Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика биологических свойств атипичных штаммов сибиреязвенного микроба, усовершенствование методов их идентификации и дифференцирования от близкородственных бацилл

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рязанова, Алла Геннадьевна

ВВЕДЕНИЕ Я

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Современная характеристика В anthracis к блммеородеткшшх бацилл

1.2, Атипичные штаммы В attihrocis 33 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2. Г ■ Материалы

24.1- Бактериальные ШТ1ММЫ и бактериофаги

2.1.2 Экспериментальные животные

2,1 Химические реютлы и ««тигельные среды

2.1.4. Праймеры дня ПНР

2.1.5, Оборудование

22- Методы SO

2-2Л. Фенотц|гичесК1й тесты 50 2.2,2. Метод сочетанного определения продукции токсина н капсулы hi vitro

2-2.3. Метод определения гемолитической н протсолитччмкоЛ активности

2.2.4. Метол шшкш динанпепышх питательных потребностей смбнрсячлепного микроба

22 5. Метод экстракции ДНК сибиреязвенного микроба и близкородственных бдцилл роли Bacillus

22.6, Метод полнмераэной цепной реакции

2-2 7, Методы статистической обработки

ГЛАВА 3 АНАЛИЗ РАСПРОСТРАНЕННОСТИ АТИПИЧНЫХ

ШТАММОВ В ASTHRAC1S, ВЫДЕЛЕННЫХ В ПРИРОДНЫХ УСЛОВИЯХ

3.1. Ретультвты идентификации штачмов, проведенной и лаборатории сибирской «*ы Ставропольского научно-исследовательского противочумного института в период 1967-2004 гг.

3-2- Распространенность атипичных штаммов сибиреязвенного микроба, мдоамт в природных условиях

3.3. Характеристика штаммов, ошибочно идентифицированных как В. tmthrecis выдел ившими и* учреждениями

ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ ФЁНОТИПИЧЕСКИХ СВОЙСТВ АТИПИЧНЫХ ШТАММОВ В ANTHRACIS И БЛИЗКОРОДСТВЕННЫХ БАЦИЛЛ ГРУППЫ BACILLUS CEREUS 4.|. Сравнительны характеристика основных сибиреязвенного микроба

4.2- Сравнительна* характеристика фенотнпнческих свойств типичных н атипичных штаммов сибиреязвенного микроба с использованием дополнительных тестов

4.3. Сравнительное изучение биологических свойств атипичных штаммов возбудителя сибирской язвы и близкородственных бацилл

ГЛАВА 5, МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСГВА ШТАММОВ В ANTHRACIS И БЛИЗКОРОДСТВЕННЫХ БАЦИЛЛ

5.1, Сравнительная характеристика штаммов В anfhracts и блюкородсткниых баимлл по результатам идентификационных генетических тестов

5.2- Результаты проведения внутривидовой дифференциации атипичных штаччо» В anlhracis и бЛННОрОДСТКННЫХ БаЦИЛЛ С НСПОЛМОВОИИСМ генетических маркеров

J.3. Генетическое лгпнровакие штаммов В anthraeit

Введение Диссертация по биологии, на тему "Характеристика биологических свойств атипичных штаммов сибиреязвенного микроба, усовершенствование методов их идентификации и дифференцирования от близкородственных бацилл"

Актуальность пройдены. Снбирои* Я1*а • часто фитильная острая ионозная бактериальная инфекция человек л и животных» рала нваюшаяс ■ при проникновении eiwp Bacfitus anthrocti » организм через поврежденные кожные покровы, ингаляционным путем или При зшгатыванни. Это эооиоч большинства млекопитающих. Особенно восприимчивыми считаются травоядные. Инфекции человека - результат контакт с больными животными или контаминнроваиными продуктами животного происхождения. Случаи передачи сибиреязвенной инфекции от человека в человеку неизвестны (Бургасо* П Н с соавт., 1970, Бургасов ПЛ., Рожков ГЛ, 19S4, Онищсико Г.Г с соавт., 1999) Сибирская язва имеет глобальную распространенность, неравномерно охватывая все континенты к не регистрируясь л нить на немногочисленных островных территориях (Бахулов И,Л, с соавт., 2001. Черкасский Б.Л. 2002). Заболеваемость сибирской язкой в России, также как н во всем мире, не имеет тенденции к снижению (МйрИнйн ЛИ с совит., 1999)

Необходимость изучения этой особо опасной инфекции связана с тем. что с давних времен ее возбудитель приобрел мрачную славу как потенциальный агент бактернолопгчтетт оружия (Christopher O.W. cl л!. >997; IngJ«by T,V ct *l, 1999; Frischknech< F., 2003; Riedel S., 2004). Война 1991 г, в Персидском шик усилила осознание возможности применения В anthracis в качестве биологического оружия (ZJlirwkaj R. А-. 1997; Uiwnbcrg М, 2001), стала стимулом важных научных исследований, касающихся данного заболевания. И, наконец, события сентября - ноября 2Q01 г, и США, когда споры ипбудиталя сибирской язвы стали причиной многочисленных биотеррактов, сделали очевидной погенцнаяысую опасность применения этою патогена, что послужнло новым толчком для продолжения детального изучения этой инфекции и it возбудителя (ЛвбПи JO B. с соавт, 2002; Evsns R. G й al.f 2002; Jnglesby T V ct «I. 2002; Jemigan D.B, « a]-, 2002).

Сибиреязвенный микроб, В anihrocis, входит и группу близхородст ценных бацилл Bacillus areas, к которой а связи е общностью свойств также относят Bacillus сета, Bacillus thuringiensu. Bacillus myvoides, Bacillus pstwdomycotiUt, а также пснхротолераитныК микроб Bacillus weiclKmn'phanenfis (Slsmii L., Lereclus D„ 2005). H* фенотнпическое и генетическое сходство является причиной многих трудностей н ошибок в видовой идентификации бшдал. Основные фснотипические отличив В anthracti от других бацилл этой группы состоят в отсутствии экспрессии таких ферментов, как аеяициллиназа, mnvmi фосфат»», ряд фосфоянпм и прогеаз, неподвижности, чувствительности к специфическим бактериофагам, способности продуцировать подмглутаыиновую капсулу н три компонента экзотоксинов Однако наряду с типичными штаммами смбирсткшога микроба, обладающими всеми перечисленными признаками, в природе встречаются варианты, имеющие одно или несколько свойств, характерных для блнзкорюсткиных бацилл, например, устойчивость к фагам н пенициллину, отсутствие капсулообраэовання, способность к продукции лешттииазы или щелочной фосфатазы. Фсиотипнческая идентификация таких штаммов весьма затруднительна,

Существует и другая проблема, связанная с генетической идентификацией Многие из перечисленных признаков детерминируются хромосомными генами, которые присутствуют в геноме всех бацилл, но не эхслресснруются у В anthracis. Поэтому только генетическая идентификация, основанная на определении зткх генов, не пояилит дифференцировать сибиреязвенный микроб от других бацилл этой группы. С другой стороны, основные факторы пагогенностн сибиреязвенного микроба - экзотоксины и капсула - кодируются генами плвзмкд pXOl и рХ02, гораздо более специфичными для лого патогена, однако к случае выделения атипичных штаммов енбнреяэвешюго микроба, которые могут быть лишены одной или обеих плазм и л, генетическая и дентификация также становится ненадежной,

Помимо лого, существуют данные о налички последовательностей, подобных токсичной п капсульной шнэмншм сибиреязвенного микроба о геномах некоторых штаммов близкородственных бацилл

Кроме того, что существуют трудные дл* идентификации природные атипичные штаммы В anthracii, вполне вероятным представляется конструирован^ искусственно тисненных вариантов с отличающимися от типовых признаками, которые могут быть исиольювлиы в качестве агентов бнотеррорими, летежима и цяеитифиншм которых также окажется непростой задачей.

Полому проводимые а этой связи научные изыскания представляются в настоящее время весьма актуальными.

Цель нсслелоаанн»: характеристика биологических с«Аст» атипичных штаммов сибиреязвенного микроба с использованием полученных данных для усовершенствования методов их идягтнфикации н дифференцирования от близкородственных бацилл, Ьничи исследования: 1 Оценить распространенность «типичных «пичмов сибиреязвенного микроба, выделенных в природных условиях. 2. Изучить фснотипичсскне свойства атипичных штаммов В anthracis и близкородственных бацилл группы В emus. 3 Усовершенствовать фенсгсминческий тест дня определения чувствительности к пенициллину 4. Сравнить геномные характеристики атипичных штаымо» сибиреязвенного микроба и бацилл группы В cercus. 5 Разработать вариант мультиплексной ПЦР тсст-смстемы для дифференциации типичных н атипичных гигам моя сибиреязвенного микроба от ипаимею близкородственных блинля

6. Исследовать возможность использования метола ыноголо кус Кого анализа областей с вариабельным числом таидемных повторов (MLVA) для дифференциации бацилл ij.lfvnah w)iwi№

Впервые оценена частота выделения атипичных штаммом возбудителя сибирской язвы, а также чистота ошибок в идентификации бациллярных штаммов, первично окарастерюованных выделившими их учреждениями left* В anlhracis н поступивших в лабораторию для проведения окончательной идентификации.

Впервые проведено сравнительное изучение фиютнпкческих свойств типичных, атипичных штаммов В. an throe is к близкородственных бацилл ГруПЛЫ В. Cfrpltl.

Усовершенствован феиотипичеекнй тест для определения чувствнтслынктн к пенициллину

Впервые изучена специфичность ираймеров к ряду плазмндных н хромосомных генов бацилл. Получена сравнительная характеристика ма,тскулярио-биолопр<сских свойств типичных, атипичных штаммом В anlhraclt и близкородственных сапрофитов.

Разработан вариант мультиплексной ПЦР тест-системы для дифференциации штаммов сибиреязвенного микроба с любым набором плагчнл от штаммов близкородственных бацнлл.

Геиотиинроиние по ыриабедмгиы хромосомным локусам »ггЛ, СсЬ-Bams 13 позволило обнаружить пггаммовыс различия между атипичными штаммами В anthrticis.

I Использование MLVA по шести хромосомным н одному- лиум плазмидным докусам выявило ранее не описанные алледьные варианты.

Впервые определен характерный для беска«сульных атипичных природных штаммов ML V А - re ногшг, присущий им независимо от (сографического происхождения.

Покпана возможность использования праймеров к локусу vtrA, а также 8-ми локусиого MLVA дли дифференциации штаммов возбудители сибирской ищи от бацилл рода Bacillus.

Пряитичссгаи значимость

У совершенство влины ft фенотнпкчсский тест для определения чувствительности к пенициллину, рюриботмптй лариа»гг ыультиираймерной ПЦР тест-системы и использование праймеров к л Оку с у wrA, MLVA по В-ми докусаы для дифференциации штаммов возбудителя сибирской язвы от бацилл рода Вос<Ни* внедрены в практику лаборатории сибирской цмшл СтмНИПЧИ

Результаты проведенных исследований отряжены в следующих методических документах, нашедших применение в научно-исследовательской и практической длительностях учреждений здравоохранения:

1 Мегарпкиис рекомендации «Использование М1ЮголокуеиоЯ полимеразной ценной реакции для идентификации Bacillus arrthracis и оценки генетическое потенциала патогенное™», утвержденные директором СтапНИПМИ профессором В.И. Ефременко » июне 2002 г 2. «Методические рекомендации по комплексной оценке фенотипнчсских признаков (гемолнтн'есской. протеолнтнчсской, децнтинаэной и пнгмеитсигтезируюшей активностей, способности ипаммамж'нзолятамн продуцировать капсулу н токсин ш vitro) культур В anihracis*, рекомендованные на заседании секции «Инфекционная патологий животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН академиком ИЛБкушш 28 моя 2004 г. протокол секции J6 2 и утвержденные директором СтявМИПЧИ профессором В.И Ефремснко 21 октября 2004 г,, протокол заседания Ученого сонета St 9.

