Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика функциональных групп стрептокиназы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Характеристика функциональных групп стрептокиназы"

РГ6 од 2 1 ШОП 1993

АКАДЕМИЯ ШК БЕЛАРУСИ ИНСТИТУТ РАДИОБИОЛОГИИ

На правах рукописи

КА.ЗЮЧИЦ Ольга Александровна

ХАРЖгаРИСГЛХА ФУНЩИОНАЛЬЕЬК ГРУШ! СТРЕПТСКИНАЗЫ

СЗ.00.04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологичзских наук

г/днек - 1393

Работа выполнена в Белорусском ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь

Научные руководители: доктор биологических наук Ннкакпров Б.Н., доктор медицинских наук, профессор Рытик П.Г.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Чпркин A.A. доктор биологических наук, профессор Черенкевич С.Н.

Ведущая организация -Институт биоорганической химии АН Беларуси

Защита состоится " Х993 г. в ^^часов

на заседании специализированного совета Д 006.30.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук в Институте радиобиологии АН Беларуси по адресу: 220600, г.Минск, ул.Еодшская, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института радиобиологии АН Беларуси

Автореферат разослан I9S3 г.

Ученый секретарь

специализированного совета кандидат биологических наук

АJL Ходосовская

ОБЩАЯ ХАРАК1ШСТШСА РАБОТЫ

Актуальность тгооблета. Борьба с тромботячесними осложнени-яст при сердечно-сосудистых, глазных и других заболеваниях определяет потребность в высокоактивных тром5олитиках, действующих как прямо на образовавшийся фибрин, так и через активацию фибриноллза посредством превращения плазглпногена в плазмин.

Среди активаторов плазгаптогена особое место занимает стре-птокиназа (СК) - бе лох, продуцирует! во внешнюю среду рядом гемолитических стрептококков. Препараты индивидуальной СК, хотя л являются широко используемым средством в тромболитяческой терапии, обладают недостатками, существенно ограничивающими их прттененле, особенно при внугриартериальном и внутривенногд введении (Дюкс, ред., 1283; ЛЫг±сН эt а1Д985; МсОга^ et а1Д985; Ппаггег, 1976). Это связано с тем, что механизм активации плаз-ганогена в присутствии СК дока не расшифрован.

Согласно одной из гипотез относительно механизма активации плазкиногена, СК осуществляет свое акгиваторное действие посредством образования зквямолярного кошлекса с ироэнзтгом и после-дупцего каталитического действия активного центра, который располагается- в плаз1язн(оген)овой части этого комплекса и имеет свойства активного центра серяновых протеаз ( Ейск ега1Д968; Саз1;е1Цпо, 1979; Андреенко, 1979).

Для понимания особенностей проявления активности СК недостает представлений о роли функциональных грушг ее молекулы: свободных ашно-, карбоксл-, индольных, фенольных и шидазолъ-ных. Имеющиеся в литературе сведения о значимости функциональных групп СК носят фрагментарный характер и касаются лишь ин-долышх и свободных аминогрупп (Вис*, Во^ало, 1971; Таратлна И др., 1985).

Связанные с особенностями структуры СК недостатки лекарственных препаратов на ее основе, в частности, высокую шялуноген-ность а чувствительность к эндогенный протеазам, можно устранить с пошщьЬз иммобилизации (Торчилин и др., 1975; Чазов и др., 1381, 1982 и др.). Первым и необходимым этапом работы в этом направлении является изучение роли функциональных груш белка в поддержании натлвной конформации и проявлении специфической активности, ибо позволяет отобрать из многообразия способов иммобилизации ряд наиболее эффективных путей (Бепеззн ц яр., ред., ■1976).

Адекватным инструментом исследования функциональных групп является химическая модификация, к преимуществам которой относят простоту в сочетании с высокой спеплалчностью, воз?.кжность следить за ходом реакции и определить число шдифицарувшх групп, однозначность полученных результатов для интерпретации, к возможность их прямого применения на практике (Реепеу е* а1., 1980).

