Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

GTP-зависимая регуляция пассивного транспорта кальция в плазматической мебране миометрия

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "GTP-зависимая регуляция пассивного транспорта кальция в плазматической мебране миометрия"

РГ6 од

АКАДЕМ Ш НАУК УКРА1НИ 2 1 ИЮНнаШи ВЮХ1М1Г 1М. О. В. ПАЛЛАД1НА

на правах рукопису

КРОПОТОВА Св1тлана АнатолПвна

ОТР-ЭАЛЕШ РЕГУЛЯЦШ ПАСИВНОГО ТРАНСПОРТУ КАЛЩ1Ю В ШЗМАТИЧН1Й МЕМБРАН! М10МЕТРШ

03.00.04.-БЮХГМШ

Авхорефе р а т дисертац11 на здобуття вченого ступеня кандидата С1олог1чних наук

Ки1в 1993

Робота виконана в в1дд1л! С1ох1мП м"яз1в 1нституту 61ох1м11 1м'.0.В.Паллад1на АкадемП наук Укра^ни

Науковий кер1вник д.б.н.,проф. К'.Д.Курський

Пров1дна устансва - «Швський державний ун1верситет

1м.Тараса Шевченка

о 14 годин! на зас1данн! спец1ал1аовано] вчено! ради Л 016.07.01 для гахисту днсертаШй в 1нститут1 б!ох1мГ1 1м.0.В.Паллад1на АН Укра!ни.еа адресов: 2.52601 м.КиЧв-ЗО, вул.Леонтовича 9.

3 дисертац!ею можна ознайомитися в б1бл1отец1 ¡нституту <51ох1мП 1м.0.В.Паллад1на АН УкраТни.

0ф1ц1йн1 опоненти: доктор 01олог1чних наук,

МАЛШЕБА м. К.

кандидат б1олог1чних наук, •ИЗМЕНЫ) А.Й.

Зачист дисертацП в1дбудеться

Автореферат роз1сланий "

Бчений секретар слетал!". вазо! вчено! ради канд.бЮл. наук

Актуальн1сть проблеми.

Проблема тонких регуляторних ыехан1эм1в,як1 забезпечують рансмембранну передачу сигналу, знаходигься в центр! уваги 6io-iMiKiB'ia молекулярних б1олог1в.Це в!дноситься до.СТР-зв'яэуючих 1лк1в (3-б1лк1в), я Iii эд1йсюоють координац1ю дП позакл1тшших фектор!в а внутр1шньокл1тинниш мессенджерами. МодуляЩя 1х ак-ивност1 в1д0уваеться як за рахунок нековаяентних вплив1в гуан1-овими нуклеотидами - GTP га EDP - i йонами магн1ю HigashiJ lma, 1987), кальмодул!ном (Katada, 1987), так 1 за рахунок овалентно'!' модиф1кацП фосфорилюванням (Lewis, 1990) та ADP-рибо-илюванням (Ueda,1985).

Саг+-канали мокуть бути стратег1чно важливими м!сцями, як1 в'язують поза- та внутр1шньокл1тинн1 под!!, осШльки калыДй е н1версальним регулятором ф181олог1чно1 повед1нки кл1тини.

Внутр1шньокл1тинн1 осциляцГ! концентрацП йон1в кальц1ю, як! егулоть i скорочувальну активШсть гладеньких. м'яз!в, запускаться, в тому числ1, агон!ст-1ндукованими зм1нами Функционально! ктивност! i й-01лк1в (Birnbauraer ,1990). Бплив агонЮта може бути 1вельовано ADP-рибоэйлюванням G-OUkia за допомогою бактер!адь-их токсин 1в (Gilman.1987). Однак ряд кл1тин мЮтять эндогенну DP-рибоэилтрайсферазу (Коц,1990; Ueda,1985; Peterson,1990), що рипускае втягнення цих регуляторних механ1зм1в до широкого кола етабол1чних та функц1ональних процес!в.

Гетерогенн1сть б-б1лк1в (Birnbaumer, 1990) - tue один фак-ор.який визначае складШсть регуляторних процес!в та координова-1сть Ix' д!й.

Досл1дження част1ше всього проводяться э використанням аго-IcTiB саме для В1докремлоння певного типу 3-б1лка. Другий экспе-иментальнйй шлях - вид1лення 1идив1дуальних субодиниць в-б1лк1в а вивчення ix впливу на активн1сть вторкнних посередник!в в тучних лШдних системах. Дан1 вивчення впливу внутр1шньокл1тин-их модулятор 1в активноеTi (3-б1лк1в та 1ндукованих ними зм!н -ак-HBHocTi систем(и) вторинних месендкер1ь в Л1тератур1 в1дсутн1.

Виходячи з вищесказаного уявлялось, що вивчення GTP-залехних ехан1зм1в транспорту кальШю дозволить найлизитися до розум1ння ункц1оначьно1 спрямованост! та доц!льност1 дП внутр!шньокл1тин-их активатор1в та 1нг1б1тор1в активное?! 0-б1лк1в.

Мета та завдання досл!дження.

Метою роботи було вивчення б!ох1м!чних механ!зм1в СТР-залеж-Н01 регуляцП функцП системи, яка пасиьно транспортуе кальц!й, в плазматичних мембранах гладеньких м'яз!в м1ометр!ю.

Для досягнення ц1еХ мети вир1шувались сл!дуюч1 завдання:

1) Вивчити вплив эндогенних модулятор1в - гуан!нових нуклеотщЦв, йон1в магн!ю та мембранозв'язаного кальмодул!ну на пасивний транспорт капыдю в сарколем! м1ометр!ю.

