Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Транспорт Са2+ в суспензии миоцитов и во фракции везикул сарколеммы миометрия

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Транспорт Са2+ в суспензии миоцитов и во фракции везикул сарколеммы миометрия"

ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им.А.Б.ПАЛЛАДИНА

На правах рукоНмсй

ШИЛОВА Оковна Пот ровна

ТРАНСПОРТ Саг+ В СУСПЕНЗИИ МИОЦИТОВ И ВО ФРАКЦИЙ ВЕЗИКУЛ САРК0ЛИ4МЫ МЙОМЕТРЙЯ

03.СО»04 ~ биохимий

V

АВТОРВФЕРАГ ДНЬсертации на Ьоиокание учёной с+вгшни кандидата биьльмчесмл науй

Иней - 1992

Работа выполнена в отделе биохимической кинетики Института биокйиии им.А.В.Палладина АН Украины, г.Киев

Научнмй руководитель Официальные оппоненты -

доктор биологических наук КОСТЕРйН С,А,

доктор биологических наук, старший научный сотрудник МАЛЫШЕВА М«К.

кандидат биологических тук, старший научный сотрудник ТЕРЛЕЦКАЯ Я,Т.

Ведущее учреждение - Киевский государственный университет

иМ,Т»Г,ШвйчеЯКо

Завита состоится " 23 " апреля 5 2 г, в 1&-00 на заседании специализированного совета К 016,07.01 в Инотйтуте биохимии им.А.В.Падладина АН Украины (гзгбСЯ.ГСП.пКивзьЭО.ул.Леонтовича.Э),

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии им.А.В.Йалладина АН Украины.

Автореферат разослан "И" марта 1992 г.

Учёный секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

О.В.КИРСЕНКО

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Согласно современным предстаэлегаям иенам Са принадлежат исключительно важная роль в обеспечении контроля сократительной активности гладких мышц, в че стквсти, миометрия. В связи с атим принципиальное значение приобретает изучение путей и механизмов регулники концентрации ионизированного калыяя б гладкокьигеч-ных клетках (ГМК).

В клетках гладких мынц и других возбудимых тканей концентрации ионизированного Са не порядка ниже, чем по шеклеточней среде, в связи с чем для клеточной мембраны характерен большой электрохимический кальциевый градиент, направленный внутрь киоцитов. Очевидно, что с целью поддержания низкой концентрации свободного Са в цитозоле в течение длительного времени необходима компенсация входящего через плазматическую мембрану (ИМ) кальциевого тока выходящим потоком этого катиона, т.к. Са-аКкукулирувщая способность внутриклеточных орга-нелл ограничена.

Плазматической меиброне принадлежит важная роль в поддержании кальциевого гомеостаэа миоцитов матки» Этой мембране присуща базаль-нея кальциевая проницаемость, проявляющаяся в наличии транссархолем-мального медленного диффузионного входа в шбциты, а такме проницаемость, обусловленная функционированием специфических белковых структур - Са^+-селективных каналов, регулируемых мембранным потенциалом и физиологически активными веществами. Кроме того в отой субклеточной структуре локализованы системы энергозависимого транспорта Са^+, обеспечивание его перенос из миоцитов в межклеточное пространство - Мд^+,АТР-зависимый кальциевый насос и Ыа+-Са^+~обменник, использующий энерггш электрохимического градиента Ыа+ для антипортной транслокации Саг+(Р.К.ОгоУег') С.У.К^аи, 1987; иШЪревси.Р.Зд па!;1985).

И если сегодня для миометрия имеются определённые данные о ха-^ рактеристиках и роли кальциевых каналов, то представления о свойствах других Са2ч"-транспортирукш!их систем, их функциональной роли в поддержании внутриклеточной концентрации ионизированного Са, чувствительности к дейстетю физиологически активных и фармакологических веществ - регуляторов сократительной активности матки - далеки от сколь-нибудь законченных. •

В опытах, проведенных на везикулах сарколеммы миометрия, было показано, что система 1^а+-Са^+-обмена Г!М ГМК имеет низкое сродство к Са^+ (^.=30-50 мкМ), на основании чего било предположено, что она

не способна регулировать концентрации; субстрата переноса при физиологических значениях последней. В то же время система Мд^+,АГР-зави-симого транспорта сарколеммы ГМ обладает высоким сродством к субстрату переноса (1^=0,3-0,6 мкМ) (С.А.Костерин и др. ,1965,1988), Поэтому считают, что Именно оно является фактором прецизионной регуляции физиологически значимой концентрации Са в ГИК. Однако парциальный вклад каждой ив систем в регуляцию концентрации ионизированного Са в миоцитах матки неизвестен.