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы явилось исследование роли свободных ш.шно-, карбоксильных, индольных, фенол-гидроксильных и имидазольных груш СК из игаьма Н46А в обеспечении нативной конфоркации и специфической функции белка, проявляющейся в результате хомшгексирования с плгзшногеном человека. При этом предусматривалось решение следующих задач:

1. Изучить кинетику модификации химическими реагентш,ш исследуемых функциональных груш.

2. Получить модифицированные производные СК и исследовать их специфическую функцию и хонйоршциокнне особенности б сравнении с нативным белком.

3. Оценить способность к образовании устойчивого кошлек-са с ллазшшогеном человека, характерную для производных СК с модифицированными функциональными грушами.

4. Сравнить температурную стабильность нативной СК и ее кодифицированных производных.

Научная новизна. Впервые установлено, что молекула СК из штамма Н45А в своем составе содержит 4 индольных, 2 ишдазоль-пнх, до 39 свободных амино— и не менее 33 свободных карбоксильных груш. По скорости реагирования с тдафицирущтш агентами выделены 3 типа свободных аляшогрупп, 3 типа индольных и 2 типа имидазольшх групп. Впервые показано, что для сохранения функциональной активности СК необходимым условием является целостность индольных структур в ее молекуле. Свободные анпно-и карбоксильные группы составляют шзкроокрунение триптофанилов, влияющее на реакционную способность последних. Впервые выявлено, что. модафякаяая третичной структуры стрептокиназкого белка затрагивает центры взаимодействия СК с ттроэнзимом. Б формировании стабильного эквямолярного меябелкового комплекса участвуют остатки триптофана, тирозина, свободные амино- и карбоксильные группы молекулы СК.

Теоретическая и практическая значиы9сть таботы. Полученные

результаты о роля функциональных групп СК вносят вклад в понимание тонких механизмов специфического фунхцяонарования СК зо взашлодойствад с плазыпногеном, что ва-азо как для направленной регуляция бябрляолиза, так и для построения модели действия неферментных активаторов белковой природы на зимогены серило вых протеаз.

Полученные данные о значимости исследованных фушщиональ-ных групп СК позволяют прогнозировать условия, которые необходимо соблюдать з технологии производства лекарственных препаратов а ферм на основе СК.На основе полученных данных о перспективных путях стабилизация СК предлонея оригинальный состав мази для лечения длительно нэзатавапцлх ран. Заявка на изобретение !i 4232395/14 подана для рассмотрения во ВНИИШЭ.

Положения, зыносимыа на зататт:

1. В молекуле СК из штамма Н46А Л-гемоллтлческого стрептококка грутшы С выявленн функциональные группы, способные модифицироваться о помощью химических реагентов: 4 индольных,

9 имндазолыщх, до 39 свободных амано-, не менее 33 свободных карбоксильных, а также имеются функциональные грушш, недоступные модифицирующим агента;.!.

2. Шдифвдируеше функциональные грутшы СК обладавт различной реакционной способностью по отношению к химическим реагентам. По скорости реагирования выделенн 3 типа свободных аминогруш, 3 типа индольных групп и 2 типа яьшдазольннх групп.

3. Целостность структуры индольных групп остатков триптофана является необходимым условием для проявления специфической активности и сохранения стабильного состояния СК,

4. Исчерпывающая .химическая модификация остатков триптофана, тирозина, свободных ашно- и карбоксильных груш-приводит

к утрате макромолекулой СК способности образовывать стабильный комплекс с молекулой плазшногона человека.

Йтбликапяи и алтобатая работы. Результаты исследований опубликованы в 10 научных работах, долояены я обсуядены на I Всесоюзной конференции "Структура бактериальных токсинов з генетический контроль их биосинтеза" (йэсква, IS85), У Всесоюзном биохимическом съезде (Кивв, 1986), Всесоюзной конференции памяти академика А.Е.Браунштейяа (Москва, 1987), Республиканском симпозиуме "Энзимология тромболпзиса а стрептоклназа" (Шнек, 1982).

Объет.; п структура диссертации. Диссертация изложена на 170 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литература, описания методов исследования, 3 глав, по результатам экспериментальных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы (226 источников). Работа иллюстрирована 53 рисунками и 21 таблицей..