2) Охарактеризувати вплив экзогених модулятор!в активност1 (3-б1л-к1в - фтороадкшнату та АОР-рибозилювайня коклюпшим токсином -на пасивний транспорт кальц!ю.

3) Визначити спектр в-б1лк1Б в плазматичнШ мембран! м!омегр!к евин! за допомогою АОР-рибозилювання коклюшним та холерним токсинами.

4) Доел1дити к!нетичн1 характеристики зв'язування та г1дрол!зу в! плазматичними мембранами м10метр1ю.

Наукова новизна роботи.

Е представление робот 1 доказана принципова: можлив!сть регуляцП пасивного транспорту кальц1ю в плаэматичн!й мембран! м1ометр!ю за допомогою БТР-залежних реагаЦй поза агон1ст1ндукова-но1 активацИ системи.

Всгановлено, що сарколема м!сметр1ю м1стить два тили С-б!л-кЛв.якд АОР-рибозилються холерним та коклюшним токсинами, при^чо-му, субстрат холерного токсину в тканин! гладенькихм*тз1в 1денти-Фшовано в перше.

Показано, що регуляторною компонентою й-б1лк1в в в1дношенв! структури.яка пасивно транспортуе кальц!й,е с< - субодиниця, а В1 -двом!рний комплекс,який утворюеться п!д час активацИ 0-б1лк1в, мабуть, не впливае на пасивний транспорт калыдю в сарколем1 м!о-метрИо.

Доказано, що 1нг1б1торна регуляц1я пасивного ' транспорту кальШю вд!йснюеться д-субодиницею 61/0о-б!лка, чутливого до коклюшного токсину.'

На основ! ю!. личного анал!зу экспериментальна дан их проде-монстрована просторова роз'еднан1сть сайт!в зв'язування СТР Т5 Щ2' на плазматичн!й мембран! м!ометр!ю.

- 2 -

Теоретична та практична аначш1сть роботи.

Одержан1 результата св1дчать про те, що в кл1тинах гладеньких ы'яз1ь м1ометр1й 1снуе GTP-модулюема система регуляцП пасив-ного транспорту кальц1ю, незапежна в1д активад!i рецептор!в, яка здатна р1аионаправлено м1няти nacHBHi потоки кальц1ю через плаз-матичну мембрану в залежност1 в1д ф1з1одог1чних вимог та/або

УМОВ В KJliTliHl.

Экспериментами! дан1 можуть бути використан! для ц!леспря-мованого пошуку внутр1шньокл1тинних анадоПв фШолопчно! д1'1 GTP, а тако'ж активатор!в зндогенних ADP-рибозилтрансфераэ э метою розробки фармаколог1чно та Ф1з1олог1чно адекватних регулятор1в скорочувадью! активносИ гладеньких и'яг\ъ м!ометр1ю.

Апробация роботи. Результати дослШень та основн! виеновки були представлен! на М1жнародному симпоз1ум! "Структура и Функции ' регуляторних полипептвдов" (Москва, 1S9S); на VI УкраТкському 61-ох1м1чному э'"1зд1 (Кихв, 1S92); на науковю; семiнарах 1нетитуту OioxiMit 1м.0.В.Паллад1на АН УкраКни.

Публ1кац11. 3 теми дисертадП опубл1ковано 6 ро01т.

Структура та об'ем роботи. ДисертаШя складаеться з вступу, огляду д1тератури (4 розд1ли), опису метод!в досл!дження (1 роздал). винладу та обговорення одержаних результаПв- (1 розд!л), заключения. висновк!в та списку використано! л1тератури (206 дже-рел.з яких 19 в1тчизняних та 187 вакордонних). Робота викладена на 135 стор1нках машинописного тексту, 1ж>стрована 16 маоткками та 14 таблицами.

Методи досд!дження. Эксперимента проводили на плазматичних мембранах м1ометр1ю свир1, як! вид1ляли за методом, який було ровроблеио в в1дд!л1 (Кондратюк, 1986).

Пасивний транспорт калыйю в фракцП переважно Шертованих везикул сарколеыи м!ометр!ю вивчали за допоьюгою 1зотопкого методу (Костерин.1983; Кондратюк,1986). Рад1оактивн1сть визначали на р!динному сцштиляцзйному спектрометр! "Bekman" (OTA). Анал1з к1-нетикй пасивного транспорту кальц1ю проводили з використанням методу Альгранаг! (Algranat1,1963).

2-X-6S ' 3 "

Для вивчення вшшву гуан1нових нуклеотид1в, АТР, йон1в алю-м!н1ю, магн!ю та фториду, а таксик комплексного йону фтороадюм1аа-ту на паоивний транспорт калыЦю в середовще пасивного транспорту вносили сл1дуюч1 к1нцев1 концентрацП досл!джуваш« модуля-Topiß: ' .

1) SDP - 0,1-1,0-10,0-100,0 Mrtd; 1 мМ;

2) STP - 0,1-1,0 MM i ATP - .1,0 мМ в присутносИ Z ,мМ Mg2+;

3) Mff2+; - 1,0 MKM; 0,1-1,0-10,0 ftM;

4) Al3+ - 10,0 MKM;

5) F~ 1,0 и 10,0 мМ;

6) AIF4- - в в1дношенн! Al3+/F~ - 1/100 (10 мкМ AI3"1" плюс

1 мМ Г.) 1. в Ыдношенн! Al3+//F~ - 1/1000 (10 мкМ А13+ плюс 10 мМ F"). ' •

ADP- рибоешповання кокшошним токсином плаэматичних мембран м1ометр1ю проводили га методом Рибейро-Нето (Ribeiro-Neto,lQ85) в модиф!кацП (Коц,1990) з посл1дуючим вивченням пасивного транспорту кагац1ю аг1дно вищеэгаданого методу (Кондратюк, 1986).