Установлено, чтЬ неряду с быстрым фазным сокращением, контролируемым входом Са в ГМК по потвициалзашсимым кальциевым каналам, для гладких мышц матки характерно также медленное тоническое сокращение. Между тем, механизм кальциевого контроля миогенного тонуса, тонического сокращения не исследован. Логично предполагать, что свой вклад и реализации такого мехенизма могут вносить медленный диффузионный Сазальный вход Са в ГМК и система М^+,АТР-зависимого выброса Са^+ из Клеток миометрия, для которой свойственна небыстрая кинетика транссарколеммального переноса Необходимо подчеркнуть, что свойства медленного пассивного переноса Са^+ через плазматическую мембрану гладкомышечных клеток (действие ингибиторов, потении-алзоиюимость, чувствительность к влиянию физиологически активных и фармакологических веществ - регуляторов сокращения-расслабления ГМ) не изучены. Мело что известно и о фармакологической регуляции активности кальциевого насоса плазматической мембраны. Имеющиеся данные о том, что окситоцин, стимулирующий сокращение матки в родах (М.ЯРе-xandrwa, M.SoEof^ ,1960), может ntступать в роли эффектора, непосредственно влияющего на систему энергозависимого транспорта Са^.+ в матке (L.M.PopeSCu, 1935; fl.Enycdt ¡¿Ji aL, 1989), неполный допускает различное толкование.

Системы, обеспечивающие вход в ГМК и выброс катиона в межклеточное пространство исследуются в настоящее время главным образом на везикулированных препаратах ПМ (С. Van breemtrl е^а£Д9вб), а также на миоцитах (в суспензии и в культуpe)(t>.Wi-Ki.omE, F.Fa^, 1966). Безусловно, особый интерес представляют результаты экспериментов, проведённых на изолированных клеткех гладких иышц - экспериментальной модели, в наибольшей степени приближённой к физиологическим условиям Smith gto! ISB5). По-видимому, именно комплексное изучение Са -транспортирующих систем ГК как нь фракциях субклеточных структур, так и гегюсредствон-ко в миоцитах, позволит сделать полные и окончательные выгоды о молекулярных механизм«* ¡»боты указанных систем.

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы было исследование пассивного и эн'ергозависимогс транспорта Са^+ в суспензии клеток и во фракции везикул сарколеммы миометрия, изучение влияния на этот транспорт некоторых физиологически активных (окситоцин) и фармакологических веществ (сигетин,хинин) - регуляторов сократительной активности мотки.

При атом решались следующие задачи?

1) с использованием Са^+-чувствитальных флуоресцентных зондов О.ИЭИ-2 и определить концентрацию Са в миоцитах матки, исследовать динамические закономерности кальциевого обмена в них, идентифицировать роль натриевого градиента в регуляции концентрации Са2+ в миоцитах!

2) изучить свойства пассивного транспорта Са + во фракции везикуЛ сарколеммы миометрия (чувствительность к органическим и Неорганическим блокаторам кальциевой проницаемости, Мембранному потенциалу);

3) исследовать влияние фармакологических веаесгв1 используемых в медицинской практике в качестве стимуляторов сокращения матки, на Мд2+,АТР-зависимый транспорт Са^+ во фраКцйи везиКуЛ сарколеммы миометрия.

Научная новизна работы. В экспериментах, проведенных на суспензии изолированных мцоцитов и фракции везикул сарколеммы мИометрия с использованием Са -чувствительных, потенииалчувствительных и дрН-чувствитвльных флуоресцентных зондов, а также изотопного метода показано, что для ГШ клеток миометрия характерны тр! компонента пассивной кальциевой проницаемости: базалЬНЫЙ диффузионный (ненасыщаемый по субстрату переноса), потении&лчувст витальный (насыщаемый по субстрату переноса) и арН-зйвисимый, Впервые показано, что в нормальных физиологических условиях Ыа+-Са^+-обменник ПМ не вносит вклад в регуляцию концентрации свободного Са2+ в клетках миометрия. Показано, что стимуляторы сократительной активности матки пептидный гормон окситоцин (Ю М) И сигетин (5М) ингибирова-ли Мд^+,АТР-зависимый транспорт Са в сарколемме' миометрия женщин и животных, не влияя при этом на пассивную проницаемость ПМ.

Теоретическое и Практическое значение работы. 3 теоретическом отношении проведенные исследования расширяют имевшиеся представления о роли систем пассивного и энергозависимого транспорта Са^+, локализованных в сарколемме, в регуляции его концентрации в клетках миометрия, сб' особенностях кальциевого контроля тонического сокращения гладкой мышц« матки. В практическом отношении полученные результаты

обосновывают использование в практической медицине лекарственных препаратов (окситовдн, сигетин), корректируютх сократительную активность ГМК матки при патологических нарушениях её контрактильного ответа.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуэдены на Международном симпозиуме "Проблемы современной биохимии и биотех-нологии"(Рига, 1965), на Международном симпозиуме "ёиэиология и фармакология гладких мышц" (Варна,1965; Варна,1988), 5-й и 6-й Всесоюзных конференциях по биохимии мышц (Телави,19Э5; Тбилиси, 1969), 5-м Всесоюзном биохимическом съезде (Киев,1986), 5-м Украинском биохимическом съезде (Ивано-Франковск,1987), Всесоюзной конференции "Ьио-химия-медицине" (Ленинград, 1968), научных конференциях и конкурсе молодых исследователей Института биохимии им.А.В.Палладина АН Украины (Киев,1967; 1988),

Структура и объём работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (3 главы), результатов экспериментальных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (34 отечественных и 193 зарубежных источников). Работа изложена на 150 страницах машинописного текста и иллюстрирована 2 таблицами и 34 рюунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Суспензию изолированных ГМК получали из миометрия небеременных крольчих или беременных (18-19 дней) крыс в соответствии с модифицированным методом (T.flmedle et оЯ.., 1986) путём обработки коллагена-зой с последующим механическим разделением ткани. Интактность клеток контролировали с помощью витального красителя трипанового синего и флуоресцентного интеркалирующего красителя атидиумбромида, используя проточный цитоспектрофлуориметр "EPISC" фирмы "ConPtronics "(Франция), ¿[изнеопособность клеток определяли по их дыхательной активности с • помощью полярографа LP-60 (ЧССР).

