбрионов млекопитающих // Физиология растений. 1999. -Т. 46, № 6. - С. 945-949.

41. Кудзин Ю.К., Пашова В.Т. О содержании фтора в почвах и растениях при длительном применении удобрений // Почвоведение. 1970. - № 2. - С. 74-79.

42. Кунах В.А. Геномная изменчивость соматических клеток растений. 3. Каллусообразование in vitro II Биополимеры и клетка. 1997. - Т. 13, № 5. - С. 362-371.

43. Кучеренко JI.A., Маддумаге Р.П., Гужев Ю.Л. К методике определения массы каллусных тканей в процессе культивирования // Сельскохозяйственная биология. 1991. - № 3. - С. 68-75.

44. Кучеренко JI.А. Морфологическая разнокачественность каллусных тканей риса и ее связь с регенерационной способностью // Физиология растений. 1993. - Т. 40, № 5. - С. 797-801.

45. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высш. школа, 1980. - 293 с.

46. Лутова Л.А., Забелина Е.К. Каллусо- и побегообразование у различных форм гороха Pisum sativum L. в условиях in vitro II Генетика. -1988. Т. 24, № 9. - С. 1632-1640.

47. Михайленко В.Г. Неоднозначность резистентности организмов // Успехи современной биологии. 2002. - Т. 122, № 4. - С. 334-341.

48. Михайлова Т.А., Бережная Н.С. Динамика состояния сосновых лесов при изменениях эмиссионной нагрузки // Сибирский экологический журнал. -2002.-Т. 9,№ 1.-С. 113-120.

49. Мишарина Е.А., Оводова Р.Г., Бушнева O.A., Оводов Ю.С. Каллусообразование Silene vulgaris (Moench) Garcke in vitro. II Растительные ресурсы. 1999. - № 2. - С. 88-95.

50. Мокроносов А.Т., Купцова Е.С., Попов A.C., Кузнецов В.В. Генетическая коллекция как способ сохранения биоресурсов планеты // Вест. РАН. 1994. - № 11. - С. 991-1001.

51. Момот Т.С. Способность к органогенезу листовой ткани лиственницы даурской (Larix dahurica Turcz.) в культуре in vitro II Лесной журнал. 1976. - № 5. - С. 27-29.

52. Момот Т.С. Культура in vitro изолированных корней лиственницы сибирской и даурской (Larix sibirica Maxim., L. dahurica Turcz.) // Лесной журнал. 1977. - № 2. - С. 35-37.

53. Мурашко Л.Н., Фадеева Т.С. Изучение характера регенерации у различных форм гороха // Вестник ЛГУ. 1973. - № 15. - С. 132.

54. Негруцкая Г.М. Физико-биохимические процессы у сосны при воздействии вредных газов // Автореф. дисс. канд. биол. наук. Киев, 1970. -23 с.

55. Никифорова В.Я. К механизму мутагенного действия фтора // Цитология и генетика. 1982. - Т. 16, № 6. - С. 40-41.

56. Николаевский В.С. Современное состояние проблемы газоустойчивости растений // Газоустойчивость растений, Вып. 1. Пермь, 1969.-С. 5-33.

57. Николаевский В.С. Лес и промышленные выбросы // Лесное хозяйство. 1987. - № 10. - С. 62-65.

58. Ниязбекова Б.С., Мальцева И.М., Потатуева Ю.А. и др. Экологические аспекты производства и применения фосфорных удобрений. -М.: НИИТЭХИМ, 1990. Вып. 4. - 80 с.

59. Осколков В.А., Воронин В.И. Репродуктивный процесс сосны обыкновенной в Верхнем Приангарье при техногенном загрязнении. -Иркутск: Изд-во Иркутского Госуниверситета, 2003. 137 с.

60. Орлов П.А. Взаимодействие ядерных и цитоплазматических генов в детерминации развития растений. Минск: ЮНИПАК, 2001. - 170 с.

61. Павлов И.Н. Изучение сорбции фтора в листьях древесных растений // Химия растительного сырья. 1998. - № 2. - С. 37-43.

62. Пашова В.Т. Фтор в почвах и растениях // Агрохимия. 1980. - № 10. -С. 165-171.

63. Пешкова Г.А. Растительность Сибири: Предбайкалье и Забайкалье. -Новосибирск: Наука, 1985. 144 с.

64. Поздняков Л.К. Даурская лиственница. М.: Наука, 1975. - 312 с.

65. Помазкина Л.В., Котова Л.Г., Раднаев А.Б.-Д., Соколова H.A. Влияние уровней загрязнения почв фторидами на циклы азота в агроэкосистемах Прибайкалья // Агрохимия. 2000. - № 12. - С. 62-70.

66. Растения в экстремальных условиях минерального питания // Ред. Школьник М.Я., Алексеева-Попова Н.В. Л.: Наука, 1983. - 176 с.

67. Рожков A.C., Михайлова Т.А. Действие фторсодержащих эмиссий на хвойные деревья. Новосибирск: Наука. Сиб. отд-ние, 1989. - 159 с.

68. Садилова М.С. Промышленные выбросы криолитового завода и их влияние на внешнюю среду // Охрана природы на Урале, Вып. 4. -Свердловск: Изд-во УФАН СССР, 1964. С. 43-48.

69. Серазетдинова Л.Д., Полимбетова Н.С., Лесова Ж.Т. и др. Действие хлорида натрия и полиэтиленгликоля в различных концентрациях на рост суспензионной культуры клеток пшеницы // Физиология и биохимия культурных растений. 2000. - Т. 32, № 4. - С. 302-308.

70. Сергеева Л.Е. Определение токсичности парафинов в системе in vitro II Физиология и биохимия культурных растений. 2000а. - Т. 32, № 4. -С. 325-328.

71. Сергеева Л.Е. Отбор и изучение клеточных линий табака, устойчивых к ванадию // Физиология и биохимия культурных растений 20006. - Т. 32, №5.-С. 369-371.

72. Сергеева Л.Е. Изучение комплексной устойчивости ванадий-вольфрамустойчивых клеточных линий табака // Физиология и биохимия культурных растений. 2000в. - Т. 32, № 6. - С. 490-493.

73. Скрипаченко В.В. Выращивание in vitro тканей проростков трех видов сосны // Физиология растений. 1982. - Т. 29, № 1. - С. 205-211.

74. Смитт М.В., Моисеева H.A. Капсулирование соматических эмбрионов и регенерация растений // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений / Ред. Бутенко Р.Г. М.: Наука, 1991. - С. 186-189.

75. Современные методы в биохимии / Ред. Орехович В.Н. М.: Медицина, 1977. - 392 с.

76. Сокал P.P. Кластер-анализ и классификация: предпосылки и .основные направления // Классификация и кластер / Ред. Дж. Вэн Райзин.-М.: Мир, 1980.-С. 7-19.