Вивначення GTPasHO'l активност! нативних та ADP-рибозильова-них кокяйтнш токсином плаематичних мембран мюметр!» проводили аа методом Л1бмана (Lletman,1990).

Зв'язування QTP з плазматичною мембраною мЮметр!ю проводили ва методом Брандта (Brandt,1986). Для анал!зу к1нетики ав'ягуван-ня GTP э сарколемою м!ометрт та нуклеотидного обм!ну використову-вади перегворення Скетчарда та модель Фергусона <Ferguson, 1986)..

Визначення субстрат1в колерного та коклюшного . tokchhIb в плазматичн1й мембран1 мЮметрш з депомогом АОР-рибогилювання эгаданими токсинами проводили ва методом Кода (Коц,1990) s допо-могою t3iP]-NAD+, с.даегованого sa методом Кассела (Cassel, 197В) ,з поел! душим электрофорезом в град1гнт! пол1акри-лам1дного геля в присутност! додецилсульфату натр1ю за методом ЛеммлГ ;(Laemmli,1970) та авторзд!ограф11 61лкоеих емуг.

Экспериментальн! дан1 оброблювали -методами вар1ац1йно1 статистики.

ОСНОВН1 РЕЭУЛЬТАТИ ДОГОИДЖЕНЬ.

1. 1дентиф1кування субстрат1в бактер1алъних токсин1в в сар-колем! м1ом<тр1ю евин!.

АЭР-рибоаилюванням в допомогою [згРЬМА0+ в присутиост1 холерного та коклюшного токсйн1в в плаэматичн1й мембран! м1ометр!ю 1дентиф1ковано два б1лкових субстрати э молекулярними масами 42 и 40 кДа, в!дпов1дно (малюнок 1).Припускаеться, що це а -субодиншЦ Оз- та С1/0о-б1лк1в.

ЭндоГенну ДОР-рибоэилтрансферазну активн!сть (в присутност1 т!льки МА0+ та 6ТР) в плазматичн!й мембран! м1ометр1ю виявити не вдалося, молишво, И позамемОрачшэ*! локал1зац1Х.

2, Характеристика 6ТР-зв'язуючих сайт1в плазматично1 мембра-ни м1оиетр!ю.

Сл1дуючим кроком в наших досл1дженнях стало визначення к1не-тичних характеристик процесу, який залускае активац1ю 6-б1лк1в, а саме, - зв'язування ЭТР.

Крив! зв'язування-ЭТР в середовтц!,яке м1стить Мг2+, та в позбавленому магн!ю, показано на малхшку 2.

3 представления данях видно, що к1льк1сть м1сць зв'явувашш (Вшах) . в середовищ! без магн!ю в 1Шзькоаф1нтму сайт! в 3,6 рази

малюнок 1.

ачектрофореграма субст-рат1в коклюшного (1-3) та холерного (4-6) токсин1в в плазматичн1й мембра-н1 м1ометр!ю.'

I 2-305 6

специф1чне зв'язування, имоль

малшок Z. Вплив 10 мМ Mg2"1"" на зв'язування GTP плазматичними

мембранами м!онетр1ю. Специф1чне зв'язування в-середо-вищ! без магн1ю (01 - Л1ва шкала, в сер°довищ1'э Mg2f, (•) - права шкача.

п-ревищуе' к1льк1стъ м1сць гв'язуьання б високоаф!нному сайт1 'таблиця 1). Ц* дозволило нам умовно поаначити високоэф1нний сайт як GTF-гв'яэуючий сайт.АОР-рибозильований ходерним токсином, а нивькоаф1нний сайт - як äTP-вв'ягуючий сайт, АОР-рибозильований коклюшним токсином. ПодИне припушення основуетея на веемому факт! : ол1гом~рний Gi-oiflQK - субстрат коклюшного токсину - эв'-яэув GTPi" £ в 4 рази бьчьше, н)ж ол1гомерний Gs - субстрат холерного токсину (Ferguson,1986)

СпорШеншпъ високо- га ниэькоаф1 иного сайт1н сарколемм .нометрш вростае в присутност! Mg"1", (таблщя 1). Можливо, да эв'ягано в тим, шо за Ыдсутност! экгогенного Mg2', один GTP не ьикликае дисоц1£оШ субодмшць GTP-эв'ягукчих сайт!в мЮметрш, ио f Еигнача? гнижену аф1нн!сть гетеротрим!рного комплексу до

Таблица 1.

ВПЛИВ Й0Н1В МАГИ1Ю НА Ущах ТА К(1 ЗВ'ЯЗУВАННЯ ОГР В ВЙСОКО- ТА НИЗБК0АФ1 ИНОМУ САЙТАХ САРКОЛЕШ ШОМЕГРШ (дан! на 1 мг мембранного б!лку).

I Мг2*,],: високоаф!нний сайт : нигькоаф1нний сайт

мМ Вшах, Ы, Вшах, Кс1,

пмоль нМ пмоль МкМ

0 9,80 ± 1,80 39,61 ± 0,39 35,51 ± 4,49 0,16 ±0,02

10,0 1,56 ± 0,12 4,77 ± 0,43 4,94 t 0,08 . 0,064 ± 0,002

вТР. Таким-чином, р1зниця в Кс1 для зв'язування 6ТР в високо- та низькоаф!иному сайтах м!ометр1ю в1дображають 1к структурну - аа-лежн/ в1д йон2в матн1в - р1эяицю в пронес! фуккцЮнування.

