Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ХАРАКТЕРИСТИКА БЕЛКОВОГО КОМПЛЕКСА МИТОХОНДРИЙ ПРИ ВИРУСНОМ ПАТОГЕНЕЗЕ У ТАБАКА

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "ХАРАКТЕРИСТИКА БЕЛКОВОГО КОМПЛЕКСА МИТОХОНДРИЙ ПРИ ВИРУСНОМ ПАТОГЕНЕЗЕ У ТАБАКА"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ иу. М.В.ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

Э.А.ТАЙМЛА

ХАРАКТЕРИСТИКА БЕЛКОВОГО КОМПЛНЮА МИТОХОНДРИЙ ПРИ ВИРУС НОМ ПАТОГЕН ЕЗВ У ТАБАКА

Спецкапьвооть - фн&иопогия растении - 03.b0.I2

Автореферат диосертаоии на соноввии9 ученой степейи кандидата биологических наук

Москва - 1973

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ни. М.В,ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

ХАРАКТЕРИСТИКА БЕЛКОВОГО КОМПЛИССА МИТОХОНДРИЙ ПРИ ВИРУСНОМ ПАТОГЕНЕЭВ 2 ТАБАКА

Спецнавьнооть - физиология растений - 03,00.12

Автореферат диссертации ее соиокчнив учваой стаяеич кандидата биоиогичвсккх неук

На правах рукопкс*

ЭДЛАЙМЛА

Носква - 1973

^..чЛ(Гай

Рейотв выполнена в лаборатории биохимия и физиология иммунитете растений на кафедре физиологии растений Биологического факультета МГУ

Научные руководители: .доцент, кандидат биологических наук, М,Е,Ладыгине профессор, доктор, член-корраопондент ВйСХНМ,Б.¿'.рубин

Официальное оппоненты: доктор биологических наук, Б.Ф.Поглаэов , кандидат биологически}: наук, Л,Н.Логинове

Вадуцее учреждение - Главный Ботанический Сад АН СССР

Автореферат равослаи 1973 г.

Защита диссертации состоится " 1973 г.

часов в аудитории . 1ях на заседании Ученого Совета физиолс^онЭисхнмичесного отделения Биологического факультета МГУ.

Вевн отзывы и замечания присылайте по адресу: Москва, ІІ7234, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет, Ученый Совет.-

т>

С диссертацией ножво ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Ученый секретарь

Н.С «Александрова

Многочисленные экспериментальные данные, полученные а -пооледнее десятилетие, свидетельствуя! о том, что важная роль в защитных реакциях растений против фитопаразитов принадлежат бедкам (Липсиц, 1969; Липсиц, 1970; Рубин, Картаиона, 1971). В пораженных тканях растения происходят количественные сдвиги в содержании растворимых балков (Rudolf,Stahmann, 1964; Far ¡cas, Stahmann, 1966; Рубал НДР •, J9?I ) и нерастворимых белков клеточных органоидов* илтокопдрий (v/eint raub, Rage til, 1964; Рубин и др., 1966), хюропластов 4chinnaadicerei, 1971; ЫООКОВВЦЬ И др., 1971), рибооон (tiritan!, Stahmann, 1961; Аксенова и др., 1968), ядер (Bhattaeharaya и др., 1968). Инфекция оказывает влияние л на качественные характеристики белков-фракдиокный и аминокислотный состав (Jakо и др., 1966; Van Loon,Van Kämmen,1970), каталитические (Fernas, Stahmann, I966;ijatta, aeatile, 1970; Аксенова и др., 1972) и иммунологические (неltafupa, I960;Uritanl, Stahmann, J96I) свойства* кэознзимний спектр фердшнгатнвных белков (Weber, stahaann, 1964; Falkas, Stahmann, 1966; Novacky,Hampton , 1968) И Т.Д. Исследования роли белков в фктош^унитете показала также, что между реакциями иммунитета квотных и растительных организмов имеется ряд общих черт: индуцированный синтез каталитических белков (Jenninga и др., I969¡ Рубин,'1972), образование ан- :■ ТИВИруОЫШС ИНТерферОНОПОДОбнЫХ ОеЛКОВ (Loebenatetll, Rosa, I96.Í; Липсиц и др., I&72), возможность реакичи типа антагев -антитело (Devay, 1970).

Однако, белки клеточннх органоидов в этих аспектах мало изучены. Учитывая относительную автономность клеточных струн-тур, наличие в них белок-синтезмрующей системы, а также то обстоятельств, что белка клеточных органоидов составляют значительную долю от общего содержания белка в клетке, становится очевидным, что раскрытие природа устойчивости растений к различным фитопвтогенаи тесно связано с изучением свойств беж-ковых компонентов клеточных структур раотеиин-хознина.

Сре^и клеточных органоидов важное место занимают мито -хиндрии-полифуякциональные органоиды, в которых лроксхсдяг . процессы окисления и фосформирования, транспорт ионов и воды, разные биосинтезы. Главным строительным материален митохондрий служат белки, которые составляют» 2/3 от лх<сухого веса и определяют з основном геометрии митохондриа дьних мембран. В то же время, участвуя в образовании полиферментянх

систем цеші транспорта электронов и энергии, белки являются биологически активными компонентами митохондрий и принимают участие в создании структурной целостности и функциональной -интегрированноети мигохоядриального аппарата.

