Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ динамики фибринообразования и фибринолиза

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Анализ динамики фибринообразования и фибринолиза"

На правах рукописи

СУББОТИНА Татьяна Федоровна

АНАЛИЗ ДИНАМИКИ ФИБРИНООБРАЗОВАНИЯ И ФИБРИНОЛИЗА

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ па соискание ученой степени доктора медицинских паут:

ииаив1254

Санкт-Петербург 2007

003061254

Работа выполнена в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский Государственный медицинский университет имени академика И П. Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Галебская Людвпга Вячеславовна Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Жлоба Александр Анатольевич (Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад ИП Павлова)

доктор медицинских наук, доцент Антонов Виктор Георгиевич (Военно-медицинская академия им С М Кирова)

доктор медицинских наук Шавловскпй Михаил Михайлович (Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины)

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится « »_2007 г. в_часов

на заседании диссертационного совета Д 208.90 03 при Санкт-Петербургском Государственном медицинском университете им. акад. И П. Павлова (197022, г. Санкт-Петербург, ул Льва Толстого, д 6/8, зал заседаний Ученого Совета)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского Государственного медицинского университета им акад. И П Павлова

Автореферат разослан «¿/У » _2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

В Ф Митрейкин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность темы

Система гемостаза - это совокупность белковых и небелковых факторов, которые контролируют текучесть крови при физиологических условиях и предотвращают потерю крови при нарушении целостности стенок сосудов Одним из наиболее важных событий в процессе гемостаза является фибринообразование - конечный этап всего каскада свертывания крови В последующем, фибринолиз обеспечивает восстановление проходимости сосуда и локализацию свертывания Свойства фибринового сгустка, его молекулярная архитектура является одним из важнейших факторов, определяющих эффективность фибринолиза (Collet J Р , 2000) Резистентная к фибринолизу структура тромба может формироваться под воздействием измененного белково-липидного состава крови (Galanakis D К,

1987, London M , 1997), либо быть следствием врожденного молекулярного дефекта фибриногена - дисфибриногенемии (Roberts H R et al, 2001)

Нарушения гемостаза часто встречаются в клинической практике, и их диагностика является чрезвычайно актуальной проблемой (Лычев В Г, 1993, Баркаган 3 С. и соавт, 1999, Петрищев H H и соавт, 1999) Трудности диагностики нарушений гемостаза обусловлены многочисленностью и многообразием ее компонентов, а также их сложными взаимосвязями На сегодняшний день не существует общепринятых методов, позволяющих оценить свойства фибринового сгустка и его доступность лизису плазми-ном В научных исследованиях используются методы электронной и трехмерной лазерной микроскопии (Blomback В et al, 1990, Ariens RAS et al, 2000, Collet J P. et al, 2004), тромбоэластографии (Тютрин И И и соавт, 1993, Yamakage M et al, 1998, Harnett M J P et al, 2002) и методы определения проницаемости сгустка для жидкости (Савушкин А В , 2003, Woodhead J.L et al, 1996, Collet J P et al, 2004) Из числа этих методов только тромбоэластография нашла применение в клинической практике, хотя и обладает рядом недостатков - плохой воспроизводимостью результатов, низкой чувствительностью и необходимостью использования узкоспециализированной аппаратуры (Плюгго A M, 1976, Wang M et al,

1988, Mallett S V et al, 1993, Di Benedetto P et al, 2003) Остальные же методы ne могут быть использованы из-за их технической сложности

К настоящему времени функциональная оценка системы фибринолиза также остается нерешенной проблемой Основным, если не единственным, методом функциональной оценки фибринолиза в клинических и даже в научных исследованиях является определение времени лизиса эуглобули-нового сгустка (Glassman A et al, 1993; KermarrekN et al, 1998) Этот тест

обладает многими недостатками Эуглобулиновая фракция плазмы крови, в которой отсутствуют ингибиторы плазмина и его активатора, лишенная многих белковых и низкомолекулярных компонентов плазмы, представляет собой весьма условный объект исследования, мало соответствующий реальной действительности Метод эуглобулинового лизиса не дает сведений о свойствах фибринового сгустка с точки зрения его резистентности фибринолизу, а его результаты в сильной степени зависят от концентрации фибриногена (Баркаган 3 С и соавт, 1999, Egbert КО et al, 1987). К недостаткам данного метода можно также отнести трудоемкость, невозможность автоматизации и длительность процедуры исследования.

Одним из наиболее доступных методов, который позволяет оценить кинетику свертывания, свойства фибринового сгустка и кинетику фибринолиза, является турбидиметрический метод, основанный на регистрации изменений оптической плотности плазмы в процессе образования фибри-новых волокон под действием тромбина и их лизиса под действием плазмина (Лежен Т.И и соавт, 1993, Carr М.Е, 1995, Veklich Y et al, 1998; Collet J P. et al, 2002) Турбидиметрический метод в настоящее время имеет ограниченное применение в научных исследованиях, но, несмотря на техническую простоту, почти не используется в клинических целях (Не-тяженко В.З и соавт, 1996; Дубицкий А Е. и соавт, 1997). Это связано с трудностями интерпретации кривой изменений оптической плотности, отсутствием общепринятого способа расчета показателей, недостаточным представлением об их взаимосвязи, информативности и диагностической значимости.

Цель исследования

Разработать условия применения турбидиметрического метода одновременной регистрации фибринообразования и фибринолиза для изучения эффекторов системы гемостаза и клинического использования

Задачи исследования

1 Оптимизировать экспериментальную систему, позволяющую одновременно оценивать кинетику фибринообразования и фибринолиза

2 Проанализировать воздействие ряда экзогенных и эндогенных факторов на структурные особенности фибриновых сгустков и кинетику их образования и лизиса

3 Оценить варьирование и взаимосвязь параметров турбидиметри-ческой кривой в и выявить наиболее информативные показатели

4. Исследовать структурно-функциональные характеристики фибриновых сгустков, кинетику их образования и последующего лизиса в группах лиц с нарушениями системы гемостаза (беременность, метаболический синдром, острые лейкозы)

5 Изучить полиморфизм гена фибриногена FGA (ТЗ12 А) в группах здоровых лиц и пациентов с метаболическим синдромом и проанализировать возможную связь показателей турбидиметрического анализа с генотипом FGA (Т312А) Научная новизна

Оптимизирована экспериментальная система, позволяющая одновременно оценивать кинетику фибринообразования, фибринолиза и структурные особенности (толщину волокон) фибринового сгустка Впервые предложен оригинальный способ расчета параметров турбидиметрической кривой, позволяющий оценить соотношение процессов свертывания и фибринолиза, а также потенциал этих систем

С помощью метода турбидиметрического анализа впервые выявлена активация фибринолиза экстрактом Laminaria digitata Обнаружен протео-лиз стрептокиназы цистеиновыми катепсинами, что приводит к снижению, а затем и к полной потере плазминоген-активирующей способности этого белка При исследовании влияния яда Vípera mkolsku и его компонентов на фибринообразование и фибринолиз выявлены вещества фибри-ногенолитического и антифибринолитического действия Впервые установлена индукция образования протофибрилл под действием ионов никеля и кадмия, ведущая к формированию утолщенных фибриновых волокон, резистентных к фибринолизу У пациентов с метаболическим синдромом впервые выявлена повышенная свертываемость крови на этапе фибринообразования, не связанная с повышенной концентрацией фибриногена, в то время как ингибирование фибринолиза отмечено лишь у некоторой части пациентов Впервые проведена оценка влияния полиморфизма гена FGA (Т312А) на фибринообразование и фибринолиз у здоровых лиц и пациентов с метаболическим синдромом Практическая значимость

Метод турбидиметрического анализа тромбин-индуцированного фибринообразования и фибринолиза, индуцируемого стрептокиназой, удобен в экспериментальных исследованиях для быстрого скрининга предполагаемых эффекторов этих процессов

Предложен способ функционального тестирования стрептокиназы, основанный на применении турбидиметрического анализа Способ может быть использован для стандартизации препаратов стрептокиназы

Турбидиметрический анализ фибринообразования и фибринолиза может применяться в диагностике нарушений заключительных стадий свертывания крови и фибринолиза, особенно в динамическом наблюдении пациентов с нестабильным гемостазом Простота и быстрота выполнения анализа позволяет использовать его для экспресс-диагностики

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Оптимизированная экспериментальная система оценки тромбин-индуцированного фибринообразования и фибринолиза, индуцируемого стрептокиназой, и способ расчета показателей дают информацию о выраженности и соотношении процессов свертывания и фибринолиза, а также характеризуют структурные особенности фибринового сгустка

2 С помощью турбидиметрического анализа возможно выявление эффекторов системы гемостаза, обладающих разнообразными механизмами действия в отношении фибриногена, тромбина, антитромбина III, плазми-ногена и ингибиторов плазмина.

3. По данным турбидиметрического анализа нормальная беременность характеризуется активацией как фибринообразования, так и фибринолиза.

4. По данным турбидиметрического анализа метаболический синдром характеризуется активацией фибринообразования, в то время как гипо-фибринолиз отмечается лишь у небольшой части пациентов

5. Турбндиметрический анализ фибринообразования и фибринолиза может являться эффективным средством мониторинга больных с нестабильным гемостазом

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты и выводы диссертационной работы используются при оказании стационарной и амбулаторной помощи в клинике кафедры госпитальной хирургии №2 и в центре гематологии СПбГМУ им. акад И П Павлова, в научно-клиническом отделе "Лабораторная диагностика" НИИ кардиологии им В А Алмазова, а также в научно-педагогической работе на кафедре биохимии СПбГМУ им. акад И.П Павлова

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены на заседаниях кафедры биохимии СПбГМУ им акад И П Павлова, на научной конференции, посвященной 100-летию кафедры биохимии СПбГМУ (Санкт-Петербург, 1998); на конференции по проблемам внезапной смерти (Санкт-Петербург, 1998), на второй ежегодной сессии Научного центра сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н Бакулева (Москва, 1998), на научной конференции «Структура и функции протеолитических ферментов», (Москва, 2000); на биохимическом конгрессе Biocatalysis-2002 (Москва, 2002), на седьмом международном симпозиуме по ионам металлов в биологии и медицине «Metal Ions in Biology and Medecine» (Санкт-Петербург, 2002), на заседании Санкт-Петербургского отделения Российского биохимического общества (2003). По материалам диссертации опубликовано 19 научных работ. Получены 1 патент на изобретение и 1 удостоверение на рационализаторское предложение

Структура и объем дпссертацпп

Диссертация изложена на 211 страницах текста и состоит из введения, обзора литературы, главы собственных данных, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложений Работа иллюстрирована 23 таблицами и 42 рисунками Указатель литературы содержит 292 наименования (33 отечественных и 259 зарубежных авторов)

Вклад автора в проведенное исследование

Автором лично выполнены исследования по оптимизации регистрации фибринообразования и фибринолиза, проведено изучение воздействий эффекторов на систему гемостаза, выделение и очистка цистеиновых ка-тепсинов Также выполнена регистрация турбидиметрических кривых, анализ ее показателей, статистическая обработка и обобщение результатов у здоровых лиц, беременных женщин, пациентов с метаболическим синдромом и острыми лейкозами

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для отработки экспериментальной системы и ее функциональной оценки применяли пуловую плазму от 4-7 здоровых доноров или индивидуальную плазму от 31 здорового донора Материал был предоставлен ФГУ НИИ кардиологии им В А Алмазова Клиническую апробацию метода проводили на образцах плазмы, полученной в трех группах обследуемых Первую группу составили 27 здоровых женщин в III триместре нормально протекавшей беременности Материал был предоставлен женской консультацией № 30 г Санкт-Петербурга Вторая группа была представлена 80 пациентами с метаболическим синдромом (МС) (средний возраст 51 год) Материал был предоставлен ФГУ НИИ кардиологии им. В А.Алмазова Всем пациентам МС, а также здоровым донорам были выполнены стандартные биохимические анализы, включающие концентрацию глюкозы натощак, показатели липидного обмена (общий холестерин (ХС), триглицериды, ХС ЛНП, ХС ЛВП), которые определяли в сыворотке крови энзиматическими колориметрическими методами, и уровень С-реактивного белка (СРБ), который определяли высокочувствительным иммунотурбидиметрическим методом Эти показатели анализировали в отделе «Лабораторная диагностика» с использованием автоматического анализатора Хитачи-902 (Япония), наборов реактивов и контрольных материалов фирмы Хофман Ля Рош (Швейцария) Третью группу составили 12 пациентов с острыми лейкозами У 9 пациентов был диагностирован лимфобластный лейкоз и у 3 - миелобластный лейкоз Материал был предоставлен Центром Гематологии СПбГМУ им акад И П Павлова. Всем

пациентам этой группы выполнялась стандартная коагулограмма с использованием автоматического коагулометра и стандартных наборов реагентов («Технология-Стандарт», Барнаул) Кроме того, определяли уровни ATIII оптическим методом с использованием наборов РЕАХром-АТШ («Ренам», Москва), DD димера полуколичественным методом (Roche Diagnostics), растворимых фибрин-мономерных комплексов («Технология-Стандарт», Барнаул) Все исследования были выполнены в центральной клинико-диагностической лаборатории СПбГМУ им акад И П.Павлова

Венозную кровь забирали из локтевой вены утром натощак, разводили 3,8% цитратом натрия в отношении 9.1 и центрифугировали при 1200 g в течение 15 минут для получения плазмы с минимальным содержанием тромбоцитов

В работе использованы коммерческие белковые препараты тромбин и фибриноген человека (ООО «Технология-Стандарт», Барнаул), стрепто-киназа (CK) (Awelysin) Вероналовый буфер содержал 0,02 М барбитурат натрия (веронал), 0,13 М NaCl и 1 мМ СаС12, pH 7,4. В качестве эффекторов фибринообразования и фибринолиза были исследованы L-аргинина гидрохлорид (L-apr), L-лизина гидрохлорид (L-лиз), L-орнитин (L-орн) (все - Sigma), гепарин (Biochemie), препарат коллагеназы из Clostridium histolyticum (Serva), соли двухвалентных металлов, сульфаты Cd2+ и Zn2+, а также хлориды Ni2+ и Са2+ (все - «Реахим», ч д а) Водный экстракт го высушенной и измельченной наземной части водоросли Laminaria digitata (Архангельский опытный водорослевый комбинат) получали следующим образом 5 г навеску порошка водоросли заливали 10 мл кипящего 0,9% NaCl, кипятили на водяной бане 5 минут, после чего центрифугировали и использовали надосадочную жидкость Высушенные цельные змеиные яды Vípera lebetina. Vípera mkolskii, Naja melanoleuca и Naja kaouthia, а также препараты промежуточных стадий фракционирования яда Vmkolsku были любезно предоставлены Институтом биоорганической химии РАН им М М Шемякина и Ю А Овчинникова Препарат цистеино-вых катепсинов, выделенный нами из трупной почки человека с использованием собственного метода (Щербак И Г , Субботина Т.Ф, 1999), обладал удельной активностью 13,5 юнит/мг белка, измеряемой по гидролизу Z-Lys-0-Np*HCl Конечный выход ферментов составил 70%, степень очистки - 90 Эффекторы добавляли в инкубационную среду в объеме 0,1 мл за 1 минуту до начала регистрации процесса свертывания и проводили прединкубацию при 37°С, при этом количество буфера в инкубационной смеси уменьшали на 0,1 мл для сохранения общего объема среды 2,0 мл Исключение составили эффекторы, обладающие ферментативной активностью — коллагеназа и цистеиновые катепсины

Оцепку дппампкп свертываиня проводили турбидичетрическим методом В стандартном эксперименте свертывание инициировали добавлением 0,1 мл рабочего раствора тромбина (0,25 единиц МНУ мл) к 0,1 мл плазмы, разведенной в 1,8 мл вероналового буфера Прохождение тром-бин-индуцированного свертывания начинали регистрировать сразу после добавления тромбина (нулевой момент времени) по увеличению оптической плотности среды вследствие образования фибриновых волокон из растворимого фибриногена Регистрация изменений оптической плотности проводилась при длине волны 340 нм в кювете с толщиной оптического слоя 1 см, термостатируемой при 37° С Определяли следующие показатели Т1 (лаг-период свертывания), Т2 (время возрастания оптической плотности), Уву (скорость возрастания оптической плотности) и Ншах (максимальная оптическая плотность)

Для одновременной оцепкп н фпбрннообразовашш, п фпбрпнолнза в инкубационную среду за одну минуту до инициации свертывания тромбином добавляли 0,01 мл (10 МЕ/мл) рабочего раствора СК, что вызывало активацию содержащегося в плазме плазминогена Активация фибриноли-за происходила медленнее активации фибринообразования, поэтому кривая изменения оптической плотности от времени имела восходящую и нисходящую части (рис 1) По восходящей части кривой определяли лаг-период (Т1), время (Т2) и скорость (Уяу) свертывания и высоту пика кривой изменения оптической плотности (Ншах) характеризует и свойства сгустка, и его доступность фибринолизу По нисходящей части кривой определяли параметры фибринолиза - скорость лизиса сгустка (У1у$) и время процесса (Т4)

0В340

Ноах

Рис 1 Кривая изменения оптической плотности при тромбин-индуцированном фибринообразовании и индуцированном стрептокиназой фибринолизе

В отдельной серии экспериментов было установлено, что при десятикратной записи одного и того же образца плазмы отклонение показателей от средних величин не превышало 2%. Эта величина была принята за погрешность метода

Для определения отношения масса/длина фнбрнповых подокон использовали метод, предложенный Карром (Carr М.Е, 1978) Измерение оптической плотности фибринового сгустка проводили в диапазоне длин волн от 360 до 700 нм на спектрофотометре СФ2000 с программным обеспечением Как показали контрольные эксперименты, зависимость оптической плотности против длины волны в минус третьей степени (X"3) имела линейный характер в диапазоне от 360 нм до 520 нм (г=0,99; р<0,001) Для оценки размеров фибриновых волокон использовали пропорциональную отношению масса/длина величину - тангенс угла наклона линейного участка графика.

Анализ полиморфизма гспа Аа-цспп фибриногена (FGA) (Т312А)

проводили в группах здоровых лиц и пациентов с MC. Эта часть работы была выполнена в научно-клиническом отделе «Лабораторная диагностика» ФГУ НИИ кардиологии им В А. Алмазова. ДНК для генетических исследований выделяли из лейкоцитов периферической крови исследуемых лиц Идентификацию аллелей генов проводили при помощи методов, основанных на технологии полимеразной цепной реакции (ПЦР) и анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ)

Фракционирование яда Vípera nikolskii осуществляли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на катионообменной колонке НЕМА BIO 1000 СМ (8 х 250 мм, Tessek, Чехия) в градиенте ацетата аммония от 5 мМ до 1 М (pH 7,5) с получением 7 основных фракций Не сорбировавшиеся кислые белки подвергали высокоэффективной жидкостной хроматографии на анионообменной колонке НЕМА ВЮ 1000 DEAE с получением 5 кислых фракций Эта часть работы была выполнена в Институте биоорганической химии РАН.

Определение концентрации фибриногена проводили на автоматическом анализаторе Hitachi 902 (Roche Diagnostics, Швейцария) хронометрическим методом (Clauss А , 1957)

Концентрацию плазминогена в плазме оценивали с помощью набора реактивов по методу (Момот А П. и соавт, 1999), основанного на определении скорости гидролиза хромогенного субстрата плазмина For-AIa-Phe-Lys-pNA*HBr комплексами СК-плазминоген

Протеолитическую активность коллагеназы и препаратов змеиных ядов в отношении фибрина регистрировали путем оценки диаметров зон лизиса фибринового слоя.