3, «Методические рекомендации по межвидовой и внутривидовой дифференциации группы баиилл. включающих Bacillus ал throe is», утвержденные директором СтавНИПЧИ профессором В И Ефременко 27 мал 2005 г., протокол заседания Ученого совета №S.

4 «Методические рекомендации по филогенетическому анализу штаммов микроорганизмов прн генотнпнровинни», утвержденные директором СтавНИПЧИ профессором В И. Ефременко 27 мая 2005 г., протокол заседания Ученою совета Jft 5.

5 Учебно-методическое пособие «Теоретические основы и практические аспекты иол им с разной ценной реакции», утверждено директором СтавНИПЧИ профессором В И Ефременко 27 мая 2005 г., протокол заседания Ученого совета № 5.

Материалы диссертации пошли в заключительные отчеты но НИР СтавНИПЧИ «Изучение феиогниической н генетической вариабслыгости штаммов сибиреязвенного микроба» Nt ГР 02 200 10909], «(Изучение биологических, биохимических и молскулярно-генетичсских свойств микроорганизмов бактериальной природы, перснсипсжых а плане разработки и опенки эффективности средств н методов диагностики особо опасных и социально» значимы к инфекций человека и животных», выполнен ной в соответствии с Договором № 7/56 от 04.02 2002 г

OcnoBiiktf положения, вмноемчме ив lb опт

1. Частота выделения атипичных штаммов сибиреязвенного микроба и пошм бяизморедегееишх бацилл, ошибочно идентифицированных как В anthracis, примерно одинакова.

2. Сравнительное изучение основных биологических свойств атипичных, типичных штаммов В antkraeb и близкородственных бацилл рода В сегеия выявляет как внутривидовые различия, так к межвидовые сходства фенотипнчсских признаков

3. Замена трудно воспроизводимого и приводящего к неоднозначной интерпретации результатов теста ■гжемчужного ожерельях на определение чувствительности к пенициллину метолом диффузии в агар с коммерческими дисками с пенициллином, позволяет получить четкую «пуши-му» картину и избежать сомнительных и ложноположнтельных результатов теста.

4. Дня атипичных штаммов возбудителя сибирской язвы, помимо нраймеро* к плазмшшык J-емам, специфичными являются нраймеры к хромосомным последовательностям S-слоя sap и бактериофагосвязывакнцсму локусу Е4 irpu подборе оптимальной концентрации праймеров. Использование праймеров к бактсриофагосвязывающему локусу в одной амштнфнкацнониой смеси с праЯ мерам! к последовательностям cajtC (рХ02) и суа (pXOI) дает возможность применять зтот набор п качестве варианта мультиплексной ПНР для идентификации штаммов сибиреязвенного микроба с любым набором платмид и даффереионацни отблтпкородственных бацилл.

5 Нраймеры EWA,.j к локусу vrrA. а также 8-ми локусиый MLVA могут быте. использованы как для генетического тнпнрокання штаммов В attihraai. так и для днфференииаиин штаммов возбудителя сибирской язвы от бацилл рода Bacillus.

Ли раба ним работы

Материалы диссертации были представлены на t-ofl Всероссийской научно-практической конференции «Генная диагностика особо опасных инфекций» (Саратов. 2000). на международной научно-практической конференции «Современный эпидемический потенциал природных очагов чумы», посвященный 10-летию суверенитета Республики Казахстан и 50-летню Талдыкорганской противочумной станции (Алматы, 2001), на юбилейной конференции, «освященной 50-летию СтааНИПЧИ - "Эпидемиологическая безопасность на Капкан: Итоги и перспективы.; (Ставрополь, 2002), на научно-црактнческом симпозиуме «Технологии теиодиагностнки в практическом здравоохранении» (Москва, 2002), на -4-Й и 5-й Всероссийских научно-практических конференциях «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва. 2002; 2004), на юбилейной конференции, поепкпееннмй 75-леппо ИНН Микробиологии МОРФ (Киров, 2003), из конференции «Актуальные проблемы ийрщиш (Томск, 2004). ко V! Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Санитарии охрана территорий государств-участников содружества нставиенных государств: проблемы биологической безопасности и противодействия бногерроризму в современных условиях», (Волгоград, 2005), на VII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и решениях санкт*пстсрбургсхого саммита «группы цосьмп>" и санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств^ (Обо,тетех, 2006).

Материалы диссертации обсуждены н одобрены на межлабораторной конференции СТавНИПЧИ 28 нюня 2006 Г

Публигании

Основное содержание диссертации отражено в 26 опубликованных работах

Структур* и обм-ч диссертации

Работа изложена на 1% страницах машинописного текста и состоит из апедешгя. обзора дитеротуры. 4-х глав собственных исследований. заключения. выводов и списка литерату ры, включающего 269 работ, из них 86 на русском и ]8Э на шюстраниых язмкад. Материалы ндлюстрнреммы 20 рисунками н 24 таблицами

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Рязанова, Алла Геннадьевна

выводы

I Атипичные штаммы возбудителя сибирской язвы составили II,] % от числа штаммов, идентифицированных как В anthracis Источниками нх выделения чипе всего были почва «старых» скотомогильников, материал от животных и несколько реже материал от больных людей, что может свидетельствовать в пользу существования механизмов изменчивости как при развитии во внешней среде, тах и в организме хозяина в ходе инфекции.

2. Атипичные штаммы сибиреязвенного микроба отличались измененными хультуралыю-морфояогическимн свойствами, капсуло- токсино- н спорообразованием, леиктиназиой и фосфатазной активностями, чувствительностью к сибнроязвешшм бактериофагам, способностью ЛИзировать отмытые эритроциты барана, протеолнпгчсской активностью по отноикнню к альбум нну. питательными потребностями Ряд штаммов близкородственных бацилл обладал одним или несколькими фенотип нческим и признаками, характерными для возбудителя сибирской язвы, включая рост m лиффереишшп.ио-диагностнческой среде для сибиреязвенного микроба, отсутствие подвижности, характер роста на питательном агаре и бульоне, каиеулообраэоваиие in vitro, елвбоположнтсльна* или отрицательная реакция в тесте на щелочную фосфатазу и лецитнназу, отсутствие гемолитической активности, чувствительность к сибиреязвенному бактериофагу.

4 Замена теста нжемчужиого ожерелья» ввиду нечеткой ею интерпретации на определение чувствительности к пенициллину методам диффузии в агар с коммерческими дисками позволила избежать сомнительных и уменьшить частоту неверных результатов идентификаций,

5. Инкубирование штаммов В a/tlhracts в атмосфере с 3 % COj стимулировало гемолитическую активность по отношению к отмытым эритроцитам барана через 48 ч инкубации, а к 72 ч позволяло получить количественные характеристики этого Признака даже у атипичных штаммов с ниткой гемолитической аючвностыо

Все штаммы возбудителя сибирской «вы, включая отличные, имели описаизтые как специфичные для этого патогена хромосомные и локализованные на юксииной штазмиде 1ены, при этом 6 штаммов не продуцировали токсины. Результаты ПЦР с примерами к pXQ2-локаллоааиным геном капсулообразояаиия сорС и каталитического домети аутолизлна ami могут дифференцировать атипичные бескапсульиые штаммы и служить дополнительным подтверждением наличия или отсутствия плазм или рХ02 в геноме изучаемых культур.

7. Для возбудителя сибирской к злы, помимо праймеров к хромосомным генам S-слоя iapt специфичными оказались также праймеры к хромосомному бактернофагосвазываюадсму участку Е4, что позволяет использовать их в мультиплексной ПЦР с п размерами к последовательностям сарС (рХ02) н суа (рХО!) дая идентификации типичных и атипичных штаммов сибиреязвенного микроба с любым набором плазмнл и дифференциацин от близкородственныхбапилл.

8, Присутствие генов фосфатилил иношталомА фосфолицазы и ферригнн-подобиых белков В anlhracis характерно для всех без исключения бациллярных штаммов, а гены фосфатндил ннознтоловой фосфолиплзы В сеrem и В. ihuringicraLi, фосфатндил холиновой фосфолнпазы С В ihvrigietute, ингибитора иммунитета В anlhracis и знтеротокенна S В cereт и В thuringtejuii позволяют выявить межштпммовые различия как нзолятов возбудителя сибирской язвы, так и нссибнрсязвснных бацилл. Наличие обнаруживаемых в ПЦР генов транскрнппионного регулятора и каталитического домена аутолизнив Н anthraett подвержено внутривидовой вариабельности и позволяет дифференцировать штаммы

9. MLVA ко 8 генетическим локусаы в сочетании с филогенетическим анализом л ал возможность дифференцировать две категории атипичных штаммов сибиреязвенного микроба - природные бсскапсульиые н штаммы раз»сии происхождения с комплексом атипичных свойств от типичных Штаммов н других категорий атипичных штаммов, а также дифференцировать любые штаммы В unthracU от прочих бацилл

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Атипичные штаммы возбудителя сибирской язвы, т.е. штаммы, с отличными от типичных культур В, anthracis биологическими свойствами, в настоящее время не являются релкостью Наиболее часто выделяются культуры с измененной морфологией колоний, вирулентностью и квпеулообразоваиием, реже - штаммы, с отличающимися от ^тгапонньш* культур В. anthracis биохимическими свойствами (гемолитическая, протсолнтическая, фосфатмио* активности}, резистентностью к действию специфических сибиреязвенных бактериофагов и антибиотиков различных групп, спорообразованием

Необходимо учитывать, что в природных условиях штаммы с атипичными свойствами часто выделяются нз почвы {Бср£зкина Г.П. с соавт. 1974; Гулый А.А., 1982; Буравиева НЛ. с соавт. 1983, Ипатенко Н-Г, с соалт., 1991; Еременко К.И. с соавт. 1993), откуда также изолируются бл из королствеиiгые споросбратующие сапрофнты Полому сункствузощая в настоящее время проблема недостаточной однозначности большинства фенотширксекнх к ыолекулярно-бнологическнх критериев идентификации В anthracis, зачастую затрудняет процесс идентификации и создает сложности, особенно прн дифференциации атипичных штаммов сибиреязвенного микроба от близкородственных бацилл группы В сети. Решение этой проблемы может быть найдено с усовершенствованием существующих схем исследования, а также в результате поиска новых надежных идентификационных признаков. Это позволит дать эпидемиологическую и эннзоотологнчсскую оценку выделенных июлятов, а также поможет в дифференциации представителей группы В. еегечг.

13 лаборатории сибирской язвы Ставропольского научно-исследовательского протнпочуммопз института проводилась окончательная идентификация 1092 штаммов микроорганизмов, выделенных различными медицинскими и ветеринарными учреждениями в период с 1953 по 2004 гг. и предварительно идентифицированными ими как В anthracis 64,84% (70В) нпамыов были )г»лированы в 33 регионах Российской Федерации, и» них 76,5 % (542) штаммов выделено в республиках, краях и областях Южного Федерального округа. 33,79 % (369) штвммоя были направлены на идентификацию in 6 стран ближнего зарубежья, большая часть из которых (57,45 %, 212 штаммов) приходилась на Азербайджан, 1,37 % (15) штамммов были производственными и вакцинными и получены нз ГИСК нм. Л.А. Тарясевича к ГНКИ ветпрепаратон.

Проведение окончательной идентнфнканин позволило сделать заключение, что 963 штамма (88,2 %) являлись сибиреязвенными, из них свойства 107 культур отличались от типичных штаммов возбудителя сибирской язвы по одному или «скольким фенотнпнческнм признакам, что составило 9,8 % от общего количества исследованных культур и 13,1 % от числа Штаммов, идентифицированных как В anthracis.

Штаммы, с биологическими свойствами, не свойственными ТИИЧКЫЫ штаммам возбудителя сибирской язвы, были Ювлирошы на 9 территориях Российской Федерации и в 4 странах ближнего зарубежья. Часто объектом их выделения являлись почва «старых» скотомогильников (22%). Факт частого выделения атипичных штаммов нз почвы «старых* скотомогильников совпадает с имеющимися литературными данными (Бср£зкнна Г.П., 1978; Федотов B.C., 1978; Еременко EJL, 1997; Марин им Л.И. с соавт, 1999, Бакулов Н А и др., 2001).