жтшшш и шады исследования

Ь работе использовали получешке нага образцы СК л плазки-когена человека. СК выделяли как непосредстветшо из кулътурадь-ной жидкости по методу В.Н. Пикандрова к соавт.(1987), Tait и из коммерческого препарата "пелиаза" последовательно осажденлек хлоридом натрия, хроьатограйяей на ДЗАЭ-се?адексе А-50, голубой сефарозе CL-бв в се$адексес -100. Полученные образцы иг.ели удельную активность 50-100 тыс. меяцународанх единиц на мг белка. Плазмшюгев выделяли из обогащенной Л-глобулинат.,и фракции ила-зш крови человека глетодом аффинной хроматографии на лизин-се-фарозе peutch,Mertz, 1970) и на лизин-содеркацем сорбенте (Ку-динов и др., 1979). Образцы содержали до 25% спонтанного плаз-кпна.

Активность СК определяли по лизису пластин и сгустков из человеческого фибрина, содержащего плазманоген (Никандров и др., 1987; Савельвольй, Сисенко, 1967).

Концентрацию белка определяла по методу Bradford CX97G),

а такзе по величине абсот>бпик при 280 ньс, используя значения коте? *

эв^ишзенга /адля СК и плазшногена соответственно 5,0 и . 17,1 (xirschenbaum,IS75; Роббинз, Маркус, IS82).

МодкфикапиЕз свободных а.таногрупп СК проводили с понощкз 2,4,6-тришгаробеЕЗолсугьфоновоЁ кислоте (ТНБС) (Haynes et. al., 1967; НаЬееЪ, 1966). 'Ыодпфпхашт свободанх карбоксильных групп проводили в системе 1-этил-3(3-диметилг.г.янопрош;л)1:арбоди1:1.ззд (ЭДК) -г этилендиашн (Гплевич к др., IS87), Гядольнке группы С!', кодифицировала в системе ^С^-диоксан-бикарбонатний буйер (на -chimo ri et el., ISS4). Йодирование оксигрупп тлрозилов Сл вели no.otwell et al. (1976). Кодификации ш.здазодышх групп прово-диле дизтклпцрокарбокатом (Miles,IS77; Koosemont , IÎ78) и с помощью тогоогасления (Кочетов, ID78).

Об образовании эквш.галярнкх комплексов C7Í и пдазгзжогена

зудили на основании результатов гель-хрогатографии на колонке ; сефадексом G-200 в 0,01 ',! трис-лизиновом булгаре, рН 8,0.

Термоинактивацига СК и ее модифицированных производных язуча-ти при 50, 80 и 100° в 0,06 М фосфатной буфере, рН 7,4, при концентрации белка 5*10 М. Константу термоинактивации у рас-зчатывата как тангенс угла наклона изотер.® инактивации для каждой данной температуры (Кравцов и др., 1985).

Спектры поглощения записывали на спектрофотометре Specord vi—40. Спектры флуоресценции снимали на спектройлуорикетре Picáis. Спектры кругового дихроизма записывали на спектрополяримет-ре J -20. Значения молярной эллиптичности рассчитывали, принимая среднюю тесу аминокислотного остатка равной 133,6. Расчет этносительноЗ доли элементов вторичной структуры вели по пята рдперпым спектра!.! (Bolotina et al.,1979) на Э31,Г С'.! 1420.01.

Полученные результаты обработаны статистически (Рокицкий, [964).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ II ИХ СБСГЛДЕНИЕ

Тшнитройетшгоование свободных аминогрупп молекулы СК. Зпектрофотокетрическое определение числа тринитрофеннлируемых аминогрупп показало, что модификации подвергаются 39±3 свободных аминогрупп СК. Графический анализ полученной кинетической кривой и компьютерный расчет величин констант скорости реакции указывают на то, что шдифшщруешэ аминогруппы СК Функционально гетерогённы: мояно выявить 7-9 быстрореагирующих (константа ¡короста равна 0,03-0,07 мин-*)17 реагирующих со средней скорости (константа равна 0,09-0,24 мин-1), и'13-14 дадленнореаги-рующих (константа 0,4-1,0 шн ) групп.