Активность цистеиновых катепсинов оценивали в отношении хромо-генного субстрата Z-Lys-0-Np*HCl

Обработку CK препаратом цистеиновых катепсинов проводили в условиях, близких к оптимальным для действия катепсина В (pH 6,5,37°С)

Для обработки данных н представления результатов использовали программы Prizm 3 02 (GraphPad Software, San Diego, CA) и Statistica 6 0 При оценке влияния эффекторов проводили шесть параллельных экспериментов, и достоверность отличий по сравнению с контролем, не содержащим эффектора, оценивали с помощью парного критерия знаков Проверку на нормальность распределения показателей проводили с помощью критерия Шапиро-Уилка. Для оценки корреляционной зависимости использовали коэффициент корреляции Пирсона г в тех случаях, где распределение не отличалось от нормального (здоровые лица, беременные женщины), и ранговый коэффициент корреляции Спирмена rs в случаях распределения отличного от нормального (больные с МС) Сравнение показателей здоровых доноров и беременных женщин проводили с помощью t-теста для независимых выборок Равенство генеральных дисперсий проверяли с помощью F-критерия Фишера Для сравнения показателей здоровых лиц и пациентов с МС применяли непараметрический критерий Ман-на-Уитни Проверку на равновесие Харди-Вайнберга в генетической структуре выборок оценивали критерием Пирсона х2 Для оценки зависимости изучаемых показателей от генотипа использовали однофакторный непараметрический дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса Критический уровень значимости (р) при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимался равным 0,05

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Несмотря на то, что турбидиметрический метод анализа использовался в многочисленных исследованиях, в литературных источниках отсутствуют данные, позволяющие обосновать оптимальный выбор реагентов В работе (Лежен Т И и соавт,, 1993) приводится оценка влияния температуры, рН, ионной силы инкубационной среды и разведения плазмы Следуя выводам авторов, мы использовали вероналовый буфер с ионной силой и рН, соответствующими физиологическим условиям крови (ц=0,15, рН=7,4) и проводили процесс в условиях термостатирования при 37°С

Главными участниками заключительного этапа свертывания являются фибриноген и тромбин Для изменения концентрации фибриногена мы варьировали количество плазмы, добавляемой в инкубационную среду, при неизменной концентрации тромбина Было показано, что оптическая плотность сгустка линейно возрастает при увеличении концентрации фибриногена Такая же закономерность отмечалась и при свертывании чистого фибриногена Было установлено, что связь между регистрируемой тур-бидиметрическим методом оптической плотностью и относительными

размерами фибриновых волокон является линейной (г=0,99, р<0,001), то есть при увеличении количества подвергаемого свертыванию фибриногена пропорционально возрастает отношение масса/длина фибриновых волокон. Следует также отметить, что при изменении количества фибриногена при неизменном содержании тромбина изменяется соотношение между этими белками, что должно было бы приводить к нарушению линейной зависимости между размером фибриновых волокон и концентрацией фибриногена Исходя из полученных данных, можно сделать вывод о том, что влияние соотношения фибриногена и тромбина оказывает намного меньшее воздействие на свойства сгустка, чем количество фибриногена.

При увеличении концентрации тромбина (0,05-2,5 ед МН/мл) и неизменной концентрации фибриногена нами наблюдались следующие эффекты: (1) уменьшалась оптическая плотность сгустка (Ншах), (2) уменьшалось время формирования протофибрилл (Т1), (3) возрастала скорость агрегации протофибрилл (Уэу) (рис. 2А, В) Эти изменения наблюдались как в плазме, так и при свертывании очищенного фибриногена_

—QCSfaNHkm —Q125<» NHMl -*-а25едМНм1 -«-а5едЖк»1

-~<105ед NHm —aiZfaNHwi

—<15едШм1

Д няне В

Рис 2 Свертывание плазмы (А) или раствора очищенного фибриногена (В) при разных концентрациях тромбина.

Однако при свертывании фибриногена и плазмы отмечались определенные различия В плазме по мере понижения концентрации тромбина продолжительность лаг-периода Т1 возрастала экспоненциально, а в растворе фибриногена это возрастание было линейным Это различие связано с присутствием в плазме антитромбина III (АТШ) Другим отличием является то, что скорость латеральной агрегации при понижении концентрации тромбина уменьшается более существенно в растворе фибриногена, нежели в плазме Вероятно, эти различия объясняются тем, что некоторые компоненты плазмы являются индукторами агрегации протофибрилл фибрина Зависимость между относительными размерами фибриновых волокон и концентрацией тромбина была обратно пропорциональной

Согласно традиционным взглядам на роль фибринопептидов А и В (ФПА и ФПВ) в фибринообразовании, подобную обратную зависимость

объясняют тем, что отщепление ФПА и открытие сайта полимеризации «А» стимулирует в основном рост протофибрилл в длину, а отщепление ФПВ и открытие сайта полимеризации «В» стимулирует в большей степени латеральную агрегацию образовавшихся протофибрилл между собой При высокой концентрации тромбина отщепление ФПА происходит быстрее, образуются длинные протофибрилльг, и их концентрация быстро достигает критического значения, достаточного для формирования сгустка Таким образом, при большой концентрации тромбина сгусток состоит из тонких и длинных волокон Если тромбина мало, оба фибринопептида будут отщепляться медленно, и прежде чем накопится достаточное для образования стабильного сгустка количество протофибрилл, произойдет их значительная латеральная агрегация Данные, представленные на рис 2А, позволяют считать оптимальными концентрации тромбина в диапазоне 0,125-0,25 едМН/мл, поскольку они соответствуют состоянию наибольшей чувствительности тест-системы к влияниям ингибиторов и активаторов тромбина_

-ЮШнг

-50М5мп -75 Шип -100№/мп

Д время, с В время, с

Рис 3 Свертывание и фибринолиз в плазме при высоких (А) и низких (В) концентрациях СК (времч инкубации — 1 мин )

Одновременная турбидиметрическая регистрация процессов свертывания и фибринолиза достигается добавлением в инкубационную смесь стрептокиназы (СК) Фибринолиз, индуцируемый СК, имеет свои особенности по сравнению с процессом, индуцируемым физиологическими активаторами Хотя качественно турбидиметрическая кривая не меняется в зависимости от использования СК, тканевого (тАП) или урокиназного активатора плазминогена (ОгиЬег А. ^ а1, 1994), учитывать эти особенности при работе с данной тест-системой необходимо Основные отличия действия СК от тАП заключаются, во-первых, в том, что активация плазминогена происходит сразу же после добавления СК к плазме, а не после формирования фибринового сгустка Во-вторых, комплексы СК-плазминоген обладают малой фибринолитической активностью, но способны расщеплять фибриноген (Вохгис! Р О. е1 а1, 2000) Для того чтобы

минимизировать действие этих особенностей, мы проанализировали зависимость турбидиметрической кривой от концентрации СК (0,5-100 МЕ/мл) и времени ее инкубации с плазмой (0-20 мин) Увеличение концентрации СК от 25 до 100 МЕ/мл (рис ЗА) приводило не к ускорению фибринолиза, а задерживало или предотвращало его, что соответствует представлению о низкой фибринолитической активности комплексов СК-плазминоген. Увеличение времени инкубации в присутствии высоких концентраций СК приводило к пролонгированию Т1, снижению Уву и Нтах, что свидетельствует о фибриногенолизе Понижение концентрации СК<10 МЕ/мл сопровождалось замедлением фибринолиза (рис ЗВ), что объясняется снижением скорости образования плазмина По этой причине свертывание продолжалось дольше, и высота пика при уменьшении количества СК увеличивалась Однако на начальные этапы свертывания (Т1 и Уву) концентрации СК от 0,5 до 10 МЕ/мл влияния не оказывали.

Приведенные данные показывают, что фибринолиз ингибируется в присутствии как высоких, так и низких концентраций СК. Наиболее чувствительным параметром является время сохранения максимума оптической плотности (ТЗ) Зависимость ТЗ от концентрации стрептокиназы является и-образной (рис 4) Подобная зависимость с четко выраженным минимумом может быть удобной для тестирования препаратов СК Известно, что тестирование и определение активности этого белка представляет серьезные трудности (СоШо Ь.Т. е1 а!, 2004) Обнаруженная нами закономерность позволяет достаточно легко и надежно стандартизовать препараты стрептокиназы по минимуму параметра ТЗ_

СК, МЕ/мл

Рис 4 Зависимость времени сохранения максимума оптической плотности ТЗ от концентрации СК

Таким образом, были подобраны условия для проведения турбидиметрической регистрации фибринообразования и фибринолиза Оптимальным является использование 10 МЕ/мл СК, когда эффект образования комплексов плазминогена с СК минимален фибринолиз проходит полностью, а фибриногенолиз практически не происходит При этой концентрации

оптимальным временем инкубации оказалась одна минута Использование больших времен инкубации (5 - 20 минут) вызывало удлинение Т1 и снижение высоты пика кривой, что свидетельствует о фибриногенолизе

Параметры турбидиметрической кривой свертывания и фибринолиза, а также их интерпретация представлены в табл 1. Нами предложено также использовать дополнительные расчетные показатели Так, общее время свертывания можно выразить как сумму времен его лаг-периода и времени латеральной агрегации Тзу=Т 1+Т2 Общее время фибринолиза может быть выражено как сумма времен его лаг-периода Т2+ТЗ и времени наблюдаемого лизиса Т4' Т1уз=Т2+ТЗ+Т4

Таблица 1

Параметры турбидиметрической кривой свертывания и фибринолиза

Параметр Определяемые величины Интерпретация параметра

Т1, лаг-период свертывания Время от инициации свертывания до начала возрастания оптической плотности Время образования и накопления критической длины и числа протофибрилл

Убу, скорость свертывания Максимальная скорость нарастания оптической плотности Максимальная скорость агрегации протофибрилл

Т2, время латеральной агрегации Время от начала возрастания оптической плотности до его остановки Агрегация протофибрилл, когда процессы свертывания преобладают над процессами фибринолиза

Ншах, высота пика Максимальная оптическая плотность Характеризует оптические свойства сгустка и быстроту запуска фибринолиза

ТЗ, время плато Время, когда оптическая плотность колеблется не более чем на 0,001-0,002 о е от максимальной Характеризует быстроту запуска фибринолиза

У1уБ, скорость лизиса Максимальная скорость убывания оптической плотности Максимальная скорость фибринолиза

Т4, время наблюдаемого лизиса Время от начала убывания оптической плотности до достчжения исходного ее уровня Время, необходимое для прохождения полного лизиса сгустка

Для проверки информативности тест-системы нами были проведены серии экспериментов с эффекторами, механизмы действия которых известны К ним относятся аминокислоты Ь-арг, Ь-лиз и Ь-орн, а также гепарин

Поскольку тромбин является сериновой протеиназой, адсорбционный центр которой связывает аргининовые остатки фибриногена, вещества, обладающие гуанидиновой группой, в том числе Ь-арг, являются конкурентными ингибиторами тромбина (81£е£ Т.\У. et а1., 2001). Турбидиметри-ческие кривые, полученные в присутствии 5 и 10 мМ Ь-арг, представлены на рис. 5А. Как видно из приведенных данных, 5 мМ Ь-арг существенно удлинял лаг-период свертывания (Т1) и тем самым увеличивал общее время свертывания ТвУ. Лаг-период фибринолиза (Т2+ТЗ) практически не изменялся, а общее время фибринолиза Т1уя даже несколько уменьшалось сообразно с умеренным снижением Ншах. Описанные изменения соответствуют представлению об ингибировании активности тромбина. Однако несколько неожиданным оказался эффект 10 мМ раствора Ь-арг: дальнейших изменений продолжительности свертывания не происходило, но более чем вдвое уменьшалась скорость агрегации протофибрилл Убу. Кроме того, в присутствии Ь-арг наблюдалось дозо-зависимое снижение Ншах. Поскольку концентрация фибриногена в данной серии опытов оставалась постоянной, снижение Ншах было лишь кажущимся: лизис сгустка начинался соответственно своему неизменному лаг-периоду и не давал завершиться процессу свертывания.

Общий вывод, который позволяет сделать анализ турбидиметрических кривых, заключается в том, что Ь-арг, не оказывая никакого воздействия на фибринолиз, замедляет процесс свертывания как на уровне образования протофибрилл, так и на уровне их латеральной агрегации, причем в разной эффективной концентрации (5 и 10 мМ, соответственно). Данное наблюдение не выглядит парадоксальным, если учесть, что в молекуле фибриногена тромбин гидролизует два типа связей, отщепляя ФПА и ФПВ, и каталитический центр тромбина обладает разным сродством к остаткам аргинина в центрах А и В фибриногена._

А В

Рис. 5. Свертывание и фибринолиз в плазме крови в присутствии Ь-арг (А) и Ь-лиз(В).__

Ь-лиз является хорошо известным ингибитором фибринолиза, действие которого связано с конкурентным блокированием лизин-связывающих участков в кринглах плазмин(оген)а (Wu Н Ь е1 а1, 1990), что приводит к нарушению связывания фермента с фибрином Данные, представленные на рис. 5В, демонстрируют, что фибринолиз отчетливо замедляется в присутствии 5 мМ и полностью блокируется в присутствии 10 мМ Ь-лиз Анализ количественных данных показывает, что наибольшим изменениям подвергается лаг-период фибринолиза Т2+ТЗ, те Ь-лиз задерживает сорбцию плазмин(оген)а на фибрине Это приводит к существенному увеличению продолжительности латеральной агрегации и к умеренному повышению Нтах Обращает на себя внимание умеренное, но дозо-зависимое и отчетливое увеличение Т1 и такое же умеренное снижение скорости латеральной агрегации Убу Таким образом, хотя главной точкой приложения Ь-лиз являются лизин-связывающие центры плазмин(оген)а, эта аминокислота также оказывает ингибирующее действие на активность тромбина, хотя и в гораздо более слабой степени Такой результат вполне объясним, учитывая структурное сходство боковых цепей Ь-арг и Ь-лиз

Структурным аналогом Ь-лиз является Ь-орн, влияние которого было исследовано в конечных концентрациях 5-15 мМ Его ингибирующее действие на процесс фибринолиза оказалось слабее, чем у Ь-лиз, и концентрация 15 мМ не блокировала процесс полностью

Еще один препарат известного действия — гепарин — был испытан нами в отношении заключительных этапов свертывания и фибринолиза Его добавление в плазму приводило к дозо-зависимому увеличению Т1, что объясняется его известным эффектом ингибирования тромбина, опосредованном АТШ (рис 6) Анализ количественных данных показывает, что достоверные изменения времени агрегации протофибрилл Т2, лаг-периода фибринолиза Т2+ТЗ и его общей продолжительности Т1уБ отсутствуют. Выраженное дозо-зависимое снижение Нтах и скорости агрегации Узу, наблюдающееся при концентрациях гепарина >= 5,0* 10"3 ЕД/мл, вероятно, связано с нарушением агрегации протофибрилл и «незавершенностью» процесса свертывания Поскольку антиагрегационное и антифибриноли-тическое действие гепарина описано в литературе как независимое от АТШ (Розенфельд М А, 1984), запись турбидиметрических кривых была выполнена с использованием не только плазмы, но и ее эуглобулиновой фракции, не содержащей АТШ В этом случае даже максимальная концентрация гепарина не вызывала достоверных изменений ни по одному показателю Использование вместо плазмы очищенного фибриногена также не обнаружило никакого влияния гепарина в отношении агрегации протофибрилл. Таким образом, по данным турбидиметрического исследования,

гепарин в данной тест-системе обнаруживает два эффекта - ингибирова-ние образования протофибрилл и возможное нарушение их агрегации, причем оба эффекта проявляют зависимость от АТ1Н.

Рис 6 Свертывание и фибринолиз в плазме крови в присутствии гепарина. Кривые соответствуют разным концентрациям гепарина 1-0 (контроль), 2 - 2,5*10"3ЕД/мл, 3-5,0* Ю"3 ЕД/мл, 4 - 7,5* 103 ЕД/мл, 5 -1* 102 ЕД/мл

В водорослях Laminaria содержатся антикоагулянты с гепариноподоб-ным действием (Гаврилова Е.А. и соавт., 1997). Турбидиметрические кривые, полученные в присутствии возрастающих количеств экстракта ламинарии, похожи на те, которые приведены для гепарина, однако анализ количественных показателей позволяет выявить довольно существенные отличия (табл. 2). Во-первых, обращает на себя внимание различия в характере зависимости Т1 от концентрации эффектора, которая оказалась линейной для экстракта ламинарии и экспоненциальной для гепарина. Это позволяет предположить, что антикоагулянт из экстракта оказывает свое действие не через ATIII, либо взаимодействует с ним иначе, чем гепарин. В дополнительных опытах было установлено, что эффект экстракта ламинарии связан с ингибированием тромбина, поскольку внесение в инкубационную среду больших количеств тромбина полностью или частично устраняло удлинение Т1. Во-вторых, в присутствии >= 0,6 мкл/мл экстракта ламинарии достоверно уменьшалась продолжительность лаг-периода фибринолиза Т2+ТЗ, а при наибольшей концентрации (1 мкл/мл) и общее его время Tlys, т.е. наблюдалась активация фибринолиза. Наконец, под действием экстракта, в отличие от гепарина, не происходило достоверных изменений скорости агрегации протофибрилл. Таким образом, приведенные данные подтверждают присутствие в экстракте Laminaria digitata антикоагулянта. Помимо этого известного факта, турбидиметри-ческий анализ показал, что экстракт не проявлял антиагрегационной активности и обладал способностью активировать фибринолиз. Изучение активатора фибринолиза из экстракта ламинарии представляет определенный интерес по причине доступности этого растительного сырья.

00340

1

Время

Таблица 2.

Параметры турбидиметрической кривой в присутствии водного экстракта Laminaria digitata

Параметр Концентрация экстракта, мкл/мл инкубационной среды

0 0,05 0,2 0,4 0,6 1,0

Т1, с 46 48 65* 94* 123* 185*

(1Д) (1,7) (1,7) (2,2) (2,5) (2,0)

Т2, с 92 90 84 82* 79* 74*

(1,1) (1,5) (2,0) (2,4) (1,3) (1,9)

Tsv, с 138 138 149* 176* 202* 249*

(2,3) (2,2) (2,4) (3,3) (3,7) (5,0)

Т2+ТЗ, с 103 101 95 93 90* 84*

(1,5) (1,2) (2,6) (3,0) (1,4) (2,3)

Tlys, с 175 173 173 171 166 160*

(2,4) (2,0) (2,7) (2,3) (3,2) (2,8)

Vsv, 0,180 0,192 0,180 0,180 0,174 0,168

о е /мин (0,0052) (0,0043) (0,0008) (0,0046) (0,0060) (0,0032)

Vlys, 0,168 0,168 0,168 0,168 0,168 0,156

о е /мин (0,0040) (0,0048) (0,0031) (0,0050) (0,0026) (0,0042)

Птах, 0,123 0,124 0,125 0,123 0,107* 0,095*

о е (0,0021) (0,0021) (0,0022) (0,0025) (0,0031) (0,0030)

Примечание: в скобках ошибка средней, * - достоверные отличия от контрольного уровня

Модуляция системы фибринообразования/фибринолиза может осуществляться за счет протеолитической модификации или деградации ее компонентов Нами были исследованы последствия обработки плазмы крови коллагеназой и цистеиновыми катепсинами Коллагеназа является метал-лоферментом, весьма избирательно расщепляющим коллаген и ему подобные протеины Первичная структура фибриногена имеет несколько участков, уязвимых для коллагеназы (Бышевский А Ш и соавт, 1990). Многие патологические состояния сопровождаются появлением или активацией в крови протеолитических ферментов различного происхождения, в том числе коллагеназы (Ва§Ип Т, 1996, Мои Е е1 а1, 2002) В опытах этой серии проводили прединкубацию неразведенной плазмы с различными концентрациями фермента при 37°С Через определенные промежутки времени из смеси отбирали 0,1 мл для стандартного турбидиметрического анализа На рис 7 представлены турбидиметрические кривые, записанные после 15-минутной прединкубации Видно, что увеличение концентрации коллагеназы приводит лишь к незначительному возрастанию лаг-периода свертывания Т1, но зато дозо-зависимо снижает высоту пика Ншах, что

указывает на протеолитнческое расщеплении фибриногена Степень этого снижения (АНшах) по сравнению с контролем линейно зависит от концентрации коллагеназы в диапазоне 0,1 — 0,8 мг/мл, причем прямая экстраполируется не к началу координат, а к некоторой величине на оси абсцисс. Можно полагать, что этот порог действия коллагеназы обусловлен присутствием ингибиторов фермента в плазме крови. Величина порога может быть предложена для количественной оценки антиколлагеназного потенциала плазмы крови

00340

Рис 7 Свертывание и фибринолиз в плазме крови после прединкубации с кол-лагеназой

Кривые соответствуют разным концентрациям коллагеназы 1-0 (контроль), 2 - ОД мг/мл, 3 - 0,4 мг/мл, 4 - 0,8 мг/мл

С314Э - ГА ~ С.