Изучение митохондрий при патологии обычно ограничивается исследованием нарушений их катаболичаских функций и ультра отру ктуры. Показано» например, что после варанения воспри-жнчизого » вта вида табака происходит разобщение дыхания от фо сформирования, нарушение конформационных изменений и проницаемости иитохондриальных мембран, дезинтеграция их ультраструктуры (Ладыгина и др., 1966; Ладыгина, Балнокин, 1970; 1а-дыгина и др., 1971). Однако, связь патологических изменений с биохимический« перестройками в составных компонентах митохондрий, т.е. в белках и липидах, практически не изучена. Учитывая роль белков в организации митохондрий и в реакциях фитоиммуинтета, можно предположить, что существует связь между патологическим функционально-морфологическим состоянием митохондрий и физико-биохимическими и каталитическими свойствами их белковых компонентов. В еві.зи с этим, цел«» настоящее работы явилось изучение влияния вирусной инфекции на некоторые биохимические характеристики мембранных белков и изо-фермейтнай спектр оксидорвдукгаа митохондрий.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объектов исследования использовали различные ПО УСТОЙЧИВОСТИ К ВТМ растения Табака: Kieotiana tabacuffl, сорт Трапезонд-9'3 с системной реакцией на заражение (восприимчивый вид) И Nleotiana glutinosa , отьечающий .на инокуляции ВТМ некротической реакцией (устойчивый вид). Растения вы- ' ращивали в теплига и в камерах ЛИК'а при постоянной температуре (2б°С), влажности (60%) и освещенности (8000-10000 лике). Возбудитель - вирус табачной мозаики (ВТМ), итамм обыкновенный

Изучали белковый комплекс митохондрий названных видов табака в корме ив динамике развития вирусной инфекции: через

и 48 часов после инокуляции вируса і ког$а видимые симптомы заболевания иа ЛИСТЬЯХ Mleotlana tai-acula отсутствуют, а у ITlCOtiana glutinosa едва выражены, а также после появления

г

выраженных симптомов заболевакля діерез 7-ІЬ двей после заражения.

Вирус иаокулировали в отделенные ох растения листья второго яруса (сверху) затиранием листьев суспензией, приготовленной ІіЗ мозаичных растений Hicotlana tebeeum (X г ласгьев на 10 мд воды). Контрольно листья натирали суспензией, полученной из здоровых растений. До анализа (в течение 24 или 48 часов) кнокулированные листья выдерживали во влажной камере. При изучении более длительного воздействия инфекции на растение (7-15 дней) заражение проводилось на листьях, не отделенных от растений.

Митохондрии иа листьев табака выделял» методом дифференциального центрифугирования в среде, состоящей из 0,4 U сахарозы, 0,001 M ЭДТА, 0,02 Ц цитрата ira , 0,002 U аскорбаїа Se, 1% альбумина (рН среды 7,8). Очистку митохондрий проводили в ступенчатом градиенте плотнооти сахарозы. Чистоту фракции митохондрий проверяли с помощью электронного микроскопа.

Легкорастворимые белки удаляли многократной отмывкой митохондрий в низкомолярном ИЄЛОЧНОЦ буфере в пписутствии 0,9^ КСІ. KCI - нерастворимый остаток солюбилизировали неионндас детергентом тритоном Х-100. Неразрушенные фрагменты мембран удаляли центрифугированием и из надоеадочной жидкости высаливали белки сульфатом аммония до ЭОЛ, насыщения. Полученный осадок белка очищали (диализом, ацетоном, геїь-фильтрацией) и использовали в дальнейших опытах.

Гель-фильтрацию проводили на колонках (I х 65 eu) с се-фадексом 6-200. Колонки калибровали до Андрью (* Andiewe, 1964; 1965).

Электрофорез трудгорастворимых белков проводили на 7,5% полиакриламиднои геле (с кислым и щелочные значениями рН) по Дэвису (ватіва, 1964) в модификации Сафоновых (Сафонов, Сафонова, 1968). В гель добавляли тритон Х-ГОО. Белки на гелях окрашивали 0,2% раствором кумасси или 1% раствором аиидошвар-ца. Гели фотометрировали на І1Ш.

Инфракрасные спектры митохондрий к белков снимали ла спектрофотометрия -10 в интервале спектра І500-І800 см""* с насі призмой. В анализе использовала прессованные таблетки митохондрий и белков с квг . Ошибка при измерении люкаяжзацнх

полос поглощения * 3 ом"1. . (

Полярографический анализ трудвдрас творимых белков проводили после их растворения в щелочи в реактиве Ердячка с СоС12 (Иванов, Рахпъеза, 1968). Измеряли высоту волн (Ь) я потенциал« восстановления (Е>. Ошибка при измерении напряжения * 1,5% вольт, силы тока * 2,5^. Контрольные и опытные проби перед снятиец лолкрограш выравнивала по концентрации белка.

Аминокислотный анализ белков проводили на амклокислот-нон анализаторе КІА-ЗВ "Hitachi" после кислотного гидролиза белков в запаянных ампулах (поело удалелия воздуха) в течение ZU и 48 часов при т-,цпературЕ Ю5°С.

Белки для экзш-элекгрофореза экстрагировали из митохондрий после ИХ осмотического пока средой, . СОСІОЯ1ДОЙ из следующих компонентов: 15$ сахароза, 0,1% аскорбат ка, цистекн (pH среды 8,3). оерменты на гелях проявляли гистохи-млчесіии.Дегидрогеназн определяли тетразолиевым методом (Marker t, ко Ив г, 1959). Допораия водорода при тяте am пероксидаэы служили бензидин, пирогаллол, гваякол. Концентрация Н^О^ - 0,02%. Субстраты, иопользовэнпкэ для проявления компояе н тов фенолоксидазы: пирокатехин, хлорогеновая ілелота Ъл-дигидроксифвнилаяаяин (Sheen, Calvert, 1969). Электрофорез проводили от катода к аноду при силе тока 4 mA на одну трубку и напряжении 400-500 вольт.

Белок определяли по Лоури (lowry и Др., 1951).

Результатыэкспериментов обработаны статистически (Пло-таноккй» 1970).