Столько же атипичных штаммов было выделено из почвы с места прирезки н падежа больных животных (22%). По существу, тги итоляты представлены возбудителем сибирской язвы, недавно попавшим в почву из организма больных животных, находящихся в нредтерминальноВ или терминальной стадии сибиреязвенной инфекции. В случае, когда нсктишм вылелеиня служил нехарактерный для сибиреязвенного микроба объект • труп серой полевки, то, схорее всего при жизни она также была комтамннирована спорами возбудителя из почвы В совокупности с другими штаммами, имеющими отношение к эпизоотическим и эпидемическим проявлениям сибирской язви, а именно, выделенными из обьектов окружающей среды, из организма больных людей и животных, а также продуктов животноводства, они составляют половину (50%) или ббдьшую часть всех атипичных штаммов. Однако, если учесть, что доля атипичных штаммов среди более 600 штаммов вишепри веденного происхождения составляет около 3,5%, в то время как из 2? штаммов, выделенных в старых скотомогильниках, более половины являются атипичными, следует признать наиболее частым их источником именно эти oCvcnu

При исследовании фснотнпнчсскнх свойств атипичных штаммов были получены следующие результаты. Большинство штаммов (82) явились циничными по калсулообразованию; 81 штамм был лишен способности образовывать капсулу (л vivo к in vitro и авирулентен для белых мышей, одни штамм формировал капеулу ири культивировании как в ВОздушмсЯ атмосфере на агаре Хотпшгеро, так и в атмосфере, обогащенной СО,, был вирулентным для мышей и морских свинок, ноавирулентиым для кроликов Для 41 культуры неспособность к капсулообразоваиию явилась единственной отлнчителыюй чертой от характерных для еибиреяэвенноге микроба свойств. У остальных 40 культур неспособность к капсулообразоваиию сочеталась с наличием от одного до четырех фснотнпнчсскнх признаков, не свойственных «эталонным» штаммам В anthracii нехарактерная бактериоскопнческая морфология, нетипичный для данного возбудителя рост на питательных агаре и в бульоне, слабоположительиэв реакция в тесте на щелочную фосфатазу, леиитииазная активность. Кроме тгого, в ходе исследования фенотнпическнх свойстп культур по тестам идентификации было выявлено 5 штаммов со елвбоположитедьной реакцией в тесте но щелочную фосфатазу, 15 лецитниаэопознтнвных штаммов, 5 изолятов с сомнительным результатом фаголнзабельиоети сибиреязвенным бактериофагом, в то время как по остальным тестам идентификации их свойствах штаммов варьмромлн от одного до яеенаяинх прюнаков Так, 20 штаммов были W способны к продукции капсулы на t % бикпрбоивтном «таре н были авнрулентич для белых мышей. I штамм обрлйлялвпл капсулу Кох и воздушной атмосфере на агоре Хоттингера, так н на 1 % бикарбонат ном агоре в атмосфере COj, он также отличался избирательной вирулентностью для белых ыыикй, но был авирулентным для кроликов, как и еще одни цшшм. У IS культур имя ilicji роад нчн uft уровень лецнтииj iiuiii активности, а этот признак у 6 штаммов сочетался е неспособностью к синтезу капсулы. 3 пквпеульных штамма обрпОШкик легкую пленку при росте на бульоне Хоттингера Тест ни щелочную фосфатюу был слабоположительным у двух штаммов: у одного штамма лот признак сочетался с отсутствием кансулообраювания, а у другого ■ с замедленным енорообрмованием в течен«« первых пяти суток инкубации. Атипичное спорообразование отмечено сак у двух дошит: у одного нюдята выявлено «медленное образованием спор, большая часть которых характеризовалась нетипичной морфологией, у другого штамма скорость спорообразования была выше обычной, кроме ткмх», споры этого и»,Чита могли прорастать только при наличии в среде аланнна.

Стабильными для возбудителя сибирской язвы фенотигичсскими характеристиками и данной выборке штаммов оказались неподвижность, чувствительность к лизису си&иреянкиным бактериофагом «Гамма Л-2&1», к пенициллину в тесте «жемчужного ожерелья» н отсутствие гемолитической активности по отношению к чригроцктам на агаре с 3-5 % дефибринированной крови барана. Достаточную стабильность проявил тест на мелочную фосфптазу

Использование дополнительных тестов при сравнении фснотнническнх свойств типичных и атипичных штаммов сибиреязвенного микроба также отводило вытггь внутривидовые различия между игтаммамн.

Определение вирулентности штаммов В anthracts с исчислением LDW иокаддо, что 20 гапеулообразующих штаммов, также как и тнгтрольные типичные штаммы В anthraca, были вирулентны для белых беспородных мышей, значения их LDM не превышали 500 спор, SB исключением апамма с замедленным атипичным спорообразованием значение LD» которого составило 10000 спор, а штамм расценен как слабовирулентный. У 20 акалсульных культур значения LD» превышали 10000 спор, что соответствовало лвирулсктным штаммам

При определении способности к капсуообразованню ш vitro на среде СОПОК были получены результаты, совпадающие с данными, выявленными при культивирования исследуемых культур на 1 % бикарбонатом агаре

Токсннообразовашк in vitro тяхже определяли на среде СОПЭК по наличию ореолов нммунолрецнпкттщни вокруг колоний. Большинство культур образовывали токсин, формируя ореолы преципитации на различном расстоянии от края колоний, 7 штаммов не образовывали ореолов, 2 штамма формировали невыраженные кольца у края колоний, в у одного штамма очень слабое кольцо нммунопрснишгпишн у самого края колонии становилось различимым лишь на &-е сутки выдерживания чашки с посевом при 4-10 °С.

При изучении минимальных питательных потребностей атипичных штаммов В anthracii на сшгтетичеекой среде «9А» были получены следующие результаты. 11 штаммов ис росли на минимальной среде, из них 7 культур, не синтезирующих токсин in vitro: 6 капсулообразующих штаммов, в том числе штамм, синтезирующий капсулу независимо от условий и среды выращивания, н один акапсульиый игтамм, Также на этой среде не давали роста одни вирулентный лецигиназоподожительный штамм н три акапсулысых штамма. 15 акапсуяьных и 2 капсулообразующнх иггачма росли на среде «9А» с задержкой - через 48 ч., остальные культуры, 13 вирулентны:* (в том числе 2 типичных) и I авирулентная, формировали колонии через 24 ч.

Изучение протеолнтнчсской активности по отношению к бычьему сывороточному альбумину и камину , а также способности лидировать отмытые зршрошгш барана выявило, что образование прозрачных зон гемолиза через

48 ч инкубации в воздушной среде, совпадала с высокой протеолитнческой активностью и вирулентностью. Акапсулыше и «ТОКСНГСННЫС штаммы, а также культуры, обладающие комплексом атипичных свойств, ik расщепляли альбумин н не вызывали лизис отмытых эритроцитов, Исключение составили акапсульный штамм 13/39, который, о отличие от всех бескапсулииых штаммов, не имел дополнительных питательных потребностей, был протеолитически активным и формировал прозрачные зоны лизиса при посевах на чашки с отмытыми эритроцитами барана к инкубированных как описано шик, и протеолитически неактивный штамм 881, способный вызывать гемолиз в данных условиях. Полученные результаты подтвердили данные ряда автором (Еременко Е.И-, 1986; Цыганкова О.И., 1993; Буравцева НЛ. с соавт,. 1997; Соркисова II,В,, 2002).

Интсрест, 1Ш наш вчгдяд. было оценить влияние углекислоты на способность штаммов В anthracis ШЗЫМть гемолиз прн посеве на aiap с 5 % лефибрнннроваиной крови барана и на лизнс отмытых эритроцитов барана. Исследования покопали. что гемолиз иц 5 % кровяном агаре в течение 4? ч отсутствовал как прн инкубировании в воздушной среде, так н а атмосфере 3 % CO., д лизис отмытых эритроцитов через 24 ч инкубации был менее выражен При культивировании с СО|, чем при инкубации в воздушной атмосфере. Напротив, более продолжительная инкубация в атмосфере с содержанием 3 % СО} стимулировала гемолитическую активность по отношению к отмытым эритроцитам уже через 48 ч, а к 72 ч осе культуры проявляли способность лидировать отмытые эритроциты барана. При тгом протеолитически активные типичные вирулентные культуры и штаммы 13/39 и 881 с отличиями соответственно в капсулооброзовоини и спорообразовании формировали широкие прозрачные, а атипичные акалсульные, втокснгенные, протеолнтнчески неактивные культуры и штаммы с дополнительными питательными потребностями - узкие мутные зоны гемолиза. Менее всею гемолитическая активность была выражена у штаммов, имеющих комплекс атипичных свойств - шшгешкп, низкая нротеолитцческвя активность и д<яюлиительные пнвтсл ьныс потребности,

Сравнительное изучение штаммов близкородственных баонлл рода В ccnrui по основным для сибнрсюнснного микроба фенотяпНЧеслнм теспн вышило как межнттаммоаис отличи* сапрофнтов, так и сходства по ттнм признакам с исследованными атипичными и типичными штаммами В anlhracis. Все без исключения штаммы близкородственных садтрофнтои росли на дифференциально-диагностической среде для сибиреязвенного микроба, содержащей полимнкенн и трнметопркм. Палочки 31 культуры близкородственных бацилл были неподвижны, характер роста на питательном бульоне двух культур сапрофито» был не отличим от такового у двух iигамиов В anlhracis- пристеночное кольцо или легкая пленка на поверхности прозрачного бульона; рост на питательном агаре в R-форме с крупными, грубыми завитками, был характерен как для большинства сапрофнтов, так н для некоторых штаммов сибиреязвенного микроба, л одни «профит, ка* и одна культура В anlhracis, рос в SM-форме, т.е. формировал капсулу как на питательном агаре на воздухе, так и на 1% бикарбонат ном агаре в атмосфере повышенного содержания СО?. Слабоиоложитсльная активность в тесте на щелочную фосфатазу была присуща 7 штаммам близкородственных бацилл и 2 нзолятам сибиреязвенного микроба; одни сапрофит фосфатазной активностью не обладал. При выращивании культур на азотной среде с желтком куриного яйца выявлено 11 лешгтинаэомегатнвиых епорвобразуюших сапрофитов (27 штаммов В anthracis) и 39 штаммов, облвдпюптих различным уровнем лецнтнназиой активности (15 штаммов В anihracu). Гсмолипгчески неактивными оказались б штаммов близкородственных бацилл

Ряд штаммов близкородственных сапрофитов обладал сочетанием нескольких фенотнпических признаков, характерных как для типичных, так и «типичных нзолятов яозбу д^исля сибирской язвы, что создавало определенные трудности при проведении дифференциации. Наиболее значимым, па наш взгляд, явилось выявление трех культур неембнрапвеиных бацилл, сочетавших неподвижность с отсутствием гемолитической активности (тги штаммы также были лештпаооиетатгвнымн) Оби«руже«ше неподвижных Гром-положительных спорообразузосцих палочек, не обладающих гемолитической активностью, является с1н*иальным тестом для предварительной идентификации штамма кок В, anthracis нв первом уровне четырехступенчатой системы детекции возбудителя сибирской язвы как агента бнотсррор«пма, принятой в Департаменте здравоохранения США (Khan A S- et al-, 2000; Miller J.M. 2001; Heller МЛ. e« al, 2002; Perkins B.A. el al,, 2002). Потому, полученные нами результаты подтвердили данные некоторых исследователей (Gurunann D M , Ellax D J. 2000; Dib E G. et al., 2003) и свидетельствуют о том, что баниллы, ж обладающие нолвижностью и гемолитической активностью не всегда является возбудителем сибирской язвы, а сочетание этих двух свойств может быть присуще и другим представителям рода Bacillus

В данной выборке отсутствовали штаммы близкородственных бацилл, чувствительные к действию сибиреязвенного бактериофага «Гамма А-26».