«140 9 >

С,120 •

0 100 • *

00й> а Л \ \ 1 \

оово $ Д1 V \4 _

о.см 8 \ \ \

0 020 в \ \ \ По .

ЙЛ^С? \ \ \

Ю 100 150 200 250 МО 350 400

гр.ш, с Г ~ * * ^ _ * *

12 3 4 5 6

А В

Рис 8 Свертывание и фибринолиз в плазме после предварительной обработки

СК цистеиновыми катепсинами активностью 1 юнит/мл (А) Протеолитическая

деградация СК (В)

Кривые и столбики геля соответствуют разному времени обработки СК цистеиновыми ка-

тепсинами 1- 0 мин, 2-5 мин, 3 - 10 мин; 4 - 18 мин, 5 - 30 мин, 6 — 45 мин

Помимо коллагеназы, нами была исследована фракция цистеиновых катепсинов, выделенная из почки человека После 60-минутной прединкубации плазмы крови с препаратом цистеиновых катепсинов (2 юнит/мл)

нами не было выявлено изменений турбидиметрической кривой Отсутствие изменений не является свидетельством того, что катепсины не способны использовать отдельные белки этой системы в качестве своих субстратов По-видимому, мы использовали концентрации ферментов, не превышающие антипротеолитический потенциал плазмы (Gabrijelcic D et al., 1990). В дальнейшем нами была проведена аналогичная прединкуба-ция отдельных компонентов тест-системы с препаратом цистеиновых ка-тепсинов, которая выявила, что тромбин и фибриноген устойчивы к действию этих протеиназ, тогда как CK в течение 10-15 мин теряет плазми-ноген-активирующую способность. Протеолитическое разрушение CK цистеиновыми катепсинами было подтверждено исследованием продуктов ее деградации методом электрофореза в ПААГ (рис 8А, В) Полученные данные позволяют объяснить быструю инактивацию CK в организме человека ее лизосомальным протеолизом

Известно, что яды змей содержат большое количество протеолитиче-ских ферментов. По нашим данным, цельные яды кобр - Naja kaouthia и Naja melanoleuca — в конечной концентрации до 0,1 мг/мл не оказали значимого воздействия ни на один из показателей фибринообразова-ния/фибринолиза Предннкубация (5-60 мин.) неразведенной плазмы с этими ядами при 37°С также не приводила ни к каким изменениям турбидиметрической кривой Таким образом, нами не обнаружено эффекторов протеолитических систем крови в яде этих представителей семейства Ela-pidae При исследовании ядов змей семейства Vipendae, напротив, обнаружены мощные эффекторы гемостаза Турбидиметрические кривые, записанные в присутствии яда V lebetina в конечных концентрациях 1—5 мкг/мл, выявили сочетание коагуляционного и фибриногенолитического эффектов, что подтверждается данными о составе этого яда (Siigur Е. et al, 2001; Samel М et al, 2002)

Рис 9 Свертывание и фибринолиз в плазме крови в присутствии цельного яда Vípera nikolsku

1 -контроль, 2 - в присутствии яда

Сведений о составе и биологической активности компонентов яда другой гадюки, V nikolsku, в литературе нет. Турбидиметрические кривые,

полученные в присутствии цельного яда V ткоЬки (5 мкг/мл, время инкубации 1 мин ), представлены на рис 9. В сравнении с контролем, отмечается два основных эффекта- выраженное снижение Нтах и умеренно выраженное, но достоверное замедление фибринолиза — пролонгирование его лаг-периода Т2+ТЗ и особенно общего времени Т1уэ При исследовании отдельных фракций яда V ткоЬки влияние на фибринообразова-ние/фибринолиз выявлено лишь в одной из основных и во всех кислых фракциях.

Таблица 3

Влияние фракций яда V ткоЬки в конечной концентрации 5 мкг/мл инкубационной среды на фибринообразование и фибринолиз

Параметр Контроль Кислая фракция Основная фракция

Т1, с 58(1,1) 46* (1,4) 64* (1,8)

Т2, с 72 (2,0) 102* (2,2) 70(1,5)

Тбу, с 130 (2,4) 148* (2,8) 136(1,1)

Т2+ТЗ, с 87 (2,0) 142* (3,0) 85 (2,2)

"Пув, с 152 (2,1) 220* (3,6) 150(1,1)

Убу, о е /мин 0,192 (0,0045) 0,192 (0,0082) 0,108* (0,0023)

У1уБ, о е /мин 0,156(0,0067) 0,144 (0,0030) 0,096* (0,0020)

Нтах, о е 0,104 (0,0014) 0,120* (0,0031) 0,068* (0,0020)

Примечание: в скобках ошибка средней, * - достоверные отличия от контрольного уровня

Эффекты основной и кислых фракций резко различались между собой (табл 3) Белок основной фракции обладал фибриногенолитическим эффектом- на это указывает снижение Нтах, соответствующее этому небольшое увеличение Т1 и снижение обоих скоростных показателей. Нарастание эффекта при увеличении времени инкубации подтвердило про-теолитический механизм действия белка. В кислых фракциях отмечалось ингибирование фибринолиза, те. увеличение всех временных показателей, за исключением Т1, при умеренном возрастании Нтах Механизм этого эффекта может быть различным, протеолиз СК или плазмин(оген)а, ингибирование плазмина, либо нарушение связывания плазминогена с СК. Прединкубация кислой фракции с СК не оказала воздействия на ее функциональную активность, однако было установлено, что компонент кислой фракции обладает высокой активностью в отношении субстрата плазминогена (Рог-А1а-РЬе-Ьу5-рК А *НВг), т е. является протеиназой Можно

предположить, что белок кислой фракции является протеиназой, расщепляющей плазмин(оген) Таким образом, метод турбидиметрического анализа при исследовании цельного яда Vmkolsku позволил выявить одновременно два эффекта, которые при последующем фракционировании яда были разделены.

Катионы двухвалентных металлов являются потенциальными эффекторами гемостаза Эксперименты по оценке их влияния на параметры процесса были проведены с использованием бескальциевого буфера, а также образцов плазмы и растворов фибриногена и тромбина, в которых содержание кальция было минимизировано путем диализа В отсутствие кальция форма и параметры турбидиметрической кривой оказываются существенно иными, чем в стандартных условиях Кривую отличает длительный лаг-период свертывания Т1 и низкий Ншах По мере увеличения концентрации Са2+ в инкубационной среде (0,5 - 20 мМ), отмечается дозо-зависимое укорочение Т1, повышение Ншах и скорости агрегации прото-фибрилл, в то время как показатели фибринолиза - его лаг-период Т2+ТЗ и общая его продолжительность Tlys — достоверно не изменяются. Скорость фибринолиза возрастает соответственно увеличению Ншах. Полученные данные позволяют придти к выводу, что ионы кальция увеличивают скорость полимеризации фибрин-мономеров в протофибриллы, либо уменьшают «критическую массу» протофибрилл, необходимую для начала латеральной агрегации, а также увеличивают скорость латеральной агрегации Однако несмотря на то, что в присутствии Са2+ фибриновые гели состоят из более толстых волокон, они так же хорошо подвергаются фиб-ринолнзу, как и в отсутствие Са2+.

Известно, что ионы кальция специфически связываются с С-концевым участком у-цепи фибриногена, который входит в состав D-области фибриногена (Liu Q et а!, 1998). Это связывание приводит к конформационным перестройкам, облегчающим последующие полимеризацию и агрегацию Полученные нами данные показывают, что эффекты кальция являются насыщаемыми - кривые и значения параметров для 10 и 20 мМ концентраций практически совпадают Это означает, что неспецифическое связывание кальция, если и происходит при высоких его концентрациях, не оказывает влияния на функциональные свойства фибриногена и фибрина.

Влияние катионов Zn2f, Ni2+ и Cd2+ оказались сходными между собой, но резко отличающимися от эффектов кальция Ни один из этих ионов при 30-минутном наблюдении не вызывал «рекальцификацию», т.е образование сгустков в отсутствие тромбина, как это свойственно ионам кальция. Добавление микромолярных концентраций Zn2+, Ni2+ и Cd2+ в инкубационную среду приводило к отчетливым изменениям турбидиметрической

кривой Таким образом, эффективные концентрации этих ионов на 1-2 порядка меньше, чем ионов Са2+ Воздействие ионов цинка иллюстрирует табл 4 Главный эффект ионов цинка, как и ионов кальция, состоит в индукции латеральной агрегации (дозо-зависимые уменьшение Т1, увеличение Убу и Нтах), однако отличие состоит в том, что влияние ионов Ъх?* не обнаруживает тенденции к насыщаемости, и при наибольшей из исследованных концентраций максимальная величина оптической плотности сгустка превосходит уровень контроля почти в 10 раз

Таблица 4

Влияние ионов цинка на турбидиметрические параметры фибринооб-разования и фибринолиза

Пара- Концентрация Хп2+ в инкубационной среде, мМ

метр 0 0,01 0,025 0,05 0,1 0,25

Т1, с 168 123* 79* 46* 40* 8*

(3,1) (1.5) (1,5) (1,2) (1,2) (1,0)

Т2, с 68 78* 92* 127* 176* 318*

(2,2) (1,3) (1,4) (1,6) (2,7) (2,8)

Тбу, С 236 201* 171* 173* 216* 326*

(3,4) (2,6) (1,6) (2,5) (2,7) (4,6)

Т2+Т3,с 86 91 109* 158* 228* 412*

(2,0) (2,4) (2,5) (3,0) (4Д) (5,2)

Пуэ, с 157 146 174* 247* 368* не опр

(2,5) (2,5) (2,6) (4,0) (5,5)

0,054 0,108* 0,178* 0,208* 0,208* 0,208*

о е /мин (0,0066) (0,0042) (0,0035) (0,0024) (0,0020) (0,018)

ЧПуэ, 0,052 0,118* 0,232* 0,188* 0,124* не опр

о е /мин (0,0042) (0,0052) (0,0035) (0,0040) (0,0068)

Нтах, 0,040 0,069* 0,123* 0,170* 0,211* 0,335*

о е (0,0011) (0,0014) (0,0025) (0,0026) (0,0042) (0,012)

Примечание: в скобках ошибка средней, * - достоверные отличия от контрольного уровня

Кроме того, в отличие от действия Са2+, начиная с концентрации 0,025 мМ, гп2+ дозо-зависимо ингибирует фибринолиз (увеличение Т2+ТЗ и Т1уБ, снижение У1уэ) вплоть до почти полного блокирования в присутствии 0,25 мМ гп2+. Ионы №2+ и Сс12+ обладают таким же эффектом, но менее выраженным Следует отметить, что при концентрациях ионов в инкубационной среде 0,05 мМ для Zn2+ и №2+ и 0,25 мМ для С<12+ и выше формируются мягкие сгустки, тогда как при любых, даже самых высоких из исследованных концентраций Са2+ механическая прочность сгустков не

испытывает видимых изменений В результате экспериментов с одновременным использованием Zn2+ и Са2+ было установлено, что эффекты этих катионов аддитивны в отношении максимума оптической плотности геля. Это свидетельствует о том, что Zn2+ и Са2+ имеют различные места связывания с молекулой фибриногена.

Известно, что ионы Zn2+ способны связываться с фибриногеном и фибрином с высоким сродством (KD 18 и 8 мкМ, соответственно) (Marx G, 1988) Тем не менее, то, что изменения оптических свойств сгустка продолжают неудержимо нарастать, когда концентрация Zn2+ превышает константу диссоциации в 10-50 раз, а также то, что сходными эффектами обладают ионы Ni2+ и Cd2+, приводит к выводу, что действие всех трех ионов, по крайней мере, в больших концентрациях, неспецифично Таким образом, в присутствии Zn2+, Ni2+ и Cd2+ формируются фибриновые сгустки аномального строения Они состоят из очень толстых волокон, но обладают малой механической прочностью и гораздо хуже поддаются фиб-ринолизу Поскольку наименьшая эффективная концентрация Zn2+ находится в том же порядке, что и нормальная концентрация этого иона в крови здорового человека (17,1+1,8 мкМ), и учитывая широкое использование цинка в лекарственных препаратах, полученные результаты могут иметь медицинское значение.

Анализ результатов исследования влияния различных эффекторов на параметры фибринообразования/фибринолиза показывает, что турбиди-метрический способ регистрации этих процессов может быть полезным инструментом в научных исследованиях, поскольку позволяет быстро выявить широкий спектр различных воздействий В случаях изучения эффекторов, обладающих одновременно несколькими видами активности, либо смеси эффекторов, нередко оказывается возможным дифференцировать несколько эффектов по одной турбидиметрической кривой Анализ концентрационных и временных зависимостей, введение в систему предполагаемых ингибиторов дает дополнительную информацию, которая позволяет судить о механизмах выявленных эффектов

Для оценки возможности клинического применения турбидиметриче-ского метода вначале мы проанализировали варьирование и взаимосвязи между параметрами турбидиметрической кривой свертывания и фибрино-лиза Описательная статистика параметров здоровых людей, здоровых беременных женщин и пациентов с MC приведена в табл 5 Наиболее сильное варьирование наблюдалось для высоты пика Ншах и скоростных показателей Vsv и Vlys, поскольку эти параметры в большой мере зависят от концентраций фибриногена, размах колебаний которых достаточно велик Варьирование остальных показателей находилось в пределах 5—12%.

Таблица 5

Варьирование параметров турбидиметрической кривой у здоровых лиц [А), беременных женщин (В) и пациентов с МС (С) __

А(п=31) Средняя Медиана Минимум Максимум Стоткл Вариация

Т1, с 60,0 60,0 45,0 80,0 6,9 11,5%

Т2, с 65,7 66,0 51,0 75,0 5,6 8,5%

ТЗ, с 12,2 12,0 6,0 21,0 3,4 27,9%

Т4, с 49,8 48,0 40,0 60,0 5,9 11,8%

тбу, с 125,7 126,0 108,0 140,0 7,8 6Д%

Т2+Т3,с 78,1 78,0 69,0 87,0 5,1 6,5%

Нув, с 127,9 126,0 114,0 147,0 9,6 7,5%

Та11, с 187,7 186,0 171,0 207,0 9,3 5,0%

Я 0,989 0,980 0,880 1ДОО 0,082 8,2%

Узу,о е /мин 0,208 0,180 0,140 0,380 0,058 27,9%

У|у5,о е /мин 0,193 0,200 0,120 0,300 0,043 22,3%

Ншах,о е 0,102 0,094 0,062 0,170 0,027 26,5%

В(п=27)

Т1, с 45,0 45,0 36,0 64,0 5,9 13,1%

Т2, с 63,6 63,0 53,0 77,0 6,7 10,5%

Т3,с 8,6 8,0 6,0 16,0 2,3 26,7%

Т4, с 53,9 53,0 42,0 66,0 6,2 11,5%

Тэу, с 108,2 106,0 95,0 141,0 10,5 9,7%

Т2+ТЗ, с 72,1 71,0 61,0 91,0 7,8 10,8%

Т1у5, с 126,3 124,0 108,0 158,0 13,1 10,4%

ТаН, с 171,3 168,0 154,0 206,0 13,7 8,0%

Я 0,864 0,860 0,720 1,120 0,088 10,2%

Узу,о е /мин 0,317 0,324 0Д15 0,486 0,062 19,6%

У|у5,о е /мин 0,242 0,242 0,131 0,300 0,041 16,9%

Нтах,о е 0,140 0,139 0,098 0,204 0,023 16,4%

С (п=80) Размах (25-75%)

Т1, с 42,1 40,0 35,0 60,0 40,0-45,0

Т2, с 63,5 62,0 52,0 80,0 60,0 - 67,0

ТЗ, с 11,3 10,0 5,0 20,0 10,0- 13,0

Т4, с 56,7 55,0 35,0 72,0 52,0-60,0

Тэу, с 105,6 105,0 92,0 117,0 102,0-110,0

Т2+Т3,с 74,8 75,0 60,0 97,0 70,0-78,0

Т1уз, с 131,7 130,0 100,0 165,0 125,0-137,0

ТаИ, с 173,5 172,5 145,0 200,0 169,0-179,5

Я 0,806 0,800 0,690 1,010 0,760-0,840

Уву.о е /мин 0,305 0,300 0,096 0,540 ОД40- 0,360

У1уз,о е /мин ОД 10 0,204 0,108 0,360 0,168-0,252

Нтах,о е 0,129 0,127 0,048 0Д06 0,108-0,147

Корреляционный анализ первичных показателей, полученных из тур-бидиметрической кривой независимо (Tl, Т2, ТЗ, Т4, Hmax, Vsv и Vlys), выявляет большое число достоверных связей, большинство из которых легко объяснимы исходя из механизмов свертывания и фибринолиза. Так, во всех группах обследуемых время образования протофибрилл (Т1) отрицательно коррелирует со скоростью латеральной агрегации протофибрилл (Vsv) и высотой максимума (Ншах). Это естественно, поскольку, чем медленнее образуются протофибриллы, тем с меньшей скоростью они образуют волокна и тем меньшая высота пика будет достигнута до начала фибринолиза. Очень сильной оказывается корреляция продолжительности наблюдаемого лизиса Т4 с Ншах, тогда как его достоверная связь с концентрацией фибриногена отсутствует. Это показывает, что эффективность фибринолиза определяется, в первую очередь, структурой сгустка. Особенно сильно коррелируют значения скоростных показателей Vsv и Vlys с Hmax (i=0,8-0,9 в разных группах). Столь жесткие зависимости свидетельствуют о том, что определение скоростных параметров в клинических исследованиях является излишним.

Что же касается временных параметров, то в клинических исследованиях представляется необходимым применение расчетных показателей, которые характеризовали бы процесс с разных сторон и были бы менее зависимы друг от друга.Привлекательность турбидиметрического анализа состоит в том, что он позволяет оценить соотношение процессов свертывания и фибринолиза Это соотношение мы предлагаем количественно выразить через отношение (R) суммарного времени свертывания (Т1+Т2) к суммарному времени фибринолиза (Т2+ТЗ+Т4):

R = (Т1+Т2)/(Т2+Т3+Т4)

Из этого отношения видно, что его понижение будет свидетельствовать об относительном преобладании процессов свертывания, а повышение - о преобладании фибринолиза. Информацию об общем потенциале свертывания и фибринолиза, которые, в сущности, являются единым процессом, дает суммарное время Tall:

Tall = Т1+Т2+ТЗ+Т4

Максимальная оптическая плотность Ншах характеризует толщину фибриновых волокон, определяемую многими факторами, главнейшими (но не единственными) из которых являются концентрация фибриногена и эффективная концентрация тромбина

Корреляционные связи предложенных нами комплексных показателей, максимальной оптической плотности Ншах и концентрации фибриногена представлены в табл. 6. Закономерна достоверная корреляция Ншах с концентрацией фибриногена, как у здоровых лиц, так и у больных с МС,

поскольку фибриноген — главнейший фактор, определяющий величину Нтах Однако характерно, что эта связь весьма умеренной силы (г=0,37 у здоровых и г5- 0,46 у больных) Это означает, что на величину максимума оптической плотности сильно влияют и другие факторы, и этот показатель не может быть заменен определением фибриногена Во всех трех группах обследованных воспроизводится достоверная отрицательная корреляция Нтах и показателя соотношения свертывания/фибринолиза И. В большинстве случаев анализ корреляций не позволяет делать заключения о причинных связях В данном случае возможно предположить двустороннюю связь Важно, что как у здоровых, так и у больных, корреляция концентрации фибриногена и показателя II не просто недостоверна, а близка к нулю Таким образом, соотношение свертывания и фибринолиза, регистрируемое данным способом, никак не определяется этой концентрацией

Таблица 6

Корреляции между комплексными показателями турбидиметрической кривой свертывания и фибринолиза у здоровых лиц (А), беременных женщин (В) и пациентов с МС (С)

А (п=31) R Нтах Фибриноген

Tall г=-0,03 р=0,857 г=0,29 р=0,111 г=0,43 0,016

R г=-0,53 р=0,002 г=0,08 р=0,665

Ншах г=0,37 р=0,042

В (п=27)

Tall г=-0,20 р=0,317 г=0,03 р=0,877

R г=-0,38 р=0,05

С (п=80)

Tall rs=-0,43 р<0,001 rs=-0,03 р=0,825 rs=0,07 р=0,520

R rs=-0,58 р<0,001 rs=-0,17 р=0,447

Ншах rs=0,46 р<0,001

Примечание: приведены значения коэффициента корреляции Пирсона г (А, В ) и ранговый коэффициент корреляции Спирмена г5 (С), выделены значимые корреляции, прочерк нет данных

Приблизительный подход к клинической оценке получаемых данных отражен на рис 10 Уменьшение величины Tall — показатель активации

процесса; если при этом величина R не изменена, то можно говорить о том, что активированы как свертывание, так и фибр и пол из; при уменьшении R можно говорить о ги пер коагуляции, а при его увеличении — о ги-перфибринолизе. Если же время Tall увеличено, то это свидетельствует об ингибировании фибринообразования/фибринолиза; при этом сдвиг отношения R в сторону повышения будет свидетельствовать о гипокоагуляции, а в сторону понижения — о гилофибринолизе, В реальных условиях необходимо также учитывать концентрацию фибриногена. Если она существенно отклоняется как в сторону повышения, так и понижения, то это будет сказываться на продолжительности периода Tall.

