Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функционирование системы освобождения Са2+ саркоплазматическо ретикула скелетных мышц без кальсеквестрина

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Функционирование системы освобождения Са2+ саркоплазматическо ретикула скелетных мышц без кальсеквестрина"

ДНЕПРОПЕТРОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. 300-ЛЕТИЯ ВОССОЕДИНЕНИЯ УКРАИНЫ С РОССИЕЙ

На правах рукописи

ШЕВЧЕНКО СЕРГЕЯ ИВАНОВИЧ

ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ СИСТЕМЫ ОСВОБОВДЕНИЯ Са2* САРКОГИАЗКА-ТИЧЕСКОГО РЕТШШУМА СКЕЛЕТНЫХ ШЩ БЕЗ ШЬСЕКВЕСТРИНА.

03.00.04. - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени (сандидата биологических наук

Киев-1991

Работа »ыпоЛпоил я лаборатории фпоппо- лимип бкомомбрап

МГУ им. М. а Ломоносова и лаборатории мембранологии КГУ им. Т. Г. Шевченко.

Научные руководители: -к.б.н., Ритов КБ.,

-д. б. н., Рыбальченко Е К.

Офиидальные оппоненты: -д. б. н., проф. Войцицкий К М.

-к. б. н., Назаренко Е И..

Еедущэе учреждение: -Институт биохимии

им. А. Е Палладина АН Украины.

■ Защита состоится 1992г. в /3~ часов на

эаседании специализированного совета К053.24. Об по присуждении ученой степени кандидата биологических наук при Днепропетровском государственном университете по адресу: 320625, г. Днепропетровск, ГС1М0, пр. Гагарина, 72, ДГУ, биолого-экологический факультет, корп. 17, ауд. 407.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Днепропетровского госуниверситета.

¿гтореферат разослан "73" -вгнёаох* 1992г.

Ученый секретарь специализированного совета, доцент

Черная В. И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Важным направлением биофизики и биохимии является изучение мышечного сокращения. Центральная роль в регуляции мышечного сокращения принадлежит саркоплаа-матическому ретикулуму ( CP ) скелетных мышц, который регулирует концентрацию внутриклеточного Са2+. Выход Са2+ иэ внутреннего пространства CP в саркоплазму обеспечивает система освобождения Са2+, которая расположена в терминальных цистернах CP ( ТЦСР ). • -

К настоящему времени остается невыясненной роль отдельных белков CP в регуляции функционирования системы освобождения Са2+ ТЦСР. Известно, что в ТЦСР локализован кальсеквест-рин ( м. в. 42 435 Д ), примембранный белок внутреннего ком-партмента ТЦСР ( Hoffman, 1989 ). На основании экспериментальных данных постулируется роль кальсеквестрина в регуляции системы освобождения Са2+ ТЦСР( Ikerroto, 1989 ). В этой свяаи вопрос изучения кальсеквестрина и его роли в функционировании системы освобождения СаЯ+ ТЦСР скелетных мышц является актуальным.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось сравнительное изучение активности систем освобождения Са2* ТЦСР как содержащая кальсеквестрин во внутреннем конпартментэ везикул , так и лишенной кальсеквестрина. Исходя из цели работы были поставлены следующие задачи:

1 - изучить способность различных детергентов и пептида ала-

метицина селективно солюбилиаировать кальсеквестрин из везикул ТЦСР;

2 - разработать методику получения замкнутых вевикул ТЦСР,

очищенных от кальсеквестрина;

3 - определить остаточные количества кальсеквестрина в мемб-

ранах ТЦСР после процедуры очистки;

4 - исследовать влияние олигомеров Са2+-АТРааы на проницае-

мость веаикул ТЦСР; 6 - сравнить активность Са2+-канадов везикул ТЦСР содержащих и не содержащих кальсеквестрин под действием различны* активаторов системы освобождения Са2+.

Научная новизну разработана методика очистки мембран ТЦСР от кальсеквестрина с исполввованием аламеткцина и детергентов.

' - я -

Впервые было продемонстрировано, что каналоформирующий антибиотик аламетицин при определенных концентрациях приводит к высвобождению кальсеквестрина из внутреннего компартмента мембран ТЦСР. Освобождение кальсеквестрина с использованием аламетицина практически не влияет на функциональную активность системы освобождения Са2+ ТЦСР.

Обнаружена способность углеводородов блокировать каналы утечки Са2+, сформированные олигомерами Са2+-АТРазы в плос-коети мембраны.

