Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Норадренергический контроль температурного гомеостаза у белых крыс при адаптации к холоду

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Норадренергический контроль температурного гомеостаза у белых крыс при адаптации к холоду"

'Л .7* ~ .....1

* 1 ) ■■ 1

2 1 АП? 1353

На правах рукописи

ГОРБАЧЕВА Любовь Руфэльевна

НОРАДРЕНЕРГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ТЕМПЕРАТУРНОГО ГОМЕОСТАЗА У БЕЛЫХ КРЫС ПРИ АДАПТАЦИИ К ХОЛОДУ

03.00.13 — физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Тверь—1Ш

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных Ивановского государственного университета п в физико-химической лаборатории бномембран МГУ им. М.В.Ломоносова.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор, з. д. н. РФ Ю. И. Баженов

кандидат биологических наук, ст. науч. сотр. В. Б. Ритов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, чл.-корр. РАЕН Ю. Ф. Пастухов

кандидат биологических наук, доцент В. Н. Напоров

Ведущая организация — Петрозаводский госуниверситет

Защита диссертации состоится1998 года в часов на заседании Диссертационного совета К 063.97.09 при Тверском государственном университете (170002 г.Тверь, пр. Чайковского, 70а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тверского государственного университета (г. Тверь, ул. Володарского, 44а).

Автореферат разослан » 199^ года.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук, доцент

А. Н. ПАНКРУШИНА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема адаптации организма к низким температурам среды является одной из центральных в экологической физиологии. ЭтсТ вызвано активным освоением человеком зоны высоких широт, районов Крайнего Севера и Сибири. Более того, вопрос адаптации организма к холоду тесно связан с проблемой защиты от кратковременного воздействия низкой температуры. Подобные явления встречаются в экстремальных ситуациях, способных привести к переохлаждению и необратимым последствиям. \

На данный момент имеется значительное количество работ, посвященных терморегуляции и изменениям функций различных органов и систем при адаптации к холоду (Слоним, 1979; Пастухов, 1980; Баженов, 1981; Медведев, 1984; Якименко, 1984; Хочачка, 1988; Иванов, 1990; Лу-пандин с соавт., 1995; и др.). Вместе с тем ряд проблем этой области раскрыты недостаточно.

Учитывая всю сложность и многогранность исследуемого вопроса, требуется его комплексное изучение, начиная со звена регуляции процессов теплопродукции, общих механизмов перестройки функциональных систем и заканчивая формированием адекватной физиологичной реакции организма на температурное воздействие. Очевидно, что раскрытие тонких процессов, лежащих в основе терморегуляционных реакций, требуют использования современных биохимических методов исследования.

Не вызывает сомнения, что одним из основных веществ, регулирующих процессы теплопродукции является норадреналин ( Якименко, 1971; Пастухов, 1974; Bligh, 1973, 1985 и др.). В настоящее время имеется достаточное количество работ, позволяющих охарактеризовать роль различных отделов центральной нервной системы в терморегуляции ( Дымникова, 1969; Cordon е.а„ 1985 и др.). Вместе с тем, роль центральных норадренер-гических структур мозга в поддержании температурного гомеостаза организма в различных температурных условиях не совсем ясна. Следует отметить, что исследование возможности коррекции терморегуляционных реакций с помощью интравентрикулярного введения экзогенного норадре-налина, позволило бы полнее раскрыть механизмы формирования процессов теплопродукции в условиях низких температур. В свою очередь подобные научные изыскания создают основу для разработки методов защиты организма от переохлаждения и своевременной активации теплопродукции различных органов.

Известно, что реакция целостного организма на различные внешние воздействия представляет собой комплексный ответ, включающий в себя изменение функционирования всех органов и систем. Имеющиеся обособленные исследования основных термогенных органов - мышц и бурой жировой ткани (Баженов, 1981; Якименко, 1982; Иванов, 1989; Himms-Hagen, 1970; Nickols е.а., 1984; и др.), не дают четкой картины их взаимодействия в терморегуляции. Не исключено, что основой функциональной взаимосвязи

этих органов выступают биохимические реакции, успешное протекание которых зависит от состояния ферментных комплексов, контролируемых сложной системой как внутренних, так и внешних факторов.

Таким образом, несмотря на достаточно большое количество работ о терморегуляционной роли норадрсналина, бурой жировой ткани и мышц, дальнейшее разностороннее исследование их функций не только на физиологическом, но и на биохимическом уровне является необходимым и имеет как теоретическое, так и практическое значение.

Цель и задачи исследования. Основная цель исследования состояла в изучении влияния адаптации к холоду на норадренергический контроль температурных реакций бурой жировой ткани и скелетных мышц.

В исследовании ставились следующие задачи:

1) определение роли интравентрикулярных инъекций норадреналина в контроле температурного гомеостаза белых крыс после холодовой адаптации и в условиях кратковременного охлаждения;

2) изучение влияния адаптации к холоду и интравентрикулярных инъекций экзогенного норадреналина на окислительный метаболизм бурого жира и скелетных мышц;

3) определение влияния длительной адаптации к холоду на некоторые биохимические параметры скелетной мышцы m. triceps surae белых крыс.

Научна« новизна полученных данных. Результаты исследования позволили установить, что адаптация к холоду приводит к изменению чувствительности адренорецепторов мозга к экзогенному норадреналину. Предварительное введение в боковые желудочки мозга обзидана-блокатора бета-адренорецепторов, существенно изменяло температурную реакцию организма крыс на интравентрикулярные инъекции норадреналина. Данный факт позволяет говорить о том, что наибольшее значение в реализации эффекта инъекций норадреналина приобретают центральные бета-адренорецепторы.