Для измерения концентрации ионизированного кальшя в суспензии ГМК использовали Са^+-чувствительные флуоресцентные зонды QUW-2 (TslenR.etа£.,1982.) и FURA-a (G.&nnkiewicz et аВ., 1985). При этом применяли их эфирные (тетраацетоксиметильные) производные (QUIN2/AM 'и FURft-2/ЯМ ). Нагрузку клеток зондами осуществляли посредством добавления к клеточной суспензии незаряженного эфира QWIW-2. или .FURft--2 и последующего термостатирования суспензии в течение 45-90

минут при температуре 37°С. Процесс превращения эфирного производного зонда в кислотную форму под действием внутриклеточных цитоплазма-тических эстераз контролировали по омещению максимума флуореоценции QUIW -2 от ^30 нм (эфир) до ^90 нм (овободная кислота) или максимума возбуждения FWRft -2 от 370 нм (эф!р) до 3^0 нм (свободная кислота) (рис.1.). Измерения интенсивности флуоресценции проводили на спектрофлуориметре "HITACHI"650-103 (Япония). Внутриклеточную концентрацию ионизированного Са рассчитывали по методу R.TSlcn et cxP., 1382..

Фракции ПМ выделяли из миометрия неотельных коров по модифицированному методу (A.M.Kidwcil ct aP.,1971) о помощью дифференциального Центрифугирования. Отдельные зкопэрименты проводились на ткани миометрия нанщин, получаемой в клинике при операциях планового кесарева сечения. Содержание белка определяли по методу O.H.LovWy eta?.,I95I . Чистоту полученных фракций контролировали злектронномикроскопически, по активности маркерных ферментов (5'-нуклеотидаза, Кд^-АТРаза. сук-цинатдегидрогеназа) и посредством функциональных тестов (№>+(Са -обмен и М^+.АТР-зависимый транспорт Са2+)(М,Д.Курский и др., 1981).

ftic.I. Флуоресцентный контроль нагрузки изолированных клеток миометрия Са^+-чувсгвительными флуоресцентными зондами QUIN-2 (А) FURA-S (Б). Цифра у каждой спектральной кривой соответствует времени нагрузки, для формирования и регистрации электрического трансмембраннсго потенциала на везикулах сарколеммы миометрия использовали систему "К+-валиномицин" и потенциалчувствительный флуоресцентный зонд dlS

С^-СЭ), принадлежащий к классу иианиновых красителей С Л 580 нм,

ЛфЛу= 660 нм) (Ю. Ф.Владимиров, Г.З.Добрецов, 1980). Значение равновесного калиевого потенциала рассчитывали по формуле Нернста (A.S.Wид gcw, 1979), Интенсивдость флуоресценции зонда измеряли на спектро-ф>луориметре "HITACHI" 650-109 (Япония) при комнатной температуре.

Влияние мембранного потенциала на кинетику пассивного транспорта Са^+ в везикулированных фрагментах сарколеммы миометрия изучали в модельных окспериментах по выходу предварительно нагруженного ^Са21 (0,5-1 мМ) из инвертированных везикул, уравновешенных оо средой, содержащей KCI (160 мМ), в изотоническую среду разведения, содержащую ЭГТА (I мМ), валиномицин (5*1СГУМ), К* и компенсирующие катионы (Na+, холин1", IiL+) в соответствующих концентрациях. Выход катиона останавливали через равные промежутки времени добавлением охлаждённого изотонического раствора, содержащего LaCIj(I мМ) о последующим быстрым фильтрованием проб под вакуумом через мембранные фильтры "Synpor При исследовании влияния фармакологических веществ - стимуляторов сокращения матки на пассивный транспорт Са препараты (10~^- Ю-2 М) добавляли в изотоническую среду разведения.

При изучении влияния окситоцина на пассивный и энергозависимый транспорт Са^+ в сарколемме миометрия пептидный гормон вносили непосредственно в среду гомогенизации мышечного препарата (на стадии образования замкнутых мембранных пузырьков).

Для проведения экспериментов по влиянии протонного градиента на пассивный транспорт Са^+ в везикулах сарколеммы, формировали градиент концентрации Н+ методом "рН-скачка'Чк.в.ЭсНыmaker Лае.,1986). Суспензию мембран, уравновешенных оо оредой, содержащей 160 мМ KCI и трис-малеат/ КОН буфер (10 мЮ о одним значением рН разводили (1:50) той же оредой с другим значением рН. Протонный градиент оценивали по флуоресценции 3,б-бис(диметилашно)-акридаш (акридинового оранжевого) при 530 нм, возбуждаемой облучением образца светом с длиной волны 490 нм. Измерение флуоресценции проводили на спектрофлуориметре MPF Ьк 4ирмы "HITACHI" (Япония).

