Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика биологического действия Nigella sativa, Salvia officinalis и Trichoderma на живые системы

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Характеристика биологического действия Nigella sativa, Salvia officinalis и Trichoderma на живые системы"

и

На правах рукописи

Gita^

Салли Мохамед Абделазиз Эльшафей

ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯNIGELLA SATIVA, SALVIA OFFICINALIS II TRICHODERMA НА ЖИВЫЕ СИСТЕМЫ

03.01.04. - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

15 ЯНЗ Z015

Казань-2015

005557198

005557198

Работа выполнена на кафедре биохимии и биотехнологии ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет»

Научный руководитель: Алимова Фарида Кашнфовна

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты: Языкова Марина Юрьевна

доктор биологичесюгх наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение "Самарский государственный университет" профессор кафедры биохимии, биотехнологии и биоинженерии, г. Самара.

Гоголев Юрий Викторович

доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра" Российской академии наук, заведующий лабораторией молекулярной биологии, г. Казань.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»), г. Казань.

Защита диссертации состоится «12» февраля 2015 года в 13 часов на заседании диссертационного совета Д212.0 81.08 при ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: г. Казань, ул. Карла Маркса, д. 74, Институт фундаментальной медицины и биологии в зале заседания ученого совета.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского при ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу г. Казань, ул. Кремлевская, д. 35.

Автореферат разослан « » 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, ^

доктор биологичесюгх наук, профессор —— З.И. Абрамова

ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Всемирная организация здравоохранения и Европейский Союз (ЕС) выступают за необходимость выпуска стандартизированных эффективных лекарственных средств природного происхождения. В связи с их большей безопасностью по сравнению с химически синтезированными лекарственными препаратами, для которых характерен риск серьезных побочных эффектов (Лепахин В.К. и др., 2002; Orhan I.E., 2014; Ujvary I., 2014). Показана необходимость расширения не только количества биопрепаратов медицинского назначения на основе растительного и микробного сырья, а также спектра их применения (Алимова Ф.К. и др., 2007; Hyman А.Н., Simons К., 2011; Громовых Т.И. и др., 2014).Биопрепараты приобретают большое значение в современном обществе также и для профилактической медицины, т.к. современный фармакологический рынок испытывает недостаток медицинских препаратов с протекторным действием и известным молекулярным механизмом (Вайиовская И.Ф., 2011; Исакова АЛ., Прохоров В.Н., 2014; Gupta V.G. et al., 2014). С древних времен известно, что экстракты лекарственных растений обладают биологической активностью, антибактериальными, противогрибковыми, антиоксидантными и другими свойствами (Properzi A. et al., 2013). Одним из широко известных медицинских фитопрепаратов являются препараты на основе черного тмина - Nigella sativa (Zaman R., Akhtar M.S., 2004; Al-Sheddi E.S. et al., 2014) и шалфея - Salvia officinalis (Lima S.F. et al., 2004).A7ge//a sativa является одним из традиционно используемых растений для лечения опухолевых заболеваний (Houghton PJ. et al., 1995; Al-Sheddi E.S. et al., 2014), для поднятия иммунитета, гепатонротекторным действием и др. (Al-Hader A. et al., 1993; El Tahir K.E. et al., 1998). Описано более 19 видов физиологически активных метаболитов этого растения. Тем не менее, многие клинические исследования нуждаются в дальнейшей оценке эффективности и безопасности в терапевтическом применении (Llaiyaraja N.. Khanum F., 2010). Salvia officinalis—рликтк, хорошо известно своим противовоспалительным, противодиабетическом и антиоксидантным действием. Тем не менее, механизмы действия физиологически активных веществ S.officinalis до настоящего времени не имеют биологического экспериментального подтверждения (Deans S.G., Simpson E.J.M., 2000; Lima S.F. et al., 2004). Биопрепараты на основе грибов рода Trichoderma выращиваются в промышленных масштабах на отходах растениеводства для применения в промышленности, а также в сельском хозяйстве как фунгициды и регушггоры роста растений (Алимова Ф.К. 2005; Громовых Т.И. и др. 2014; Guptp V.G. et al., 2014). Однако в последнее время появились сообщения о возможности применения метаболитов Trichoderma и в медицине (Смирнова И.П. и др., 2005; Schuster A., Schmoll М., 2010; Тухбатова Р.И. и др., 2012). Перед фармакологией стоит задача изыскание и синтез не только новых лекарственных препаратов, но и расширение спектра применения хорошо известных. Производство любых биопрепаратов, как правило, сопряжено с накоплением отходов. Согласно современным подходам, производство фитопрепаратов медицинского назначения должно быть также экологически целесообразным. Разработка биологических препаратов на основе отходов производства медицинских фитопрепаратов лишенных побочных эффектов, представляется также важной задачей для сельскохозяйственной биотехнологии (Ткаченко К.Г., 2011; Симчук А.П., 2013).

Степень разработанности темы исследования. Проводимые зарубежные исследования в области производства лекарственных биопрепаратов основаны на сборе биологически безопасного растительного или микробного материала с высокой активностью (Gali-Muhtasib Н. et al., 2004; Lima S.F. 2006; Al-Sheddi E.S. et al„ 2014; Gupta V.G. et al., 2014). Разработка диссертационной темы начата на основе предыдущих экспериментальных исследований, проводимых на кафедре биохимии и биотехнологии, Казанского федерального университета (Алимова Ф.К. и др., 2007; Тазетдинова Д.И., 2008; Абдельрахман A.A., 2011; Тухбатова Р.И. и др., 2012). Показано что биопрепарат Фитотрикс на основе T.asperellum может быть использован не только в агробиотехнологии, но и в медицине. Испытаны два вида микромицетов рода Trichoderma. Показано что Trichoderma может использоваться как фунгицид и стимулятор роста кукурузы. Получены предварительные данные о протекторном действии биопрепарата на основе Trichoderma при заболевании печени и почек у мышей, цитотоксическом действие к опухолевым клеткам линии Hela. Отобран наиболее эффективный вид T.asperellum 551 (Абдельрахман A.A., 2011). В настоящей работе продолжены исследования по применению метаболитов Trichoderma asperellum 551 как лекарственного средства с противоопухолевым и гепатопротекгорным действием. Исследовалась биологическая активность биопрепаратов на основе S. officinalis и Т. asperellum 551 в отношении культур неперерожденных и раковых клеток, а также лабораторных животных по сравнению с известным противоопухолевым фитопрепаратом на основе N. sativa. Исследовалась фунгистатическая активность фитопрепаратов по отношению патогенных микромицетов по сравнению с известным биофунгицидом на основе Т. asperellum. Актуальной задачей для изучения является возможность использования отходов производства лекарственных фитопрепаратов в агробиотехнологии для защиты от фитопатогенных грибов и стимуляции роста растений. Рассматривается возможность использования биопрепаратов на основе отходов производств N. sativa и S. officinalis по сравнению с биопрепаратом на основе Т. asperellum 551 как биофунгицидов и фиторегулягоров.

Цель и задачи исследований. Цель данной работы - расширение спектра применения растительных фитопрепаратов медицинского значения на основе N. sativa, S. officinalis и отходов их производства, а также биопрепарата на основе Т. asperellum 551 в медицине и агробиотехнологии. В соответствии с поставленной целью работы решались следующие задачи:

1. Оценить цитотоксическое действие биопрепаратов на основе S. officinalis и Т. asperellum 551 в отношении клеточных линий Нек 293, Hela и MCF-7 по сравнению с противоопухолевым действием биопрепарата на основе N. sativa.

2. Выявить гепатопротекгорное действие S. officinalis и Т. asperellum 551 по изменению физиологических, биохимических, гематологических и гистологических показателей у мышей стока CD-I по сравнению с влиянием N. sativa на фоне воздействия тетрахлорметана (ССЦ).

3. Определить фунгистатические характеристики биопрепаратов на основе N. sativa, S. officinalis по изменению физиологических и биохимических параметров патогенных и фитопатогенных грибов: Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Aspergillus awamori и Fusarium oxysporum по сравнению с фунгистатическим действием Т. asperellum 551.

4 Оценить роль экстрактов на основе растительных отходов производства лекарственных масса из N. sativa, S. officinalis в изменении биохимических и биоморфологических характеристик кукурузы по сравнению с влиянием биопрепарата на основе Т. asperellum 551.