Для визначення характеру вгсливу ион!в магн1ю на эв'язування (ЗТР з плавматичними мембранами були одержан 1 к1нетичн1 парамет-ри,як1 характериэують цей процес, - Кт та Ушах (таблиця 2).

ТаСлвдя 2.

ВШИВ Й0Н1В МАГНЮ НА ЗНАЧЕНИЯ Кт ТА '/шах ЗВ'ЯЗУВАННЯ вТР 3 ПЛАЗМАТИЧНИШ КЕМБРАНАШ ШОМЕТР1Ю В ВИСОКО- ТА НИЗЬКОАФ!ИНОМУ.САЙТАХ (дан1 на 1 ыг мембранного Млку).

. високоаф1яний сайг : нигькоаИнний сайт

кМ Кт, Ушач, Кт, Утах,

.нМ пмоль мкМ пмоль

О 17,85 ± 2,95 2,74 ± 0,35 0,31 ± 0,07. 35,95 * 2.92

10,0 12,84+5,32 0,69 ± 0,27* 0,30 ±0,08 6,51 ±0,7?*

*р<0,05

З'У-63

Km, як для високо-, так 1 для низькоаф!нного сайИв, не залечить в!д наявност1 в середовгац! Mg2+. Разом з тим, в присутнос-т! 10 мМ Mg2+, в!дбуваеться дсютов1рне .зниження Ушах в обох сайтах. На основ! цих коредяШй можна зробити висновок про неконку-рентно-модулюочий вплив ион1в магн!ю на зв'язування GTP а плааматичною мембраною м!ометр1п, причому, сайти зв'язування QTP та Mg2+,wa6yrb, просторово роз'еднан1.

Швидк1сть вв'язування QTP з плазматичними мембранами м1омет-р1ю досить низька (таблиця 3), що мохе бути пояснено наявн1стю эндогенно-зв'язаного з d-субодиницею GDP, оск1льки в!домо, що швидкЮть ассоц1ац11 GTP з в-б!лками оСмежуеться ш6идк1стю дисо-ulaui'i эндогенного SDP в1д 3-б!лку (HlgashlJ Ima, 1987).

Таблиця 3.

БШШВ ЙОНГВ МАГН1Ю НА ВЕЛИЧИНУ КОНСТАНТИ ШВИДК0СТ1 ЗВ'ШУВАННЯ GTP В ВЙС0К0- ТА НИЗЬК0АФ1 ИНОМУ САЙТАХ САРКОЛЕММ MIOMETPIP.

CMg2+], : високоаф!нний сайт, : низькоаф1нний сайт,

ММ хв"1 хв"1

0 0,060 ± 0,002 0,035 ± 0,001

10,0 • 0,048 ± 0,003 0,019 ± 0,001

■ Для Gl-ölJiKy константа шеидкоот! зв'язування GTP в середоьищ! без магн!ю становигь 0,041 ± 0,0С>5 хв"1 t.Ferguson, 1986), за другими даними - коливаеться для р1зних субти-п1в Gi-6iJKlB в1д 0,025 до 0,192 хв"1 (Carty.1990).

Як видно г таолиц! 3 в присутносг1 ион! в магнию константа швидкост! зв'язування GTP знизкуеться в 1,4-1,8 рази 1 для високо-1 для'низ ькоаф1 иного сайт1Е, що гадов! ль но. узгоджуетюя э опубл1-коЕачими даниш про зниження аналогичного параметра в 1,2-1,3 рази для Оо-61лку (HlgashlJima,1987) та !ндив!дуальних «1- та ■„га-субодикииь (Ferguson,1986).

Для плагматичаих мембран м!ометр1ю константа швидкост1 дисо-uiaail QTP в середовинц без магн!ю становила 0,052 ± 0,002 хв"1 для високоафгнного сайту та 0,034 t 0,001 хв"1 для нивькоаф1нно-

• - 8 -

го,що в останньому нипадк^ не протир!чить даним л1тератури (Ferguson,1980) длй.31-б!лку : 0,023 ± 0,003 хв""1.

Таким чином, одержан! результати эвязування GTP э еарколемою мшметр1ю свЦчать про те, що 6ТР-зв'язуюч1 сайти на плазматичн1й мембран! мюметр1ю д1йсно 1снують, стабШзуються в присутност1 гуатнових нуклеотид1в та Мг2'1' 1, мабутъ, просторово в1дд1лен1 В1Д сайт1в эв'язування Мгг>.

у. Вплив гуан1ноЕих- нуклеотид1в, АТР та Mg=+ на пасивний транспорт калыйю в сарколем! м!ометр1го.

.Гуан1ноь1 нуклеотнди, АТР и Мег+ в1дносятьсл до групп эндо-генних модулятор1в актиьносач аТР-аь'л&уючих бик!в,як1 зм1нюють 1х Фуккц1онуьання негалежно в!д рецептор-дшчих агон1ст1в.

Проведен i дослЦження показали, до экзогенний GDP, взятий в широкому д1алагон1 концентрац1й, не впливае на пасивний транспорт кальц!ю (малюнок 3),що св1дчить про те, що 6БР-л1гандована форма В-б1лка - незалекно вгд його типу - "неактивна в регуляторному в1дношенн1.

