Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы работы ключевых элементов систем фототрансдукции палочек и колбочек сетчатки позвоночных

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Механизмы работы ключевых элементов систем фототрансдукции палочек и колбочек сетчатки позвоночных"

На правах рукописи

Орлов Николай Яковлевич

Межанизмы работы ключевых элементов систем фототрансдукции палочек и колбочек сетчатки позвоночных

03.00.02-биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Пущино-2005

Работа вьшолнена в Институте Теоретической и Экспериментальной Биофизики РАН (Пущино), Токийском Столичном Институте Геронтологии (Токио) и Лаборатории Клеточной и Молекулярной Биофизики Центра Ядерных Исследований (Гренобль, Франция)

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Валерий Петрович Зинченко Доктор биологических наук, профессор Олег Евгеньевич Лебедев Доктор биологических наук Григорий Рафаэлевич Каламкаров

Ведущая организация: Институт Биоорганической Химии имени академиков М.М. Шемякина и ЮА. Овчинникова РАН.

Зашита диссертации состоится « 15 » июня 2005 г. в 12 часов на заседании Диссертационного Совета Д 002.093.01 в Институте Теоретической и Экспериментальной Биофизики РАН по адресу: 142290, г. Пущино, Московская область, ул. Институтская 3, ИТЭБ РАН

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, г. Пущино, Московская область, ул. Институтская 3, ИТЭБ РАН

Автореферат разослан «_»_2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, Кандидат физико-математических наук

Ма^'

Н.Ф. Ланина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Наружный сегмент палочки (НСП) сетчатки позвоночных - специализированный отдел фоторецепторной клетки, трансформирующий световое возбуждение в электрический сигнал. Он состоит из стопки замкнутых мембранных структур - дисков, окруженных плазматической мембраной. Диски содержат первичный и единственный акцептор видимого света в зрительной системе мембранный белок родопсин (R), а генератором выходного электрического сигнала является плазматическая мембрана. Активация всего лишь одной молекулы R из 107-109 молекул зрительного пигмента, присутствующих в НСП, ведет к появлению ответа, амплитуда которого составляет 3-5% от максимальной [Baylor et al., 1979]. Это означает, что in vivo система функционирует как счетчик одиночных фотонов, а в НСП локализован молекулярный усилитель, обладающий предельно высокой чувствительностью, огромньм коэффициентом усиления, предельно низким уровнем собственных шумов и высоким быстродействием - длительность ответа на поглощение одиночного фотона лежит в секундном диапазоне времен [Baylor et al., 1979].

Вопрос о том, как построен и функционирует такой усилитель, несомненно, актуален. Он был и продолжает оставаться предметом тысяч исследований последних десятилетий. Столь пристальный интерес к этой проблеме оказался оправданным. Действительно, в результате многолетних усилий стали ясны общие принципы построения системы зрительной трансдукции. Более того, стало очевидным, что эти принципы носят универсальный характер, а сама фоторецепторная система является одним из наиболее совершенных примеров систем клеточной трансдукции, аккумулируя в себе предельные свойства таких систем. Стало также очевидным, что система фототрансдукции палочек и колбочек сетчатки является простой и удобной экспериментальной моделью для изучения общих принципов высококачественной переработки информации в живых системах. Все это определяло и продолжает определять актуальность проблемы. Это показывает, что проблема носит общебиологический характер, а ее актуальность далеко выходит за рамки актуальности вопросов, непосредственно связанных с пониманием принципов работы сенсорных систем.

Настоящая работа имеет прямое отношение к поиску и всестороннему изучению ключевых элементов системы фототрансдукции палочек и колбочек сетчатки позвоночных. Она непосредственно связана с исследованием механизмов функционирования этих элементов и принципов работы системы фототрансдукции в целом. Все это определяет как актуальность выбранного направления исследований в целом, так и актуальность и важность конкретных задач, решаемых в ходе работы.

Цели и задачи исследования. 1) Началу современного этапа формирования представлений о механизме работы фоторецептора положила появившаяся в 70-х годах так называемая Са2+-медиаторная гипотеза Хэггинса [Hagins et al., 1970; Hagins,1972]. Гипотеза постулировала, что в НСП должен присутствовать медиатор - т.е. вещество или система веществ, передающих информацию через цитоплазму от мембран дисков на плазматическую мембрану диффузионным путем [Baylor, Fuortes, 1970; Hagins, 1972; Cone, 1973]. Основываясь на ряде косвенных данных, Хэгтинс предположил, что роль медиатора играют ионы Са2+, а фотоактивированный родопсин (R*) выполняет роль ионного канала, обеспечивающего выход ионов Са 2+ из внутридискового пространства. Изменение концентрации Са2+в цитоплазме, в свою очередь, ведет к изменению режима работы проводящих элементов плазматической мембраны НСП. Один из ключевых постулатов гипотезы состоял в том, что молекула R* должна приводит к выходу значительного количества ионов Са2+ из диска. Простота и изящество этой гипотезы

привлекла внимание к ней многих исследователей, а ее всесторонний анализ был предметом большого количества работ в течение ряда лет. Однако несмотря на все усилия подтвердить основной постулат этой гипотезы и зарегистрировать выход значительного количества ионов Са2+ в ответ на активацию одной молекулы R не удалось. Наши собственные исследования осмотического поведения различных типов фоторецепторных мембран, показали, что фотолиз молекулы R ведет к трансмембранному переносу не более одного иона [Гаспарян и соавт., 1980; Орлов и соавт., 1977; 1980]. Эксперименты по исследованию регуляторных характеристик каналообразующих структур плазматической мембраны НСП на ИЛМ не подтвердили предположения о регуляторной роли ионов кальция [Гаспарян и соавт., 1979, 1982; Фесенко и соавт., 1981]. Стало очевидным, что ионы Са2+ , хотя и играют определенную роль в работе фоторецептора, вряд ли могут претендовать на роль первичного медиатора в акте фоторецепции.

Альтернативная точка зрения на природу медиатора в акте фоторецепции была стимулирована открытием сАМР и его роли как медиатора в процессах регуляции активности клеток внеклеточными гормонами. Попытки найти подобную систему в фоторецепторах [Bitensky et a]., 1971; Miller et al., 1972] привели к открытию в НСП cGMP-специфичной фосфодиэстеразы (PDE), активирующейся при обесцвечивании незначительных количеств родопсина [Pannbacker et al., 1972; Pannbacker, 1974; Bitensky et al., 1972; 1973,1975; Miki et al., 1975; Pober, Bitensky, 1979; Keirns et al., 1975]. Необычно высокое содержание PDE в НСП и ее огромная каталитическая активность делали ее потенциально способной быстро и значительно изменить концентрацию предполагаемого медиатора, в данном случае cGMP, в цитоплазме в ответ на свет. Несмотря на противоречивость данных о содержании cGMP в фоторецепторах и его концентрационных изменениях в ответ на свет, результаты экспериментов по электрофоретической инъекции этого соединения в НСП [Miller, Nicol, 1979, 1981; Miller, 1982] заставляли серьезно относится к cGMP как первичному медиатору в акте фоторецепции. В нашей лаборатории методом внутриклеточного диализа было показано, что cGMP увеличивает проводимость плазматической мембраны НСП [Куркин, Фесенко, 1982]. Кроме того, стало ясно, что длительность ответа палочек на одиночный фотон достаточно велика и потому вполне может быть обеспечена функционированием некой ферментативной системы.

Веский аргумент в пользу того, что PDE является ключевым ферментом системы фототрансдукции палочек, был получен в 1978 г в результате исследований Ии и Либмана [Yee, Liebman, 1978]. Было показано, что при низких уровнях облучения активация одной молекулы родопсина в НСП ведет к активации значительного количества (до 500) молекул PDE. Таким образом, был впервые обнаружен процесс, который потенциально мог бы обеспечить усиление зрительного стимула. Эти результаты делали принципиально интересным вопрос о том, каким же образом одна молекула родопсина способна активировать значительное количество молекул PDE? Поиску ответа на этот вопрос и посвящена первая часть нашей работы.

Выполненные нами предварительные оценки, основанные на данных о диффузионной подвижности родопсина в мембране и концентрации PDE на поверхности диска, показывали, что сам R не способен взаимодействовать с требуемым количеством молекул PDE. Выходом из этого положения могло быть предположение о наличие посредника в процессе активации PDE родопсином. Такой посредник должен удовлетворять ряду условий. Он должен обладать высокой диффузионной подвижностью, присутствовать на поверхности диска в значительной концентрации и, что принципиально важно, быть способным запоминать кратковременное взаимодействие с R* на время, достаточное для переноса этой информации на молекулы PDE и их активацию в в течение относительно длительного времени. Иными словами, такой посредник должен обладать

неким аналогом памяти. Анализ литературных данных, несмотря на их ограниченность, показывал, что таким посредником мог бы быть GTP-связывающий белок.

Предположение о возможности функционирования таких белков в процессе передачи возбуждения от рецепторов гормонов на каталитическую субъединицу аденилатциклазы, стимулированное открытием необходимости участия GTP в этом процессе [Rodbell et al., 1971], активно рассматривалось исследователями, работающими в этой области [Rodbell, 1980; Cassel, Selinger, 1977; 1978; 1980; Blume, Foster, 1976]. В 1977 году было также показано, что GTP является необходимым участником процесса фотоактивации PDE и в фоторецепторах [Wheeler et al., 1977; Wheeler, Bitensky, 1977]. Совокупность этих данных и предположений и явилось для нас основанием для поиска GTP-связывающего белка в НСП сетчатки позвоночных. Поиск GTP-связывающего белка в НСП сетчатки позвоночных и всестороннее исследование его механизмов активации и регуляции и явилось одной из основных целей настоящей работы.

