Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ГТФ-связывающий белковый комплекс наружных сегментов палочек сетчатки лягушки

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тищенков, Владимир Григорьевич

Принятые сокращения.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА I. СТРОЕНИЕ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ НАРУЖНОГО СЕГМЕНТА

ПАЛОЧКИ СЕТЧАТКИ ПОЗВОНОЧНОГО.

1. Морфология фоторецепторной клетки. Электрический ответ фоторецептора.

2. Медиаторный механизм передачи сигнала в НСП. Требования к медиатору.

3. Попытки экспериментального подтверждения кальций--медиаторной гипотезы Хагинса.

4. Циклические нуклеотиды могут являться медиатором в передаче возбуждения в фоторецепторе.

ГЛАВА 2. ФУНКЦИИ ГТФ-СВЯЗЫВАЩИХ БЕЛКОВ.

1. N -белки в механизмах гормональной рецепции.

2. Участие ГТФ-связывающих белков в процессе элонгации трансляции прокариот.

3. Участие ГТФ-связываялцего белка в механизме активации светозависимой ЩЦЭ в НСП.

4. Постановка задачи исследования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Материалы.

2. Получение препаратов наружных сегментов палочек сетчатки лягушки.

3. Получение мембран дисков наружных сегментов (ЦДНС).

4. Получение препарата,обогащенного водорастворимыми белками НСП.

5. Центрифугирование НСП в градиенте плотности сахарозы,

6. Очистка комплекса белков НСП, обладающих светоза-висимой сорбцией на фоторецепторные мембраны.

7. Термоденатурация препаратов и супернатанта НСП.

8. Электрофоретическое разделение белков в полиакрил-амидном геле ( ббб -электрофорез).

9. Электрофорез белков в неденатурирующих условиях.

10. Разделение водорастворимых белков методом гель-фильтрации на Сефакриле Б-200.

11. Изоэлектрофокусирование белков в амфолинах.

12. Связывание гуаниловых нуклеотидов с препаратами НСП.

13. Измерение Са -связывающей способности фракций, полученных после гель-фильтрации белков супернатанта НСП.

14. Тонкослойная хроматография нуклеотидов.

15. Приготовление растворов с заданной концентрацией свободного Са

16. Фосфорилирование ГДФ, связанного с нуклеотид-связывающими центрами НСП.

17. Определение аденилаткиназной активности.

18. Измерение гуанозиндифосфактиназной КФ 2.7.4.6 активности.

19. Методы измерения нуклеозидтрифосфатазных активностей.

20. Определение концентрации белка.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

ГЛАВА I. ГТФ-связывающий белковый комплекс НСП сетчатки лягушки.

1. Зависимость связывания /^Н/ГЦЦФ препаратами НСП от количества обесцвеченного родопсина.

2. sds -электрофорез в ПААГе белков супернатанта НСП. so

3. Изоэлектрофокусирование белков супернатанта НСП.

4. "Комплекс Кюна" из НСП сетчатки лягушки.

5. Гель-фильтрация белков супернатанта и идентификация ГТФ-связывающего белка.

6. Термоинактивация ГТФ-связывающей способности супернатанта НСП.

ГЛАВА 2. Обменный механизм формирования активного состояния трансдуцина НСП сетчатки лягушки.

1. Кинетические характеристики процессов связывания /3Н/ГВДФ и /14С/ГДФ препаратами НСП.

2. Характеристика процессов диссоциации комплексов гуаниловых нуклеотидов с препаратами НСП.

3. Оценки констант диссоциации гуаниловых нуклеотидов с нуклеотидсвязываюгцими центрами НСП.

ГЛАВА 3. Фосфорилирование ГДФ, связанного препаратами НСП сетчатки лягушки, как возможный механизм формирования активного состояния трансдуцина.

1. Фосфорилирование связанного ГДФ.

2. Влияние АТФ на связывание ГДФ препаратами НСП.

ГЛАВА 4. Фосфотрансферазные активности, катализируемые трансдуцином НСП сетчатки лягушки.

1. Аденилаткиназная активность препаратов НСП.

2. Аденилаткиназная активность водорастворимой фракции НСП.

3. ГДФкиназная активность различных типов препаратов

НСП и водорастворимой фракции НСП.

4. Термоинактивация АК, ГДФкиназной активностей и ЩЦФ--связывающей способности препаратов супернатанта НСП.

5. Светозависимость ГДФкиназной активности.

ГЛАВА. 5. Нуклеозидтрифосфатазные активности препаратов НСП.

1. Гидролиз ГТФ при низких (менее I мкМ) концентрациях.

2. Сопряженные ферментативные реакции в НСП.

3. Нуклеозидтрифосфатазные активности препаратов НСП.

4. Распределение ГТФазной активности во фракциях, полученных при гель-фильтрации белков супернатанта

5. Термоинактивация НТФазных активностей.

ГЛАВА 6. Модуляция ферментативных активностей трансдуцина ионами кальция. Возможная функциональная роль субъединицы трансдуцина.

1. Регуляция ионами кальция гидролиза , связанного ГТФ.

2. Зависимость ГДФкиназной активности от концентрации ионов кальция.

3. Модуляция нуклеозидтрифосфатазных активностей.

4. Са*"+-связывающая способность фракций, полученных при гель-фильтрации препарата супернатанта НСП.

5. Термостабильность фактора, обеспечивающего Са^+ регуляцию ГТФазной активности Т^ и т^ субъединиц трансдуцина.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОД*.

Введение Диссертация по биологии, на тему "ГТФ-связывающий белковый комплекс наружных сегментов палочек сетчатки лягушки"

Данная работа посвящена характеристике ГТФ-связывающего белкового комплекса наружных сегментов палочек (НСП) сетчатки лягушки, в частности, выяснению механизма образования активного ( = активаторного) состояния ГТФ-связывающего белка, способного в комплексе с ГТФ модулировать скорость светозависимой фосфоди-эстеразы ($ЦЭ) циклических нуклеотидов НСП.

Исследование ферментативных систем метаболизма циклических нуклеотидов фоторецепторной клетки имеет важное практическое значение, поскольку нарушения обмена циклонуклеотидов являются нередко первым (если не единственным) ранним регистрируемым признаком некоторых патологических состояний, например, дисплазии палочек и колбочек /Этингоф Р.Н., 1979, 1981/.