РЕЗУЛЬТАТЫ й ОБСУЖДЕНИЕ

Содержаяие тру^норастворишх белков

Труднорастворимые белки «итохондрий листьев табака составляют лі^ от общего миюхондриальяого белка. Как показали серологические исследования, полученный препарат труднораст-воршшх белков из вирус-инфицированных растений не содержал вирусного бедка. Проверка наличия ицфекщ^жних вирусных частиц во фракции митохондрий на индичаторных растениях показа-ля, что вирусы, осаждающиеся вместе с митохондриями при дифференциально» центрифугировании, бшш частично удалены после очистки митохондрий в ступенчатом градиенте плотности Саха-

розы ¡и полноотыо после отиьгвки митохондрий от легкораст.вори-кых белков* Подобные данные плтучбны и Сингерок ( singer,' 1972). Многочисленные электронно-макроскопические исследования тканей разных растений такав не обнаружили вирусов внутри митохондрий. Иногда митохондрии обнаруживаются в составе Х-Тел (Hubio-Huertoe, Hidalgo, 1964; Harrlaon, 1970). Х-Тела представляют собой ашрфные некристаллические включения в ви-руо-инфицированных клетках растений, которые состоят иэ различных клеточных компонентов (рибосомы, участки эндоплазматического ретикулума, митохондрии и др.) и вирусных частиц.

После заражения растений BIM содержание труднора отвор и-мых белков митохондрий в их тканях изменилось (табл. I).

Таблица I

Содержание труднораотворимых белков митохондрий в здоровых и зараженных BTU листьях табака

(в liter ва I г сырого веоа)

Время после инокуляции вируса т- ■■ ■ Nicotiana glutlnosa Т ■ Wlcotiana tabacus

1 8Д0р0-< * ВЫЙ > 1 ! < ■ зараженный * % от ! здоро- * вого 1 i t t i эдоро-» ВЫЙ ) 1 1 заражен-« аый 1 t t % ОТ здорового ..

24 часа 48 чаоов 7-15 дней 104*16 115*25 90*10 145*50 176*39 109*29 137,5 153.0 121.1 232*27 193*23 223*33 207*27 158*24 147*36 89,2 81,8 65,9

В листьях устойчивого вида табака содержание труднораотворимых белков митохондрий после заражения увеличивалось (табл. I). Это является дополнительна« доказательством к ранее полученным данный об увеличении в тканях Н1сог1впа г1и«повв -числа МИТОХОНДРИЙ (1»е1п*таиЬ, ИаевШ, 1964( Рубив я др., 1966), я складчатости их внутренней мембраны (Ладыгина, Бадноккя, 1970) В результате этого в тканях устойчивого вида табака активируются и энергетические процессы (Рубин, Ладыгина, Тукаева» 1966)

В митохондриях восприимчивого вида табака содерхарие труднораотворимых белков при вирусной инфекции уменьшалось (табл. I). На примере данного вида табака показана дезинтеграция ультраструктуры митохондрий и снижение сопряженности окисления и фосфорилиоования при вирусном патогенезе {Рубин, 1а-

дыгина, Тукеева, 1956; Лидыгига, Сел но к И1, 1970).

Следовательно, вирусная инфекция сопровождается изменением содержания труднорастворимых белпов б листьях табака, причем а тканях устойчивых растений их содержание увеличивается, а в тканях восприимчивых: - укевьиается» ,

■ Влияние шйекция на биохимические свойства т ру дн р ш с у во римцц ■ <г ' белков иятохон^ттаЗ

Кроме количественных сдвигов в содержании 0елка инфекция оказывает влияние и на качественные параметр« белков, что выражается в изменении их ф из и ко-биохиаи че с яих характеристик к синтезе белков с новши свойствами.

:Одной из важных характеристик белкового комплекса является его фракционный состав. Фракционирование труднорастворимых белков проводилось препаративно методом гель-хроматографии и аналитическим методом электрофореза в пол на крила и идно и геле.

. Трудно ра с творише белки митохондрий элюироваяись о колон- • ки о сефедексом в-200 в одном основной пике о молекулярных

Рис. I Фракционный состав труднорастворимых белков ыитохопдри!( табака

Лак

а сит

МиоКала <|1и&по«а

ю го ю «о 5о (о ю га ¿о ю за с»

05мм злюциа.мл

Ш

Ж

ЕШШШ -ЙШШШ

а - профиль элюции с колонки с сефадексом 6-200 б - электрофореграмма а щелочной среде - - электрофореграмма в кислой среде

б

' весом около 400 ООО (ряо.1). Потадимому,;при извлечении белков = из ив и бра н митохондрий табака тритоном Х-ЮО они выделяются "■ в виде мембранных фрагментов о блиэкшыодекулярныы весом, В спектре 'поглощения,основной фракции имеются два максимумам прж. 280 нм, обусловленный поглоцзниеы ароматических аминокисло!^ белка и при 420 ни, обусловленной поглощеккак порфирияовьо: ядер мембранных гемопротвидов (рис.2).

Анализ фракционного состава мембранных балков цетодом электрофореза в полиа крилемидяои геле показал» что основная фракция оодсраит несколько компонентов, различающихся по величина варяда. В целочаой среде трудяорастворшые белки разделились на 4-5 компонентов с ыалой элэктрофоретичаской подвижно« ы>, не превышающей 0,26; в кислой среде; - на Z четко выраженных ж больяое количество слабо окрапонных минорных полос (рис, I).

Изменения во фракционном составе мембранных белков митохондрий восприимчивого гида табака под действием инфекции дай- -более выражены через 48 часов после инокуляции вируса, когда изменился профиль элвции белков как в опытном, так и в контрольном варианте (рио. 3). В связи с теп,-что анализы на отделенных от растений листьях, выдерганных после инокуляции вируса. 48 часов во влажной камере, изменение кривых элюции труднора-створамих белков митохондрий контрольных растений, по-видимому« можно объяснить старением листьев, которое оказывает влияние на состояние белковых коипоиентазмембранных структур. Вместо одной фракции (характерной для мембранных белков.митохондрий кз свежесорванных листьев (рио. I) белки элгаровались в двух фракциях. При заражении фракционная гетерогенность^увеличивалась еще больше (рис. 3). *

Полученные данные подтвердились исследованиями мембранных белков митохондрий методом электрофореза. При старении в течение 46 чаоов листьев неустойчивого вида Н1СО-Папа ^вЪвсив изменились количество и злектрофоретичэская подвижность белковых компонентов митохондрий. Инокуляция вируса в свою очередь вызвала перераспределение белка по отдельным фракциям.