Решение этой задачи облегчалась результатами наших предыдущих исследований. Разработка установки импульсного фотолиза с источником света микросекундной длительности, работающей в широком диапазоне температур [Фесенко и соавт, 1971 ;1972 а,б] позволило выполнить детальные исследования кинетики перехода прелюмиродопсин-люмиродопсин и показать, что кинетика этого процесса хорошо описывается суммой трех параллельных реакций первого порядка [Фесенко и соавт., 1972; 1973]. Исследуя причины сложности кинетики распада ранних промежуточных продуктов фотолиза родопсина, мы предположили, что одной из них может быть взаимодействие родопсина с какими-либо белковыми компонентами НСП [Фесенко, Орлов, 1977]. В пользу такого предположения свидетельствовали и результаты анализа детергентных препаратов родопсина методом изоэлектрофокусирования (IEF) [Орлов и соавт., 1977]. Последующая модификация процедуры получения НСП и их экстракции, а также применение для анализа экстрактов метода высокоразрешающего электрофореза (SDS-PAGE) [Laemmli, 1970; Фесенко и соавт., 1980; Гулак и соавт., 1984; Gulak et al., 1984] показала, что НСП содержат полипептиды, концентрация которых в НСП очень велика (5-10% от концентрации R). Таким образом, к начале работы по поиску GTP-связывающего белка мы имели данные, указывающие на то, что в НСП присутствуют белковые компоненты в количестве достаточном для того, чтобы играть роль активатора PDE.

2) К началу следующего этапа наших исследований было ясно, что cGMP-специфичная PDE НСП - сложный мультисубъединичный фермент, относящийся к подсемейству циклонуклеотид-зависимых, циклонуклеотид-специфичных фосфодиэстераз, но отличающийся от них огромной каталитической активностью в присутствии GTP-связывающего белка НСП трансдуцина (Gt) и наличием ингибиторной субъединицы, плотно связанной с каталитической частью и потому обеспечивающего предельно низкую активность PDE в темновых палочках. В связи с этим исследование механизма активации PDE трансдуцином и ее регуляции имели принципиальный интерес. В нашей работе решались вопросы, имеющие отношение к (1) механизму ее активации трансдуцином, (2) природе ее связи с фоторецепторной мембраной и (3) регуляции ее базальной активности.

3) Хотя ионы Са2+ и не играют роль первичного медиатора, но принимают участие в регуляции параметров электрического ответа НСП. В связи с этим одной из целей настоящей работы являлся поиск Са2+-связывающих белков, которые могли бы опосредовать действие ионов Са2+, а также поиск белков, которые являются мишенями для таких Са2+-связывающих белков, например, кальмодулина.

4) Несмотря на успехи, достигнутые в изучении системы фототрансдукции палочек, принципы построения системы фототрансдукции колбочек долгое время оставались неясными. Характеристики колбочек не исключали возможности того, что роль медиатора в колбочках играют ионы Са2+. В связи с этим в нашей работе была предпринята попытка выяснить принципы построения системы фототрансдукции колбочек. Объектом исследования являлись сетчатки суслика, основное количество зрительных клеток которого представлено колбочками.

5) Система фототрансдукции НСП является одной из немногих систем, для которой можно достаточно точно определить скорость активации GTP-связывающего белка (в данном случае, Gt) в присутствии эндогенного активатора (в данном случае, R*). В связи с этим одной из задач работы являлась попытка определить, способен ли известный механизм активации GTP-связывающих белков - обмен связанного GDP на свободный GTP (GDP/GTP обмен)- обеспечить требуемую скорость активации Gt в НСП. Для этого с помощью различных методов и подходов мы пытались определить скорость диссоциации GDP из активного центра трансдуцина в присутствии R*. Одновременно были предприняты попытки (1) выяснить возможность активации Gt в результате индуцируемого молекулой R* фосфорилирования связанного GDP до GTP и (2) определить природу компонента, способного осуществить такую реакцию.

6) В ходе исследований мы обнаружили, что нуклеозиддифосфаткиназа (NDP киназа) НСП сетчатки быка взаимодействует с родопсин-трансдуциновым комплексом (R*Gt комлекс). В связи с этим одной из задач работы было детальное исследование характеристик этого взаимодействия. Исследования выполняли, используя как NDP киназу НСП сетчатки быка, так и рекомбинантные изоформы NDP киназы крысы и их генноинженерные производные. Согласно современным представлениям, NDP киназа-мультифункциональный белок, играющий важную роль в многочисленных регуляторных процессах в клетке в норме и патологии, причем функциональная роль его изоформ различна. В связи с этим одной из задач работы явилось исследование рекомбинантных а и изоформ NDP киназы и их производных физико-химическими методами (в частности, методом собственной белковой флуоресценции и методом остаточной ферментативной активности) для того, чтобы определить ключевую физическую основу различий изоформ, определяющих (а) различие их характеристик как белков, и как следствие, (б) различие их функциональных ролей в клетке.

Научная новизна. В НСП сетчатки лягушки обнаружен гетеротримерный GTP-связывающий белковый комплекс (транедуцин, Gt), молярная концентрация которого в НСП составляет 5-7% от концентрации R. Центр связывания GTP принадлежит его а субъединице. При малых уровнях фотолиза молекула R* индуцирует образование значительного количества молекул Gt-GTP. Это означает, что Gt может обеспечивать первичное усиление зрительного стимула и быть посредником в процессе передачи информации от молекулы R* на молекулы PDE.

Выполнен анализ гипотезы, согласно которой активное состояние транедуцина (Gt-GTP) формируется из неактивного состояния (Gt-GDP) в результате индуцируемого R* обмена связанного GDP на свободный GTP (GDP/GTP обмен). Эксперименты, выполненные на препаратах НСП сетчатки лягушки при соблюдении условий, способствующих максимальной скорости обмена, показали, что скорость GDP/GTP обмена мала. Ё последующих специальных опытах, выполненных на различных типах препаратов мембран НСП сетчатки быка с помощью широкого спектра подходов и методов (в частности, при использовании метода быстрой фильтрации и применении радиоактивно меченных GDP и GTP) было показано, что время диссоциации комплекса

Gt-GDP в присутствии R* в составляет 4-6 с при 20°С. Такие результаты делают маловероятным предположение о том, что обмен связанного GDP на свободный GTP может обеспечить необходимую скорость активации Gt (~103 молекул Gt/c,) in vivo.

Обнаружено, что в препаратах НСП сетчатки лягушки GDP, связанный трансдуцином, способен фосфорилироваться до GTP в присутствии R* и АТР. Процесс фосфорилирования протекает с высокой скоростью даже при 0°С. Высказано предположение о том, что фотоиндуцированное фосфорилирование связанного GDP до GTP может лежать в основе быстрой активации Gt в фоторецепторах.

Высказано предположение о том, что скорость гидролиза GTP в активном центре трансдуцина может определять время жизни его активного состояния и, следовательно, характеристики работы молекулярного усилителя НСП. Разработан так наз. «однооборотный» метод измерения времени гидролиза GTP в активном центре Gt. Выполнены измерения скорости гидролиза GTP в активном центре Gt в препаратах НСП сетчатки лягушки. Показано, что время гидролиза GTP резко уменьшается при понижении концентрации ионов Са2+ до наномолярного уровня. Таким образом, впервые была показана принципиальная возможность регуляции времени жизни активного состояния Gt. Последующее использование «однооборотного» метода измерения времени гидролиза GTP в активном центре Gt в ряде лабораторий способствовали открытию семейства белков RGS (Regulators of G protein Signalling), способных в комплексе с рядом дополнительных белков увеличивать скорость гидролиза GTP в активном центре G белков.

Выполнены эксперименты, показавшие, что активированная PDE есть комплекс фермента с активной формой Gt. Подобная точка зрения подтверждена в ряде последующих работ и стала общепринятой. Показано наличие популяции PDE, плотно связанной с мембраной, но экстрагирующейся из нее при кратковременной обработке препаратов низкими концентрациями трипсина. Высказано предположение о наличии в составе PDE липидного якоря, иммобилизующего PDE на мембране. Подобное предположение нашло свое последующее экспериментальное подтверждение в ряде работ других лабораторий. Обнаружено развивающееся во времени увеличение активности различных типов препаратов PDE НСП при гидролизе сАМР. Высказано предположение о функциональной роли некаталитических центров связывания cGMP.

Предпринята попытка выяснить природу ключевых компонентов системы зрительной трансдукции колбочек. Для этого разработан метод получения препарата НС колбочек сетчатки суслика, Полученный препарат содержал PDE, близкую PDE палочек по ее содержанию в фоторецепторной клетке, кинетическим характеристикам, значению к.м.м., pI, термостабильности, чувствительности к действию трипсина, наличию в ее составе термостабильного белкового ингибитора и способности активироваться в присутствие обесцвеченного зрительного пигмента и GTP. Это дало основание считать, что колбочки, как и палочки, содержат ферментативный каскад усиления, функционирующий с участием cGMP-специфичной PDE и GTP-связывающего белка. Выполнен анализ, результаты которого позволили сделать вывод о том, что системы фототрансдукции палочек и колбочек подобны, но различаются в системах, прекращающих развитие процесса активации после действия света и возвращающих элементы и систему в целом в первоначальное состояние. Сделанное заключение позволяет объяснить хорошо известные различия палочек и колбочек в кинетике фотоответов и светочувствительности.

Методом аффинной хроматографии на мелитгин-сефарозе обнаружен ряд белков, взаимодействующих с сорбентом Са2+-зависимым образом. Белки с к.м.м. 21 Ы5а и 10 Юа был идентифицированв как кальмодулин и белок S-100, соответственно. Белки с к.м.м ® 26 И)а были позднее идентифицированы в других лабораториях как (1) рековерин, ингибирующий родопсинкиназу в темноадаптированных фоторецепторах и снимающий ингибирующий эффект при понижении ионов кальция в цитоплазме НСП в ответ на свет и (2) как белки ОСАР-1, ОСАР-2, участвующие в процессе активации гуанилатциклазы при светоиндуцируемом понижении концентрации ионов Са+ в фоторецепторах. Совокупность этих данных способствовала формированию современных представлений о роли ионов Са2+в формировании первичного ответа фоторецепторов позвоночных.