С другой стороны, расшифровка механизма действия ГТФ-свя-зывающих белков имеет самостоятельное значение в связи с тем, что класс ГТФ-связывающих белков играет ключевую роль в ряде важнейших физиологических процессов в организме: действии гормонов и нейромедиаторов, в процессах элонгации трансляции, сборки микротрубочек /?ойЪе11 , 1980; Кагал? о , 1978; Маг сит et а], 1978/.

Результаты изучения механизма функционирования белков этого класса могут иметь важное теоретическое и практическое применение в нейрофармакологии опиоидных пептидов, необходимых для более полного понимания действия болеутоляющих средств и создания препаратов, лишенных побочного действия, поскольку имеющиеся данные показывают, что действие опиатов опосредуется ГТФ-связы-вающими белками /\Vilkening et а1. , 1980; Коек! et а1. , 1981/.

Использование препаратов НСП сетчатки позвоночных для исследования ГТФ-связывающих белков имеет несомненное преицущество перед другими объектами. Во-первых, имеется реальная возможность быстро и в препаративных количествах получать высокоочи-щенные нативные препараты НСП /Орлов Н.Я. и др., 1980; Гаспарян А.Г. и др., 1980/; во-вторых, НСП сетчатки позвоночных имеют ограниченную гетерогенность полипептидного состава, из которого часть белков функционально идентифицированы / Ktfhn,1980а,ъ /, в-третьих, ГТФ-связывающий белковый комплекс составляет значительную долю водорастворимой фракции белков НСП /Godchaux, Zimmerman , 1979/ и обладает светозависимой сорбцией на фоторецеп-торные мембраны, что существенно упрощает его выделение / Kiibn, 1980а/.

Следующие аргументы послужили нам основой для постановки задачи исследования. (I) Максимальная активация ЗЩЭ в препаратах НСП наблюдается в присутствии ГТФ в мкМ концентрации /wheeler, Bitensky , 1977/; негидролизуемый аналог ГТФ вызывает длительную активацию 5ЩЭ, снижение ЗЩЭ активности наблюдается при использовании ГТФ и связано с появлением ГТФазной активности с К^ менее I мкМ / РоЪег, Bitensky,1979 /. (2) ГТФазная активность сопряжена с двумя фракциями водорастворимых белков НСП /shinozawa , Biр. tensky , 1980/. (3) В препаратах НСП наблюдается Са -зависимый гидролиз эндогенного ГТФ /вегпЪаит , Bownds , 1979/, водораство

2+ римые белки НСП обладают Са -ингибируемой ГТФазной активностью

Krapivinsky et al. , 1980/. Последние данные указывали на одно

2+ из мест действия ионов Са в НСП. Кроме того, было обнаружено сходство свойств светоактивируемой фЦЭ и гормонактивируемой АЦ /РоЪег , Bitensky , 1979; Shinozawa et al. , 1979/, позволившее предположить, что НСП сетчатки позвоночных содержат ГТФ-связывающий белок. Однако к моменту начала нашей работы существование такого белка в ШП показано не было.

Из экспериментальных данных, представленных в диссертации, сле,пует, что НСП сетчатки лягушки содержит ГТФ-связывающий белковый комплекс, представленный тремя полипептидами,молекулярная масса которых оценена нами в 39, 36 и менее 15 кД. Содержание его субъединиц составляет 7-8% от количества родопсина в НСП.

Параллельно и независимо от нас ГТФ-связывающий комплекс был обнаружен в НСП сетчатки быка / Fung et al., 1981/ и назван авторами трансдуцином (Т). Он также представлен тремя полипептидами 39, 36 и 10 кД, которые авторы / Fung et al. , 1981/ предложили обозначать соответственно. Ряд данных, изложенных ниже, позволяет утверждать, что НСП сетчатки лягушки и быка имеют аналогичный комплекс белков, представленный близкими по молекулярному весу полипептидами, поэтому, следуя введенным обозначениям, ГТФ-связывающий белковый комплекс НСП сетчатки лягушки мы будем называть трансдуцином лягушки.

Представленные нами результаты показывают, что связывание гуаниловых нуклеотидов препаратами НСП обусловлено их взаимодействием с IV субъединицей, содержащей ГТФ-связывающий центр.Аналогичные выводы были сделаны относительно а^ субъединицы транс-дуцина быка / Fung et al., 1981; Fung , 1983/.

Темноадаптированные НСП связывают ГДФ и практически не взаимодействуют с негидролизуемым аналогом ГТФ - ГЦЦФ; фотолиз родопсина потенцирует связывание ЩДФ, причем одна молекула обесцвеченного пигмента приводит к связыванию в наших экспериментальных условиях до 70 молекул ЩЦФ. В НСП сетчатки быка связывание достигает 70-500 моль ГВДФ на моль обесцвеченного родопсина /Fung, stryer , 1980; Fung et al. , 1981/. Совокупность этих данных демонстрирует хорошее согласие с требованием активации ин виво нескольких сот молекул ФДЭ циклонуклеотидов при фотолизе одной молекулы родопсина В НСП /Тее , Liebman , 1978; Woodruff , Bownds , 1979/.

Нами показано, что потенцируемый фотолизированным родопсином обмен ГДФ на ГТФ в нуклеотидсвязывающих центрах НСП ( Тк субъединица трансдуцина) не в состоянии обеспечить необходимую скорость формирования активного состояния ГТФ-связывающего белка (т.е. комплексов^' ГТФ) из-за низкой скорости процесса обмена даже в экспериментальных условиях, способствующих его ускорению. Оценены некоторые характеристики процесса обмена гуанило-вых нуклеотидов в НСП сетчатки лягушки.

Эти результаты ставят под сомнение обменный механизм формирования активного состояния ГТФ-связывающего белка в НСП сетчатки позвоночного, предложенный в лаборатории Страйера / Fung, Stryer, 1980/ по аналогии с общепринятой моделью функционирования ГТФ-связывающих белков в других системах - рецепции гормонов и элонгации трансляции /Cassel , Seiinger , 1976; Kaziro , 1978; Pfeuffer , 1979/.