В белках митохондрии устойчивого вида ШсоПапа е1иипо«» при старении и после заражения происходило ливь небольшое "размывание" основго пика труднорастворимых белков. Электрофорвтическая подвижность белковых компонентов не изменилась

(рИО. 3). ' : '

Рио.2. Спектр поглощения основной фракции труднора створиш* белков «кгоэсоядрий после влвции с колонки (одинаковый для Кісоїівт іаЬасит к Нісоїіапа £Іиі1поеа)

Цм -

М

<*г -. '

' аі

зоа 400 500 600 700 Л,нм

рис. 3. Изменение фракционного состава трудаораство-риыых балков при вирусном патогенеза (через 2*6 часов после инокуляции В К!)

_м

014-

Місоїіааа ІаЬасшп Місоїіагіа діиіілолі

* ' ' Ъ V

л

ГІ

аг

ЖР

10 20 ЗО 40 50 «О 10 20 ЗО <0 ІО Є0

Объем мюцша, мл

Ґ\ Ґ) '-шш'-апш-'

а - профиль элюции о коленки о сефадексои 6-200 О алектрофореграмма в щелочной среда _ коатроль , опыт

I, П - фракция, антивирусная активность которых изучалась.

По-видимому, лияопротеидные мембраны митохондрий неустойчивого типа табака и орфо химически лабильнее и в связи о 8тш1 различные неблагоприятные воздействия (старение, заражение) приводят к разрыхлению мембран и ослаблению гидрофобных связей между их компонентами. В результате этого становятся доступными к воздействии детергентом ранее замаскированные участки мембран и они солвбилизируюгся с образованием фрагментов более гетерогенных по иолекулярним весам и зарядам.

Через 48 часов после заражения, когда на листьях N1соtlana glutinosa начинают появляться видимые симптомы заболевания (некрозы), была выделена новая фракция китохонд-риальных белков с ыолекулярниивесои ~20 ООО (рис. 3). До появления некрозов и з конце, некробиоза эту ыракцию выде -лить не удалось. Появление нового белкового компонента о ftf 0,0? наблюдалось и при исследовании трудяораствориыых белков методой электрофореза в полаакрила^иднои геле (рис. 3).

Динамика появления новой фракции дала возможность предположить о ее значении в защитных реакциях растения. В связи о этими изучались антикафекционные свойства данного белка и других белковых фракций митохондрий на индикаторных . растениях. (Изученные фракции указаны на рис. 3). Полученные данные приведены в таблице 2.

Таблица 2 ■

Антиинфекционные свойства белковых фракций митохондрий

Объект Ткань Фракция белка Количество некрозов на единицу площади (см2) индикаторных растений % ОТ контроля

контроль опыт

I 2 3 4 5 б

Nicotlaoa glatinosa здоровая здоровая зараженная I I Ж 5,0*0,4 5,5*0,4 5,0*0,5 4.2*0,3 4,4*0,5 2,2*0,2 80,4 80,0 44,0

здоровая I 4,5*0,2 4,6*0,3 102,2

і -СбїЄ

I 2 ! 3 4 5 ■ 6

Nicotians tabacoa здоровая ! П зараженная I зараженная . 11 4,9*0,3 4,9¿0,5 5,2±0,8 4,9j0,3 5,3±I,I 100,0 , . 93,9 101,9

- — bsreopo- ¡ТОЧНЫЙ альбумин рыка 5,IiO,6 5,3ip,7 103,9

.Из таблицы видно, что белок митохондрий Nicotlana glutinosa ;, элшрущийся с колодки во второй пике, подавлял ' \aJ инфекционное» BTU в индикаторных растениях на 56%. Интерес-во, что и балок основной фракции, выделенной из митохондрий Hiootlana glutinosa , обладал некоторым вирус-ингибирующкм действием. Белки митохондрий N1 cot lana tata cum и чужеродный белок (сывороточный альбумин быка) антивирусными свой- . ствами не обладали.

Количество белка второй фракции в митохондриях Nicotia-na glutinosa . зависит от стадии онтогенеза растений; из митохондрий молодое растений его удалось выделить значительно больше, чем из митохондрий старых растений. В листьях на один ярус выше, чем ввкротизированные листья этого белка выделить на удалось. Следовательно, его наличие связано с образованием некрозов. Возможно, действие антивирусного белка связано с реакциями локального приобретенного иммунитета, описанного Рбссом (Rose, X96I).

Вещества с антивирусными свойствами выделены из сока . листьев целого ряда иммунных сортов растений после заражения их вирусами (Loebetisteiii.Roes, 1563;sela и др., 1964; Albreebtova, 1966; Липсиц и др., 1971). Некоторые исследователи сравнивают антивирусные растительные белки о интерфе- . * роном, который образуется в тканях дивотных в ответ на внедрение вирусов (Jjoebeneteln, Коаа, 1963; Xoebensteln И др., : 11969). Из митохондрий растений антивирусные вещества белковой природы раньше не были описаны. Интересно отметить, что из нерастворимой фракции митохондрий'клеток селезенки кроли-■ ка выделена белковая фракция, стимулирующая iá vitro синтез антител (Николаева, Гурвич, 1969). Не. исключено, что некото-

рыв бел ки мам бра н кл е го чиых структур растенийтакаее опоооб-. вы выполнять аналогичную функцию.

Следовательно, старение м развитие вирусной инфекции . вызывает количественные и качественные сдвиги во фракционной составе мембранных белков митохондрий. Подобные изменения могут .быть результатом; а) нарушения гидрофобных липид-белок и белок-белок связей г организации мембран, в результате чего после применения детергента получаются фрагменты мембран о . разными молекулярными весами и разными значениями заряда; в) подавления или стимуляции синтеза «итохокдриальных белков цитоховдриалытй или цитоалааматической Селок-синте зирую-, щей системой; в) изменения активности протеолихических и лн-' политических ферментов, оказывающих в своп очередь влияние на .состояние белкового компонента в составе мембран.