1-Я: liO 1.1В 1.10

t£ 1.05 1.00 oes o.oo

IOS 170 ITS IflO 1ñ5 1« 195 200 205 210 ТЯ

Рис. 10. Диаграмма для ориентировочной комплексной оценки турбидиметрического исследования фибринообразования и фибринолиза.

По оси X: общее время процесса свертыпания и фибринолиза Tall; по оси Y: показатель соотношении свертывания и фибринолиза R=Tsv/Tlys; жирные линии: средине значения для группы здоровых лиц.

Таким образом, выбранные нами расчетные показатели Tall и R, а также показатель максимальной оптической плотности Ншах можно считать наиболее удобными для ориентировочной клинической оценки процессов свертывания и фибринолиза. Для более детального представления имеет смысл анализировать частные временные показатели. Определение концентрации фибриногена не заменяет собой данного исследования, но играет дополняющую роль и позволяет делать более уверенные заключения.

Сравнительные результаты турбидиметрического исследования группы беременных женщин и здоровых лиц представлены в табл. 7. Приведенные данные показывают достоверные изменения главных показателей беременных женщин по сравнению с контрольной группой здоровых небеременных лиц — укорочение общего времени процесса Tall, несмотря на

РйСотйиие ТяЛ ra. R

Норм | о ВЙЧЬ ДИ |

Ги гмрфмбрмнол иа а о о о о 1овьш1*яие ° ____________^ Гкпоюшгуляьда о о о о о Снижение

ютенциала " ^ а a a <i с Гилеркоягуляция ° 0 потенциала о ° о о ° ГиПРфИбр*НОЛИЭ

значительное возрастание Ншах, и снижение показателя соотношения свертывания/фибринолиза R Общая динамика данных сдвигов (см рис 10 и 11С) позволяет заключить, что имеются признаки гиперкоагуляции Все же при более детальном анализе рассеяния наблюдений по показателям R и Tall, можно увидеть, что степень уменьшения R не столь выражена, как степень укорочения Tall Большинство наблюдений по показателю R укладывается в 95% доверительный интервал (ДИ) условной нормы, в то время как по показателю Tall большинство наблюдений выходит за пределы 95% ДИ Поэтому правильнее будет заключить, что у большинства беременных женщин имеются признаки повышения потенциала и свертывания, и фибринолиза, хотя потенциал свертывания несколько преобладает Данные, представленные на рис 11С, свидетельствуют, что в исследованной группе беременных имеется несколько наблюдений, далеко отклоняющихся от основной группы в сторону гипофибринолиза Ин-гибирование фибринолитической активности при беременности характерно для гестоза (Репина М А и соавт, 1998) Однако оценка прогностического значения выявленных изменений не входила в задачи настоящей работы

Таблица 7

Сравнение основных параметров турбидиметрической кривой свертывания и фибринолиза у здоровых людей (п = 31) и беременных женщин (п = 27)

Парам ет Среднее значение у здоровых лиц Среднее значение у беременных F(P) Достоверность различий

с 187,7 (168,5-206,9) 171,3 (146,2-196,4) 1,701 (р=0,164) р< 0,0001 ***

R 0,989 (0,827- 1,15) 0,864 (0,686-1,04) 1,215 (р=0,603) р< 0,0001 ***

Нтах , ое 0,102 (0,156-0,048) 0,140 (0,186-0,094) 1,351 (р=0,451) р< 0,0001 ***

Примечание: в скобках приведен 95% ДИ, достоверность отличий р оценивали с помощью t-теста Стьюдента

Параметры фибринообразования/фибринолиза больных с МС представлены в табл 8 Анализ этих данных позволяет сделать вывод о том, что у пациентов с МС отмечаются достоверные сдвиги средних значений основных показателей, характерные для гиперкоагуляции- уменьшение показателя соотношения свертывания/фибринолиза R при возрастании Ншах и укорочении общего времени Tall Представлению о гиперкоагуляции соответствует и выраженное укорочение лаг-периода свертывания Т1.

Наиболее вероятной причиной повышения максимума оптической плотности следует признать достоверно более высокую, в сравнении со здоровыми лицами, концентрацию фибриногена

Рассеяние Tall vs R

1 з 1 2

OS

о в О 7

О 9

ое О 7

------<р о ° ч 1 ' 1 " 8 О ;

* ° °о i о °° о' 1 ' < г

______ о о •% О в 1 " €D О в ° «ъ о а О о

170 160

о

о о о° в °

о g* °

170 1вО

с

Рис 11 Диаграммы рассеяния группы здоровых лиц (А), пациентов с МС (В) и беременных женщин (С) по показателям Tall и R

По оси X общее время процесса свертывания и фибринолиза Tall, по оси Y показатель соотношения свертывания и фибричолиза R=Tsv/Tlys, жирные линии средние значения, пунктирные линии 95% ДИ для здоровых людей

Анализ диаграммы рассеяния наблюдений по показателям Tall и R (рис 11 В) выявляет значительный разброс по показателю Tall у большой группы пациентов общее время выходит далеко за предел 95% ДИ для условной нормы в сторону укорочения, тогда как у также достаточно многочисленной группы этот показатель находится выше среднего значения условной нормы Tall - комплексный показатель, который образуется путем суммирования частных времен Т1-Т4 Именно время наблюдаемого лизиса Т4 демонстрирует самый большой размах значений в группе пациентов с МС минимальное и максимальное значение составляет 35 и 72 с, тогда как в группе здоровых лиц этот размах составляет 40 — 60 с Соответственно этому, и суммарное время фибринолиза Tlys также имеет больший, чем у здоровых лиц, разброс значений (табл 5А и С) Таким образом, если признаки гиперкоагуляции выявляются у подавляющего

большинства пациентов с МС, то по показателям активности фибринолиза исследованная группа неоднородна в то время как у одной части пациентов отмечаются явные признаки ингибирования фибринолиза, у другой части значимые изменения отсутствуют и даже существует тенденция к его активации Одной из основных причин повышенного риска тромбозов и атеросклероза у больных с МС является недостаточность фибринолиза, обусловленная высоким уровнем ИАП-1 (Рез1а А, 1999) Однако обнаружить влияние ИАП-1 в данной экспериментальной системе маловероятно, поскольку в ней активация плазминогена производится с помощью СК.

Таблица 8

Сравнение основных параметров турбидиметрической кривой свертывания и фибринолиза у здоровых людей (п = 31) и пациентов с МС (п = 80)

Параметр Среднее значение у здоровых лиц Среднее значение у больных с МС Достоверность различий

ТаН, с 187,7 ± 1,66 (168,5-206,9) 173,5 ± 1,20 р< 0,0001 ***

Я 0,989 ± 0,0147 (0,827- 1,15) 0,806 ±0,0074 р< 0,0001 ***

Нтах, о е 0,102 ± 0,0048 (0,048 + 0,156) 0,129 + 0,0004 (0,67-0,191) р< 0,0001 ***

Фибриноген, г/л 2,54 + 0,126 (1,16-3,92) 2,94 + 0,092 (1,30-4,58) р = 0,013 *

Прнмечаиие: данные представлены как среднее + стандартная ошибка, в скобках приведен 95% ДИ для показателей, имеющих нормальное распределение, достоверность различий р оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни

Причина гиперкоагуляции, выявленной при турбидиметрическом анализе у пациентов с МС не совсем понятна Конечно, повышенная по сравнению со здоровыми лицами оптическая плотность сгустка Нтах является одним из факторов, смещающих отношение II в сторону преобладания свертывания (^=-0,58, р<0,001, табл 6С), и, в свою очередь, Нтах прямо коррелирует с концентрацией фибриногена (г8=0,46, р<0,001), которая у больных с МС выше, чем в группе здоровых лиц Однако прямая корреляция концентрации фибриногена и отношения Я не выявлена, а степень повышения фибриногена у больных с МС невелика, и его средняя концентрация у больных (2,94 г/л) укладывается в границы общепринятой нормы Причины выявленных нарушений можно отчасти прояснить, анализируя результаты дополнительных биохимических исследований Среди них наибольшее число достоверных корреляций у пациентов с МС приходится на СРБ и ЛВП. СРБ, как и фибриноген, является белком острой фазы, и

между ними отмечается достоверная положительная корреляция (г5=0,354) Однако фибриноген дает гораздо меньшее число достоверных корреляций с показателями турбидиметрической кривой, чем СРБ. Чем выше уровень СРБ, тем выше Ншах (г5=0,445), больше Т1уз (г5=0,317), особенно время наблюдаемого лизиса Т4 (гх=0,358) и тем более смещено в сторону свертывания отношение Я (г5=-0,284) Учитывая, что уровень СРБ у 2/3 пациентов оказался существенно выше нормы, можно предположить, что он вносит свой вклад в формирование выявленных нарушений свертывания и фибринолиза

Концентрация ЛВП обнаруживает противоположные корреляции При высоком уровне ЛВП отмечается более низкий Ншах (г8=-0,258), укорочение времени фибринолиза Т1уэ (г5=-0,269) и времени наблюдаемого лизиса Т4 (г5=-0,272), удлинение Т1 (г5=0,270), все это приводит к смещению отношения II в сторону преобладания фибринолиза (г5=0,361) Такие же по характеру корреляции проявляются и в группе здоровых лиц Если учесть, что средний уровень ЛВП у пациентов с МС был на 40% ниже, чем у здоровых лиц, то можно допустить, что дефицит этих липопротеинов у больных также способствует развитию гиперкоагуляции и гипофибринолгаа.

Таким образом, возможным объяснением выявляемых турбидиметри-ческим методом гиперкоагуляции и гнпофибринолиза у пациентов с МС является измененный белково-липидный состав крови

Выборки пациентов с МС и здоровых людей были проанализированы по полиморфному гену РСА (Т312А) и распределены в зависимости от генотипа (табл 9)

Таблица 9

Частоты генотипов и аллелей РСА(Т312А) в группах пациентов с МС (п=74) и здоровых лиц (п=32)

Генотип/ аллель Пациенты с МС Здоровые лица Достоверность отличий (х2 Пирсона)

п И±8„ п Ь±8ь

ТТ 37 0,50 ± 0,058 21 0,66 ± 0,084 8,88

ТА 29 0,39 ± 0,057 8 0,25 ± 0,077

АА 8 0,11 ±0,036 3 0,09 ± 0,052

Т 103 0,70 ± 0,076 50 0,78 ±0,103 6,30

А 45 0,30 ±0,076 14 0,22 ±0,103

Критическое значение критерия х2 при сравнении частот генотипов (число степеней свободы=2, р=0,05) 5,99

при сравнении частот аллелей (число степеней свободы=1, р=0,05) 3,84

Примечание: п - количество, Ь - частота, 5ь - ошибка частоты

Качественная структура выборки больных с МС была такой же, как и здоровых лиц, однако гомозиготы по аллели дикого типа ТТ встречались реже, а гетерозиготы ТА и гомозиготы по мутантной аллели АА - несколько чаще Были выявлены достоверные отличия в распределении частот аллелей гена FGA в изучаемых группах частота мутантной аллели А повышена в группе пациентов с МС по сравнению с группой здоровых лиц Также достоверно отличались распределения частот генотипов FGA в группах пациентов с МС и здоровых лиц Непараметрический однофак-торный дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса не выявил достоверных отличий ни одного из показателей турбидиметрической кривой фибрино-образования и фибринолиза в зависимости от генотипа FGA (Т312А) как среди здоровых лиц, так и среди пациентов с МС. При этом следует отметить, что сравнение показателей здоровых и больных людей с одинаковым генотипом выявляет те же достоверные различия по показателям Tall и R, которые были обнаружены в пределах общей выборки Не выявлено достоверных отличий и в концентрации фибриногена в зависимости от генотипа FGA (ТЗ12А) в обеих исследованных группах

Известно, что в гомозиготном по мутантной аллели фибрине АА образуется большее количество поперечных сшивок между а-цепями, с чем ассоциируется большая ригидность таких сгустков (Standeven К et al., 2003) Поскольку стабилизация фибринового сгустка под воздействием фХШ является медленным процессом, мы оценили относительные размеры фибршювых волокон через 20 мин после индукции фибринообразова-ния тромбином в системе, не содержащей СК Установлено, что отношение масса/длина фибриновых волокон также не проявляет зависимости от генотипа FGA (Т312А) Таким образом, наши исследования не позволяют связать нарушения фибринообразования и фибринолиза, выявленные у пациентов с МС, с тем или иным вариантом генотипа FGA (Т312А), несмотря на достоверные отличия в распределении генотипов у здоровых и больных людей По литературным данным, мутантный фибриноген АА образует более толстые фибриновые волокна в экспериментальной системе, включающей очищенные фибриноген и фХШ Это позволяет предположить, что в плазме крови присутствуют факторы, нивелирующие воздействия мутантного генотипа на структуру и свойства фибринового сгустка. Возможно, что эти факторы являются белковыми продуктами других генов, и описанная ассоциация генетического полиморфизма FGA (ТЗ 12А) с тромбоэмболическими осложнениями (Carter AM. et al, 2000, 2001) проявляется лишь во взаимодействии с полиморфизмом по другим генам (Lim В С et al, 2003)

Турбидиметрический анализ фибринообразования и фибринолиза у больных острыми лейкозами выполнен нами в динамике их лечения методом аллогенной трансплантации костного мозга Комплексное исследование пациентов проводили четырежды при поступлении больного в стационар, после проведения кондиционирования (на максимуме иммуносу-прессии), на 6 или 14 день восстановительного периода и в конце восстановительного периода (27 или 30 день). Все пациенты поступили в стационар в фазе ремиссии основного заболевания. Показатели, как стандартной коагулограммы, так и турбидиметрического исследования, не выявляли существенных отклонений от нормальных значений

Динамика коагулологического статуса пациентов отличалась большим разнообразием, зачастую различной направленностью и отсутствием единых временных закономерностей Наибольшую опасность для пациентов в этот период представляет развитие синдрома диссеминированного внут-рисосудистого свертывания (ДВС). Вероятность его развития в данной ситуации чрезвычайно высока в связи с целым рядом суммирующихся факторов (ВагЬш Т е1 а1, 1993) (1) основное заболевание, (2) цитостати-ческая терапия, (3) присоединение тяжелых инфекций Комплекс стандартных клинико-лабораторных признаков, указывающих на тромбине-мию с последующим потреблением фибриногена, развитием гипокоагуля-ции, активацией фибринолитической активности и потреблением плазми-ногена, позволил нам диагностировать развитие хронического синдрома ДВС у 5 пациентов Из них у 4 отчетливые признаки II стадии синдрома ДВС (ДВС И) появились на 14 день, а у одного - в конце восстановительного периода Сведения о результатах турбидиметрического анализа этих пациентов в сопоставлении со стадиями синдрома ДВС приведены в табл 10 За существенные отклонения показателей принимались лишь те из них, которые выходили за пределы 95% ДИ условной нормы

На стадии ДВС I турбидиметрическое исследование не дает преимуществ по сравнению со стандартными методами: умеренная гиперкоагуляция отмечена у троих пациентов, что соответствует укорочению тром-бинового времени и АЧТВ у тех же пациентов Эти изменения нельзя признать специфичными, поскольку подобные сдвиги отмечены и у некоторых пациентов с благоприятным последующим течением восстановительного периода Турбидиметрические данные, касающиеся ДВС II, очень характерны: это отчетливые признаки активации фибринолиза, зарегистрированные у 4 пациентов из 5 При этом активация фибринолиза может находиться в различных сочетаниях с показателями свертывания коагуляция может быть нормальной (1 пациент), ускоренной (т е активированы оба процесса -1 пациент), или же замедленной (2 пациента) Последнее

сочетание, видимо, наиболее характерно, поскольку потребление фибриногена, ведущее к гипокоагуляции, сочетается с реактивней активацией фибринолитической системы.

Таблица 10

Данные турбидиметрического анализа фибринообразования и фибри-нолиза в сопоставлении со стадиями синдрома ДВС

Стадия Признаки Число наблюдений

ДВС I Гиперкоагуляция 3

(п=5, ретроспективно) Ингибирование фибринообразова-ния/фибринолиза 1

Т Ншах 3

нормальный Ншах 2

ДВС II Гиперкоагуляция 1

(п=5) Гипокоагуляция + гиперфибринолиз 2

Гиперфибринолиз 1

Активация фибринообразова-ния/фибринолиза 1

1 Нтах 3

нормальный Нтах 2

ДВС III Гипокоагуляция + гиперфибринолиз 1

(п=3) Ингибирование фибринообразова-ния/фибринолиза 2

1 Нтах 3

На стадии ДВС III у всех обследованных турбидиметрическим методом пациентов зарегистрирована гипокоагуляция, что соответствует данным коагулограммы, в двух случаях она сочеталась с угнетением также и фибринолиза, а в одном - с его активацией Следует отметить, что эта активация была лишь относительной — по сравнению с крайней степенью гипокоагуляции Наиболее вероятной причиной угнетения фибринообра-зования/фибринолиза на стадии ДВС III является истощение фибриногена и плазминогена; концентрация последнего у двоих пациентов была резко снижена, а у одного была на нижней границе 95% ДИ Следует остановиться на значении показателя Ншах в данной группе пациентов Здесь, как ни в одной другой группе обследуемых лиц, наблюдалось особенно жесткое соответствие этого показателя концентрации фибриногена Именно концентрация фибриногена у данных больных подвержена наиболее широким вариациям, и в определенных ситуациях она определяет весь характер регистрируемого процесса Учитывая то, что в диагностике ДВС особую роль играет оценка именно динамики показателей, по изменению Ншах можно уверенно судить о динамике концентрации фибриногена

Таким образом, изменения турбидиметрической кривой в процессе развития ДВС носят фазный характер, согласующийся с представлениями о патогенезе этого синдрома, выявляются фазы гипер- и гипокоагуляции, активация фибринолиза, а также истощение фибриногена и плазминогена В фазе ДВС I метод турбидиметрического анализа позволяет выявить гиперкоагуляцию, но не обладает преимуществами по сравнению со стандартной коагулограммой В фазе ДВС II турбидиметрический метод обнаруживает активацию фибринолиза, когда с помощью использованного нами комплекса стандартных методов она еще не выявляется Наконец, наряду с оценкой свертывания и фибринолиза, метод турбидиметрического анализа позволяет адекватно оценивать динамику концентрации фибриногена

ВЫВОДЫ

1. Оптимизированная экспериментальная система одновременной регистрации фибринообразования и фибринолиза позволяет оценить кинетику фибринообразования, ход фибринолиза, толщину волокон фибрино-вого сгустка, дать количественную оценку соотношения процессов свертывания и фибринолиза, а также оценить их потенциал.

2 Зависимость времени сохранения максимума оптической плотности от концентрации стрептокиназы в экспериментальной системе имеет четко выраженный минимум, что дает возможность оценки функциональной активности препаратов стрептокиназы

3 Обнаружен протеолиз стрептокиназы цистеиновыми катепсинами, что приводит к снижению, а затем и к полной потере плазминоген-активирующей способности белка

4. Выявлена активация фибринолиза экстрактом Laminaria digitata, что выражается в дозо-зависимом укорочении лаг-периода и общего времени фибринолиза.