Экспериментально показано наличие в НСП сетчатки лягушки альтернативного обмену механизма, а именно, фосфорилирования ГДФ, связанного с т^ субъединицей, до ГШ в ГДФкиназной реакции. Полученные данные указывают на то, что эта реакция является свето-стиэдулируемой, что подчеркивает ее физиологическую значимость. Роль фосфотрансферазы выполняет, по-видимому, Т/> субъединица трансдуцина. Формирование активного состояния т«* субъединицы в реакции фосфорилирования по нашим данным может обеспечить требуемую скорость активации $ДЭ в НСП в ответ на свет.

Сопряжение ГТФазной активности т^ субъединицы трансдуцина (появляющейся в присутствии мембран дисков наружных сегментов, содержащих обесцвеченный родопсин) с ГДФкиназной активностью т^ и (Г} субъединиц проявляется в виде АТФазной активности. Эту активность можно зарегистрировать, по-видимому, только в том случае, если Т^ субъединица содержит связанный ГДФ. Такое сопряжение ферментативных активностей трансдуцина объясняет ранее известные факты гидролиза АТФ и ГТФ препаратами НСП и фракцией водорастворимых белков НСП /Ostwald , Heller, 1972; Thacher, 1978; Kiapivinsky et al., 1980/. Нами обнаружен гидролиз трансдуцином АТФ, ГТФ, ЦТФ, УТФ; причем К^ этих реакций более чем в 100 раз превышает ГТФазной активности Т^( I мкМ) /Wheeler, Bitensky, 1977/.

Ферментативные активности трансдуцина: ГТФазная, ГДФкиназная, НТФазная - модулируются ионами кальция в диапазоне концен-—7 —8 траций 10 -10 М, причем все типы реакций ингибируются ионами

2+ -7

Ca при повышении его концентрации более 5*10 М. Ряд косвенных данных, полученных нами, позволяет сделать предположение,что регуляция ионами кальция ферментативных активностей трансдуцина, по-видимому, обеспечивается % субъединицей, которая обладает

2+ способностью связывать Ca , а действие этих ионов направлено на ГТФазную активность с Км менее I мкМ.

Есть основания полагать, что механизм формирования активного состояния ГТФ-связывающего белка в реакции трансфосфорилирова-ния является универсальным, поскольку в экспериментах, проведенных нами совместно с С.К.Смаиловым в лаборатории академика Спирина A.C. (Институт белка АН СССР, Щпдино), было показано (1982г, данные не опубликованы) образование активных комплексов фактора элонгации прокариот ебче5ГТФ в результате фосфорилирования ГДФ, связанного с ер-tu.

Полученные в диссертационной работе результаты могут быть использованы при исследовании систем, в функционировании которых принимают участие ГТФ-связывающие белки»

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Тищенков, Владимир Григорьевич

ВЫВОДЫ

1. Препараты НСП сетчатки лягушки содержат ГТФ-связывающий белковый комплекс трансдуцин (Т), представленный тремя полипептидами с молек. массой 39 (Т^), 36 (Т^) и менее 15 кД (Ту),молярная концентрация которых составляет 5-7 % от концентрации родопсина.

2. Т^ субъединица комплекса обеспечивает связывание гуанило-вых нуклеотидов ( ГДФ,ГТФ и его негидролизуемого аналога ГИД® ) препаратами НСП. Показано, что темноадаптированные препараты НСП способны связывать ГДФ, но не ГИДФ; фотолиз зрительного пигмента приводит к снижению ГДФ-связывающей и появлению ГИДФ-связывающей способности НСП. При уровнях фотолиза порядка 0,1% родопсина в препарате одна молекула обесцвеченного родопсина потенцирует связывание около 70 молекул ГВДФ.

3. Проведен экспериментальный анализ гипотезы, согласно которой активное состояние трансдуцина ( Т-ГТФ ) формируется в результате индуцируемого обесцвеченным родопсином обмена ГДФ, связанного с Т^, на свободный ГТФ. Показано, что даже в условиях, способствующих протеканию обмена с максимальной скоростью, процесс занимает десятки секунд (^^2^30-40 с), что значительно превышает время развития электрического ответа фоторецепторной клетки.

4. Показано, что ГДФ, связанный препаратами НСП, при наличие в препарате обесцвеченного родопсина фосфорилируется до ГТФ в присутствии АТФ за время менее 3-5 с даже при О°С.Предполагается, что обнаруженный процесс обеспечивает формирование активных комплексов Т-ГТФ .

5. Показано, что препараты трансдуцина катализируют ГДФкиназ-ную и аденилаткиназную реакции. ГДФкиназа регистрируется в присутствии и Тр субъединиц трансдуцина, имеет температуру полуинактивации 55°С. Аденилаткиназная активность сопряжена с Тр субъединицей и термостабильна. Предполагается, что Тр выполняет роль фосфотрансферазы в ГДФкиназной реакции.

6. Показано, что все типы препаратов НСП способны гидролизовать АТФ, ГТ5, УТФ, ЦТ® с Км 50, НО, 200 и 220 мкМ, соответм ственно. Предполагается, что гидролиз нуклезидтрифосфатов обусловлен сопряжением ГТ§азной (К менее I мкМ) и ГДФкиназной активностей комплекса Т. Реакции гидролиза ГТг1? и УТ& имеют температуру полуинактивации 55°С.

7. Обнаружено, что активность ГТ®азы (К <I мкМ) увеличивается при снижении концентрации свободного кальция менее I мкМ. Эффект кальция, по-видимому, опосредуется через термостабильную Т^ субъединицу, обладающую кальцийсвязывающей способностью.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тищенков, Владимир Григорьевич, Москва

1. Азимова A.M., Берман: А.Л., Грибакин Ф.Г., Петросяы A.M. Некоторые свойства Mg Са2+- и иа+, К+-АТФаз в палочках сетчатки. -В сб.: "Механизмы сенсорной рецепции", 1977, Л., с.5-10.

2. Ашмарин И.П. Молекулщэная биология. Избранные разделы. 1977, Л., ЛГУ, с.298-335.

3. Березин И.В., Мартинек К. Основы физической химии ферментативного катализа. 1977, М., "Высш.шк.", 5-34, 268-275.