Показано, что водорастворимая NDP киназа в препаратах НСП сетчатки быка способна к равновесному связыванию с обесцвеченными фоторецепторными мембранами. Такое равновесное взаимодействие находится под контролем концентрации Н* И На+, К+, Са ИЛИ Мя . Обнаружено, что: 1) мембраносвязанная N0? киназа высвобождается в присутствии низких концентраций ОТР[8); 2) СТР[8]-зависимое взаимодействие NDP киназы с обесцвеченными мембранами имеет место лишь в присутствии трансдуцина; 3) мембраны, лишенные СЙ, характеризуются низким сродством к МВР киназе и взаимодействуют с ферментом 0ТР[8]-независимым образом. Предполагается, что 0ТР[Б]-зависимое взаимодействие NDP киназы с обесцвеченными мембранами НСП опосредуется с помощью (Й, а центрами связывания фермента являются комплексы между а и я*. Рассматривается возможность участия МВР киназы в процессе быстрой фотоактивации 01. В последующих модельных экспериментах исследовалось взаимодействие рекомбинантных а- И Р-изоформ NDP киназы крысы с обесцвеченными мембранами НСП сетчатки быка. Показано, что изоформа а способна к рН, катион- и 0ТР[8]-зависимому взаимодействию с мембранами подобно эндогенной NDP киназе НСП сетчатки быка, а трансдуцин является необходимым партнером такого взаимодействия. Обнаружено, ОТР-зависимое взаимодействие является изоформ-специфичным: кажущееся сродство изоформы Р к центрам связывания в фоторецепторных мембранах по крайней мере в 100 слабее, чем сродство МВР киназы а. Представлены косвенные данные, указывающие на то, что различия в сродстве изоформ к комплексу Я^а обусловлены различиями вариабельных участков VI этих гомогексамеров. Показано, что именно МВР киназа является мишенью для действия Н* и катионов К+, Са2+ ИЛИ М£2+) и

опосредует их влияние на взаимодействие между NDP киназой и комплексом

Изолированные высокогомологичные рекомбинантные гомогексамеры а И Р NDP киназы крысы (каждый из двух типов субъединиц содержат 3 триптофана (Тгр78, 133, и 149) и 4 тирозина (Тут 52, 67, 147, и 151)) были детально исследованы методом собственной белковой флуоресценции в растворе. Обнаружено, что данные белки принципиально различны по своим флуоресцентным свойствам (квантовому выходу, положению максимума спектра флуоресценции и форме спектра) при нейтральных рН и их поведению при рН титровании. Обнаружено, что МВР киназа а подвергается структурным изменениям в диапазоне рН 5-8, тогда как NDP киназа Р стабильна в этом диапазоне условий. Выполнен анализ, указывающий на то, что различия в конформационной лабильности и спсобности изоформ NDP киназы к взаимодействию с родопсин-трансдуциновым комплексом могут иметь одну и ту же физическую основу, которая возможно одновременно определяет и известные различия в функциональной роли изоформ NDP киназы в клетке. Предполагается, что причиной таких различий, скорее всего, являются различия электростатической ситуации в этих белках, а не какие-либо структурные различия между ними при нейтральных рН.

Выполнено сравнительное исследование рекомбинантных МБР киназ а и крысы (} и их химерных, мутантных и tag-производных методом собственной белковой флуоресценции. Полученные результаты дают основания считать, что уникальные флуоресцентные свойства МБР киназы а и способность к конформационным перестройкам, отличающие ее от изоформы ¡5, определяются свойствами вариабельного участка VI. Возможно, что различия в структуре и свойствах этого участка и определяют функциональные различия изоформ а И Р в клетке. Показано, что участок VI также определяет способность МБР киназы а взаимодействовать с О-белками и различия в термостабильности а- и Р-производных фермента. Сделан вывод о том, что дальнейшие исследования по выявлению основ функциональных различий между изоформами МБР киназы млекопитающих должны сводиться к изучению точечных мутантных форм МБР киназы по вариабельным аминокислотным остаткам участка VI. Наиболее вероятными заменами, определяющими функциональные различия изоформ крысы, являются

замены Аг£4201п, Н1з47Ьеи И АЯ1б9Н18. В дальнейших исследованиях эти аминокислотные остатки должны быть главной мишенью для направленного мутагенеза.

Анализируется гипотеза, согласно которой функциональный смысл обнаруженного в настоящей работы специфического взаимодействия между МБР киназой и R*Оt комплексом отражает один из этапов участия этого фермента в процессе активации О белка палочек сетчатки.

Научно-практическое значение работы. Результаты работы и высказанные предположения значительно расширяют наши представления как о молекулярных механизмах работы фоторецепторов сетчатки позвоночных, так и об общих принципах работы систем клеточной трансдукции. Они также способствуют углублению наших представлений о принципах построения систем, осуществляющих высококачественный информационный процессинг в клетке.

Сравнительное исследование палочек и колбочек показало принципиальное подобие их систем фототрансдукции. Одновременно выявлены ключевые элементы молекулярного усилителя, изменение которых принципиально меняет основные свойства фоторецепторов позвоночных.

Разработанный нами однооборотный метод измерения времени гидролиза ОТР в активном центре ОТР-связывающих белков нашел широкое применение во многих лабораториях нашей страны и за рубежом. Данный метод позволил получить результаты, способствующие формированию современных представлений о молекулярных механизмах регуляции времени жизни активного состояния белков этого семейства.

Полученные данные вносят заметный вклад в понимание вопроса о физиологическом смысле присутствия в клетках млекопитающих консервативных изоформ МБР киназы с близкими структурными и каталитическими свойствами. Сделаны предположения о физической основе различий между изоформами, которая, по-видимому, и определяет все известные различия в функциональной роли изоформ МБР киназы в клетке. Такие выводы представляют интерес в связи с многочисленными данными об участии различных изоформ МБР киназы в процессах клеточной регуляции (процессы клеточной трансдукции, дифференцировка, регуляция экспрессии генов) в норме и патологии (канцерогенез, метастазирование, апоптоз).

Апробация работы. Материалы работы докладывались на 1-ом Всесоюзном Биофизическом Конгрессе (Москва, 1982), IV Всесоюзном Симпозиуме «Циклические нуклеотиды» (Минск, 1982), IX Всесоюзной Конференции по Биохимии нервной системы

(Ереван, 1983), IV Всесоюзном Симпозиуме «Химия белков и пептидов» (Рига, 1983), V Всесоюзном Симпозиуме «Механизмы сенсорной рецепции» (Пущино, 26-28 сентября 1984), Юбилейной Научной Конференции Института Биофизики АН СССР «40-летие Великой Победы» (Пущино, май 1985), VIII Симпозиум Биохимических Обществ СССР и ГДР «Проблемы биохимии и биотехнологии» (Рига, 1985), Симпозиуме «Люминесцентный анализ в медицине и биологии. Приборы и применение» (Рига, 1985), Всесоюзном Симпозиуме «Зрение организмов и роботов»(Вильнюс, 1985), 13th International Biochemical Congress (Amsterdam, 1985), V Всесоюзном Симпозиуме «Циклические нуклеотиды и регуляция ферментативных реакций» (Рязань, 1985), VI Всесоюзном Симпозиуме «Конформационные изменения биополимеров в растворах» (Тбилиси, 1985), V Всесоюзном Биохимическом Съезде (Киев, 1986), 17 FEBS Meeting (West Berlin, 1986), II Школе-семинаре «Механизмы зимней спячки млекопитающих» (Пущино, 3-12 июля 1986), VI General Meeting of the European Society for Neurochemistry «Molecular Basic of Neural Functions», (Prague, 1986), VI Всесоюзном Симпозиуме «Роль циклических нуклеотидов и вторичных месенджеров в регуляции ферментативных реакций» (Петрозаводск, 1988), VI Всесоюзном Симпозиуме «Механизмы сенсорной рецепции» (Москва, 12-16 ноября 1988), International Simposium "Molecular organization of biological structures" (Moscow, 1989), 19th FEBS Meeting (Rome, Italy, 1989), 8th European Society Neurochem. Meeting (Leipzig, 1990), Научной конференции ИТЭБ РАН (Пущино, 1994), International Conference «Physics and Chemistry of Organic Luminophores'95» (Kharkhov, 1995), International Meeting «Spectroscopy of Organic Compounds» (Nezhgin, Ukraine, 1995), First International Workshop on nm23/NDP kinase (Paris, 1995), Eighth International Conference ofthe International Society of Differentiation (ISD) (Hiroshima, Japan, 1994), 3rd Internet World Congress on Biomedical Sciences (Tokyo, 1996), 41th Annual Meeting ofthe American Biophysical Society (New Orleans, USA, 1997), XXXIII International Congress of Physiological Sciences (St. Petersburg, Russia, 1997), Междунар. конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 1998), П Russian Biophysical Meeting (Moscow, 1999), International Symposium «Biological Motility: New Trends in Research» (Pushchino, 2001), Fourth International Congress ofthe Genetics, Biochemistry and Physiology of NDP Kinase/NM23 (Tokyo, Japan, 2001), 45th Annual Meeting ofthe American Biophysical Society (Boston, USA, 2001), Международной конференция "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 2003), Fifth International Congress of the Genetics, Biochemistry and Physiology of NDP Kinase/ NM23/AWD (Lexington, KY, U.S.A., 2003), International Symposium "Biological Motility" dedicated to the memory of academician G.M. Frank (1904-1976) (Pushchino, 2004), III Съезде Биофизиков России (Воронеж, 2004).

Основные методы

Получение препаратов НСП сетчатки позвоночных. Препараты НСП сетчатки лягушки Rana temporaria и быка Bos taurus получали в близком соответствии с описанными ранее методами [Гаспарян и соавт., 1980; Krapivinsky et al, 1980; Тищенков, Орлов, 1983] при 4°С и слабом красном свете (20 ВТ, X > 680 нм) в результате мягкой гомогенизации сетчаток в 40% (w/v) растворе сахарозы, приготовленном на изотоническом буфере А (25 мМ Tris-HCl, pH 7.6, 140 мМ NaCl, 3.5 мМ КС1, 2 мМ MgCI2, 0.1 мМ СаС12 и 0.1 мМ дитиотрешол (DTT)) и последующей двукратной флотации (140000 g, 1 ч) суспензии. Очищенные НСП (А280/А500 =2,3-2,8) суспендировали в той же среде при концентрации R = 5 мг/мл, хранили в темноте при 0°С и использовали в работе 1-3 суток. Длительное хранение осуществляли при -20°С. Получение препаратов, обогащенных водорастворимыми белками НСП сетчатки лягушки. НСП суспендировали в растворе с низкой ионной силой (1 мМ Tris-HCl, pH 7.6, 0.1 мМ DTT) при слабом красном свете и центрифугировали 1 ч при 140000 g. Супернатанты (концентрация белка 1-1.5 мг/мл) собирали и использовали в работе.