77. Соков М.К., Габиб-заде J1.A. Внутривидовые различия в газоустойчивости сосны // Физиолого-биохимические и экологические аспекты устойчивости растений к неблагоприятным факторам внешней среды. Иркутск: СИФИБР СО АН СССР, 1977,- С. 213-220.

78. Соков М.К. Влияние фтористых выбросов алюминиевых заводов на состояние хвойных лесов // Автореф. дисс. канд. биол. наук. Красноярск: Институт леса и древесины им. В.Н. Сукачева СО АН СССР, 1979. - 24 с.

79. Тарчевский В.В. Влияние дымо-газовых выделений промышленных предприятий Урала на растительность // Растения и промышленная среда. -Свердловск, 1964. С. 5-69.

80. Торгашева Э.Г. Ультраструктуральные изменения хлоропластов мезофилла листа Morus alba (Moraceae) в условиях алюминиевого завода // Ботанический журнал. 1984. - Т. 69, № 7. - С. 921-925.

81. Третьякова И.Н., Бажина Е.В. Жизнеспособность пыльцы пихты сибирской в нарушенных лесных экосистемах гор Южной Сибири // Экология. 1994. - № 6. - С. 20-28.

82. Уоринг Ф., Филлипс И. Рост растений и дифференцировка. М.: Мир, 1984.-512 с.

83. Фарафонтов М.Г. Биоиндикаторные свойства хлорофилла в условиях воздействия загрязнений неопределенного состава // Экология. 1991. - № 5. - С. 76-79.

84. Федоров Е.А., Мартюшов В.З., Смирнов Е.Г. и др. Накопление 90Sr и 137Cs растительностью естественных сенокосов и пастбищ лесостепной зоны // Экология. 1989. - № 5. - С. 79-83.

85. Харинарайн Р.П., Долгих Ю.И., Гужов Ю.Л. Перспективы использования биотехнологических методов в селекции сахарного тростника Saccharum officinarum L. на устойчивость к гипоксии // Изв. РАН. Серия биологическая. 1996. - № 4. - С. 411-421.

86. Харук В.И., Винтербергер К., Цибульский Г.М. и др. Техногенное повреждение притундровых лесов Норильской долины // Экология. 1996. -№ 6. - С. 424-429.

87. ЮО.Хомина А.Б., Журавлев Ю.Н. Культура клеток растений как источник протобербериновых алкалоидов // Растительные ресурсы. 1996. -Т. 32, № 1/2.-С. 134-151.

88. Чуб В.В., Власова Т.А., Бутенко Р.Г. Каллусогенез и морфогенез в культуре генеративных органов весеннецветущих видов Crocus L. // Физиология растений. 1994. - Т. 41, № 6. - С. 815-820.

89. Школьник М.Я. Микроэлементы в жизни растений. Л.: Наука, 1974.-324 с.

90. Шмаков В.Н., Константинов Ю.М., Васильева O.A. Клеточные технологии как основа изучения генетического разнообразия хвойных Прибайкалья // Конференция "Проблемы экологии", Иркутск, 28-30 октября, 1997, Материалы. Новосибирск: Наука, 1998. - С. 193-195.

91. Юб.Ярмишко В.Т., Деева Н.М., Мазная Е.А., Леина Г.Д. Влияние промышленных выбросов на ассимиляционный аппарат Pinus sylvestris L. и Viccinium myrtillus L. на Европейском севере России // Растительные ресурсы. 1995. - Т. 31, Вып. 3. - С. 36-51.

92. Abdul Rahman N.N., Diner A.M., Skilling D.D., Karnosky D.F. In vitro responses of conifer adventitious shoots and calli inoculated with Gremmeniella abietina // For. Science. 1987. - V. 33. - P. 1047-1053.

93. Aderkas P. von, Bonga J.M., Nagmani R. Promotion of embryogenesis in cultured megagametophytes of Larix decidua // Can. J. Forest. Research. 1987. -V. 17.-P. 1293-1296.

94. Aderkas P. von, Bonga J.M. Morphological definition of phenocritical period of initiation of haploid embryogenesis tissue from explants of Larix decidua II Somatic cell genetics of woody plants / Ed. Ahuja M.R. Dordrecht: Kluwer, 1988a. - P. 29-38.

95. Aderkas P. von, Bonga J.M. Formation of haploid embryoids of Larix decidua: early embryogenesis // American J. Botany. 19886. - V. 75. - P.690-700.

96. Aderkas P. von. Embryogenesis from protoplasts of haploid European larch // Can. J. Forest. Research. 1992. - V. 22. - P. 297-402.

97. Aderkas P. von, Bonga J.M. Plants from haploid tissue culture of Larix decidua H Theor. Apl. Genet. 1993. - V. 87. - P. 225-228.

98. M.Applegate H.G., Adams D.F., Carriker R.C. Effect of aqueous fluoride solutions on respiration of intact bush bean seedlings. I. Inhibition and stimulation of oxygen uptake // American J. Botany. 1960. - V. 47. - P. 339-345.

99. Arnold S. von, Woodward S. Organogenesis and embryogenesis in mature zygotic embryos of Picea sitchensis II Tree Physiology. 1988. - V. 4. - P. 291-300.

100. Aronen T.S., Krajnakova J., Haggman H.M., Ryynanen L.A. Genetic fidelity of cryopreserved embryogenic cultures of open-pollinated Abies cephalonica II Plant Science. 1999. - V. 142. - P. 163-172.

101. Arzani A., Mirodjagh S.-Sh. Response of durum wheat cultivars to immature embryo culture, callus induction and in vitro salt stress // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1999. - V. 58. - P. 67-72.

102. Attree S.M., Bekkaoui F., Dunstan D., Fowke L.C. Regeneration of protoplasts from an embryogenic suspension culture of white spruce (Picea glauca) // Plant Cell Reports. 1987. - V. 6. - P. 480-483.

103. Attree S.M., Dunstan D.I., Fowke L.C. Plantlet regeneration from embryogenic protoplasts of white spruce (Picea glauca) // Biotechnology. 1989. -V. 7.-P. 1060-1062.

104. Barcelo J., Poschenrieder Ch. Plant water relations as affected by heavy metal stress: a review // J. Plant Nutrition. 1990. - V. 13. - P. 1-37.

105. Barnes R.L., Naylor A.W. Culture of pine root callus and the use of Pinus clausa callus in preliminary metabolic studies // Bot. Gaz. 1958. - V. 120. -P. 63-66.

106. Baryla A., Laborde C., Montillet J.-L. et al. Evaluation of lipid peroxidation as a toxicity bioassay for plants exposed to copper // Environmental Pollution. 2000. - V. 109.-P. 131-135.

107. Baur P.R., Walkinshaw C.H. Fine structure of tannin accumulation in callus culture of Pinus elliotti (slash pine) // Can. J. Botany. 1974. - V. 52. -P. 615-619.