Взаимодействие СК с ТНБС сопровождается значительным снижением активности белка (рис.1). Обращает на себя внимание различный характер инактивации СК:- при определении активности по методу лизиса фибриновых сгустков уяё при модификации около 15 аминогрупп (глубина модификации с(=0,4) наблюдалась полная инактивация белка, но в случае определения активности методом лизиса фибриновых пластин даже исчерпывающее тринитрофенилироваше не приводит к полной утрате СК ее специфической функции.

Спектроскопия КД в дальней ультрафиолетовой области выявила, что при модификации свободных аминогрупп СК ТНБС молярная элпп-тичность белка возрастает по абсолютной величине, отралая узе-

личение доли Д-спиралей б антипараллельной ^-структуры за счет неупорядоченной хонфоркации.

Как видно из результатов гель-хроа&гагрдфии на колонке с се-фадексом О-200 (табл.1), при этом, вероятно, происходит уменьшение радиуса белковой глобуж. Каявшаяся молекулярная масса нативной СК, рассчитанная из соотношения величин объема выхода и свободного объема, равна 50 кДа, модифицированный белок элаи-руется в объеме, соответствующем величине кажущейся молекулярной массы 30 кДа.

Таблица I

Значения каяуцейся молекулярной массн белков, рассчитанные по результатам гель-хродатогратии на сефадексе 0-200 =4,Змл)

Исследуемый образец } Те, мд ] 1е к ¡и, зйа

Нативная СК 8,7 4,701 50

Плазминогев 7,6 4,553 ВО

СК + ллазщноген 6,9 5,114 130

Исчерпывающе тринигрофенили-

рованная СК 9,7 4,472 30

При гель-хроматограйии эквамолнрной смеси нативной СК с пла-зминогеном белковый пик элюируется быстрее, чем индивидуальные белки (табл.1). Это свидетельствует о том, что нативная СК образует комплекс с цроэнзимом. При элюировании смеси исчерпывающе модифицированной ТНБС СК с плазщногеном наблюдались два не полностью разрешенных пика белка, соответствующих индивидуальным компонентам смеси. Таким образом, СК, модипидированная ТКБС, не способна образовывать устойчивый комплекс с плазминогеном.

Таблица 2

Значения констант тердаинакгавашгш нативной и модифицированной . ТНБС СК при различных температурах, ш"1

Исследуемый образец ; 50° \ 800 \ 100°

Нативная СК 0,9-КГ3 5,8'ПГ3 1,5-10"^

Модифицированная СК 1,1-ю-3 7,9'10~3 2,е'Ю~2

35сследованве кинетики температурной инактивации шдкфиццро-

Рис.1. Инактивация С2С в процессе тринитрофенилзрования. Активность определена по лизису сгустков (I) и пластин (2) фабрика. 3-нарастание модимицитгаван-ных аминогрупп."

Рис.2. Лнактивадия СК в процессе реакции с ЗДК и этиленди-амином. Активность определена по лизису сгустков (I) и пластин (2) фибрина.

ванной 1НБС СК (глубина модификации с(=0,15) показало, что при трех температурах прогревания константы тэрюинактивации имели значения, близкие коэффициентам термоинактивации нативного белка (табл.2).

Химическая модийикадия йункпионалытх групп СК в система водорастворимый карбодиимяд-нуклеойго?. При инкубации СК в системе, содержащей ЭДК и эталввдиамин, рН 5,35, происходит модификация, до 33 свободных карбоксильных групп и до 9 свободных аминогрупп белка. При этом наблвдается снижение специфической активности СК (рис.2). Сопоставляя кривые инактивации СК и нарастание числа первичных аминогрупп белка в процессе реакции, можно видать, что свободные карбоксильные группы несущественны доя проявления специфической активности СК. Инактивация белка происходит вследствие нарушения состояния других функциональных групп.