4. Винников Я.А. Цитологические и молекулярные основы рецепции. -1971, Л., "Наука",

5. Гаспарян А.Г., Орлов Н.Я., Фесенко Е.Е. Быстрые фотоиндуциро-ванные изменения светорассеяния препаратов фоторецепторных мембран позвоночных. I. Изучение суспензий наружных сегментов палочек сетчатки. Биофизика, 1980, т.25, JE I, с.87-92.

6. Гарновская М.И., Думпер И.Л., Этингоф Р.Н. Влияние нуклеозидтри-фосфатов на фосфодиэстеразу циклических нуклеотидов; роль белковых модуляторов. Биохимия, 1982, т.47, вып. 2, с.212-215.

7. Говардовский В.И. 0 роли ионов кальция в возбуждении фоторецепторов позвоночных. Докл. АН СССР, 1977, т. 235, JS 6, с.1445-1448.

8. Говардовский В.И., Берман А.Л. Механизм возбуждения фоторецепторов позвоночных: возможная роль циклических нуклеотидов. -Докл. АН СССР, 1978, т.237, № 3, с.739-742.

9. Говардовский В.И., Берман А.Л. Внутриклеточный медиатор в фоторецепторах позвоночных. В сб.: "Сенсорные системы . Зрение", 1982, Л., "Наука", с.9-25.

10. Говардовский В.И., Берман А.Л. Механизм возбуждения фоторецепторов позвоночных. Внутриклеточный медиатор в фоторецепторах позвоночных. Вест. АМН СССР, 1977, № 10, с.13-17.

11. Донцов A.E., Зак П.П., Островский М.А. Регенерация АТР в наружных сегментах фоторецепторов лягушки. Биохимия, 1978, т.43, с.592-595.

12. Думлер И.Л. Фесфодиэстераза наружных сегментов сетчатки глаза: свойства, активирование и ингибирование. Биохимия, 1974, т.39, J£ 5, C.I09I-I096.

13. Думлер И.Л., Этингоф Р.Н. Аденилатциклаза и содержание циклической 3',5'-АМФ в изолированных наружных сегментах сетчатки. Докл. АН СССР, 1974, т.217, Je 6, с.1431-1434.

14. Зегбуш П. Молекулярная и клеточная биология. М., "Мир", 1982, т.2, с.116-121.

15. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. М., "Мир", 1979.

16. Корчагин П.В., Берман А. Л., Щгколюков С. А., Рычкова Ж.И., Этингоф Р.Н. Модификация фоторецепторных мембран сетчатки и свяр Iзывание иона Са . Биохимия, 1978, т.43, с.1749-1755.

17. Куделин Б.К., Каминский Ю.Л., Иванова И.Ф., Гаврилова С.С. Разделение нуклеозидов и нуклеозид 5'-моно,-ди и -трифосфатов тонкослойной хроматографией на силуфоле. Биохимия, 1979,т.44, вып.2, с.368-373.

18. Маурер Г. Диск-электрофорез. Теория и практика электрофореза в полиакриламидном геле. "Мир", М., 1971, с.60-61.

19. Орлов H.H. Исследование фотохимических и конформационных превращений родопсина. Дисс.канд.физ.-мат.наук. - Пущино, 1975. -240 с.

20. Островский М.А. Фоторецепция. В кн.: Физиология сенсорных систем. Часть I. Физиология зрения. - "Наука", Л., 1971, гл.5, с.88-119.

21. Питере А., Пален С., Уэбстер Г. Ультраструктура нервной системы. "Мир", М., 1972, с.37,

22. Пальмер Дж.К., Меньян A.A. Действие нейролептических агентов на системы циклических нуклеотидов в ВДС. В сб.: "Нейрофар-макология циклических нуклеотидов", "Медицина", М., 1982,с.74-126.

23. Ратнер В.Л. Исследование индуцируемых светом конформационных переходов родопсина быка методом белковой флюоресценции. -Дисс.канд.физ.-мат.наук. Пушино, 1978. -94 с.

24. Сетлоу Р., Полард Э. Молекулярная биофизика. М.: "Мир", 1964, с.401-431.

25. Ткачук В.А. Третий Всесоюзный симпозиум по циклическим нукле-отидам. "Биохимия", 1981, вып.4, с.761-765.

26. Ткачук В.А. Введение в молекулярную эндокринологию. М.: Изд-во МГУ, 1983, -256 с.

27. Фураев В.В., Думлер И.Л., Казимирский А.Н., Этингоф Р.Н. Очистка фосфодиэстеразы циклических нуклеотидов наружных сегментов палочек сетчатки; сопряжение фермента с ингибитором. Докл.

28. АН СССР, Биохимия, 1978, т.243, J& I, с.247-250.

29. Фесенко Е.Е., Орлов Н.Я., Кулаков В.Н., Любарский А.Л., Фесенко Н.К. Фотохимические исследования гемсодержащих белков и зрительного пигмента. В сб.: "Молекулярная и клеточная биофизика", "Наука", М., 1977, с.30-38.

30. Шварценбах Г., Флажка Г. Комплексометрическое титрование. -М., "Химия", 1970.

31. Этингоф Р.Н. Новые аспекты в изучении циклических нуклеотидов (исследования на сетчатке). Успехи совр.биол., 1981, т.92, вып.2(5), с.198-211.

32. Этингоф Р.Н., Думлер И.Л. Участие 3',5'-АМФ в первичных механизмах экстерорецепторных процессов. Ж.эвол.биохим. и физиол., 1975, т.II, lb I, с.28-38.

33. Этингоф Р.Н. 0 роли циклической 3',5'-АШ на первичных этапах фоторецепции. В сб.: "II Симпозиум по физиологии сенсорных систем", "Физиология зрения", Л., 1973, с.5-6.

34. Этингоф Р.Н., фураев В.В., Дутллер И.Л. Белковый ингибитор фосфодиэстеразы циклических нуклеотидов. В сб.: "Циклические нуклеотиды", 1979, "Наука", М., с.20-30.