Научная новизна работы. Впервые установлено противоопухолевое, гепатопротекторное и фунгистатическое действия растительного масла S. officinalis. Противоопухолевое и гепатопротекторное действия растительного масла S. officinalis не уступает по эффективности фитопрепарату на основе масел N. sativa, а фунгистатическое действие - биопрепарату на основе Trichoderma. Впервые установлено фунгистатическое действие масел N. sativa и его безопасность в отношении неперерожденных клеток Нек 293. Фунгистатическое действие масел N. sativa превосходит по эффективности биофунгицид на основе Т. asperellum 551.

Теоретическая и практическая значимость работы. Получены экспериментальные основания для расширения спектра практического применения биопрепаратов на основе N. sativa, S. officinalis^ и Т. asperellum 551 в медицине и агробиотехнологии. Цитотоксичность метаболитов Т. asperellum 551 и растительных экстрактов N. sativa и S. officinalis по отношению к линиям раковых клеток указывает на возможность использования этих биологических веществ в поддержке больных с онкологическими заболеваниями. Дешевизна и безопасность производства метаболитов Т. asperellum 551, а также растительных экстрактов является предпосылкой для промышленного производства этих веществ и разработки в дальнейшем противоопухолевых препаратов. Расширен спектр возможных биопрепаратов с гепатопротекторным действием за счет фитопрепарата на основе S. officinalis и биопрепарата Фитотрикс на основе 7WcWemza.Отходы производства фитопрепарата па основе S. officinalis могут быть использованы в качестве биофунгицидов и стимуляторов роста кукурузы, а масла N. sativa - в производстве биофунгицидов. Результаты работы могут быть использованы в учебном процессе в рамках дисциплин «Биотехнология», «Биологически активные вещества микробного и растительного происхождения» и «Фармакология».

Положения, выносимые на защиту:

1. Растительные масла N. sativa, S. officinalis и внеклеточные метаболиты Т. asperellum 551 оказывают противоопухолевое действие в опытах т vitro и т vivo и не обладают цитотоксической активностью в отношении неперерожденных клеток. Биологические активные экстракты атгенуируют канцерогенную активность тетрахлорметана (CCL,) и обладают гепатопротекторной активностью у мышей стока CD-I.

2 Масла N. sativa обладают фунгистатическим действием в отношении патогенных и фитопатогенных микромицетов, и превосходит известный биофунгицид на основе Т. asperellum 551.

3. Растительные экстракты S. officinalis и метаболиты Т. asperellum 551 оказывают комплексное позитивное адаптогенное влияние на растения кукурузы, путем стимуляции роста и развития, а также подавления фитопатогенных грибов.

4. Суммарная биологическая активность исследуемых биопрепаратов по воздействию на отдельные параметры живых систем возрастает в ряду: S. officinalis> N. Sativa> Т. asperellum 551.

Степень достоверности результатов исследования. Все научные положения и выводы обоснованы с применением системного анализа поставленной темы исследования современных методов научно-биологических исследований, достоверной выборкой испытуемых, большим объемом фактического материала, который подвергнут математическому анализу. Все проведенные исследований подтверждаются большим объемом многократных лабораторных экспериментов, выполненных и анализированных на современных приборах с высокой точностью; опубликованием полученных данных в Российской и международном научных журналах после рецензирования манускриптов ведущими учеными в данной области; сопоставлением с новыми данными и апробированием возможности использования исследуемых препаратов в поддержке больных с онкологическими заболеваниями и в качестве стимуляторов роста и развития сельскохозяйственных важных растений.

Апробация работы. Основные положения результаты диссертации представлены на следующих конференциях: Третья международная научная интернет-конференция Казанского федерального университета «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии» (19-22 ноября 2012 г.); Ежегодная научная конференция Казанского федерального университета (31 января 2013); Вторая международная научная интернет-конференция Казанского федерального университета «Биотехнология. Взгляд в будущее» (26-27 марта 2013 г.); Вторая международная научная интернет-конференция «Современные тенденции в сельском хозяйстве» Казань, (10-11 октября 2013 г.); Четвёртая международная научная интернет-хонференция Казанского федерального университета «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии» (16-17 октября 2013 г.); Международный симпозиум «Биохимия - основа наук о жизни», посвященного 150-летию образования кафедры биохимии Казанского федерального университета (21-23 ноября 2013 г.); Третья международная научная интернет-конференция Казанского федерального университета «Биотехнология. Взгляд в будущее» (25-26 марта 2014 г.); Четвёртая международная научно-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине», Казанский федеральный университет, Казань, 29 октября - 1 ноября 2014.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа выполнена в соответствии с тематическим планом института фундаментальной медициной и биологии КФУ в рамках проекта «Биохимические, молекулярно-генетические и биоинформационные аспекты взаимодействия нано и биопрепаратов с живыми организмами» (НИР КФУ, девиз Бюджет 12-01), НИЛ «Молекулярные основы патогенеза и терапии опухолевых заболеваний» и «Разработка опытного образца биоудобрения с двойным эффектом для растениеводства. Лабораторные исследования свойств опытного образца биоудобрения». Госконтракт с Фондом содействия развитию МП НТС (30.05.201117.09.2013, N No.9375p/15160).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 научных работы, из них 1 статья в зарубежном издании, включенном в базу систем цитирования ISI Web of Science и Scopus, 4 статей в Российских изданиях, включенных в список Высшей аттестационной комиссии (ВАК), 9 материалов международных и Всероссийских конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 168 страницах машинописного текста, иллюстрирована 4 таблицами и 39 рисунками. Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения и выводов, а также списка литературы, состоящего из 48 отечественных и 188 зарубежных публикаций.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1.1. Объекты исследований

1.1.1. Растительные препараты. Масла, экстрагированные из семян N. sativa и S. officinalis, произведенные фирмой El Hawag Factory (Bader city, Egypt). Растительные водные экстракты из отходов производства масел N.sativa и S. officinalis.

1.1.2. Штаммы Trichoderma. В работе был использован штамм T.asperellum 551, выделенный из почв Республики Татарстан и используемый для производства биопрепарата Фитотрикс.

1.1.3. Объекты воздействия биопрепаратов.

1.1.3.1. Клеточные линии человека. Клеточные линии Нек 293, HeLa и MCF-7, были куплены из фермы Sigma Pvt. Ltd. St. Louis, MO, USA. Клетки выращивали на среде DMEM. Инкубировали в увлажненном инкубаторе с 5% СО2 при 37°С.

1.1.3.2. Подопытные животные (сток мышей CD-I). Здоровые взрослые самцы швейцарских белых мышей на стадии 10-12 недель с массой тела~20 г, были получены из Российской академии наук, Филиал института биоорганической химии имени М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, г. Пущино, Россия.

1.1.3.3. Патогенные и фитопатогенные грибы. Патогенный штаммы A. flavus и A niger получены из ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». Фитопатогенный штамм F. oxysporum получен из музея кафедры биохимии и биотехнологии КФУ. Штамм A. awamori 66А предоставлен лабораторией исследования клеток микромицетов Эдинбургского университета как безопасная модель для работы in vitro.

1.1.3.4. Семена кукурузы. Исследования проводили на семенах кукурузы двух сортов: Краснодарский 194 MB РСт Fl и Поволжский 188 M В1, Fl.

1.2. Методы исследований.

1.2.1. Определения синтеза микотоксинов T. asperellum 551. Для определения синтеза микотоксинов с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) культуры штаммов А. flavus и Т. asperellum 551 инокулировали в жидкую среду глюкозо-картофельный бульон и инкубировали при 28°С в течение 18 суток при аэрации 130 об/мин. Культуральную жидкость использовали для иммуноферментного анализа (ИФА) афлатоксина В1 и охратоксина (Урусов А.Е., 2012).

1.2.2. Определение активности лектинов у Т. asperellum 551. Для приготовления гомогената микромицеты культивировали на Глюкозо-картофельном бульоне (ГКБ) в течение 7 суток при 28°С. Мицелий собирали фильтрованием и промывали дистиллированной водой. Для определения гемагглютинирующей активности лектинов использовали реакцию агглютинации эритроцитов человека 1 группы крови. (De-Mfsa M.D. et al., 2004).

1.2.3. Анализ жизнеспособности неперерожденных и раковых клеток (Нек, HeLa и MCF-7). Клетки высеяли в 96-ти луночные планшеты в концентрации 0,5* 105 клеток/мл. Через 24 часа заменили питательную среду, добавив тестируемые

соединения в различных концентрациях (0, 20, 40, 60, 80 и 100 мг/мл) и инкубировали еще 24 часа. Процент жизнеспособных клеток производили по формуле (Patel S. et al., 2009):

t, (a — fr) * 100% a

Где: а - общее количество клеток; b - количество мертвых клеток.