Сдельные эксперименты со свободными аминокислотами (тирозином и триптофаном), УФ- и флуоресцентная спектроскопия показали, что при модификация СК претерпевает изменение состояние остатков триптофана. Об этом яе свидетельствует характер спектров

/

Рис.З. Спектры кругового дихрояз- . Рис.4. Дпнамика спектров абсо-

ма дативной (I) и модной- тхЗдли СК в системе Но0л

цпрованной в система ЭДК- -диоксан. (1-до окис-

этилеадиакик (2) СК. Раст- ~ 3-

КД кодифицированного белка в ароматической области (рис.3). В частности, сникается интенсивность экстремумов при 286 и 292нм, отракая ушныпение степени асшаетрпи окружения хромофорных групп остатков триптофана.

Указанные изменения состояния трпптофанилов СК не приводят к дестабилизации белка: найденные значения констант терисикактива-2ии при 5С, 8С и 100° нагнвкой и модифицированной СК близки.

Однако, данные гель-хроматографии свидетельствуют об утрате кодифицированной в системе ЗДК-этилендишян СК способности, к образованию устойчивого комплекса с плазмнвогеном.

Окпсление остатков триптофана в смеси перекись водотояа-ди-оксан. Серии модельных экспериментов по окислению в системе свободных аминокислот (триптофана, тирозина и метионина) позволили подобрать условия для избирательной модификации индольных групп трпптофанилов СК: концентрация ~ 3-10 м'", температура -4°, бикарбонатный буфер, рН 8,5. В этих условиях инкубация СК в смеси вызывала изменения УФ-спектров с уменьшением абсорбции -при 280 ем (рис.4), свидетельствующем о разрушении индольных груйп. Учитывая максимальные изменения спектра поглощения СК под действием системы Н202-ДИОксан,найдено число модифицированных индольных групп. Око равно 4.

Исследования кинетики изменений полосы поглощения 280 им

окисления)

УФ-спектров СК при инкубации ее при разных концентрациях перекиси водорода позволили заключить, что 4 ивдольннх труппы СК неодинаковы по окисляегости (рис.5). Константа скорости окисления петаэой индольной группы равна 1,5'10-2шн~1\ константа скорости

~ о т

окисления первых двух групп - 1,1*10 ман , а третьей и четвертой - С,5*Ю-2 мин-^. При этом модификация уже первого трип-тофанила приводит к утрате 50/' активности СК, а разрушение есе одной индольной группы сопровождается полной инактивацией белка.

СК с одним окисленным триптофакилом более чувствительна к действия тепла, чем нативный белок (табл. 3).

Таблица 3

Значения констант термошактивадии нативной и модифицированной в системе НзОз-диоксан СК при различных температурах, млн-*

Исследуемый образец | 50° | : 80° | 100°

Нативная СК СК с одной модифицированной индольной труппой 0,9-1СГ3 2,8'Ю"3 5,8'1СГ3 1,5'КГ2 42,0-10~3 19,7'ПГ2

Кроме того, окисление кндольных групп приводит к утрате СК способности образовывать устойчивый комплекс с плазминогевом.'

?.'юджпи7сапвя тирозилов СК тгои йодировании. Модельные эксперименты со свободными аминокислотами позволили определить условия (температура - 4°, 0,06 Ы фосфатный буфер, рН 7,4), при которых вероятно йодирование лишь оксигрупп тирозилов СК.

Сравнивая данные дифференциальной ГФ-спектроскопии (рис. 6) со спектральными характеристиками йодированных производных тирозина, мо.-лю полагать, .что модификация СК при 20- и 30-хратноы избытке реагента ведет к частичному образованию ыопойодтирозилов и дийодтнрозилов. Однако, поскольку даже у этих производных сохранена полоса абсорбции при 295,5 нм, вероятно, часть оста^ ков тирозина в молекуле СК остается ^модифицированной.

При 5-кратном молярном избытке реагента йодирование не ведет к изменению ектпваторной функции белка. ^Здльнейзее увеличение концентрации йода сопровоящается значительной инактивацией СК (рис.-7), что, по-видимому, свидетельствует о гетерогенности оксигрупп тирозилов по окружению.