35. Abood М.Е., Hurley J.В., Pappone М.С., Bourne H.R., Stryer L. Functional homology between signal-coupling proteins. Cholera toxin inactivates the GTPase activity of transducine. J. Biol.Chem., 1982, v.257, N 18, p.10540-10543»

36. Barnstable G.J. Monoclonal antibodies which recognize different cell types in the rat retina. Nature, 1980, v.286, p. 231235.45« Baylor D.A., Fuortes M.G.F. Electrical responses of single cones in the turtle. J.Physiol., 1970, v.207, p.77-92.

37. Baylor D.A., Lamb T.D., Yau K.-W. Responses of retinal rods to single photons. J.Physiol., 1979b, v.288, p.613-634.

38. Bennett N. Light-induced interactions between phodopsin and the GTP-binding proteins. Relation with phosphodiesterase activation. Eur.J.Biochem., 1982, v.123, p.133-139.

39. Bignetty E., Caraggioni A. Metabolism of frog outer segments a kinetic study. J.Physiol., 1977, v.270, p.705-717.

40. Bignetty E., Caraggioni A., Sorby R.T. Light-activated hydrolysis of GTP and cyclic GMP in rod outer segments. J.Physiol., 1978, v.279, N 1, p.55-69.

41. Bitensky M.W., Gorman R.E., Miller W.H. Adenylcyclase as a link between photon capture and changes in membrane permeability of photoreceptors. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1971, v.68, N 3, p.317-335.

42. Bitensky M.W., Miller W.H., Gorman R.E., Neufeld A.H., Robinson R. Advances in Cyclic Nucleotide Research, 1972, v.l,p.317-335. Raven Press, New York,

43. Bitensky M.W., Miki IT., Mareus F.R., Kierns J.J. The role of cyclic nucleotides in visual excitation. Life Sci., 1973, v.13, N 11, p.1451-1472.

44. Bitensky M.W., Miki N., Kierns J.J., Kierns M., Baraban J.M., Freeman J., Wheeler M.A., Lacy J,, Marcus F.R. Activation of photoreceptor disk membrane phosphodiesterase by light and ATP, Adv.Cyclic Nucleotide Res., 1975, v.5, p.213-240.

45. Bitensky M.W., Wheeler M.A., Rasenick M.M., Yamaraky A.,

46. Bonting S.L. Sodium-potassium activated ATPase and cation transport. In: "Membrane and ion transport", ed. Bittar E.E., Viley-Interscience, 1971, v.l, p.257-363.

47. Bonting S.L., Daemen P.J.M. Calcium as a transmitter in photoreceptor cells. In: "Transmitters in the Visual Processes". (Ed. by S.L.Bonting), Pergamon Press. Oxford, 1976,p.59-88.

48. Bownds M.D. Biochemical steps in visual transuction: roles for nucleotides and calcium ions. Photochem.Photobiol., 1980, v.32, p.487-490.

49. Borys T.L., Uhl R., Abrahamson E.W. Cyclic GMP stimulation of a light-activation ATPase in rod outer segments. Nature, 1983, v.304, p.733-735.

50. Caldwell P.C. Calcium chalation and buffers. In: "Calcium and Cellular Function", ed. Cuthberg A.W., St.Martin's Press, N.-Y.', 1970, p.11-16.

51. Cavetta A., Cavaggioni A., Sorbi R.T. Phosphodiesterase and GTPase in rod outer segments. Kinetics in vitro. Biochim. Biophys.Acta, 1979, v.583, N 1, p.1-13.

52. Cavetta A. Cavaggioni A. On the metabolism of the rod outer segments. J.Physiol., 1976, v.257, p.687-697.

53. Cassel Iu, Selinger Z. Mechanism of adenylate cyclase activation by cholera toxin: inhibition of GTP hydrolysis at the regulatory site. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1977, v.74, N 8, p.3307-3311.

54. Clack J.W., Oakley B., Pepperberg D.R. Light-dependent effects of hydrolysis-resistant analog of GTP on rod photoresponsesin toad retina. Proc.Uatl.Acad.Sci.USA, 1982, v.79, N 8, p.2690-2694.

55. Clo C., Caldarera G.M., Tantini B., Benald D., Bachrach U. Polyamines and cellular adenosine si^-cyclic monophosphate. Biochem.J., 1979, v.182, p.641-649.

56. Cone R.A. The internal transmitter model for visual excitati-tion: some quantitative implication. In: "Biochemistry andphysiology of visual pigments", ed. Danger H., SpringerVerlag Inc., N.-Y., 1973, p.267-282.

57. Cooper D.M.F. , Jagus R. , Somers R.L. , Rodbell M. Cholera toxin modifise deverse GTP-modulated regulatory proteins. -Biochem.Biophys.Res.Commun., 1981, v.101, N 4, p.1197-1185.

58. Cooper D.M.E. Bimodal regulation of adenylate cyclase. FEBS Lett., 1982, v.138, N 2, p.157-163.

59. Coquil J.F., Wermoux G., Mandel P., Goridis C. Cyclic nucleotide phosphodiesterase of retinal photoreceptors. Partial purification and some properties of enzyme. Biochem.Biophys. Acta, 1975, v.403, N 2, p.425-435.

60. Donaldson S.K.B., Kerrick W.G.L. Characterization of the ef2+ 2+ 2+ fects of Mg on Ca and Sr -activated tension generationof skinned skeletal muscle fibers. J. Gen.Physiol., 1975,v.66, N 4, p.427-444.

61. Daemen F.J.M. Vertebrate rod outer segment membranes. Biochem.Biophys. Acta, 1973, v.300, N 3, p.255-288.

62. Denuchi T., Ohsaka S., Nakane M., Ichikawa M., Yoshioka M. Cellular mechanism'involved in the synthesis of cyclic GMP in nervous tissues. J.Neural.Transmission, 1983, Suppl.18, p.369-378.

63. De Vries G.W., Cohen A.I., Dowry O.H., Ferendeli J.A. Cyclic nucleotides in cone-dominant ground squerretinas. Exp.Eye Res., 1979, v.29, p.315-321.

64. Dumler I.L., Etingoff R.N. Protein inhibitor of cyclic adenosine 3',5'-monophosphate phosphodiesterase in retina. Bio-chim.Biophys.Acta, 1976, v.429, p.474-484.