Получение препаратов фоторецепторных мембран, свободных от водорастворимых компонентов НСП сетчатки лягушки. НСП суспендировали в растворе с низкой ионной силой (1 мМ Tris-HCl, pH 7.6, 0.1 мМ DTT) при слабом красном свете и центрифугировали 30 мин при

140000 g. Процедуру промывки мембран проводили не менее 3-4 раз. Полученные мембраны хранили в темноте при -20°С.

Разделение белков методом гель-фильтрации. И зоэлектр о фокусирование (IEF). Электрофорез. Гель-фильтрацию препаратов водорастворимых белков НСП (1-1.5 мг) проводили при 0°С на колонке 93 х 1.5 см с Sephacryl S-200 (Pharmacia, Швеция) в буфере, содержащем 10 мМ Tris-HCl, рН 7.6, 100 мМ КС1, 5 мМ MgCl2 и 0.1 мМ DTT, при скорости элюции 20 мл/ч. Объем собираемых фракций 1-2 мл. IEF водорастворимых белков НСП в градиенте плотности сахарозы проводили как описано ранее [Тищенков, 1984] на самодельной колонке объемом 30 мл, используя для создания градиента рН (рН 3.5-9.5) амфолиты-носители (LKB, Швеция), Элетрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствие додец ил сульфата натрия ( SD S -PAGE) проводили по методу Лэммли [Laemmli, 1970].

Связывание гуаниловых нуклеотидов различными типами препаратов НСП. Определение

уровня связывания негидролизуемого аналога GTP

([3H]GppNHp) проводили при 20°С в среде, содержащей 50 мМ Tris-HCl, рН 7.6, 100 мМ КС1, 1 мМ MgCl2 и 0.1 мМ DTT при конечной нуклеотида 0.43-10 мкМ. Реакцию индуцировали добавлением [3H]GppNHp в темновые или облученные видимым светом суспензии НСП при концентрации зрительного пигмента 0.1-1 мг/мл. После инкубации в течение определенного времени пробы объемом 50-100 мкл наносили на нитроцеллюлозные фильтры с диаметром пор 0.4 мкм ("Сынпор", ЧССР) и промывали 3-4 порциями по 0.8 мл указанного выше буфера в течение 15 с. Радиоактивность фильтров определяли в толуольном сцинтилляторе на счетчике SL-4000 (Intertechnique, Франция). Препараты НСП, содержащие дозированное количество R*, получали, облучая темновые препараты НСП желтым светом в течение 2 мин за 15-20 мин до начала опыта. Степень фотолиза регулировали изменением расстояния до источника облучения и применением нейтральных светофильтров. Препараты, содержащие более 80% R*, были обозначены как светоадаптированные препараты НСП.

Измерение уровня связывания [3H]GppNHp препаратами водорастворимых белков НСП или фракциями, полученными при их разделении методом гель-фильтрации, проводили в среде, содержащей указанный выше буфер и светоадаптированные мембраны ([R*]=l мг/мл), свободные от водорастворимых белков НСП (см. выше). Связывание инициировали добавлением препарата водорастворимых белков или фракций, полученных при гель-фильтрации. Инкубацию вели 20 мин.

Процессы диссоциации [14C]GDP из связывающих центров светоадаптированных и преинкубированных с 1 мкМ радиолигандом в течение 10-15 мин НСП сетчатки лягушки изучали, регистрируя кинетику уменьшения количества связанного после введение в

образец GppNHp в конечной концентрации 0.1-1 мМ. Полученные данные описывали экспоненциальной зависимостью - стационарные

уровни связывания [3H]GDP до и после добавления антагониста, соответственно, а Т| - постоянная времени процесса.

Связывание негидролизуемого аналога GTP гуанозин 5'-0-(3-тио)трифосфата ([y^3S]GTP, GTP[S]) различными типами препаратов НСП сетчатки быка выполняли в принципиальном соответствии с описанными выше методами, используя нитр о целлюлозные фильтры НА 0.45 мкм (Millipore Corp., USA). В ряде случаев при исследовании процесса ассоциации [■/"SIGTP с центрами связывания использовали установку для быстрой фильтрации и метод скоростной обратной фильтрации, описанные далее.

Измерение скорости гидролиза [aMPJGTP в препаратах НСП сетчатки лягушки. Для удаления

эндогенного GDP светоадаптированные препараты НСП сетчатки лягушки суспендировали в изотоническом буфере А и центрифугировали 15 мин при 30000 g. Подобную процедуру проводили 3-4 раза. Полученные НСП суспендировали в той же среде в концентрации по R* 25-50 мкМ.

Измерения проводили в условиях, при которых концентрация [anP]GTP (0.3-0.5 мкМ) значительно ниже концентрации центров связывания . Реакцию инициировали

добавлением [a32P]GTP и вели при 20'С. Через определенные моменты времени из реакционной смеси отбирали пробы объемом 3-5 мкл и смешивали их с равными объемами этанола. Содержание [ct32P]GTP И [aî2P]GDP В пробах определяли в результате их разделения методом тонкослойной хроматографии на селикагелевых пластинах (Merck), радиоавтографии пластин и

последующего денситометрирования радиоавтографов. Временное разрешение метода, определяемое скоростью смешивания реагентов и отбора проб, составляло 2-3 с.

Аффинная хроматография водорастворимых белков НСП на мелиттин-сефарозе и кальиодулин-сефарозе. Мелиттин из яда пчел (Apis mellifera) получали по несколько модифицированному методу Кинга и соавт. [King et al., 1976] в результате гель-фильтрации (Sephadex G-50) и ионообменной хроматографии на колонке с КМ-целлюлозой. Электрофоретически гомогенные препараты кальмодулина и белка S-100 из мозга быка получали как описано нами ранее [Permyakov et al., 1985; Kreimer et al., 1992]. Мелиттин-сефароза и кальмодулин-сефароза были синтезированы сотрудником лаборатории В.М. Грищенко по описанным ранее методам [Kincaid, Coulson, 1985; Kincaid, Vaughan, 1979; Kreimer et al., 1992].

Для экстракции водорастворимых белков НСП суспендировали в гипотоническом буфере (10 мМ HEPES, рН 8.0,2 мМ EDTA, 1 мМ DTT) при концентрации R~l мг/мл и центрифугировали 1 ч при lOOOOOg. Процедуру экстракции проводили трижды. Супернатанты, содержащие 40-45% белка исходного препарата НСП, объединяли, диализовали при 0*С против буфера, содержащего 25 мМ BES, рН 7.0,250 мМ NaCl, 5 мМ MgC^,1 мМ СаС1 и 1 мМ DTT, центрифугировали (100000 g, 1 ч) и наносили на колонку в том же буфере. Колонки промывали Са2+-содержащими растворами с целью удаления компонентов, не взаимодействующих с сорбентом. Последующие этапы элюции проводили, используя EGTA-содержащие среды [Грищенко и соавт, 1989; Грищенко и соавт, 1998]. Определение активности PDE. Фосфодиэстеразную активность препаратов измеряли рН-метрическим методом [Liebman, Ivanchuk, 1982], регистрируя закисление среды, обесловленное появление протонов в ходе реакции гидролиза сАМР (иногда cGMP). В качестве рН-индикатора использовали краситель крезоловый красный (Реахим). Увеличение пропускания красителя при 575 нм регистрировали с помощью спектрофотометра "Specord UV-VIS", включенный в режиме измерения кинетики. Реакцию вели в кварцевых кюветах (длина оптического пути 0,2-1 см, объем 0.5-2 мл) при 30°С в среде, содержащей в большинстве опытов 10-40 мМ HEPES-NaOH (начальное значение рН 8,0), 25-50 мкМ крезоловый красный, 10 мМ MgCl2 и исследуемый препарат.

Часть измерений активности PDE, в частности измерения, проводимые при высокой концентрации НСП, выполняли с помощью малогабаритного (диаметр 3 мм) малоинерционного (т <2 с) рН-электрода в стеклянной ячейке (1-2 мл), снабженной магнитной мешалкой. Электрод был соединен с операционным усилителем и далее с аналогово-цифровым преобразователем. Цифровые значения подавались на вход персонального компьютера, снабженного разработанной в лаборатории программой (автор Д. Б. Вепринцев). Программа позволяла интегрировать значения в пределах устанавливаемого экспериментатором времени (0,1-1 с) и выводить значения рН каждые 1-5 с в виде табличных данных и(или) в виде графика изменений рН от времени.

Реакции инициировали добавлением 100 мМ сАМР до конечных концентраций 0,1-25 мМ. В ряде опытов использовали cGMP. При изучении активации PDE под действием активного трансдуцина после регистрации базальной активности фермента в течении нескольких минут в среду добавляли GTP, GppNHp или GTP[S] до необходимых концентраций и продолжали измерения в течении последующих 1-2 мин. В течении указанного времени скорость высвобождения протонов была постоянной. Для определения уровня максимальной активности фермент активировали трипсином (10 мкг/мл). После инкубации при 30°С в течении 2 мин протеолиз останавливали добавлением избытка ингибитора трипсина.

В ряде случаев измерение активности PDE в препаратах НСК сетчатки суслика проводили при 20°С, используя в качестве субстрата [14C]cGMP ("Amersham"). Реакционная смесь содержала 50 мМ Трис-HCl, рН 7.4, 140 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2, 2-3 мМ [uC]cGMP (конечная удельная активность 5-20 мКи/моль) и исследуемый препарат. Содержание [14C]cGMP и [14C]GMP в пробах, отбираемых в соответствующие моменты времени, определяли в результате их разделения методом TLC и авторадиографии пластин как описано выше.