Практическая ценность. Результаты проведенных исследований дают новые представления о регуляции активности Са2+-ка-налов ТЦСР. Блокирующее действие углеводородов на каналы пассивной утечки Са2+ может быть применено в клинической практике для усиления барьерной функции биологических мембран. Полученные данные могут быть с успехом использованы для разработки методов трансмембранного переноса нивкомолекулярных белков и других молекул.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на VI Всесоюзной конференции по биохимии мышц ( Тбилиси, 1989 ), на семинаре лаборатории мембрапологии и заседании ученого совета НИИ физиологии Киевского госуниверситета.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 работы.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения и пяти глав, включающих обзор литературы, описание материалов и методов, изложение результатов и их обсувдение, а также выводов и списка цитированной литература Диссертация изложена на 102 страницах, содержит 17 рисунков и 3 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Фрагменты СР иа белых скелетных мышц кролика выделяли методом дифференциального центрифугирования ( Ритов, 1977). Мэмбраиный препарат Са2+-АТРазы получали по методу (Еулдыге-рова, 1987 ). Протеолипосомы из яичного фосфатидилхолина и Са2+-АТРааы с различным соотношением липид/белок получали разведением белка фосфолипидом в присутствии холеата ( Ритов, 1982 ). Липосомы готовили из раствора яичного Зосфатидил-холина в холеате натрия с помос^ю диализа.

- а -

Концентрацию бежа определяли по Сиуреговой реакции или о использованием красителя амидочерного ( Schaffner, 1973 ). Для определения концентрации липида был предложен метод регистрации флуоресценции AHO в присутствии аламетицина ( lifeb-ченко.1989).

Электрофоретическое разделение мембранных белков проводили в присутствии SDS по ( Laemmll, 1970 ).

Липиды экстрагировали из мембран CP по модифицированному методу ( Folch, 1957 ). Аналитическое разделение фосфоли-пидов CP проводили на хроматографе НРР Б001 ( Буддыгеро-ва,1987 ).

Измерение транспорта Са2+ проводили по флуоресценции хлортетраци клина ( Caswel, 1979; Ритов, 1984 ) и quin-2 ( Rink, 1983; Ритов 1984 ) на спектрофлуориметре Hitachi SP850.

Обработку мембран CP аламетицином проводили гомогенизированием в гомогенизаторе Пэттера о суспензией аламетицина и последующей инкубацией ( до 30 минут ) при 4 С.

Для очистки мембран CP от аламетицина были разработаны и использованы методы хроматографии на колонке о гидрофобным ионообменником XAD-2 и обработки липосомами иа яичного фосфа-тидилхолина.

Числовые значения, представленные в таблицах и на графиках, являются средними значениями из З-б параллельных измерений, разброс между которыми не превышал 7,6%.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Блокирующее действие углеводородов на каналы утечки

Са2+, формируемые агрегатами Са2+~АТРазы СР.

Предполагается, что встраивание Са2+~АТРазы в мембрану липооом приводит к формированию в мембране неспецифических каналов утечки ионов в результате агрегации молекул Са2+-АТРаэы. . Са24~транспортируютая функция препаратов Са2+-АТРазы усиливается под действием углеводородов ( рис. 1). Вызванное углеводородсодерлащими липосомами увеличение флуоресценции свидетельствует об увеличении накопления Са2+ внутри везикул, поскольку добавление в инкубационную смесь аламетицина Приводит к снияэнию флуоресценции до исходного уровня.

Рио. 1. Транспорт Са2+ мембранными везикулами СР и препаратом Са2+-АТРазы (А),. а также протеолипосомами (Ш1) с весовым соотношением липид/Селок 1,6 (1) и 3,4 (2) (Б), измеренный по флуоресценции ди!п-2. Д - декансодержащие лилосомы.

I Флд х i фл.г в

Рис. 2. Графики зависимости относительного содержания рианодинового рецептора (1) и кальсеквеетрина (2), а также величины Са2+-индуцированного освобождения Са?н (3) от концентрации холеата На (А), CHAPS (Б), луброла РХ (В) и аламе-тицина (Г).

- Б -

Мзмбракные препараты о высоким содержанием олигомерных форм Са2+-АТРазы ( протеолипосомы, содержащие 1,6 мг липи-да/мг белка) демонстрируют более высокую чувствительность к декану, что свидетельствует о блокировании углеводородом каналов утечки, формируемых олигомерами Са2+-АТРазы.

Анализ изменения белкового состава ТЦОР под действием

детергентов и аламетицина.

Мембраны ТЦСР инкубировали с лубролом РХ, CHAPS, холеатом Na или аламетицином в диапазоне концентраций 0,26-2,0 мг/мл. Очистку проводили хроматографией на колонке XAD-2, Контрольные образцы инкубировались без детергентов или аламетицина, но пропускались через колонку XAD-2. Изменения белкового состава оценивали по изменению оптического поглощения белковых полос после электрофоретического разделения.