При изучении Мд2+,АТР~зависимого транспорта Са2+ в везикулах сарколеммы общее накопление катиона фракцией сарколеммы изучали в среде, содержащей 25 мМ HEPES-трис (рН=7.0), 160 мМ KCI, 5 мМ М$С12, 3 мМ ATP, O.OImM и исследуемый препарат везикул. Количество

связанного ^Са2+ определяли в той же среде, но без АТР. Мд^+,АТР-за-висимое накопление Са2+ рассчитывали по разности между общим накоплением и величиной связанного катиона. Реакцию начинали внесением белка

(50-100 мкг), а останавливали добавлением к ореде инкубации ледяной изотонической промывочной среди, содержащей LaCIj (0,5-1 мМ) о последующим быстрым фильтрованием через мембранные фильтры "Synpor ".

В случае изучения влияния окоитоцина и фармакологических ве-• ществ - стимуляторов сокращения матки (хинин,сигетин) на активное накопление Са везикулами сарколеммы миометрия инкубационная среда содержала 30 мМ Ыа+-фосфатный буфер (рН=7,0) и все указанные компоненты. Реакцию начинали, внооя в среду инкубации Са + . Фармакологические вещества добавляли непосредственно в ату среду.

Изучение влияния сигетина при различных концентрациях ионизированного Са на процесс его аккумуляции проводили, как описано ранее (С.А.Коотерин и др., 1955).

i3o bcqx вышеописанных экспериментах для определения количества накопленной везикулами радиоактивной метки высушенные фильтры "5уп-рог " (фирма "СИтароГ'.ЧССР, размер пор 0,3-0,4 мкм) помешали во флаконы оооцинтилляционНой етдкостьга jiC-I и измеряли их радиоактивность на жидкостном оцинтилляционном спектрометре 9Ь -№00 фирмы "3riterteoh(Utyi<£ "(Франция) и фирмы "Веоктст'ЧСША).

При проведении статистического анализа полученных результатов руководствовались общепризнанными расчетными методами,

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3 качестве модели для изучения роли пассивного и онергозашси-мого переноса Са^+ в обеспечении внутриклеточного гомеосгаза катиона нами была выбрана суспензия изолированных ГМК, кальциевый обмен в которой можно исследовать о помощью Са^-чувствительных флуоресцентных зондов (T.Rtnk et aß.,1985).

Изолированные ГМК миометрия крольчих и крыс, полученные с помощью коллагеназной обработки и использованные в экспериментах непосредственно после выделения, были морфологически интактны, злектровоз-будимы, характеризовались активным дыханием и способностью гомеоста-тически регулировать концентрацию кальция в миоплазме на уровне её физиологических значений.

Для измерения концентрации ионизированного Са в невозбуздёнлых ГМК нами использовались Ca -чувствительные флуоресцентные зонды QUIN-2 и FURR-2. Рассчитанная величина концентрации свободного катиона в цитоплазме клеток мисметрия (0,1-0,3 мкМ) является физиологически значимой и соответствует таковой для миоцитов матки человека (л.В.

Rtchardeon et aP., 1987), ГЩ коронарной артерии свиньи (K.Sumiffl°to et а£, 1966), желудка жабы (D.fl.vcLeeiams, RS.Fay. , 1986).

Известно, что в условиях калиевой деполяризации (изотоническая замена во внеклеточной среде На* на К+) наблюдается увеличение концентрации ионизированного Са в миоцитах за счёт входа катиона в мио-плаэму из межклеточной среды (M.B.BlcViai'dEOn et р2., 1987).

В наших окопериментах, моделирующих сдвиг мембранного потенциала посредством калиевой деполяризации при изотонической замене Na+ на К+, также наблюдалооь быстрое возгорание флуоресценции QUIM-2,4to свидетельствует о повышении концентрации в клетках миомет ри я в условиях электрической стимуляции. В присутствии блокатора потенциал-зависимых кальциевых каналов нитрендипина этот эффект снижался (рис,2}

Ы\*п

'250 •£00 -180 -100 ■60 .Ô

Рис.2. Влияние изотонической замены Na+ на К+ в растворе Хенкса на концентрацию Са^+ в клетках миометрия крольчих. I и 2 - в присутствии и в оТсутотвие нитрендипина (2,5 мкМ) соответственно. Использовали Са^-чувотвительный флуоресцентный зонд OU1N-2.

Введение в раствор Хенкса,содержащий клеточную суспензию, хела-тора Са^+ ЭГТА приводило к снижению концентрации ионизированного Са в ГМК почти на порядок (от 130 до 16 нМ)(рис,ЗА), Следовательно, концентрация Са^+ в миоцитах матки зависит от концентрации Са + в омывающей среде. .

При дискретном повышении концентрации Са^+ во внеклеточной среде мы наблюдали дозозависимое повышение концентрации ионизированного катиона в клетке. В то же время, титрование суспензии ГМК кальцием на фоне присутствия в среде инкубации нитрендипина индуцировало повышение концентрации Са^+ гораздо в меньшей степени, чем в отсутствии блокатора кальциевых каналов (pic.3E).