Судя по характеру элвциа экеимольной смеси йодированной (при

0ä6-

0,04-

30 90 ао НИН 280 295,5 303 340 ни

Кинетика окисления остатков три- Рис.6. Дифференциальные

птооаяа молекулы СК в системе (рН 11,5 против рН

НоОо-даоксан. Концентрация Н?09: 2,5) спектры нагив-

oíTn-3M fт\ c-.rn-Зр; (оЛ _ г.. 4 ной (I) СКи кодайи

3 10 Ы (I). 5 Ю И (2) в 6 цированной при S-{2

•10 iM (3); концентрация СК -6'Ю"6М.

4/Аа, %

10-(3), 20—(4) и 30 кратном (5) молярно: избытке йода.

I * * и я

Мотныи избыток ¿вця

Рис.7. Инактивация СК при

различном соотношении 19:СК. Активность определена по лизису пластин и сгустков «гЗраяа.

iff » (О во мин

Рис.8. Кинетика этохсиформалир вания и деашлирования гистидилов СК. Концентр;

ция белка 6,5'10~%, да-

этилпирокарбоната - 2,.6

30-кратном молярном избытке реагента ) СК п плазминогена, после модификации СК ее способность к образованию устойчивого комплекса с проэнзимом утрачивается.

Изучение тепловой денатурации показало, что величины константы скорости термоинактивацпи йодированной СК близки к этим значениям нативного белка.

Химическая модификация остатков гистидина СК дпэтилпитхжар-бонатом. Обработка диэтилпирокарбонатом отдельных аминокислот показала, что, в отличие от гистидина, в реакции с триптофаном и тирозином продуктов, дащих вклад абсорбции в области 240 км, не образуется.

Инкубация СК с реагентом приводила к росту абсорбции при 240 нм. Расчет, общего числа модифицируемых шидазольных групп показал, что оно соответствует 9. Предварительная обработка СК 6И мочевиной или 61Л гуанидинхлорвдом не приводила к дальнейшему приросту абсорбции при 240 нм, характерному для этоксиформилгис-тидина л диэтоксифоршлгистидина. Модификация имидазольных групп обратима: после добавления 0,5 М гидроксиламина наблюдается уменьшение величины специфической абсорбции (рис. 8), Вместе с тем характер полученной зависимости дает основания полагать, что 2 остатка гистидина этоксищрмилируются необратимо, свидетельствуя.о функциональной гетерогенности имидазольных ' групп СК.

После модификации имидазольных групп молекула СК частично утрачивает функциональную активность, причем эта потеря сопряжена с модификацией лишь двух групп (рис. 3). Деацилирование не вело к восстановлению активности СК.

С помощью титрования ТНБС выявлено, что в молекуле СК с двумя модифицированными гпстидилами нативннми остаются лишь 14 аминогрупп.

Судя по данным спектроскопии КД, при модификации СК диэтилпирокарбонатом не происходит заметных изменений "вторичной структуры белка, но имеет место изменение третичной структуры молекулы.

модибикапия имидазольных групп молекулы СК пта йотоокислении.

Серив модельных'экспериментов со свободными аминокислотами (триптофаном, тирозином, гистидиком и метионнном) показали,, что в .избранных условиях быстрее других модифицируется гистидин.

При фотооблучении СК происходит изменение спектров абсорбции

1 г б 1 5

±±

7 в

А-/Г/А.Х

3 />Н

Рио.Э. Инактивация СК в про- Рис.10. Фотоинактивация СК

цессэ эгоксаооргдшгро- пли различных значениях

вания. Активность оп- рй. Активность опреде-

ределена до лизису делена по лизису пла-

сгустков (I) и пластин стин (I) и сгустков (2)

(2; йибрина. фибрина.

I 1.0

0.5

« $

А г ЕЕ§

■ ь\ / \

г \

-щ \\ / \

—1-1-1—г

зов

ЗОН

4» А.««

Рас.II. Спектры триптофановой флуоресценции дативной СК (I) и модифицированной мотоокислением при рН 6,Э в теченаел15 (2)у и 60 (3) мин. Кон" ' ~ "ЛЬ —

06 М 6 М

мочевины (б).

5елка, указывающее на возможность разрушения индольных групп ин-холышх групп остатков триптофана. Однако определение констант скорости фотоокисления К при различных значениях рН среды свидетельствует о том, что в избранных условиях окислении подвергаются лмидазольные группы гистидилов белка, лак показало титрование диэтилпирокарбопатом, при фотоокислении при р£ 6,9 раэ-эушается одна шлидазольная группа в молекуле СК.