С увеличением концентрации детергентов в мембране понижалось содержание как кальсеквестрина,' так и интегрального мембранного белка ТЦСР-рианодинового рецептора ( РР ) ( рис. 2). В случае обработки аламетицином удаление кальсеквестрина не сопровождается изменением относительного содержания PP. Следовательно, аламетицин вызывает освобождение кальсеквестрина ( до 70% ) без соиобилизации РР из мембран "ГЦ СР. фи этом частично сохраняется активность системы осробождения Са2+.

Полученные результаты позволили остановить наш выбор на обработке аламетицином как перспективном методе удаления кальсеквестрина из ТЦСР.

Подбор условий для полного удаления кальсеквестрина из мембран ТЦОР с -помопъ» аламетицина С целью проверки способности вызывать полное освобождение кальсеквестрина из вевикул ТЦСР, были исследованы различные препараты апамзткцина.

Максимальное, но не полное освобождение кальсеквестрина из везикул ТЦСР отмечено при обработке смесью кислых пептидов аламетицина или индивидуальным кислым пептидом F30 ( табл. 1).

Другой экспериментальный подход основывался на применении модификаторов функционального состояния Са2+-канала и детергентов в присутствии аламетицина. Минимальное содержание кальсеквестрина в везикулах ТЦСР ( 6% ) зафиксировано после обработют аламетицином в присутствии кесолюбилизирующих концентраций детергента. Получений результат позволил предпсню-

- б -

N Препарат аламетицина Концентрация Содержание

аламетицина. кальсеквестрина.

кг/ш Г.

1. Контроль - 100Х

- 100%

£. Смесь отрицательно 0.2 гаг.

еаряженных пептидов 0,4 34*

В. Р 30 ' 0,2 гэг

0,4 еж

4. Г 60 о.г ■пг

0.4 тх

мембранах ТЦСР После обработки различными препаратами аламетицина

N

и

ТИСР, анср 60 ^

ю

зоо площадь . пико». *«*'

N

Рис. 3. Электрофоретнческие спектры белков нативных (А), очищенных от кальсеквестрина(Б) мембран ТЦСР и суперна-танта, полученного после осаждения очищенных от кальсеквестрина мембран ТЦСР (В): 1-Са2+-АТРава; 2-кальсеквестрин. калибровочный график для определения относительного содержания кальсеквестрина^.

жить, что аламетицин формирует каналы достаточно большого размера для трансмембранного прохождения мономеров кальсек-вестрина.

С цельп определить изменение содержания других белков и оценить остаточное количество кальсеквестрина провели элект-рофорегическое разделение белков мембран ТЦСР, очищенных от кальсеквестрина, аламетицина и детергентов ( рис.3). Сравнительный анализ денситограмм злектрофоретичесКого спектра продемонстрировал практически полное удаление кальсеквестрина ( удалено 97% от содержания в нативноМ образце мембран ТЦСР), частичное удаление белков в диапазоне 160-170 КД и протеоли-пида 12 кД.

Сравнительный анализ Са2+-емкости контрольных везикул

ТЦСР и лишенных кальсеквестрина

Мембраны.ТЦСР, очищенные от кальсеквестрина ( в дальнейшем опытный или экспериментальный образец ) получали обработкой аламетицином ( 0,2 мг/мг белка мембран ) в присутствий холеата На ( 0,6 мг/мл ) о последующей очисткой мембран от аламетицина обработкой липосомами. В качестве контроля использовали везикулы ТЦ СР, обработанные О,Б мг/мл холеата и очищзнные инкубацией с липосомами. В качестве дополнительного контроля использовашсь нативные везикулы ТЦСР.

Са2+-емкосгь везикул, очищенных от кальсеквестрина, составляла 17 нмоль Са2+/мг белка мембран, т. е. 43% от емкости контрольных везикул. Величина емкости для Са2+ контрольного образца везикул была на 10% меньше Са2+-емкости исходного образца везикул ТЦСР ( рис. 4). Величина Са2+-емкости для на-тивных и экспериментальных везикул легкой фракции СР ( изначально не содержащих кальсеквестрина ) Практически одинакова ( соответственно 232 и 230 нмоль Са2+/мг белка). Мэжно предполагать, что уменьшение Са2+-емкосТи мембранных везикул ТЦСР вызвано удалением кальсеквестрина, но не обработкой аламетицином или процедурой очистки.

Анализ активности системы освобождения Са2+ мембран ТЦСР в отсутствие кальсеквестрика. Оценка активности Са2+-каналов проводилась по способности к освобождению Са2+ под действием наиболее эффективного из известных активаторов - три^етилпенгана ( 1?11оу, 1990 )(рис. б ). Величина активности Са2+-каналов для контримого и

Юнишь Саг*

Рис. 4. Измеренная по флуоресценции ди!п-2 кинетика накопления и аламетицин-индуцированного освобождения Са2+ ве-викулами натианых (А), контрольных (Б) и экспериментальных (В) мембран ТЦ0Р Веа (1) ив присутствии (2) декансодержащих липосом.