Ксе(Шм1Ч)

I

8

MMJ ^^"«"«mMtWM 1

[Саа+]цнМ Ш 1мМ Ы СаСе&

ЧмМ ЭГТА

ППУИМММ

ЛГУ«««*»» 1-1

ь

4 ь

4

1 О 0.05 1.08 ш В,03 [Са ]е,мМ

Рис.3. Влияние внеклеточного Са на концентраций отого катиона в изолированных клетках миометрия крольчих» I и" 2 - в присутствии и в отсутствие нитрендипина (2,5 мкМ) ооответотвенно. Использовали Са24-чувствительный флуоресцентный зонд ОКШ-2,

Эти результаты подтверждают, имеющуюся в Литературе точку зрения о том, что в ПМ ГМК имеется популяция олектроуправляемых кальциевых каналов, открытых и при отоутстам деполяризувщега воздействия (об атом свидетельствует нитрендипинчувотвитвльный компонент входа Са2+)(рис.З), Наличие же нечувствительного я блокатору компонента кальциевой проницаемости, завйоящей от присутствия Са в омывающей среде (рис.Э), свидетельствует о существовании а ПН ГМ баэальной кальциевой проницаемости, не овязанной о функционированием олектроуправляемых кальциевых каналов,

Таким образом, в ПМ клеток миометрия нами идентифицированы два компонента кальциевой проницаемости; потенциалчуветвительный (рис.2) и базальный (рис.3,кривая1). К выводу о существовании этих двух компонент входа Са2+ в миоплазму приводят также результаты экспериментов, проведённых на фракции везикул сарколеммы миометрйя.

Энергонезависимый выход Са2+ из везикул сарколеммы, замкнутых цитоплазматической стороной наружу, в изотоническую ореду, содержащую ЗГТА (рис.^А) в определённом Приближении моделирует процесс пассивного поступления катиона в ГМК. Мы нашли, что" кривая зашсимости начальной скорости выхода Са^+ от концентрации ионизированного катно-

на в везикулах не ртрвмитоя к насыщению по субстрату переноса (рис.^Б),' Следовательно, в основе транооарколеимального выхода Са + из везикул . лежит его диффуеив ив внутривезикулярного пространства в среду разведения, на требующая для о?оей реализации переносчика и тождественная, по-видимому, наблюдаемому 'ф у'ыо медленному бааальному входу этого Катиона в нввовбуждённые ГМК (гио.ЗБ).______ _____________

Рнс.к, Пассивное ^«зоболщвние ив в.98икул сарколеммы гладкой

мышцы матки^коров (А) и концентрационная зависимость его начальной скорое»«'(£)< Везикулы уравновешивались с изотопом пассивно -в Чреда, содержащей 1мМ Са^+, 160 мМ КС1, 20 мМ НЕРЕЗ /трио "буфер (рН«7,0), Среда; разведения (в 20 раз) содержала'Ь«М;-8РТА( 160 мМ КС1, 10 мМ НЕРЕЭ/трис буфер (рН=7,0).

•8 ^Кб«9{Ямейтах Ь иопольвованием потенциалчувствительного оресшшгногоаонда оЦ5-С3~(5) (АвозСс 560 нм,|ЛфЛу= 660 нм) нами было тЦйкаайно, .что на мембранных везикулах сарколеммы'миометрия в системе мЙ+чваяшномицин" формируется мембранный потенциал со знаком минус внутри *вбзикул (рис»5А)»"-Регистрируемый потенциал-был-стабилен во времени, ■ не зависел 'от^химической природы диссипирувщвго'-катиона и соответствовал величин»'калиевого равновесного потенциала,-рассчитанного теоретически по-уравнению Нернста (А.ЗЛК/аддопеу ,1979).

'Было обнаружено, что изменение мембранного потенциала от -61 мВ дс 0-кВ 'приводит к активации пассивного выхода Са2+ из мембранных пу-зыэьков' (в качестве' Противокатиона в среде разведения использовали хо.тин+) (рис.5Б)»~Величина этой активации в различных экспериментах составляла 15-20$,'»что соответствует величине ингибирования выхода

Са + при введении в среду разведения двухвалентных катионов или органического блокатора 0-600.

Ми наили, что зашсимооть скорости потенциалчувотвительного выхода Са2+ из везикул сарколеммы от концентрами катиона й них не подчиняется кинетическим закономерностям простого диффузионного процесса а описывается кривей, характеризующейся Насыщением По субстрату переноса (К^ 0,5 мМ). Эти данные свидетельствуют о том, что нами идентифицирован потенциалзавиоимый компонент пассивного выхода Са2+ из везикул (рис.5), осуществляемый, По-шдимому, по КййаЛЬНКм структурам, и тождественный электроуправляейому входу катиона в миоциты (рис,2).

Рис.5. Идентификация мембранного потенциала во фракции везикул сарколеммы миометрия коров с помощью с118—Сд—С5) (А) и его влияние на пассивный выход из этих везикул (Б). I -лц7 =-б1мВ (160 мМ КС11./16 мМ КС1а+ мМ СЬС1е)! 2 " 0 мВ (160 мМ КС11/160 мМ НС10): 3 - потенциалчувствитвльНЫй компонент пассивного выхода Са , раоочитанный по разнице между кривыми I и 2. Концентрация валиноницина 5»«10~еЙ»

Таким образом, обобщая приведенные выше данные! полученные в экспериментах, проведённых на изолированных миоцитах матки и на фракции везикул сарколеммы миометрия о использованием флуоресцентных зондов 0ИШ-2 и (¿й-С3-(5) и ^Са24, мы оделали вывод о существовании в ПМ клеток миометрия двух компонентов пассивной кальциевой Проницаемости: базального диффузионного (ненасыщаемого по субЬтрату Переноса и нечувствительного к нитрендипину) и потенциалзависимого (насыщаемого по субстрату переноса и подавляемого Нитрвндипином).