1.2.4. Цитотоксический анализ. Клетки высеяли в 96-ти луночные планшеты в концентрации 0,5* 105 клеток/мл. Через 24 часа заменили питательную среду, добавив тестируемые соединения в различных концентрациях и инкубировали 72 часа. За ингибирующую концентрацию (IC50) принималась концентрация тестируемых веществ, вызывающая ингибирование роста клеток на 50% относительно контроля с использованием линейной регрессии кривых доза-ответ по SOFTmaxPro. (Patel S. et al., 2009).

1.2.5. Изучение изменения морфологии неперерожденных и раковых клеток (Hek, HeLa и MCF-7). Определяли согласно методике Al-Sheddi E.S. et al., (2014) Изменения в морфологии клеток под воздействием масел визуализировали с помощью оптического микроскопа.

1.2.6. TMRE-анализ мембранного потенциала митохондрий неперерожденных и раковых клеток (Бондарь О.В., 2013).

1.2.7. Изучение гепатопротекторного влияния масел N. sativa, S. officinalis и метаболитов Т. asperellum 551 на физические, биохимические, гематологические и гистологические параметры мышей стока CD-I получавших тетрахлорметан. Схема опыта. Мышам вводили культуральную жидкость Т. asperellum 551, масло N. sativa, S. officinalis и тетрахлорметан в следующих дозировках: ССЦ - 80 мкл / Юг вес тела, N. sativa - 50 мкл / Юг вес тела, КЖ - 125 мкл/Юг вес тела, оливковое масло - 80 мкл / Юг вес тела, S.officinalis - 40 мкл / Юг вес тела. За основу эксперимента был взят метод, описанный ранее в работе (Farhoudi М., Ghodratizadeh S., 2011). Первая группа мышей являлась контролем и получала внутрибрюшинно раз в три дня оливковое масло. Вторая группа получала внутрибрюшинно ССЦ - на первой неделе и масло N. sativa перорально - на второй неделе. Третья группа получала внутрибрюшинно ССЦ - на первой неделе и масло S. officinalis - на второй неделе. Четвертая группа получала внутрибрюшинно ССЦ - на первой неделе и КЖ Т. asperellum 551 - на второй неделе. Пятая группа получала масло N. Sativa перорально - на первой неделе и внутрибрюшинно ССЦ - на второй неделе. Шестая группа получала масло S. officinalis - на первой неделе и внутрибрюшинно ССЦ - на второй неделе. Седьмая группа получала КЖ Т. asperellum 551 перорально - на первой неделе и внутрибрюшинно ССЦ - на второй неделе. Восьмая группа мышей получала ССЦ внутрибрюшинно. Девятая группа получала только масло N. sativa, а десятая -только масло S. officinalis. Одиннадцатая группа получала КЖ Т. asperellum 551.

1.2.7.1. Биохимические параметры мышей. Функционирование печени определяли по содержание белков (Ianculov I. et al., 2010), активности трансаминазы (Reitman S., Frankel S., 1957) и содержанию общего билирубина (Tietz U.M., 1983), -почек - по содержанию белков (Ianculov I. et al., 2010), мочевины (Eisenweiner H.G., 1976) и креатинина (Barties Н. et al., 1972; Larsen К. 1972).

1.2.7.2. Гематологические параметры мышей. Подсчитывали количество красных кровяных телец, уровень гемоглобина, гематокрит (объём форменных элементов крови), средний объём эритроцита (MCV), средний объём гемоглобина

(МСН) и средний размер гемоглобина в эритроците (МСНС) (Dacie S.J., Lewis S.M., 1991).

1.2.7.3. Гистологические параметры мышей стока CD-I получавших тетрахлорметан. Гистологические препараты готовили по стандартной схеме (Коржевский Д.Э., Гиляров A.B., 2010).

1.2.8. Фунгистатическое и стимулирующее влияние биопрепаратов на кинетические и биохимические параметры микромицетов и растительный тест объект - кукуруза. Для изучения влияния на микромицеты использовали КЖ T.asperellum и масла S. officinalis и N. sativa, а для изучения влияния на растения -использовали ЮК T.asperellum, буферный экстракт из отходов производства фитопрепарата Л', sativa и водного экстракта из отходов сухого сбора 5. officinalis.

1.2.8.1. Определение удельной скорости роста микромицетов (Шишаков В.В., 2014). Удельную скорость роста микромицетов определяли по формуле:

2.3 (log di - log do) (ц) --

ti-to

Где: ц - удельная скорость роста, d, - диаметр колонии в конечное время, do - диаметр колонии в начальное время, ti - конечное время, h - начальное время.

1.2.8.2. Определение биохимических параметров: содержание фенолов (Amin I. et al., 2006), флавоноидов (Meda А. et al., 2005), белков (Ianculov I. et al„ 2010), танинов (Makkar H.P. et al., 1993) и ангиоксидантной активности (Priya M.G. et aL, 2011) Хроматографический анализ методом гель-фильтрации на хроматографе АКТА™ avant 25, колонка Superose 12 10/300 GL (GE Healthcare, Швеция), определение ксиланазной целлюлазной и амилазной активности только ь культуральном фильтрате микромицетов (König H.J. et al., 2006).

1.2.9. Методы приготовления биопрепаратов для изучения влияния на

растения.

1.2.9.1.Приготовление буферного экстракта из отходов производства фитопрепарата из N. sativa. 5г отходов производства лекарств на основе семян N. sativa. К промытым отходам добавили 50 мл 100 мМ фосфатного буфера рН-7.4. Фосфатный буфер с семенами поставили на качалку (140 об. /мин) и качали при 37 С в течение 24 часов. Для получения экстракта из отходов семян с фосфатным буфером фильтровали через фильтровальную бумагу.

1.2.9.2.Приготовление водного экстракта S. officinalis из отходов сухого сбора. 5г отхода сухого сбора S. officinalis инкубировали при 100°С в 50 мл дистиллированной воды в течение 30 минут. После этого фильтровали экстракт с помощью фильтровальной бумага.

1.2.9.3. Приготовление культуральной жидкости Т. asperellum 551. Культуральную жидкость Т. asperellum 551 готовили согласно технологии производства биофунгицида Фитотрикс (Ибатуллина Р.П., Алимова Ф.К., 2013).

1.2.10. Фитотоксичность метаболитов N. sativa, S. officinalis и Т. asperellum 551. Семена кукурузы обработали культуральной жидкости Т. asperellum 551, буферным экстрактом N. sativa, водным экстрактом S. officinalis. В течение 7 дней проводили измерения длины корней и проростков.

1.2.11. Получение гомогенатов проростков и корней кукурузы. Отделили части корней от проростков. 0.5 г. каждый образец растерли в ступке до гомогенного состояния с добавлением 5 мл 100 мМ фосфатного буфера рН=7.4. Гомогеиаты

центрифугировали 30 минут при скорости 15000 об/мин, затем слили супернатант в чистые пробирки. Полученные гомогенаты использовали для дальнейших биохимических исследований.

1.2.12. Статистический анализ. Результаты представлены как среднее арифметическое со стандартным отклонением. Достоверность результатов определяли с использованием ANOVA. Уровень значимости, примененный в работе, р < 0,05.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Сравнительная цитотоксическая активность препаратов на основе S. officinalis и Т. asperellum 551 в отношении неперерожденных и опухолевых клеточных линий Нек 293, HeLa и MCF-7 по сравнению с известным противоопухолевым препаратом на основе N. sativa.

Для решения прикладных задач в современной цитологии требуется оценка Í параметров клеток, которые определяют жизнеспособность их популяций (Герасимов И.Г., Попандопуло А.Г., 2007). В связи с этим, нами было изучено влияние 1 растительных масел с известным противоопухолевым эффектом N. sativa в сравнении } с малоизученным метаболитами S. officinalis и Т. asperellum 551 на жизнеспособность клеточных линий Нек 293, HeLa и MCF-7.

2.1.1. Определение средних токсических доз препаратов на основе S. officinalis и Т. asperellum 551 в отношении неперерожденных и опухолевых

клеток человека по сравнению с /V. sativa.

. }

С помощью МТТ-теста определяли ингибирующую концентрацию (IC50) - j концентрацию тестируемых веществ, вызывающих ингибирование пролиферации ( клеток на 50%. Через 72 часа культивирования средняя токсическая доза масла N. sativa для линий клеток Нек 293. Hela и MCF-7 составила 14.04. 1.70, и 1.49 мг/мл соответственно, средняя токсическая доза масла S. officinalis для тех же клеток составила 17.07, 5.66, и 0.68 мг/мл соответственно, а средняя токсическая доза КЖ Т. asperellum 551 для исследуемых клеток составила 15.94, 8.64, и 0.70 мг/мл (Рис. 1).