нмоль Са2+/мг б!лку-сек

1,6 -

1.2 0.8 ~ 0.4 ~

i г з а

малюнок 3. Вплив гуан1нових нуклеотид1в на початкову швидкЮть пасивного виходу калыЦю з 1нвертованих везикул сарколемм м!шетр1ю: 1-1 иМ QTP 3 - контроль

2 - 0,1 ыМ GTP 4-0,1 мкМ-0,1 мМ GOP - 9 -

г*

В1домо,що механ!зм активацП- 1нактивац11 «-субодиниц1 6-б1д-ку.який регудюеться 'процесами зв'явування та г!дрол1зу вТР (в11тап,1987), вимагае ттрисутност! йон!в магн!ю. Шд час викорис-тання в якост1 модулюючого активШсть 6-б1лк1в агента йон1в маг-Н1ю, ми одержали дву.чфазну крнву (матонок 4), яка св!дчить про наявшсть двох тип!в кисць зв'язування даного кат1ону а мембран-ними структурами м!ометрш.

имоль Оа~ /мг б!лку'сек

ТаЛлиця 4.

ВШИВ СЛР ТА АТР Б ПРИСУТНОСТI ЙОНШ МАГНШ НА ПОЧАТКОВУ ШВИДКЛСТЬ Г1АСИВН0Г0 ТРАНСПОРТУ КАЛЫИЮ Б ВЕЗИКУЛАХ САРКОЛЕММ МЮМЕТР1Ю.

[•ЗТР], мЫЛСАТР], мкМ : початкова шевдк1сть виходу,

нмоль Оа£+''мг б!лку«сек

п 0 0,ру 0,04

0 1,0 0.83 + 0,04

0,1 0 0,78 0,03

1,0 1,0 1,16 0,09

БЦомо.шо 0-С1лки в плазматичних мембранах багатюх тканин TlcHO а:оц1йоЕан1 ? ну>:леотгад^}осфок!назок', Шйснгаоть трансфос-форилюьання эндогенного 6DP на «-субодиниц! в-б!лку (Otero, 1990) за рахунок АТР або GTP ( Не Mb', ic he 1, 1990).

Одержан! нами результати про активуючу д!ю GTP та АТР на па-сивний транспорт кальШю в сарколем! м1ометр!ю (малюнок 4, таблица 4) св!дчить на користь припущення про можлив1сть асоц!ацП (3-б1лк!в тканин гладеньких м'яз1в м1ометр1к з нуклеотиддифосфок!-назою та пояснюе активац!» 0-б1лк1в сарколемм м!ометрш незалекно в!д агон1ст1Е-!ндукуючих активац!ю рецептор1в.

'4. Вплив ионiв ачюмШю, фториду та комплексного иона фтора-люм1нату на пасивний транспорт кальШю.

Ряд 3-б1лк1в можуть активуватися суШиго фторид-йон1в та йо-н1в алкм1н1ю,як1. дають комплексний ион фтороалюм! нат.у (AlF^'") (Inoue, 1990; Higashl.llma, 1987}. При цьому в1дбуваеться дисоШаШя «-субодиниц! 5-б1лка в1д зтс-димера (Kohnken, 1989), а при цьому «s-субодиниця, aie не «i/ <:<е, переходить в розчинну форму та ди-соц!юе в!д мембрани (Скурат,1989). Таким чином конаентрац1я вт-димерного комг...ексу в мембран! гростае.Б!домо, що uv-лимэр ¡даний! модулювати ряд систем вторинних месенджер1в, не эалежно в1д . «-субодиниць (Katada,1987; В!гпЬаитег,Г'-Э0) та зв'язувати кальмодул1н плазматичних мембран (Katada, 1987). в цьому гв'язку виникае питання про зт- залежну регуляЩю пасивного транспорту калыЦю в сарколем! м1ометр!ю.

Для цього ми позбувались в1д мембранозв'язаного качьмодул1ну шшхом обробки везикул сарколемм м1ометр1ю 1 ыМ ЭГТА в присутнос-г! 0,2 M NaCl (Кондратюк, 1988). Вивчення пасивного виходу каль-д1ю з Еезикул.як! м!стять та як1 не м1сгять кальмодул1н, дозволяе зробити припущення. про 1нг1буючу д!ю эндогенного кальмодул1ну на актив н!сть структур«,яка пас1'~_,о транспорту^ кальц!й Дей ьплив .юже бути зумовлений Езаемод1ею качьыодул!ну з рг-димером Ql/Qo-51лку та/або взаемод!ею кальмодул1ну г канальной структурою. Для зизначення рол1 зг-субодиниць 3-б1лк!в в модуллцГ! транспорту сальШю в сарколем! н1ометр!ю ми. вивчили вплив комплексного иону ¡)тороалюм!нату на цей процес.

Эксперименти показали, що окремо1 мМ F", 10 мкМ А1?+ та ïx соме 1нац!я не чинять впливу на пасивний транспорт кальШю, неза-

- 11 -

лежно в1д присутност! в мембран! кальыодул!ну, в той час як 10 мМ F- 1нг!буе його в 3,5 рази в пор1внянн1 з контролем (таблица 5) для везикул з кальмод/л1ном.можливо, за рахунок присутност1 эндогенного А13+ в тканин! ( Anderson, 1991). -Фтороалымшат в в!дно-meHHi Al3+/F- - 1/1000 повн1стю iHriöye пасивний вих!д кальц1ю з везикул сарколеми м!ометр1ю,

Таблица 5.

ПОЧАТКОВА ШЩКГСТЬ ВИХОДУ КАЛЫНЮ 3 1НВЕРТ0ВАНИХ ВЕЗИКУЛ САРКОЛЕМИ МЮМЕТР1Ю, ЯК1 МЮТЯТЬ ТА НЕ ШСТЯТЬ КАЛЬШДУЛШ, П1Д ВГЩИВ0М ФТОРИД-ЙОНУ, ЙОНУ АЛЮМ1Н1Я ТА ФТ0Р0АЖМ1 НАТ.У..