С целыз расширения наших представлений о роли Н+ в регуляции пассивного транспорта Са^4" через ПМ ГМК, мы изучили влияние протон-

кого градиента на обмен этого катиона во фракции везикул сарколеммы миометрия коров, Применяя метод ''рН-скачка" мы показали, что характеристическое время дароипации протонНого градиента, направленного из внутривезикулярного Пространства во внешнюю среду, составляет 4-5 мин (начальное значение траномембраннОГо лрН= £), В дальнейших экспериментах было исследовано влияние градиента протонов на пассивный транспорт Са?+ во фракции аеЗивуЛ сарколемму ГМ матки. Было найдено, что протонный градиент, направленный И8 внутривезикулярного пространства наружу, стимулировал пассивное поступление Св + в везикулы. В то же время градиент, напраблецНЫй # противоположном направлении, подавлял вход Са^+ в мембранный пузырив

Таким образом! результату Маши» вкоперииентов свидетельствуют о том, что Пассивный ЦйрйНЬЬ Са во фракции везикул сарколеммы регулируется также градиейтоМ рН<

В связи с этим,возникнет вопрос о механизмах контроля концентрации ионизированного Са в ГМК и определении роли энергозависимых Са транспортирувцях сив$Вм< обйопечивающих компенсацию базального диффузионного, &рН-»^ше«Ного И вызванного деполяризацией ПМ входящего в миоциты потока в*огв шчюнь,

Как уже укаЗУйишаЬ| £ настоящее время рассматриваются две основные системы, ЛокалиаЬваШШ в сарколемме ГМ: Ыа+-Са2+-обменник и кальциевый Насоб (Й^ри^еикбег4 ^ пЧч 1965; д.Зтик еи?.Д987).

А" А'ВШ* 6

15 £0 НИН

чо ЙО ей

СЕЙ

,!"о 6. Ид2+,АТР-зависиМУЙ (А) и 1Ма+~зависимый (Б) транспорт ^5Са2+

во фракции £езикул сарколеммы миометрия коров. I - контроль;

ДУ—61 мВ (160 йМ КС1{./16 мН КС1е+144 мМ СИ«е); 2 ~лу=~61 мВ

(160 мМ КСЬ/16 мк КС10+1<й мМ МаС1„); 3 - Ыа-зависимый ком-2+ .

понент выхода Са . [А-23187] = 5*10~б

Из данных, представленных на рио.бА, видно, что фракция сарколеммы миометрия, используемая нами в экспериментах, обладала способностью активно накапливать из среды, содержащей АТР и Добавление в среду инкубации ионофора A-23I87 на 15-й минуте приводило к быстрому и полному освобождению предварительно аккумулированного катиона. Следоватесьно, Накопление Са + внутрь везикул осуществлялось против концентрационного градиента, Многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что трансм^мбранный перенос катиона обеспечивается функционированием Са »Mg +-АТРаЗЫ ПМ, активируемой кальмодулином (UPopeeeu et ав., 1985} A.EnyedL et а(?.,1989).

На рис.бБ представлен график, в соответствии о которым при одной и той же величине мембранного потенциала (-61 мВ) замена с среде разведения холина+ на Nа+ стимулирует Пассивное освобождение Са^+. Кривая 3 характеризует собственно Ыа+-зависимый компонент выхода Са^+ из везикул, обусловленный работой Ыа+-Са2+-обменного механизма. Между тем, вклад системы Ыа+-заэ1СИмого транспорта Са^+ в регуляцию концентрации этого катиона в ГМК матки, роль натриевого градиента в обеспечении кальциевого гомеоотаза в клетках ГМ не выяснена.

Поэтому с использованием Са^+-чувсТвителЬноГо зонда FURA-2 мы исследовали влияние натриевого градиента на внутриклеточную концентрацию Са^+ в клетках миометрия. Нами было найдено» что преинкубация клеточной суспензии с ингибитором Ыа*,Н+-АТРазы оубаином или же обработка миоцитов Ыа+-Н+-обменником моненсином, также как изотоническая замена Na+ в среде инкубации на холи«4 не изменяли [Са^4"] в ГМК.