14.04

17.07

1.70

5.66 —Í—

Нек293

Hela

■ масло N. sativa □ масло S. officinalis Ш КЖ Т. asperellum 551

1.49

0.70

тшЕттгт

MCF-7

Рис.1. Средняя токсическая доза (мг/мл) масел N. sativa, S. officinalis и КЖ Т. asperellum 551 в отношении клеток Нек 293, Hela и MCF-7 в течении 72 часов культивирования.

Таким образом, выявлено значение IC50 относительно клеточных линий MCF-7 и Hela у КЖ Т. asperellum 551 и масла S. officinalis, по сравнению с маслом N. sativa. Полученные результаты, указывают на то, что масла N. sativa, S. officinalis и КЖ Т. asperellum 551 - не оказывают токсическое действие на клетки линии Нек 293. Наибольшая токсичность показана для масла N. sativa в отношении клеток HeLa по сравнению с маслом S. officinalis и КЖ Т. asperellum 551. Наименьшая токсичность к клеткам HeLa выявлена у Т. asperellum 551(Рис. 1).

2.1.2. Влияние масла S. officinalis и КЖ Т. asperellum 551 на морфологию неперерожденных и опухолевых клеток человека по сравнению с N. sativa.

Известно, что внешний вид клетки может дать различную информацию о ней, в том числе о внутриклеточной структуре и содержании различных веществ (Герасимов И.Г., Попандопуло А.Г., 2007). Поэтому нами было изучено действие исследуемых масел и КЖ Т. asperellum 551 на морфологию клеток. Изучая изменения в морфологии, обращали особое внимание и на состояние межклеточных контактов. Изменение в морфологии при обработке клеток маслами N. sativa, S. officinalis и КЖ Т. asperellum 551 носит концентрационно зависимый характер. При всех видах обработки наблюдалось увеличение межклеточных контактов, так же изменялась степень адгезии клеток к поверхности планшета (Рис. 2 и 3).

Согласно результатам эксперимента, под воздействием масел N. sativa, S. officinalis и метаболитов Т. asperellum 551 клетки Нек 293 не претерпевают значительных морфологических изменений, что указывает на их биобезопасность.

При обработке клеток линии HeLa исследуемыми маслами, наблюдается изменение морфологии клеток: клетки округляются и уменьшаются в размерах, пропадают межклеточные контакты, клетки обособляются. При обработке клеток HeLa КЖ Т. asperellum 551 в концентрации 20 мг/мл и 100 мг/мл можно отметать, что с увеличением концентрации КЖ Т. asperellum 551 происходит потеря контактов между клетками, они обособляются, также приобретают округлую форму. Наблюдается деградация клеточных мембран. (Рис.2). Кроме того, при обработке клеток линии MCF-7 маслом N. sativa происходит увеличение размеров клеток с появлением различных нехарактерных выростов мембраны (Рис.3). При концентрации N. sativa выше 80 мг/мл происходит уменьшение размеров и гибель клеток. Масло S. officinalis оказывает губительное воздействие уже при концентрации 60 мг/мл, в этом случае клетки округляются, отсоединяются от дна лунки планшета и плавают в толще среды (Рис.3). При обработке клеток MCF-7 КЖ Т. asperellum 551 в концентрации 60 и 80 мг/мл, с увеличением концентрации уменьшается объем клеток, происходит потеря контактов между ними. Клетки приобретают округлую форму. Наблюдается деградация клеточных мембран (Рис.3).

Рис.2. Морфологические изменения в клетках HeLa под воздействием различных концентраций N. sativa, S. officinalis и Т. asperellum 551 в течение 24 часов культивирования Х200.

S.officinalis

клетки округляются и уменьшаются в размерах

О

íl г-

20 мг/мл Л'.&айЧэ [fÜ

60 мг/мл Т. asperellum

80 мг/мл

I

80 мг/мл Т. asberellmn

увеличение размеров клеток с появлением различных нехарактерных выростов мембраны

потеря контактов

между клетками

деградация клеточных мембран

уменьшение размеров и гибель клеток

Рис.3. Морфологические изменения в клетках MCF-7 под воздействием различных концентраций N. sativa, S. officinalis и Т. asperellum 551 в течение 24 часов культивирования Х200.

2.13. Влияние масла S. officinalis и КЖ Т. asperellum 5S1 на мембранный потенциал митохондрий неперерожденных и опухолевых клеток человека по сравнению с маслом N. sativa.

Апоптоз играет центральную роль в регуляции гомеостаза нормальной ткани и принимает участие в устранении потенциально опасных клеток, в том числе и предшественников опухолевых клеток (Evan G.I., Vousden К.Н., 2001). Митохондрии играют важную роль в регуляции процесса апоптоза. В частности, на ранних стадиях апоптоза наблюдается выделение нескольких белков, в том числе цитохрома-с и апоптоз-индуцирующих факторов, обычно расположенных в межмембранном пространстве (Hengartner М.О., 2000). В эксперименте оценивалось действие исследуемых препаратов на мембранный потенциал митохондрий клеток. Согласно результатам эксперимента, процентное содержание апоптотических клеток Нек 293 в контрольном образце составило 18.65 % (Рис. 4А). Наибольшей апоптотической активностью относительно клеток Нек 293 обладает масло S. officinalis (содержание негативных по TMRE клеток 22.25%) (Рис. 4В). При обработке маслом N. sativa и метаболитов КЖ Т. asperellum 551 содержание апоптотических составило 19.86 и 21.38 % соответственно (Рис. 4 Б, Г). Кроме того, было показано, что в контрольной пробе HeLa - содержание апоптотических клеток составило 24.12% (Рис. 5А). Наибольшей апоптотической активностью относительно клеток HeLa обладает масло S. officinalis — содержание негативных по TMRE клеток в пробе составило 64.90% (Рис. 5В). Процент апоптотических клеток при обработке маслом N. sativa и метаболитов КЖ Т. asperellum 551 составил 59.50 и 53.50% соответственно (Рис. 5 Б, Г). В контрольной пробе MCF-7 - клетках без обработки содержание апоптотических клеток составило 22.63% (Рис. 6А). Наибольшей апоптотической активностью относительно клеток MCF-7 обладает масло S. officinalis — процент негативных по TMRE в пробе составил 37.42% (Рис. 6В). Процент апоптотических клеток при обработке маслам N. sativa и КЖ Т. asperellum 551 составил 28.23 и 28.36 % (Рис. 6 Б,

Г).

Plot РОЗ, gated on POl.Rl

флуоресценция (отн.ед)

флуоресценция (отн.ед)

Рис.4. Распределение флуоресценции 100 нМ TMRE в клетках Нек 293 после культивирования с различными концентрациями N.sativa (Б), S. officinalis (В) и Т. asperellum 551 (Г). *Указаны количество клеток, окрашенных TMRE в процентах.

о Plot РОЗ, gated

флуоресценция (отн.ед)

флуоресценция (отн.ед)

Рис.5. Распределение флуоресценции 100 нМ TMRE в клетках HeLa после культивирования с различными концентрациями N.sativa (Б), S. officinalis (В) и Т. asperellum 551 (Г). ^Указаны количество клеток, окрашенных TMRE в процентах.

aPlot РОЗ, gated on P01.R1

э Plot РОЗ, gated on P01.R1

СГ

(А) контроль кол.окр.% = 22.63

R2

флуоресценция (отн.ед)

Plot РОЗ, gated on P01.R1_

(В) масло 5. officinalis * кол.окр.% = 37.42

К

флуоресиениия (отн.ед)

Plot РОЗ, gated on P01-R1_

(Г) КЖ Г. asperellum кол.окр.% = 28.36

флуоресценция (отн.ед)

флуоресценция (отн.ед)

Рис.6 Распределение флуоресценции 100 нМ TMRE в клетках MCF-7 после культивирования с различными концентрациями N.sativa (Б), S. officinalis (В) и Т. asperellum 551 (Г). *Указаны количество клеток, окрашенных TMRE в процентах.