Особого внимания заслуживают результаты определения чувствительности к пенициллину сиорообразующнх сапрофитов в тесте «жемчужного ожерелья», который используется в качестве одного нз сигнальных методов при идентификации возбудителя сибирской язвы При постановке данного тесга как минимум 6 штаммов близкородственных бацилл из пашей выборки изменяли свою клеточную морфологию под действием 0,05 и 0,5 Ед/мл пенициллина в среде При микроскопии визуализировались несколько типов клеток: «классические» сфероплвсты, расположенные одиночно, попарно или короткими цепочками, раэдутые промежуточные формы и небольшое количество иитзхтиых палочек. На основании вышеизложенной картины тест «жемчужного ожерелья» у этих штаммов был расценен как сомнительный.

Сведения о нечетких результатах теста «жемчужного ожерелья» имеются и в литературе (Ипатенко Н.Г. с соввт , 1995) Кроме того, иг литературных данных следует, что чувствительность в ДАННОМ тесте проявляли около 5 % близкородственных микробов (Груз ЕВ., 1965; Шляхов Э.Н. с совят., 1975; Мари unit Л И. с соавт., 1999), в отдичне от 12 % штаммов в нашем исследовании Поэтому, исходя иг вышеизложенного, было произведено определение чувствительности в пенициллину методом днффушн в отар, в результате чего была выявлена однозначная резяететтюсп. к данному антибиотику всех штаммов слорооброзукниих сапрофитов, за исключением одного. Таким образом, замена трудно воспроизводимого и, зачастую ведущего к неоднозначной интерпрстадии результатов, теста «жемчужного ожерелья» на определение чувствительности к пенициллину методом диффузии в агор с коммерческими дисками с пенициллином, позволила избежать сомнительных результатов и уменьшить частоту встречаемости чувствительных к нацщиллииу штаммов бдизкородетвеиных баиилд с 12 % до 2 %.

Результаты проведенных исследований фенотнпических свойств близкородственных бацилл соответствует данным ряда исследователей {Мелихов А.Д, 1957; Груз 1965; НЕляхоа ЭЛ. с соавт-. I97S; Маринин Л И. с соавт, 1999; Doucy D. et al„ 2003 н др.), как и тот факт, что такие свойства как неподвижность, характер роста на плотных н жидких питательных средах, данные биохимических тестов, позволяют выявить внутривидовые рипдичня и межвидовые сходства штаммов возбудителя сибирской язвы и близкородственных бацилл, что указывает лишь ив ориентировочную значимость этих признаков. Для идентификации н дифференциации культур необходимым является использование всего комплекса имеющихся на данный момент фенотип ических тестов.

Следующий этап нашей работы заключался о ргзученни геномных характеристик штаммов енбиреязвешюго микроба и близкородственных бацилл. Как известно, представители группы В сtrtus генетически чрезвычайно близки, о чем свидетельствует практически 100 %-нвя гибришзацианим гомология нх хромосомной ДНК (Somerville H.J., Jones ML., 1972; КилеЬо Т, et at., 1978), Результат MEF-, сравнительного определения вуклсстндных последовательностей н секвенировоние I6S г RNA показали, что отдельные штаммы В сегеш были подобны или идентичны штаммам В ant гhrас а и В thuringtensls {Kolsto А.В. et al., 1999; 2001). Данные о чрезвычайно близком родстве некоторых штаммов В ctreus и В thwingiensis нзолятам сибиреюкниосо микроба подтверждены результатами ссквенирования, сравнительного анализа п осле довотел ьносте ii генома и AFLP (Han C.S. et al., 2006), ПЦР по иисерцнонным сайтам рестрикции (RSI-PCR) (DafFonchio D. et al., 2006). Кроме лого, в геномах близкородственных бацилл подтверждено наличие последовательностей, подобных токенниой пяаэмиде pXOI (Pannocci J. et al., 2002-a; НоГГтаНы A A. et al-, 2004; Rasko DA, et al., 2004; Ehling-Schul/, M et al 2006) и хвпеульной плазмнде pX02 В antrhracis {Pannucci J. ct al. 2002-b; Luna V.A. et al, 2006).

Постановка ПЦР с праймерамн к локусу сарС, локализованному на плазмнде рХ02, выявили отсутствие амплификации с ДНК 20 штаммов В anthracis, что соответствовало нх акапсульному фенотип}', Пробы ДНК всех без исключения тестируемых штаммов В. anthracis амплифицнровалнсь с праймерамн к pXOI -локализованным генам, ответственных за синтез компонентов токсинов, pag. суа. Iff, и оперона прорастания спор В anthracis gar X, хотя 7 иггаммов фслотигтнчсскн |к мспресснровалн признак токсинообраэовання in vitro, Подобные нарушения синтеза токсина, по данным P.F. Fellow (1996) и Е.И. Еременко (1997), по всей видимости, обусловлены мутациями а структурных и регуляторных генах. Все без исключения штаммы близкородственных бацилл продемонстрировали отрицательный результат ПЦР с праймерамн к последовательностям плазмндных генов сарС. pag, ста, lef и gcrX

Апробация нраймеров к хромосомным последовательностям BaSI3, dhp73.009, гроВ (р-су^ьсднннив РНК-под имс разы В. anthracis), предложенных как вндоспецнфичные для возбудителя сибирской язвы, продемонстрировала их недостаточную специфичность Так, праймсры к вышеописанным локусам, работа* со всеми штаммами В anthracis, амплнфицчроваянсь также с ДНК некоторых штаммов несибиреяжничх бацилл: с ДНК 16 шгаымои при тестировании праймеров к последовательностям BaS/З и с&рУ} 009, с пробами ДНК 9 штаммов прн использовании праймеров к локусу гроВ,

Высокую специфичность проявили п рай меры к хромосомному гену S-слоя юр, поддерживая ГИДР исключительно с ДНК В. anthracis. Использование зтой пары праймеров в мулътнпраймерной ГИДР совместно с праймерамн к генам суа, (pXOI), сарС (рХ02) позволяло как идетнфюшроватъ штаммы В anthracis с любым набором платмнд, так и дифференцировать их от несибиреяэвеииых бацилл рода Baciihts.

Постановка ПЦР с праймерамн к бак тсрнофагос вязы вающему хромосомному участку Е4 с соблюдением условий реакции, предлагаемых автором (Dwyer К- et al., 20CW), показала недостаточную иидоспецифичностъ. Оптимизация параметров ГИДР позволила добиться амплификации только с ДНК В anthracis, а использование праймеров к локусу Е4 в одной ямллкфнклцнонлой смеси с праймерамн к последовательностям он и сарС дало возможность применять тот набор а качестве варианта мультиплексной ПЦР для идентификации любых штаммов сибиреязвенного микроба н их ДНффсрСКШВДНН от бл»гткорадствснных бацилл,

Известно, что фенотипнчсские различия между В anthracis с одной стороны и В cereus - В thurtngiettiLj с другой, по крайней мере, частично могут быть связаны с тем, что плейотроиный регулятор Мстряцеддюмршга факторов галогенНОСТИ PlcR. выступающий регулятором большого количества генов у В cere us н В thurlngiemts, является функционально «безмолвным» у В anthratts (Agiiw Н. я я]., J 999, КоЫо Л,В. et а)., 2001 и др.). Поэтому было интересно выявить различия между штаммами В anthrac'a и нсснбнрсязвсннымн бациллами с использованием праймеров к фрагментам генов фосфатидил инозитол-епсцнфичес кой фосфолнпазы С в сегеш и В. ihur/ngicnsis ijripicbc), фосфатидил ииоэнтол-специфичсской фосфолнпазы С В anthrocis {piptcba). фосфатчднл-ходин-спеиифической фосфолвтзы С В thurigtensis (picА), а также ингибитора иммунитета £1 anthrocis [InA) и энтсроюкспиа S В сета и В thuringtensis {en! 5), разработанных D M Gunman и DJ. ELIlar (2000). Последовательности, ам плифицнру юшнеся с праймерами к гену piplcba имелись у всех исследованных бациллярных штаммов ДНК большинства HXUttTOB епчрообразуюших сапрофитов поддерживали амплификацию с праймерами к последовательности гена ptplcbc, в отличие сп основного количества штаммов В. anthrocis. Амплнконы с праймерами к гену pic Л выявлялись с ДНК большинства штаммов нссибиреязвскиых бацилл, в изодятов В. anthrocis (рХОГ, pXOI"), но не определялись или были слабо выражены у штаммов В anthrocis (pXOI \ рХ02*) и остальных акапсульных культур, Основная чисть протестированных бацилл образовывала ампднкоиы с праймерами к гену ингибитора иммунитета В anthracii Продукты амплификации с праймерами к гену cnl S обнаруживались у большинства сапрофитов, вирулентных игтачмоп В anthrocis, lto не выявлялись или были слабоположтельиыми у большей части культур В anthrocis (pXOIpXffi").

Исследование ДНК штаммов В anthrocts с праймерами к последовательности гена транскрипционного регулятораp/cR (Еременко Е И, с соавт , 2004) позволило обнаружить этот фрагмент у 74 % штаммов сибиреязвенного микроба.

Тестирование бациллярных штамма* ид наличие генов dip /. dip 2 ферритин-подобных белков В anthracii, претендующих на роль дополнительных факторов 1ыюгс1шкгн сибиреязвенного микроба (Papinutro Е. et aJ., 2002), не позволило выявить ни меж-, ни внутривидовых различий штаммов В anthracii и спорообразузоших сапрофитов. гены ферритинов были ндентнфи иированы у всех без исключения исследуемых бацилл, что добывает жшнениую ввжиОСТЪ их функции кож для сибиреязвенного микроба, гак и для прочил; бацилл,

Амплификация с првймсроми к рХ02-локалиэованной последовательности гена AMI аутолизинв Н anthracis, сшс одного фактора, предположительно участвующего в патогенеза сибиреязвенной инфекции fMcsnaye Я., Fouct Л., 2002), проходила у веек рХ02', но не у рХ02" ипаммов сибиреязвенного микроба, что можег служить дополнительным подтверждением наличия или отсутствия плвМКДЫ рХ02 в геноме тестируемых иэолятов.

Геном В anthracis характеризуется высокой степень» гомогенности и мономорфностн, в отличие от полиморфных В. Crrru.f И Н ihuringiensis (Keim P et iL, 1997; 1999; Helgason Ё el al-, 1998) Но обнаружение маркеров полиморфизма, включающих в себя пилотные повторы (VNTR), а также использование MLVA стали толчком в развитии молекулярного тклироваиня штаммов В. anthracis и предоставили надежные критерии для дифференциации различных изолятов сибиреязвенного микроба (Keim Р, е( а!., 2000).

Предварительное генотипиромише но вариабелыюму локусу vrrA показало, что изучаемые штаммы В anthracis были представлены тремя категориями- VNTRj, VNTR* и VNTR, с преобладанием самой распространенной в мире J-оЙ VNTR-кате горн и Было выявлено, что ауксотрофиые штаммы и их прототрофные варианты относились к различным VNTR-катсгориям,

Определение генотипа по схеме P- Keim el al- (2000) с использованием только хромосомных л о кусов (ипгА, wrB|, vrrBi, v/rC), vrrCj н CG3) дало возможность разделить штаммы на 7 ГеИОТНПОВ

Последоватсльность с вариабельными тандемнымн повторами СеЬ-Вап» 13 (l,e Flech Р el al., 2001) гена ЬсМ кодлагеноподобиого поверхностного гликопротеина в изученной выборке штаммов сибиреязвенного микроба была представлена четырьмя аллсльнымн вариантами Вариабельность числа тандемных повторен и гене ЬсМ, ответственного за синтез этого нммуиоломннаитиого белки, прямо связана с длиной филамешов экэоспориума < Sylveslre P. ct al, 2003),

Анализ вариабельности по хромосомному локусу Ceb-Bams 13 выявил такое же распределение по генотипам, как н по системе P. Кот et al. (2000).