65. Fabiato A., Fabiato P. Calculator programs for computing the composition of the solution containing multiple metals and ligands used for experiments in skinned muscle cells. J. Physiol., 1979, v.75, p.463-505.

66. Parber D.B., Brown B.M., Lolley R.N. Cyclic nucleotide dependent protein kinase and the phosphorelation of endogenous proteins of retinal rod outer segments. Biochemistry, 1978, v.18, p.370-378.

67. Parber D.B., Lolley R.N. Cyclic guanosine monophosphate: elevation in generation photoreceptor cells of the C3H mouse retina. Science, 1974, v.186, p.449-451.

68. Parber D.B., Lolley R.N. Light-induced reduction in cyclic GMP of retinal photoreception cells in vivo: abnormalities in the degenerative diseases of RCS rats and rod-mice. J.Neurochem., 1977, v.28, p.1089-1095.

69. Parber D.B., Chase D.G., Lolley R.N. Cyclic nucleotides in rod- and cone-dominant retinas. Neurochemistry, 1980, v.l, p.327-336.

70. Perrendeli J.A., De Vries G.W., Cohen A.T., Lowry O.H. Localisation and roles of cyclic nucleotide systems in retina. -Neurochemistry, 1980, v.l, p.311-326.

71. Fung B. K.-K. Characterization of transducin from bovine retinal rod outer segments. Separation and reconstitution of the subunits. J.Biol.Chem., 1983, v.258, p.10495-10502.

72. Fung B.K.-K., Nash C.R. Characterization of transducin from bovine retinal rod outer segments. II. Evidence for distinct binding sites and conformational changes revealed by limited proteolysis with trypsin. J.Biol.Chem., 1983, v.258, p.10503-10510.

73. Gold G.H., Korenbrote J.I. Light-induced calcium release by intact retinal rods. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1980, v.77, N 9, p.5557-5561.

74. GodchauxW., Ill, Zimmerman W.F. Membrane-dependent guanosine nucleotide binding and GTPase activities of soluble protein from bovine rod cell outer segments. J.Biol.Chem., 1979, v.254, p.7874-7884.

75. Goridis C. The effect of flash illumination on the endogenous cyclic GMP content of isolated frog retinae. Exp.Eye Res., 1977, v.24, p.171-177.

76. Goridis C., Virmaux N. Light-regulated guanosine-3',5'-monophosphate phosphodiesterase of bovine retina. Nature, 1974, v.248 , p.57-58.

77. Govardovsky V.I. On the sites of generation of the early and late receptor potentials. Vision Res., 1975, v.15, p.973-981.

78. Hagins W.A. The visual process: excitatory mechanisms in the primary receptor cells. Ann.Rev.Biophys.Bioeng., 1972,v.1, N 1, p.131-158.2+

79. Hagins W.A. , Yoshikami S. A role for Ca in excitation of retinal rods and cones. Exp.Eye Res., 1974, v.18, p.299-305.105« Hagins W.A., Penn R.D., Yoshikami S. Dark current and photo-current in retinal rods. Biophys.J., 1970, v.10, p.380-412.

80. Hatase 0., Tokuda M. , Itano T. , Matsui H., Doi A. Purification and characterization of calmodulin from rat liver mitochondria. Biochem.Biophys.Res.Commun., 1982, v.104, N 2, p.673-679.

81. Hendriks T.H. , De Pont J.J.H.H.M. , Daemen E.J.LI. , Bonting S.L. Biochemical aspects of visual process. XXIV. Adenylate cyclase and rod photoreceptor membranes: a critical approach. Biochim.Biophys.Acta, 1973, v.330, N 2, p.156-166.

82. Hendriks T.H., Daemen F.J.M., Bonting S.L. Light-induced calcium movement in isolated frog rod outer segments. Bio-chim.Biophys.Acta, 1974, v.345, p.468-473.

83. Hendriks Th., Heard P.M.M., Daemen P.J.M., Bonting S.L. Calcium binding of the cattle ROS membranes studied by means of equilibrium dialisis. Biochim.Biophys.Acta, 1977, v.467, p.175-184.

84. Hemminki K. Light-induced decrease in calcium binding to isolated bovine photoreceptors. Vision Res., 1975, v.15, p.64-72.

85. Hermolin J., Karell M.A., Hamm H.E., Bownds M.D. sCalcium and cyclic GMP regulation of light-sensitive protein phosphorylation in frog photoreceptor membranes. J.Gen.Physiol., 1982, v.79, N 4, p.633-655.

86. Hurley J.B., Barry B., Ebry T.G. Isolation of an inhibitory protein for cyclic guanosine 3',5'-monophosphate phosphodiesterase of bovine rod outer segments. Biochim.Biophys.Acta,1981, v.675, N 3-4, p.359-365.

87. Harley J.B., Stryer L. Purification and characterizationof the -regulatory subunit of the cyclic GMP phosphodiesterase from retinal rod outer segments. J.Biol.Chem.,1982, v.257, p.10503-10510.

88. Karivo Y. Role of GTP in polypeptide chain elongation. Biochim.Biophys.Acta, 1978, v.505, p.95-127.

89. Kierns J.J. , Miki N. , Bitensky M.V/. , Kierns M. A link between rhodopsin and disc membrane cyclic nucleotide phosphodiesterase. Action spectrum and sensitivity to illumination. -Biochemistry, 1975, v.14, N 12, p.2760-2766.

90. Kilbride P., Ebrey T.G. Light-initiated changes of cyclic guanosine monophosphate levels in frog retina measured with quick-freezing technique. J.Gen.Physiol., 1979, v.74,p.415-426.

91. Kimura N., Nagata N. Mechanism of stimulation adenylate cyclase by GDP and glucagon in the rat plasma membranes. J. Biol.Chem., 1979, v.254, N 9, p.3451-3457.

92. Kincaid R.L. , Manganiello V.C., Vaughan M. Effects of spermine on activity and stability of calcium-dependent guanosine3',5'-monophosphate phosphodiesterase. J.Biol.Chem., 1979, vol.254, N 12, p.4970-4973.

93. Krapivinsky G.B., Tishchenkov V.G., Fesenko E.E. Molecular2+mechanisms of photoreception. IV. Ca -inhibited GTPase of rod outer segments of the frog retina. Biochim.Biophys. Acta, 1980, v.614, p.435-445.