108. Bekkaoui F., Pilon M., Laine E. et al. Transient gene expression in elektroporated Picea glauca protoplasts // Plant Cell Reports. 1988. - V. 7. -P. 481-484.

109. Berlyn G.P., Beck R.C., Renfroe M.N. Tissue culture and the propagation and genetic improvement of conifers: problems and possibilities // Tree Physiology. 1986. - V. 1. - P. 227-240.

110. Berlyn G.P., Anoruo A.O., Beck R.C., Cheng J.P. DNA content polymorphism and tissue culture regeneration in Caribbean pine // Can. J. Botany. 1987.-V. 65.-P. 954-961.

111. Berlyn G.P., Kohls S.J., Anoruo A.O. Caribbean pine (Pinus caribaea Morelet) // Biotechnology in Agriculture and Forestry, Vol. 16. Trees III / Ed. Bajaj Y.P.S. Berlin, Heidelberg: Springer, 1991. - P. 254-268.

112. Bhojwani S.S., Razdan M.K. Plant tissue culture: Theory and practice, a revised edition. Amsterdam: Elsevier, 1996. - 767 p.

113. Bonga J.M. Shoot formation in callus from the stalks of young female strobili of Larix decidua II Can. J. Botany. 1982. - V. 60. - P. 1357-1359.

114. Bonga J.M. Adventitious shoot formation in cultures of immature female strobili Larix decidua II Phisiol. Plantarum. 1984a. - V. 62. - P. 416-421.

115. Bonga J.M. Adventitious root and shoot formation in tissue cultures of mature Larix decidua II Proc. Int. Symp. Recent Advances in Forest Biotechnology. Traverse City, 19846. - P. 64-68.

116. Bonga J.M., Aderkas P. von. Attempt to micropropagate mature Larix decidua Mill. // Somatic cell genetics of woody plants / Ed. Ahuja M.R. -Dordrecht: Kluwer, 1988. P. 155-168.

117. Bonga J.M., Pond S.E. Adventitious shoot formation in cultures of 30-year-old Larix decidua, L. leptolepis, L. euroleois and L. laricina trees // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1991. - V. 26. - P. 45-51.

118. Bonga J.M. Frozen storage stimulates the formation of embryo-like structures and elongating shoots in explants from mature Larix decidua and Larix x eurolepis trees //Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1996. - V. 46. - P. 91101.

119. Braun G. Über die Ursachen und Kriterien der Immissionsresistenz bei Fichte, Picea abies (L.) Karst. II. Reflektorische Immissionsresistenz II Europ. J. Forest Pathol. 1977. -V.l.- P. 129-152.

120. Brennan E., Rhoads A.F. The response of woody species to air pollutants in an urban environment // J. Arboriculture. 1976. - V. 2. - P. 1-5.

121. Bueno P., Piqueras A. Effect of transition metals on stress, lipid peroxidation and antioxidant enzyme activities in tobacco cell cultures // Plant Growth Regulation. 2002. - V. 36. - P. 161-167.

122. Bücher-Wallin I. Zur Beenflussung des physiologischen Blattalters von Waldbäumen durch Fluor-Immissionen, Mitteilungen Eidgenossiche Anstalt für das Forstliche Versuchswesen, V. 52. Schweiz., 1976. - P. 101-158.

123. Campbell R.A., Durzan D.J. Induction of multiple buds and needles in tissue cultures of Picea glauca II Can. J. Botany. 1975. - V.53.- P. 1652-1657.

124. Chalupa V. Micropropagation of conifer and broadleaved forest trees // Commun Inst. For. Czech. 1983. - V. 13. - P. 7-39.

125. Chalupa V. In vitro propagation of Larix, Picea, Pinus, Quvercus, Fagus and other species using adenine-type cytokinins and thidiazuron // Commun Inst. For. Czech. 1985. - V. 14. - P. 65-90.

126. Chalupa V. Micropropagation of Larix decidua Mill, and Pinus sylvestris L. // Biol. Plantarum. 1989. - V. 31. - P. 40-407.

127. Chalupa V. Larch {Larix decidua Mill.) // Biotechnology in agriculture and forestry, V. 16, Trees III / Ed. Bajaj Y.P.S. Berlin, Heidelberg: Springer, 1991.-P. 446-470.

128. Chang C.W. Effect of fluoride on nucleotides and ribonucleic acid in germinating corn seedling roots // Plant Physiology. 1968. - V. 43. - P. 669 -674.

129. Chang C.W. Effect of fluoride on ribosomes from corn roots. Changes with growth retardation // Physiol. Plantarum. 1970a. - V. 23. - P. 536-543.

130. Chang C.W. Effect of fluoride on ribosomes and ribonuclease from corn roots // Can. J. Biochemistry. 19706. - V. 48. - P. 450-454.

131. Chang C.W., Thompson C.R. Site of fluoride accumulation in navel orange leaves // Plant Physiology. 1966. - V. 41. - P. 211-213.

132. Cho U., Park J. Mercury-induced oxidative stress in tomato seedlings // Plant Science. 2000. - V.156. - P. 1-9.

133. Christiansen H. On the germination of pollen of Larix and Pseudotsuga on artificial substrate, and on viability tests of pollen of coniferous forest trees // Silvae Genet. 1969. - V. 18. - P. 104-107.

134. David A., David H. Influence de diverses conditions de nutrition sur le développement d'extremites de jeunes raciness de Pinus pinaster Sol. en culture in vitro //CR Acad Sei Paris. 1975. - V. 281. - P. 1373-1376.

135. David A., David H., Mateille T. Evaluation of parameters affecting the yield, variability and cell division of Pinus pinaster protoplasts // Physol. Plantarum. 1982. - V. 56. - P. 108-113.

136. Dazzler H.-G., Ranft H., Rahn K.-H. Zur Widerstandsfähigkeit von Gehölzen gegenüber Fluorverbindungen und Schwefeldioxid // Flora. 1972. -Bd. 161.-S. 289-302.

137. De Vos R.H.C., Schat H., Voojis R., Ernst W.H.O. Copper-induced damage to the permeability barrier in roots of Silene cucubalus II J. Plant Physiology. 1989. - V. 135. - P. 164-169.

138. Diaz-Cacho P., Molar R., Encina A. et al. Cell wall modifications in bean (Phaseolus vulgaris ) callus cultures tolerant to isoxaben // Physiol. Plantarum. -1999.-V. 107.-P. 54-59.

139. Diner A.M., Strickler A., Karnosky D.F. Initiation, elongation, and remultiplication of Larix decidua micropropagules // NZ J. Forest. Science. -1986.-V. 16.-P. 306-318.

140. Diner A.M., Karnosky D.F. Potential of genetic engineering in Larix I I Research and Development Conference, Atlanta, 1986, Abstr. Atlanta: TAPPI,1986.-P. 93-94.