Однако, патологические процесс« могут затрагивать и структуру митохондриальных белков, их конфоркаци». В связи о вткм исследовали мктохокдриальные белки методами инфракрасной оиектроскопии и полярографии, которые являются весьма чувствительными для обнаружения конформациовных перестроек балков.

Инфракрасную спектроскопию используют для изучения состояния белковых компонентов в составе различных биокембрав (CTftham, Wallaeh, 19693 йтвеп, Saltón, 1970; БйНЮКОВ И др., 1971; ATíuot, wallacb, 1971; Атаяасов и др., 1971). Важным цементом является то, что с помощью этого метода иохно научать мембранные «елки без-разрушения нативной структуры мембран детергентами. Характерными для инфракрасных спектров похи-паптидов и белков является сильное поглощение пептидной-(анидной) группы* В результате этого в интервале спектра I500-I8Q0 ом*** выделяются характерные для белков полосы поглощения Амид I и Амид II. Полоса Амид I <<w 1650-1660 см"*) обусловлена валентными колебаниями 00 связей пептидных групп, полоса Амид II (л* 1550 сн~^) деформационными колебаниями NH-евязей и валентными колебаниями оя-связей (Чиргадзе 1965, 1967). Структура полос Амид I и Амид II зависит от кояформацик ; пептидных цепей, входящих в состав белков. .Максимумы поглощения пептидов с А-спиралью и ^-структурой локализованы в равных частотах спектра (Чиргадзе, 1965) ilaaMff , 1967);

Если ранее утверждали, что в мембранах ивгохоядрнв пол-

, носхыо отсутствуют пептиды з£-форме, то позже ВЫЯСНИЛОСЬ, что в мембранах митохондрий тканей животных, в зависимости от энергетического состояния митохондрий» могут присутствовать, бедки в виде л-спирали, р-структуры и неупорядоченного клубка (агаЬшв,КаНаеЬ , 1969; Панченко и др., 1972). В оптимальных условиях окисления и фо сформирован и я преобладают белки в виде л. -спирала. Разобщение окислительного фосфорилирования сопровождается переходом части пептидов в ^-структуру ( <;гаКыв, *а11яеь, 1969). Однако,.мембраны растительных митохондрий методом инфракрасной спектроскопии практически не изучены.

Как видно из ркс. Ч, инфракрасные спектры митохондрий, .выделенных из листьев табака, сходны со спектрами других метаболически активных биомембран (китохондрий животны^гканей, бактериальных мембран и т.д.)* Преобладают белки в виде о. -спирали или неупорядоченного клубка, на что указывают максимумы поглощения Амид I при 1663 см"1 и Амид II при 1552, 1555 см"1. Поглощения при 1636 сы-1, 1540 см-1 могут указывать на наличие ^-структуры.

Инфракрасные спектры митохондрий двух видов табака сходны. Однако, измерение на спектрах высоты пиков и плеч, соответствующих ^-структуре и л-спирали или неупорядоченному клубку по Груда (0ги1а, К1п« , 1971) показало, что относительное содержание пептидов с ^-структурой в «ятохондриях неустойчивого

вида табака несколько больше, чей в митохондриях устойчивого вида (таблица 3),

' ■ . Таблица 3 _

Соотношения высоты пиков в инфракрасных спектрах митохондрия табака (в относительных единицах)

Объект. . 1636, 1637 СМ-1 -1540 см"1 1663 СМ™1

1663 см"1 1552, 1555 см"1 1730 см"1

ЗИсоНаие е11^±ао '■ ее - 0,71*0,01 . 0,86±0,03 5,8 ±0,2

1Т1ооЪ1ая* ЪеЪвсип 0,7710,02 0,93^,03 ■5.3*0,2 ■■

О большей степени гетерогенности вторичной структуры «итохондриальяых бел]»в Н1сог1впа ^оЬесшп свидетельствует и

больна?

Рис. Ч. Инфракрасные спектры митохондрий табака

N¡«11

1500 1600 ПОО »«о

■ =(

о) ?

о 5 о

лсит.

„л

ш

1Ш (т до

I - до удаления липидов; Н - посла удаления липидов

1 90% ацетоном. .

Рис. 5. Инфракрасные спектры трудкораствориных белков митохондрий табака

Сапа а1и1тма

Мио^впа ^ а 1а сиг»

Юдн.ВТМ

и

с

1500 И 00 1700 №00

(»0 1*00 ПВО [<00

контроль,

ОПЫТ

ширина полоси Анид I (Абатуров и др., 1970{ Чиргадзе и да;, 1971) (рис. 4).

Поглощения np« 1730 см"1 и 1745 си"1 обусловлены колебаниями эфирных связей фосфолипидоа, Относительное содержание,^ белков и липидов в пробе характеризуется отношением jy^-^x • В 1ІКТ0Х0НДРКЯХ Kiootiana tabaeum ЭТО отношение равно 3,3*0,2, /В митохондриях ßicotlaea glutinöse 3,8*0,02,^что свидетельствует об относительно болызем содержанки лишідоз в митохондриях tficotlana tabacum . После удаления липидов 9QJi ацетоном і:ак-симуиы при 1730 см"* и 1745 см"1 исчезли (рис,4). Положение' максимума полосы Анид I после удаления липидов не изменялось. Максимум полосы Амид II сдвигался в сторону меньших частот спектра: в митохондриях устойчивого вида на 7 см"*, в митохондриях неустойчивого вида - на 15 см"*. Этот сдвиг, по-видимому, объясняется разрывом водородных связей, стабилизирующих структуру белка. Величина одвига частот характеризует силу разрываемой водородной связи (Чиргадзе, 1967).