10 вмоль саг*

^

ТЦСР

/

АЛ

к.

ГЦСР

Г

J АЛ

Рис. 6. Измеренная по флуоресценции фПп-2 кинетшса накопления и триметилпентан-индуцированного освобождения ионов Па2+ везикулами иативных (л), контрольных (В) и экспериментальных (В) мембран ТЦСР. Са£+ - СаСП ; Т - триметилпентаноо-деряащие лшоеомн; Ал - алямртшдоч.

- в -

опытного образцов почти в 2 раза меньше величины освобождения ионов Са веэикулами нативного препарата мембран ТЦСР.

Анализ фоефолипидного состава и содержания липидов в мембранах ТЦСР ( таблица 2) позволяет предполагать, что причиной уменьшения величины освобождения ионов Са из мембран ТЦСР является уменьшение относительного содержания липидов в составе мембран ТЦСР. Вероятно, высокое соотношение липид/бе-лок является одним из факторов, определяющих активность системы освобождения Са2+ из ТЦСР.

Анализ функциональной активности Са2+-каналов ТЦСР различными активаторами освобождения Са2+. В качестве активаторов использовали Са2+, Ag+, триметил-пентан, кофеин, гепарин. Каждый из перечисленных активаторов реализует определенный механизм запуска системы освобождения Са2+ из вевжул ТД СР. Ш представленных данных следует, что все использованные в эксперименте индукторы вызываю® освобождение Са2+ из исследованных везикул ТЦСР С рис, 6 ). Величина этого выброса Са+ из контрольных вевикул ТЦСР составляет 65-64% относительно освобождения Са2+ исходным препаратом везикул ТЦСР, а для везикул ТЦСР лишенных кальсеквестрйИа от 41X до Б3%.

' ВЫВОДЫ

1. Разработан метод очистки мембран ТЦСР скелетных мышц от белка кальсеквестрина с использованием каналоформирующе-го антибиотика аламетицина в присутствий несолюбилизиру-кяцих концентраций детергента

2. Продемонстрирована способность олигомеров Са2+-АТРавы формировать в мембранах каналы пассивного транспорта для ионов Са2+.

3. Установлено, что насыщенные углеводороды способны блокировать каналы утечки ионов Са, формируемые олигомерами Са2+-АТРазы.

4. Удаление кальсекйестрина с помощыо детергентов ( CHAPS, холеат Na, луброл РХ ) сопровождается потерей активности системы освобождения Са2+ ГЦСР скелетних мьгшц.

5. Аламетидан обладает способность» к частичному селективному удалению кальсеквестрина из внутреннего компартмента

-

Мзмбраншй препарат ТЦСР Относительное содержание фэсфатидилхолииа Относительное содержание общих липидов Выброс Са2+,

4Х/48А +«1 I лилид/ белок X

нативный 1,22 100 0,48 100 100

контрольный 1,28 106 0,31 68 68

опытный ' 1,Б2 125 0,26 57 57

Таблица 2. Относительное содержание фосфатидилхолина, общих липидов и величина освобождения Са2+ везикулами ТЦСР.

I

к

рис. 6. Величина освобождения Са2+ ( в % от содержания Са2+) йатИвнымСО). контрольным®) и опытным (а) образцами везикул ТЦСР под действием: Л-Ар»-; Б-кофеина; Вкофеинп и гепарина; Г-триметнлпентаяоол^ргашик липосои.

ранных вевикул ТЦСР.

5. Аламетиции не оОладает солюбилизирующей активностью по отношению к интегральным мембранным белкам ТЦСР.

7. Практически полное удаление кальсеквестрина ( 97Х ) с помощью аламетицина и холеата На не влияет на функционирование системы освобождения Са2* ТЦСР скелетных мьшц.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Шевченко С. И., Чернова Т. Л., Меньшикова Е.Е , Ритов ее Блокирующее действие алифатических углеводородов на каналы утечки Са2+, сформированные агрегатами Са2+-АТРавы саркоп-лааматического ретикулума. -Биохимия, 1989, т. Б4, N9, о. 1526-1Б32.

2. Шевченко С. И., Ритов Е Е Освобождение кальсеквестрина из везикул ТЦСР под действием аламетицина-Материалы VI Всесоюзной конференции по биохимии мышц, Тбилиси, 1989, с. 14Б-146.

3. Шевченко С. И., Островская Г. Е , Мэгилевнч Е Р., Рыбальчен-ко Е К. Изучение действия вавопрессина на мембраны липооом и вевикул оаркоплаэматического ретикулума.- Весник Киевского университета, 1992, ( в печати ).