Фотоокисление СК не приводит к падению термостабильности бел-га. При исследовании термоинактивации при 50, 80 и 100° внявле-ю, что значения константы термоинактивации ^ модифицированной три рИ 6,9 СК близки к величина!.! нативного белка и производ-юго СК с одни:.; этоксиформилированшм гистидилом, но на порядок

значений ^ производного с одной окисленной в системе хлоксан индольной группой.

Учитывая, что разрушение одной индольной группы приводит к резкому скикенкю активности и температурной стабильности СК, лозно полагать, что в избранных условиях фотоокисления СК ее щцольные группы не повреждаются.

Фотоокисление СК сопровождается снижением ее активаторной функции на 25-40£ (в зависимости от способа'определения актив-гости) (рис. 10).

Имея в виду снижение абсорбции хромофоров СК после фото оке о-тения, !лк провели исследование конформационных особенностей про-13водных СК в сравнении с нативнкм белком.

У подвергшихся фотоокислению в течение 60 мин при рК 6,9 образцов СК наблюдалось некоторое снижение интенсивности триптофа-ювой флуоресценции (рис. II). При добавлении 6М мочевины, т.е. з условиях, когда происходит разупорядочпвание вторичной структуры СК, спектры нативного и модифицированного белка практичес-<и совпадали. Это свидетельствует о том, что фотоокисление ими-©зольной группы приводит к изменению гакроощзукенпя остатков гриптофана, что влечет за собой снижение интенсивности флуорес-хенции их хромофоров.

Спектры кругового дихроизма в пелтийной области модифицированных в указанных выше условиях производных СК отличаются от шэктров нативного .белка. Расчет вклада элементов вторичной -:труктурк указывает на снижение относительной доли М -спиралей 5 некоторое увеличение суммарной доли ^-структуры е неупорядо-1енЕ0й конформацли. В то же время характер спектров КД в арома-

тической области свидетельствует об изменении третичной структуры молекулы.

Судя по данный гель-зрощтографяи, модифицированная гоотооклс-лением СК сохраняет способность к образованию устойчивого комплекса с цлазшногеном человека.

Обсуядая роль изученных функциональных групп СК в поддержании нативнон конйормации н специфическом функционировании белка, необходимо отлетать следующее.

Функциональные группы СК тлеют различную реакционную способность, связанную, по всей вероятности, с их разной доступностью модифицирующим агент и.!. По скорости реагирования с последними выделены 3 типа свободных аминогрупп, 3 типа индольных и 2 типа пмидазольных групп.

Быстро- а среднереагирующие группы формируют поверхность молекулы СК и играют ванную роль в проявлении ее специфической активности, поскольку обеспечивают реализацию комплементарных мех-белковых взаимодействий.

В образовании внутримолекулярных связей участвуют функциональные группы, недоступные модифицирующим агентам: свободные карбоксильные и оксигруппы тирозилов.

Дня сохранения функциональной активности СК необходимым условием является целостность структуры индольных групп остатков триптофана в ее молекуле: модификация двух остатков приводит к полной инактивации белка, а одной - к его заметной дестабилизации. Особую роль триптофаншгов СК необходимо учитывать при выделении белка, его очистке, стабилизации и других видах технологического воздействия, создавая условия, исключающие возможность говреяде-ния индодьной структуры.

Свободные амино- и карбоксильные группы, вероятно, входят в шщроокру^еше триптофанилов СК, влиящее на реакционную способность последних.

Результаты химической кодификации подтверждают данные литературы (Никандров, 1386; Нпкандров и др., 1990) о том, что даш образования устойчивого комплекса с цлазминогеном человека необходимо сохранение нативной кокфортйии СС. Однако взаимодействие СК с цроэнзиком при образовании эквимольного комплекса определяется не только грубой структурой глобулы белка, но устойчивостью структуры небольших областей макромолекулы СК, включающих остатки триптофана, тирозина, свободные амнно- и карбоксильные группы

выводы

1.3 молекуле СК из штамма Н46А л-гемолитического стрептококка группы'С выявлены функциональные группы, способные модифицироваться с помощью химических реагентов: 4 ивдольных, 9 имида-зольных, до 39 свободных амнно-, не менее 33 свободных карбоксильных.