[F~], мМ : [А13+3, мМ ! початкова швидкЮть виходу . нмоль Саг+/мг б!лку>сек

вевикули э ! везикули бев • кальмодул!ном : кальмодул1ну

0 0 0.69 i 0,02 0,90 ± 0,03

10,0 ■ 0 0.23 ± 0,09* 0

0 0.01 0.59 ± 0,02 0.92 ± 0,01

10,0 .0,01 0 0

*р<0,05

незалехно в!д присутност! в мембран! кальмодул1ну (таблиця б). 1нг!бування забезпечуеться блокуванням ЗТРазно! активност!

сй/йо-субодиниць G-CLikv плааматично! мембрани м!ометр!ю 1в-8с в!дсутност! субстрату для реакцП, оск1льки активац!я Q-61akv комплекскиы йоноы фтороалюм1нату ед1йснюстеся за рахунок йоге взаемодп г эндогенним QDP на d-субодиниц!, що !м!туе эфект QTF (Deterre,lS87J.

Таким чином, !нг!буючий вплив активованих фтороалюм!нато» 3-б1лк1в на пасиЕну проникнуть сарколемм м1ометр1ю для калыЦю, мабуть, не аалежить в!д присутност! в мембран1 кальмодул1ну,який мае зв'язуючу вг-димер здатн!сть.

Б!дпов1дно, 1ндив1дуальн1 ит-с-убодиниц! (3-б!лку не е регуляторнш

- 12 -

компонентом системи, яка пасивно траяспортуе калии й в м1ометрИ сама по собЬ

5. Вплив АОР-рибоэилювання коклюшним токсином плааматичних мембран м1ометр!ю на пасивний транспорт кальц1ю в них.

нмоль Са2+/мг С1лку-сек

. 0.96 -I -Г~ ,-Т __

0,58 "

0.32 *

о_об - -г

12 3 4

малюнок Б. Вплив цисте!н-специф1чного АОР-рибозилговання

коклюш..им токсином сарколеми м!ометр1ю на пасивний транспорт кальц!ю в них :

1 - контроль

2 - ДОСЛ1Д з 10 мкг/мл токсину

3 - досл!д з 10 мкг/мл токсину+0,5 ММ п-хлормеркур!й-

бенэоат

4 - контроль + 0,5 мМ п-хлормеркур1йбензоат

АОР-рибозилюваяня коклюшним токсином 6-б1лк1в, чугливих до нього, приводить до зм!ви активное?! аден!латциклази, фосфол1пази С, канальних структур. Рахують, що 8-61лки - субстрати коклюшного токсину втягуються в знихет-чя концентрадП внутр!шньокл!тиного кальц!» (б11шап,1987).

Одержан! результата св!дчать про те, но АБР-рибозилювання коклюшним токсином везикул сарколеми м!ометр1ю вед.' до суттевого 1нг1бування пасивних. поток!в кальц!» через мембрану (малюнок Б).

В результат! эксперимент!в з вар1ювання1.' концентрацИ коклюшного токсину та часу 1нкубац11 везикул з ним можна константу-вати.що п!д чао !нкубац!1 вевикул (2 мг/мл б!лку плааматичних

- 13 -

мембран) a 10 мкг/ид коюшшного токсину иа протяа! 1 годинн вхд-буваеться вовне ADP-рибозшшвання вс1х сайпв 0-С1лку - субстрату цього токсину в сарколем! мЮметрШ.

. В1домо,шд: а) кокшаний токсин ADP-рибозшяое т1дьки ав'яван! з одазматичнов мембраною а-б!лки (Jacobson,1990)j б) ковадентна модиф!кац1я В1д0уваеться на залишку цистерну (Bockaert,1987). Для доказу того, що ! в тканин! гладеньких м'яэ1в м!ометр!» ADP-рибо-зилювання коклюшним токсином носить цисте!н-специф1чний характер, ми вивчили д1ю О,Б ыМ п-хлормеркурШензоату (п-ХМБ) - який, як В1домо, реагуе а SH-групами 01лк!в - на процеси ADP-рибоаилювания коклюшним токсином та вплив самого п-ХМВ на пасивний транспорт кальц1ю (малюнок 6). Очевидно,що сам п-ХМБ не проявляв впливу на вих!д кальц!ю з везикул шшзматичних мембран м1ометр!в. При цьому ыодиф1кац!я п-ХКШ б!лку в!дбувает! :я на залишку цисте!ну,який звичайно ADP-рибозшаоеться коклюшним токсином, насл!дком . чого е невдагнЮгь та/або немолиивють коклюшного токсину приеднуватй ADP-рибозу в!д NAD+ до залишку цистерну «1/ао-б1лку. При цьому транспорт кадьц1ю в!дновлюеться до контрольного р1вня (малюнок Б).

Таким чином, сугтеве !нг1бування пасивного транспорту каль-ц!ю в сарколем! мЮметрШ п1д впливом ADP-рибозилюв.аня коклюшник токсином св1дчить про те, що один is механ!зм1в регуляцП систе-ми.яка пасивю транспортуе кадьц1й в м1ометрП ,зд!йсшоеться через G-61jok, чутливий до коклюшного токсину. .

6. Характеристика STPaaaol активност! сарколемм м}ометр1ю.

Необн1дн1сть ВТРазно'1 активност! а-субодиниц1 0-б!лку дикту-еться необх!дн1стю в його 1нактивац11.

Ми показали, что 1нг1бування коклюшним токсином GTPa3Ho'i активност! везикул сарколеми м1ометр!я> суттево (в 5,5 рази)в пор1в-нянн1 s немодиф1кованими ADP-рибозою везикулами (малюнок 6).