Экстракция PDE из фоторецепторных мембран НСП сетчатки быка. Препараты НСП

сетчатки быка, полученные как описано выше, суспендировали в соответствующей среде при концентрации по родопсину 1 мг/мл и центрифугировали 1 ч при 60000 g. Супернатанты собирали, а осадок подвергали последующим этапам экстракции. В качестве сред применяли изотонический буфер (20 мМ Трис-HCl, рН 7.4, 150 мМ NaCl, 5 мМ MgC^ и 0.1 мМ DTT) и гипотонические растворы: раствор I (2 мМ Трис-HCl, рН 7.4, 0.5 мМ MgC^ и 0.1 мМ DTT) и раствор П (2 мМ HEPES, рН 8.0). В ряде случаев гипотонические растворы содержали 200 мкМ GTP или 2 мМ EDTA или (и) EGTA.

Получение препаратов наружных сегментов колбочек сетчатки суслика. В качестве исходного материала использовали сетчатки сусликов (Citellus undulates). Препарирование сетчаток и выделение наружных сегментов колбочек (НСК) проводили при слабом красном свете

(Я,> 680 нм) и 4°С. Сетчатки встряхивали 4-5 мин в 47% (w/v) растворе сахарозы, приготовленном на изотоническом буфере А (см. выше) и центрифугировали 15 мин при 10000 g. Супернатант собирали, гомогенизировали, помещали на дно центрифужной пробирки, наслаивали 40% и 30% (w/v) растворы сахарозы в буфере А и центрифугировали 1 ч при 100000 g. Материал, локализованный на границе между 30% и 40% растворами сахарозы (препарат НСК) и в стартовом растворе 47% сахарозы (препарат Ф47)» собирали и использовали в работе. Выход препарата НСК составлял 0.1-0.3 мг белка на сетчатку и определялся условиями гомогенизации. В качестве экстрактов препаратов НСК использовали супернатанты, полученные при экстракции препаратов НСК растворами с низкой ионной силой (10 мМ Tris-HCl, pH 7.4) и последующего центрифугирования (100000 g, 2 ч).

В ряде опытов использовали препараты ST - супернатанты, полученные из сетчаток животных, адаптированных к темноте 10-12 часов. Декапитацию животных, препарирование сетчаток и все последующие операции проводили в темноте или при слабом красном свете. Сетчатки (1-2 шт.) помещали в 1-2 мл буфера А, встряхивали и центрифугировали 1 мин при 300 g. Супернатант ST собирали, хранили в темноте и использовали в работе в течение 20-30 мин после их получения.

Анализ и очистка препаратов GDP. Чистоту GDP (Boehringer) анализировали методом высокоразрешающей жидкостной хромаграфии (FPLC) на колонке Mono Q (Pharmacia), используя для элюции линейный градиент NaCl (0 - 500 мМ) в 20 мМ Tris-HCl буфере (рН 8.0). По данным анализа препарат GDP содержал 0,2 - 0,5% GTP. Для очистки GDP подвергали двукратной жидкостной хроматографии на колонке Mono Q как описано выше. Примесь GTP в таком препарате была ниже чувствительности метода определения (<0.05%). Чистоту препаратов GDP также проверяли по их способности активировать PDE в суспензии НСП (см. далее).

Чистоту [3H]GDP (NEN) анализировали методом тонкослойной хроматографии (TLC) на 0.2 мм селикаглевых пластинах "Kieselgel (Merck) в смеси 1,4-диоксан : NH4OH (27%) :

вода в соотношениях 6:1:4 (v/v) с последующей радиоавтографией пластин и использованием усилительного экрана. Препарат [3H]GDP использовали без дополнительной очистки, поскольку примесь GTP не превышала 0.1%.

Процессинг GDP в препаратах НСП. НСП, суспендированные в изотоническом буфере А в конечной концентрации по белку 0.2-2 мг/мл, обесцвечивали комнатным светом. Реакции инициировали добавлением GDP или [3H]GDP до конечной концентрации 0.1-1 мМ. В диапазоне времен 0-60 мин отбирали пробы и анализировали их методами FPLC, или TLC с последующей авторадиографией пластин как описано выше.

Установка для скоростной фильтрации. В работе использовалась установка для скоростной фильтрации, детально описанная ранее [DuPont, 1984]. Благодаря фиксации нитроцеллюлозных фильтров (объем 30 мкл) между пластинами из пористого стекла и наличию устройства, подающего раствор определенного состава с заданной скоростью, аппаратура позволяла осуществлять промывку фильтров в течение заранее заданного времени со скоростью до 7 мл/с . Это давало возможность провести предельно быструю смену среды в фильтре, а при введении в среду промывки радиоактивных лигандов предельно быстро внести радиолиганд в реакционную среду (метод обратной скоростной фильтрации).

Измерения активности вТРазы трансдуцина «однооборотным» методом в препаратах НСП сетчатки быка. НСП суспендировали при 4°С в изотоническом буфере А в концентрации по белку 2 мг/мл, обесцвечивали и промывали 2-3 раза тем же буфером, центрифугируя по 15 мин при 100.000 g для удаления эндогенного GDP. Полученные НСП ([R*] ~ 1 мг/мл) при температуре 21-23°С быстро (<1 s) смешивали с [y^PJGTP (NEN) до конечной концентрации GTP 0.17-0.66 мкМ. Через определенные интервалы времени из реакционной среды отбирали пробы объемом по 30 мкл. Определение 32Р в пробах выполняли как описано ранее [Arshavsky, Bownds, 1992]. Эксперименты, выполненные на НСП сетчатки лягушки, проводили в близком соответствии с описанной схемой, используя в качестве субстрата [<X32P]GTP и разделяя продукты реакции ([a32P]GTP и [a32P]GTP) методом TLC с последующей авторадиографией пластин как описано выше. Данные описывали экспоненциальной зависимостью:

где - начальная и максимальная амплитуды ответа, соответственно, а - постоянная

времени процесса.

Измерение кинетики инкорпорирования [y^SJGTP в препаратах НСП, преинкубированных с

GTP. Полученные как описано в предыдущем разделе образцы НСП объемом по 100 мкл и

содержащие 2.5 нмолей R* и Ä 0.07 нмолей Gt (измерено по уровню инкорпорирования

быстро (<1 s) смешивали с 100 мкМ GTP до конечной концентрации 2 мкМ. После инкубации каждой из проб с GTP при 23°С в течение 2 с, достаточных для практически полного насыщение комплексов R*Gtлигандом, в нихдобавляли [y3,S]GTP до конечной концентрации 20 мкМ. После инкубации проб в течение 1-80 с, их быстро разбавляли 2 мл изотонического буфера и фильтровали. Общее время разбавления и фильтрации не превышало 2 с. Радиоактивность фильтров определяли стандартным методом. Данные описывали как результат двух последовательных реакций: A(t) - Ао + (Amax - Aq) {1 + [К2/(КrK2)]eXp(-K1t) - [Kt/( KrK2)]exp(-

- начальная и максимальная амплитуды ответа, соответственно, а константы скорости первого и второго последовательных процессов, соответственно. Определение активности и содержания NDP киназы в препаратах. Активность NDP киназы измеряли при ЗО'С, определяя скорость фосфорилировании TDP NDP киназой с помощью системы сопряженных ферментов пируваткиназы и лактатдегидрогеназы [Park and Agarval, 1973; Fukuchi et al., 1994]. Скорость расхода NADU на финальной стадии данной системы реакций измерялась спектрофотометрически по скорости уменьшения поглощения NADH при 340 нм в результате его перехода в NAD*.

Содержание NDP киназы определяли с помощью SDS-PAGE и иммуноблоттинга, используя поликлональные антитела (NK2) против NDP киназы крысы, взаимодействующие также с NDP киназой быка [Kimura, Shimada, 1988]. Поскольку распределения активности фермента и количества белка NDP киназы соответствовали друг другу, в большинстве опытов измеряли лишь ферментативную активность NDP киназы.

Получение препаратов рекомбинантных изоформ NDP киназы крысы и их производных.

Гены изоформ С1 И ß NDP киназы крысы и их производных были сконструированы и экспрессированы в Е. coli в Отделе Молекулярной Биологии Токийского Института Геронтологии Н. Ишикавой (Dr. N. Ishikawa) и Ю. Ишиджимой (Dr. Y. Ishijima) под руководством проф. Н. Кимуры. Рекомбинантные белки были очищены до гомогенного состояния (чистота > 98%, метод SDS-PAGE) сотрудниками нашей лаборатории методом аффинной хроматографии на АТР-агарозе. Получение частично очищенных препаратов NDP киназы НСП сетчатки быка. Препараты НСП промывали (100000 g, 10 мин) на свету при рН 5.5 (10 мМ MES-NaOH, 0.25 мМ MgCh) для удаления пула водорастворимых белков НСП и нуклеотидов. NDP киназу экстрагировали изотоническим буфером (рН 8), центрифугируя 1 ч при 100000 g.

Получение препаратов Gt: Препараты Gt получали известным методом [Kuhn, 1980]. По данным SDS-PAGE, трансдуцин составлял >90% белка в препарате. NDP киназа составляла <0.1% белка препаратов Gt.

Получение препаратов N- и W-мембран НСП для опытов по связыванию NDP киназы. Для

получения обедненных NDP киназой, Gt-содержащих мембран (N-мембраны), суспензии НСП (R*/R=0.2, [R]=0,5 мг/мл) в нейтральном буфере (10 мМ Tris-HCl, рН 7,5, 0,25 мМ MgC^) центрифугировали 10 мин при 100000 g. Далее мембраны трижды промывали как описано выше. Полученные мембраны содержали 80-90% Gt и 7-10% NDP киназы, присутствовавших в исходных препаратах НСП.