94. Krishna G., Krishnan N.,Fletcher R.T. , Chader G. Effects of light and cyclic GMP metabolism in retinal photoreceptors. -J.Neurochem., 1976, v.27, p.717-722.

95. Krishnan N., Fletcher R.T., Chader G.J., Krishna G. Characterisation of guanilate cyclase of rod outer segments of bovine retina. Biochim.Biophys.Acta, 1978, v.523, p»506-515.

96. Kuhn H. Light- and GTP-r egulat ed interaction of GTPase and other proteins with bovine photoreceptor membranes. Nature, 1980, v.283 , p.587-589.

97. Kühn H. Light-regulated binding of rhodopsine kinase and other proteins to cattle photoreceptor membranes. Biochemistry, 1978, v.17, p.4389-4395.

98. Kühn H. Light-induced, reversible binding of proteins to bo-bovine photoreceptor membranes. Influence of nucleotides. -Neurochemistry, 1980, v.2, p. 269-285.

99. Lee R.H., Brown B.M., Lolley R.N. Autophosphorilation of rhodopsin. Kinase from retinal rod outer segments. Biochemistry, 1982, v.21, N 14, p.3303-3307.

100. Leichtling B.H., Coffman D.S., Yaeger E.S., Rickenberg H.V.,

101. Jamaliy, Haley B.E. Occurrence of adenylate cyclase "G-protein" in membranes of Dictyostelium discoideum. Biochem.

102. Biophys.Res.Commun., 1981, v.102, p.1187-1195.2+

103. Liebman P.A. Light-dependent Ca content of rod outer segment disk membranes. J.Invest.Ophthalmol., 1974, v.13,p.700-701.

104. Liebman P.A., Pugh E.N., Jr. The control of phosphodiesterase in rod disk membranes: kinetiks, possible mechanisms and significance for vision. Vision Res., 1979, v.19, p.375-380.

105. Limbird L. Activation and attenuation of adenylate cyclase systems. The role of GTP-binding proteins as macromolecular messengers in receptor-cyclase coupling. Biochem.J., 1981, v.195, p.1-13.

106. Liu V.P., Wong W.G. A heart stable protein inhibitor of cyclic 3',5'-nucleotide phosphodiesterase. Biochem.Biophys. Acta, 1979, v.583, p.283-288.

107. Mailt or p M. , McConnell D. G. Adenylate cyclase in vertebrate retina. Relationship to specific fraction and to rhodopsin. J.Biol.Chem., 1974, v.249, N 14, p.4608-4613

108. Mason W.T. , Fager R.S., Abrahamson E.W. Ion fluxes in disk membranes of retinal rod outer segments. Nature, 1974, v.247, p.562-563.

109. Miki N. , Baraban J.M. , Eeirns J.J. , Boyee J.J., Bitensky M.W. Purification and properties of the cyclic nucleotide phosphodiesterase of rod outer segments. J.Biol.Chem., 1975, v.250, p.6320-6327.

110. Miller W.H., Gorman R.E., Bitensky M.W. Cyclic adenosine monophosphate: function in photoreceptors. Science, 1972,v.174, p.295-297.

111. Miller W.H., Nicol G.D. Evidence that cyclic GMP regulates membrane potential in rod photoreceptors. Nature, 1979, v.280, N 1, p.64-66.

112. Mourad M., Parks R.E., Jr. Erithrocyte nucleoside diphospho-kinase. II. Isolation and kinetiks. J.Biol.Chem., 1966, v.241, N 2, p.271-278.

113. Neufeld A.H., Miller W.H. , Bitensky M.W. Calcium binding to retinal disk membranes. Biochem.Biophys.Acta, 1972, v.226, N 1, p.67-71.

114. Northup J.K., Smigel M.D., Gilman A.G. The guanine nucleotide activation site of the regulatory component of adenylate cyclase. Identification "by ligand "binding. J.Biol.Chem. , 1982, v.257, N 19, p.11416-11423.

115. Pannbacker R.G., Fleischman D.E., Reed D.W. Cyclic nucleotide phosphodiesterase: high activity in mammalian photoreceptor. Science, 1972, v.175, N 4023, p.757-758.

116. Park R.E., Jr., Agarwal R.P. Nucleoside diphosphokinase. -In: "The Enzymes", ed. Boyer P.D., 3rd ed., Acad.Press, N.-Y., 1973, v.8, p.307-333.

117. Penningroth S.P., Kirschner M.W. Nucleotide binding and phosphorylation in microtubule assambly in vitro. J.Mol. Biol., 1977, v.115, p.643-676.

118. Pfeuffer T. Guanine nucleotiae-controlled interactions between components of adenylate cyclase. FEBS Lett., 1979, v. 101, N 1, p.85-89.

119. Pike L.J., Lefkowitz R.J. Correlation of -adrenergic recep3tor-stimulated H GDP release and adenylate cyclase activation. Differences between frog and turkey erithrocyte membranes. J.Biol.Chem., 1981, v.256, N 5, p.2207-2212.

120. Pinto L.H., Brown J.E., Coles J.A. Mechanism for generation of the receptor potential of rods of Bufo marinus. In: "Vertebrate photoreception", Don., N.-Y., San-E., 1977,p.159-167.

121. Poo Hu-Ming, Cone R.A. Lateral diffusion of rhoaopsin in photoreceptor membrane. Nature, 1974, v.247, p.438-441.

122. Pober J.S. , Bitensky M.W. Light-regulated enzymes of vertebrate retinal rods. Adv.Cyclic Nucleotide Res., 1979, v. II, p.265-308.

123. Robinson W.E., Hagins W.A. A light activated GTPase in retinal rod outer segments. Biophys.J., 1977, v.17, 196a (abstr.).

124. Robinson W.E., Hagins W.A. GTP hydrolisis: a possible source of free energy for transmitter cycle in visual excitation.- Biophys.J., 1979, v.25, 318a (abstr.).