MI.VA по шести вышеописанным хромосомным н двум лдаэмидным локусам (pXOl-dal, рХ02-й) распределил изучаемые оттаммы В anshracis на 12 генотипов- шесть из них соответствовали описанным ранее (пять полных и один неполный в связи с отсутствием амплификации с праймерами к локусу рХ02-аИ), остальные шесть наборов омплнконов отличались от известных генотипов но одному и более локусам и ранее описаны не были (пять полных it один )»с1Юлиый) Анализ ноаучеииых генотипо* позволь отнести изучаемые штаммы к пяти различным подгруппам обоих известных кластеров A (Al a, Alb, A3, л, А4) и В (BI) В ходе исследования было выявлено, что штаммы 228 и НО П с комплексом атипичных свойств, ■тмчшнцни нарушение токсниобразования, гемолитической и протеолитической активности, дополнительные питательные потребности, их производные с такими же свойствами (генотипы 93 и 1С new) имели отличия от вариантов этих штаммов, типичных по всем перечисленным свойствам, и типичных природных штаммов (генотип 95), в размерах амплкконо» мши из шести хромосомных локусоп (итА, vrrB], ittCi, vrrCi, CG3) и плазмзиного локуса pXOl-aot.

С целью определения возможности использования праймеров EWAi.j к локусу w*A н 8-и локуе|юго MI.VA для дифференциации штаммов возбудителя сибирской язвы от бацилл роля ВасгИю была проверена их специфичность при постановке ПЦР с ДНК близкородственных сапрофитов. Амплификация с праймерами EWAi-j была получена с пробами ДНК 57,5 % штаммов н ее ибире язвенных бацилл, при этом злектрофорстнчеснм подвижность омплнконов 15 штаммов была близко к подвижности вмштнконов В mthracis, но ни у одного штамма сапрофитов не было выявлено ампликоноа с размерами. идентичными В anlhracis. Результаты MLVA с пробами близкородственны* бацилл показал, что ДНК этих штаммов либо не амплифицироващю. с прайм срами ко веем хромосомным по* у сам, либо темериропади амплчкоиы с праймерами к отдельными локусам, но при этом размеры фрагментов н их совокупности отличались от размеров, описанных для В an throe и, а амплификация с праймерамн к нлазмндным локусам не происходила.

Нами было показано, что MLVA обнаруживает, помимо общепризнанной географической привязки определенных генотипов. характерные геиотнтш для атипичных штаммов с измененными феиотнническими признаками капсуло-, токеинообрлзовання, гемолитической, протсолитнчсской активное™ и ростовых свойств.

MLVA также позволяет одновременно и с высокой достоверностью определить генотип, отличить некоторые атипичные штаммы сибиреязвенного микроба от типичных и дифференцировать любые штаммы В anlhracis от прочих бацилл.

Полученные данные дают возможность применения вышеописанных праймеров для дифференциальной диагностики штаммом возбудителя сибирской язвы и спорообратуюших сапрофнтов.

Таким образом, атипичные штаммы возбудителя сибирской язвы не является редкостью, а частота их выделения приблизительно равна таковой иеснбнреязвешшх бацилл, ошибочно идентифицированных выделившими нх учреждениями как В anlhracis. Проведение сравнительного изучения фенотипических и молекулярио-бнологических свойств типичных, атипнчтшх штаммов В anlhracis и близкородственных бацилл позволило сделать заключение как о внутривидовой вариабельности, так и о межвидовых сходствах бациллярных штаммов Оптимизация процессов идентификации и дифференциации может быть достигнута при использовании »»амеи теста «жемчужного ожерелья» в существующей схеме межвидовой дифференциации метода диффузии в агар с коммерческими лисками с пенициллином, а н дополнение к тгой схеме и для внутривидовой дифференциации Использовать предложенный вариант мультипраЙмерноИ ПЦР и метод MLVA по 6 хромосомным и 2 плазмндным локусам (Keiin P. et aL, 2000) в нашей модификации (Цыганкова О.И. с еоплпч 2002).

163

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рязанова, Алла Геннадьевна, Ростов-на-Дону

1. Абгарян Л.Г. Совершенствование метода индикации возбудителя сибирской «вы //Дне,. канд. мед. наук. Ставрополь, 2001, -12* с.

2. Ашмарии ИЛ-, Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследовании* Л-: Медицина, 1962, * С, 82-144.

3. Бакулов И.А, Гаврнлов В А,, Селиверстов В.В Сибирская язва (антракс): новые страницы в изучении «старой» болезни Владимир. «Посад», 2001.-231 с.

4. Буравцева НЛ. Некоторые особенности взаимодействия сибиреязвенного вакцинного штамма СТИ-1 с пенициллином // Антибиотики. • 1968. -Т, 13,- № г. С. 260-264.

5. Буравцева Н.П. Роль пенииипликазы в механизме устойчивости сибиреязвенного микроба к бензилпениинллику // Антибиотики. 1971. -Т, 16, - f6 12.-С- 168-173.

6. Буравцева Н.П. Лопаткин О Н Устойчивость сибиреязвенного микроба к стрептомицину // Вопросы противоэпидемической защиты населения.1977. Вып.27,-С. 190-199.

7. Буравцева HTL Специфическая и экстренная профилактика сибирской язвы //Дне,.,, док, мед. иаух, Ставрополь, 1991. - 389с.

8. Буравцева IIП, Еременко Е.И., Цыганкова О.И. Роль атипичных штаммов сибиреязвенного микроба в эпизоотологии и эпидемиологии сибирской язвы Н Материалы Мсжрсгионого Рабочего совещания ВОЗ/ФАО по сибирской язве Алматы, 1997.-С. 38-39.

9. И Бургасов ПЛ., Черкасский БЛ-, Марчук Л.М., Щербак Ю.Ф. Сибирская язва-М: Медицина, 1970.-128с.

10. Галиуллни А К . Содыков Н С , Ннзамов Р-Н. н др. Обнаружение возбудителя сибирской язвы» иробах. взятых в бывших очагах инфекции Ц Материалы юбилейной научной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ Киров, 1998 - С, 71-72,

11. Гинзбург Н Н Живые вакцины (история, элементы теории, практика). -М-: Москва, 1969.-336е,

12. Л'кнсбург Н.Н. Сибирская язва, М.: Меднщша, 1975,- 160 с.22 .Груз Ё,В. Изучение н рационализация некоторых лабораторных методов индикации и идентификации Bacillus arrihracis /I Автореф. дне. . канд. мед. наук. Одесса, 1965, ■ (9 с.

13. Гулый А,А, К характеристике авнрулентзшх штаммов, выделенных из почв скотомогильников Н Эпидемиология, диагностика к профилактика инфекционных и инвазионных бо.зезией Кишенев, 1982. ■ С, 106-107,

14. Ережмхо Е Й, 1отреб1гости сибиреязвенного микроба в факторах роста и новые питательные среды для его культивирования И Дне. . кан. мед. неук. Ставрополь, 1986. - 181 с.

15. Еременко Е Й. Биологические и популяииоиные аспекты патогенное™ ВасШиг anthracii // Дис . докт. мед. наук. Ставрополь, 1997, • 275 с.

16. ЗГЗавирюха АД, Харчук А.Н. Пирофосфат натрия для исследования почвы на сибирскую язву И Ветеринария, 1980 - № 2, - С. 25.

17. Инструкция и методические укатили» ih> лабораторной» клинической диагностике, профилактике н лечению сибирской язвы у людей. М., 1980.-63 с.

18. Инструкция по определению чувствительности возбудителей опасных инфекционных заболеваний к антибиотикам н хнмионрепарвтим. М , 1990, • 34 с.

19. Ипатенко Н.Г, Атипичные формы возбудителя сибирской язвы у свиной !! Ветеринария. 39Й9. - Jfe 8.- С. 2S-29.35Ипатенко 11Г-, Седов В.А., Зелсяукмн B.C., Глушян В Н. Сибирская язва сельскохозяйственных животных. М : Агропромиздат -1987. - 2S6 с.

20. Зб.Ипатснко Н.Г. Почва основной резервуар возбудителя сибирской язвы // Ветеринария. - 1991. - № 12. - С. 23-26.

21. Ииатснко нх. Маничев АА-, Шноргун Б.И. и др, Дифференциация Bacillus anthracis от спорообразующих почвенных бацилл Л' Ветеринария. 1995. - № 7. - С 19-22.

22. Зв.Ипатенко It Г., Яковлева Т.Н. Свойства нетипичных форм Bacillus anthracis I/ Ветеринария 1996, - № 5. - С. 21 -24.

23. Ипатенхо Н.Г. Испытание сибиреязвенных бактериофагов И Ветеринария. 2000. - № 6.-С. 22-23.

24. Колосов С.Г. Сибирская язва. М : Медицина. - 1976, ■ 288 с.

25. Короли A.C-t Погрсбняк ЛИ. Сибирская «на. Киев; Урожай - 1976, ■ 160 с.

26. Курпква АН-, Кузнецова Л.И, Гуленко Э.И. и др. Антнбиотикоустойчивые варианты сибкрсязвсшюго микроба И Сборник научны* трудов «Проблемы особо опасных инфекций ». ■ Саратов, 1969. -Вып. 3.-е 138-140

27. Лабораторная диагностика возбудителей опасных инфекционных болезней Саратов, 998, -Т, I. -С. 50-89.

28. Левина V М„ Архилова В.Р. Сравнительное изучение сибиреязвенных бактериофагов //ЖМЭИ. 1967. - ЛЬ 9. - С- 24-28.

29. Лобзии Ю.В., Волжанин В,М , Захлренко С.М. Сибирская язва // Клиническая микробиология н анпемнкробная терапия. 2002- - Т. 4 -№2.-С 104-127.

30. MapHHini Л.И., Онкщенко ГГ., Степанов АВ и лр, Микробиологическая лиагноспгха сибирской язвы. ВУНМЦ МЗ РФ, М., 1999. -224 с.

31. Мелихов А.Д. Об использовании кровяного агара для дифференциации сибиреязвенной палочки и некоторых почвенных анаэробных бацилл /I Сборник научных трудов Московской ветергошриой академии М-, 1957, - Т. 19. - Вып. 2,-4.1. - С. 86-89,

32. Я.Методнческис указания по лабораторной диагностике сибирской язвы у животных И людей и обнаружению возбудится* сибирской язвы в сырье животного происхождения, в объектах внешней среды, М , 1986. - 22 с.

33. Mctодические указания «Экстренная профилактика и лечение опасных инфекционных заболеваний"» М. 2000. - 107 с.

34. Методические указания «Обеззараживание биологического материала и объектов внешней среды, зараженных бактериями I-JV групп патогенности, при исследованиях методом ПЦР» • МЗ РФ, М, 2001

35. Мерснюк Г.В. Обнаружение сибиреязвенной палочки Н В кн.: Справочник по санитарной микробиологии Кншенсв, Карта Молдовеияско. ■ 1981, - С, 108-111.

36. Мнкшнс НИ, Еремин СЛ., Шевченко О,В, н др. Влияние спонтанных хромосомных мутаций на вирулентность возбудителя сибирской язвы // Материалы юбилейной науиюй конференция, посвященной 70-летню НИИ микробиологии МО РФ, Киров, 1998, - С. 165-166.

37. Наймлнов ПЛ. Особенности шгтания и биологическая характеристика Bacillus arUhracis // Дне. каид. мед. наук. Иркутск, 1987. -125 е.

38. Невский А-С, Об атипичных формах Bacillus anthracii tt Агробиология. -1953.-At 2.-С. 18-22.

39. Померанцев А.П. Суковатова JJ.B-, Маринин Л .И. И Антибиотики и химиотерапия 1993. - Т. 38, ■ St 8, - С. 34-38.