$о фракции трудно рас творимых белков митохондрий, полученной после солюбализации нзгивных мембран митохондрий детергентом, преобладают белки в f-конформации, на что указывают максиму« поглощения Амид I при 1625-163? сы~* и полосы Амид Н при І52В-І540 см"1 (рис. 5). По-видимому, после разрушения натпвной мембранной структуры детергентом молекула белка, стабилизируются путем образования менмолекуляряш: водородных связей, т.е. образованием ^-структуры.

После инокуляции вируса в листьях табака в инфракрасных спектрах митохондрий Biootlana glutlaoea изменений не наблюдалось. В инфракрасных спектрах митохондрии восприимчивого--вида при длительном развитии инфекции наблюдался сдвиг nor лосы Амид И на 5-8 см"1 в сторону . меньших частот и появлялось плечо при 1690 см"1, указывающее на наличие пептидов о ^-структурой. Интересно отметить, что разобщение окислительного фосфорилирования, наблюдаемое у этого вида табака при -развитцй вирусной инфракции (Ладыгина в др., 1966), по данныы ■ Грахама также сопровождается переходом частя пептидов в і Р -форму (Graham,Wallach , 1969)* В инфра красиш: спектрах »руднораствориыых белков неустойчивого вида через 48 часов после инокуляции вируса изменился характер полосы Амид II, что свидетельствует о деструктивных изменениях в трудяорастворя-

мых белках после лизиса мембран и удаления липидов. Наиболее ■ выражены эти изменения при длительном развитии инфекции . (рис, 5). Положение полосы Амид II в инфракрасных спектрах . устойчивого вида при воздействии инфекции не изменилось.

Изменения в структуре мктохо н дри альиых белков выявились и при изучения полярографических воля труднорастворишх белков я реактиве Брдичка (окииачкыЯ буфер о рН 9,0), содержащей яони кобальт^. Теория воаникковсияя полярографических воля ' белков приведена в монографии Иванова » РзхлеевоЯ (1963). Необходимо отметить лишь, что за появление, полярографических волн белков в реактиве Брдичка ответственны образующиеся комплексы кобальта с сульфгидрняьныии: группами белков (Иванов, Рахяеева, 1966; Кузнецов, 1970). Изменения в структуре белка, ¡информационные перестройки белков, сказываются на высоте и потенциале полярографической волны, в результате чего изменяется и форма лолярограммы белков (Иванов, Рахлеева, 1968 11и«1сау-ггеаеоку, ВвгчсЬ , 1971). В связи с этим полярографию мокно использовать для изучения изменений состояния . » белков при патологии. Например, в медицине и ветеринарии, анализ полярографических волн белков.тканей и крови используют при прогнозе и диагнозе воспалительных и злокачественных заболеваний организма (Шевченко, Городинский, 196*0*

Труднорастворимые белки митохондрий табака после растворения в щелочи дали хорошо выраженную полярогрзфичесцую "< волну с максимумом при -1,42 вольта (рис.б). Вторая ступень . волны при -1,6 голым выражена очень слабо. По-видимому, это свидетельствует о гидрофобном характере'изучаемого белна, ■ т.к. предполагают, что возникновение первой.ступени полярографической волны обусловлено йН-группами, локализованными -в гидрофобных участках белковой молекулы (кигав*80У ,1971). Аминокислотный анализ также,показал высокое.содержание неполярных аминокислот в составе мембранных белков митохондрий (табл. 4). ' ■■■■■■:. 1

: Таблица *

. Аминокислогный состав ыеибранкьос белков митохондрий (мол %)

Аминокислоты líicotlana glutinosa Nicotlana tab acuta

здоровый зараяенныЕ (длит.) здоровый зараженный (длит.)

лизин 6,04 б, 65 4,54 6,50

'ГЯСТИДИЯ "3,05 2,« 1148 2,41

аргкник , 5,01 6,14 2,4S 3,63

цистеиновая кислота 0,93 0,92 1,78 1,89

аспарагиновая кислота 9,20 7,31 10,00 9,45

тресиин 5,оІ 5,73 4,13 4,61

серин 7,39 5,90 6,95 7,04

глютаииновая кислота 7,5? 8,39 10,20 9,62

пролив следи следы следы • следы

глицин 12.30 10.75 .13,55 12,85

аланин 10,02 9,78 II, 10 10,43

в алии 6,55 6,74 5,90

иетионин следы 1,23 1,12 . 1,52

изолевцин 5,74 5,20 5,20 3,78

лейцин 11,44 II ,10 ■ 12,55 11,22

тирозин 2,87 4,13 3,78 2,95

фенялалания 6,36 7,29 4,38 6,20

Результаты данной работы показали, что вирусная инфекция оказывает влияние на высоту полярографической волны труднорастворимых белков аитохондрий. Высота полярогра -фической волны труднорастворимых белков неустойчивого вида на начальной этапе патогенеза увеличивалась, достигая иаксинуиа через часов.после инокуляции вируса. Затем, после появления на листьях'ііозіаики (примерно через 10 дней после заражения), высота полярографической волны несколько снижалась по сравнение с контролем (рис. ?), Интересно отметить, что высота полярографической волны денатурированного

Рнс.б. Подпрограмма труднорастворимых белков митохондрий табака

сО

-1,2 -1.1 -1.6 ~и £,ВШ1

Стрелками обозначены: Со - волна кобальта 1,П - первая и вторая ступень полярографической волны белков.