5 В яде Vípera mkolskii выявлены два различных компонента, модулирующих фибринообразование и фибринолиз, один из них обладает фиб-риногенолитическим, а другой - антифибринолитическим действием

6 Ионы цинка, никеля и кадмия в микромолярных концентрациях являются индукторами агрегации протофибрилл, что приводит к формированию утолщенных фибриновых волокон, резистентных к фибринолизу

7 Наиболее информативными комплексными показателями турбидиметрической кривой фибринообразования и фибринолиза в клинических исследованиях являются общее время процесса Tall, соотношение времен фибринообразования и фибринолиза R и высота максимума оптической плотности Нтах

8 По данным турбидиметрического анализа фибринообразования -фибринолиза нормальная беременность характеризуется увеличением потенциала обеих систем с некоторым преобладанием свертывания.

9. У подавляющего большинства (81%) пациентов с метаболическим синдромом выявлена гиперкоагуляция на этапе фибринообразования, не связанная с повышенной концентрацией фибриногена, в то время как ин-гибирование фибринолиза отмечено лишь у 14% больных Наиболее вероятной причиной гиперкоагуляции при данной патологии является измененный белково-липиднын состав плазмы крови, в частности, повышенная концентрация С-реактивного белка и пониженная концентрация липопро-теинов высокой плотности

10 Распределения генотипов FGA (Т312А) в группах пациентов с метаболическим синдромом и здоровых людей достоверно различаются, однако не выявлено достоверных связей показателей турбидиметрического исследования фибринообразования — фибринолиза с генотипом FGA (Т312А)

11 Изменения турбндиметрической кривой в процессе развития дис-семинированного внутрисосудистого свертывания у пациентов с острыми лейкозами носят фазный характер, согласующийся с представлениями о патогенезе этого синдрома, поэтому предложенный вариант турбидиметрического анализа фибринообразования и фибринолиза может быть использован в качестве экспресс-метода для динамического наблюдения за пациентами с угрозой развития синдрома ДВС

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 В предложенной экспериментальной системе регистрации тромбин-индуцированного фибринообразования с последующим фибринолизом, индуцированным стрептокиназой, оптимальной концентрацией стрепто-киназы, минимизирующей ее влияние на процесс фибринолиза, является 10 МЕ/мл при предварительной инкубации с плазмой в течение 1 минуты. Наибольшей информативностью обладают комплексные показатели - общее время процесса Tall и соотношение времен фибринообразования и фибринолиза R, а также высота максимума оптической плотности Нтах

2 Предложенный вариант турбидиметрического анализа фибринообразования и фибринолиза удобен в экспериментальных исследованиях для быстрого скрининга предполагаемых эффекторов этих процессов В случаях изучения эффекторов, обладающих одновременно несколькими видами активности, либо смеси эффекторов, нередко оказывается возможным дифференцировать несколько эффектов по одной турбидиметрической кривой

3. Турбидиметрический анализ фибринообразования и фибринолиза может применяться в клинической практике для диагностики нарушений заключительных стадий свертывания крови и фибринолиза, особенно для динамического наблюдения пациентов с нестабильным гемостазом Простота и быстрота выполнения анализа позволяет использовать его для экспресс-диагностики

4 В условиях клинической лаборатории предложенный вариант турби-диметрического анализа фибринообразования и фибринолиза может быть автоматизирован, а необходимая для этого стандартизация препаратов стрептокиназы может быть выполнена путем тестирования ее функциональной активности описанным в работе способом

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Орловский П И, Кадинская M И, Гриценко В В , Вавилова Т В , Новиков В К , Курапеев И С , Субботина Т.Ф Коррекция гемореологических показателей у больных с протезированием клапанов сердца в отдаленные сроки после операции // Конференция по проблемам внезапной смерти 2527 мая 1998/Тез докл -СПб, 1998 - С 142-143

2 Орловский П И , Кадинская M И , Гриценко В В , Вавилова Т В , Новиков В К , Курапеев И С , Субботина Т Ф Диагностика и лечение дисбаланса в системе гемостаза у больных с искусственными клапанами сердца в отдаленные сроки наблюдения // Вторая ежегодная сессия Научного центра сердечно-сосудистой хирургии им А H Бакулева с Всероссийской конференцией молодых ученых 17-19 мая 1998 / Тез докл - Москва, 1998 -С 95

3. Субботина Т.Ф , Гриценко В В , Орловский П И, Фаенкова В П, Кадинская M И , Вавилова Т В Турбидиметрический метод одновременной регистрации свертывания крови и фибринолиза // Фундаментальные и прикладные аспекты современной биохимии - Т 1 / Труды научной конференции, посвященной 100-летию каф биохимии СПбГМУ им. акад И П. Павлова 15-17 октября 1998 - СПб, 1998 - С. 118-123

4. Субботина Т.Ф, Гриценко В В , Орловский П И, Фаенкова В.П, Кадинская M И, Вавилова Т В. Оценка параметров гемостаза у больных с механическими искусственными клапанами сердца турбидиметрическим экспресс методом // Фундаментальные и прикладные аспекты современной биохимии - Т. 2 / Труды научной конференции, посвященной 100-летию каф биохимии СПбГМУ им. акад. И П Павлова 15-17 октября 1998 - СПб, 1998 - С. 507-511.

5 Субботина Т Ф , Фаенкова В П, Щербак И Г. Деградация стрепто-киназы катепсином В в почках человека // Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения / Тез докл науч конф, поев. 200-летию ВмедА -СПб, 1999 - С 473-474

6 Орловский П И , Давыденко В В , Коваленко А.Н , Кадинская М И, Вавилова Т В, Субботина Т Ф Оценка коагуляционно-фибринолитических свойств крови у больных с различными конструкциями искусственных клапанов сердца в отдаленные сроки наблюдения // Актуальные проблемы сердечно-сосудистой, легочной и абдоминальной хирургии / Сб. трудов науч конф , поев 95-летию со дня рожд акад РАМН Ф Г. Углова. - СПб, изд-во СПбГМУ, 1999 - С 111-112

7 Субботина Т Ф , Фаенкова В П , Кадинская М.И , Вавилова Т В , Полежаев Д А Возможности турбидиметрического экспресс-метода в оценке дисбаланса системы гемостаза у больных с искусственными клапанами сердца // Актуальные проблемы сердечно-сосудистой, легочной и абдоминальной хирургии / Сб трудов науч конф , поев 95-летию со дня рожд акад РАМН Ф Г. Углова - СПб, изд-во СПбГМУ, 1999. - С. 143 -144

8. Щербак И Г, Субботина Т Ф , Фаенкова В.П Влияние катепсина В почек человека на плазминоген-активирующую способность стрептокина-зы // Научное наследие акад И Н Буланкина и его развитие в совр биохимии / Труды науч конф, поев 100-летию со дня рожд акад И Н Буланкина, 16-17 янв 2001 г - Харьков, 2001 -С 100-101.

9 Вавилова Т.В , Орловский П И , Гриценко В В , Мочалов О Ю , Субботина Т Ф., Эмануэль В J1 Состояние системы гемостаза у больных с искусственными клапанами сердца в отдаленные сроки наблюдения // Актуальные вопросы грудной, сердечно-сосудистой и абдоминальной хирургии -С-Пб, изд-во СПбГМУ, 2001 -С 34-35

10 Щербак И Г, Субботина Т Ф , Фаенкова В П, Рюмина Е В Турби-диметрический анализ полимеризации фибрина в плазме крови // Вопросы медицинской химии -2001 -Т 7,№1.-С 80-90

11 Субботина Т Ф Влияние физической нагрузки на состояние системы гемостаза // Ученые записки Санкт-Петербургского медицинского университета им. акад И П Павлова - 2002, Т 9, № 4 - С. 53-57

12 Fayenkova V Р , Subbotina Т F, Galebskaya L V Cathepsin В catalyzed degradation of the streptokinase preparation // International conference Biocatalysis-2002. Fundaments & Applications, June, 22 - 27 / Department of Chemical Enzymology -Moscow, 2002 -P 131.

13 Фаенкова В П, Субботина Т Ф , Галебская JI В Распад стрептоки-назы под действием почечного катепсина В // Вестник Московского Университета Химия - 2003. - Т 44, № 1. - С. 40-44.

14 Полежаев Д А, Гриценко В В., Вавилова Т.В , Орловский П И , Гриненко А Я , Евдокимов С В , Субботина Т Ф , Кадинская М И., Лобачевская Т В , Галилеева А Н Профилактика тромбозов и тромбоэмболиче-ских осложнений у больных с отечественными механическими искусственными клапанами сердца «Мединж-2» в отдаленные сроки наблюдения //Вестник хирургии имени И И Грекова -2003 -Т. 162, №6 -С. 51-56

15 Субботина Т.Ф , Галебская Л В , Щербак И Г Влияние двухвалентных катионов на образование и лизис фибринового сгустка // Биомедицинская химия -2005 -Т 51,№1 -С 60-65.

16 Субботина Т.Ф , Закуцкий А Н Аргинин в эндокринной системе // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. — 2005 -Т. 12,№ 1 -С 7-12

17. Субботина ТФ, Закуцкий АН Транспорт L-аргинина // Ученые записки Санкт-Петербургского медицинского университета им акад. И П Павлова - 2005 - Т 12, № 4 - С 5-9

18 Закуцкий АН, Боровец СЮ, Субботина ТФ Биохимические и клинические аспекты влияния L-аргинина на функциональную активность мужской половой системы // Ученые записки Санкт-Петербургского медицинского университета им акад ИП Павлова — 2005.-Т 12, №4 — С. 13-16

19. Субботина ТФ. Сорбция плазминогена на фибрине как одно из условий эффективного фибринолиза // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии - 2006, Jfe 1. - С 24-29

20. Субботина Т Ф , Щербак И Г, Фаенкова В П Способ выделения цистеиновых катепсинов из экстрактов тканей // Патент на изобретение № 2126684, приоритет от 15 11 1995 - опубл 27 02 1999, бюл № 6

Лицензия ИД № 00597 от 15 12 99 Подписано в печать 27 06 07 Уел печ л 2,75 Формат 60x84 1/16 Печать офсетная Тираж 100 экз Заказ 372/07 197022, Санкг - Петербург, ул Л Толстого 6-8 Издательство СПбГМУ

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Субботина, Татьяна Федоровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Фибринообразование

1.1.1. Строение и свойства фибриногена человека

1.1.2. Механизм тромбин-индуцированного фибринообразования

1.1.3. Стабилизация фибринового сгустка

1.2. Фибринолиз

1.2.1. Система фибринолиза и ее компоненты

1.2.2. Характеристика тАП-зависимого фибринолиза

1.2.3. Особенности фибринолиза, индуцируемого 29 стрептокиназой

1.3. Факторы, влияющие на фибринообразование

1.3.1. Условия среды и эндогенные эффекторы

1.3.2. Экзогенные эффекторы

1.4. Факторы, влияющие на фибринолиз

1.5. Нарушения системы гемостаза

1.5.1. Нарушения гемостаза при дисфибриногенемиях

1.5.2. Нарушения гемостаза при метаболическом синдроме

1.5.3. Нарушения гемостаза при острых лейкозах

1.6. Методы изучения свойств фибрина и динамики свертывания и фибринолиза

1.6.1. Оценка свойств фибринового сгустка

1.6.2. Оценка динамики свертывания

1.6.3. Оценка эффективности фибринолиза

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Источник материала для исследований

2.2. Использованная аппаратура

2.3. Реагенты

2.4. Турбидиметрический анализ свертывания

2.5. Турбидиметрический анализ свертывания и фибринолиза

2.6. Оценка размеров фибриновых волокон

2.7. Определение концентрации плазминогена в плазме

2.8. Анализ полиморфизма гена фибриногена

2.9. Определение концентрации фибриногена в плазме

2.10. Регистрация активности ферментов

2.10.1. Регистрация фибринолитической активности коллагеназы и змеиных ядов

2.10.2. Регистрация активности цистеиновых катепсинов

2.11. Обработка стрептокиназы препаратом цистеиновых катепсинов

2.12. Электрофорез в полиакриламидном геле

2.13. Фракционирование яда Vipera nikolskii

2.14. Статистические методы

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Оптимизация экспериментальной системы

3.1.1. Турбидиметрическая регистрация процесса свертывания

3.1.2. Одновременная турбидиметрическая регистрация процессов свертывания и фибринолиза

3.2. Действие эффекторов фибринообразования и фибринолиза по данным турбидиметрического анализа

3.2.1. Влияние свободных аминокислот на фибринообразование и фибринолиз

3.2.2. Влияние гепарина и экстракта Laminaria digitata на фибринообразование и фибринолиз

3.2.3. Влияние протеиназ - коллагеназы и цистеиновых катепсинов на компоненты системы фибринообразования и фибринолиза

3.2.4. Влияние ядов змей и их компонентов на фибринообразование и фибринолиз

3.2.5. Влияние катионов двухвалентных металлов на фибринообразование и фибринолиз

3.3. Применение турбидиметрического анализа фибринообразования и фибринолиза в клинических исследованиях

3.3.1. Варьирование параметров турбидиметрической кривой свертывания и фибринолиза

3.3.2. Взаимосвязь между параметрами турбидиметрической кривой в исследуемых группах

3.3.3. Фибринообразование и фибринолиз при нормальной беременности

3.3.4. Фибринообразование и фибринолиз при метаболическом синдроме

3.3.5. Влияние генотипа FGA (Т312А) на фибринообразование и фибринолиз у здоровых лиц и пациентов с метаболическим синдромом

3.3.6. Турбидиметрический анализ фибринообразования и фибринолиза в динамическом наблюдении больных острыми лейкозами 153 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ динамики фибринообразования и фибринолиза"

Актуальность темы. Система гемостаза — это совокупность белковых и небелковых факторов, которые контролируют текучесть крови при физиологических условиях и предотвращают потерю крови при нарушении целостности стенок сосудов, что обеспечивается за счет равновесия про- и антикоагулянтных процессов. Одним из наиболее важных событий в процессе гемостаза является фибринообразование - конечный этап всего каскада свертывания крови. Не менее важным является и процесс лизиса фибрина (фибринолиз) под действием плазмина, который обеспечивает восстановление проходимости сосуда и локализацию процессов свертывания. Свойства фибринового сгустка, его молекулярная архитектура является одним из важнейших факторов, определяющих эффективность фибринолиза [76].

Нарушения гемостаза часто встречаются в клинической практике, и их диагностика является чрезвычайно актуальной проблемой [9]. Трудности диагностики нарушений системы гемостаза обусловлены многочисленностью и многообразием ее компонентов, а также их сложными взаимосвязями. На сегодняшний день не существует общепринятых методов, позволяющих оценить свойства фибринового сгустка и его доступность лизису плазмином. В научных исследованиях используются методы электронной и трехмерной лазерной микроскопии [37, 48, 78, 273], тромбоэластографии [29, 116, 132, 284] и методы определения проницаемости сгустка для жидкости [27, 47, 78, 280]. Из числа этих методов только тромбоэластография нашла некоторое применение в клинической практике, хотя и обладает рядом недостатков [24, 190, 226], остальные же не могут быть использованы из-за их технической сложности.

К настоящему времени функциональная оценка системы фибринолиза также остается нерешенной проблемой. Основным, если не единственным, методом функциональной оценки фибринолиза в клинических и даже в научных исследованиях является время лизиса эуглобулинового сгустка. Однако тест эуглобулинового лизиса не учитывает влияния ингибиторов фибринолиза, не дает никаких сведений о свойствах самого фибринового сгустка с точки его резистентности фибринолизу [113, 157], а его результаты в сильной степени зависят от концентрации фибриногена [4, 89].

Одним из возможных методов, который позволяет решить эти задачи и при этом является простым и доступным, является турбидиметрический метод, основанный на регистрации изменений оптической плотности плазмы в процессе образования фибриновых волокон под действием тромбина и их лизиса под действием плазмина [16, 64, 77, 265]. Турбидиметрический метод в настоящее время имеет ограниченное применение в научных исследованиях, но, несмотря на техническую простоту, почти не используется в клинических целях. Это связано с трудностями интерпретации кривой изменений оптической плотности, отсутствием общепринятого способа расчета показателей, недостаточным представлением об их взаимосвязи, информативности и диагностической значимости.

Проведенные исследования являются составной частью работ, выполняемых в ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова Федерального агентства по здравоохранению^ социальному развитию» по теме «Стромально-сосудистые взаимоотношения в органах экспериментальных животных и человека при повреждении, хроническом воспалении и опухолевом росте», фрагменту Д.01.002 «Исследование механизма и функциональных последствий взаимодействия клеточных и плазменных компонентов крови» (2001-2005 г.г.), а также в рамках инициативной темы «Поиск эндогенных регуляторов защитных систем крови» (2006-2007 г.г.).

Целью данного исследования является разработка условий применения турбидиметрического метода одновременной регистрации фибринообразования и фибринолиза для изучения эффекторов системы гемостаза и клинического использования.

Задачи исследования:

1. Оптимизировать экспериментальную систему, позволяющую одновременно оценивать кинетику фибринообразования и фибринолиза;

2. Проанализировать воздействие ряда экзогенных и эндогенных факторов на структурные особенности фибриновых сгустков и кинетику их образования и лизиса;

3. Оценить варьирование и взаимосвязь параметров турбидиметрической кривой в и выявить наиболее информативные показатели;

4. Исследовать структурно-функциональные характеристики фибриновых сгустков, кинетику их образования и последующего лизиса в группах лиц с нарушениями системы гемостаза (беременность, метаболический синдром, острые лейкозы);

5. Изучить полиморфизм гена фибриногена FGA (Т312А) в группах здоровых лиц и пациентов с метаболическим синдромом и проанализировать возможную связь показателей турбидиметрического анализа с генотипом FGA (Т312А).

Научная новизна. Оптимизирована экспериментальная система, позволяющая одновременно оценивать кинетику фибринообразования, фибринолиза и структурные особенности (толщину волокон) фибринового сгустка. Впервые предложен оригинальный способ расчета параметров турбидиметрической кривой, позволяющий оценить соотношение процессов свертывания и фибринолиза, а также потенциал этих систем.

С помощью метода турбидиметрического анализа:

• впервые выявлена активация фибринолиза экстрактом Laminaria digitata;

• впервые обнаружен протеолиз стрептокиназы цистеиновыми катепсинами, что приводит к снижению, а затем и к полной потере плазминоген-активирующей способности этого белка;

• впервые исследовано влияние яда Vipera nikolskii и его компонентов на фибринообразование и фибринолиз и выявлены вещества фибриногенолитического и антифибринолитического действия;

• впервые установлена индукция образования протофибрилл под действием ионов никеля и кадмия, ведущая к формированию утолщенных фибриновых волокон, резистентных к фибринолизу;

• у пациентов с метаболическим синдромом выявлена повышенная свертываемость крови на этапе фибринообразования, не связанная с повышенной концентрацией фибриногена, в то время как ингибирование фибринолиза отмечено лишь у некоторой части пациентов;

• впервые проведена оценка влияния полиморфизма гена фибриногена FGA (Т312А) на фибринообразование и фибринолиз у здоровых лиц и пациентов с метаболическим синдромом.

Научно-практическая значимость. Метод турбидиметрического анализа тромбин-индуцированного фибринообразования и фибринолиза, индуцируемого стрептокиназой, удобен в экспериментальных исследованиях для быстрого скрининга предполагаемых эффекторов этих процессов.

Предложен способ функционального тестирования стрептокиназы, основанный на применении турбидиметрического анализа.

Методтурбидиметрическогоанализа фибринообразования и фибринолиза может применяться в диагностике нарушений заключительных стадий свертывания крови и фибринолиза, особенно в динамическом наблюдении пациентов с нестабильным гемостазом, поскольку позволяет выявить соотношение этих процессов. Простота и быстрота выполнения анализа позволяет использовать его для экспресс-диагностики.

Результаты и выводы диссертационной работы используются при оказании стационарной и амбулаторной помощи в клинике кафедры госпитальной хирургии № 2 и в центре гематологии ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика

И.П. Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», в научно-клиническом отделе "Лабораторная диагностика" ФГУ НИИ кардиологии им. В.А. Алмазова, а также в научно-педагогической работе на кафедре биохимии СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Оптимизированная экспериментальная система оценки тромбин-индуцированного фибринообразования и фибринолиза, индуцируемого стрептокиназой, и способ расчета показателей дают информацию о выраженности и соотношении процессов свертывания и фибринолиза, а также характеризуют структурные особенности фибринового сгустка.

2. С помощью турбидиметрического анализа возможно выявление эффекторов системы гемостаза, обладающих разнообразными механизмами действия в отношении фибриногена, тромбина, антитромбина III, плазминогена и ингибиторов плазмина.