40. Родзико»ский А-В, Поиудяцпониая динамика сибиреязвенного микроба в некоторых почвах Н Дне. . канд. мед наук. Иркутск, 1989- -114 с.

41. Федотов В С Выживаемость возбудителя сибирской язвы в тундровых почвах // Тезисы пленарного заседания Межведомственной комиссии по сибирской язве. 1978. - С. Ив-ISO.

42. Цыганкова О.И., Буравлева Н.П. Определение гемолитической активности у сибиреязвенного микроба: Методические рекомендации -М-, 1989.- 6 с.

43. Цыганкова О,И,, Бурав^ва Н.Л., Ефременко 0-И Взаимосвязь гемолитических и протеолитическнх свойств возбудителя сибирской язвы Н Современные аспекты профилактики зоонозных инфекций: Тезисы докладов научной конференции Ставрополь, 1991-а, * С. 129-130,

44. Цыганкова О.И., Ефременко В.И, Буравцева Н.П. Изучение протеолптнческнх свойств сибиреязвенного микроба // Современные аспекты профилактики зооношых инфекций: Тезисы докладов научной конференции Ставрополь, 1991-6. - С. 128-129.

45. Цьтганкоаа О-И. Гемолнтзтческая и яротеол итичее кд* плавность сибиреязвенного микроба И Дисс, . кан мед. |»ук Ставрополь, 1993. -176 с.

46. Цыганкова О.И Изучение популяциоиного состава сибиреязвенного штамма 1(СО) по чувстпитсльиости к сибиреязвенным бактериофагам // Материалы юбилейной научной конференции. посвященной 7О-летию НИИ микробиологии МО РФ- Киров, 1998. - С, 258-259.

47. Цыганкова О И Цнтотовсическое действие фильтратов енбиретвенны* культур с различной ферментативной активностью Н Материалы юбилейной научной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ- Киров, 1998. - С 259.

48. Черкасский ЕЛ Эпидемиология и профилактика сибирской язвы. • М «1ШТЕРСЭН». 2002. - 384 с.

49. Шдяхов Э.Н-, Груз Е.В,, Присакарь В.И. Сибирская язва (очерки эпидемиологической, лабораторной диагностики и профилактики). -Кншеиев: Штнинпа 1975. - 162 с.

50. Шляхов Э.Н., Присакарь В, И. Эпидемиолоюческий надзор прн сибирской язве Кишенсв: Штнинпа - 1989. • 240 с.

51. Abshirc T.G., Brown I.E., Teska J.D, et al Validation of the use of Gamma phage foe identifying BaciJ/ta anthracis H The 4* Inlemational Conference on Anthrax. St Johns College, Annapolis, Maryland, USA, June 10-13, 2001. -P, 30.

52. АЫИге Т.О., Brown J,E,, Ezzell J. W. Production and validation of the use of gamma phage for identification of Bacillus anthracis II J. Clin. Microbiol. -Sep- 2005. Vol. 43, - № 9, - P. 4780-4768.

53. Agais«: H. Gominct M . Ok5,Lad O A. et a|. PIcR is plcotropic regulator of extracellular vifulence factor gene expression in Bacillus thuringtensis ll Mol

54. Microbiol. -1999, -Vol- 325.-P.1043-1053.

55. Agata N-, Ohm M-, Mori M-, Isobe M, A novel dodecadepsipeptidc. ceieulide, is an emelic toxin of Bacillus emus it FEMS Microbiol. Lett 1995. - Vol. 129. - P. 17-20.

56. Andersen G.L., Simchock J.M., Wilson KM. Identification of n region of gmrtic variability among Bacillus anthracis strains and related species IIS. Bacterid, -1996, Vol. 17». - P. 377-384.

57. Asano SL Nukumiai Y,. Baado H tf al, Cloning of novel cnterotoxm genes from Bacillus Ccrcvs и Bacillus thuringiensts it Appl. Environ. Microbiol. -1997 Vol 63. -P 1054-1057

58. Ash C.J., Farrow A.E., Dorsch M- et al. Comparative analysis of Bacillus anthracis. Bacillus cercus, and related species on the basis of reverse transcriptase sequencing of 16S rRNA II Int. J. Syst. Bacteriol, ■• 1991. • Vol. 41. P. 343-346,

59. Ash CJ, Collins M D Comparative analysis of 23S ribosomal RNA gene sequences of Bacillus anthracis and emetic Bacillus carpus determined by PCR-direct sequencing// FEMS Microbiol. Lett, 1992. - Vol. 94. - P 75-80,

60. Bcaman TC„ Pankralz US. Gertiardt P. Paracrystallinc sheets reaggregatcd from sotidMlbted exosporium of Bacillus cercus U J, Bacteriol, 1971- - Vol. 107. - P 320-324.

61. Bccchex DJ„ Pulido J.SH Bamcy N.P., Wong A.C- Extracellular virulence factors in Bacillus cereus endophthalmitis: methods and implication of involvement of hemolysin BL И Infect. Immun. 1995. - Vol, 63. - P, 632-639.

62. Beecher DJ , Schocni J.L., Wong A-C-L. Enterotoxm activity of hemolysin BL from Bacillus cereus U Infect, Immun. 1995. - Vol. 63. - P. 4423-4428.

63. B6hm R., Pocivalsek S., Beyer W PCR-Elisa for detection of В anthracis ui environmental samples H Abstract Book. Зг-d International Conference on Anthrax, Plymouth. England, 7-10 September 1998.-F. 11.

64. Bradaric N.t Punda-Polic V. Cutaneous anthrax due to pentcillm-resistant Bacillus anthracis, transmitted by an insect bite U Lancet 1992. -Vol. 340 - p. 306-307.

65. Bruboker R.R Mechanisms of bacterial virulence // Ann. Rev Microbiol. 1985. - № 39. - P. 21-50.

66. Candela Т., Fouct A. Bacillus anihracit CapO, belonging to the gamma-gkitamykranspcplidasc family, is required for the covolent anchoring of capsule to pcptidoglycan H МЫ. Microbiol. Aug 2005. - Vol. 571. P. 717-726.

67. Chao K-C., Hawkins D„ Williams R.P Pigments produced by Bacillus amhracts // Federation Proceedings. September-October. 1967. Vol, 26. -№ 5,- P, 1532-1533.

68. Chen Y., Succi J,, tenovcr F.C., Kohler T.M. Bcta-lactamase genes of pcmcMri-susceptible В ansltracis Sterne strain II J, Bactenoi 2003. - Vol, 185.-P. 823-830.

69. Chen V., Tenover F.C-, Kohlw T.M Bcta-lactamase gene expression inй penicillb-resistaw В anthrocis swain // Arnimicrob. Agents Chemother ■ Dec. 2004. Vol. 48. ■ Us 12. - P. 4873-4877.

70. Cherif A., Bonn S. Riziri A. et al. Characterization of a repetitive element polymorph!sm-polyпигам chain reaction chromosomal marker that discriminated Bacillus anthrocis from related species //J Appl Microbiol • 2002, Vol. 93. - № 3. - P 4S6-462.

71. Chenf A. Brusctti 1. , Bonn S. et al. Genetic relationship in the Bacillus corns group' by rep-PCR fingerprinting and sequencing of a Bacillus aiilhracts-spcdfie rep-PCR fragment // J, Appl. Microbiol 2003. - Vol. 94. -№ 6 -P. П08-1П9.

72. Cheung D.T.L,. Kam KM,, iiau K L « al, Characterization of a Bacillus anthrocis isolate causing a rare case of fatal anthrax in a 2-year-old boy front Hong Kong U J, Clin- Microbiol,- Apr. 200S. Vol 43. - № 4. -P, 1992-1994,

73. Christopher G.W., Cieslack TJ., Pavlin J.A., d al. Biological warfare: a historical perspective tt J AM A. -1997 -Vol. 278. tt 5. - P- 412-417,

74. Coker P R., Smith K.L , Hugh-Jones M.E. Antimicrobial susceptibilities of divwse Bacillus anthrocis isolates // Antiimc/ob. Agents Chemother. 2002. -Vol,46, ■ P.3843-3845,

75. Daflonchio Г>, Raddadi N. Merabishviti M, el al. Strategy for identification of Bacillus ccreus and Bacillus thurlngiensis strains closely related to Bacillus anthrocis И Appl. Environ, Microbiol, 2006. - Vol, 72. -№2,-P. 1295-1301

76. Davison S-, Couiwe-Tosi E Candela T, et al. Identification of the Bacillus anthrocis у phage reccptar И J, Bacterid, 2005, - № 187 - P 67426749,

77. Г16. DesRosicr J.P., Lara J.C- Synthesis of the esosporium during sporulation of Bacillus ccretis Я J. Gen. Microbiol. 1984. - Vol. 130. - P 935-940.

78. Dib EG-, Dib S,A„ Koikmitt DA, Neville K. et al. Nonhemolytic, nonmotile Gram-positive rods indicative of Bad Ни* antkracis 1/ Emerg. Infect Dis. Aug. 2003. - Vol. 9- - № B.

79. S. Ding JJ, Gross C.A. ti American Society for Microbiology. Ann. Meeting, 46*; Abstracts. Washing)on. - 19B6. - P. 161.

80. Doganay M., Aydin N. Antimicrobial susceptibility of Bacillus anlhracis ti Scand. J. Infect. Dis. 1991. - Vol. 23, - P. 333-335.

81. Douey D., ugovu J, S/ubo ft A Isolation and enumeration of Bad Ни* cereus in foods // Health products and food branch Ottawa- - Apr 2003, mflp-42. -12 p.

82. Drobniewsky F A Bacillus cereus and related species // Clin. Microbiol Rev. 1993. - Vol. 6 - P. 324-338.

83. EhLing-Schmlz M., Fricfcer M., Grnllert H. et al. Cereulidc synthetase gene cluster from emetic Bacillus cereus: Structure and location on a mega virulence plasmid related to Bacillus anlhracis toxin plasmid pXOI ti BMC Microbiology 2006,6:20.

84. Eremenko E.I., Buravtseva N.P., Tsygankova OJ. et al, Study of atypical «rains of Bacillus anlhracis U 3M Intcmetional Conference on Anthrax- Plymouth, England, 7-10 September 1998. ■ P, 46,

85. J27- Eiictuve-Toumelin J„ Serard J.C-, Duflot E. et al. Chamctherization of (he S layer cloning and sequencing of (he structural gene. // J. Bacterial. -1995.- Vol. 177.-Jfe J.-P.614-620.

86. Evans R.G-, Crvacher JM. Shadcl B. el al. Terrorism from a public health perspective И Am. J- Med Sei. Jun. 2002. - Vol. 323. - №S.-P 291298.

87. Fasanella A., Smith K.L. Keys C.„ el al. Mokcalnr Epidemiology of Bacillus arthrosis in Italy It 4a International Conference on Anlhrax. St-John'sCollege. Annapolis, Mary land. USA, June 10-13. 2001. - P. 14.

88. Fasanella A., Van Ejt M. Altaffiura S.A. et a). Molecular diversity of Baciitus arthrosis in Italy U J. Clin. MiereWol- Jul. 20O5 - Vol. 43. - X? 7. -P. 3398-3401.

89. Fellow P.F. A survey of worldwide strains of Bacillus anthraeis U Salisbury medical bulletin, № 87, Special Supplement, June 1996. P. 31-33.

90. Rev. Microbiol. 1ОД5- - № 39 ■ P 21-50.

91. Gerhardl P., Ribi E, Ultrostnieiure of (he exosporium enveloping spores o( Bacillus cereus II J. Bacterid. -1964. Vol. 88. - P. 1774-1789.

92. Gicrczynski R. Kaluzewski S , Rakin A. et al. Intriguing diversity of Bacillus anthracis in eastern Poland ■ the molecular echoes of ihe past outbreaks// FJiMS Microbiol, Lett, 2004. - Vol. 239. - P. 235-240.