141. Diner A.M., Karnosky D.F. Differential responses of two conifers to in vitro inoculation with Agrobacterium rhizogenes // Eur. J. Forest. Pathology.1987.-V. 17.-P. 211-216.

142. Dixit V., Pandey V., Shyam R. Differential antioxidative responses to cadmium in roots and leaves of pea (Pisum sativum L. cv. Azard) // J. Experimental Botany. 2001. - V. 52. - P. 1101-1109.

143. Dixit V., Pandey V., Shyam R. Chromium ions inactivate electron transport and enhance superoxide generation in vivo in pea (Pisum sativum L. cv. Azard) root mitochondria // Plant, Cell and Environment. 2002. - V. 25. - P. 687693.

144. Dumont-BeBoux N., Anholt B.R., von Aderkas P. In vitro germination of western larch pollen // Can. J. Forest. Research. 2000. - V. 30. - P. 329-332.

145. Durzan D.J. Somatic embryogenesis and sphaeroblasts in conifer cell suspensions // Plant tissue culture / Ed. Fujiwara A. Maruzen, Tokyo, 1982. - P. 113-114.

146. Durzan D.J., Chalupa V. Growth and metabolism of cell and tissue of jack pine (Pinus banksiana) II Can. J. Botany. 1976. - V. 54. - P. 456-506.

147. Durzan D.J., Gupta P.K. Somatic embryogenesis and polyembryogenesis in Douglas fir cell suspension cultures // Plant Science. 1987. - V. 52. - P. 229235.

148. Durzan D.J., Stevard F.C. Cell and tissue culture of white spruce and jack pine // Dep. First Can. Bi-m. Res. Notes. 1968. - V. 24. - P. 30.

149. Ellis D., Bilderback D. Multiple bud formation by cultured embryos of Pinus ponderosa II J. Plant Physiology. 1984. - V. 115. - P. 201-204.

150. Encina A.E., Molar R.M., Acebes J.L., Alvarez J. M. Characterization of cell wall in bean (Phaseolus vulgaris L.) callus cultures tolerant to dichlobenil // Plant Science. 2001. - V. 160. - P. 331-339.

151. Facanha A.R., de Meis L. Inhibition of maize root H^-ATPase by fluoride and fluoroaluminate complexes // Plant Physiology. 1995. - V. 108. -P. 241-246.

152. Facanha A.R., Okorokova-Facanha A.L. Inhibition of Phosphate uptake in corn roots by aluminum-fluoride complexes // Plant Physiology. 2002. -V. 129.-P. 1763-1772.

153. Faye M., David A. Isolation and culture of gymnosperm root protoplasts (Pinus pinaster) II Physiol. Plantarum. 1983. - V. 59. - P. 359-362.

154. Flinn S.B., Webb D.T., Newcomb W. Morphometric analysis or reserve substance and ultrastructural changes during caulogenic determination of eastern white pine {Pinus strobus L.) // Can. J. Botany. 1989. - V. 67. - P. 779-789.

155. Fornasiero R.B. Phytotoxic effects of fluorides // Plant Science. 2000. -V. 161.-P. 979-985.

156. Fornazier R.F., Ferreira R.R., Pereira G.J.G. et al. Cadmium stress in sugar cane callus cultures: Effects on antioxidant enzymes // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2002. - V. 71. - P. 125-131.

157. Fortin J.A., Piche Y. Cultivation of Pinus strobus root-hypocotyl expiants for synthesis of ectomycorrhizae // New Physiology. 1979. - V. 83. - P. 109-119.

158. Foy C.D., Chaney R.L., White M.C. Physiology of metal toxicity in plants // Annu. Rev. Plant Physiology. 1978. - V. 29. - P. 511-566.

159. Garcia A., Baquedano F.J., Navarro P., Castillo F.J. Oxidative stress induced by copper in sunflower plants // Free Radie Res. 1999. - V. 31 Suppl. -P. S45-S50.

160. Gautheret R. La culture des tissus végétaux. Paris, 1959. - 864 p.

161. Gonzalez J.M., Friero E., Jouve N. Influence of genotype and culture medium on callus formation and plant regeneration from immature embryos of Triticum turgidum Desf. cultivars // Plant Breeding. 2001. - V. 120. - P. 513-517.

162. Gossett D.R., Millhollon E.P., Lucas M.C. Antioxidant response to NaCl stress in salt-tolerant and salt-sensitive cultivars of cotton // Crop Sci. 1994. -V. 34.-P. 706-714.

163. Gould J.H., Zhou Y., Padmanabhan V. et al. Transformation and regeneration of loblolly pine: shoot apex inoculation with Agrobacterium II Molecular Breeding. 2002. - V. 10. - P. 131-141.

164. Guevin T.G., Micah V., Kirby E.G. Somatic embryogenesis in cultured mature zygotic embryos of Abies balsamea II Plant Cell Tissue and Organ Culture. 1994.-V.27.-P. 205-208.

165. Guevin T.G., Kirby E.G. Induction of embryogenesis in cultured mature zygotic embryos of Abies fraseri (Pursh) Poir // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1997. - V. 49. - P. 219-222.

166. Gupta P.K., Durzan D.J. Isolation and cell regeneration of protoplasts from sugar pine (Pinus lambertiana) II Plant Cell Reports. 1986a. - V. 5. - P. 346348.

167. Gupta P.K., Durzan D.J. Somatic polyembryogenesis from callus of mature sugar pine embryos // Biotechnology. 19866. - V. 4. - P. 643-645

168. Gupta P.K., Durzan D.J. Plantlet regeneration via somatic embryogenesis from subcultured callus of mature embryos of Picea abies (Norway spruce) // In vitro Cell Dev. Biology. 1986b. - V. 22. - P. 685-688.

169. Gupta P.K., Durzan D.J. Somatic embryos from protoplasts of loblolly pine proembryonal cells // Biotechnology. 1987a. - V. 5. - P. 710-712.

170. Gupta P.K., Durzan D.J. Biotechnology of somatic embryogenesis in loblolly pine // Biotechnology. 19876. - V. 5. - P. 147-151.

171. Gupta P.K., Durzan D.J. Somatic polyembryogenesis in embryonal cell masses of Picea abies, Pinus taeda after freezing in liquid N3 // Can. J. Forest. Research. 1987b.-V. 17.-P. 1130-1132.

172. Gupta P.K., Dandekar A.M., Durzan D.J. Somatic proembryo formation and transient gene expression of a luciferase gene in Douglas fir and loblolly pine protoplasts // Plant Science. 1988. - V. 58. - P. 85-92.

173. Haissing B.E., Nelson N.D., Kidd G.H. Trends in the use of tissue culture in forest improvement // Biotechnology. 1987. - V. 5. - P. 52-59.