3. По данным турбидиметрического анализа нормальная беременность характеризуется активацией как фибринообразования, так и фибринолиза.

4. По данным турбидиметрического анализа метаболический синдром характеризуется активацией фибринообразования, в то время как гипофибринолиз отмечается лишь у небольшой части пациентов.

5. Турбидиметрический анализ фибринообразования и фибринолиза может являться эффективным средством мониторинга больных с нестабильным гемостазом.

Апробация работы. Основные положения работы доложены на заседаниях кафедры биохимии ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»; на научной конференции, посвященной 100-летию кафедры биохимии СПбГМУ (Санкт-Петербург, 1998); на конференции по проблемам внезапной смерти (Санкт-Петербург, 1998); на второй ежегодной сессии Научного центра сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н.Бакулева (Москва, 1998); на научной конференции «Структура и функции протеолитических ферментов», (Москва, 2000); на биохимическом конгрессе Biocatalysis-2002 (Москва, 2002); на седьмом международном симпозиуме по ионам металлов в биологии и медицине «Metal Ions in Biology and Medecine» (Санкт-Петербург, 2002); на заседании Санкт-Петербургского отделения Российского биохимического общества (2003). По материалам диссертации опубликовано 19 научных работ. Получены 1 патент на изобретение и 1 удостоверение на рационализаторское предложение.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 211 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы собственных наблюдений и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложений. Работа иллюстрирована 23 таблицами и 42 рисунками. Указатель литературы содержит 292 наименования (33 отечественных и 259 зарубежных авторов).

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Субботина, Татьяна Федоровна

ВЫВОДЫ

1. Оптимизированная экспериментальная система одновременной регистрации фибринообразования и фибринолиза позволяет оценить кинетику фибринообразования, ход фибринолиза, толщину волокон фибринового сгустка, дать количественную оценку соотношения процессов свертывания и фибринолиза, а также оценить их потенциал.

2. Зависимость времени сохранения максимума оптической плотности от концентрации стрептокиназы в экспериментальной системе имеет четко выраженный минимум, что дает возможность оценки функциональной активности препаратов стрептокиназы.

3. Обнаружен протеолиз стрептокиназы цистеиновыми катепсинами, что приводит к снижению, а затем и к полной потере плазминоген-активирующей способности белка.

4. Выявлена активация фибринолиза экстрактом Laminaria digitata, что выражается в дозо-зависимом укорочении лаг-периода и общего времени фибринолиза.

5. В яде Vipera nikolskii выявлены два различных компонента, модулирующих фибринообразование и фибринолиз; один из них обладает фибриногенолитическим, а другой - антифибринолитическим действием.

6. Ионы цинка, никеля и кадмия в микромолярных концентрациях являются индукторами агрегации протофибрилл, что приводит к формированию утолщенных фибриновых волокон, резистентных к фибринолизу.

7. Наиболее информативными комплексными показателями турбидиметрической кривой фибринообразования и фибринолиза в клинических исследованиях являются общее время процесса Tall, соотношение времен фибринообразования и фибринолиза R и высота максимума оптической плотности Нтах.

8. По данным турбидиметрического анализа фибринообразования -фибринолиза нормальная беременность характеризуется увеличением потенциала обеих систем с некоторым преобладанием свертывания.

9. У подавляющего большинства (81%) пациентов с метаболическим синдромом выявлена гиперкоагуляция на этапе фибринообразования, не связанная с повышенной концентрацией фибриногена, в то время как ингибирование фибринолиза отмечено лишь у 14% больных. Наиболее вероятной причиной гиперкоагуляции при данной патологии является измененный белково-липидный состав плазмы крови, характерный для метаболического синдрома.

10. Распределения генотипов FGA{Т312А) в группах пациентов с метаболическим синдромом и здоровых людей достоверно различаются, однако не выявлено достоверных связей показателей турбидиметрического исследования фибринообразования - фибринолиза с генотипом FGA (Т312А).

11. Изменения турбидиметрической кривой в процессе развития диссеминированного внутрисосудистого свертывания у пациентов с острыми лейкозами носят фазный характер, согласующийся с представлениями о патогенезе этого синдрома; поэтому предложенный вариант турбидиметрического анализа фибринообразования и фибринолиза может быть использован в качестве экспресс-метода для динамического наблюдения за пациентами с угрозой развития синдрома ДВС.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В предложенной экспериментальной системе регистрации тромбин-индуцированного фибринообразования с последующим фибринолизом, индуцированным стрептокиназой, оптимальной конечной концентрацией стрептокиназы, минимизирующей ее влияние на процесс фибринолиза, является 10 МЕ/мл при предварительной инкубации с плазмой в течение 1 минуты. Наибольшей информативностью обладают комплексные показатели -общее время процесса Tall и соотношение времен фибринообразования и фибринолиза R, а также высота максимума оптической плотности Hmax.

2. Предложенный вариант турбидиметрического анализа фибринообразования и фибринолиза удобен в экспериментальных исследованиях для быстрого скрининга предполагаемых эффекторов этих процессов. В случаях изучения эффекторов, обладающих одновременно несколькими видами активности, либо смеси эффекторов, нередко оказывается возможным дифференцировать несколько эффектов по одной турбидиметрической кривой.

3. Турбидиметрический анализ фибринообразования и фибринолиза может применяться в клинической практике для диагностики нарушений заключительных стадий свертывания крови и фибринолиза, особенно для динамического наблюдения пациентов с нестабильным гемостазом. Простота и быстрота выполнения анализа позволяет использовать его для экспресс-диагностики.

4. В условиях клинической лаборатории предложенный вариант турбидиметрического анализа фибринообразования и фибринолиза может быть автоматизирован, а необходимая для этого стандартизация препаратов стрептокиназы может быть выполнена путем тестирования ее функциональной активности описанным в работе способом.

176

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Субботина, Татьяна Федоровна, Санкт-Петербург

1. Абдурахманов Ф.М. Вопросы циркуляторной адаптации системы гемостаза к гестационному процессу // Акуш. и гинек. 1989, № 11. — С. 9-11.

2. Айсина Р.Б., Житкова Ю.В., Еремеев H.JI. и др. Кинетика фибринолиза in vitro плазмином и эквимолярным комплексом плазмин-стрептокиназа // Укр. биохим. журнал. 1991. - Т.63, № 1. - С. 20-26.

3. Алмазов В.А., Благосклонная Я.В., Шляхто Е.В., Красильникова Е.И. Метаболический сердечно-сосудистый синдром. СПб.: Изд-во СПбГМУ, 1999.- 156 с.

4. Баркаган З.С., Момот А.П. Основы диагностики нарушений гемостаза. -М.: Ньюдиамед АО. - 1999. - 224 с.

5. Бышевский А.Ш., Чирятьев Е.А., Умутбаева М.К. Выделение ингибитора самосборки фибрина из плазмы крови и экстрактов тканей // Вопр. мед. химии. 1985. - Т. 31, № 5. - С. 30-32.

6. Бышевский А .Ш., Терсенов О. А., Галян С. JI. и др. Биохимические компоненты свертывания крови // Свердловск: Изд-во Урал. Ун-та, 1990. 212 с.

7. Гаврилова Е.А., Барбанова И.И., Усов А.И. и др. // Эксп. и клин, фармакология. 1997. - Т. 60, № 1. - С. 42-44.

8. Гематология детского возраста: руководство для врачей / Под ред. Н.А. Алексеева. СПб: Гиппократ, 1998. - 544 с.

9. Гемостаз. Физиологические механизмы, принципы диагностики основных форм геморрагических заболеваний / Под ред. Н.Н. Петрищева и Л.П. Папаян. СПб, 1999. - 120 с.

10. Гланц С. Медико-биологическая статистика. -М.: Практика, 1998. 459 с.

11. Диссеминированное внутрисосудистое свертывание: Пособие / А.И. Крылова, Г.В. Глущенко, М.А. Меншутина, М.Л. Степанян. СПб: Изд-во СПбГМУ, 2002.-34 с.

12. Добровольский А.Б., Панченко Е.П., Карпов Ю.А. Роль компонентов системы фибринолиза в атеротромбогенезе // Кардиология. 1996, № 5. -С. 68-72.

13. Жабин С.Г., Зорин С.А., Горин B.C., Лыкова О.С. Изучение структурных особенностей комплексов макроглобулинов с плазмином // Вопр. мед. химии. 1993. - Т. 39, вып. 4. - С. 53-56.

14. Клиническая оценка лабораторных тестов / Под ред. Н.У. Тица: Пер. с нем. М.: Медицина, 1986. - 480 с.

15. Лежен Т.И., Соколовская Л.И., Прусская В.В., Кудинов С.А. Турбидиметрический экспресс-микрометод одновременной оценки параметров свертывания и фибринолиза в плазме крови // Укр. биохим. журнал. 1993. -Т.65, № 3. - С. 23-30.

16. Лычев В.Г. Диагностика и лечение диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови. М.: Медицина, 1993. - 160 с.

17. Макогоненко Е.М. Влияние гепарина на гидролиз фибриновых сгустков быка и человека различными фибринолитическими системами // Укр. биохим. журнал. 1997. - Т. 69. - № 5-6. -С. 109-116.

18. Мачабели М.С. Коагулопатические синдромы. М.: Медицина. - 1970. -304 с.

19. Момот А.П., Мамаев А.Н., Баркаган З.С. и др. Метод определения плазминогена и его диагностическое значение // Проблемы гематологии. 1999, №1.-С. 17-20.

20. Нетяженко В.З., Лежен Т.И., Мальчевская Т.И., Лисенко Т.В. Использование турбидиметрического метода для диагностики нарушенийгемостаза у больных острым инфарктом миокарда // Укр. биохим. журнал. 1996. - Т. 68, № 3. - С. 100-104.

21. Павликова Е.П., Караваева И.П., Мерай И., Моисеев B.C. Эффективность тромболитической терапии стрептокиназой, альтеплазой и саруплазой у больных острым инфарктом миокарда // Клин. фарм. и терапия 2003. -Т. 12, № 1.-С. 83-86.

22. Петри А., Сэбин К. Наглядная статистика в медицине: Пер. с англ. — М.: Изд. дом «Гэотар-Мед», 2003. 144 с.

23. Плютто A.M. Определение фибринолитической активности крови методом тромбоэластографии // Лаб. дело. 1976. - № 9. - С. 569.

24. Репина М.А., Корзо Т.М., Папаян Л.П. и др. Коррекция нарушений гемостаза при беременности, осложненной гестозом // Акуш. и гинек. -1998, №2. -С. 38-45.

25. Розенфельд М.А., Леонова В.Б., Хавкина Л.С., Мешков Б.Б. Антифибринолитическое действие гепарина // Биохимия. 1984. - Т. 49, № 10.-С. 1672-1678.

26. Савушкин А.В. Концентрация фибриногена и свойства фибринового сгустка // Гемат. и трансфузиол. 2003. — Т. 48, № 3. - С. 29-32.

27. Скоупс Р. Методы очистки белков: Пер. с англ. М.: Мир, 1985. - 358 с.

28. Тютрин И.И., Удут В.В., Журавлев В.И., Журавлева Н.И. Информативность метода тромбоэластографии при оценке коагуляционного гемостаза у онкологических больных // Лаб. дело. -1993, № 10.-С. 600-604.

29. Фибринолиз. Современные фундаментальные и клинические концепции / Под ред. П.Дж. Гаффни, С. Балкув-Улютина: Пер. с англ. М.: Медицина, 1982. - 240 с.

30. Шевченко О.П. Высокочувствительный анализ С-реактивного белка и его применение в кардиологии // Laboratory Medicine. 2003, № 6. - С. 17-21.

31. Щербак И.Г., Субботина Т.Ф., Фаенкова В.П. Способ выделения цистеиновых катепсинов из экстрактов тканей / Патент Российской Федерации на изобретение № 2126684. Опубл. 27.02.1999, бюл. № 6.

32. Юрковская А.Н., Кудинов С.А. Оценка влияния 6-аминогексановой кислоты и контрикала на фибринолиз // Укр. биохим. журнал. 1994. - Т. 68, №5.-С. 47-51.

33. Andoh К., Kubota Т., Takada М., et al. Tissue factor activity in leukemia cells. Special reference to disseminated intravascular coagulation // Cancer. -1987.-Vol. 59.-P. 748-754.

34. Andrade-Gordon P., Srickland S. Interaction of heparin with plasminogen activators and plasminogen: Effect on the activation of plasminogen // Biochemistry. 1986. - Vol. 25, N 14. - P. 4033-4040.

35. Angles-Cano E., Rojas G. Apolipoprotein(a): structure-function relationship at the lysine-binding site and plasminogen cleavage site // Biol. Chem. 2002. -Vol. 383, N1.-P. 93-99.

36. Апёпз R.A.S., Philippou H., Nagaswami C., et al. The factor XIII V34L polymorphism accelerates thrombin activation of factor XIII and affects cross-linked fibrin structure // Blood. 2000. - Vol. 96. - P. 988-995.

37. Ariens R.A.S., Lai T.-S., Weisel J.W., et al. Role of factor XIII in fibrin clot formation and effectsof genetic polymorphism // Am. Soc. Hematol. 2002. -Vol. 100.-P. 743-754.

38. Attie-Castro F.A., Zago M.A., Lavinha J. Ethnic heterogeneity of the factor XIII VaI34Leu polymorphism // Thromb. Haemost. 2000. - Vol. 84. - P. 601-603.

39. Baglin T. Disseminated intravascular coagulation: diagnosis and treatment // Br. Med. J. 1996. - Vol. 312. - P. 683-687.

40. Bajaj A.P., Castellino F.J. Activation of human plasminogen by equimolar levels of streptokinase // J. Biol. Chem. 1977. Vol. 252, N 2. - P. 492-498.

41. Bale M.D., Mosher D.F. Effects of thrombospondin on fibrin polymerization and structure // J. Biol. Chem. 1986. - Vol. 261, N 2. - P. 862-868.

42. Barbui Т., Finazzi G., Falanga A., et al. Bleeding and thrombosis in acute lymphoblastic leukemia // Leuk. Lymphoma. 1993. - Vol. 11 (Suppl. 2). - P. 43-47.

43. Bauer K.A., Rosenberg R.D. Thrombin generation in acute lymphoblastic leukaemia // Blood. 1984. - Vol. 64. - P. 791-796.

44. Beller F.K., Ebert C. The coagulation and fibrinolytic enzyme system in pregnancy and in puerperium // Europ. J. Obstet. Gynec. Reprod. Biol. 1982. -Vol. 13.-P. 177-197.

45. Blomback В., Hessel В., Hogg D., Therkildsen L. A two-step fibrinogen-fibrin transition in blood coagulation // Nature. 1978. - Vol. 275, N 5680. - P. 501515.

46. Blomback В., Carlsson K., Hessel В., et al. Native fibrin gel networks observed by 3D microscopy, permeation and turbidity // Biochim. Biophys. Acta. 1989. - Vol. 997. - P. 96-110.

47. Blomback В., Banerjee D., Carlsson K. et al. Native fibrin gel networks and factors influencing their formation in health and disease // Adv. Exp. Med. Biol. 1990. - Vol. 281. - P. 1-23.

48. Bode W., Huber R. Natural protein proteinase inhibitors and their interaction with proteinases // Europ. J. Biochem. 1992. - Vol. 204, N 2. - P. 433-415.

49. Boekholdt S.M., Bijsterveld N.R., Moons A.H., et al. Genetic variation in confgulation and fibrinolytic proteins and their relation with acute myocardial infarction: a systemic review // Circulation. 2001. - Vol. 104, N 25. - P. 3063-3068.

50. Bosma P.J., Rijken D.C., Nieuwenhuizen W. Binding of tissue-type plasminogen activator to fibrinogen fragments // Eur. J. Biochem. — 1988. -Vol. 172.-P. 399-404.

51. Boyer M.H., Shainoff J.R., Ratnoff O.D. Acceleration of fibrin polymerization by calcium ions // Blood. 1972. - Vol. 39, N 3. - P. 382-387.

52. Brummel K.E., Butenas S., Mann K.G. An integrated study of fibrinogen during blood coagulation // J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 274. - P. 2212322900.

53. Budzinski A.Z. Fibrinogen and fibrin: biochemistry and pathophysiology // Crit. Rev. Oncol. Hematol. 1986. - Vol. 6. - P. 97-146.

54. Bulletin of World Health Organization. 1965. - Vol. 33. - P. 235.

55. Caprini J.A., Arcelus J.I., Goldshteyn S., et al. Thromboelastography: measuring statistical probabilities // Semin. Thromb. Hemost. 1995. - Vol. 21, Suppl. 4. - P. 14-20.

56. Carlson R.H., Garnick R.L., Jones A.J.S., Meunier A.M. The determination of recombinant human tissue-type plasminogen activator activity by turbidimetry using a microcentrifugal analyzer // Analyt. Biochem. 1988. - Vol. 168. - P. 428-435.

57. Carr M.E., Hermans G. // Macromolecules. 1978. - Vol. 11. - P. 46-57.

58. Carr M.E., Hardin C.L. Fibrin has larger pores when formed in the presence of erythrocytes //Am. J. Physiol. 1987. - Vol. 253, N 5, Pt. 2. - P. 1069-1073.

59. Carr M.E. Fluid phase coagulation events have minimal impact on plasma fibrin structure // Am. J. Med. Sci. 1988. - Vol. 295, N 5. - P. 433-437.

60. Carr M.E. Fibrin formed in plasma is composed of fibers more massive than those formed from purified fibrinogen // Thromb. Haemost. 1988. - Vol. 59, N3.-P. 535-539.

61. Carr M.E., Powers P.L. Differential effects of divalent cations on fibrin structure//Blood Coagul. Fibrinolysis. 1991.-Vol. 2, N6.-P. 741-747.

62. Carr M.E., Alving B.M. Effect of fibrin structure on plasmin-mediated dissolution of plasma clots // Blood Coagul. Fibrinolysis. 1995. - Vol. 6, N 6. -P. 567-573.

63. Carr M.E., Dent R.M., Carr S.L. Abnormal fibrin structure and inhibition of fibrinolysis in patients with multiple myeloma // J. Lab. Clin. Med. 1996. -Vol. 128, N 1. - P. 83-88.

64. Carter A.M., Catto A.J., Kohler H.P., et al. Alpha fibrinogen Thr312Ala polymorphism and venous thromboembolism // Blood. 2000. - Vol. 96. - P. 1177-1179.

65. Carter A.M., Catto A.J., Grant P.J. The association of the a-fibrinogen Thr312Ala polymorphism with post-stroke mortality in subjects with atrial fibrillation // Circulation. 2001. - Vol. 99. - P. 2423-2426.

66. Chandler W.L., Levi W.C., Veith R.C., Stratton J.R. A kinetic model of the circulatory regulation of tissue plasminogen activator during exercise, epinephrine infusion, and endurance training // Blood. 1993. - Vol. 81, N 12. -P. 3293-3302.

67. Chung D.W., Davie E.W. Gamma and gamma' chains of human fibrinogen are produced by alternative mRNA processing // Biochemistry. 1984. - Vol. 23.-P. 4232-4236.

68. Clauss A. Gerinnungshpysiologische Schnellmethode zur Bestimmung des Fibrinogens // Acta Haematol. 1957. - Bd. 17. - P. 237-240.

69. Collen D. Metabolism and distribution of fibrinogen // British J. Hematol. -1972.-Vol. 22.-P. 681-700.

70. Collen D. The plasminogen (fibrinolytic) system // Thromb. Haemost. 1999. -Vol. 82.-P. 259-270.

71. Collet J.P., Montalescot G., Lesty C., Weisel J.W. A structural and dynamic investigation of the facilitating effect of glycoprotein Ilb/IIIa inhibitors in dissolving platelet-rich clots // Circ. Res. 2002. - Vol. 90, N 4. - P. 428-434.

72. Collet J.P., Nagaswami C., Farrell D.H., et al. Influence of gamma' fibrinogen splice variant on fibrin physical properties and fibrinolysis rate // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2004. - Vol. 24, N 2. - P. 382-386.

73. Conejero-Lara F, Parrado J., Azuaga A.I., et al. Analysis of the interactions between streptokinase domains and human plasminogen // Protein Science. -1998. Vol. 7, N. 10. - P. 2190-2199.