93. Gromnn P.E., Lund T. Bacillus cereus and its food poisoning toxins // FEMS Microbiol. Lett 1997. - Vol. 157. - P. 223-228.

94. Green B.D., Battisti L., Koehler T M, et al, Demonstration of a copsule ptasmid in Bacillus anthracis1! Infect, mmim. 1985. - Vol. 49. - № 2. - P 291-297,

95. Cruitmann D M., Ellar DJ. Phenotypic and gcnotypic comparisons of 23 strains from the Bacillus cereus complex for selection of known and putative В thutingiensls virulens factor* // FEMS Microbiology Letters 2000, - Vol. 188. - P. 7-13.

96. Gustafson В A., Svcgah S.E. The resistance-condition in Bacillus anthracis and some anthrax- like organisms t! Nord. Vet- Med, 1956, - Vol. 8. - Jfe 1L - P. 902-908.

97. Ghuysen J., Tipper DJ., Strmninger J ,1,- Enzymes thai degrade cell waits // Methods Ensymol, -1966. Vol. 8. - P 685-699.

98. Hachisuka Y., Kojima K., Sato T. Fine filaments on the outside of the exosporium of Bacillus anthracis spores // J. BactcrioL 1966. - Vol. 91. - P. 2382-2384.

99. Hon C.S., Xie G,, Gtallacombe J.F et al Pathogcnomic scqwcnce analysis of Bacillus сегеш and Bacillus tkurmgiemis isolates closely related to

100. Bacillus anthracis /П. Bacterid. ■ May 2006. Vol- 1 «8. • № 9- - P. 33823390.

101. Hamach R , Megaros E.r Plcva V. Resistanti tcrennich клеше Bacillus anthracis к penicillinu streptomycinu a aurcomycinu po spontanni а пиле adaptaci // VeL Casopts. I960, - Vol. 9, - № I. • P. 56-64.

102. Harrell LJ-, Amicnen G L, Wilson К H. Gcnclic variability оГ Bacillus anthracis and related species U J, Clin. Microbiol- July 1995. - Vol. 33, -№7,- P. 1847-1850.

103. Hclgason E, Caugant D, Lccadct MM. ct al. Genetic diversity of Bacillus cereia/8 tlmringiensis isolate» from natural sources fl Curr, Microbiol. • 1998. Vol 37. - P. 80-87.

104. Helgason E„ Caugant D. A., Olsen l.f Kolslo A.B. Gcnetic structure of population of Bacillus cercus ami 8 thurhtgimtb isolates associated with periodontitis and other human infections (f J. din. Microbiol. 2000-a. - Vol. 38, - P 1615-1622.

105. Hisoshi M., Akhlenifiaman M. Pathogenic potential of bacterialproteasesUClin. Chim. Acta. ■ 1989. Vol-185. -J6 3.-P, 357-388.

106. Hoffmastcr A- R., Fitzgerald С. C-, Ribot E. et al. Molecular subtyping of Bacillus arfthmcis atid (he 2001 bi ot errorism ■ assot i a ted anthrax outbreak. United States It Eraerg Infect. Di»- 2002. - Vol. 8. - N. 10. - P I 111-1116.

107. Hoffmastcr A.R, Ravel J. , Rasko D.A. et al- Identification of anthrax toxin gene? in Bacillus cereus associated with an illness resembling inhalation anthrax It PNAS. ■ 2004 Vol 101- - № 22, - P. 8449-8454.

108. Holt J.G. The Shorter Bergey Manual of Determinative Bacteriology. • Baltimore, 1980, • 495 p.

109. Hflltje J.V. Growth of the stress-bearing and shape-maintaining murein saccules of Escherichia call II Microbiol. Med. Biol. Rev. 1998. - Vol. 62. -P. 181-203.

110. Hutson ILAr, Duggleby CX, Lowe J.R. et al, The development and assessment of DNA and oligonucleotide probes for the specific detection of Baclllu* anthrocis tt J, Appl, Bacteriol. Nov. 1993, - Vol. 75. - № 5. - F 463-472,

111. Inglesby Т. V., OTooleT., Henderson D-A.etal. Anthrax as a biologicalweapon, 2002: updaled recommendations for management t) JAMA. May 2002.

112. Vol, 287.-)ft 17--P. 2236-2252.

113. Ivanova N. Sorokin A., Anderson I, et al, Genome sequence of Bacillus ccreus and comparative analysis with Bacillus anthrocis t! Nature. 2003 May 1; 423(6935 ). - P- 87-91

114. Jackson PJ, Walthers E.A., Kalif A.S. Characterization of the variablenumber repeals in vrr A from different flociftn anthraclt isolates It Appl. Environ. Microbiol • 1997. Vol. 63. - P, MOO-1405.

115. S66. Jackson PJ. НШ K-. Partington L. Ticknor O. The relationship of В anthracis to Other Subgroup I Bacillus Species t! The 4Л Interactional Conference on Anthrax, St. Johns College, Annapolis, Maryland. USA. June 10*13,2001. -P. 15.

116. Jemigan P.B. Raghunatban P L., Bell B.P. et al. Invtttigation of bioterrorism-relaled anthrax. United States, 2001 epidemiologic findings II Eraerg Infcct. Dis. 2002. - Vol- 8. - P. 1019-1028.

117. Kaneko Т. Moaiki R,, Aizawa К Deoxyribonucleic acid rektcdncss between Bacillus anthracis. Bacillus cercus and Bacillus thurirtgitinsis II Microbiol. Immunol. 1978 -Vol. 22- - P. 639-641.

118. Ketm P , Kalif A , Schupp J. c< at, Molecular evolution and diversity Ln Bacillus anthracis as detected by amplified fragment length polymorphism markers II J. Bacterid- -1997. ■ Vol, 179. Jfe 3. - P. 818-824.

119. Ketm P., KJevylska A.M. Price L.B. et al. Molecular diversity in Bacillus onihracis II I, App. Microbiol. • 1999- Vol. 87 - P, 215-217,

120. Keim P., Price LB., KAevyisko AM et al. Multiple locus variable namber tandem repeat analysis reveals genetic relationships within Bacillus anthracisU J, Bacterid. 2000. - Vol. 182. -» 10. - P. 2928-2936.

121. Klichko V.I., Miller J., Wu A. el al. Anaerobic induction of Bacillus anihracis hemolytic activity II Biocbem. Biophys. Res. Commun Apr. 2003. - Vol. 303, -Л» 3. - P855-862

122. Ко K.S., Kim J.-M., Kim |.-W et al. Idoili fication of Bacillus anthraeis by rpoB sequence analysis and multiplex PCR H J. Clin Microbiol July 2003 - P. 2908-2914.

123. Kolsto А.В., Hclgason F„, Okstad О.Л. Bacillus anthraeis. Bacillus thuringitnsis, Bacillus ccreus Janus-face in Microbiology // The 4* lutetnetional Conference on Anthrax. St, Johns College, Annapolis, Maryland, USA. June 10-13,2001 - P. 15.

124. Kramer M J , Roth IJ UllrasuucLuml differences in the exosporium of the Steme and Volium strains of Bacillus jndvocla II Can, J. Microbiol, -1968. Vol. 14. - P. 1297-1299.

125. Kuppc A. Evarn L.M., McMtllen DA, GrifTiili OIL Pliosphfltidylinositd-specific phospholipasc С of Bacillus ceiw. cloning, sequencing, and relationship to other phospJiolipases II J. Bacteriol. Nov 1989. - Vol. 171.-Aft 11.- P. 6077-6083.

126. Iл Fleche P., Hauck Y . Ontcnienie L- et al. A tandem repeats database for bacterial genomes: application to the get»typing of Yersinia pestis and Bacillus anthraeis ft BMC Microbiology 2001, I (l):2.

127. Leehner S , Mayr R., Francis К-P et al, Bacillus wfthenslcphanensis sp, nov, is spectcs of the Bacillus cereus group H Int. J. Syst Bacteriol. 1998. -Vol. 48.-P. 1373-1382.

128. Lcendertz PH. Yumlu S„ Pauli Get аЗА new Bacillus anthraeis found in wild chimpanzees and a gorilla from West and Central Africa И PLoS Psthog 2006, - Vol. 2. - Issue I: e8,

129. Leilenbexg M. Biological weapons in the twentieth century: a review andanalysis ft Crit Rev. Microbiol, ■ 2001, Vol. 27 - P, 267-320.

130. Leppla S11, 'Hie anlhrax toxin complcx /fin: Sourcebook of bacterial protein toxins. Alouf I.E. and Freer J (ed.), Academic Press Limited, New York, NY. -1991. P. 277-298.

131. Little S.F. Knudson G,B, Comparative efficacy of Bacillus anlhracis live-spore vaccine and protective antigen vaccine against anthrax in the guinea pig tt Infect Immun. -1968. Vol. 52. - № 2. - P. 509-512.

132. Lttfa F, Foggioni G, Valjevac S. et al Gcnotyptng of Bacillus anlhracis strains based on automated capillary 25-loci Multiple Locus Variable-Number Tandem Repeats Analysis !t BMC Microbiology 2006.6:33.

133. Logan N. A., Tumbull P.C.B. H In : Manual of Clinical Microbiology, ed. Murray PJL (Am. Soc. Microbiol,, Washington, DC, 1999). P. 357-369

134. Luctmova L, Temiralieva G, Mcka-Mcchenko T. The characteristic of Bacillus anlhracis strains isolated from Kazakh anthrax foci I/ 5* International Conference on Anthrax, • Nice, Fiance, March 30-April 3, 2003, P, 66 -Poster 508,

135. Luna V.A., King D.S„ Peak K,K et al, Bacillus anlhracis virulent plasmid pX02 genes found in large plasmids of two other Bacillus species // J. Clin. Microbiol. July 2006, - VoL 44, - №> 7. - P 2367-2377.

136. Miller J M , Hair J.G , Hebert M. ct al. Fulminating bacteremia and pneumonia due to Bacillus cereus H i. Gin. Microbiol. -1997. • Vol. 35. P 504-507,

137. Mikesell P.r Ivins B.E., RisWoph J.D., Dreicr T.M. Evidence for plasm id- mediated toxin production in Bacillus anthracis // Infect. Irnmun 1983 -Vol. 39. - P. 371-376.

138. Miller J.M. Agents of biotenroriiffl Preparing for bioterrofism at dve community health care level И Infect Dis. Clin. North. Am. 2001, - Vol. 15.- A 4. -P 1127-1156.

139. Milohanic E., Jonquieres P., Cossort P, et al. The autolysin Ami contributes to the adhesion of Listeria monocytogenes to cukaryotic cells via ittcell wall anchor// Mol, Microbiol. 2001, - Vol- 39. - P. 1212-1224.

140. Mohr W, Der Milxbrand in Deutschland im Laufe der letzten zchn Jahrc untcr Beracksichnigung der im Hamburger Tropenkzankenhaus beobachteten Falle II LsnditfzJ- i960. - Bd 36. - S, 9-1 \.

141. Moeaer E M . Rest R.F. The Bacillus anthracis cholcstcrol-depcndcnt cytolysin, Anthrolysin O. kills human neutrophils, monocytes andmacrophages // BMC Microbiology 2006,6:56.

142. Naknmura L K DMA rclatcdncss among Bacillus thuringicrwis serovars

143. Int J. Syst. Bacteriol. 1994. - Vol- 44. - P. 125-129203, Nakamura 1.K. Bacillus pseudomycoides sp. nov. И Int. J. Syst. Bacterid -1998, -Vol, 48. - P 1031-1035.

144. Ofcinaka R.T., Cloud K, Hampton O. el al. Sequence and organisation of pXOI, the large Bacillus anthracis plasmid harboring the anthrax toxin genes //. Bacterid, Oct, 1999.-Vol. 181.-№20.-P. 6509-6515.