Мембраны, обедненные NDP киназой и Gt (W-мембраны), получали комбинацией методов, используемых для экстракции Gt и других периферических белков [Kuhn, 1980, Shinozawa, Bitensky, 1980]. По данным SDS-PAGE, R составлял >90% белка мембран. Содержание Gt в мембранах, определяемое с помощью антител против (Х-субъединицы G белков (DuPont/NEN), было ниже чувствительности метода (<5% от содержания Gt в НСП). Содержание NDP киназы составляло 5-7% от ее содержания в НСП.

Связывание эндогенной NDP киназы сетчатки с мембранами НСП. Для разделения свободной

и связанной форм NDP киназы НСП использовали метод центрифугирования. НСП разбавляли буфером до заданных концентраций по белку в объемах 50-200 мкл, гомогенизировали и центрифугировали 10 мин при 100000 g на центрифуге ТЫ 00 (Beckman, США) при 15-20°С. Супернатанты и осадки использовали для измерений активности NDP киназы и/или содержания фермента.

Связывание рекомбинантных NDP кияаз Ot Я ß с N- и W-мембранами. Эксперименты по

связыванию рекомбинантных изоформ NDP киназы крысы и их производных с препаратами N- и W-мембран проводили в близком согласии с методом, описанным выше. N- или W-мембраны смешивали при определенных условиях с препаратами рекомбинантных NDP киназ. Образцы (50200 мкл) центрифугировали 10 мин при 100000 g. Супернатант и осадок использовали для определения активности свободного и связанного фермента, соответственно. Активность NDP

киназы препаратов N- и W-мембран не превышала 0.2-0.5% активности рекомбинантного фермента. В отсутствии мембран рекомбинантные NDP киназы не седиментировали при центрифугировании, и не претерпевали необратимых изменений активности в присутствии используемых буферных и солевых растворов. Данные опытов по связыванию NDP киназы при различных концентрациях IT, солей и нуклеотидов анализировали с помощью выражения А= Aq +

активности NDP киназы в супернатантах при концентрации лиганда L, в отсутствии лиганда и при его насыщающих концентрациях, соответственно; К|/2 - полунасыщающая концентрация лиганда и h-коэффициент Хилла Флуоресцентные измерения. Для измерения собственной белковой флуоресценции изоформ NDP киназы крысы и их производных использовали лабораторный спектрофлуориметр с монохроматическим возбуждением [Burstein et al., 1973; Bukolova-Orlova et al., 1974], либо спектрофлуориметр Shimadzu RF 5000. Флуоресценцию возбуждали светом с длиной волны 296.7 нм, избирательно поглощаемым остатками триптофана. Спектры корректировали [Burstein, Emelyanenko, 1996] Интенсивности в корректированных спектрах были пропорциональны числу фотонов в единице интервала длин волн в единицу времени. Разложение спектров на индивидуальные компоненты проводили как описано ранее [Abornev, Burstein, 1992; Orlov et al., 1998]. Определение квантового выхода исследуемых белков выполняли общепринятым методом [Burstein, 1977]. Данные по тушению флуоресценции анализировали как описано ранее [Burstein, 1977].

Исследование термостабильности NDP киназ. Термостабильность NDP киназ определяли как описано ранее [Орлов и соавт., 1983; Erent et al., 2001], измеряя ферментативную активность образцов после их инкубации в течение 15 мин при температуре в диапазоне 20-80°С. Образцы содержали исследуемый фермент (5 мкг/мл), 5 мМ HEPES-NaOH буфер (рН 8), 0.5 мМ MgCl2 и БСА (1 мг/мл).

Дополнительные методы. Спектральные измерения выполняли на спектрофотометрах "Specord UV-VIS (Carl Zeiss, GDR) и Beckman DU 650 (Beckman, USA). Содержание родопсина определяли по разности поглощения образцов НСП при 500 нм до и после их полного обесцвечивания оранжевым светом лампы накаливания 40 вт в присутствии NH2OH. Молярный коэффициент экстинкции родопсина при 500 нм принимали равным 40600 СМ 'М*1. Содержание белка определяли по известному методу Брэдфорд [Bradford, 1978] или с помощью стандартного набора реактивов ВСА Protein Assay Kit (Pearce, USA), используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин.

Глава I. GTP-связывающий белок трансдуцин. Механизмы активации и регуляции

GTP-связывающий белок трансдуцин - посредник в процессе активации молекул PDE молекулой родопсина. Согласно изложенным выше аргументам, роль посредника в процессе активации большого количества молекул PDE молекулой R* мог бы играть GTP-связывающий белок. Поиску такого белка в препаратах НСП лягушки и посвящен начальный этап данной работы.

Светодаптированные препараты НСП сетчатки лягушки эффективно связывали негидролизуемый аналог GTP [3H]GppNHp. Стационарный уровень связывания достигал 25-30 ммоль [3H]GppNHp на моль R). Светоадаптированные препараты МДНС, не содержащие водорастворимых белков НСП, практически не связывали [3H]GppNHp. Добавление к светоадаптированным МДНС препарата водорастворимых компонентов НСП, увеличивало уровень связывания [3H]GppNHp. Преинкубация препарата водорастворимых компонентов НСП в течение 10 мин при 70°С полностью подавляла способность системы к связыванию [3H]GppNHp. Очевидно, что полученные результаты подтверждали предположение о наличии в НСП значительных количеств водорастворимого GTP-связывающего белка.

Основная часть (65-70%) водорастворимого белка НСП представлена полипептидами с к.м.м. 39, 36 и <15 kDa (Рис. 1), причем молярные концентрации этих полипептидов (39К,

36К и 15К) в НСП были близки между собой и составляли 5-7% от концентрации родопсина. Дополнительным указанием на то, что эти полипептиды являются субъединицами комплекса явились данные анализа препарата водорастворимых белков методом IEF: указанные полипептиды фокусировались в одной и той же зоне рН. В пределах точности оценок молярное содержание комплекса в препаратах хорошо совпадало с данными о содержании -связывающих центров в препаратах НСП.

Последующие эксперименты по фракционированию водорастворимых белков НСП методом гель-фильтрации (Рис. 2) показали, что распределение [ H]GppNHp -связывающей способности хорошо совпадает с профилем элюции полипептида 39К. Совокупность полученных данных указывает на то, что в НСП действительно присутствует водорастворимый GTP-связывающий гетеротримерный белковый комплекс, одна из субъединиц которого (39К) имеет центр, обладающий высоким сродством [ HjGppNHp. Комплекс присутствует в НСП в количестве, достаточном для того, чтобы играть роль посредника в процессе передачи возбуждения от молекулы родопсина на молекулы PDE.

Аналогичный гетеротримерный GTP-связывающий белковый комплекс был обнаружен в составе НСП сетчатки быка и получил название трапедуцин (Gt) [Fung et al., 1981]. Входящие в его состав полипептиды 39К, 36К и 10К были обозначены как a-, ß- И у-субъединицы (Gtoc, Gtp, и Gty), соответственно. Было также показано, что GTP-связывающая субъединица а в комплексе с GppNHp способна активировать PDE в присутствии мембран дисков НСП, свободных от подавляющего количества водорастворимых белков [Fung et al., 1981]. Сравнение этих результатов с данными наших исследований указывало на то, что GTP-связывающий белок транодуцин, способный играть роль активатора PDE, является универсальным компонентом фоторецептора позвоночных палочки.

В темноте НСП практически не взаимодействовали с [3H]GppNHp, однако фотолиз родопсина индуцировал связывание радиоактивного лиганда (Рис. 3). Это означало, что в соответствии с формирующимися представлениями о механизмах работы GTP-связывающих белков [Kaziro, 1978; Cassel, Selinger, 1978] транедуцин в НСП переходит из неактивного состояния (по-видимому, Gt-GDP) в активное состояние Gt-GTP под действием специфического для системы воздействия (в данном случае, обесцвечивания родопсина). Это фактически означало, что именно R* является эндогенным активатором транедуцина. Более того, в модельных экспериментах было показано, что при низких уровнях фотолиза молекула R* способна активировать значительное количество молекул Gt (Рис. 4). Совокупность этих данных показывала, что транедуцин действительно может играть роль посредника в процессе фотоактивации PDE: молекула R* последовательно активирует значительное количество молекул Gt, переводя их из состояния Gt-GDP в активное состояние Gt-GTP, что, в свою очередь, ведет к активации значительного количества молекул PDE. Данная последовательность событий при фотоактивации палочки сетчатки нашла свое отражение в хорошо известной и ставшей классической схеме Страйера (см. напр. [Stryer, 1983]).

Механизмы активации транедуцина родопсином. В начале 80-х годов считалось, что GTP-связывающие белки переходят в активное состояние благодаря стимулируемому специфическим воздействием обмену связанного GDP на свободный GTP [Kaziro, 1978; Lucas-Lenard, 1971; Weissbach et al., 1970; Arai et al., 1974; Fasano et al., 1978; Rodbell, 1980; Blume, Foster, 1976; Cassel, Selinger, 1978]. Аналогичный механизм был предложен и для объяснения процесса активации транедуцина родопсином [Fung et al., 1981; Stryer, 1983].

Индуцированный родопсином обмен связанного GDP на свободный GTP в транедуцине был продемонстрирован экспериментально [Fung et al., 1981], однако реальные

«- и. (WO

Рис. 1. Денситограмма, полученная при анализе препарата водорастворимых белков НСП сетчатки лягушки методом 808-РЛ0Е. Препараты получали в результате экстракции суспензии НСП гипотоническим раствором и последующего центрифугирования

Рис 2. Разделение водорастворимых белков НСП методом гель-фильтрации. Экстрагированные белки (1.5 мг) разделяли на колонке (91 х 1.5 см) с Sephacryl S-200 в 10 мМ Трис-НС1, рН 7.6,100 мМ КС1,5 мМ MgCl2 и 1 мМ DTT при скорости элюции 20 мл/ч. Объем фракции 2 мл. Концентрацию индивидуальных полипептидов во фракциях определяли в результате их анализа методом SDS-PAGE, окраски гелей и денситометрирования. Определения уровня связывания [3H]GppNHp проводили как описано в методической части работы.