174. Hakman I., Arnold S. von. Isolation and growth of protoplasts from cell suspensions of Pinus contorta Doug, ex Loud. // Plant Cell Reports. 1983. - V. 2. - P. 92-94.

175. Hakman I., Arnold S. von. Plantlet regeneration through somatic embryogenesis in Picea abies (Norway spruce) // J. Plant Physiology. 1985. -V. 121.-P. 1439-158.

176. Hanson J.B. Impairment of respiration, ion accumulation and ion retention in root tissue treated with ribonuclease and ethylenediamine tetra-acetic acid // Plant Physiology. 1960. - V. 35. - P. 372-379.

177. Harvey A.E. Tissue culture of Pinus montícola on a chemically defined medium // Can. J. Botany. 1967. - V. 45. - P. 1783-1787.

178. Harvey A.E., Grasham J.L. Procedures and media for obtaining tissue cultures of 12 conifer species // Canadian J. Botany. 1969. - V. 47. - P. 547-549.

179. Horntvedt R., Robak H. Relative susceptibility of eleven conifer species to fluoride air pollution // Medd. Norsk inst. Skogforsk. 1975. - V. 305. - P. 189206.

180. Hotberichts F.A., Orzaez D., van der Pías L.H.W., Woltering E.J. Changes in gene expression during programmed cell death in tomato cell suspensions // Plant Mol. Biology. 2001. - V. 45. - P. 641-654.

181. Hrib J., Rypacek V. In vitro testing for the resistance of conifers to the fungus Phaeolus schweinitzii (Fr.) Pat. on callus cultures // Eur. J. Forest. Pathology. 1983. - V. 13. - P. 86-91.m

182. Karnosky D.F., Diner A.M. A cotyledon culture system for cloning Larix. decidua and Pinus banksiana II Research and Development Conference, Atlanta, 1984, Abstr. Atlanta: TAPPI, 1984. - P. 13-15.

183. Karnosky D.F. Micropropagation of Larches {Larix spp.) //

184. Biotechnology in agriculture and forestry, V. 18, High-Tech, and

185. Micropropagation II / Ed. Bajaj Y.P.S. Berlin, Heidelberg: Springer, 1992. -P. 123-135.

186. Kartha K.K., Fowke L.C., Leung N.L. et al. Induction of somatic embryogenesis and plantlets from cryopreservated cell cultures of white spruce {Picea glauca) H J. Plant Physiology. 1988. - V. 132. - P. 529-539.

187. Kassem M., Mosekilde L., Eriksen E.F. Effects of fluoride on human9bone cells in vitro: differences in responsiveness between stromal osteoblast precursors and mature osteoblasts // Eur. J. Endocrinol. 1994. - V. 130. - P. 381386.

188. Kaul K. Establishment of long-term callus cultures from mature white pine {Pinus strobus, Pinaceae) // Amer. J. Botany. 1986. - V. 73. - P. 242-245.

189. Keller H. Histologische und physiologische Untersuchungen an Forstpflanzer in einem Fluorschadensgebiet // Ber. Eidgen. Anstalt Forstl. Versuchswesen. 1976. - Bd. 154. - S. 1-82.

190. Kirby E.G., Chang P.Y. Colony formation from protoplasts derived from Douglas-fir cotyledons // Plant Sei. Letter. 1979. - V. 14. - P. 145-154.

191. Kim Y.W., Youn Y., Noh E.R., Kim J.Ch. Somatic embryogenesis and plant regeneration from immature zygotic embryos of Japanese larch {Larix letolepis) // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1999. - V. 55. - P. 95-101.

192. Kinraide T.B. Reconsidering the rhyzotoxicity of hydroxyl, sulphate, and fluoride complexes of aluminum // J. Experimental Botany. 1997. - V. 48. -P. 1115-1124.

193. Klimaszewska K. Plantlet development from immature zygotic embryos of hybrid larch through somatic embryogenesis // Plant Science. 1989a. - V. 63. -P. 95-103.

194. Klimaszewska K. Recovery of somatic embryos and plantlets from protoplast cultures of Larix x eurolepis II Plant. Cell Reports. 19896. - V. 8. -P. 440-444.

195. Klimaszewska К., Ward С., Cheliak W.M. Cryopresirvation and plant regeneration from embryogenic cultures of larch (Larix x eurolepis ) and Black spruce ( Picea mariana) // J. Experimental Botany. 1992. - V. 43. - P. 73-79.

196. Klimaszewska K., Devantier Y., Lachance D. et al. Larix laricina (tamarack): somatic embryogenesis and genetic transformation // Can. J. Forest. Research. 1997. - V. 27. - P. 538-550.

197. Knabe W. Luftverunreinigungen und Forstwirtschaft // Forstarchiv. -1975.-Bd. 46.-S. 59-62.

198. Konschuh M.N., Thorpe T.A. Metabolism of 14C-aspartate during shoot bud formation in cultured cotyledon explants of radiata pine // Physiol. Plantarum. 1997.-V. 99.-P. 31-38.

199. Kopp J.B., Robey P.G. Sodium fluoride does not increase human bone cell proliferation or protein synthesis in vitro II Calcif. Tissue Int. 1990. - V. 47. -P. 221-229.

200. Krogstrup P., Eriksen E.N., Moller J.D., Roulund H. Somatic embryogenesis in Sitka spruce (Picea sitchensis (Bong.) Carr. // Plant Cell Reports. 1988. - V. 7. - P. 594-597.

201. Laine E., David H., David A. Callus formation from cotyledon protoplasts of Pinus oocarpa and Pinus patula II Physol. Plantarum. 1988. -V. 72. - P. 374-378.

202. Laine E., David H. Somatic embryogenesis in immature embryos and protoplasts of Pinus caribaea II Plant Science. 1990. - V. 69. - P. 215-224.

203. Laliberte S., Lalonde M. Sustained organogenesis in callus cultures of L. x eurolepis initiated from short shoot buds of a 12-year-old tree // American J. Botany. 1988. - V. 75. - P. 767-777.

204. Lang, H., Kohlenbach H.W. Protoplast culture from Fagus, Ulmus and Abies II NATO ASI series, series A: Life Sciences, Vol. 210, Woody Plant Biotechnology / Ed. Ahuja M.R. New York: Plenum Press, 1991. - P. 339-340.

205. Laseter J.L., Lawler G.C., Walkinshaw C.H., Weete J.D. Fatty acid of Pinus elliotti tissues // Phytochemistry. 1973a. - V. 12. - P. 817-821.

206. Laseter J.L., Weete J.D., Baur P.S., Walkinshaw C.H. Lipid composition slash pine tissue cultures grown with lunar and earth soils // Space Life Science. -19736.-V. 4.-P. 353-356.

207. Lau Y.L., Sheld H.W., Cowles J.R. Phenylalanine ammonia-lyase activity in callus cultures of Pinus elliotti II Physiol. Plantarum. 1980. - V. 49. -P. 299-303.