Исходя из полученных данных, можно предположить, что тестируемые препараты - масла N. sativa и S. officinalis, а также КЖ Т. asperellum 551 - вызывают процесс апоптоза в опухолевых клетках HeLa и MCF-7 и не оказывают токсическое действие на в неперерожденные клетки Нек 293. Известно, что большая часть лечебных свойств N.sativa проявляется благодаря наличию тимохинона, главного биологически активного компонента эфирного масла (Bamosa А., 2014). Тимохинон взывает р53-независимый апоптоз через активацию каспаз, в частности, каспазы-3 и -8, а также изменение митохондриальных событий в р53-нулевых HL-60 клеток

миелобластного лейкоза. Кроме того, например, обработка HL-60 клеток тимохиноном вызвала заметное увеличение коэффициента Вах/ВС12 за счет увеличения Вах и снижения экспрессии ВС 12 белков (EL-Mahdy М.А. et al., 2005). Вероятно, такой же механизм индукции апоптоза опухолевых клеток отмечен у клеток HeLa и MCF-7 под влиянием КЖ Т. asperellum 551, т.к. у последнего также доказана способность к синтезу тимохинона. Механизм противоопухолевого действия масла S. officinalis не известен. Таким образом, регистрация явления апоптоза, в большей степени у клеток MCF-7, позволило предположить наличие у масла S.officinalis и метаболитов Т. asperellum 551 противоопухолевого эффекта аналогичного - маслу N. sativa. Отсутствие апоптоза у неперерожденных клетках Нек 293 указывает на биобезопасность исследуемых препаратов (Рис. 4,5 и 6). Нами показано отсутствие содержания микотоксинов и наличие лектинов у T.asperellum 551, что дает вероятно указывает на причину отсутствия токсического действия на клетки Нек 293 и токсического - на опухолевые. Данные представляют особенный интерес, поэтому требуются дальнейшие исследования для потенциального применения этих препаратов для лечения различных заболеваний, в том числе и опухолевых.

2.2. Влияние препаратов на основе S. officinalis Т. asperellum 551 на биохимию и морфологию органов лабораторных мышей, получавших тетрахлорметан по сравнению с действием N. sativa.

Несмотря на то, что различными авторами накоплено большое количество данных о разнонаправленном действии масел N.sativa, S. officinalis и метаболитов КЖ Trichoderma вопрос об их влиянии на важные показатели организма остается недостаточно изученным (Gupta et al., 2014; Al-Sheddi E.S. et al., 2014).

Известно, что тетрахлорметан (ССЦ) является сильным гепатотоксином, который, в первую очередь, поражает печень и почки (Khalaf А.А. et al., 2009). Поэтому нами было изучено влияние препаратов на основе S. officinalis Т. asperellum 551 по сравнению с N. sativa на биохимические параметры печени и почек мышей получавших тетрахлорметан.

2.2.1. Влияние препаратов на основе S.offlcinalis и Т. asperellum 551 на биохимические параметры печени и почек по сравнению с N. sativa.

Было протестировано действие тетрахлорметана и масел N.sativa, S. officinalis и КЖ Т. asperellum 551 на основные показатели функционирования печени, а именно, активность аспартатаминотрансферазы и аланинтрансаминазы, а также концентрацию билирубина в сыворотке крови. Согласно результатам эксперимента мыши, подвергавшиеся действию тетрахлорметана, имели высокий уровень трансаминаз и общего билирубина, что говорит об интоксикации организма и ухудшении работы печени (Табл.1). Введение мышам масел N. sativa, S. officinalis и КЖ Т. asperellum 551 до или после тетрахлорметана оказывает благоприятное действие на функционирование печени, что, вероятно, объясняется активацией защитных механизмов, которые могут происходить, либо в результате индукции генов некоторых защитных ферментов, либо путем инактивации CYP2EI (Takahashi S. et al., 2002). В таблице 2 представлены данные о влиянии исследованных препаратов на состояние почек мышей (содержание креатинина и мочевины). Согласно результатам эксперимента, было отмечено достоверное увеличение

концентрации мочевины и креатинина при обработке тетрахлорметаном, что указывает на дисфункцию почек (Табл. 2). Таким образом, тетрахлорметан оказывает резко токсическое действие на печень и почки мышей, вызывая их дисфункцию. После введения масел N.sativa, S.offcinalis и КЖ Т. asperellum 551 наблюдается тенденция к восстановлению работы почек. В группах 9, 10 и 11, где мыши получали только масло N.sativa или S.offlcinalis или КЖ Т. asperellum 551, нарушения работы почек не выявлены.

Таблица 1

Влияние масел N. sativa, S. officinalis и КЖ Т. asperellum 551 на основные показатели функционирования печени мышей стока CD-1 получавших тетрахлорметан

Вариант Основные показатели печени

АлАТ, ед./л ± SD АсАТ, ед./л ± SD Общий билирубин (мг %) ± SD

Группа 1 (Контроль) 45.20 ± 1.90 53.20 ±3.84 0.37 ±0.30

Группа 2 (ССЦ + N8) 47.22 ± 4.00 56.42 ± 12.40 0.32 ±0.18

Группа 3(СС14 +80) 45.00 ±4.44 49.50 ±4.44 0.38 ±0.12

Группа 4 (ССЦ + КЖ) 45.56 ±2.22 49,50 ± 2.22 0.38±0.11

Группа 5 (N8 + ССЦ) 50.22 ± 9.80 58.22 ± 12.16 0.41 ±0.10

Группа 6 (БО + ССЦ) 53.42 ± 12.40 61.22* ±5.78 0.36±0.12

Группа 7 (КЖ+ССЦ) 55.55 ±6.20 61.22* ±2.89 0.39 ±0.16

Группа 8 (ССЦ +.....) 119.20* ±7.96 171.05* ±3.86 5.22* ±2.48

Группа 9 (N8 +.....) 45.50 ±4.56 53.80 ±7.36 0.40 ±0.24

Группа 10 (80 +.....) 46.20 ±7.56 55.20 ±2.40 0.42 ±0.18

Группа 11 (КЖ+.....) 47.73 ±2.11 54.12 ±4.00 0.44 ± 0.09

* Значимо отличаются от контроля (р < 0.05).

Таблица 2

Влияние масел N. sativa, S. officinalis и КЖ Т. asperellum 551 на основные показатели функционирования почек мышей стока CD-I получавших тетрахлорметан

Вариант Основные показатели почек

Мочевина (мг%) ± SD Креатинин (мг%) ± SD

Группа 1 (Контроль) 25.22 ±4,16 0.63 ± 0.26

Группа 2 (ССЦ+ N8) 26.33 ± 2,30 0.62 ± 0.20

Группа 3 (ССЦ + 80) 26.15 ± 1,80 0.64 ± 0.40

Группа 4 (ССЦ + КЖ) 25.15 ± 1.91 0.65 ±0.13

Группа 5 (N8 + ССЦ) 26.12 ±3.88 0.61 ± 0.24

Группа 6 (80 + ССЦ) 25.98 ±5.48 0.62 ± 0.28

Группа 7 (КЖ +ССЦ) 26.12 ± 1.74 0.63 ± 0.25

Группа 8 (ССЦ +.....) 58.42* ± 6,04 2.12* ±0.48

Группа 9 (N8 +.....) 25.12 ±2,28 0.66 ± 0.62

Группа 10 (80 +.....) 26.12 ±5,8 0.65 ± 0.24

Группа 11(КЖ+.....) 26.15 ±2.97 0.64 ±0.10

* Значимо отличаются от контроля (р < 0.05).

Таким образом, исследуемые препараты, по данным изменения биохимических показателей, вероятно, могут атгенуировать токсическое действие тетрахлорметана. Гепатопротекторным действием после воздействия токсинов обладают все

исследуемые препараты в равной степени. Следует отметить, что введение масел N.sativa или S.qfficinalis или КЖ Т. asperellum 551 смягчает влияние тетрахлорметана на функционирование почек и печени мышей, что указывает на их гепатопротекторное действие. Использование масел или КЖ Т. asperellum 551 до введения тетрахлорметана не вызывало ожидаемого профилактического эффекта, возможно, это связано со спецификой действия метаболитов, содержащихся в исследуемых препаратах.

2.2.2. Влияние препаратов на основе S. officinalis и Т. asperellum 551 на гистологию печени мышей, получавших тетрахлорметан по сравнению с N. sativa.

На фотографии среза печени контрольной мыши хорошо видно компактное расположение гепатоцитов, они неправильной многоугольной формы, имеют нормальную клеточную архитектуру, у нормальных гепатоцитов в клетках с хорошо сохранившейся цитоплазмой видны и ядро, и ядрышко (Рис 7А). После воздействия тетрахлорметана обнаружены некоторые повреждения клеток и центродолевые заторы, нет инфильтрации воспалительных клеток, увеличилась митотическая активность, обнаружен интенсивный нейтральный инфильтрат, обширное жировое перерождение и тяжелый центродолевой некроз (Рис. 7Б).