125. Robinson P.R., Kanamura S., Abramson B., Bownds M.D. Control of the cyclic GMP phosphodiesterase of frog photoreceptor membranes. J.Gen.Physiol., 1980, v.76, p.631-645»

126. Robinson J.B., Jr., Brems D.N.,•Stellwagen E. A monoisomeric NDPK capable of complete phosphorylation. J.Biol.Chem., 1981, v.256, p.10796-10773.

127. Rodbell M. The role of hormon receptors and GTP regulatory proteins in membrane transtuction. Nature, 1980, v.284, p.17-22.

128. Roobol K. , Moller ¥«. Protein sinthesis in Artemia salina. Eucaryotic elongation factor eEF-Ts is a transphosphorylase.- Molec.Biol.Rep., 1981, v.7, p.197-202.

129. Ruusala T., Ehrenberg M., Kurland C.S. Catalytic effects of elongation factor Ts on polypeptide synthesis. EMBO Journal, 1982, N 1, p.75-78.

130. Ross E.M., Gilman H.G. Biochemical properties of hormon sensitive adenilate cyclase. Ann.Rev.Biochem., 1980, v.49, p.533-564.

131. Shinozawa T., Uchida S., Martin E., Cafiso D., Hubbell W.,

132. Bitensky M. Additional component required for activity andireconstitution of light-activated vertebrate photoreceptor GTPase. Proc.Hatl.Acad.Sci.USA, 1979b, v.77, N 3, p.1406-1411.

133. Shichi H., Somers R.L. Distribution of enzymes involved in nucleotide metabolism in the disk and other rod membranes. Photochem.Photobiol., 1980, v.32, p.491-495.

134. Shinozawa T., Bitensky M.W. Purification and characteristics of photoreceptor lightactivated guanosinetriphosphatase. -Biochem., 1981, v.20, p.7068-7074.

135. Smith H.G. , Jr., Eager R.S., Litman B.J. Light-activated calcium release from sonicated bovine rod outer segments disks. Biochem., 1977, v.16, p.1399-1405.

136. Stryer L. , Hurley J.B., Eung B.K.-K. Transducin: an amplifier protein in vision. Trends in Biochem.Sci., 1981, v.6, N 9,p.245-247.

137. Szuts E.Z., Cone R.A. Calcium content of frog rod outer segments and disks. Biochim.Biophys.Acta, 1977, v.468, p.194-208.

138. Totsuka Y., Nielsen T.B. , Field J.B. Roles of GTP and GDPin the regulation of the thyroid adenylate cyclase system. -Biochim.Biophys.Acta, 1982, v.718, p.138-143»

139. Uchida S. , Wheeler G.L. , Yamazaki A. , Bitensky M.V. A GTP-protein activator of phosphodiesterase which forms in response to bleached rhodopsin. J.Cycl.Nucleotide Res., 1981, v.7, N 2, p.95-104.

140. Weissbach H., Miller D.L., Hachmaun J. Studies on the role of factor Ts in polypeptide synthesis. Archives Biochem. Biophys., 1970, v.137, p.262- 269.

141. Wheeler G., Matuo I., Bitensky M.W. Light-activated GTP-ase in vertebrate photoreceptors. Nature, 1977b, 269, p.822-824.

142. Wheeler G.L., Yamazaki A., Bitensky M.W. A GTP-protein activator of phosphodiesterase which forms in response to bleached rho-dopsin. J.Cycl.Nucleotide Res., 1981, v.7, N 2, p.95-104.

143. Wheeler G.L., Bitensky M.W. A light-activated GTPase in vertebrate photoreceptors: regulation of light-activated cyclic GMP phosphodiesterase. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1977, v.74, p.4238-4242.

144. V/ilkening D. , Sabol S.L. , Nirenberg M. Control of opiate receptor-ad enylate cyclase interactions by calcium ions and guanosine-5'-triphosphate. Brain Res., 1980, v.189, p.459-466.

145. Woodruff M.L., Bownds M.D. Amplitude, kinetics and reversibility of a light-induced in guanosine 3',5'-cyclic monophosphate in frog photoreceptor membranes. J.Gen.Physiol., 1979, v.73, p.629-653. *

146. Woodruff M.L., Bownds D. , Green S.H., Morrisey J.L., Shed-lovsky A. Guanosine 3',5'-cyclic monophosphate and the in vitro physiology of frog photoreceptor membranes. J.Gen.Phys., 1977, v.69, p.667-679.

147. Woodruff M.L., Fain G.L., Bastian B.L. Light-dependent ion influx into toad photoreceptor. J.Gen.Physiol., 1982, v.80, p.517-536.2+

148. Yamazaki A., Sen I., Bitensky M.W. Cyclic GMP specific, high affinity, noncatalytic binding sites on light-activated Phosphodiesterase. J.Biol.Chem., 1980, v.255, N 23, p.11619-11624.

149. Yee R., Liebman P.A. Light-activated phosphodiesterase of the rod outer segments. Kinetics and parameters of activation and deactivation. J.Biol.Chem., 1978, v.253, p.8902-8909.

150. Yoshikami S., George J.S., Hagins N.A. Light-induced calcium fluxes from outer segments layer of vertebrate retinas. -Nature, 1980, v.286, B 5771, p.395-398.

151. Yoshikami S., Hagins W.A. Control of the dark currents in vertebrate rods and cones. Ins "Biochemistry and physiology of visual pigments", ed. Langer H., Springer-Verlag Inc., N.-Y., 1973, p.245-255.

152. Yoshikami S., Hagins W.A. Calcium in excitation of vertebrate rods and cones: retinal efflux of calcium studies with di-chlorophosphonazo III. Ann.N.Y.Acad.Sci., 1978, v.407,p.545-561.

153. Young R.W. The renewal of the photoreceptor cell outer segments. J.Cell.Biol., 1967, v.33, p.61-72.

154. Yoshikami S., Hagins W.A.H. Ionic composition of vertebrate photoreceptors by electron probe analysis. Biophys.J.,1976, v.16, N 2, pt.2, p.35a.

155. Zuckerman R., Schmidt G.J., Dacko S.M. Rhodopsin-to-metarhodopsine II transition triggers amplified changes in cytosol ATP and ADP in intact retinal rod outer segments. Procl.

156. Natl.Acad.Sci.USA, 1982, v.79, N 21, p.6414-6418.