[

0 5 10 15 20 25 30 1С-4 1Ы 0,01 0,1 I 10 100

ВРЕМЯ (МИН) R*,%

Рис 3. Фотолиз родопсина индуцирует связывание аналога GTP в препаратах НСП сетчатки лягушки. Реакцию индуцировали добавлением [3H]GppNHp в препараты НСП. В определенные моменты времени из реакционной среды отбирали пробы объемом по 100 мкл для определения содержание связанного [3H]GppNHp. Препарат облучали вспышкой света, обесцвечивающего 1% родопсина в образце. Уровень связывания, принятый за 100%, составлял 0.021 моля [3H]GppNHp на моль R.

Рис. 4. Зависимость уровня связывания [3H]GppNHp от количества активированного родопсина (Я*,%) в образце. Образцы суспензий НСП, содержащие различное количество R*, инкубировали в темноте в присутствии [3H]GppNHp при 25'С в течение 20 мин. Содержание связанного [3H]GppNHp определяли как описано выше. Уровень связывания, принятый за 100%, составлял 0.028 моля [3H]GppNHp на моль зрительного пигмента.

временные характеристики этого процесса оставались неясными. Определение этих характеристик представлялось принципиально важным для выяснения вопроса о том, каким же образом происходит активации Gt в зрительной клетке. Было очевидно, что активации трансдуцина родопсином - быстрый процесс. Простые расчеты показывали, что время, затрачиваемое молекулой родопсина на активацию молекулы трансдуцина должно лежать в миллисекундном диапазоне. В тоже время, наши эксперименты, выполненные в условиях, способствующих максимальной скорости обмена, показали, что фотоиндуцированная диссоциация комплекса Gt-GDP как лимитирующей стадии процесса обмена происходит за 35-40 с, т.е. на несколько порядков медленнее требуемой величины. Это заставило нас сомневаться в том, что обменный механизм может обеспечить требуемую скорость активации трансдуцина in vivo.

Отметим, что факт низкой скорости GDP/GTP обмена, ограниченной низкой скоростью диссоциации GDP, не представлялся удивительным и по независимым соображениям. Действительно, трансдуцин, присутствующий в НСП в огромной концентрации (500 мкМ), необходимой для обеспечения высокой скорости взаимодействия молекулы R* с молекулами Gt, одновременно может быть и источником шума в темноте вследствие перехода Gt в активное состояние при спонтанной ассоциации с цитоплазматическим GTP. Было также очевидным, что подавление шума достигается присутствием в активном центре трансдуцина очень плотно связанного GDP. Как показали последующие измерения, сродство GDP к активному центру действительно достигает огромных величин (Ка>1010М '), а время диссоциации комплекса Gt-GDP в отсутствие R* исчисляется десятками часов (105 с) [Fawzi, Northup, 1990]. Это означает, что молекула R* должна ускорять процесс диссоциации комплекса Gt -GDP на уникально большую величину - 108-109 раз. Столь значительное, происходящее с очень высокой скоростью изменение характеристик взаимодействия трансдуцина с GDP под действием R* представлялось нам маловероятным.

Альтернативным механизмом активации трансдуцина мог быть механизм, не требующий диссоциации комплекса Gt-GDP. Таким механизмом могло бы быть т. н. трансфосфорилирование - фосфорилирование связанного GDP до GTP непосредственно в активном центре GTP-связывающего белка некоторой фосфотрансферазой, использующей в качестве донора макроэргического фосфата трифосфаты, например, АТР. Возможность существования такого процесса была впервые рассмотрена при изучении процесса полимеризации тубулина [Jakobs et al., 1974].

Мы предприняли попытку проверить возможность такого механизма фотоактивации трансдуцина в НСП. Проверка такой возможности представляет определенную трудность, связанную с тем, что фосфорилированию может подвергаться свободный GDP, диссоциирующий из активного центра белка а затем рекомбинирующий с ним после его фосфорилирования до GTP. В связи с этим мы выполнили специальные эксперименты, которые показали, что в суспензии частично обесцвеченных НСП фосфорилируется пул GDP, количественно соответствующий пулу связанного, а не свободного нуклеотида. Центры связывания гуаниловых нуклеотидов в препаратах НСП насыщали [14C]GDP, инкубируя частично обесцвеченные НСП (R*/R = 0.01) С 1-6 мкМ [I4C]GDP. Концентрация центров связывания, оцененная независимо, составляла около 1.5 мкМ. В определенные моменты времени из реакционной среды отбирали пробы для определения концентрации [14C]GDP и [14C]GTP. В отсутствие экзогенного АТР уровень |14C]GDP оставался постоянным, добавление АТР индуцировало падение концентрации [ C]GDP на величину 0.7-1.2 мкМ и образование примерно эквимолярных количеств [14C]GTP

препаратах НСП сетчатки лягушки. Суспензии НСП ([R] = 100 мкМ, [R*] = 1 мкМ) инкубировали в темноте с [I4C]GDP в концентрациях 1 мкМ (А) и 4 мкМ (Б) Стрелкой отмечен момент добавления АТР Содержание нуклеотидов определяли как описано в методическом разделе работы в результате их разделения методом TLC и последующей авторадиографии пластин

Рис. 5. ATP индуцирует синтез [ C]GTP из [ C]GDP в светоадаптированных

Рис. 6. Фотолиз родопсина - необходимое условие быстрого синтеза [14С]ОТР из [14С]ОБР и АТР в препаратах НСП. Суспензии НСП ([Щ=100 мкМ) инкубировали в темноте с 1 мкМ [14С]ОБР, добавленным за 15 мин до начала измерений В отмеченный момент времени препарат облучали 3 с желтым светом, обесцвечивающим 1% родопсина

Рис 7. АТР индуцирует быстрый синтез [14С] вТР из [14С]ОЭР и АТР в препаратах НСП при низкой температуре Суспензии НСП (ВД = 100 мкМ, = 1 мкМ) инкубировали в темноте при температуре 0°С с 1 мкМ [ С] ОБР, добавленным за 15 мин до начала измерений В отмеченный момент времени в препарат добавляли АТР до концентрации 50 мкМ На рисунке приведены данные нескольких опытов, выполненных на одном и том же типе препаратов НСП

(Рис. 5А). Принципиально важно, что концентрация синтезированного [14C]GTP мало зависела от первоначальной концентрации [14C]GDP (1-6 мкМ) (Рис. 5А, Б). Такие результаты свидетельствовали в пользу того, что фосфорилируется именно связанный, а не свободный [14C]GDP.

В дополнительных опытах было также обнаружено, что в препаратах НСП, не подвергавшихся предварительному облучению, АТР-индуцированного фосфорилирования [14C]GDP не наблюдалось, однако этот процесс можно было стимулировать фотолизом родопсина (Рис. 6). Процесс протекал за времена менее нескольких секунд даже при 0°С (Рис. 7).

Совокупность полученных данных позволяет рассматривать исследованный процесс как индуцируемое обесцвеченным родопсином АТР-зависимое фосфорилирование GDP в активном центре трансдуцина. При физиологических температурах он должен протекать за время не более нескольких десятков мс. Таким образом, полученные данные вполне укладываются в рамки предположения о том, что основу механизма быстрого формирования активного состояния трансдуцина составляет процесс фосфорилирования GDP в активном центре этого белка.

Результаты исследований, дополнительно свидетельствующих о низкой скорости диссоциации комплекса Gt-GDP в присутствие R*, а также вопрос о том, что является фосфотрансферазой, фосфорилирующей связанный GDP, будут рассмотрены в последующих частях работы.

Время жизни активного состояния трансдуцина. Основные характеристики системы фототрансдукции - коэффициент усиления системы и время фотоответа определяются не только скоростью активации трансдуцина, но и временем его жизни в активном состоянии. Время жизни активного состояния GTP-связывающего белка определяется скоростью гидролиза связанного GTP. Поэтому в данной части работы мы определяли время жизни активной формы трансдуцина, измеряя скорость гидролиза GTP в его активном центре. Мы также пытались выяснить, существует ли принципиальная возможность регуляции скорости этого процесса.

Обычно активность GTPa3bi трансдуцина измеряется стационарными методами. В этом случае трудно определить время самого акта гидролиза - это лишь один из этапов многостадийного процесса. Поэтому для измерения истинной скорости гидролиза GTP в активном центре трансдуцина, мы разработали так называемый «однооборотный» метод измерения. Измерения проводили на препарате НСП, в котором молекулы трансдуцина находились в составе комплекса R*Gt, а активные центры Gt были свободны от GDP (см. «Материалы и методы»). Субстрат GTP ([a32P]GTP) использовался в концентрации 0.3-0.5 мкМ, меньшей, чем концентрация комплексов родопсин-трансдуцин (2-4 мкМ). Кроме того, высокая концентрация центров связывания обеспечивала высокую скорость их ассоциации с GTP. Поскольку константа скорости ассоциации для этого процесса составляет 3 • Ю'М"'с"' (см. далее), время ассоциации не превышало сотен миллисекунд.

Используя этот метод мы впервые показали, что при стандартных условиях ([Са2+ ] =1(Г М) гидролиз GTP до GDP является медленным процессом (Рис. 8), время которого (Т~ 40 с) значительно превышает время ответа фоторецептора, однако при низкой концентрации ионов ([Са2+ ] =10 М) гидролиз GTP в активном центре трансдуцина в составе препаратов НСП протекал за время, быстрее нескольких секунд (Рис. 8). Такие результаты были подтверждены результатами экспериментов по активации PDE в полностью обесцвеченных

Рис. 8. Кинетика образования [a32PJGDP в препаратах НСП (концентрации родопсина и трансдуцина 25 мкМ и 1 мкМ, соответственно) после добавления в нулевой момент времени [а Р]СТР (500-1000 Ки/ммоль, "АтегеЬат") до конечной концентрации 0.3 мкМ. Реакционная среда: 50 мМ Трис-НС1, рН 7.6, 100 мМ КС1, 5 мМ , мМ СаС12 и 1 мМ дитиотреитол.

Температура 20 С.