У мышей, получавших в качестве терапии масло N. sativa, S. officinalis и комплекс метаболитов КЖ Т. asperellum 551 после тетрахлорметана обнаружено улучшение в ткани печени и заметна умеренная степень жировых изменений, повреждение ткани и некроз были выражены в меньшей степени, чем в группе с ССЦ. (Рис. 7Г, Д). Кроме того, нет расстройства и заметны нормальные печеночные пластинники (Рис. 7В) и нормальная клеточная архитектура (Рис. 7 Д). Данные проведенного исследования подтверждают результаты, полученные Khalaf A.A. et al., (2009)

(Г) CCI, + иасло X о/ПсймК (Д)СС1, + КЖ Т. аьрекПцо, SSI

Рис.7. Влияние N. sativa, S. officinalis, Т. asperellum 551 и тетрахлорметана на гистологию печени хЮО.

Тетрахлорметан рассматривается как гепатотоксин, действующий напрямую на печень и приводящий к лобулярному некрозу и стеатозу. Механизм печеночных повреждений тетрахлорметаном включает в себя перекисное окисление липидов мембран, связанных с жирными кислотами, которое приводит к разрушению клеточной мембраны и внутриклеточных органелл гепатоцитов (Adewale О.В. et al, 2014). Таким образом при исследовании влияния исследуемых препаратов на гистологию печени мышей, получавших тетрахлорметан, выявлено, что масло N. sativa, S. officinalis, а также КЖ Т. asperellum 551 возвращают нормальную архитектуру тканей печени. При обработке мышей исследуемыми препаратами уменьшается количество двухъядерных гепатоцитов, сохраняется баночная структура ткани по сравнению с обработанной только тетрахлорметаном. Также, исследуемые препараты предотвращают воспалительные и некротические процессы в ткани печени, возвращая ее нормальную морфологическую структуру.

Полученные данные коррелируют с результатами предыдущего исследования, где было выявлено, что при применении жидкого препарата Т. asperellum 551 в течение 7 дней после воздействия менее токсичного гепатоксина - пирена выявлена тенденция к восстановлению печеночной ткани: дольчатая структура органа восстанавливается; вокруг кровеносных сосудов заметны обширные участки пролиферирующих ярко окрашенных гепатоцитов, имеющих более плотную структуру (Абдельрахман А. А., 2011). Таким образом гематологические исследования подтвердили гепатопротекторный эффект исследуемых препаратов.

2.3. Фунгнстатическая активность препаратов на основе масел N. sativa и S. officinalis по данным изменения физиологических и биохимических параметров в отношении патогенных и фитопатогенных грибов по сравнению с известным фунгицидом на основе Т. asperellum 551.

Фармацевтический и сельскохозяйственный рынки испытывают дефицит эффективных фунгистатических препаратов. Нами исследовалось влияние препаратов на возбудителей аспергилеза- A. niger, A. Jlavus и возбудитель фузариоза F. oxysporum. В работе также изучалось влияние на вид A. awamori, используемый как модельный при работе с патогенами. Патогенные виды являются причиной микозов, аллергии и других заболеваний человека Известно, что фитопатогенные микромицеты инфицируют многие растения и, таким образом, влияют на рост и продуктивность растения на всех стадиях развития. Они выделяют много токсинов в пище и кормах. Для снижения уровня их токсинов, а также разрушения токсинов в пище и кормах используются разные физические, химические и биологические методы для предотвращения роста этих грибов (Thanaboripat D., 2002, Drizhinina I.S. et al., 2011). Препараты на основе Trichoderma хорошо известны как фунгистатические и фунгицидные препараты, широко используемые в агробиотехнологии как альтернатива пестидам (Алимова 2006, Ибатуллина Р.П., Алимова Ф.К., 2013). В литературе появились данные о возможном фунгиститическом эффекте масел N. sativa и S. officinalis (Aljabre S.H. et al., 2005; KhalilR., Li Z., 2011).

2.3.1. Влияние масел N. sativa и S. officinalis на физиологические параметры патогенных и фитопатогенных грибов по сравнению с влиянием Т. asperellum. 551.

Способность к росту является одним из основных свойств микроорганизмов. Удельная скорость роста является одним из важных физиологических параметров микроорганизмов. Для изучения влияние масел N. sativa, S. officinalis и культуральной жидкости Т. asperellum 551 на физиологические параметры микромицетов нами была исследована удельная скорость роста патогенных штаммов A. niger, A.flavus и фитопатогенного штамма^, oxysporum, которые были обработаны в разных вариантах маслами и Т. asperellum 551. Как показано на рисунке 8 А, Б, В и Г скорость роста A. niger, A. flavus, A. awamori и F. oxysporum снизились на 86, 75, 84 и 85% соответственно по сравнению с контролем после обработки маслом N. sativa и S. officinalis в течение 168 часов инкубации при 28°С. А после обработки КЖ Т. asperellum 551 скорость роста данных патогенных грибов снизились на 75, 25, 67 и 68% соответственно по сравнению с контролем. Кроме того, следует заметить, что на данном рисунке видно, что, максимальная скорость роста A. awamori была регистрирована после 72ч инкубации (Рис. 8В), а максимальная скорость роста А. niger, A. flavus и F. oxysporum было отмечена после 24ч инкубации (Рис. 8 А, Б и Г).

A.flavus

—♦ - - Контроль

Время, ч —А— масло N.sativa •

-масло S.officinalis •

Время, ч КЖ T.asperellum 551

Рис.8. Влияние масел N. sativa, S. officinalis и КЖ Т. asperellum 551 на удельную скорость роста A.niger (A); A.flavus; (Б); A.awamori. (В) и F. oxysporum (Г).

Отмеченное нами ингибирование роста тестируемых микромицетов, вероятно, связано с содержанием в маслах N. sativa и S. officinalis фунгистатических веществ типа сесквитерпеновых лактонов и а-терпинен соответственно (Байкова Е.В. и др., 2002).

Фунгистатическое действие Т. asperellum связано с содержанием комплекса соединений с антибиотическим типом действия типа пептаиболов, белка параселсина, трихотецина, триходермина, глиотоксина, виридина, вортманина и других (Shi М. et al., 2010). Самоактивируемый виридин является пролекарством, медленное высвобождение и. цитотоксическое действие которого, как предполагают, могут быть полезны в химиотерапии (Smith R. et al., 2009). Цитотоксическая активность глиотоксина, как правило, опосредована прямой инактивациеи тиолов белка (Hume A. et al., 2000). Анализ результатов проведенных исследовании показывает, что масла N. sativa и officinalis обладают большей способностью к снижению удельной скорости роста патогенных и фитопатогенных микромицетов, чем КЖ Т. asperellum 551. Поведение модельного микромицетаЛ. awamori совпадает с чувствительностью патогенных видов A. niger и A. flavus (Рис. 8).

2.3.2. Влияние масел N. sativa, S. officinalis на биохимические параметры патогенных и фитопатогенных грибов по сравнению с влиянием Т. asperellum.

Для подробного изучения механизма фунгистатического действия масел N. sativa и S officinalis и КЖ Т. asperellum 551 нами было изучено изменение содержания белков, фенолов, флавоноидов и танинов, а также антиоксидантнои активности в культуральной жидкости тестируемых микромицетов (Рис.9).

Обработка маслом N. sativa на 25 и 40% увеличивает содержание белка в кучьтуралъной жидкости A. flavus и A. awamori, обработка маслом S. officinalis - на 30% у A. awamori, обработка КЖ Т. asperellum 551 - на 49 и 54% у A. mger и Ь. oxvsporum соответственно и снижает действие последнего на 38% у A. awamori (Рис. 9Á) Результаты нашего исследования также показали, что обработка маслом А. sativa на 44% увеличивает содержание фенолов в культуральной жидкости у A. niger маслом S. officinalis - на 11% у A. flavus. После обработки КЖ Т. asperellum 551 содержание фенолов в культуральной жидкости на 42% снижалось у A. flavus (Рис. 9Б). В данной работе похазано, что после обработки маслом N. sativa содержание флавонидов в культуральной жидкости увеличивается на 82% у A. awamori, после обработки маслом 5. officinalis - на 52 и 38% у A. awamori и F. oxysporum соответственно, после обработки КЖ Т. asperellum 551 - на 35% у A.flavus (Рис. 9В).

При изучении влияния исследуемых препаратов на содержание танинов было отмечено при обработке маслом N. sativa увеличение на 63% содержания танинов в культуральной жидкости A. awamori, под воздействием Т. asperellum 551 - на 41 и 28% в культуральной жидкости A. niger и F. oxysporum соответственно (Рис. 9Г).

Кроме того, обработка маслом N. sativa и ОС Т. asperellum 551 увеличивает антиоксидантную активность культуральной жидкости A. niger на 20% и 17% соответственно, обработка маслом S. officinalis практически полностью ингиоирует антиоксидантную активность этого гриба. Обработка маслами N. sativa или S. officinalis увеличивает антиоксидантную активность в культуральной жидкости А. fiavus на 15%, а обработка Т. asperellum 551 - на 17%.