145. Pannucci Ofcinaka R.T, Sabin R,, Kwske C,R. Bacillus anthracis pXOI plasmid sequence conservation among closely related bacterial species HI Bacteriol Jan. 2002 - Vol. 184 - Hi I . P. 134-141 (a),

146. Petra G„ Sylvestre P., Ramissc V. et aJ. Isolation of a specific chromnsomic DNA scquensc of Bacillus anthracis and its possible use in diagnosisH FEMS Immun. and medical microbial. 1996. - Vol. IS, - P 221231.

147. Palra G., Vatssaire J., Weber-Levy M. Mdecular characteri/Jiion of Baciltu$ strains involved in outbreaks of anthrax in Francc in 1997 // 1 Clin. Microbiol. Nov. 1998. - Vol. 36, • № 11, ■ P. 3412-3414.

148. Petri G.P, Niemcewicz M., Zakowska D., Delvecchio V,G- Use of pulsed-ficld gel electrophoresis to investigate the whole genome organization in the Bacillus сети group of bacteria /I The 4* International Conference on

149. Anthrax- St. Johns College. Annapolis, Maryland, USA, June 10-13. 2001.1. P- 22.

150. Pearson Т., Busch J,D„ Ravel J. et al. Phylogenetic discovery bias in Bacillus anthracis using single-nuclcotide polymorphisms from whole-genome sequencing // PNAS • Sept 2004, Vol. 101. -№37.-P. 13536-13541

151. Percy Fine S„ Tipton CM, Keim P. Rifampicin resistance in Bacillus anthracis H The 2 International workshop on the molecular biology of В cereus, B. anthracis and В ihuringiensis, - Taos, New Mexico. USA, August 11-13,1999,- P- 49,

152. Perkins B.A., Popovic Т., Vcikey K. Public health in the lime of biotetTorism // Emerg. Infect Dis. Okl. 2002. - Vol. 8. - № 10. - P. 10151018,

153. Pomerantsev A,P, Starisin N,A.r Mockev Y.V., Marinin L I. Expression of ccrcolysine AB genes in Bacillus anthracis vaccine strain ensures protection against experimental hemolytic on&rax infection 11 Vaccine. Dec, 1997; 15 (17-18) P. 1846-1850.

154. Pomerantsev A.P., Kalmn K.V. Osorio M., leppla S.H. Phosphalidylchotmc-spccific phospholipase С and sphingomyelinase activities in bacteria of the Bacillus cereus group И Infcct. Immun. Nov. 2Q03. - Vol. Т1.-Л It - P 6591-6606.

155. Price L.B. Vogler A. Pearson T. rt al. Characterisation of Bacillus anthracis mutants with High-level resistance to ciprofloxacin II Antimicroh. Agents Chemother, * July 2003. Vol. 47. - № 7. - P- 2362-2365,

156. Qi Y, Patra G, Liang X, ct al Utilisation of the rpoB gene as a specific chromosomal marker for real-time PCR detection of Bacillus anthrocis U Appl. Environ. Microbiol. ■ Aug- 2001 - Vol. 67. - P. 3720-3727.

157. Radii edge L, Agron Pfl,, НШ KK- et at. Genome differences that distinguish Bacillus anthracii from Bacillus cercus and Bacillus thuringiewis It Appl. Environ. Microbiol. May 2003. - Vol. 69. - tt. 5. - P 2755-2764.

158. Ramisse V„ Patra G-, Garringue H. et al. Identification and characterization at Bacillus anthracii by multiplex PCR analysis of sequences on plasmids pXOI and pX()2 and chromosomal DMA 11 FEMS Microbiol. Lett. Ш,- Vol 145. - P 9-16

159. Ramisse V, Potra G, Vnissaire J, Моек M. The Ba813 chromosomal DNA sequence ciTectively traces the whole Bacillus anthrocis community 11У Appl. Microbiol. Aug- 1999. - Vol. 87 - № 2, ■ P 224-228.

160. Rasko D.A-, Ravel I., Okslad O.A- et al. The genome sequence of Bacillus cercus ATCC 10987 reveals metabolic adaptations and a large plasmid related to Bacillus anthracis pXOI 11 Nucleic Acids Research 2004. -Vol. 32. -tt3.-P 3 977-3988.

161. Read T.D., Salzberg S L, Pop M. ct al. Comparative genome sequencing for discovery of novel polymorphisms in Bacillus anthrocis it Science. 2002. - Vol 296, - P, 2028-2033,

162. Read T.D. Peterson S.N., Tourassc N4 Baitlic L.W. ct al. The genome sequence of Bacillus anthracii Ames and comparison to closely related bacteria II Nature. 2003 Moy 1.423(6935} - P. 81-86.

163. Redmond C . Baillie L.W., Hibbs S. ct al. Identification of proteins in theexosporium of Bacillusanthracis //Microbiology Feb, 2004 • Vet, 150. ■ P 355-363.

164. Riedel S. Biological warfare and biotcrrorism: a historical review IIBUMC Proceedings Okt 2004 - Vol. 17. - № 4. - P 400-406.

165. Sehnepf E., Crickmorc N. van Ric J ei al Bacillus ihurlnghntft and its pcsticidal proteins //Microbiol. Mo|. Biol. Rev. -1998. Vol. 62- - P, 775-806.

166. Schraft H. Griffiths M -W, Specific oligonucleotide primers for detection of lecithinase-positivc Bacillus spp. by PCR If Appl, Environ. Microbiol. Jan. 1995.-Vol.61, -Jfe 1 -P 98-102.

167. Shangkuan Y JL, Yang J.F. Lin H-C, Shaio M.F. Comporison of PCR-RFLP, ribotyping and ER1C-PCR for typing Bacillus anlhracis and Bacillus ccrcus strains // Appl. Microbiol Sep. 2000. - Vol. 89, - № 3. - P. 452-462.

168. Shannon J.G., Ross C.L., Koehler T.M. Rest R.F. Characterization of anthrolysin O, the Bacillus anlhracis cholesterol-dependent cytolysin // Infect, immun. ■ June 2003, Vol, 71 - Jfe 6, - P. 3183-3189.

169. Shinogawa K. Ueno S , Konuma H. et al. Purification and charactcrization of the vascular pcimeability factor produced by Bacillus ccnus // J. Vei. Med. 5d. Apr. 1991. - Vol 53. - Ht 2. ■ P 281 -286,

170. Shinagnwa К , Tokechi Т., Malsusaca N., Sugii S. Purification of an entcrotoxin produced by Bacillus cereus by immunoaffinity cliromatography usmg a monoclonal antibody II Can. J, Microbiol, Feb. 1992. - Vol, 38.2.-P. 153-156,

171. Shulin D. Л recommendation оГ the typing of Bacillus anthraeis 4 3Tl International Conference on Anthrax. Plymouth, England, 7-10 September 199Й . - P, 94- 95.

172. Slamli L, Lereelus D. A cell-cell signaling peptide oictivatcs the PlcR virulence regulon in bacteria of the Bacillus cere us group U EMBQ J. Sep. 2002. - Vol,21,-» 17.- P «50-4559

173. Slamli L„ Pcrchal S , Gominet M et al Distinct mutations in PlcR explain why some strains of the Bacillus cereut group are nonhemolytic U J, Bacteriol. June 2004. - Vol. 186, - № 11. - P. 3531-353S.

174. Slamli L„ Lereelus D Specificity and polymorphism of the PlcR-PapR quorum-sensing in the Bacillus cercus group H J. Bacteriol. • Feb. 2005. Vol, 187 -ЛЗ.-Р. 1182-1187,

175. Smith TJ,, Blackman S.A., Foster SJ. Autolysins of Bacillus subtilts: multiple enzymes with multiple functions II Microbiol. 2000. - Vol. 146 - P 249-262.

176. Somerville HJ., Jones M L. DNA competition experiments within the Bacillus cereus group of bacilli//J. Gen. Microbiol. 1972. ■ Vol. 73. - P, 257-26L

177. Stamatin N. Raducanesko H. Anghelesko S, Ч Рик 4* Cong- Hung. Assoc. Microbiologist*, Budapest, 1964. Budapest -1966 ■ P. 309 311.

178. Sleichen C., Chen P„ Kearney J.F., Tumbough C.L. (jr.) Identi fication of the immunodominant protein and other proteins of rhe Bacillus anthraeis exosporium НУ Bacteriol. ■ Mar. 2003, • Vol, 185 №6, - P 1903-1910.

179. Steichen C.T., Kearney J.F. Tumbough C.L. (jr.) Characterization of the exosporium basal layer protein BxpB of Bacillus anlhraca U J. Bacteriol, ■ Sept. 2005, Vol. 187. - N* 17, - P. 5868-5876.

180. Strange R.E. Helton F C. Studiea on a protective antigen produced in vitro from Bacillus anthraeis: puri fication and chemistry of the aruhrax U Brit

181. J. Expil. Pathol. 19S4. - Vol 35. - P. 153-165.248, Straulo C-W., Low» C-T. Bryden L. « ai- Single-Nucteotide Repeat analysis for subtyping Вас ill us anthracis isolates I/ J.Clin. Microbiol Mar 2006. - Vol. 44. -Jfe 3. - P. 777-782.

182. Sylvestre P. Couteure-Tosi E , Моек M, A collagen-like surface glycoprotein is structural components of the Bacillus anthracis cxosporium И Mol. Microbiol. 2002. - Vol. 45. - Mr IP. 169-17B.

183. Sylvestre P., Coutewe-Tost E., Mock M. Polymorphism in the collagenlike region of (he Bacillus anthracis BcLA protein leads to variation in exosporium filament length // J. Bacteriol. Mar- 2003. - Vol. 185. - Jft 5. - P 1555-1563.

184. Thome C.B., Gomez C.G., Blind G-R. House wight RJ>. Synthesis of glutamic acid and glutamyl polypeptides by Bacillus anthracis 11 J, Bacteriol ■ 1953.-Vol. 65, -P, 472-478,

185. Thome C.B. Biochemical properties of virulent and avirulent «rains of Baciiha anthracis tl Ann, N,Y, Acod- Sci. 1960. - Vol. 88, - Jfe 6.- P. 10241033.

186. Thompson N,E., Kctterhagen MJ, Bcrgdoll M.S., Schantz EJ, Isolation and some properties of entcratoxin produced by Bacillus cereus If Infect. Immun. ■ Mar- 1984. Vol. 43. - № 3. - P. 887-894 .

187. Ttcknor L.O., Kolsto A.B., Hill K.K. ct al. Fluorescent amplified fragment length polymorphism analysis of Norwegian Bacillus cercm and Bacillus thvringiensis soil isolates II Appl. Environ. Microbiol. OcL 2001. -Vol- 67 - Ks 10. - P 4863-4873.

188. Todd Si., Moir A.J.G., Johnson MJ., Moir A. Genes of Bacillus cereusand Bacillus anthracis encoding proteins of the exosporium H J. Bacterid. -June 2003. Vol 185. - № II. - P. 3373-3378,

189. Tumbuil PCB. Bacillus cereus 1/ In: F. Domer and J. Drcwcr (ed.), Pharmacology of bacterial toxins. Pergamon Press, Oxford. 1986, P. 397-448.

190. Tumbuil P.C.B., Kramer J.M. Bacillus // In: Balows A. el al. (ed.). Manual of Clinical Microbiology. 5*ed., 1991. * P 296-303

191. Tumbuil P.C.B., Huston R.A , Ward M.J. et al. Bacillus anthracis but not anthrax l! У Appl- Bacteriol. 1992,. Vol, 72, - P, 21-28.

192. Uchida I, Sekizaki Т., Hashimoto K , Tcrakado N. Association of the encapsulation of Bacillus anthracis with a 60 megadalton plasmtd .1/ J. Gen. Microbial. 1985. - Vol. 131. - № 2. - P. 363.367.

193. Wright G.G., Hedbcrg M.A., Slcin J.B. Studies on immunity in anthra* //J. Immunol. 1934. - Vol. 72. ■ P. 263

194. Ztlinskas R. A- Iraq's biological weapons. The past as future? it JAMA. -Aug. 1997, Vol, 278, - Pfe 5. - P. 418-424.