В то же время в условиях инверсии натриевого градиента, достигаемой в результате обогащения клеток Na+ При преинкубации их с оубаином или моненсином в Ыа^-содвржащей среде о последующей заменой этой среды на безнатриевую, наблюдалось эначитёльйое возрастание величины концентрации Са в ГМК (рис.7),

Зти данные прямо указывает на то, что в Нормальных физиологических условиях натртевый градиент, направленный вНутрь миоцитов, не вносит существенный вклад в регуляции концентраций ионизированного Са в клетках миометрия. По-юдимому, только при поВыйении концентрации Са + до Ю~б-10-5М Ыа+~Са2+-обменный механизм будет включаться в регуляцию концентрации Са2+ в ГМК. Однако в услошях инверсии Натриевого градиента выход Ыа+ из ГМК стимулирует возрастание [Са^+] в миоцитах (рис.7). Следовательно, логично предполагать, что именно кальциевый насос, но не Na^-Ca +-ойменник ПМ ГМК, является фактором осуществлявшим энергоэависимый выброс Са2* из клеток миометрия в нормальных физиологических условиях.

prfVH

tsoúr

400-

ÍQO

SCO'

о

л-

i 8 а.Ч

rtio.7. Влияние факторов, цЮдифицирующих Натриевый градиент,на концентрацию Саг+ в ГМК'натки крыс (оИределяли с помощью FURA-2). I - контроЛИ 2 - йаотоничеокая замена Ыа+ на холин+ в среде инкубации! 3 - ЬреМйкубация С оубаином (I мМ) с последующей заменой Na+ на колмк+ в среде Инкубации; 4 - преинкубация с ноНенсийом (50 мкИ) В Последующей заменой Na+ на холин+ в среде инкубации»

Как известно, окситоцин является наиболее мощным из многочисленных агентов^ вйзышкнцик оойращенйе матки в родах, играющим определяющую роль в инициации Й Ьоддержанйи родов (M.AfexandrovactaP.,I980). Имеются сведения о том, ¡itü Данный пептидный гормон наряду со стимуляцией канального входа Са й клетки миометрия (S.Batra,I966) и выброса катиона иа оарксПлазнатиЮСкого ретикулума (S.Marc et а?-, 1986) ингибирует такжб Мд |АТР-еаи*сймый выброс катиона из них. Об этом сшдетельствует факт инЬибйроваНия оКситоцином активности мембрано-связанной и солюбилизироваНной Саг+,Кд2+-АТРазы (H.Akcrman etaP.,1979; L.Fbpescü»ИШ5). Одкако во фракций сарколеммы миометрия влияние данного пептидного Гйрмона непосредственно На активный транспорт Са2+ было изучено фрагментарно, Дцвя о Том* что один из возможных физиологических эффектов оксйТсцйна, как стимулятора сокращения матки, заключаете в ингибировании Мо2+,АГР-зависикого переноса катиона через ПМ ГМК

(С.Л.Костерин и др.,1$85) оставалась недостаточно разработанной.

Нами получены данные, Подтверждающие ингибирующее влияние окситоцин 1 на Мд^+,АТР-завиеймЦй транспорт Са2+ в везикулах сарколеммы миометрия женщин (рис;8А), Показано также, что в условиях одинакового начального градиента Са + окситоцин, содержащийся внутри везикул, не вли-

МИН

.2+

9

,АТР-зависимое

Рис.Ь. Влияние окситоцина (А) и сигетина (Б) на Щ'-

накопление во фракции везикул сарколеммы миометрия.

I - контроль; 2 - фармакологический препарат (окситоцин в среде гомогенизации ткани, сигетин (5 мМ)-в среде инкубации).'

яет на пассивный выход катиона из них. На основании вышеизложенного нами сделан вывод о том, что данный пептидный гормон, Наряду с активацией канального $<ода кальция в миовдты (Ева^а ,1985),может инга-бировать кальциевый насос ПМ ГМК матки.

0 0

Имеются сведения о чувствительности активности Са Мд -АТРазы сарколеммы миоцитов матки не только к охсигоцину, но и к другим физиологически активным и фармакологическим веществам ( Ь.йэрезои., 1985; G.DeELconstantLnos et аР., 1986). В медицинской практике последних лет для усиления сократительной активности матки и преодоления её инертности в родахшироко используются такие фармакологические Препараты, как хинин и сигетин. В то же время» практически ничего не извегих их влиянии на Са^+-транспортирующие системы ПМ ГМК матки.

Са^+ из везикул сарколеммы миометрия человека и жйвотНых, однако в концентрации 5 мМ ингибировал Мд +,АТР-завиСймую аккумуляцию катиона в мембранных пузырьках. Характерно, что сигетин нэ влиял На сродство Са^+ к транспортной системе (^=0,5-0,7 мкМ), однако вдвое снижал скорость аккумуляции катиона при насыщавщйх Концентрациях субстрата переноса (рис.8Б). Таким образом, подобно оксИтоцИну, сигетин подавлял АТР-зависимый выброс Са из ГМК матки, Можно полагать, что ингич бирование кальциевого насоса сарколеммы миометрия является одним из

Мы нашли, что сигетин (Ю"б-10~2М) нэ влиял на пассивный выход

возможных механизмов стимулирующего дейотшя этого фармакологического агента на оократительную активность матки. Следствием этого может быть задержка снижение концентрации свободного кальция в миоплазме сократи вшхся ГНК и потенциирование сокращения органа.

Что касается хинина, то это вещество в концентрации более I мМ вызывало быстрое освобождение из везикул Са^+, предварительно накопленного в Мд^АТР-эависимом процессе, за очёт увеличения неспецифической проницаемости мембран к втому Катиону. Хинин также резко увеличивал скорость пассивного освобождения Са" из мембранных пузырьков* Вероятно, механизк действия хинина на сократительную активность мио-метрия не связан с влиянием на ойергоэависимые Са '•"-транспортирующие процессы.