По данным биохимического анализа поведение модельного микромицета А. awamori более чувствительно по сравнению с патогенными видами A. niger и А. flavus и его реакция на фунгистатические вещества не отражают полностью реакцию патогенных микромицетов.

A. niger A. flaws A.awamori F.oxyspomm A. nigerm A. flavus A.awamori F.oxysporvm

ш^ш масло N.sativo !_I масло S. officinalis I_IНЖ T. aspereiium 551 — — —Контроль

Рис.9. Влияние масел N. sativa, S. officinalis и КЖ Т. aspereiium 551 на содержание белков (А), фенолов (Б), флавоноидов (В) и танинов (Г) в культуральной жидкости фитопатогенных грибов.

Масло A', sativa оказывает больший эффект по сравнению с маслом S. officinalis и культуральной жидкости Т. aspereiium 551 на выработку метаболитов тестируемыми микромицетами. Кроме того, при исследовании влияние исследуемых препаратов на антиоксидантную активность культуральной жидкости патогенных и фитопатогенных микромицетов было отмечено увеличение выделения в культуральную жидкость A. fiavus и A. niger соединений, перспективных в качестве противоопухолевых средств. Производство любых биопрепаратов, как правило, сопряжено с накоплением отходов, которые также могут представлять экономический интерес, в частности для агробиотехнологии, по аналогии с биопрепаратом Фитотрикс на основе Trichoderma, который может иметь как медицинское, так и сельскохозяйственное значение.

2.4. Влияние метаболитов N. sativa, S. officinalis, полученных на основе отходов производства лекарств, на растение (фитотоксичность) по сравнению с влиянием Т. asperelliwu

В качестве тест объекта использовали кукурузу, которая является важнейшей культурой в России. Актуальной является задача по разработке биопрепаратов для защиты, увеличения роста и продуктивности кукурузы (Лукаткин A.C. и др., 2013).

Хорошо известны положительные результаты по использованию в растениеводстве биопрепаратов на основе Trichoderma. В связи с этим была

произведена оценка влияние исследуемых биопрепаратов на основе N. sativa, S. officinalis на физиологические и биохимические параметры кукурузы по сравнению с влиянием Т. asperellum.

2.4.1. Влияние метаболитов N. sativa, S. officinalis и Т. asperellum на физиологические параметры кукурузы.

Нами была произведена оценка динамики развития проростков кукурузы двух сортов: Краснодарский 194 и Поволжский 188, обработанные культуральной жидкостью Т. asperellum 551, экстрактами S. officinalis и N. Sativa (контроль-КГ среда, вода и фосфатный буфер). Фитотоксический эффект экстракта N. sativa на рост проростков и корней кукурузы составил 80% (Рис. 10А и Б).

Обработка семян кукурузы экстрактом S. officinalis значительно (Р < 0.05) увеличивает длину корней и проростков кукурузы обеих сортов в равной степени (на 45%) и высоту растений, в большей степени Поволжского сорта (на 30%). Стимулирование длины корней и проростков кукурузы культуральной жидкостью Т. asperellum 551 уступает по эффективности экстракту S. officinalis (Р < 0.05).

V 6

4 -

ШКраснодарский 194 ■ поволжский 188

3.89

3.18

т.. 2.78 % гп 2.7

::IL 1Л1

5.06 4 Q4

Il il ia

КГ кж

Т.asperellum 551

Ш Краснодарский 194 I поволжский 188

Вода

экстракт фосфатный экстракт

S. officinalis буфер

N. sativa

ш поволжский 188 V 2J7

2.16 2.08 2Т18 S H

II* I I J

1111И И И 111111 m , m m , m\

КЖ T.asperellum 551

Вода

0.5 0.45

ШШ

экстракт фосфатный экстракт S.officinalis буфер N.sativa

Рис.10. Влияние культуральной жидкости Т. asperellum 551, экстрактов N. sativa и S. officinalis на длину корней (А) и проростков кукурузы (Б).

2.4.2 Влияние метаболитов N. sativa, S. officinalis и Т. asperellum на содержание белков, флавоноидов, танинов и фенолов в корнях и проростках кукурузы.

Исследуемые биохимические показатели использовались для выяснения механизма действия на растения. Экстракты N. sativa ингибируют исследуемые физиологические и биохимические параметры кукурузы. Под действием экстракта S. officinalis содержание белков в корнях и проростках увеличивалось в среднем на

27%, фенолов - в корнях и проростках на 40% и 49% соответственно, флавоноидов -в корнях и в проростках на 65% и 78% соответственно, танинов - в корнях и в проростках на 29% и 80% соответственно, антиоксидантная активность увеличилась в корнях и проростках в среднем на 35%. Положительное действие водных экстрактов S. officinalis сопоставимо с положительным действием биопрепарата на основе Т. asperellum. Показано комплексное положительное влияние на кукурузу водного экстракта отходов производства лекарственных средств из S. officinalis, оказывающего не только стимулирующее действие, но и улучшающее питательную ценность и другие важные биохимические характеристики растения. Таким образом, выявлены новые характеристики для лекарственных препаратов на основе масел N. sativa, S. officinalis и Т. asperellum 551, что позволит расширить спектр их применения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты экспериментов подтвердили терапевтическое, гепатопротекторное и противоопухолевое действие масла N. sativa, а также выявили новые характеристики для биопрепаратов на основе масла S. officinalis и КЖ Т. asperellum 551. Нами было показано, что комплексы метаболитов N. sativa, S. officinalis и КЖ Т. asperellum 551 способствуют нивелированию гепатотоксического действия тетрахлорметана на организм мышей и оказывают цитотоксическое действие в отношении раковых клеток Hela, MCF-7, восстанавливают основные биохимические показатели печени и почек у мышей. Отсутствие цитотоксического действия на клетки Нек 293 подтвердило их биобезопасность. На основании кинетических и биохимических параметров выявлено фунгистатическое действие метаболитов масел N. sativa, S. officinalis и КЖ Т. asperellum 551 в отношении патогенных (A. niger и А. flavus) и фитопатогенных (F.oxysporum) мнкромицетов. Исследована возможность использования не только самих лекарственных средств на основе растительных масел, но и отходов их производств. Показана перспективность использования водных экстрактов отходов производства лекарственных препаратов из S. officinalis в агробиотехнологии для защиты и повышения урожайности кукурузы. Эффективность последнего сопоставима с известным биопрепаратом Фитотрикс на основе Trichoderma. В дальнейшем требуются исследования по выделению конкретных метаболитов N. sativa, S. officinalis и КЖ Т. asperellum 551 для изучения механизма их действия и получения новых лекарственных препаратов.

Проведенная экспериментальная работа позволила сделать следующие основные выводы:

1. Показано, что растительные экстракты S. officinalis и метаболиты T.asperellum 551 оказывают цитотоксическое действие на опухолевые клетки линии HeLa и MCF-7, и безопасны для клеточных линий Нек293 и сопоставимы с действием противоопухолевого препарата на основе N. sativa.

2. Установлено, что масла S. officinalis и метаболиты T.asperellum 551 атгенуируют гепатоканцерогенную активность гепатотоксина тетрахлорметана и восстанавливают нормальные биохимические, гематологические и гистологические показатели у мышей стока CD-I в опытах in vivo аналогично с действием масел N. sativa.

3 Установлена фунгистатическая активность экстрактов N. saliva, S. officinalis аналогичная с действием биофунгицидов на основе T.asperellum 551 в отношен™ патогенных (A. niger, A. flavus) и фитопатогенных видов (i-.oxysрогит). Наибольшая эффективность в подавлении микромицетов выявлена у N. sativa.

4 Экстракты'растительных отходов производства фитопрепарата из 5. officinalis и биопрепарат на основе T.asperellum 551 стимулируют рост кукурузы и увеличивают содержание в них флавоноидов, танинов, белков и фенольных соединений.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I. Статьи, опубликованные в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определенных ВАК:

1 Эльшафей С.М.А. Влияние растительных масел Nigella sativa и Salvia officinalis ' на биохимические показатели мышей стока CD-I / С.М.А. Элыиафей, А.А.

Абдельрахман, Р.И. Тухбатова, Е.В. Иванова, Е.А. Акинина, Ю.Е. Воронцова, Л.С. Evkvdv АН Фаттахова, Ф.К. Алимова // Ученые записки Казанского Университета, Серия Естественные науки. -2013.-Т.155. -№ 3. - С. 82-89. (Список

ВАК, РИНЦ-0,030). , , .