Полученные данные конкретизируют картину перестройки как регуляции термогенеза со стороны центральной нервной системы, так и основных органов терморегуляции. Обнаруженное изменение некоторых показателей липидного обмена в скелетной мышце при адаптации к холоду, на фоне повышения активности термогенеза в бурой жировой ткани, позволяет предположить наличие взаимосвязи этих процессов. Более того, результаты биохимических исследований мышечной ткани могут послужить основой для разработки вопроса о наличии зависимости активности кальций-транспортной системы, а следовательно и сократительной функции мышцы от состояния липидного обмена при длительной холодовой адаптации. Для определения удельной активности митохондриальной NADH-окендазы и FoFi-ATFa3bi был использован метод, основанный на применении каналообразующего антибиотика аламетицина для обеспечения свободного прохождения NADH и АТФ через внутреннюю мембрану митохондрий.

Основные положения, выносимые на защиту. Адаптация к холоду приводит к развитию резистентности гомойотермного организма к охлаждению.

Интравентрикулярные инъекции норадреналина повышают активность окислительных процессов в бурой жировой ткани и мышцах. Особую роль в опосредовании данного процесса играют бета-адреиергические рецепторы, о чем свидетельствуют результаты, полученные при изучении температурного эффекта экзогенного норадреналина в условиях предварительного введения бета-адреноблокатора обзидана. Длительная холодовая адаптация приводит к повышению чувствительности адренорецептороп мозга к экзогенному норадреналину.

Продолжительное воздействие низких температур вызывает повышение активности окислительных процессов в бурой жировой ткани и изменение общего содержания липидов и свободных жирных кислот в мышцах белых крыс.

Увеличение содержания ненасыщенных жирных кислот в скелетных мышцах при адаптации к холоду сопровождается изменением активности некоторых митохондриальных ферментов и транспортных функций сарко-плазматнческого ретикулума. В результате при длительной холодовой адаптации происходит возрастание активности РоР|-АТФазы и снижение эффективности работы кальциевого насоса в гомогенате мышечной ткани.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты позволили обобщить ряд теоретических вопросов, касающихся механизмов регуляции теплообразования и энергетики мышечной ткани в условиях длительного воздействия низких температур.

Данные о влиянии интравентрикулярных инъекций экзогенного норадреналина на температурный гймеостаз в условиях холодовой адаптации и кратковременного охлаждения углубляют существующие представления о центральных механизмах приспособления гомойотермного организма к различным факторам окружающей среды.

Исследования, проведенные на скелетных мышцах позволили оценить некоторые аспекты биохимических изменений в мышечной ткани при адаптации к холоду.

Более полное познание центральных механизмов формирования холодовой адаптации создает практические предпосылки для направленного поиска путей управления адаптационным процессом. В частности, выводы о сочетанном влиянии адаптации, кратковременного охлаждения и интравентрикулярных инъекций норадреналина на изменение терморегуляции могут быть применены в медико-биологических исследованиях по изучению механизмов приспособления человека и животных к экстремальным факторам среды. Более того, наблюдаемые изменения липидного обмена, активности ферментных и транспортных систем в мышечной ткани при адаптации к холоду, могут служить основой дальнейшей расшифровки механизма изменения теплопродукции скелетных мышц. Следует учитывать возможность влияния липидного обмена на сократительный аппарат мышечной ткани. В результате созданы предпосылки для поиска путей кор-

рекции уровня теплопродукции и функциональных изменений в скелетных мышцах.

Апробация работы. Материалы. диссертации представлены на научных конференциях Ивановского госуниверситета (Иваново, 1989, 1990, 1996, 1997), на Ш-ей и 1У-ой областных конференциях молодых ученых и специалистов ( Иваново, 1989, 1990), на 3-й Международной и 6-й Всероссийской научно-практической конференции "Экология и охрана окружающей среды" (Владимир, 1996), на Ш-ем съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1997).

Данные, полученные в ходе проведенного исследования, используются при чтении спецкурсов ("Физиология терморегуляции", "Биофизика" и др.) для студентов кафедры физиологии человека и животных Ивановского госуниверситета.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, в том числе в Физиологическом.журнале им. И.М. Сеченова и в журнале "Биохимия".

Объем и структура диссертации. Работа состоит из введения , пяти глав, заключения, выводов и списка литературы. Её объем составляет 146 страниц, в том числе 10 таблиц, 19 рисунков. Список литературы включает 152 отечественных и 134 зарубежных источников.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводились на белых беспородных крысах-самцах, которые подразделялись на две группы. Контрольная группа содержалась в условиях вивария (20°-22°С), а опытная группа животных - в течение 4-х недель в специальной камере с автоматически регулируемым освещением и температурой воздуха 4-6°С.

В первой серии опытов исследовалось изменение температурных показателей у обеих групп животных при интравентрикулярном введении изотонического раствора, норадреналина (доза 20 мкг) и обзидана (доза 10 мкг), в расчете на каждую особь, в условиях термонейтральной зоны (22°-25°С) и изотонического раствора и норадреналина (в дозе 10 и 20 мкг) при 30-минутном .охлаждении (0°-+4°С). Блокаду центральных бета-адренорецепторов осуществляли инъекцией обзидана за 15 мин до введения норадреналина. Общий объем вводимых фармакологических препаратов для каждого животного составлял 20 мкл. Дозы использованных в работе препаратов согласуются с исследован' ми по изучению температурного гомеостаза у белых крыс (Турин, 1986).

Характер воздействия фармакологических веществ на температурный гомеостаз организма определяли по изменению показателей: потребления кислорода животными и температуре: ректальной, мозга, бурой жировой ткани, скелетной мышцы. Регистрация температурных показателей осуществлялась в течение 60 мин. с момента инъекции препаратов. Температура животных измерялась с помощью медно-константановых термопар.

Величину потребления кислорода животными определяли по методу Хол-дена.

Введение фармакологических веществ осуществлялось через заранее вживленные в область боковых желудочков мозга канюли. Для проведения стерсотаксичсских операций использовали координаты из атласа Фифко-вой и Маршала (1960) AP1.5L2H3.

Во второй серии эксперимента изучалось изменение биохимических показателей скелетных мышц m. triceps surae белых крыс при адаптации к холоду. Для проведения биохимических исследований мышечную ткань гомогенизировали по ранее разработанной методике (Ритов, Мурзахмето-ва, 1985). Экстракцию липидов осуществляли следующим образом: образец мышечной ткани (1г) гомогенезировали при 4°С в 10 мл метанола, затем добавляли 20 мл хлороформа и полученную смесь оставляли на 1 ч для экстракции, периодически встряхивая. Экстракт фильтровали через широкопористый бумажный фильтр, смешивали с 6 мл 0,1 М NaCl и после расслаивания отбирали органическую фазу, которую выпаривали на роторном испарителе и определяли общее содержание липидов методом взвешивания и выражали в мг на грамм сырой ткани. Липияы растворяли в 1 мл хлороформа, содержащего ионол (0,1 мг/мл) и использовали для анализа методом ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии) на колонке с нормальной фазой. Качественный анализ жирных кислот осуществляли методом хроматографии на бумаге (Левачев и др., 1965).

Скорость гидролиза АТФ измеряли рН-метрически при 37 °С, используя стеклянный электрод в 4 мл среды, содержащей 100 мМ'NaCl, 4 мМ MgCl 2, 2 мМ АТФ, 0,25 мМ ЭГТА, 2,5 мМ имидазол (рН 7,0), 20 мкМ АрзА и аламетицин ( 10 мкт/ мл). Данный метод основан на освобождении при гидролизе АТФ нонов Н*. Для регистрации изменения рН использовали стеклянный электрод ЭСЛ-41 Г-04. В качестве электрода сравнения -хлорсеребрянный электрод, соединенный через агаровый КС1-насыщенный мостик с измерительным прибором "Иономер универсальный ЭВ - 74". Запись проводили с помощью электронного потенциометра КСП-4 с чувствительностью 10 мВ на всю шкалу или 0,1 рН. Для пересчета Н+ в количество накопившегося в процессе гидролиза АТФ неорганического фосфата использовали величину сдвига на шкале самописца при добавлении в инкубационную смесь титрованного раствора КН2РО4. Активность Са2+-АТФазы оценивали по разности АТФазных активностей в среде с ионами кальция и без них и выражали в нмолях неорганического фосфата (Pi) в минуту на 1 мг белка (Ритов, 1977).

Активность FoFi-АТФазы оценивали по разности активностей в отсутствие и в присутствии в среде инкубации 5мМ азида натрия или олиго-мицина (1мкг/мл).

Скорость окисления NADH измеряли с помощью спектрофотометра. Для лучшего прохождения NADH во внутреннее пространство митохондрий был использован каналообразующий антибиотик аламетицин, который применяется для повышения проницаемости мембранных везикул. Под действием аламетицина наблюдается активация окисления NADU.

Аламетицин-индуцированное окисление ЫАЙН полностью подавляется ротеноном. Реакционная смесь содержала 0,1М сахарозу, 75мМ КС1, 2,6 мМ М^СЬ, 5мМ НЕРЕБ, рН 7,4, бычий сывороточный альбумин (0,5 мг/мл), 0,1мМ ЭГТА, 0,125мМ NADH, цитохром с (83 мкг/мл), аламетицин (20 мкг/мл) при 25 или 37°С. Активность ротснон-чувствитсльного окисления ИЛЬИ определяли по разности измерения активностей в отсутствие и в присутствии 1,5 мкМ ротенона.

Транспорт кальция измеряли с помощью Са-селективного электрода (электрод "Орион 92-20") в термостатирусмой ячейке с перемешиванием. Непрерывную запись потенциала Са2*-элекгрода осуществляли с помощью ионометра И-120 с присоединенным к нему самописцем Тг4221. Инкубационная смесь объемом 4 мл содержала 100 мМ КС1, 15 мМ оксалата Ыа, 4 мМ Гу^СЬ, 2 мМ АТФ, 5 мМ №N3, 2,5 мМ имидазол, 10 мМ НереБ, рН 7,0 при 37°С. В реакционную смесь дважды вводили добавку СаСЬ 25 нмоль, которая использовалась также для калибровки электрода, и затем инициировали реакцию введением 10 мкл гомогената (160-210 мкг белка в зависимости от пробы). Скорость аккумуляции оценивали по максимальному значению в начальном прямолинейном участке кривой транспорта кальция для каждой отдельной пробы.

Показатель Са/АТФ для каждого препарата определяли с использованием графика , где по оси ординал откладывали Са/АТФ-1 эксп для ряда сред с разной концентрацией оксалата, по оси абсцисс - концентрации свободных ионов кальция внутри везикул (данные брали из специальной таблицы соотношения концентрация ионизированного кальция внутри везикул при различных концентрациях оксалата (Болдырев, 1977)). Точка пересечения линии этого графика с осью ординат соответствует величине Са/АТФ, наблюдающейся при нулевой концентрации кальция внутри везикул, т.е. в условиях нулевого выхода кальция (Болдырев, 1977).

Для получения липосом "нагруженных кальцием" 10 мг липида добавляли к 5 мг холата натрия растворяли в спирте и высушивали на роторном испарителе. Затем к липиду добавляли 5 мл среды, содержащей 10% глицерина, 0,1 М КС1, 10 мМ трис НС1, 10 мМ СаСЬ, рН 7,5 при 25 "С. Для получения везикул данный раствор пропускали через колонку со смолой (Дауэкс). Затем, используя метод ультрафильтрации липосомы отмывали и концентрировали (Марголис и др., 1986).

. Утечку ионов кальция из липосом измеряли по флюоресценции quin2 методом спектрофлюориметрии в среде инкубации, содержащей 100 мМ КС1, 10 мМ НереБ, 1,5 мМ Г^СЬ, рН 6,? при 28 °С (Меньшикова и др., 1989).

Содержание белка в пробе определяли по биуретовой реакции. К 100 мкл суспензии образца добавляли 0,9 мл 1%-ного дезоксихолата натрия и 4 мл биуретового реактива. Через 30 мин измеряли оптическую плотность с помощью спектрофотометра при 540 нм. В качестве стандарта использовали сывороточный альбумин человека. Количество белка в пробе оценивали по заранее построенной калибровочной кривой для данного раствора биуретового реактива (Кочетов, 1971).

Результаты экспериментов подвергались статистической обработке с использованием ^критерия Стыодента.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1

I

1, Влияние адаптации к холоду и интравентрикулярных инъекций норадреналина на температурный гомеостаз белых крыс в термонейтральных условиях (22°-25°С) и при охлаждении (0°-+4°С).

Использование 30-ти минутного охлаждения при температуре 0°-+4°С показало, что выбранный режим холодовой адаптации обеспечивает резистентность организма белых крыс к воздействию низких температур.

Данный процесс осуществляется, вероятно, за счет сохранения теплопродукции скелетных мышц на более высоком уровне, о чем можно судить по незначительному изменению температуры у адаптированных к холоду животных по сравнению с контролем при используемом охлаждении (0°-+4°С) (рис. I). Температура остальных исследуемых органов также снижается в меньшей степени у предварительно адаптированных белых крыс.

л Факт интенсификации

Дсхо^ныид£оверь метаболизма у белых крыс после адаптации к холоду при охлаждении подтверждается и

большим повышением потребления кислорода у адаптированных крыс по сравнению с контрольными животными

Рис.1. Изменение температурных реакций у контрольных

н адаптированных к холоду белых крыс при 30-ти минут- Для исследования соче-ном охлаждении (0°-+4°С). (По оси ординат - изменение тайного влияния крат-температуры к исходному уровню(4°С). За нулевую от- ковременного охлажде-метку принята исходная температура для каждого пока- 11ня и экзогенного но-зателя; ¡-температура мозга (38,4° и 38,7°С, соответствен- «адреналина на темпе-но для контрольных и адаптированных животных); 2- бу- -

рой жировой ткани (39,3° и 38,7°С); З-ряаальная темпе- ратурныи гомеостаз ое-ратура (38,3° и 37,9<>С); 4-температура мышцы (.35,7° и ЛЬ1Х КРЫС изучали изме-36,1°С); *-различия достоверны по отношению к контро- ряемые параметры при лю Р<_0,05). интравентрикулярных

инъекциях норадреналина при температуре 0-+4°С.

У контрольной группы животных норадреналин сдерживал развитие гипотермии, вероятно, за счет активации теплопродукции бурого жира и скелетных мышц, на что указывают изменения температурных показателей (табл. 1) и величины потребления кислорода животными при охлаждении и введении норадреналина (рис. 2). Вместе с тем, у адаптированных к холоду крыс норадреналин в дозе 10 мкг при интравентрикулярном введении обеспечивает еще большую устойчивость температурного гомеостаза к

□ контроль

□

адаптация к холоду

охлаждению, тогда как увеличение дозы в два раза как бы нивелировало приобретенную в процессе адаптации резистентность организма к охлаждению (табл. 1).

ТАБЛИЦА 1.

Влияние интравентрикулярных инъекций норадреналина на температурные реакции

контрольных и адаптированных к холоду белых крыс в условиях охлаждения (0"-+4°С)

Исследуемая температура (°С) Контроль (п= 15) Адаптация к холоду(п= 14)

Исходная Опытная Исходная Опытная

Введение изотонического раствора

бурого жира 39,3+0,3 34,8+1,0* 38,7+0,2 36,7+0,5*

ректальная 38,3+0,7 33,9+1, Г 37,9+0,6 36,1 + 1,0*

мышцы 35,7+0,1 31,3+0,9* 36,1+0,2 35,8+0,1

Введение норадреналина в дозе 10 мкг

бурого жира 1 39,2+0,3 36,4+1,1* 38,8+0,2 38,3+0,3

ректальная 38,2+0,6 ■ 34,3+0,5* 38,2+0,2 37,7+0,6

мышцы | 35,7+0,2 32,7+0,1* 36,3+0,1 35,9+0,1'

Введение норадреналина в дозе 20 мкг

бурого жира 39,0+0,3 36,7+0,4* 39,1+0,1 1 36,3+0,4*

ректальная 37,7+0,2 35,7+0,6* 37,6+0,7 34,0+0,8*

мышцы 35,5+0,3 30,8+0,2* 36,0+0,2 | 31,5+0,1*

Примечание; *) - различия достоверны (при р<0,05) по отношению к исходным показаниям.

Термонейтральная зона (22'-25*С)

Охлаждение

□ Контроль

I Адаптация к холоду

Рис. 2. Влияние норадреналина и обзидана на потребление кислорода у белых крыс в различных температурных условиях. Нулевая отметка соответствует исходным показаниям для каждой группы животных 25,9+1,8 мл/кг.мин - для контрольных и 30,8+1,2 мл/кг.мин - для адаптированных животных (1-введение изотонического раствора; 2-введение норадреналина в дозе 10 мкг; 3-введение норадреналина в дозе 20 мкг; 4-введение обзидана и норадреналина; * - различия достоверны по отношению к контролю Р< 0,05)

Следует отметить, что дозозависи-мая реакция на интравентрикуля-рное введение норадреналина в условиях охлаждения наблюдается лишь у адаптированных к холоду крыс, тогда как у контрольной группы животных введение норадреналина в дозах 10 и 20 мкг вызывали однонаправленные реакции - сдерживание снижения темпера гурных показателей по сравнению с ре-

и

зультатами, полученными при введении изотонического раствора в тех же условиях.

Таким образом, активация адренорецепторов мозга инъекциями но-радреналина в дозе 10 мкг у адаптированных к холоду животных при температуре 0°-+4°С сдерживала снижение температурных показателей по отношению к данным термометрии в отсутствие инъекций. Вместе с тем, наблюдаемое нивелирование у крыс резистентности к охлаждению при ин-травентрикулярных инъекциях этого медиатора в дозе 20 мкг в аналогичных условиях (температурные показатели в этом случае снижались в большей степени, чем при воздействии только охлаждения), позволяет говорить о повышении чувствительности центральных адренорецепторов к экзогенному норадреналину при длительной холодовон адаптации. Очевидно, что в отличие от контрольной группы животных доза норадреналина в 20 мкг для адаптированных к холоду крыс является сверхпороговой и вызывает угнетение процессов теплообразования и ведет к развитию гипотермии.

Проявление калоригенного эффекта внутрижелудочковых инъекций норадреналина при охлаждении, вероятно, в большей степени связано с активацией через норадренергические структуры мозга симпатических волокон бурой жировой ткани. Экзогенный норадреналин сдерживал снижение температуры этого органа в условиях охлаждения у контрольной группы при дозе 10 и 20 мкг, а у адаптированной только при 10 мкг вещества.

Исследования действия норадреналина в термонейтральных условиях (22°-25°С) указывают на двухфазность температурных реакций. Так у белых крыс норадреналин, введенный в боковые желудочки мозга, приводил к снижению (на 30-ой мин) ректальной температуры, которое в последую-

10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

■ Контроль (изотонический раствор)

• Адаптация к холоду (изотонический раствор)

■ Контроль (норадреналин)

■ Адаптация к холоду (норадреналин)

Время (мин)

Рис. 3. Динамика изменений ректальной температуры у белых крыс при интравентрику-лярном введении норадреналина в термонейтральных условиях (22°-25°С). Нулевая отметка соответствует исходным показаниям температуры у контрольных -38,2+0,4°С, у адаптированных к холоду животных - 38,1+0,3°С (* - различия достоверны по отношению к контролю при р<0,05).

щем (на 60-ой мин) сменялось повышением (рис. 3).

Предварительная адаптация к холоду усиливала ответную реакцию организма на норадреналин: отмечалось более выраженное снижение ректальной температуры у адаптированных к холоду крыс, по сравнению с контролем (рис. 3).

Температура в бурой жировой ткани изменялась в противоположном направлении. На 20-25-й мин после введения отмечалось максимальное повышение температуры бурой жировой ткани (у контрольных на 0,4 °С и у адаптированных к холоду животных на 1,4°С)(рис.4).

■ Контроль (изотонический раствор)

■ Адаптация к холоду (изотонический раствор)

- Контроль (норадреналин)

• Адаптация к холоду (норадреналин)

10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

Время (мин)

Рис. '4. Динамика изменений температуры бурой жировой ткани у белых крыс при ин-травентрикулярном введении норадреналина в терыонейтральных условиях (22°-25°С). Нулевая отметка соответствует исходным показателям температуры для контрольных -37,5+0,3°С, для адаптированных животных - 38,0+0,2°С ( * - различия достоверны по отношению к контролю при р<0,05).

Достоверные изменения температуры скелетных мышц наблюдались лишь у адаптированных белых крыс. Данный показатель при введении норадреналина повышался на 0,8°С по сравнению с исходным уровнем (табл. 2).

ТАБЛИЦА 2.

Изменение температурных реакций у контрольных и адаптированных белых крыс при интравентрикулярном введении норадреналина в условиях термонейтральной зоны

Исследуемая Контроль Адаптация к холоду

температура п= 12 п= 10

(«С) Исходная Опытная Исходная Опытная

бурого жира 37,5+0,3 37,9+0,1 38,0+0,2 39,4+0,2*

ректальная . 38,2+0,4 37,9+0.2 38,1+0,3 37,6+0,3

мышцы 35,5+0,1 35,8+0,2 35,7+0,2 36,5+0,1*

Примечание: *) - различия достоверны (при р<0,05) по отношению к исходным показаниям.

Возрастание температуры бурого жира, могло бы быть свидетельством стимуляция окислительных процессов в бурой жировой ткани под влиянием интравентрикулярных инъекций норадреналина, что подтверждается и повышением потребления кислорода животными после холодовой адаптации (рис. 2). Очевидно, что норадрсналнн активирует окислительные процессы в организме не только при периферическом (Зыков, 1982; Плотников, 1982; Соболев с соавт., 1994; ЬаП"апсе е.а., 1980), но и при ин-травентрикулярном введении.

Наблюдаемое понижение ректальной температуры связано с давно установленным фактом стимуляции вазодилатации поверхностных сосудов при введении норадреналина в боковые желудочки мозга (Бань с соавт., 1978; Турин, 1980; Пастухов, 1980).

Для изучения участия бета-адренергических рецепторов мозга в терморегуляционных эффектах норадреналина осуществлялась их блокада введением обзидана. Обнаружено, что при этом существенно изменяется термогенное действие норадреналина. Полученные результаты указывают на отсутствие повышения потребления кислорода, температуры бурой жировой ткани и скелетных мышц; наблюдается также снижение ректальной температуры у контрольной группы животных (рис. 2, табл. 3).

ТАБЛИЦА 3.

Влияние совместных интравентрикулярных инъекций обзидана и норадреналина на температурные реакции у контрольных и адаптированных к холоду белых крыс в условиях термонейтральной зоны (22"-25"С).__

Исследуемая Контроль Адаптация к холоду

температура п= 12 п= 10

(°С) Исходная Опытная Исходная Опытная

бурого жира 37,3+0,2 37,2+0,2 37,8+0,2 37,2+0,1*

ректальная 38,3+0,1 37,9+0,2* 38,0+0,2 37,2+0,3*

мышцы 35,3+0,1 35,7+0,3 36,1+0,1 35,5+0,2*

Примечание: *) - различия достоверны (при р<0,05) по отношению к исходным показаниям.

Исследования участия центральных бета-адренорецепторов в термо-генезе при адаптации к холоду показали, что после адаптации к холоду центральное влияние норадреналина на термогенез осуществляется преимущественно через бета-адренорецепторы.

Очевидно, что введение норадреналина в боковые желудочки мозга вызывает у адаптированных к холоду белых крыс более выраженный температурный ответ, чем у неадаптированных (например температура бурого жира и скелетных мышц у адаптированных к холоду животных повышается на 1°С и 0,5°С (соответственно) выше, чем у контрольных (рис. 4, табл. 2). Данное различие проявляется и в условиях блокады бета-адренергических рецепторов мозга: температура бурого жира, ректальная и скелетных мышц снижается на 0,5°С, 0,4°С и 0,2°С(соответственно) больше у адаптированных белых крыс, в сравнении с контрольными (табл. 3).

На основании полученных результатов, указывающих на различие температурного эффекта норадреналина при охлаждении (0°-+4°С) и в условиях термонейтралыюй зоны (22°-25°С): в первом случае происходит удержание температурного гомеостазнса, несмотря на охлаждение, на более высоком уровне по сравнению с данными без использования инъекций норадреналина (табл, I); а во втором - снижение ректальной температуры (рнс.З); можно предположить, что у адаптированных к холоду крыс влияние норадреналина при ннтравентрикулярном введении зависит от температуры окружающей среды, что также подтверждается и имеющимися литературными данными (Пастухов, Ерошенко, 1982; ВПйЬ е.а., 1979).

Таким образом, обнаруженный у адаптированных белых крыс дозо-зависимый эффект норадреналина при охлаждении (0°-+4°С) , а также более значительные изменения температурного гомеостаза по сравнению с контролем в термонейтральных условиях (22°-25°С) , позволяют говорить о повышении, в результате адаптации к холоду, чувствительности адреноре-. цепторов мозга к экзогенному норадреналину.

2. Влияние адаптации к холоду на общее содержание липидов и свободных жирных кислот в скелетных мышцах белых крыс.

Изменение температурных реакций бурого жира и скелетных мышц после адаптации к холоду в ответ на охлаждение и интравентрнкулярное введение норадреналина (табл. 1,2), могло бы свидетельствовать о возрастании окислительного метаболизма в этих органах и повышении их теплопродукции, что и проявляется в изменении температурных показателей.

Имеются доказательства, что жирные кислоты и липиды способны влиять на процессы ресинтеза макроэргических соединений в митохондриях и играют существенную роль в адаптивных изменениях термогенеза (Северин с соавт., 1960; Осадчая с соавт., 1983; Скулачсв, 1989).

ТАБЛИЦА 4.

Общее содержание липидов и свободных жирных кислот в скелетных мышцах белых крыс в контроле и при адаптации к холоду___

Исследуемый показатель Контрольная группа животных (п=11) Адаптированные к холоду животные (п=9)

Общее содержание липидов ( мг/ г сырой ткани) 10,28 + 0,07 8,20 + 0.04*

Содержание свободных жирных кислот (мкг/г сырой ткани) 88,92+0,12 92,25+ 0,06*

Примечание: *) - различия достоверны (ири р<0,05) по отношению к контролю.

На зависимость обмена липидов от длительного воздействия низких температур указывают и данные нашего исследования.

При адаптации к низкой температуре среды происходит снижение общего содержания липидов в мышцах на 21,4% по сравнению с контро-

_ 60 •■

50

40

30

20

10

,гО,гн,

лем. Данный процесс сопровождается достоверным повышением уровня свободных жирных кислот (табл. 4).

Адаптация к холоду приводит к изменению спектра свободных жирных кислот, которое свидетельствует о перераспределении соотношения между насыщенными и ненасыщенными жирными кислотами при холодо-вой адаптации в сторону повышения количества ненасыщенных свободных жирных кислот (рис. 5). Значимое увеличение отмечено для олеиновой (20,22%) и линолевой (8,21%) кислот.

Полученные результаты позволяют 70 т говорить как о качественном, так и о

количественном изменении липид-ного пула скелетных мышц при адаптации к холоду. Снижение общего содержания липидов может происходить под действием различных факторов. Одними из них могут быть: 1)активизация некоторых фосфолнпаз при температурных воздействиях (Брустовецкий с соавт., 1989; Алматов с соавт., 1995); 2) активация ферментов-десатураз, регулирующих вязкость мембраны за счет повышения доли ненасыщенных липидов (Хочачка, Сомеро, 1988). Этот процесс мог бы в определенной мере обеспечить и повышенный уровень свободных жирных кислот наблюдаемый в гомогенате скелетных мышц исследуемых животных.

Количественный и качественный анализ свободных жирных кислот в скелетных мышцах выявил увеличение содержания в липид-ной фракции пула ненасыщенных жирных кислот.

Данный факт можно объяснить возрастанием энергетической функции скелетных мышц у белых крыс после адаптации к холоду, о чем свидетельствуют ряд литературных данных (Ткаченко с соавт., 1976; Иванов, 1990).

Известно, что свободные жирные кислоты выступают как 1) субстраты окисления; 2) как разобщители дыхания и фосфорнлирования; 3) регуляторы функций ( в частности, транспортной) мембран. В скелетных мышцах адаптационное повышение теплопродукции на отдельный сократительный акт связано с увеличением тегшопотерн в отставленной фазе -ресинтезе АТФ ( Хаскин, 1976; Алюхин, 1987; ДакМепко, 1975). Данный процесс, возможно, обеспечивается действием свободных жирных кислот на ферментные системы мышечной клетки.

□

контроль

П адаптация к холоду

Рнс. 5. Содержание жирных кислот в гомогенате скелетных мышц (в % к общему содержанию свободных жирных кислот в контроле). Условные обозначения: 1-пальмитиновая; 2 - стеариновая; 3 - олеиновая; 4 - линолевая; 5 - арахидоновая; 6-неидентифицированные кислоты; * - различия достоверны по отношению к контролю при р< 0,05.

3. Влияние адаптации к холоду на активность ферментных систем скелетных мышц белых крыс.

Повышенное выделение тепла при мышечном сокращении может быть следствием высокой чувствительности к норадреналину тех метаболических процессов в мышце, которые обеспечивают ресннтез АТФ.

Известно, что тепловая мощность мышцы должна зависеть от количества функционально-активных редокс-цепей на I г ткани. Для количественной оценки данного показателя в скелетных мышцах крыс нами был применен, новый методический подход, основанный на определении активности ротенон-чувствнтсльной NADH-oкcидaзы в мышечном гомоге-нате. Такое определение стало возможным в результате применения кана-лообразующего антибиотика аламетицнна, формирующего во внутренней митохондриальной мембране поры, проницаемые для ЫАОН.

Нами обнаружено, что скорость ротенон-чувствительного окисления NADH на 1 мг белка гомогената не меняется при длительной холодовой адаптации (табл. 5). Это позволяет заключить, что у крыс длительная хо-лодовая адаптация не оказывает влияния на содержание митохондриаль-ных редокс-цепей в скелетных мышцах со смешанным типом волокон.

Определение влияния длительной холодовой адаптации на соотношение активностей ротенон-чувствительной ЫАОН-оксидазы и РоРг АТФазы в гомогенате скелетных мышц показало, что адаптация к холоду не изменяет активность НАОН-оксидазы, в то время как активность РоР|-АТФазы возрастает почти в 3 раза (табл. 5). Митохондриальная Н+-АТФаза обеспечивает два процесса: гидролиз и синтез АТФ. Можно предположить, что увеличение гидролитической активности Н+-АТФ-синтетазного комплекса без соответствующего увеличения КАОН-оксидазной активности связано с дополнительным синтезом или, что более вероятно, со структурно-функциональной модификацией молекул Н+-АТФ-синтетазы, затрагивающей механизмы контроля гидролитической активное 1 и.

Сократительная деятельность скелетной мускулатуры остается мощным источником тепла и после адаптации к холоду (Якименко с соавт., 1971; Ткаченко с соавт., 1976; Баженов, 1973; Иванов, Пчеленко, 1978; Иванов, 1989, 1990). Возможно, что при этом изменяется весь цикл ферментативных реакций, обеспечивающих процесс мышечного сокращения, особую роль в которых играют ионы кальция.

Исследования активности кальций-зависимой-АТФазы и скорости аккумуляции ионов кальция везикулами гомогената при адаптации к холоду показали, что активность данной АТФ-азы не изменяется, в то время как скорость аккумуляции ионов кальция резко снижается после длительной холодовой адаптации (табл. 5).

Наблюдаемое значительное снижение показателя Са/АТФ, свидетельствует о том, что в скелетных мышцах белых крыс при адаптации к холоду происходит снижение эффективности работы кальциевого насоса.

ТАБЛИЦА 5.

Влияние адаптации к холоду на активность некоторых мнтохондриальных ферментов и кальций-транспортные функции саркоплазматического ретикулума скелетных мышц белых крыс. __ .___

Исследуемый показатель Скорость окисления ЫАОН (нмоль ИАОН/ 1мг белка за мин) Активность РоР.-АТФазы (нмоль Р1/ 1мг белка за мин) Активность Са2*-АТФазы (нмоль Р1/ 1 мг беяка за мин) Скорость аккумуляции Са:* (нмоль Са2*/1мг белка за мин) Са/АТФ

Контроль п=25 12,7+4,5 31,8+7,4 138,4+15,2 269,8+8,1 1,95+0,21

Адаптация к холоду п=28 12,4+4,4 93,1 + 14,3* 142,0+16,3 145,5+7,4* 1.02+0,12*

Примечание: *) - различия достоверны (прл р<0,05) по отношению к контролю.

Согласно литературным данным способностью транспортировать ионы кальция обладают некоторые жирные кислоты (Осадчая с соавт., 1983; МеББшеое.а., 1984).

На примере липосом "нагруженных кальцием" мы исследовали проницаемость липидного бислоя для ионов кальция в присутствии жирных

кислот ( пальмитиновой, стеариновой, олеиновой). Проницаемость для кальция через липидный бислой увеличивает лишь олеиновая кислота. Вероятно, ненасыщенная алифатическая цепь этой кислоты способна изменять высвобождение ионов кальция за счет "разрыва" мембранных структур и посредством этого увеличивать кальциевую проницаемость (МеБвшео е.а., 1984).

В связи с этим, жирные кислоты можно рассматривать не только как пальмитиновая; 2-стеариновая; 3- главный субстрат окисления на холоде олеиновая кислоты; стрелкой обозначе- й как разобщитель окислительного на добавка: Л-суспензии липосом; К- фосфорилировгния, но и как физиоло-кислоты; Са2+-1мМ СаС12 для калибров- гический регулятор транспорта ионов ки; АЛМ-антибиотика аламетицина). кальция в мембранах саркоплазматического ретикулума.

Таким образом, адаптация к холоду приводит к изменению как некоторых показателей липидного обмена, так и активности ряда мнтохондриальных ферментов и кальций-транспортной системы в скелетных мышцах белых крыс. Предполагается, что ненасыщенные свободные жирные кнс-

Рис. 6. Влияние жирных кислот на проницаемость билипидного слоя для ионов кальция.(приведены кривые записи спектрофлуориметра: 0-беэ кислот; 1-

лоты могут быть одной из причин наблюдаемого снижения скорости аккумуляции ионов кальция везикулами гомогената скелетных мышц после холодовой адаптации.

ВЫВОДЫ

1. Длительная холодовая адаптация повышает чувствительность центральных адренорецепторов белых крыс к экзогенному норадреналину. Терморегуляционные реакции на интравентрикулярное введение норадреналина у .адаптированных к холоду животных носят более выраженный характер относительно контрольных.

2. Интравентрикулярные инъекции норадрсналнна при охлаждении повышают устойчивость организма к низкой температуре среды, а в термонейтральных условиях, наоборот, происходит снижение ректальной температуры у животных. Таким образом, терморегуляционный эффект интравентрикулярных инъекций норадреналина у белых крыс зависит от температуры окружающей среды.

3. Адаптация к холоду повышает эффективность температурных реакций в бурой жировой ткани и скелетных мышцах белых крыс в ответ на охлаждение, вследствие чего происходит развитие резистентности к низким температурам. Данный процесс свидетельствует об увеличении активности окислительных метаболических процессов в этих органах. Интравентрикулярные инъекции норадреналина стимулировали наблюдаемые изменения, предварительная блокада центральных бета-адренорецепторов элиминировала действие норадреналина, что позволяет предположить наличие преимущества центральных бета адренорецепторов в опосредование норадренергического эффекта.

4. Длительное холодовое воздействие изменяет некоторые показатели липидного состава скелетных мышц белых крыс. Существенно возрастает содержание ненасыщенных свободных жирных кислот: олеиновой и лино-левой; снижается общее содержание липидов на 21,4%.

5. У белых крыс адаптация к холоду повышает активность FoFi-АТФазы в ~3 раза и уменьшает в 1,85 раза скорость аккумуляции кальция в мышце ш. triceps surae, что вероятно свидетельствует о снижении эффективности работы кальций транспортной системы в результате длительной холодовой адаптации. Одной из причин изменение активности ферментов и транспорта кальция, может быть увеличение содержания ненасыщенных свободных жирных кислот в мышечной ткани.

6. Предполагается, что адаптация к холоду повышает норадренерги-ческий контроль сопряжения терморегуляционных процессов в бурой жировой ткани и скелетных мышцах, что обеспечивает эффективное поддержание температурного гомеостаза организма.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Михайлова Л.Р. Норадренергнческий контроль температурного гомеостаза при адаптации к холоду // Тезисы докладов III обл. конф. молодых ученых и спсц-тов по актуальн. общеполит. и науч. техн. проблемам. Иваново, 1989. Т. 1. С. 15.

2. Михайлова Л.Р. Участие центральных норадренергических структур мозга в регуляции температурного гомеостаза белых крыс при адаптации к холоду II Тезисы докл. 1У обл. конф. молод, ученых и спец-тов по актуальн. пробл. 11-12 мая, Иваново, 1990. Т. 1. С. 83.

3. Баженов Ю.И., Михайлова Л.Р. Участие норадренергических структур мозга в терморегуляции при адаптации к холоду // Физиол. ж. СССР. 1990. Т. 76, № 4. С. 523-527.

4. Ритов В.Б., Горбачева Л.Р., Твердислова И.Л., Лейкнн Ю.Н., Баженов Ю.И. Ротенон-чувствительное окисление КАОН и активность РоРи АТРазы в гомогенате скелетных мышц крысы при термоадаптации II Биохимия. 1993. Т. 58, вып. 11. С. 1779-1787.

5. Горбачева Л.Р., Кормилицына Н.К. Влияние адаптации к холоду на некоторые биохимические показатели плазмы крови и скелетных мышц белых крыс // Тезисы докл. 3-й Междунар. и 6-й Всеросс. научно-практ. конф, "Экология и охрана окружающей среды" , Владимир, 1996. С. 119120.

6. Горбачева Л.Р., Баженов Ю.И. Липидный обмен и кальций-транспортная система в скелетных мышцах белых крыс при адаптации к холоду // Тез. докл. Ш-го съезда физиологов Сибири и Дальнего Востока. Новосибирск, 1997. С.44.

7. Горбачева Л.Р., Кормилицына Н.К. Соотношение липидного обмена и транспорта кальция скелетных мышц белых крыс при длительном холодовом воздействии // Мат.конф. " Молекулярно-клеточные основы кислотно-основного и температурного гомеостаза: физиология,биохимия,клиника". Сыктывкар, 1997. С.73-77.

8. Баженов Ю.И., Горбачева Л.Р., Ритов В.Б. Влияние адаптации к холоду на липидный обмен и транспортные функции мембран скелетных мышц белых крыс // Росс, физиол. ж. им. И.М. Сеченова. 1998. № 1-2. С. 96102.

Подписано к печати 27.03.98г. Формат издания 60x841/16. Печ.л.1,25. Усл.п.л. 1,16. Заказ 893/р. Тираж ЮОэкз.

Типография ГУ КПК,г.Иваново,ул.Ермака,41.