208. Laukkanen H., Soini H., Kontunen-Soppela S. et al. A mycobacterium isolated from tissue cultures of mature Pinus sylvestris interferes with growth of Scots pine seedlings // Tree Physiology. 2000. - Vol. 20. - P. 915-920.

209. Le V.Q., Belles-Isles J., Dusabenyagasani M., Tremblay M. An improved procedure for production of white spruce (Picea glauca) transgenic plants using Agrobacterium tumefaciens II J. Experimental Botany. 2001. - V. 52. - P. 20892095.

210. Legriffoul A., Mocquot B., Mench M., Vangronsveld J. Cadmium toxicity effects on growth, mineral and chlorophyll contents, and activities of stress related enzymes in young maize plants (Zea mays L.) // Plant and Soil. 1998. -V. 200.-P. 241-250.

211. Lelu M.-A., Boulay M., Arnaud Y. Obtention de calls embryiogènes à partir de cotylédons de Picea abies (L.) Karst. prélevés sur de jeunes plantes âgées de 3 à 7 jours après germination II C.R. Acad. Sci. Paris. 1987. - V. 305. - P. 105109.

212. Lelu M.-A., Klimaszewska K., Charest P.G. Somatic embryogenesis from immature and mature zygotic embryos and from cotyledons and needles of somatic plantlets of Larix II Can. J. Forest. Research. 1993. - V. 24. - P. 100-106.

213. Leonard C., Graves H. Effect of Fluoride Air Pollution on Florida Citrus // Fluoride. 1972. - V. 5. - P.145-163.

214. Lesney M.S. Growth responses and lignin production in cell suspensions of Pinus elliotti "elicited" by chitin, chitosan or mycelium of Cronatium quercum f. sp.fusiforme II Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1989. - V. 19. - P. 23-31.

215. Liang L. L., Fleming N. Aluminum fluoride inhibition of cabbage phospholipase D by a phosphate-mimicking mechanism // FEBS Letters. 1999. -V. 461.-P. 1-5.

216. Liu T., van Staden J. Selection and characterization of sodium chloridetolerant callus of Glycine max (L.) Mer cv. Acme // Plant Growth Regulation. -2000.-V. 31.-P. 195-207.

217. Liu T., van Staden J. Growth rate, water relations and ion accumulation of soybean callus lines differing in salinity tolerance under salinity stress and its subsequent relief// Plant Growth Regulation. 2001. - V. 34. - P. 277-285.

218. Lowenberg J.R., Skoog F. Pine tissue culture // Physiol. Plantarum. -1952.-V. 5.-P. 33-36.

219. Lu C.-Y., Thopre T.A. Somatic embryogenesis and plantlet regeneration in cultured immature embryos of Picea glauca II J. Plant, Physiology. 1987. -V. 128.-P. 297-302.

220. Lu C.Y., Torpe T.A. Soot-bud regeneration in subcultured callus Engelmann spruce II In vitro Cell Dev. Biology. 1988. - V. 24. - P. 239-242.

221. Lunardi J., Dupuis A., Garin J. et al. Inhibition of H+-transporting ATPase by formation of a tight nucleoside diphosphate fluoroaluminate complex at the catalytic site II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. - V. 85. - P. 8958-8962.

222. Machaliñski B., Zejmo M., Stecewicz I. et al. The influence of sodium fluoride on the clonogenecity of human hematopoietic progenitor cells: preliminary reports // Fluoride. 2000. - V. 33. - P. 168-173.

223. Magyar G.M., Stout R.G., Callis P.R., Williams S.A. Tonoplast ATPase proton pumps in wheat roots // Plant Science. 1989. - V. 65. - P. 153-160.

224. McNulty I.B., Newman D.W. The effect of a lime spray on the respiration rate and chlorophyll content of leaves exposed to atmospheric fluorides // Proc. Utah. Acad. Sci. 1956. - V. 33. - P. 73-79.

225. Miernyk J.A., Randall D.D. Some properties of pea mitochondrial phospho-pyruvate dehydrogenase-phosphatase // Plant Physiology. 1987. - V. 83. - P. 311-315.

226. Mikhailova T.A. The physiological condition of pine trees in the Pribaikalia (East Siberian) // Forest Pathology. 2000. - V. 30. - P. 345-359.

227. Miller G.W., Yu M.H., Psenak M. Presence of fluoroorganic compounds in higher plants // Fluoride. 1973. - V. 6. - P. 203-214.

228. Missiaen L., Wuytack F., Desmedt H. et al. AIF4" reversibly inhibits P-type cation-transport ATPases, possibly by interacting with the phosphate-binding site of the ATPase // Biochem. J. 1988. - V. 235. - P. 872-833.

229. Mochamed A.N., Applegate H.G., Smith J.D. Cytological reactions induced by sodium fluoride in Allium cepa root tip chromosomes // Can. J. Genet. Cytology. 1966. - V. 8. - P. 241-244.

230. Mochamed A.N. Cytogenetic effects of hydrogen-fluoride on plants // Fluoride. 1969. - V. 2. - P. 76-84.

231. Mochamed A.N. Chromosomal changes in maize induced by hydrogen fluoride gas // Can. J. Genet. Cytology. 1970. - V. 12. - P. 241-244.

232. Munnik T., Meijer H.J.G., ter Riet B. et al. Hyperosmotic stress stimulates phospholipase D activity elevates the levels of phosphatidic acid and diacylglycerol pyrophosphate // Plant J. 2000. - V. 22. - P. 147-154.

233. Murashige T., Scoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plantarum. 1962. - V. 15. -P. 473-497.

234. Nagmani R., Bonga J.M. Embryogenesis in subcultured callus of Larix decidua//Can. J. Forest. Research. 1985. - V. 15. - P. 1088-1091.

235. Niemi K., Haggman H. Pisolithus tinctorius promotes germination and forms mycorrhizal structures in Scots pine somatic embryos in vitro II Mycorrhiza. -2002.-V. 12.-P. 263-267.

236. Niemi K., Haggman H., Sarjala T. Effects of exogenous diamines on the interaction between ectomycorrhizal fungi and adventitious root formation in Scots pine in vitro 11 Tree Physiology. 2002a. - V. 22. - P. 373-381.

237. Niemi K., Vuorinen T., Ernstsen A., Haggman H. Ectomycorrhizal fungi and exogenous auxins influence root and mycorrhiza formation of Scots pine hypocotyl cuttings in vitro II Tree Physiology. 20026. - V. 22. - P. 1231-1239.

238. N0rgaard J.V., Krogstrup P. Cytokinin-induced somatic embryogenesis from immature embryos of Abies nordmanniana II Plant Cell Reports. 1991. -V. 9.-P. 509-513.