2. !.5одифицируедае функциональные группы СК обладай? различной реакционной способностью по отношению к химическим агентам. 1о скорости реагирования с последними выделены 3 типа свободных аминогрупп, 3 типа дадольных и 2 типа шицазолышх групп.

3. Имеатся функциональные группы СК, недоступные модифши-эуюцим агентам: часть оксигрупп тирозилов белка недоступна для .толекул йода, часть свободных карбоксильных групп СК недоступна 1ля модификаторов при инкубации белка в системе ЗДК-этилендиа-аш.

4. Целостность структуры лндольеых групп остатков трилтофа-га является необходншы условием для проявления специфической активности и сохранения стабильного состояния СК.

5. Исчерпывающая химическая модификация остатков тирозина, триптофана, свободных амино- и карбоксильных групп приводит к .•трате макромолекулой СК способности образовывать устойчивый, юмплекс с молекулой плазгашогена человека.

6. Свободные карбоксильные и имидазольная группы СК могут !ыть использованы в реакциях с носителями при иммобилизации бел-:а или для наложения на белковую глобулу'внутримолекулярных сши-юк с целью стабилизации ее нативной конформации.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Никандров В.Н., Воробьева Г.В.,Демидчик Н.Б. .Казючин О.А. Исследование некоторых физико-химических свойств-стрептокиназы стрептококка штамма Н46А// Энзимология тромболизиса и стрептоет-ааза: 1.5атериалы Республиканского симпозиума. - Минск,1982. -

С.41-53.

2. Никандров В.Н., Воробьева Г.Б., Лыяова Н.С., Казючиц О.А. Особенности структуры молекулы стрептокиназы // Молекулярная ¡труктура бактериальных токсинов и генетический контроль их био-:йнтеза:Теэ.докл. 1-2 Всесоюзной конференции.- М, Д985.-С.79-80.

3. Никандров В.Н., Воробьева Г.Б., Пьсгова Н.С., Казючиц О.А., Цыманович С.Г., Микуц HJB.- Исследование структурнсмТункцяональ-ной специфики стрептокиназн !// У Всесоюзный биохимический съезд: Тез. стенд, сообгц. -Т.2 -I.!, ,IS86. - C.I4-I5.

4. Никандров В.Н., Казючиц О.Л. Исследование роли остатков триптофана в молекуле стрептокиназн методом химической кодификации // Биохишя. - 1988. - Т.53, Ш. - С. 5C8-5I5.

5. Никацпров В.Н., Казючиц О.А. ¿-.'одийикация остатков тирозина ьтолекулы стрептокиназн при йодировании // Вопр. кед. химии.-IS69.- Т. 35. И.- С. 41-47.

о. Микандров В.П., Казшлц О.А. Исследование функциональных групп стрептокиназн с помощью иодирования // Яишя сгазиологиче-оул: активных веществ: Сборник научных трудов. - Нальчик, 1989.. О JJ. .

7. Никандров В.П., Казючиц О.А., Янковская Г.С. Исследование роли остатков гистидина в молекуле стрептокиназн с помощью модификации диэтилпирокарбонатом // Биохимия,- I990.-T.55,.'s5. -С. 888-897.

8. Казючиц О.А., Никандров В.Н., Янковская Г.С., Рытик П.Г. Модификация функциональных групп молекулы стрептокиназн цри фотоокислении // Биохимия. - 1990.-Т.55,йЮ.-С.1847-1859.

9. Казючиц О.А., Никавдров В.Н. Химическая модификация функциональных групп стрептокиназн в системе водорастворимый карбо-дишид-нуклеофил // Вопр. мед. химии. - I99I.-T.37, J55.-

28.

Ю. Uikandrov Т.Н., Kazyutchit3 О.А. Chemical modification of the streptokinase functional groups // 13th. Intern . Congress о Biochemistry: Abatr. - Amsterdam, 1985. - V.11. - P. 302.