ВЫВОДЫ.

р ,

1. С использованием Са -чувствительных флуоресцентных зондов (МЫ-г и Р1Щ-2 Показано, что концентрация свободного кальция в не-возбуждёняых ГМК миомйтрИя составляет 0,1-0,3 мкМ, В плазматической мембране миоцитов идентифицированы два компонента кальциевой проницаемости! базальный (нечувствительный к нитрендапину) и подавляемый нитрендипином потенциалэависимый.

2. В Нормальных физиологических условиях На+-Са2+-обменник плазматической мембраны не вносит вклад в регуляцию концентрации свободного кальция в клетках миоМетрия, тестируемую по изменению флуоресценции ГМЯЙ-2. Инвертированный натриевый градиент индуцирует повышение концентрации Са в миоплазме»

3. В опытах, проведённых на фракши везикул сарколеммы миомет-р!я с использованием Са2+ й флуреоцентных зондов сШ5-Су-( 5) и акридинового оранжевого,идентифицированы три компонента пассивного транс-_| порта базальйыЯ_ диффузионный (ненасыщаемый по субстрату переноса), потенциалэависимый (насыщаемый По субстрату переноса) и арН-зависимый.

4. Пептидный гормон окситоцин (Ш""17 М) и сигетин (5*10~Э И) -стимуляторы сократительной активности матки - ингибировали Мд2+,АТР-зависимый транспорт Сй2+ во фракции везикул сарколеммы миометрия, не влияя при этом На пассивную кальциевую проницаемость ПМ,

5. Й1нин (10~б-10~2 М), индуцирующий Контрактильный ответ матки, не влиял на активность кальциевого насоса Плазматической мембраны Кле-то! миометрия, однако стимулировал Повышение неспецифи^ ,ской проницае-мссги сарколеммы для Са2+.

- 17 -

Список работ, опубликованных по теме дирсертации»

1.Курский М.Д.,#омиН В.П., Шинлова 0,Л,,Кост9риН С,А. Влияние мембранного потенциала На пассивный транспорт Са^+ во фракции везикул сарколеммы миометрия//Еиохимия.-1987*~ 52, вып.6,- С.900-907.

2.Шинлова 0.П., Фомин В,П., КосТарин С.А. Влияние окситоцина на кальциевый наоос сарколеммы миометрия//Укр.биохим.журН.-1987,- 59,&2,-С.75-79.

3. Koaterin 3.A,,romin ähinlova O.J?. Effeot of membrane potential on pcuaive transport o i Qa2^ into ajfonstriua aaroolemmal vesicles// International aympoaitua "fU/aiobg/ and fchaimicologjr of amöoth auaole'l,- Varna, 1988,-

^.Курский M.Д., Шинлова О.П., Фомин В.П., КосТерин C.A« Влияние стимуляторов сокращения маткй на активный й паоййвнйй транспорт Са2+ во фракции сарколеммы миометрйй//0оПр,М0д,хи1<ий.-ЕВ8,-№2,-С,НЗ-П7,

5.Шинлова О.П.,Фомий В.П., КостёриН С.А, АлияНйе у*ероТоничвских веществ на обмен Саг+ во фракции сарколеммы мио!«т{ий швНщий//Всесоюз. конф."Ьиохимия-медацинэ1':Тез.докл,— Ленинград» 1966,- С*212»

6.СтепанКовская Г.К,, Шинлова Ö.tl», §0МЯН В.П.* Кбстеьин С.А., Яроцкий Н.Е, Влияние окситоцййа и си^еТина на Транспорт Ca" во фракции плазматических мембрай KjiStoK миомэфрия// УЙр.бйохим.журН,- 1989, 61, №5,-0.109-112.'°

7.Фомин В,Л., Шинлова О.П.» БурдыГй Ф«В* PoJlfc баёальиой кальциевой проницаемости и кальциевого насоса сарколеммы я Контроле тонического сокращения гладкой мышцы// 6-й ÖcöcodS, койф. йо бйохймий мышц: Гез.докл,- Тбилиси, I989.r С.56,

В.Костерин С.А., Фок1и« В.П., Черяойейко liMJidi» ö.tl. лрН-шдуцируемый транспорт Са^+ во фракции вЭЭИКуЛ Нлаэматической Мембра-ш гладкомыпючных клеток// bioxtiMHjU- С«73-79»

9.Шинлова О.П.,ФоИин B.tl.', Бурдыга Ф»В4» KtictepMtt С«А, Пассивный •ранспоргг Са2+ в суспензии изолированных Мадкбмышб^ккх KjíetoK й вклад ¡азальной кальциевой прокицае^осТй НЛаймаТйЧаексй йё^брайы в активацип онического сокращения// Известия АН СССР (böfHH tíritíri.)*- 1990.- »3.1.383-390.

10.ï'omin V.P, i áohinlova,О,!1.| Burdyga îh,V4l Kbaterin 3.A. îffecta of aodium gradient on trie eytöäoÜö free Ca2+ end Contraoti-.ity of the pregnant rat ayoiaetrlua áaooth mitácle// Gen.Phyàiol.Bio-iliya1У91НЮ,- P.217-221,

Щ