74. Couto L.T., Donato J.L., de Nucci G. Analysis of five streptokinase formulations using the euglobulin lysis test and the plasminogen activation assay // Braz. J. Med. Biol. Res. 2004. - Vol. 37. - P. 1889-1894.

75. Cunningham M.T., Citron B.A., Koerner T.A.W. Evidence of the phospholipid binding species within human fibrinogen preparations // Thromb. Res. 1999. - Vol. 95. - P. 325-334.

76. Dang C.V., Ebert R.F., Bell W.R. Localization of a fibrinogen calcium binding site between gamma-subunit positions 311 and 336 by terbium fluorescence//J. Biol. Chem. 1985. - Vol. 260, N 17. - P. 9713-9719.

77. De Haan J., van Oeveren W. Platelets and soluble fibrin promote plasminogen activation causing downregulation of platelet glycoprotein Ib/IX complexes: protection by aprotinin // Thromb. Res. 1998. - Vol. 92, N 4. - P. 171-179.

78. Dempfle C.-E., Argiriou S., Kucher K., et al. Analysis of fibrin formation and proteolysis during intravenous administration of ancrod // Blood. 2000. -Vol. 96, N8.-P. 2793-2802.

79. Di Benedetto P., Baciarello M., Cabetti L., et al. Thrombelastography: present and future perspectives in clinical practice // Minerva Anestesiol. — 2003. -Vol. 69, N6.-P. 501-515.

80. Diamond S.L., Anand S. Inner clot diffusion and permeation during fibrinolysis // Biophysical journal. 1993. - Vol. 65. - P. 2622 - 2643.

81. Dietler G., Kanzig W., Haeberli A., Straub P.W. //Biopolymers, 1998. - Vol. 25. - P. 905-929.

82. Doolittle R.F., Yang Z., Mochalkin I. Crystal structure studies on fibrinogen and fibrin // Ann. N. Y. Acad . Sci. 2001. - Vol. 936. - P.31-43.

83. Ebert R. Index of Variant Human Fibrinogens. CRC Press, Boca Raton FL. -1994.

84. Egbert K.O., Kruithof E.R., Thang-Thang C., et al. Fibrinolysis in pregnancy: a study of plasminogen activator inhibitors // Blood. 1987. - Vol. 69, N 2. -P. 460-466.

85. Erickson H.P., Fowler W.E. Electron microscopy of fibrinogen, its plasmic fragments and polymers // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1983. - Vol. 408. - P. 146163.

86. Evans E., Courtois G.M., Kilian P.L., et al. Induction of fibrinogen and a subset of acute phase response genes involve a novel monokine which ismimicked by phorbol esters // J. Biol. Chem. 1987. - Vol. 262. - P. 1085010854.

87. Everse S.J., Spraggon G., Doolittle R.F. A three-dimensional consideration of variant human fibrinogen // Thromb. Haemost. 1998. - Vol. 80. - P. 1-9.

88. Executive summary of the third report of the national cholesterol education program (NCEP) expert panel on detection, evaluation, and treatment of high blood cholesterol in adults (Adult Treatment Panel III) // JAMA. 2001. - Vol. 285. - P. 2486-2497.

89. Fatah K., Hessel B. Effect of zinc ions on fibrin network structure // Blood Coagul. Fibrinolysis. 1998. - Vol. 9, N 7. - P. 629-635.

90. Fears R. Binding of plasminogen activators to fibrin: characterization and pharmacological consequences // Biochem. J. 1989. - Vol. 261. - P. 313324.

91. Ferrannini E., Haffner S.M., Mitchell B.D., Stern M.P. Hyperinsulinaemia: the key feature of a cardiovascular and metabolic syndrome // Diabetologia. -1991. Vol. 34, N 6. - P. 416-422.

92. Festa A., D'Agostino R., Mykkanen L., et al. Relative contribution of insulin and its precursors to fibrinogen and PAI-1 in a large population with different states of glucose tolerance // Arterioscler. Thromb.Vasc. Biol. 1999. - Vol.19.-P, 5 62-5 68.

93. Fleury V., Angles-Cano E. Characterization of the binding of plasminogen to fibrin surfaces: the role of carboxy-terminal lysines // Biochemistry. 1991. -Vol. 30.-P. 7630-7638.

94. Folsom A.R., Wu K.K., Rosamond W.D., et al. Prospective Study of hemostatic factors and incidence of coronary heart disease. The Athersclerosis Risk in Communities (ARIC) Study // Circulation. 1997. - Vol. 96. - P. 1102-1108.

95. Forsgren M., Raden В., Israelsson M., et al. Molecular cloning and characterization of a full-length cDNA clone for human plasminogen // FEBS Lett. 1987.-Vol. 213.-P. 254-260.

96. Francis C.W., Marder V.J. A molecular model of plasmic degradation of crosslinked fibrin // Semin. Thromb. Hemost. 1982. - Vol. 8, N 1. - P. 25-35.

97. Fu Y., Grieninger G. Fib420: a normal human variant of fibrinogen with two extended alpha chains // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1994. - Vol. 91. -P. 2625-2628.

98. Fuller G. Translational and cotranslational events in fibrinogen synthesis // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1983. - Vol. 408. - P. 440-448.

99. Furlan M., Stucki В., Steinmann C., et al. Normal binding of calcium to five fibrinogen variants with mutations in the carboxy terminal part of gamma-chain // Thromb. Haemost. 1996. - Vol.76, N 3. - P. 377-383.

100. Gabriel D.A., Smith M.A. Folds J.D., et al. The influence of immunoglobulin (IgG) on the assembly of fibrin gels // J. Lab. Clin. Med. -1983.-Vol. l.-P. 545-552.

101. Gabriel D.A., Muga K., Boothroyd E.M. The effect of fibrin structure on fibrinolysis // J. Biol. Chem. 1992. - Vol. 267, N 34. - P. 24259-24263.

102. Gabrijelcic D., Annan-Pran A., Rodic B. et al. Determination of cathepsin В and H in sera and synovial fluids of patients with different joint diseases //J .Clin. Chem. Clin. Biochem. 1990. - Vol. 28, N 3. - P. 149-153.

103. Gaffney P.J., Whitaker A.N. Fibrin crosslinks and lysis rate // Thromb. Res. 1979. - Vol. 14. - P. 85-94.

104. Galanakis D.K., Lane B.P., Simon S.R. Albumin modulates lateral assembly of fibrin polymers: evidence of enhanced fine fibrin formation and of unique synergism with fibrinogen // Biochemistry. 1987. - Vol. 26. - P. 2389-2400.

105. Gao W., Starkov V.G., Tsetlin V.I., et al. Isolation and preliminary crystallographic studies of two new phospholipases A2 from Vipera nikolskii venom// Acta Cryst. 2005. -Vol. 61.-P. 189-192.

106. Ginsburg D., Zeheb R., Yang A.I. cDNA cloning of human plasminogen activator-inhibitor from endothelial cells // J. Clin. Invest. 1986. - Vol. 78. -P. 1673-1680.

107. Glassman A., Abram M., Baxter G., Swett A. Euglobulin lysis time: an update //Ann. Clin. Lab. Sci. 1993. - Vol. 23, N 5. - P. 329-332.

108. Gong Y., Kim S.O., Felez J., et al. Conversion of Glu-plasminogen to Lys-plasminogen is necessary for optimal stimulation of plasminogen activation on the endothelial cell surface // J. Biol. Chem. 2001. - Vol. 276. -P. 19078-19083.

109. Gorkun O.V., Veklich Y.I., Medved L.V., et al. Role of the aC-domains of fibrin in clot formation // Biochemistry. 1994. - Vol. 33. - P. 6986-6997.

110. Gottumukkala V.N.R., Sharma S.K., Philip J. Assessing platelet and fibrinogen contribution to clot strength using modified thromboelstography in pregnant women // Anesth. Analg. 1999. - Vol. 89, N 1453. - P. 214-219.

111. Grailhe P., Boyer-Neumann C., Haverkate F., et al. The mutation in fibrinogen Bicetre II (gamma Asn308Lys) does not affect the binding of t-PA jind plasminogen to^ fibrin // Blood Coagul. Fibr. 1993. - Vol. 4. - P. 679687.

112. Grailhe P., Nieuwenhuizen W., Angles-Cano E. Study of tissue-type plasminogen activator binding sites on fibrin using distinct fragments of fibrinogen // Eur. J. Biochem. 1994. - Vol. 219. - P. 961-967.

113. Green F.R. Fibrinogen polymorphism and atherothrombotic disease // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2001. - Vol. 936. - P. 549-559.

114. Greenberg C.S., Achyuthan K.E., Fenton J.W. Factor Xllla formation promoted by complexing of alpha-thrombin, fibrin, and plasma factor XIII // Blood. 1987. - Vol. 69. - P. 867-871.

115. Gruber A., Mori E., del Zoppo G.J., et al. Alteration of fibrin network by activated protein С // Blood. 1994. - Vol. 83. - P. 2541-2548.

116. Gurewich V., Pannell R. Inactivation of single-chain urokinase (pro-urokinase) by thrombin and thrombin-like enzymes: relevance of the findings to the interpretation of fibrin-binding experiments // Blood. 1987. - Vol. 69, N3. - P. 769-772.

117. Gwynn I., Evans P.M., Jones B.M., Chandler J.A. Effects of divalent cations on calcium levels, aggregation and morphology of human blood platelets in vitro // Cytobiol. 1980. - Vol. 27, N 106. - P. 97-106.

118. Hack C.E. Fibrinolysis in disseminated intravascular coagulation // Semin. Thromb. Hemost. 2001. - Vol. 27, N 6. - P. 633-638.

119. Hahn B. S., Yang K. Y., Park E. M., et al. Purification and molecular cloning of calobin, a thrombin-like enzyme from Agkistrodon caliginosus (Korean viper) // J. Biochem. 1996. - Vol. 119, N 5. - P. 835-843.

120. Halbmayer W.M., Mannhalter C., Feichtinger C., et al. The prevalence of factor XII deficiency in 103 orally anticoagulated outpatients suffering from recurrent venous and/or arterial thromboembolism // Thromb. Haemost. -1992. Vol. 68. - P. 285-290.

121. Hall С. E., Slayter H.S. The fibrinogen molecule: its size, shape, and mode of polymerization // J. Cell Biol. 1959. - Vol. 5. - P. 11-27.

122. Hamako J., Matsui Т., Nishida S., et al. Purification and characterization of kaouthiagin, a fon Willebrand factor-binding and -cleaving metalloproteinase from Naja kaouthia cobra venom // Thromb. Hemost. -1998. Vol. 80, N 3. - P. 499-505.

123. Hambleton J., Leung L.L., Levi M. Coagulation: consultative hemostasis // Hematol. Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2002. - P. 335-352.

124. Hantgan R.R., Hermans J. Assembly of fibrin // J. Biol. Chem. 1979. -Vol. 254, N 22. - P. 11272-11281.

125. Harnett M. J. P., Bhavani-Shankar K., Datta S., Tsen L.C. In vitro fertilization-induced alterations in coagulation and fibrinolysis as measured by thromboelastography //Anest. Analg. 2002. - Vol. 95. - P. 1063-1066.

126. Harpel P.C., Borth W. Fibrin, lipoprotein(a), plasmin interactions: A model linking thrombosis and atherogenesis // Ann. N. Y. Acad .Sci. 1992. -Vol. 667.-P. 233-238.

127. Haverkate F., Samama M. Familial dysfibrinogenemia and thrombophilia. Report on a study of the SCC Subcommittee on fibrinogen // Thromb. Haemost.- 1995.-Vol. 73. P. 151-161.

128. Hellgren M. Hemostasis during normal pregnancy and puerperium // Semin. Thromb. Hemost. 2003. - Vol. 29, N 2. - P. 125-130.

129. Henry I., Uzan G., Weil D. The genes coding for A alpha-, В beta-, and gamma-chains of fibrinogen map to 4q2 // Am. J. Hum. Genet. 1984. - Vol. 36.-P. 760-768.

130. Henschen A. Covalent structure of fibrinogen // Ann. N. Y. Acad. Sci. -1983. Vol. 408. - P. 28-43.

131. Henschen A., McDonagh J. Fibrinogen, fibrin and factor XIII / In: Blood coagulation / Zvaal, Hemker, eds. Elsevier Science Publishers, 1986. - P. 171-241.

132. Hermans J. Models of fibrin // PNAS. 1979. - Vol. 76, N 3. - P. 11891193.

133. Hermans P.W., Hibberd M.L., Booy R. 4G/5G promoter polymorphism in the plasminogen-activator-inhibitor-1 gene and outcome of meningococcal disease. Meningococcal Research Group // Lancet. 1999. - Vol. 354. - P. 556-560.

134. Hicks R.C., Golledge J., Mir-Hassein R., Powell J.T. Vasoactive effects of fibrinogen on saphenous vein // Nature. 1996. - Vol. 379. - P. 818-820.

135. Higgins D.L., Lewis S.D., Shafer J.A. Steady state kinetic parameters for the thrombin-catalyzed conversion of human fibrinogen to fibrin // J. Biol. Chem. 1983. - Vol. 258, N 15. - P. 9276-9282.

136. Hittel D.S., Kraus W.E., Hoffman E.P. Skeletal muscle dictates the fibrinolytic state after exercise training in overweight men with characteristics of metabolic syndrome // J. Physiol. 2003. - Vol. 548, N 2. - P. 401-410.

137. Holmes W.E., Nelles L., Lijnen H.R., Collen D. Primary structure of human a2-antiplasmin, a serine protease inhibitor // J. Biol. Chem. 1987. -Vol. 262.-P. 1659-1664.

138. Homyak T.J., Bishop P.D., Shafer J.A. Alpha-thrombin-catalyzed activation of human platelet factor XIII: relationship between proteiolysis and factor Xllla activity // Biochemistry. 1989. - Vol. 28. - P. 7326-7332.

139. Homyak T.J., Shafer J.A. Role of calcium ion in the generation of factor XIII activity // Biochemistry. 1991. - Vol. 30. - P. 6175-6182.

140. Horan J.T., Francis C.W. Fibrin degradation products, fibrin monomer and soluble fibrin in disseminated intravascular coagulation // Semin. Thromb. Hemost. 2001. - Vol. 27. - P. 657-666.

141. Hoylaerts M., Rijken D.C., Lijnen H.R., Collen D. Kinetics of the activation of plasminogen by human tissue plasminogen activator. Role of fibrin // J. Biol. Chem. 1982. - Vol. 257. - P. 2912-2919.

142. Hummal B.C.W., Buck F.F., De Renzo E.C. Interaction of streptokinase and human plasminogen // J. Biol. Chem. 1966. Vol. 241, N 15. - P. 3474 -3479.

143. Imamura Т., Kaneda H., Nakamura S. New functions of neutrophils in the arthus reaction: expression of tissue factor, the clotting initiator and fibrinolysis by elastase // Lab. Invest. 2002. - Vol. 82. - P. 1287-1295.

144. Jackson K.W., Tang J. Complete amino acid sequence of streptokinase and its homology with serine proteases // Biochemistry. 1982. - Vol. 2, N 26. - P. 6620-6625.

145. Janmey P.A. A torsion pendulum for measurement of the viscoelasticity of biopolymers and its application to actin networks // J. Biochem. Biophys. Meth. 1991. - Vol. 22, N 1. - P. 41-53.

146. Jones C.I., Goodall A.H. Differential effects of the iodinated contrast agents Ioxaglate, Iohexol and Iodixanol on thrombus formation and fibrinolysis //Thromb. Res.-2003.-Vol. 112, N 1-2.-P. 65-71.

147. Kluszynski B.A., Kim C., Faulk W.P. Zinc as a cofactor for heparin neutralization by histidine-rich glycoprotein // Am. Soc. Biochem. Mol. Biol. -1997. Vol. 272, N 21. -P. 13541-13547.

148. Koenig W., Ernst E. The possible role of hemoreology in atherothrombogenesis // Atherosclerosis. 1992. - Vol. 94. - P. 93-107.

149. Kohler H. P. Insulin resistance syndrome: interaction with coagulation and fibrinolysis // Swiss Medicine Weekly. 2002. - Vol. 132. - P. 241 - 262.

150. Kojima Y., Urano Т., Kojima K., et al. The significant enhancement of fibrinolysis by calcium ion in a cell free system: the shortening of euglobulin clot lysis time by calcium ion // Thromb. Haemost. 1994. - Vol. 72, N 1. - P. 113-118.

151. Kolev K., Lerant I., Tenekejiev K., Machovich R. Regulation of fibrinolytic activity of neutrophil leukocyte elastase, plasmin and mini-plasmin by plasma protease inhibitors // J. Biol. Chem. 1994. - Vol. 269. - P. 1703017034.

152. Kolev K., Komorowicz E., Owen W.G., Machovich R. Quantitative comparison of fibrin degradation with plasmin, miniplasmin, neutrophil leukocyte elastase and cathepsin G // Thromb. Haemost. — 1996. — Vol. 75. P. 140-146.

153. Kolev K, Machovich R. Molecular and cellular modulation of fibrinolysis // Thromb. Haemost. 2003. - Vol. 89. - P. 610-621.

154. Komatsu Y. Studies on coagulation-fibrinolysis during normal pregnancy, labor and puerperium using recently developed molecular markers // Nippon Sanka Fujinka Gakkai Zasshi. 1995. - Vol. 47, N 7. - P. 627-634.

155. Koopman J., Haverkate F., Grimbergen J., et al. Fibrinogen Marburg: a homozygous case of dysfibrinogenemia, lacking amino acids A alpha 461-610 (Lys 461 AAA->stop TAA) // Blood. 1992. - Vol. 80. - P. 1972-1979.

156. Kostelansky M.S., Lounes K.C., Ping L.F., et al. Calcium-binding site beta2, adjacent to the "b" polymerization site, modulates lateral aggregation of protofibrils during fibrin polymerization // Biochemistry. 2004. - Vol. 43, N 9.-P. 2475-83.

157. Kruithof E.R., Thang-Thang C., Bachman F. Studies on the release of a plasminogen activator inhibitor by human platelets // Thromb. Haemost. -1986.-Vol. 55.-P. 201-205.

158. Kukhtina V.V., Weise С., Osipov A.V., et al. The MALDI mass-spectrometry in the identification of new proteins in sake venoms // Rus. J. Bioorg. Chem. 2000. - Vol. 26, N 11. - P. 721-724.

159. Larsson L.-I., Skriver L., Nielsen L.S. Distribution of urokinase-type plasminogen activator immunoreactivity in the mouse // J. Cell. Biol. 1984. -Vol. 98.-P. 894-903.

160. Lee A.Y., Fredenburgh J.C., Stewart R.J. et al. Like fibrin, (DD)E, the major degradation product of cross-linked fibrin, protects plasmin from inhibition by alpha2-antiplasmin // Thromb. Haemost. 2001. - Vol. 85, N 3. -P. 502-508.

161. Levi M., Hack C.E., de Boer J.P. Contact system dependent fibrinolytic activity in vivo: observations in healthy subjects and factor XII deficient patients // Agents Actions Suppl. 1992. - Vol. 38. - P. 292-298.

162. Lewis S.D., Shields P.P., Shafer J.A. Characterization of the kinetic pathway for liberation of fibrinopeptides during assembly of fibrin // J. Biol. Chem. 1985. - Vol. 260, N 18. - P. 10192-10199.

163. Lezen T.I., Kudinov S.A., Medved L.V. Plasminogen binding site of the thermostable region of fibriniogen fragment D // FEBS Lett. 1986. - Vol. 197.-P. 59-62.

164. Li X., Galanakis D., Gabriel D.A. Transient intermediates in the thrombin activation of fibrinogen. Evidence for only desAA species // J. Biol. Chem. 1996. - Vol. 271. - P. 11767-11771.

165. Liang H., Huang J., Tu C.Q., et al. The subsequent effect of interaction between Co(2+) and human serum albumin or bovine serum albumin // J. Inorg. Biochem. 2001. - Vol. 85, N 2-3. - P. 167-171.

166. Lijnen H.R. Elements of the fibrinolytic system // Ann. N.- Y. Acad. Sci. 2001. - Vol. 936. - P. 226-236.

167. Lim B.C., Ariens R.A.S., Carter A.M., et al. Genetic regulation of fibrin structure and function: complex gene-environment interactions may modulate vascular risk // Lancet. 2003. - Vol. 361. - P. 1424-1431.