239. Palet K.R., Thorpe T.A. In vitro regeneration of plantlets from embryogenic and seedling explants of Engelmann spruces (Picea engelmanii) Parry. //Three Physiology. 1986. - V. 1. - P. 289-301.

240. Pandolfmi T., Gabbrielli R., Comparini C. Nickel toxicity and peroxidase activity in seedlings of Triticum aestivum L. // Plant, Cell and Environmental. -1992.-V. 15.-P. 719-725.

241. Patalakh 1.1., Grishko V.N. Estimation of plant cuticle water retention in ecotoxicological analysis // Доп. Нац. АН Украши. 2000. - № 9. - С. 185-190.

242. Patel K.R., Shekhawat N.S., Berlyn G.P., Thorpe Т.A. Isolation and culture of protoplasts from cotyledons of Pinus coulteri D. Don. // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1984. - V. 3. - P. 85-90.

243. Pattanavibool R., Aderkas P. von, Hanhijiirvi A. Diploidization in megagametophyte-derived cultures of the gymnosperm Larix decidua II Theor. Apl. Genet. 1995. - V. 90. - P. 671-674.

244. Patnaik J., Debata B.K. In vitro selection of NaCl tolerant callus lines of Cymbopogon martini (Roxb.) Wats // Plant Science. 1997. - V. 124. - P. 203-210.

245. Piola F., von Aderkas P. Controlled mycorrhyzal initiation as a means to improve root development in somatic embryo plantlets of hybrid larch (Larix x eurolepis) // Physiol. Plantarum. 1995. - V. 95. - P. 575-580.

246. Pirttila A.M., Laukkanen H., Hohtola A. Chitinase production in pine callus (Pinus sylvestris L.): a defense reaction against endophytes? // Planta. -2002,-V. 214.-P. 848-852.

247. Phillips G.C., Gladfelter H.J. Eldarica pine, Afghan pine {Pinus eldarica Medw.) 11 Biotechnology in agriculture and forestry, Vol. 16, Trees III / Ed. Bajaj Y.P.S. Berlin, Heidelberg: Springer, 1991. - P. 269-287.

248. Randall D.D., Williams M., Rapp B.J. Phosphorylation-dephosphorylation pyruvate dehydrogenase complex from pea leaf mitochondria // Arch. Biochem. Biophys. 1981. - V. 207. - P. 437-444.

249. Rauncillac M. Multiplication végétative in vitro et synthèse mycorrhizienne: Pin maritime Hébélome, Pisolithe // Les mycorhizes: biologie et utilization, Vol. 13. - INRA Publ., 1982. - P. 351-357.

250. Rauncillac M., Faye M., David A. In vitro rooting of cloned shoots in Pinus pinaster II Physiol. Plantarum. 1982. - V. 56. - P. 97-101.

251. Reinert J., White P.R. The cultivation in vitro of tumor tissues and normal tissues of Picea glauca II Physiol. Plantarum. 1956. - V. 9. - P. 177-189.

252. Rey M., Gonzalez M.V., Ordes R.J. et al. Factors affecting transient gene expression in cultured radiata pine cotyledons following particle bombardment // Physiol. Plantarum. 1996a. - V. 96. - P. 630-636.

253. Robertson D., Weissinger A.K., Ackley R. et al. Genetic transformation of Norway spruce (Picea abies (L.) Karst) using somatic embryo expiants by microprojectile bombardment. //Plant Mol. Biology. 1992. - V. 19. - P. 925-935.

254. Rout G.R., Samantaray S., Das P. In vitro selection and biochemical characterization of zinc and manganese adapted callus lines in Brassica spp. // Plant Science. 1999. - V. 137. - P. 89-100.

255. Salajova T., Salaj J., Kormutak A. Initiation of embryogenic tissue and plantlet regeneration from somatic embryos of Pinus nigra Arn. // Plant Science. -1999.-V.145.-P. 33-40.

256. Samantaray S., Rout G.R., Das P. In vitro selection and regeneration of zinc tolerant calli from Setaria italica L. // Plant Science. 1999. - V. 143. -P. 201-209.

257. Sandalio L.M., Dalurzo H.C., Gomez M. et al. Cadmium-induced changes in the growth and oxidative metabolism of pea plants // J. Experimental Botany. 2001. - V. 52. - P. 2115-2126.

258. Sauter M., Hager A. The mycorrhizal fungus Amanita muscaria induces chitinase activity in root and in suspension-cultured cells of its host Picea abies II Planta. 1989. - V. 179. - P. 61-66.

259. Schenk R.U., Hildebrandt A.C. Medium for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures // Can. J. Botany. 1972. - V. 50.-P. 199-205.

260. Schuller A., Reuther G., Geier T. Somatic embryogenesis from seed explants of Abies alba II Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1989. - V. 17. -P. 53-58.

261. Schtiitzendubel A., Polle A. Plant responses to abiotic stresses: heavy metal-induced oxidative stress and protection by mycorrhization // J. Experimental Botany. 2002. - V. 53. - P. 1351-1365.

262. Schween G., Schwenkel H.-G. Effect of genotype on callus induction, shoot regeneration, and phenotypic stability of regenerated plants in the greenhouse of Primula ssp. II Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2003. -V. 72.-P. 53-61.

263. Sederoff R., Stomp A.M., Chilton W.C., Moore L.W. Gene transfer into loblolly pine by Agrobacterium tumefaciens II Biotechnology. 1986. - V. 4. -P. 647-649.

264. Shin D.-J., Podila G.K., Karnosky D.F. Transgenic larch expressing genes for herbicide and insect resistance // Can. J. Forestry Research. 1984. -V. 24. - P. 2059-2067.r

265. Sinha S., Gupta M., Chandra P. Oxidative stress induced by iron in Hydrilla verticillata (l.f.) Royle: response of antioxidants // Ecotoxicol. Environ. Saf. -1997. V. 38. - P. 286-291.

266. Soikkeli S. The types of ulrastructural injuries in conifer needles of northern industrial environments // Silva Fenn. 1981. - V. 15. - P. 339-404.

267. Sterling G. Preliminary attempts in larch embryo culture // Bot. Gaz. -1949.-V. 111.-P. 90-94.

268. Stevens D.P., McLaughlin M.J., Alston A.M. Phytotoxicity of the aluminiume-fluoride complexes and their uptake from solution culture by Avena sativa and Lycopersicon esculentum II Plant and Soil. 1997. - V. 192. - P. 81-93.

269. Stevens D.P., McLaughlin M.J., Alston A.M. Phytotoxicity of the fluoride ion and its uptake from solution culture by Avena sativa and Lycopersicon esculentum II Plant and Soil. 1998a. - V. 200. - P. 119-129.

270. O.Stevens D.P., McLaughlin M.J., Alston A.M. Phytotoxicity of hydrogen fluoride and fluoroborate and their uptake from solution culture by Lycopersicon esculentum and Avena sativa II Plant and Soil. 19986. - V. 200. - P. 175-184.