Оск1льки !нг!бування GTPaaHo'i активност! плазматичних мембран м!ометр1ю Б1дбуваеться за в1дношення концентрац1й коклютногс токсину та мембраншого б!лку 1/200, а саме таке 1х сп!вв1дно-шення викликае максимаяьне 1нг!бування пасивного транспорту каль-ц1ю в сарколем! м!ометр1ю, ми припускаемо, що саме 1нПбуванш БТРазно'! активност! (3-б!лку плавматичних мембран м1ометр1ю, шутливого до коклюшного токсину, зм!гаое активность калыцй-транспор-

- 14 -

туючо! системи в м!ометрП. неорган1чний фосфат, пмоль

2

I

малюнок 6.

Лктивн1сть ОТРаэи натив-ни.ч (1) та АОР-рибозильо-ваних коклшним токсином (2) плазматичних мембран мЮметр..) за 1н-кубацП 1х э 10 нМ Сг-32РЬ ЭТР.

О 2

5

10 хв

Розраховаяе зг!дно экспериментальных даних значения Кш бТРазно! реакцП для нативних плазматичних мембран скдадае 0,15 ± 0,02 м..!, а для АОР-рибозильованних ксклюшним токсином -22,51 ± 1,00 мкМ.. Не св1дчить про те, що аф1нн!сть АОР-рибозиль-ованного в-быку до йТР зростае.

Таким чином, цистеш-специф1чна ковалентна модиф!кац1я (3-б1лку - субстрату коклюшного токсину в м1ометрП - по-р!зному впливае на просторову орган!зац1ю БТР-зв'язуючого сайту та сайту,який приймае участь в г1дрол1з! СТР. Зв'язано це.можливо, з конформаШиними перебудовами в АОР-рибозильованному б1лку та його стабШзаШею в цьому стан! (\Лпз1ош,198б).

Зм!на концентрацП кальц1ю в цитозол! е важливою регулятор-ною компонентою,яка забезпечуе контроль скорочувально! активност! м1ометр1ю. Рецептор-опосередкована регуляц1я контрактильно! ак-

ми.

Ми показали, що 1 в в1дсутност1 агапста мае м1сце ОТР-за-¡ежна регулятя пасивного транспорту кальц1ю в сарколем! м!омет-

ЗАКЛЮЧЕННЯ

тивност1 гладеньких м'яз1в забезпечуеться ВТР- зв'язуючими 01лка-

р1ю.

Эксперимента,як! демонструють активадш пасивного транспорту кальШю (в присутностi GTP, ATP та v HiB магн!ю), св!дчать на ко-, ристь втягування и-субодиниц! 6-б!лку сарколеми м!ометр!ю ъ мол.масою 42 кДа (субстрат холерного токсину) в регуляцП актив-ноет! канально! структури, . а також про можливе втягування в цей прочее нуклеотиддифосфок!нази плазматичних мембран м!ометр1ю.

1нг1бування пасивких поток1в каяьЩю в сарколем! мЮметрШ досягаеться за використанням в якост1 модулятор!в активност!. б-б!лк!в фторид-йону, комплексного йона фтороагом1нат у та ADP-ри-бозшповання коклюшним токсином. Мабуть, 1нг1б1торна регуляц!я пасивних поток1в кальц1ю забезпечуеться «-субодиницею в-б!лка сарколеми м!ометр!ю ' з мол.масою 40 кДа (субстрат коклюшного токсину).

0держан1 экспериментальн! дан! дозволяють уявити соб! сл!ду-ючу модель активадП GTP-зв'язуючих сайт1в сарколеми ы!ометр!ю за в1дсутност; агон1ст1в (малинок ?).

В присутност! GTP (АТР) та Mg2+ эфективн!сгь впливу ai- GTP-цг - та «1-GDP- уг -форм G-бику - субстрату коклюшного токсину з молекулярного масою 40 кДа на транспортний процес одинакова i,мабуть, якраз ■! 1 визнача*? бааальний транспорт кальцш. Активация канально! структури эд !йснюеться; швидше всього, активованою «s-GTP-субодиницею G-SIjky - субстрату холерного токсину а молекулярного масою 42 кДа.

В присутност1 фтороадкшнату as-субодиниця дисоцюе з плаз-матичноГ мемврани в цитозоль. 1нг1бування пасивного. транспорту калыд!ю викликаеться «1-GDP-A1F4- Bv -субодиницею за рахунок бло-кування 'II GTPaaHO'i активност!. Моыиво, зб!льшення концентрацП в!льних er-димерних комллекс!в в плазматичн1й мембран! також проявляв модулючий эфект на транспорт кальц1ю.

За ADP-рибозилювання коклюшним токсином Gl/Go-Oiiiiy 1нг1бу-вання пасивного транспорту кальц!» забезпечуеться «!- GDP-ADP-ри-бозо- цv - модиф!кованим тримером, а as-GTP-субодиниця визначае незначиий транспорт кальц1ю,який все-таки вгдбувавться'за кова-лентно! модиф!кац!1 б-б!лку - субстрату коклюшного токсину.

виеиовки

1. Зкзогенний GDP, який вабеэпечуе гетеротримерний стан

16 -

VHht1J,VUl£b>L>U - 17 -

3-С1лк1а, не адшзкюе ыичву на пасивний транспорт каяыЦю в сарколемм мюметрш свин1,що сЫдчить про функцюнальну неактивнЮть 6СР-л1гандовэно! форми 0-б1лку, неэалежно в!д його типу. Экаоген-н! 61Р та АТР активують пасивний транспорт кальцИо.