168. Lip G.Y., Chin B.S., Prasad N. ABC of antithrombotic therapy: Antithrombotic therapy in myocardial infarction and stable angina // Brit. Med. J. 2002. - Vol. 325, N 7375. - P. 1287-1289.

169. Liu Y., Pan J., Wang S., et al. Beta-fibrinogen gene -455A/G polymorphism and plasma fibrinogen level in Chinese stroke patients // Chin. Med. J. 2002. - Vol. 115, N 2. - P. 214-216.

170. London M. Non-covalent associations of proteins in plasma: self-, mixed fibrin(ogen), mixed protein-non-protein association // Clin. Biochem. 1997. -Vol. 30.-P. 83-89.

171. Lorand L., Gray A.J., Brown K. Dissociation of the subunit structure of fibrin stabilizing factor during activation of the zymogen // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1974. - Vol. 56. - P. 914-922.

172. Lord S.T. Fibrinogen// In: Molecular Basis of Thrombosis and Hemostasis / High K.A., Roberts H.R. eds. Marcel Dekker: New York, 1995. -P. 51-74.

173. Loscalzo J. Structural and kinetic comparison of recombinant human single- and two-chain tissue plasminogen activator // J.Clin.Invest. 1988. -V.82. — P.1391-1397.

174. Lottermoser K., Weisser В., Hertfelder H.J., et al. Antihypertensive drug treatment and fibrinolytic function // Am. J. Hypertens. 1998. - Vol. 11, N 3, Pt.l.-P. 378-384.

175. Machovich R., Owen W.G. The elastase-mediated pathway of fibrinolysis // Blood Coagul. Fibrinolysis. 1990. - Vol. 1. - P.79-90.

176. Malke H., Roe В., Ferretti J.J. Nucleotide sequence of the streptokinase gene from Streptococcus equisimilis H46A // Gene. 1985. - Vol. 34, N 2-3. -P. 357-362.

177. Mallett S.V., Cox D.J. Thrombelastography // Br. J. Anaesth. 1992. -Vol. 69, N3.-P.307-313.

178. Mangel W.F., Lin B.H., Ramakrishnan V. Characterization of an extremely large, ligand-induced conformational change in plasminogen // Science. 1990. - Vol. 248, N 1. - P. 69-73.

179. Mansfield M.W., Heywood D.M., Grant P.J. Circulating levels of factor

180. VII, fibrinogen, and von Willebrand factor and features of insulin resistance infirst-degree relatives of patients with NIDDM //Circulation. 1996. - Vol. 94. -P. 2171-2176.

181. Marder V.J., Francis C.W. Plasmin degradation of cross-linked fibrin // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1983. - Vol. 408. - P. 397-406.

182. Marsh N.A. Snake venoms affecting the hemostatic mechanism: a consideration of their mechanisms, practical applications and biological significance // Blood Coagul. Fibrinolysis. 1994. - Vol. 5, N 3. - P. 399-410.

183. Marx G. Elasticity of fibrin and protofibrin gels is differentially modulated by calcium and zinc // Thromb. Haemost. 1988. - Vol. 59, N 3. — P. 500-503.

184. Marx G. Zinc binding to fibrinogen and fibrin // Arch. Biochem. Biophys. 1988. - Vol. 266, N 1. - P. 285-288.

185. Marx G. Divalent cations induce protofibril gelation // Am. J. Hematol. -1988. Vol. 27, N 2. - P. 104-109.

186. Marx P.F., Bouma B.N., Meijers J.C. Role of zinc ions in activation and inactivation of thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor // Biochemistry. -2002. Vol. 41, N 4. -P. 1211-1216.

187. Matsui N., Fujimura Y., Titani K. Snake venom proteases affecting hemostasis and thrombosis // Biochim. Biophys. Acta. 2000. - Vol. 1477, N 1-2.-P. 146-156.

188. Medved L.V., Gorkun O.V., Privalov P.L. Structural organization of C-terminal part of fibrinogen Aa-chains // FEBS Lett. 1983. - Vol. 160. - P. 291-295.

189. Medved L., Tsurupa G., Yakovlev S. Conformational changes upon conversion of fibrinogen into fibrin: the mechanisms of exposure of some cryptic sites // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2001. - Vol. 936. - P. 185-204.

190. Medved L., Nieuwenhuisen W. Molecular mechanisms of initiation of fibrinolysis by fibrin // Thromb. Haemost. 2003. - Vol. 89. - P. 409-419.

191. Mills J.D., Ariens R.A.S., Mansfield M.W., Grant P.J. Altered fibrin clot structure in the healthy relatives of patients with premature coronary artery disease // Circulation. 2002. - Vol. 106, N 15. - P. 1938-1942.

192. Moir E., Robbie L.A., Bennett В., Booth N.A. Polymorphonuclear leukocytes have two opposite roles in fibrinolysis // Thromb. Haemost. 2002. Vol. 87.-P. 1006-1010.

193. Moser M., Nordt Т., Peter K., et al. Platelet functions during and after thrombolytic therapy for acute myocardial infarction with reteplase, alteplase, or streptokinase // Circulation. 1999. - Vol. 100. - P. 1858-1864.

194. Mosher D.F., Misenheimer T.M., Stenflo J., Hogg P.J. Modulation of fibrinolysis by thrombospondin // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1992. - Vol. 667. -P. 64-69.

195. Mullin J.L., Gorkun O.V., Lord S.T. Decreased lateral aggregation of a variant recombinant fibrinogen provides insight into the polymerization mechanism // Biochemistry. 2000. - Vol. 39, N 32. - P. 9843-9849.

196. Mundada L.V., Prorok M., DeFord M., et al. Structure-function analysis of the streptokinase amino terminus (residues 1-59)// J. Biol. Chem. 2003. -Vol. 278, N 27. - P. 24421-24427.

197. Okada M., Blomback B. Calcium and fibrin gel structure // Thromb. Res. 1983. - Vol. 29, N 3. - P. 269-280.

198. Peerschke E.I. Stabilization of platelet-fibrinogen interactions: modulation by divalent cations // J. Lab. Clin. Med. Vol. 121, N 1. - P. 135141.

199. Peisach E., Wang J., de los Santos Т., et al. Crystal structure of the proenzyme domain of plasminogen // Biochemistry. 1999. - Vol. 38, N 34. -P. 11180-11188.

200. Ponting C.P., Marshall J.M., Cederholm-Williams S.A. Plasminogen: a structural review // Blood Coagul. Fibrinolysis. 1992. - Vol.3. - P. 605-614.

201. Procyk P., Bishop P.D., Kudryk B. Fibrin-recombinant human factor XIII A-subunit association // Thromb. Res. 1993. - Vol. 71. - P. 127-138.

202. Rabbani L.E., Loscalzo J. Recent observations on the role of hemostatic determinants in the development of the atherothrombotic plaque // Atherosclerosis. 1994. - Vol.105. - P. 1-7.

203. Ramirez M.S., Sanchez E.E., Garcia-Prieto C., et al. Screening for fibrinolytic activity in eight Viperid venoms // Сотр. Biochem. Physiol. C. Pharmacol. Toxicol. Endocrinol. 1999. - Vol. 124, N 1. - P. 91-98.

204. Ranjadayalan К., Stevenson R., Marchant В., et al. Streptokinase induced defibrination assessed by thrombin time: effect on residual coronary stenosis and left ventricular ejection fraction // British Heart J. 1992. - Vol. 68,N2.-P. 171-175.

205. Reaven G. The metabolic syndrome or the insulin resistance syndrome? Different names, different concepts, and different goals // Endocrinol. Metab. Clin. North Am. 2004. - Vol. 33. - P. 283-303.

206. Reed G.L., Houng A.K., Liu L., et al. A catalytic switch and the conversion of streptokinase to a fibrin-targeted plasminogen activator // PNAS. 1999. - Vol. 96, N 16. - P. 8879-8883.

207. Retzinger G.S., DeAnglis A.P., Patuto S.J. Adsorption of fibrinogen to droplets of liquid hydrophobic phases. Functionality of the bound protein and biological implications // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1998.- Vol.18. -P. 1948-1957.

208. Ridgway H.J., Brennan S.O., Faed J.M;, George P.M. Fibrinogen Otago: a major a-chain truncation associated with severe hypofibrinogenaemia and recurrent miscarriage // British J. Haematol. 1997. - Vol.98. - P. 632-639.

209. Roy S., Yu S., Banerjee J. Assembly and secretion of fibrinogen. Degradation of individual chains // J. Biol. Chem. 1992. - Vol. 267. - P. 23151-23158.

210. Sakkinen P. A., Wahl P., Cushman M., et al. Clustering of procoagulation, inflammation, and fibrinolysis variables with metabolic factors in insulin resistance syndrome // Am. J. Epidemiol. 2000. - Vol. 152, N 10. -P. 897-907.

211. Salooja N., Perry J. Thrombelastography // Blood Coagul. Fibrinolysis. -2001. Vol. 12, N 5. - P. 327-337.

212. Samel M., Subbi J., Siigur J., Siigur E. Biochemical characterization of fibrinogenolytic serine proteinases from Vipera lebetina snake venom // Toxicon. 2002. - Vol.40, N 1. - P. 51 -54.

213. Sasaki M., Ohkubo I., Hidashiyama S. et al. Kininogens as thiol proteinase inhibitors / In: Cysteine Proteinases and Inhibitors. Proc. Int. Symp., Portoroz, Sept. 15 18, 1985. - Berlin - New York, 1986. - P. 393 -412.

214. Siebenlist K.R., Mosesson M.W. Progressive cross-linking of fibrin у chain increases resistance to fibrinilysis // J. Biol. Chem., 1994. Vol. 269. -P. 28414-28419.

215. Siigur E., Samel M., Tonismagi K., et al. Isolation, properties and N-terminal amino acid sequence of a factor V activator from Vipera lebetina (Levantine viper) snake venom // Biochim. Biophys. Acta. 1998. - Vol. 1429, N 1.-P. 239-248.

216. Siigur E., Tonismagi К., Trummal К., et al. Factor X activator from Vipera lebetina snake venom, molecular characterization and substrate specificity // Biochim. Biophys. Acta. 2001. - Vol. 1568. - P. 90-98.

217. Slofstra S.H., Spek C.A., ten Cate H. Disseminated intravascular coagulation // The Hematol. J. 2003. - Vol. 4. - P. 295-302.

218. Smith G.F. // Biochemical journal. 1980. - Vol. 185. - P. 1-11.

219. Sobel J.H., Gawinowicz M.A. Identification of the a-chain lysine donor sites involved in factor XHIa fibrin cross-linking // J. Biol. Chem. 1996. -Vol. 271.-P. 19288-19297.

220. Spraggon G., Everse S.J., Doolittle R.F. Crystal structures of fragment D from human fibrinogen and its crosslinked counterpart from fibrin // Nature. -1997.-Vol. 389.-P. 455-462.

221. Standeven K.F., Grant P.J., Carter A.M., et al. Functional analysis of thefibrinogen-Aa-Thr312Ala polymorphism // Circulation. 2003. - Vol. 107. 1. P. 2326-2330.

222. Stasio E.D., Nagaswami C., Weisel J.W., Cera E.D. СГ regulates the structure of the fibrin clot // Biophys. J. 1998. - Vol. 75. - P. 1973 - 1979.

223. Stief T.W., Weippert M., Kretschmer V., Renz H. Arginine inhibits hemostasis activation // Thromb. Res. 2001. - Vol. 104, N 4. - P. 265-274.

224. Sueishi К., Yasunaga С., Murata Т. Endothelial function in thrombosis and thrombolysis // Jpn. Circulat. J. 1992. - Vol. 56. - P. 192-198.

225. Suenson E., Bjerrum P., Holm A., et al. The role of fragment X polymers in the fibrin enhancement of tissue plasminogen activator-catalyzed plasmin formation // J. Biol. Chem., 1990. Vol. 265. - P. 22228-22237.

226. Tallman M.S., Kwaan H.C. Reassessing the hemostatic disorder associated with acute promyelocytic leukemia // Blood. 1992. — Vol. 79. - P. 543-553.

227. Taylor F.B., Toh C.H., Hoots W.K., et al. Towards definition, clinical and laboratory criteria, and a scoring system for disseminated intravascular coagulation // Thromb. Haemost. 2001. - Vol. 86. - P. 1327-1330.

228. Tsurupa G., Medved L. Identification and characterization of novel tPA-and plasminogen-binding sites within fibrin(ogen) aC-domains // Biochemistry. 2001. - V. 40. - P. 801-808.

229. Turk V., Brzin G., Kotnik M. et al. Human cysteine proteinases and their protein inhibitors stefins, cystatins and kininogens // Biomed. Biochem. Acta. - 1986. - Vol. 45, N 11 - 12. - P. 1375 - 1384.

230. Ueno H., Hirosawa H., Oda S., et al. Coagulation/fibrinolysis abnormality and vascular endothelial damage in the pathogenesis of thrombocytopenic multiple organ failure // Crit. Care Med., 2002. Vol. 30. -P. 2242-2248.

231. Urano Т., Ihara H., Takada Y., et al. The cleavage and inactivation of plasminogen activator inhibitor type 1 and alpha2-antiplasmin by reptilase, a thrombin-like enzyme // Blood Coagul. Fibrinolysis. 2000. - Vol. 11, N 2. -P. 145-153.

232. Utermann G. The mysteries of lipoprotein(a) // Science. 1989. - Vol. 246.-P. 904-910.

233. Van Hinsbergh V.W.M. Regulation of the synthesis and secretion of plasminogen activators by endothelial cells // Haemostasis. 1988. - Vol. 18. -P. 307-327.

234. Van Loon В .J., Heere L.P., Kluft C., et al. Fibrinolytic system during long-distance running in IDDM patients and in healthy subjects // Diabetes Care. 1992. - Vol. 15, N 8. - P. 991-996.

235. Van Zonneveld A.J., Veerman H., McDonald M.E., et al. Structure and function of human tissue-type plasminogen activator (t-AP) // J. Cell. Biochem. 1986. - Vol. 32. - P. 169-178.

236. Varadi A., Patthy L. Location of plasminogen-binding sites in human fibrin(ogen) // Biochemistry. 1983. - Vol. 22. - P. 2440-2446.

237. Varadi A., Sheraga H.A. Localization of segments essential for polymerization and for calcium binding in the gamma-chain of human fibrinogen // Biochemistry. 1986. - Vol. 25, N 3. - P. 519-528.

238. Veklich Y., Francis C.W., White J., Weisel J.W. Structural studies of fibrinolysis by electron microscopy // Blood. 1998. - Vol. 92. - P. 47214729.

239. Wada Y., Lord S.T. A correlation between thrombotic disease and a specific fibrinogen abnormality (A alpha 544 ArgCys) in two unrelated kindred, Dusart and Chapel Hill III // Blood. 1994. - Vol. 84. - P. 37093714

240. Walker J.B., Nesheim M.E. The molecular weights, mass distribution, chain composition, and structure of soluble fibrin degradation products released from a fibrin clot perfused with plasmin // J. Biol. Chem. 1999. -Vol. 274.-P. 5201-5212.

241. Wang M., Zhuang F.Y., Tian T. Analysis of thromboelastogram on coagulation and fibrinolysis // Biorheology. 1988. - Vol. 25, N 3. - P. 539544.

242. Wang S., Reed L., Hedstrom L. Zymogen activation in the streptokinase-plasminogen complex. Ilel is required for the formation of a functional active site // Eur. J. Biochem. 2000. - Vol. 267, N 13. - P. 3994-4001.

243. Wei W., Yang R., Guo Т., et al. Fibrinolysis kinetics and its application // J.Huazhong Univ. Sci. Technolog. Med. Sci. 2007. - Vol. 27, N 1. - P. 111-113.

244. Weisel J.W. Fibrin assembly. Lateral aggregation and the role of two pairs of fibrinopeptides //Biophys. J. 1986. - Vol. 50. - P. 1079-1093.

245. Weisel J.W., Nagaswami C. Computer modeling of fibrin polymerization kinetics correlated with electron microscope and tubidity observations: clot structure and assembly are kinetically controlled // Biophys. J.-1992.-Vol. 63, N 1. P. 111-128.

246. Weisel J.W., Veklich Y., Gorkun O. The sequence of cleavage of fibrinopeptides from fibrinogen is important for protofibril formation and enhancement of lateral aggregation of fibrin clot // J. Mol. Biol. 1993. - Vol. 232, N 1.-P. 285-297.

247. Weisel J.W., Nagaswami C., Korsholm В., et al. Interactions of plasminogen with polymerized fibrin and its derivatives, monitored with photoaffmity cross-linker and electron microscopy // J. Mol. Biol. — 1994. -Vol. 235.-P. 1117-1135.

248. Weisel J.W., Medved L. The structure and functions of the a-C domains of fibrinogen//Ann. N. Y. Acad. Sci. -2001. Vol. 936. - P. 312-327.

249. Weitz J.I., Leslie В., Ginsberg G. Soluble fibrin degradation products potentiate tissue plasminogen activator-induced fibrinogen proteolysis // J. Clin. Invest. 1991. - Vol. 87, N 3. - P. 1082-1090.

250. Wilf J., Minton A.P. Soluble fibrin-fibrinogen complexes as intermediates in fibrin gel formation // Biochemistry. 1986. - Vol. 25, N 11. -P. 3124-3133.

251. Wolberg A.S., Gabriel D.A., Hoffman N. Analyzing fibrin clot structure using a microplate reader // Blood Coagul. Fibrinolysis. 2002. - Vol. 6. - P. 533-539.

252. Woodhead J.L., Nagaswami C., Matsuda M., et al. The ultrastructure of fibrinogen Caracas II molecules, fibers, and clots // Blood. 1996. - Vol. 271, N9. - P. 4946-4953.

253. Wu H.L., Chang B.I., Wu D.H., et al. Interaction of plasminogen and fibrin in plasminogen activation // J. Biol. Chem. 1990. - Vol. 265. - P. 19658-19664.

254. Xue S., Madison E.L., Miles L.A. The kringle V-protease domain is a fibrinogen binding region within Apo(a) // Thromb. Haemost. 2001. - Vol. 86, N5.-P. 1229-1237.

255. Yakovlev S., Makogonenko E., Kurochkina N., et al. Conversion of fibrinogen to fibrin: the mechanism of exposure of tPA- and plasminogen-binding sites // Biochemistry. 2000. - Vol. 39. - P. 15730-15741.

256. Yamakage M., Tsujiguchi N., Kohro S., et al. The usefulness of celite-activated thromboelastography for evaluation of fibrinolysis // Canadian Journal of Anesthesia. 1998. - Vol. 45. - P. 993-996.

257. Yamamoto C. Toxicity of cadmium and lead on vascular cells that regulate fibrinolysis. (Jap.) // Yakugaku Zasshi. - 2000. - Vol. 120, N 5. - P.463.473.

258. Yang Z., Li F., Liu G. The study of beta-fibrinogen gene -455G/A, ~ 148C/T, 448G/A polymorphisms and their association with plasma fibrinogen levels. (Chinese) // Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi. 2000. - Vol. 21, N 9. -P. 463-465.

259. Yang Z., Kollman J.M., Pandi L., Doolittle R.F. Crystal structure of native chicken fibrinogen at 2.7 A resolution // Biochemistry. 2001. - Vol. 40. -P. 12515-12523.

260. Yee V.C., Pedersen L.C., Le Trong I., et al. Three-dimensional structure of a transglutaminase: human blood coagulation factor XIII // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1994. - Vol. 91. - P. 7296-72300.

261. Yee V.C., Pratt K.P., Cote H.C., et al. Crystal structure of a 30 kDa C-terminal fragment from the gamma chain of human fibrinogen // Structure. -1997. Vol. 5, N 1. - P. 125-138.

262. Yoshida N., Wada H., Morita K, et al. A new congenital abnormal fibrinogen Ise characterized by the replacement of the В beta glycine 15 by cysteine //Blood. 1991. - Vol. 77. - P. 1958-1963.

263. Young K.-C., Shi G.-Y., Chang Y.-F., et al. Interaction of streptokinase and plasminogen // Blood. 1995. - Vol. 270, N 49. - P. 29601-29606.

264. Zhang Y., Wisner A., Maroun R.C., et al. Trimeresurus stejnegeri venom plasminogen activator // Blood. 1997. - Vol. 272, N 33. - P. 20531-20537.