2 Эльшафей С.М.А. Изменение состава метаболитов Trichoderma harzianum и фитопатогенных грибов при воздействии масла шалфея лекарственного / С.М.А. Эльшафей, Т.А. Невзорова, А.А. Абдельрахман, Р.И. Тухбатова С.С Рябичко, Ф.К. Алимова // Фундаментальные исследования. -2014. - Т.8. -№ 3. - С. 646-6DU.

(Список ВАК, РИНЦ-0,296). 3. Эльшафей С.М.А. Влияние экстрактов Nigella sativa п Salvia officinalis на физиологические и биохимические показатели растений / С.М.А. Эльшафей, А.А. Абдельрахман, Е.А. Акинина, Р.И. Тухбатова, С.С. Рябичко, Ф.К Алимова// Фундаментальные исследования. -2014. - Т.9. 2,- С. 349-354. (Список ВАК,

РИНЦ-0,296). , .

4 Abd El-Rahman А.А. Cytotoxicity of Trichoderma spp. cultural filtrate against human

cervical and breast cancer cell lines / A.A. Abd El-Rahman, S.M.A. El-Shafei, E.V.

Ivanova, A.N. Fattakhova, A.V. Pankova, M.A. El-Shafei, E.A. El-Morsi, F.K. Alimoya

// Asian Рас J Cancer Prev.-2014.-V.15.-No.17. - P.7229-7234. (Список ВАК,

Импакт-фактор JCR-1.5). 5. Эльшафей С.М.А. Цитотоксическая активность растительных масел Mgetta sativa, Salvia officinalis и пептидных метаболитов Streptomyces mirabilis FK749 против раковых клеточных линий HeLa и MCF-7 / С.М.А. Эльшафей, А.А. Абдельрахман, ШЗ Валидов, А.Г. Бикмуллин, Э.Р. Санатова, Л.М. Залялютдинова, А.Н. Фаттахова, Ф.К. Алимова // Гены & Клетки. -2014. -Т.9- № 3. -в печати (Список ВАК, РИНЦ-0,403).

II. Тезисы докладов региональных и международных конференций:

6 El-Shafei S.M.A. Rapid evaluation of black seed oil and salvia oil for antifungal activity against some plant pathogenic fungi / S.M.A. El-Shafei, A.A. Abd-El-Rahman R.I. Tukhbatova, A.M. Sirinovna, E.V. Ivanov, E.A. Akinina, J.E. Voronkova, L.C. Bukuru, FK Alimova // Book of abstracts of the 3nd international onlme conference :

biochemistry and biotechnology, Kazan (Volga region) federal university, Kazan, 19-22

- November, 2012,- P.340-341.

7. Мухаметзянова A.M. Влияние масла черного тмина, шалфея и культуральной жидкости Trichoderma на жизненные показатели мьпней / A.M. Мухаметзянова, С.М.А. Эльшафей, А.А. Абдельрахман, Р.И. Тухбатова, Е.В. Иванова, Е.А. Акинина, Ю.Е. Воронкова, JI.C. Букуру, Ф.К. Алимова, А.Н. Фатгахова // Сборник трудов III Международная конференция: "Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологий" Казанский федеральный Университет, Казань, 19-22 ноября

2012.-С.201-202.

8. EI-Shafei S.M.A. Screening of ultrastructural changes in maize seedlings treated with Trichodema, black cumin and salvia extract / S.M.A. El-Shafei // Book of abstracts of the 2nd international online scientific conference Biotechnology: Looking to the future, Kazan (Volga region) federal university, Kazan, 26-27 March 2013. - P.423-424.

9. Эльшафей С.М.А. Влияние экстракта черного тмина, шалфея и культуральной жидкости Trichoderma на некоторые показатели растений in vivo / С.М.А. Эльшафей, A.M. Мухаметзянова, А.А. Абдельрахман, Р.И. Тухбатова, Е.В. Иванова, Е.А. Акинина, Ю.Е. Воронкова, Л.С. Букуру, Ф.К. Алимова // Сборник трудов II Международная научная Интернет конференция "Биотехнология. Взгляд в будущее" Казанский федеральный Университет, Казань, 26-27 марта, 2013. -Т.2.-С. 341-342.

10. El-Shafei S.M.A. Changes in enzymatic activity of some plant pathogenic fungi h eated with Nigella sativa and Salvia officinalis essential oil / S.M.A. EI-Shafei, A.A. Abd-El-Rahman, E.V. Ivanov, R.I. Tukhbatova, A.M. Sirinovna, E.A. Akinina, J.E. Voronkova, F.K. Alimova // Book of abstracts of the 2nd international online scientific conference, "Modem trends in agriculture dedicated to the day of the Russian agricultural workers" Kazan, 10-11 October 2013.-T.2.-P.133-134.

11. Эльшафей C.M.A. Биологическое действия метаболитов масла черного тмина и шалфея лекарственного на биохимические параметры фитопатогенных грибов / С.М.А. Эльшафей, А.А. Абдельрахман, Р.И. Тухбатова, Е.В. Иванова, Е.А. Акинина, Ю.Е. Воронкова, Ф.К. Алимова // Сборник трудов IV Международная научная Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии" Казанский федеральный Университет, Казань, 16-17 октября

2013. -C.164-I65.

12. Эльшафей С.М.А. Хроматографический анализ метаболитов некоторых фитопатогенных грибов, обработанных маслом черного тмина / С.М.А. Эльшафей, Т.А. Невзорова, А.А. Абдельрахман, Р.И. Тухбатова, Е.В. Иванова, Е.А. Акинина, Ю.Е. Воронкова, Ф.К. Алимова // Сборник трудов международной симпозиумы «Биохимия - основа наук о жизни» посвященного 150-летию образования кафедры биохимии, Казанский федеральный Университет, Казань, 21-23 ноября 2013. -С.139

13. EI-Shafei S.M.A. Cytotoxic effects of essential oils of some plants and Trichoderma metabolites against cancer cell lines in vitro / S.M.A. El-Shafei, E.V. Ivanov, A.A. Abd-El-Rahman, A.N. Fattakhova, F.K. Alimova // Book of abstracts of the 2nd international online scientific conference Biotechnology: Looking to the future, Kazan (Volga region) federal university, Kazan, 25-26 March 20I4.-T.2.-P.165-166.

14. El-Shafei S.M.A. Inhibitory and cytotoxic activities of Nigella sativa and Salvia officinalis on HeLa and MCF-7 cancer cell lines by induction of apoptosis / S.M.A. El-

Shafei. A. A. Abd El-Rahman, A.G. Bikmullin, F.K. Alimova// Book of abstracts of the 4* international conference on science and applied research "Post-genome methods of analysis in biology and laboratory and clinical medicine", Kazan (Volga region) federal university, Kazan, 29 October- 1 November, 2014.-P.143.

Автор выражает глубокую признательность научному руководителю д.б.н. проф. Алимовой Ф.К. за внимательное отношение к работе; д.б.н., проф. Абрамовой З.И. за советы в процессе выполнения диссертационной работы; к.б.н., доц. Фаттаховой А.Н. за помощь при приведении исследований на животных; к.б.н. Абдуллину Т.И. за помощь в проведении исследований на опухолевых клетках; кбн Бондарь О.В. за консультации в процессе выполнения работы по цитотоксичности; Валидову Ш.З., к.б.н„ с.н.с. каф. биохимии и биотехнологии за консультативную помощь; д.б.н. проф. Эльшафей М.А и Эльморсей Э.А. за ценные идеи в процессе выполнения работы. Автор выражает глубокую благодарность родителям за поддержку и помощь при выполнении работы. Благодарность выражается к.б.н. Абдельрахман А.А. за помощь и советы в процессе выполнения работы. Благодарность выражается всем преподавателям, сотрудникам, аспирантам и студентам кафедры биохимии и биотехнологии КФУ.

Просьба посылать отзывы на автореферат по адресу: Казань, 420008, ул. Кремлевская, 18, Казанский университет, отдел аспирантуры, Ученому секретарю Диссеотациониого совета Д212.081.08 проф. Абрамовой Зинаиде Ивановне. Факс 8(843)238-76-01. E-mail: atefnagi2000@yahoo.com, Тел: +79518922596.

Заказ № 434 Формат 60*84//1б. Объем1,75 п.л. Тираж 100 Бумага офсетная

.отпечатано с готовых оригинал-макетов в ООО «Альфа-К» 420029, РТ, г.Казань, ул. Сибирский тр. 34, корп. 10 Тел 510-96-35 , 8 917 260 06 28