271. Stomp A.-M., Loopstra C., Sederoff R. et al. Development of DNA transfer system for pines // Genetic manipulation of woody plants / Eds. Hanover J.W., Keatlhley D.E. New York: Plenum Press, 1988. - P. 231-241.

272. Struglics A., Fredlund K.M., Konstantinov Y.M. et al. Protein phosphorylation / dephosporylation in the inner membrane of potato tuber mitochondria // FEBS Letter. 2000. - V. 475. - P. 213-217.

273. Sumaryati S., Negrutiu J., Jacobs M. Characterization and regeneration of salt- and water-stress mutants from protoplast culture of Nicotiana plumbaginifolia (Viviami) // Theor. And Appl. Genet. 1992. - V. 83. - P. 613-619.

274. Tabor C.A., Barnett N.M. An experimental system for studying interrelationships between the embryo and megagametophyte of Pinus strobus during seed germination // Can. J. Botany. 1987. - V. 65. - P. 1212-1217.

275. Taesdale R.D., Rugini E. High yield preparation of viable protoplasts from suspension cultured loblolly pine {Pinus taeda) and subsequent regeneration to callus // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1983. - V. 2. - P. 253-261.

276. Tang W., Sederoff R., Whetten R. Regeneration of transgenic loblolly pine (Pinus taeda L.) from zygotic embryos transformed with Agrobacterium tumefaciens II Planta. 2001. - V. 213. - P. 981-989.

277. Tautorus T.E., Bekkaoui F., Pilon M. et al. Factors affecting transient gene expression in electroporated black spruce (Picea mariana) and jack pine {Pinus banksiana ) protoplasts // Theor. Apll. Genet. 1989. - V. 78. - P. 531-536.

278. Tautorus T.E., Attree S.M., Fowke L.C., Dunstan D.I. Somatic embryogenesis from immature and mature zygotic embryos, and embryo regeneration from protoplasts in black spruce {Picea mariana Mill.) // Plant Science. 1990. - V. 67. - P. 115-124.

279. Thompson R.G., von Aderkas P. Somatic embryogenesis and plantlet regeneration from immature embryos of western larch // Plant Cell Reports. 1992. -V. 11.-P. 379-385.

280. Tramblay F.M. Somatic embryogenesis and plantlet regeneration from embryos isolated from stored seed of Picea glauca II Can. J. Botany. 1990. -V. 68. - P. 236-242.

281. Trouller A., Girardet J.L., Dupont Y. Fluoroaluminate complexes are Afunctional analogs of phosphate in sarcoplasmic-reticulum Ca -ATPase // J. Biological Chemistry. 1992. - V. 267. - P. 22821-22829.

282. Tyagi A.K., Rashid A., Maheshwari S.C. Sodium chloride resistant cell line from haploid Datura innoxia Mill. A resistance trait carried from cell to plantlet and vice versa in vitro II Protoplasma. 1981. - V. 105. - P. 327-332.

283. Van Assche F., Clijsters H. Effects of metals on enzyme activity in plants // Plant, Cell and Environmental. 1990. - V. 13. - P. 195-206.

284. Vera-Estrella R., Barkla B.J., Bohnert H.J., Pantoja O. Salt stress in Mesembryanthemum crystallinum L. cell suspensions activates adaptive mechanisms similar to / those observed in the whole plant // Planta. 1999. -V. 207. - P. 426-435.

285. Vike E., Habjorg A. Variation in fluoride content and leaf injury on plants associated with three fluoride smelters in Norway // The Science of the Total Environment. 1995. - V. 163. - P. 25-34.

286. Walkinshaw C.H., Jewell F.F., Walker N.W. Callus culture of Fusiform rust-infected slash pine // Plant Dis. Reports. 1965. - V. 49. - P. 616-618.

287. Walter C., Grace L.J., Donaldson S.S. et al. An efficient Biolistic® transformation protocol for Pcea abies embryogenic tissue and regeneration of transgenic plants // Can. J. Forest. Research. 1999. - V. 29. - P. 1539-1546.

288. Ward P.F.V. Metabolism of fluoroacetate by Lettuce // Fluoride. 1973. -V. 6.-P. 194-202.

289. Wentzel K.F. Empfindlichkeit und Resistenzunterschiede der Pflansen gegenüber Luftverunreinigung // Forstarchiv. 1968. - Bd. 39. - S. 189-195.

290. Werner A., Zadworny M., Idzikowska K. Interaction between Laccaria laccata and Trichoderma virens in co-culture and in the rhizosphere of Pinus sylvestris grown in vitro II Mycorrhiza. 2002. - V. 12. - P. 139-145.

291. Werner A., Zadworny M. In vitro evidence of mycoparasitism of the ectomycorrhizal fungus Laccaria laccata against Mucor hiemalis in the rhizosphere of Pinus sylvestris II Mycorrhiza. 2003. - V. 13. - P. 41-47.

292. Wernicke W., Milkovits L. Development gradients in wheat leaves — Response of leaf segments in different genotypes cultured in vitro II J. Plant

293. Physiology. 1984. - V. 115. - P. 49-58.

294. Wilde L.G., Yu M. Effect of fluoride on superoxide dismutase (SOD) activity in germinating mung bean seedlings // Fluoride. 1998. - V. 31. - P. 81-88.

295. Wilson S.M., Thorpe T.A., Moloney M.M. PEG-mediated expression of GUS and CAT genes in protoplasts from embryogenic suspension cultures of Picea glauca II Plant Cell Reports. 1989. - V. 7. - P. 704-707.

296. Winicov I. Characterization of rice (Oryza sativa L.) plants regeneratedfrom salt-tolerant cell lines // Plant Science. 1996. - V. 113. - P. 105-111.

297. Yang Q., Laliberte S. Cell division and microcolony formation in protoplasts from mature material of hybrid larch (Larix x eurolepis Henry) // Plant Science. 1996. - V. 117. - P. 159-165.

298. Xu Ch.Ch., Jeon Ah.Y., Hwang H.J., Lee Ch.-H. Suppression of zeaxanthin epoxidation by chloroplast phosphatase inhibitors in rice leaves // Plant Science. 1999. - V. 146. - P. 27-34.

299. Zhu Ch-H., Huang Y., Oberley L.W., Domann F.E. A family of AP-2 proteins down-regulate manganese superoxide dismutase expression // J. Biological Chemistry. 2001. - V. 276. - P. 14407-14413.

Информация о работе

Шмаков, Владимир Николаевич
кандидата биологических наук
Иркутск, 2004
ВАК 03.00.12

Диссертация

Изучение меж- и внутривидовых различий по устойчивости к действию фтора у сибирских видов лиственниц методом культуры in vitro - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Изучение меж- и внутривидовых различий по устойчивости к действию фтора у сибирских видов лиственниц методом культуры in vitro - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы