Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

GTP-связывающие белки легких, взаимодействующие с аденилатциклазой, рецептором ANP и актином

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "GTP-связывающие белки легких, взаимодействующие с аденилатциклазой, рецептором ANP и актином"

V) А> О

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МВДЩШСКИХ НАУК КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи

СТАРИКОВА Марииа Геннадьевна

СТР-СВЯЗШАКиШ БЕЛКИ ЛЕГКИХ, ВЗАИМОДЕИСТВУРШ С АДЕННЛАТЦШШЗОЙ, РЕЦЕПТОРОМ АКР И АКТИНОМ

03 30.04 - Биологическая химия

А в т о р й ф о р а т диссертации иа соискание ученой степени кандидата биологически наук

МОСКВА - 1992

Диссертационоя работа выполнена в лаборатории молекулярной эндокринологии Института экспериментальной кардиологии К1Щ РАМН.

Нвутий руководитель: Научные консультанты:

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук, старший научннй сотр.' дник М.П.Панченко

доктор биологических наук, профессор В.А.Ткачук, доктор биологических наук, старший научннй сотрудник С.А.Хорвва

доктор биологических наук, профессор Л.С.Соболев, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник И.Л.Гривенников

Ведущее учреждение: Институт Эволюционой Физиологии и

Биохимии юл.И.М.Сеченова

.Защита состоится

и//п АбШ^9Э2

года в. // часов на

заседании Спениализированого Совета К 001.22.02 в Кардиологическом научном центра РАМН по адресу: 121052, Москва, 3-я Черепковская ул., 1Ба.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке . Кардиологического центра РАМН у- .

Автореферат разослан У" . См/с^. 1992 г; •

Ученый секретарь Спвциализироввного Совета, кандидат биологических наук

Втрпяпет|

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Рецонтори многих гормонов (агонистн I- и p-йдренергических, мускариношх холинергиччеких, оо^х.тонино-зых, гистаминових и др. рецзпторо») сопряжонн. п момбране с км-л -зтвом СТР-свяэиваюцих болтов (G-белкоп), которшо модулирук.'Т ыстк-зность внутриклеточных оф^екторних систем, таких как адонилатцик-паза (АС), фосфолипазн С и А.?, нонншз каналы, сОМР-р-ависимая jcc-[юдизстораза и др. (Birnbaumer, АЪгшгкжКя, Brown, 1990]. G-бглки [моют гетвротримерную структуру. а-Оубмдшпшя G-белка oô.wior ЗТР-связывпндим участком и СТРазноЛ активностью, р- и ]Г-суОъодюшщ« обоспочивают пзаимодоЛстпио 0--болка с рецептором. Звизиванио гормона или огонистя со специфическим рецептором пнзи-•аот обмен О DP на GTP в нуооотидсрязшзпщем центре О-белка, сопряженного с sтим рецептором. При этом, геторогример G б,>лкп дис-хт.иирует на a-GTP и ру-комилекс. Свободная а-<»1Р взпимодойотвует 3 :>Jit>;KTOpoM , ШЗНПОЯ ПОрОХОД ВТОГО ЯЭДчКТОра н нокч» Функиио-!НЛЫЮ0 СОСТС 4110. ГИЛ[ЮЛИЯ GTP ДО Орр И Р 1фИП0ДИТ к днс?оциа-UU1 п-УРР ОТ ^{tJOKTOpmn СНС l''"*f 'ii И Р'^Н-СОШШЦИИ а-СубТ?ДИ1!«1Ш с !•>• к^милнксом. h ре.чультчто цр исходя! .-,<1р-т<опяиип или доррллчиия »торпнчх 1!ос]^ч\инк','!1 : сДМГ, cCVP, ijp"\mvkto« ¡псфошкч'гтлдного У^'-НЧ, ПУОЛ в клотку или мобилизация 0нЛ* .

В клетках '.-укариот рксяр'ччтуотся <*'!л»о PO ирчлсттнполнй

jt'MnflCTI'n НИЗКОЬ'ОЛ'Ч'УЛНОйЫХ <ji Р-СЛМОиь'-М'МХ Ф; rrjVi;-('l'.ï'^.i-; ,

.'олркуляпнпй массой гя-'М rih (ВчгЬаоЫ, r>37J. Помимо ■галп1Г.'л>фиоЙ масс», ллрпкторнмм отличием SMG-.1->л'ссп от rç.<Чгь.ев

->Ч.'1Я"Т1-.Ч ОТСУТСТВИИ мультисуб! РДННИЧНОГ! ClpVKTypV И поолхолин 'СТЬ ИС'11!'.'ШИГ'5ЛЬИ0Г0 *Я1КЯ ДЛЯ Пр^ЯКЛОННЯ Glbl.MI':» Wl'Hni.'Oi"'-!'. :м1|_<5(>дки вовлечены в оботечони" таких клоточннх ирср»с'">п чяи ГЮ"Т, ЛИфГ'.'роНШфОВКО, Ь'ЧМ'КулирНЧЙ ТГЯИГГСРрТ и СИ'! "!»*•! <i>!-,0Y з(; а1„ 199В) к но мохани:<мч регуляции ¡»г»'* щч.чичу'ов рм : -'••«•лкрмп по сих пор на расшифрован)!.

• 1)у)'кцч"и;ич-поо сапря*:енн'> G- и "MG белк^н с p<>:!oin-"p-Эф1юктсрнци'.1 С И О гонами KJ10TK4 ЧГ»МПНЯ«ТСЯ При порог-) [V.-Пкпх -

иого иитпекол"га - мгкротруЛяок т^улнна и mшчочих Mfi-|vvj5!.|4. ччитпи. Л спои оч о роль, сборка 'рялам-"Ч1 "M» и мгкр-и-р). '<—mt: p^'v.ih-

.руется 0- и БМО-белками Лавеп1ск, 19917 . Однако, как покг

зыигют анализ данных литературы, вопрос!/ взаимодействия 0-БМО-Оолков с белками цитосколета требуют дальнейшего изучения.

В предварительных исследованиях мы обнаружили на~ичие С-БЬИ-болков но только в мембранной, .:о .и в цнтозольной фракцш При этом, функциональная роль цитозольных белков изуч01 недостаточно.

В легких млокопит ыцих выявлены рецепторы для секротируемо] предсердиями атриального натрийуретического пептида (АМР), горм. на, который стимулирует активность гуанилотциклазы (СС) во мноп 'тканях. Однако, как было показано на гладкомыщечзшх клетка: 'клетках коры надпочечников и кардномиоцятах, АИР способен ] только стимулировать активность СС, но и вТР-зависимым образ ингиОировать активность АС [Дпапс1-3г1уав1ауа, 1986].

Цель работы. Целью нашей работы было исследован ■структурно-функциональных свойств С- и йМО-белков легких, работе были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1) идентифицировать и оценить количества С- и ШЬбелк вкспроссирущихся в легочной ткани;

2) оценить распределение данных -белков между цнтозольной мембранной Фракциями клетки; выявить условия, приводящие перераспределении С- и БМС-белков межл"' мембраной и ■цитоплазмой

3) ьыявить возмс^аюа взаимодействие штозольшх б-БНО-белков с болком цитоскелота актином;

4) проверить участие мембранных в-белкоа в механиг ингибирования ндошиштциклазы легких атриальным натрийуретичесь пептидом на примере альвеоцитов второго порядка (А2П) секреторных клеток логких.

Научная новизна и практическая значимость работы. В разум то проведенного исследования показало, что некоторые 0-БМО-болки могут взаимодействовать с актиловим цитосколетом. Ей; лены две вф1«кторныа системы - едашшйтциклаза и гуагшлатцикл',: участвующие в реализации рогуляторного сигнала лКР в альвеоцт второго порядка. Настоящая работа является еще одним шагом в р: ■витии современныхпредставлений о структурно-функциональной ор>

низации G- и SlfG-белок-управляемых сигнальных систем клетки. Полученные данные позволяют прогнозировать изменения в гормональ- . .ной чувствительности аукариотической клетки при патологически! состояниях, а также при применении лекарствепнихпропаратов.

■ Апробация работы. Результаты работы били представлен на VI Всесоюзном симпозиуме "Роль циклических нуклеотидов и вторичных посредников в регуляции ферментативных реакций" (Петрозаводск, ' 1988), Международном симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур" (Москва, 1089), Советско-японском симпозиуме "Рецепторы: структура и функции" (Москва, 199Я), всемирной конкуренции по легким (ВозЮп, 1990)..

Публикации. Г1о тема пнссортации опубликовано 7 работ.

Структура объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов.и объектов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов й списка цитируемой литературы ( ссылок). Работа изло*'.ша не ■

стран jax машинописного текста, иллюстрирована _ рисунками и таблицами.

ЭКСПЕРИМЕНТ АЛЫШ1 ЧАСТЬ Материалы и методы

Выделение плазматических мембран и цитозоля из легких свиньи • проводили, как описано в работе.Tkachuk с сопвт. (1.^9).

Первичные культуры зндотелмчльных клоток из сооудоа аорты человека были любозло 'предоставлены А.С. Антоновым (FKHI1, Москва).

' 32

{_PIADP-рибозилированио С^ и SMG-белксв бактериальными

ADP-рибозилтрансфэразами проводили в течении (Ю кип и к Л мкл. среда, содержащей 50 мМ TpiM-HCl (рН 7.S), 1 мМ ЯЛТА, 2 мМ VgOl , 10 мМ дитиотройтол, 10 мМ тимидин, 10 мкМ NAD, 1 нЧ NAPP, I мМ ATP, ?. мкКи I32P1HAD, 100 мкМ гуннилового нукпоотида, 60 мкг/мл холерного токсина, 20 мкг/мл коюиганого токсина или 5 мкг/мл бо~ тулинического С3 экзофермента, б - 100 мкг белка мембран или цитозоля.

Обработку клеток,коклюшным или холерным токсинами проводили при 37"С в течение 120 мин п'средо, .содержащей холернчЧ njm кок-

- о -

лшшй токсшш в концентрациях 1 мкг/мл или 0.6 мкг/мл соответственно.

Измерение внутриклеточного содержания сАМ? и cGMP. Клетки вкс ^агнроьали 1 мл горячего раствора - этанол:вода (2-1). Экстракт упьрииили, 'растворяли в 100 мкл Трис-ЭДТА буфера и использовали для определения oAJiP и cGMP с помощью наборов фирмы "Ameraliam".

Определение актш мости аданилатциклазы проводили в среде (коночный объем 60 мкл), содержащей: 50 мМ Трис-HCl (pH 7.5 при 37*С), 120 мМ NaCl, 1 мМ cAMP, 10 мМ креатинфосфат, 0,25 мг/мл кревтшшкнази, 0.5 мМ З-изобутил-1-матилксантин, Б мМ MgClgt 1 мМ дитиотройтол, 0.1 мМ АТР, 2 мкКи (азгР] АТР и 10-15 мкг мембранного белка. Пробы шгкубировали 10-20 шн при 37°С.

F-актин-зависимое гвлообразованиа в цитозольной фракции про-

■ водили по Pollard, Cooper (1982).

Тритон Х-ЮО-зависимую экстракцию клеток проводили по методу ОвЬогп, Weber (1977).

Ишуио- или [q3gP] GTP блоттинги с Q- и SMO-болками проводили посл-j их разделения электрофорезом в 12!« ПААГ в присутствии DS Na и шшктроперсшоса но нитроцеллюлозу по метода Towbin с соавт. (1979).

Высвобождение G^ и SMfl-белков из мембран проводили в течение 60 мин при 37°С в буферных растворах с низкой ионной силой (pH 7.5) в отсутствие и в присутствии Б м).1 MgCl2, как описано в работе Панч'знко с соавт. (1902).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Идентификация G- и SMG-белков в легких, их взаимодействии с актином. Некоторые G- и SMG-болки обладают спскЗностью подвергаться химической модификации бак i ыриальнша ADP-рибоаилтрансферазами, которая заключается в переносе ADP-рибозы с NAD на G-белок. Используя t32PlNAD и различные ток-

■ сины мокно идентифицировать . чувствительные к втим токсинам СТР-связывавдие белки.

В плазматической мембране и цитозоле легких холерный токсин

•(XT) выбивает ADP-рибозилировашш 42 и 45 кДа форм а-субъединицн

Од-бвта (рис.1). Креме того, в цитозолз XT ADP-рибозшшрует также белки с молекул. ; ними массами 55-57 кДа.

В этих же препаратах коклюшный токсин (КТ) ■ вызывает ADP-рибозилирование•40 кДа а-субъединиц G -белков (рис.1).

Анализ XT- и КТ-чувствительных белков иммуноблоттиигом указывает на наличие в. мембранах и цитозоле легких двух изоформ а-субъедгашцы 0 - белка: 42 и 45 КДа, а также выявляет а-субъединицы трех известных С1-белков: 41 кДа a^i 40 кДа al2 и 41 .кДа a g. По данным иммуноблоттинга п легких но выявляется a-субъедшшца G -болка - основного КТ-чупствителыюго G-белка головного мозга. Ш в мембранвх и в цитозолз присутствует, р -субъединица с молекулярной массой 36 кДа. рг-Субт,единица (35 .JIа) выявляется лишь в мембранной фракции (рис.1).

a-Субъеданицы Gj- и Со-белков могут быть ADP-рибозилированы ксяшипшм' токсином только после сопряжения этих белков с ^-комплексом [Oilman, 1987; Blrnbaumsr, 15901. Такие гуаниловне иуклоотиды, как GDP и его стабильный Яна.", ;' GDPpS, стабилизирующие гетеротркмер G-Oojaca, усиливают ADP-рибозилирование, а негид-ревизуемые аналоги GTP - Gpp(NH)p и GTP7S, вызывающие диссоциацию гетеротршера, ослабляют эту модификацию G -белков.Потенпиирова-ниа КТ-зависимога ADP-рибозилирования о^-субъедгашц под действием GDPpS и ослабление ого в присутствии GTP7S (рис.1) указывапт не функциональное сопряконио с^- убъедишц с ру-комплексом. В пользу существования этого сопрякония в цитозоло говорит и тот факт, что вкзогешшЛ Р7-К0ШШКС не усиливает КТ-эависимого ЛПР-рибозильрорания.

Ботулийичедкий окзоформент С3 (ВС3) в мембранах и цитозоло легких ,АВР-рибозилирует 24 я 26 кДа SMG-белки, относящиеся к' семейству гЬ.о/гас-белков. Методом GTP-блоттингя как в мембранной, так и в цитозольйой фракциях легких выявляются 19-2G ■ кДа SMG-белки, связывающие GTP на нитроцеллюлозе. (белки нитроцеллюлозного связывания). Мотодоп гатауноблоттинга выявляются газ-, Gp-f ARF-' и. гас-белки. SMG-белок зес4, регулирующий в дрожках образование' секреторных' везикул, в легких не обнаруживается (рис.2).

AUF -рисюзплирование XT

MfjMdpíiiiu

Питозоль

ы,

-хг

!Л

CÜ.

&

a Pi

О Сэ

О,

Ii а

о о

<0-

&

■ t; л, ipAf

#VȒ

+АТ

kDa

55 43

36

л,

VI

tn.

i ■ Й & & а в

' о ta о и «

■У-Г'Г- Ш ( t'f»' Й

:?¡.< ■

-xr

+J.T

ADP —РИ00ЯИЛН]Х1И'ПЛ.ИО KT l.loiviöpaiin Цитозоль

"V-

■Й

о

m ■

ах

fe «

о

55 43

36

В &

о и

i):> -'M»,

i./UWjlïS

-KT

t-кт

ИммуЛ0бЛ0ТТ1Ч]Г

-KT

+KT

\

KDa

Giia

, га

Oj За

V1

Opt

m

i^-rr— ïf \ fe. •"'•-• ''■]

mXii-ы '^..J-iitii . .Л-.&'.-н CwPi.

1 2 ■ . 1. „ 2

1 2

1

I - renfipaim, 2 - пито толь.

í'ho.I. И;'рити<Т икания G-rSc.yor< в легких мфньи.

АШ" -pililo зи-лирование ßC«j

атр-блоттиш'

kDa 29

к.

i.

i .;

f..i.

/у -..'•

'■'г

t

•V.

kDa 29 -

12

Иммуноблоттиш'

Г<"» • AÍÍP гво ыа0'1

10 - Г" v.; = ^ • i¡Y: . .J ч '

Mi.','--i/.'IV-i.j^VJví '...i1,'i

<

2 1 г \

\ - MPMrtpanu, 2 - штозоль.

^па.г. Идтп'иТикатш зка-йолкпп л'легких ср.чнмГ.

В альвеоцитах второго•порядка, выделенных из логких крысы, выявляются: 42-45 1сДя дублет а---'бъединицы G -белка

в

(АЫ'-рнбозилироианием ХТ и иммуноблоттишгом); 40-41 кДа al2- и ■ а^ субъодиницы (но не а^-субъединица) С1-бежов (АРГ-рибозилиронаниом КТ и • имм. лоблоттингом) и 36 кДа р -субьоднница G-Оелков (иммуноблоттиигом),

Можно полагать, что выявление • G-. и SMG-белков как в мембранной, так и в i итозолыюй. Фракциях легких в ' определенной степени отряжает росиродоленио этих белков, существуйте в живой .клетке.

Как известно, субклеточная локализация G- и SMG-белков ' зависит от . постгрпноллщюшш модификаций этих бежоп -м^рястоилированне но М-концу а-субъодшшцы и иэопрешушровяние по О-концу Т'-суОт.едшшцы G-белков, a также подиизопронилирсввниэ и метилирование но С-концу SMG-бллкон приводит к: их ■ переходу из ишоилазмы в идя^матическуг! мембрану. tSteniwela, 1990; Hall, • IWI. Частично, высвобождение а-суб'юдшши из' .балка макет происходит.при стимуляции С-болко» гормглфецопторннми комплексами fR'HÚb^j.J, 19851. Для некоторых SMG-белков показана диссоциация из мембран после фос*]орилирования нротеинкинпзами [Lfipetina, 19893.

Высвобождение а-, но не р-субъедишш G1 и р -белков из 'момбрчн б раствор происходит при Щ'-*-зависимой стимуляции мерянных <}-0олков под действием • негидфолирувшх аналогов , GIT - OppíNIDp и G'fPrS (рис.3}.

Наличие • в исходном цитзоле . лёгких а- и р-субъединип G <1».»ков, a токко различных 5MG-белков указывает на возможность оуиесп'еншшя и другого механизма вчсвобокдения G- и SMG-белков ил в цитоэоль. • ¿ушщиональное с-'рютекие at- с

р-суб'Чд'^'ницей в нитозоло . предполагает, что этот механизм шев'-'л'чклэния G-бодкор непосредственно но связан, с Utf -tjTP-зштсиг/'Л диссоциацией моьорэшюго гетеротриморэ.

Эктгрекцая плазматически*. м'.-мбр'ан расгвором низкой нашей силн. с-олергтим 1 мМ ЭДТЛ, гыжнаот высвобождение из момбрян в раствор не только 40 кДа at~ и 3G кДа р-субъедшшц., но и 43 кДа ' актина (рис.4). Вероятно,■ н мембране G -белок способен воаимодой-

m

«S

- 11 -Иниуноблоттлнг

Осадок

Суп'тиютинт

to

ах

О,

•V 1

Р-1 Е* а

о. О _ о

m

y ^ЬМ -• , , • , ,

(fzr* «*0.-<«Sλ

СЧ

Иса.

a

о

¡H ç< Cl о .

'V 'I i ' ' u

Нпдупнропаиное ноглдролизуемчмгг аимогаи GTP тщсвп-бождешге йз мембран в раствор a.- if р -с.убгпдитщ о-белков. 'Среда ¡ппсубаь-ш? .мргО'оял содержоля 5 t.''i M*;v i_2 , Ус."01чш инкуба-шш мембран: I мг/мл белка, 37°С, вП глш, рН 7. Г).

ствовать с актиновымн филаментами, а деголимерипшдоя -связанных с мембраной актйновнх филамонтов (переход F-актана я fî-aктт) сопровождается. ви^гюбокдешюм из мембран Соболка.

Окраска Кум^ои 0-2Ш ...../П'^.

Ш

Актин

• r'i S

•ils

Шмуноблоттинг

ai

ЕШ

ш

i г

Рис. .4. Быслобо;кдрн1;о актина и субголнпш г,-белка из мембпап в тотиор nor, л^гпнгем ш'пг.еП ионной сил;!. I п Й - ооа/ок и суперяптаит, плл<"гоггнчб пост ^"стр-исасг не:-годк.'х .".-»vdniH рпстяопоа йонно:; оадч.

[ т.;'.' ОД'ТД-.' Условия- iviKvri.-y;;»! мембран: I »лг/"л оелка, 37еС, 60 тЛ 7.1, - • .

На основании втого можно било' предположить, чтс полимеризация О-актшш в Р-актин приведет к тому, чтс цитоаолышй выбелок и Р-вктин при ультрацентрифугировании цитозолл будут. соосаждаться. Действительно,

МйС12+КС1-индуциройалное образование Р-актшш в цитозоле полученное из легкого свиньи, сопровождается соосакдешшм пр] ультрацентрифугиров&нии • 40 кДа с^- и ЗС> кДа р^субъвдини С-болка (рис.5). С Г-актшюм соосавдаются также белки актиновог*

Окраски К-.'маооп й - 2СО Миозкн-

Виыоткн

ГГГ5 те

1 ■ - ■

. — к»»

*

йаад,' »''и. >

■1 2 3 4 :

АВР-рибозилироиы'.ии 1и' п ВС-

гЬо/гас

¿У .¿г ? ! Т 2 3 4 5

Группе "от»';»')'

г

4 о

29 к!)и

ОТР-блэти.!'

1Й ¡Ц>а

I

-

. -Ул'"»

! ■ О»

Л 5

Рк1.5. . Г- ПКШНЗсШИСИКое ра^преДсЛОИ;») пито-голиых

й- ,< -31.0-белки».

I -• 11,}хо;поЛ( ! ало золь; Я и 3 - о.уийрнчтпнт '/, ооадок на • 1ШЛ 00 в поояч лг^уоац'ш иитюья и ут^ути'лшв ЫвС12-»кс1, 4 и 5 - сушфшхтант и осадок н.1 Н'иЛЯЮе посла инкубации ПИТО ЗОЛЯ в П(.1(1)У2''П'ИКИ 5 Ц!Ь6-012+ 100 мМКС1,

цитоскелата - 200 кДа миозин и 55 кДа виментин. ■ Пместе с Р-актином количественно соосаадаются и цнтозольнш SM«-белки, выявляемые •; GTP-блоттингом. Напротив, БС3-чувствитолышо белки цитозоля в гораздо меньшой степени взаимодействует с ?-ек".шоц: лишь около 20% атих белков, обнаруживается во Фракции }' -патан. Контрольное прогревание логичного цитозоля (в отсутстьиа индукторов полимеризации G-иктшш). iw приводит ни к образованию актиповых филамантав, ни к осаждогаш пар^числошшх Солкой.

Ещо одно подтверждение, возможного взаимодейстыы G- и SMG-белков с белками цитодкелета .могло бить тлучено в модальном эксперюкште по' окстракцни клеток тритонам Х-100, которая позволяет селективно соЛиУчшзировать соде ритмов клетки, оставляя нерастворимым е.- цитоскалет (Oobom, Weber, 19У7). Для атих опытов наиболее ■ удобными оказались культивируемые индоголиалыши клетки из аорты человека. В тритон Х-100 нерастворимой часта клетки выявляется манерные цитоскалотныо белки: актин, виментин, миозин. Окал; 20%, содержащихся в эндотелии а^- н р-субьедшшц G-бэлкоп, a tuküo GMG-болкоц, выявляемых ОТР-блоттингом, содержится- и тритон Х-100 нерастворимой фракции. В свои очеридь БС3-чувствитель'ны9 белки не шяпляйтся в связанном о йктинорым цитоскелетом состоянии (рис.6).

Таким образом, полученные шсспорцмонталышо дылшв свидетельствуют, что со-о раадио" я в цнтоосле легких ö -болки и SMG-болки нитроцеллвлозноГо связывания способны пзаимод^п повать с актшювым нитосколотсм. Можно предполагать, что нгпимояопоткиа цитозпльннх белков с F--актином может влиять на сопрягшие дпншя белков с эффекторами '(например, фоиГолшоптм С или А ) или регуляторннми 'белками, стимулирушимн GDP/GTP обмен или GlTivwyta активность G~ а SMG-белкоа'.

Окросла. Кумаоои О-200 кОа

А^'-рибознлиропшше КТ

г?*

I * < у «

67

43.

36 -

29 24

20

«л—.-Виментин I _Лктнн

я,

I 1,

I 2

а.—«;--- . -■:.

Иммуноблоттипг

. . I 2

йтг -<ь0ттп1г

кБа . 29 -

18

: . * «

1 2

А1)Р -ри(5осшлм|Юишшс

гЬо/гес —

Гис.6. Содрргпиио а- и зка-белков и тритон Х-100 растглрймо1Г и нерастворимой Фракциях эндотелия аортн.

1 - тритон Х-1Ш'раотнорклал (¡.ршишя; , •

V. - тритон Х-'1Ш нерастворимая (Тракния.

■ С^белок-опосредовэнное проведение ингибиторного сигнала А1ГР

а аденилатциклазу в альвеоцитах второго порядка (А2П)., Актив-ость АС в мембранах, изолированных из А2П, . ри действии простаг-эндина Е1 'повышается в 2.5, р-аготшста кзопротеренолп - . 4' и орсколина - в 25 раз. АтриалышЙ натрийуретичоский пептид (АИР) нзывает достоверное 30.56 ингибироваше агокист-стимулировэшюй, о не базальной активности АС. Как стимуляция, ток и торможение ктивности АС под действием гормонов происходят только п присутс-вии активатора 0-болков - СГР и подавляются в присутствии инги-итора С-белков, стабильного аналога '"ЭР - ОБРрЗ. Форсколин-тимул;фованная активность АС менее чувствительно к ингиблторному юздействйя 00РП5 (табл.1).

Таблица 1

1ЛИЯНИ0' АИР, изопротеренола, простчгландина Е, и Форсколина па ¡ктизность аденилатциклоэы в мембранах А?,П

Добавки Лкывншль (пмоль сАМГ/мин ли------------------- на мг белка)

без добавок 50 мкМ изо-щюто ренол • 10 нгЧ проста-гляндин Е1 10 >/"'!' фо]"г.-К0 ЛИН

Без добавки 7.70+0.85 32.4±1.3 18.5+0.7, ' .0

5 ккМ-АКР 6.70+0.75 23 Л¿1.4* 13.3+0.4* 135.С+4 .0*

100 мнМ СБРрЯ 5.30+0.30 5.62±0.54 5.Б0±0.35 !.' 5.0±5 0

5 мкМ АМР+ 100 мкН ОСРрЗ fi.41t0.65 5.80+0.35 • 5.35+0.45' 123.0+6 0'

Активность АС определяли'в стандартной среде инкуФн^л, содэряа-дей 10 мкМ СТР. * - указывает на достоверность различий в присутствии и в отсутствие АНР; *Р <'0.01.

Кпгибйрущий эффект АКР на ипопротпрдиол- и фарсролин-стимулированнуи активность мембранной АС устраняется поело с1рз-Зоткя А 2й КОКЛШ1ШМ токсгаюм, котороыН, АРР~рттбоз;шфуя

а •субъи.щгышу С1-Сал1С ), переводит ого в неактивное состояние.

Модификация 0 -белка под действием холерного токсина, который переводит данный белок в необратимоактивированное состояние, но устраняет ингибиторное влияние А№Р на активность мембранной АО (табл.2). .

Таблица 2

Влияние коклюшного (КТ) или .холерного (ХТ) токсинов на чувствительность аденилатциклазы к АМР ,

ГОШШость AU (пмоль сАМР/мин на мг белка]

без добавок 50 мкМ изо- .10 мкМ форс__протервнол ко ин

Контрольные Ео.а ANP к лутки 5 мк.М AIÍP

Клетки, обработанные КТ

Клетки, обработанные ХТ

Без ANP

6 мкМ АШ> Без АКТ

Б мкМ ^ГР

I0.2tl.0 0.75*0.1

17.3+1.4

16.7*1.О-53.0*0.5

43.1*1.5*

42.7*1.8

30.3*0.1*

¿47.0*9.0 178.0*3.0*

59.0*4.5 ' 354.0*13.0

54.5*4.0 360.0*16.0

64.0*3.5 ' 500.0*45.0

45.5 *0.6* 409.0*20.0*

* означает достоверность (*P < 0,001) ингибиторного рффикта ANP на Ийопроторонол-, фороколин- или ХТ-стшулировяшгую активность '■ АС.

Ингибиру'пцев влияние ANP на активность мембранной АС в А2П коррелирует с АМР-эависиуч понижением уровня сАМР в отих клет-, kíix. Повышении. концентрации ANP приводит к зависимому от концентрации гормона 2-х кратному сиишшш изонротеренол-стимулироь яшо-го уровня сАМР в А2П; концентрации ANT, вызывпмдая полумпшЫаль-иь'й пнгабиру гадай эДОюкт равняется 10.нМ. Обработка клеток'коклюш--ним токсгчом устраняет ANP-зависимое снижение концу играми сАМР в A2ÍI. Ингибирущий оф1«кт ANP но проявляется на бязалыюм уровне внутриклеточного сАМР (рис.7).

- ч-

250 г

§ 225 г

<о 200

о

а

X

175

3 150

® 125 /

*■ иэопротер'чюл

ГО М}«

^--

11 10 9 8 7 Чод (АМР),М

шой

Рис. 7. АИР -:-'л.")>'01!И'.1° ;1ам"1!'па«е пиутриклето»

СО Г>1и:Ь'ТрШ!ИИ <:А.'!Р Л А£ 1,

я —в— - кл^Ткн, мо ьбпа^отпнкчо К1; - глет к::, одп.иоотпшсю- КТ.

В настоящее вромя выделен и охарактеризован один из роцвпто-ров АКР, который облаДае'т. гуашиштниклазной активностью [ЪеИшап, Мигай, 19861. Повышение концентрации ЛИГ до 1СГ5 М приводит к'10-кратному увеличении внутриклеточной концентрации сСМР в А2Д. В отличие от АС, актарность 00 не опосредуется активацией С-белков, в соответствии с чем изопротеронол и коклюшный токсин 'не изменяют способности АИР повышать внутриклеточную концентрации сСМР в АГП (рис.8). Вероятно, ингибирупдиА эффект АИР

3.5 1

ё з.'о

ад о

2.5 -

й 2.0 -

о о

1.5 -

в (.0 -

0.5 -

+ иэонротере! 50 мкМ

V/-

1 1 10

д

—г~ 8

7

—т-6

б

-1од (АИР), М

'Рио.В. аир -зависимое иженение внутриклеточной конпентраппк гОМР в А2П.

и —в——клетки, не обработаете КТ;

клетки, обработанное ИТ.

на активность мембранной АС опосредуется не известным рецептором, обладаниям гуанилатцгаслазной активностью, а ишм рецептором АКР, относящимся к • типу С-белок-зависимых I щепторов. Согласно нашит данным, в А2П АИР иш'ибируот аданилатциклазу о помощью О^-белка и вто иигибироваиио осуществляется только из фоне стимуляшш форманта 0 -белком.

. я

вывода

1. Вмембранной и цитозольной фракциях, выделенных из легкого свиньи, выявлены и охарактеризованы сигнал-проводящие С-белки: 12 кДа (мажорный белок) и 45 кДа '(минорный белок) *ормы 1-субъединиц ' ХТ-чувствитольного С -белка; сх-субъединшш К'Г-[увствителышх - 41 кДа (мшгорный), 012 - 40 кДа (мажорный) и >13 - 41 кДа (минорный) белков; р1 - 36 кДа (мажорная) и р2 - 35 :Да (мшюрная) субъединипы С-белков. В этих же фракциях легких фоанализироввн качественный и количественный состав 5М0-белков. )бнаруженн 21 кДа гав- и гас-белки; 25 кДа О^К (0 ) белок; 1.9 Да - АОТ-белок; 24 кДа (мажорные) и 26 кДа (минорные) !С3-чувствителыше гЬо/гас-болки, а также 19-26 кДа БМО-белки, .оторое ■ после электрофореза в присутствии БЗ На и переноса на мтроцеллюлозу, сохраняют способность связывать СТР.

2. -Обнаружено, что в легких С1-белки и БМС-бэлга, обладающие шособностью связывать СТР после электрофореза в присутствии ПЗ

и переноса на нитроцеллюлозу (белки нитк "-целлюлозного спяоыва-:ия), способны взаимодействовать с Р-яктином.

3. Показано, что в среде, содержащей и СТР, из мембран егких высвобождаются а-субъедшпяш С - и Оа-белкоп. Под действи-м низкой ионной силы из этих :ке мембран могут диссоциировать как . так и р~ субъодишцы О-белков.

4. Установлено, что в мс .бранах альвеоцитов второго порядка ч-белки, чувствительные к коклюшному токсину, представлен» -субъединицачи 0^-белка (40 кДа, мажорный; белок) и белка 41 кДа, |,1инорннй белок). В состав этих белков входит ^-субъедшащэ с молекулярной массой 36 кДа.

5. -Атризлышй натрийуретический пептид (АИР) при одних и тех е концентрациях (Ю-9 - Ю-6 М) повышает внутриклеточный уровень СМР и подавляет гормонстимулйровагагое повышение внутриклеточного ровня сАМР в альвеоцитах второго порядка - секреторных зпители-лышх клетках легких. Показано, чтс снижение внутриклеточного ровня сАМР в' альвеоцитах второго порядка опосредуется ^-зависимым иншбированием активности олонилвштсллзи с участп-'д чувствителышх к коклюшному токсину 0 -белков. - -

СПИСОК ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Старикова М.Г., Ианченко М.П.. Растворимый GTP-связыващий белок (G-белок) в легких млекопитающих. - Тезисы докладов .VI Всесоюзного симпозиума "Роль циклических нуклеотидов и вторичных пос^едшшов^в регуляции ферментативных реакция", Петрозаводск,

2. Tkaciiuk V.A., Hoffcnberg S.I., Starlkova М.О., Panchenko M.P. Signal-transducing G-protelns oi heart and lung. J. Mol. Cell. Cardiol., 1989, v.21, p.91-95.

3. Tkachuk V.A., НоГ'епЬегь S.-I., Starlkova 11.G., Panchenko M.P., Daniienko M.P., Volno-Yaeenetskaya T.A., Nupenko E.V., Rybln V.0. Involvement of guanine nu'ileotide-binding regulatory proteins into the process oi hormunal regulation oi signal transducing systems In mammalian cells. International Symposium "Molecular organisation of biological atinctures". Abet. Book, v.1, Moscow, 1989, p.114.

4. Tkachuk V.A., fioTfenberg S.I., Starlkova M.G., Panchenko M.P., Danilenko M.P, Characterization of guanine nucleotidn-bindlng regulatory proteins in heart and lung. Soviet-Jar,an oympoaium "Receptors: structure and function", AbatractB, iu'oscow, 1989, p.23.

5. Panchenko M.P., Starlkova M.G.Rubins .J.В., Levlne R.A., Dickey B.F. Inhibitory regulation of the adenylyl cyclase complex 1л rat alveolar type 2 epithelial cells ,bv atrial natriuretic factor. World Conrference on lung Health, Abstracts, Beaton, 1990. v.141, p.635.

6.Panchenko M.I\, Joyce-Brady M., Starlkova M.G., Dickey B.F., Brady J.S. Atrial natriuretic peptide Induces signal transduction by modulation of adenylyl and*guanylyl cyclases and la a developmentally-repulated autocrine factor in pulmonary alveolar type 2 cello. J. Ulln. Invest, 1992, в печати.

7. Паиченко М.П., Старикова М.Г., Гришин А.В., Нюпенко Е.В., Кйбаева Н.В., Романов Ю.А., Антонов А.С., Ткачук В. А. Сигнал-проводявда и низкомолокулярныо GTP-связыващие баш легких и ондотелин: локализация в мембранах и цитоволе, взаимодействие с F-ек'пшом. Биохимия, 1992, в печати.