Рис.7. Влияние вирусной инфекции на высоту полярографических ВОЛН зддвораотворишх белков митохогдрхй табака

Мес^апа £а£гасит КсоКала

7-ю

И

г. 1

-1 -2 -3

'4

о . о

о о

1 2 г-ю

ТП

Л«и. после

имокуицын ВТМ

+ А - увеливение высоты волны! в % от контроля - Д - уменьшение высоты волны)

В щелочи гаиопротеина из тканей больных со злокачественными опухолями изменяется такий яв образок - увеличивается по мере прогрессировать болезни, а затем скитается (ЗбарскиЯ, Элвпикер, 1947). Зыоота подярогр&фичаоксй волны труднораст-вориынх белков ыигохондри» устойчивого вида Яіооіїапа єііт-аова при воздействии инфекции снижалась. В связи с теп, что содержание цистекда при заражении практически не меняется (табл. 4), мозно предположить, что наблюдаемые изменения высоты полярографических волн обусловлены конфорыационныыи перестройками в белках, в результате чего меняется доступность восстанавливаемых сульгкдрильных групп для електродного процесса. По-видимому, в митохондриальных белках устойчивого вида после инокуляция вируса полярографически активные группы белков становятся более маскированными и менее доступными для электродного процесса по сравнению с митахондриальныни белками неустойчивого вида. Присутствие определенных функциональных групп на поверхности молекул или их блокирован-иостъ несомненно играют важную роль в образовании третичной структуры белков• 0 разном состоянии мембранных белков митохондрий, выделенных из зараженных тканей различных по устойчивости видов табака, свидетельствует и тот факт, что высота их полярографической волны неодинаково реагирует на температурное воздействие. При температуре 40°С высота подпрограммы белков митохондрий Яісоііапа еІнПпова и Нісо«»-аа -іаЬасиш уменьшилась нев одинаковой степени.

На основании изложенного иожно ваключить, что вирусный патогенез сопровождается изменением физико-биохимических свойств белковых компонентов митохондрий. Разобщение окислительного фосфорилирования, нарушение конформационных изменений. и ультраструктуры митохондрий неустойчивого вида табака, по-видимому, объясняются разрыхлением мембран в результате структурных изменений и дезагрегация белка. Структурные и конформанионные перестройки в белковых компонентах мембран могут быть вызваны разрывом внутри- и межмолекулярных водородных связей, стабилизирующих структуру белка, изменениями электрических, агрегацхоняых свойств, степени диссоциации белковых молекул и т.д. в результате развития янфек-

ции и искаженного,обмена веществ в инфицированной »летке. Конформацкя белков, в свою очередь/ влияет на их биологическую активность,, ферментативные и иммунологические свойства.

Влияние вирусной инфекции >та .изо^ериентгшй состав ококугов^уктаа уктрхонг^кР

В связи с тем, что изменения в белковом комплексе затрагивают и каталитические свойства белков, ми изучили воздействие вирусной кифекции на молекулярную гетерогенность оксидоредуктаз митохондрий, 3 настоящее-время, молекулярная гетерогенность, т.е. наличке изоферуектов,- активность которых может изменяться в зависимости от возраста, условий пиг тания растений, заболевания и ь?. д., показана для целого ряда окислительно-восстановительных ферментов растений (ЗЬамюп, 1968). Естественно, что для выяснения механизмов,.связанных ' о устойчивостью растений недостаточно изучить только .общую активность дыхательных ферментов. Необходимо более подроб- -яое изучение изменений, происходящих под влиянием инфекции в изоэнзикном комплексе оксидоредуктаз энергетических центров клетки.

В связи с этим, в задачу ¿Ьстоящей работы вооЛи вопросы, связанные с изучением влияния вирусной инфекции на изо- 1 ферментный состав оксидоредуктаз митохондрий. Методом эн-экм-элекгрофореэа научали молекулярную гетерогенность следующих оксидоредуктаз: цалат^иэоцихрат-, глюкозо-б-фосфатдегид-рогеназы, фенолоксидазы и п'ероксидааы. Для'всех'этих. ферментов показано наличие ыитохондриальных форы ( наскеН,-Йан1ад<1 , 1962; Разумовская и др., 1970; Раг1еЬ г 1972). Все изученные ферменты, кроме глутаматдегидрогеназы, оказались молекулярно гетерогенными (рио. 8).

Вирусный патогенез сопровождался преимущественно изменением активности отдельных изоформ оксидоредуктаз, причем- ' характер и степень этих изменений в митохондриях устойчивого и неустойчивого видов табака,били неоднозначны.

Так, у имукного вида табака через 24 часа после заражения изогнзимный спектр изученных ферментов практически не изменился. Во время образования некрозов (48 часов и 7 дней после инокуляции вируса) активизировались изоферменты 2 к 3 глюкозо-6-фосфатдегидрогенаэы. Кроме того, глюкоза-б-фос-

Рис. 8. Электрофопвграымц оксидоред/ктаэ ичтохондрий.

Ntcoiiana {aLacum. .

Rf

- - —

+ 4 і — і ----- і і

tüá і і W.'.TJí 3 ¡\

І ¿si,

4

4 І т а 3 •0 =й s 6 ? а і ==

Nicoílana tjlulînota

— 1 о

+ ¡ — і ■ВИ і ..... 1 ----

H і — 2 г j

і ti 3 і s 1 Я M — Д5

; • \ . і Q Í S Г 7 , « 1

к> N

—! - LJ J ІЛ

І' Я ж ВГ зг Ш

I - иаіатдегндрогене аа t И - глюкоао-6-фосфатдегидрогеваза J П - ввоциіратдвгидрогевазаї ІУ - глугаматдегидрогева за; .-' 7 - щроксадазаі 71 - фе волокся^ за

Цифраця обозначены нзоанаїши отдельных ферментов + - полоса неизвестной природы. 1

фатдагидрогенаэа устойчивого вида более гетерогенна (3 полоси фортзана в мнтохозвдршгх устойчивого вида ¿абака, 2-ї неустойчивого вида.)« Активация из »ферментов глюко з о-6-фосфатде гид-роге из.зы во время образования некрозов свидетельствует об усилении доли апотомического пути превращения глюкозы, ответственной за. ряд вэрных синтезов в клетке.Образовапив некрозов соп-рсвоздалось и значительной активацией лзофермснтов 2 и 3 леро-ксидэзы. Ло-видимоцу, г реякшшх сверхчувствительности участвуют в основном иэофериенты пероясидазы с малой алектрофоре-тнческоЗ подвижноетыэ, шстивнос ть которых значительно возрастает в период некробиоза. .