2. Двохфазний характер вяливу koiub магн1ю на пасивний транспорт кальЩю св^дчить про наявнЮть двох тиШв мЮць зв'язу-нання цього кат Юну е мембранними структурами мюметрш.

3. Фторид-ион та комплексний йон фтороалкшнату,як! необо-ротно активують б-б1лки, хнгЮують пасивний транспорт кальЩю в сарколем! мЮметр1ю.

4. Or-димерний комплекс 6-б1лк1в,який утворюеться за '1х ак-тивацП та вв'язуе кальмодул1н плазматичних мембран, неактивний в регуляторному план! по в!дноиенню до структури м1ометр1ю,яка па-сивно транспортуе кальщй .

5. Ковалентна модиф!кац1я ADP-рибозилюванням за допомогою коклюшного токсину Sl/Go-6UKiB сарколеми м1ометр1ю, чутливих до нього, веде до 1нпбування пасивного транспорту калылю.

6. вТРазна активн!сть ADP-рибозильованих коклюшним токсином плазматичних мембран м1ометр1ю суттево 1нПбуеться в поргвнянн! а нативними мембранами.

7. На плазматичн1й мембран! м1ометр!ю виявлено два типи м!сщ эв'язування QTP, як1, мабуть, просторов© розд1лен! в сайтами зв'я зування магн1ю.

8. 1дентиф1кован1 субстрати бактергальних токстйв в плазма-тичн!й мембран! мЮметрш.як! в1дпов1дають а-субодинищм йз-б1лку (субстрат холерного токсину, молекулярна маса'42 кДа) та Gi/Go-б1лку (субстрат коклюшного токсину, молекулярна маса 40 кДа).

ВЫВОДЫ

1. Экзогенный QDP, обеспечивающий гетеротримерное состояние 6-белков, не оказывает влияния на пассивный транспорт кальция в сарколемме мометрия свиньи, что свидетельствует- о функциональной неакгивности GDP-лигандированной форме G-белка, независимо от его типа. Экзогенные GTP и АТР активируют пассивный транспорт кальция.

2. Двухфазный характер влияния ионов магния на пассивный транспорт кальция свидетельствует о наличии двух типов мест связывания этого катиона с мембранными структурами миометрия.

- 18 -

3. Фторид-ион и комплексный ион фторсалюмината, необратимо активирующие G-белки, ингибируют . пассивный транспорт кальция в сарколемме миометрия.

4. от-димеркый комплекс G-белков, образующийся при их активации и связывающий кальмодулин плазматических мембран, неактивен в регуляторном плане по отношению к пассивно транспортирующей кальций структуре миометрия.

5. Ковалентная модификация ADP-рибоэ, лированием с помощью коклюшного токсина 61/Go-белков сарколеммы миометрия, чувствительных. к нему, ведет к ингибированию пассивного транспорта кальция.

6. бТРазная активность ADP-рибогилированных коклюшным токсином плазматических мембран миометрия существенно ингибируется по сравнению с нативными мембранами.

7. На плазматической мембране миометрия обнаружено два типа мест связывания GTP, которые, по-видимому, пространственно разделены с сайтами связывания магния.

8. Идентифицированы субстраты бактериальных токсинов в плазматической мембране миометрия, которые соответствуют а-субъедини-цам Gs-белка (субстрат холерного токсина, молекулярная масса 42 кЯа) и Gl/Go-белка (субстрат коклюшного токсина, молекулярная масса 40 кДа).

ОСНОВНI МАТЕР 1АЛИ ДИСЕРГАДП ОПУБЛ!КОВАНI В СЛЩЮЧИХ РОБОТАХ :

1. Кропотова С. А., Коц А.Я., СенькоЛ.Н., Курский М.Д. Субстраты ADP-рибозилирования бактериальными токсинами в плазматической мембране миометрия свиньй/УДокл. АН Украины.-1992.-N11.-С.151-153.

2. Курский М.Д., Кропотова С.А., Прищепа Л.А. Ингибирующее действие 'ADP-рибозилирования коклюшным токсином на пассивный транспорт кальция в плазматич'-жой мембране миометрия свиньи//'Би-охимия.-1992.-57.-N11. -С.1751-1755.

3. Кропотова С.А., Курский М.Д. Влияние гуаниновых нуклеоти-доб и нонов магния на пасивный транспорт кальция t сарколемме ми-омётркя/'/Докл. АН Украины.-1993. -Л1. -С.84-88.

4. Кропотова С.А., Курский М.Д. Влияние комплексного иона фторозлюмината на пассивный транспорт кальция в сарколемме миометрия свиньи//Укр.Биохим.журн.-1993.-65.-N1.-C.116-U9.

- 19 -

6. Kropotova S.A., Kursky M.D. The regulation of calcium passive transport by в proteins In miometrium plasma membranes//Symp. Structure & function of regulatory polypeptides. Abstracts.-Moscow.-1092.-V.l.-p.37.

6. Курський M.Д., Кропогова С.А. Гетерогенн1сть сайт1в зв"язування субстрату б-б!лками плааматично! мембрани м!ометр!ю cbhhI/VYI Укр. В!ох!мл з"!ад. Тези допов!дей.-Ки!в.- Вид.УС-ГА.-1992.-4.1. -С.84.

Поди. к iw4.î ï.« 9i

формат 60x 84Vie.

Бумага тип. № 3 ■ Способ печати офсетный. Услови. ne«, л. 4(6-S'cmîh. «p.-ort. <.ЬЧ . Уч.-изд. л. -f, С . Тираж 400 • За*. Ж J2 ■ Вгсплгтно.__

Фирна «ВШ10Л»

232151, г. Ким, ул. Волыисмя, 60.