В митохондриях ¡геуотойчивого вада 24-4S часов после иноку-ляшш вируса значительно упелїічквзлаоь активность многих изо-ферментов иэученшх дегідрогеназі После появления ыозаичности на молодых листьях обнаружен изофермент шлатдепгдрогеяазы (ЗЇ, отсутствующи в митохондриях контрольных растений. Однако, аа-тішиость изоферментов г^аокозо-б-фосфатдегидрогеназы и 2 и 3 персксидазы снижалась. ■ . і

Ha основатти изложенного экспериментального материала модно аеключить, что вяруснзя инфекция вызывает, в основном, количественные изменения в изоэнзямноч Спектре изученных океидоре-дуктаз. Перераспределение активности мевду молекулярными формами фермэнтов при воздействии инфекции свидетельствуй о неравноценности их в обмене веществ в системе роатеїш-хозяян-паразит. Налитеє субстратов ферментов, интенсивность но пользовался юс . -и накопление конечных продуктов, как известно, может оказывать регуляторное действие на скорость и направленность обмена веществ в клетке. Преобладание активности одних окоидоредуктаэ или их иэофэрм определяет определенное физиологическое состояние тканей, уровень энергетического обмета и образование промежуточных активных метаболитов, используемых в разнообразных обменных процессах и в биосинтезах. Таким образом, неоднозначное ззменение активности разных изоферментов может оказать регуляторное действие на метаболизм в системе расгеюте-хозяин-дараэат.

Из изложенного яксперимектального материала следует, что развитие вирусной инфекции сопровождается мэионенияни ¡сак каталитических, V8K и фИЗИ КО-бИОХИМЯ46СКИХ свойств белковых :гаыпо-, кентов митохондрий. Характер этих изменений в митохондриях устойчивого и неустойчивого к BTU видгв табака неодинаков. Мембранная структура митоховдий неустойчивого вида, по-видимому, морфохимическа лаб-лвкое, чем в митохондриях устойчивого вида, в результате чего при старении и после заражения нарушаются ли-пид-белок и белок-Селок связи в мембране и происходят структурные перестройки в белковых компонентах мембран. Зто ведет к нарушению нативного состояния меибраи, к нарушению их функциональной деятельности и изменению ультра структуры.

ВЫВОДЫ v'

1. Развитие вирусной инфекции вызывает количественные ч качественные изменения в труднорасгворкшых белках шнох^ндрий табака.

2. Содержание труднораствопимых белков митохондрий в тканях устойчивого вида табака при вирусном патогенезе увеличивается, в тканях неустойчивого вида - снижается.

3. Из митохондрий устойчивого вида табака на начальном этапе патогенеза выделена белковая фракция, подавляющая инфекционные свойства BTU на 56JS. Белки митохондрий восприимчивого вида антивирусными свойствами не овладеют.

В неблагоприятных условиях (старение, заражение) увеличивается морфохимическая лабильность мембран митохондрий восприимчивого вида табака. Митохондриалздые мембраны иммунного вида более устойчивы к действию неблагоприятных факторов.

5. Белки ь мембранах митохондрий табака находятся преимущественно в виде •¿-спирали или неупорядоченного клубка* Присух- . ствуют и пептиды с {3-конформацизй. В выделенной франции труднорастворимых белков митохондрий преобладают белки с р-итцгктурой. Вторичная структура Шм^раниы* белков митохондрий устойчивого вида табака при вирусном патогенезе не изменяется. В митохондриальных белках восприимчивого вида табака происходит изменение инфракрасного спектра в области Амид Д.

6. Трудяооастворюые белки митохондр;;й полнрографически

.кктквкы к дают колярографическую "волну с максимумами при -1,42

гг

.. и I,в вольта. Высота полярографической волны балко:ввинфициролав-яшс 5'канях устойчивого вида табака уменьшатся, неустойчивого вида - увеличивается, и несколько уиеныгался после появления внешних симптомов заболевания.'

7. Изменение во фракционной составе, инфракрасных спектрах ' и.подпрограммах белков свидетельствует о структурных перестройках в белках митохондрий, происходящих в результате вирусной инфекции,

8. Показано, что оксидоредуктазы митохондрий молекулярно гетерогенна и состоят гз нескольких изофериентов. Вирусная инфекция вызывает в основном количественные изменения активности отдельных иэоформ изученных океидоредуктаз, характер и степень которых в митохондриях восприимчивого и устойчивого вида различим. В иигохоидриях восприимчивого вида табака инфекция пндуцярует образование нового компонента малатдегидрогепазы.

Материалы диссертации изложены в следующих работах:

1. Ладыгина U.E., Таймла Э.А., Рубин Б.4. Особенности изо> энзимного состава пероксидазы и полифенояоксидазы при вирусном _

патогенезе у табака, физиология растений т. 17, в. 5, 92?, 1970.

2. Рубин S.A., Ладыгина U.E.. Тайила Э.А. Особенности иэо-феркеятного состава дегидрогеназ при вирусном патогенезе у табака. Биологические науки № 2, 78, 1972. с-

3. Ладыгина И:Е., Рубин Б.А., Таймла,S.A., Лысенко Г.Г. Характеристика труднорастворимой фракции белка при вирусном па-* тогеквэе у табака. Физиология растений т,19, в.4, 831, 1972.

4. Рубин Б.А., Ладыгина U.E., Таймла Э.А. Антивирусные свойства белковых фракций митохондрий табака. Доклады.ВАСХНИЛ, № З, 197 5.

5. Ладыгина u.E., Тайшп Э.А., Гзйваронская Л.Ы. К#форма-циоклые изменения .белкового комплекса митохондрий при вирусном патогенезе у табака, физиология растений г. 2.0, в.3, J973

6. рубин Б.А., Ладыгина U.E., Таймла Э.А. Изменения в белковом комплексе при фятопатогенеэе. Успехи современной биологии (в печати).

Ротапринт тип. "Московский печатник? Зак.