Рис 9. Полипептидный состав фракций (1-4), полученных при хроматографии препарата водорастворимых белков (40 мг) НСП сетчатки быка методом аффинной хроматографии на мелиттин-сефарозе. Анализ полипептидного состава выполняли методом ЗБЗ-РАОЕ. 1- препарат водорастворимых белков НСП до нанесения на колонку; 2-полипептиды, не связывающиеся с сорбентом при высокой концентрации (1 мМ) ионов Са2+; 3,4 - полипептиды, элюирующиеся при промывке колонки средами с низкой концентрацией свободных ионов Са2+( =10 нМ). Проба 5 помимо полипептидов фракции 4 дополнительно содержала 1 мкг кальмодулина

препаратах НСП сетчатки быка низкими концентрациями GTP при различных концентрациях ионов Са2+ (данные не приведены). Таким образом, впервые была показана принципиальная возможность регуляции времени жизни трансдуцина.

Наличие в НСП системы регуляции активного состояния трансдуцина подтверждено результатами многочисленных исследований последнего десятилетия (см. напр. [Cowan et al., 2000; Arshavsky et al., 2002]). К настоящему времени достаточно детально исследован лишь процесс инактивации активной формы трансдуцина (Gta-GTP), находящейся в комплексе с PDE. Показано, что обязательным участником такого процесса является комплекс белка RGS-9 (Regulator of G protein signalling) с одной из форм р-субъединицы Gt. Роль ионов Са2+в регуляции процесса инактивации трансдуцина пока детально не исследовалась, однако такая возможность не исключается [Cowan et al., 2000; Wensel, 2002]. Возможно, что определенную роль в этом процессе играет эндогенная протеинкиназа НСП, фосфорилирующая RGS-9 по Ser475 Са2+-зависимым образом [Ни et al., 2001]. Поскольку фотоактивация системы фототрансдукции в палочках сетчатки, как известно (см. напр. [Pugh, Lamb, 1993]), ведет к быстрому понижению внутриклеточной концентрации ионов Са2+, предположение об участии этих ионов в регуляции активного состояния трансдуцина выглядит достаточно привлекательным.

Водорастворимые Са2+-связывающие белки препаратов НСП сетчатки быка. Белки-мишени комплекса Са2+-кальмодулин. Данные о влиянии ионов Саполученные в настоящем исследовании, и результаты ряда других работ (см. напр. [Kawamura, Bownds,

1981; Del Priore, Lewis, 1983; Pugh, Cobbs, 1986]) стимулировали нас к поиску Са2+-связывающих белков в НСП. Очевидно, что это является одним из подходов для изучения регуляторных путей системы фототрансдукции. В настоящей работе поиск таких белков проводили методом аффинной хроматографии на мелиттин-сефарозе. Как известно, пептид яда пчел мелиттин взаимодействует с кальций-связывающими белками Са2+-зависимым образом (см. Hanp.[Kincaid, Coulson, 1985; Pennyakov et al., 1991]. Получение мелиттина, синтез аффинного сорбента и его использование позволило обнаружить составе водорастворимых белков НСП три компонента белковой природы, связывающихся с сорбентом при высокой концентрации ионов Са2+ и элюирующихся в присутствие EGTA (Рис. 9). Содержание этих компонентов в НСП лежало в пределах 0.1-1% от молярного содержания родопсина. Компоненты с к.м.м 21 kDa (Х2) и 10 Ы)а(Хз) были идентифицированы нами по их сравнительной электрофоретической подвижности как кальмодулин и субъединицы белка S-100, соответственно. По современным представлениям, кальмодулин регулирует активность cGMP-зависимого канала плазматической мембраны НСП [Haynes, Stotz, 1997] и аденилатциклазы фоторецепторов [Willardson et al., 1996], а белок S-100 активирует гуанилатциклазу НСП при высоких концентрациях ионов Са2+ [Margulis et al.,1996; Pozdnyakov et al., 1997,1998; Sitaramayya et al., 2000] и является Са2+-зависимым регулятором процесса фосфорилирования белка р80 фоторецепторов [Pozdnyakov et al., 1998; Sitaramayya et al., 2000].

К моменту окончания данного этапа работы (1988 г.) третий обнаруженный компонент с к.м м 26 kDa (ХО не был идентифицирован. Впоследствии было обнаружено, что он представлен тремя белками. Исследование этих белков и выяснение их физиологической роли потребовали значительных усилий многих лабораторий в течение последнего десятилетия. Было показано, что два высокогомологичных белка (GCAP1 и GCAP2) являются Са2+-зависимыми активаторами гуанилатциклазы НСП (см. напр. [Dizhoor, 2000; Dizhoor et al., 1994, 1995; Duda et al., 1998; Sokal et al., 1999; Ermilov et al., 2001; Mendez et al., 2001]), а третий белок - рековерин является Са2+-зависимым регулятором родопсинкиназы (см. напр. [Dizhoor et al., 1991; Kawamura, 1993; Gorodovikova et al., 1994; Klenchin et al., 1995; Заргаров и соавт., 1996; Zargarov et al., 1998; Pennyakov et al., 2000; Филиппов, 1999]). Данные белки являются элементами системы обратных связей, инактивирующих R* и восстанавливающих внутриклеточную концентрацию медиатора cGMP в ответ на понижение концентрации ионов в цитоплазме наружного сегмента после действия света [Филиппов, 1999; Dizhoor, 2000; Arshavsky et al., 2002].

Нами была также предпринята попытка поиска и идентификации белков, взаимодействующих с кальций-связывающими белками. Для частичного решения этой задачи мы использовали метод аффинной хроматографии на кальмодулин-сефарозе, поскольку ранее нам удалось разработать метод получения высокоочищенного кальмодулина [Permyakov et al., 1985; Пермяков и соавт., 1985; 1986] и синтезировать аффинный сорбент [Kincaid, Vaughan, 1979]. В серии исследований, выполненных на различных системах, нами была продемонстрирована эффективность используемого метода [Креймер и соавт., 1992; Kreimer et al., 1992; Zherelova et al., 1994]. Главный результат, полученный при анализе водорастворимых белков НСП сетчатки быка - трансдуциновый комплекс является основным компонентом НСП, взаимодействующим с кальмодулином. Эти результаты нашли подтверждение в работах других лабораторий, исследовавших как гетеротримерные GTP-связывающие белки (G белки) [Asano et al., 1986; Katada et al., 1987; Liu et al., 1997; Mangels et al., 1992], так и мономерные низкомолекулярные GTP-связывающие белки [Moyers et al.,1999]. Функциональный смысл такого взаимодействия пока не ясен. В целом, все это может означать, что системы клеточной трансдукции, функционирующие с участием GTP-связывающих белков, потенциально способны

регулироваться через прямое взаимодействие между GTP-связывающими и Са2+-связывающими белками.

Глава П. Активация и регуляция PDE НСП сетчатки

Механизм активации PDE трансдуцином. В темноте в палочках сетчатки PDE находится под мощным ингибиторным контролем. Это обеспечивается наличием в составе фермента, помимо каталитических субъединиц (PDEap), двух ингибиторных субъединиц (PDEy). Они обладают мощным ингибируюшим действием (>1000 раз) и огромным сродством к каталитическим субъединицам (K<j = 0.1-Ю рМ [Hurley, Stryer, 1982; Wensel, Stryer, 1986; Bennett, Clerk, 1989; Helmreich, Hofinann, 1996], время диссоциации комплекса PDEaP~2PDEy составляет >1000 с). При таких параметрах взаимодействия в темноте фермент находится в состоянии с очень низкой активностью, а сам фосфодиэстеразный каскад становится очень инерционным. Таким образом, исключаются быстрые флуктуации концентрации медиатора cGMP и обеспечивается низкий шум системы в целом. Каким же образом такая инерционная система быстро активируется в ответ на свет? Комплекс вопросов, связанных с решением этой проблемы, являлся предметом многих исследований в течение последних 25 лет. В нашей работе, выполненной в 80-х годах, была предпринята попытка выяснить вопрос о структуре активного фосфодиэстеразного комплекса.

Работу выполняли на полностью обесцвеченных препаратах НСП сетчатки быка. После предварительной части работы, определившей условия определения значения Vm для активной формы PDE (насыщающие концентрации НСП, GTP и его аналогов), мы показали, что кинетические характеристики PDE, активированной трансдуцином, зависят от того, каким нуклеотидом был активирован трансдуцин (GTP, GppNHp, GTP[S]). Значение Vm было максимально (100%) при использовании GTP[S] и достигало около 70% и 50% в присутствии GTP и GppNHp, соответственно. Значение для сАМР составляло 5±0,9 мМ и 7±1,2 мМ при использовании GTP и GppNHp, соответственно, но достигало значительно большей величины (12-13 мМ) при проведении измерений в присутствии GTP[S]. Эти характеристики также значительно отличаются от характеристик PDE, лишенной ингибитора в результате ограниченного протеолиза. Совокупность этих данных означает, что активная PDE в НСП является не свободной каталитической частью PDEap, как это предполагалось ранее [Yamazaki et al., 1983], а представляет собой комплекс между PDE и активной формой трансдуцина. К настоящему времен структура активного фосфодиэстеразного комплекса более детализована (см. напр. [Clerk, Bennett, 1992; Catty et al., 1992; Otto-Bruc et al., 1992; Malinski, Wensel, 1992; Liu, Northup, 1998; Liu et al., 1998]), однако в всех известных схемах ее основой остается комплекс фермента с трансдуцином.

Дополнительным результатом этой части работы является вывод о том, что конформации активной формы трансдуцина в комплексе с различными производными GTP различны, причем это не меняет сродство к Gt к PDE (данные не приводятся), но меняет, как показано выше, максимальную каталитическую активность финального комплекса и его сродство к субстрату. Такие данные следует учитывать при использовании GTP и его аналогов в экспериментах по активации систем клеточной трансдукции, функционирующих с участием GTP-связывающих белков-посредников.

Взаимодействие PDE с фоторецепторной мембраной. Было принято считать, что периферический белок PDE НСП связан с мембраной в изотонической среде, но полностью экстрагируется из нее растворами с низкой ионной силой (см. напр. [Pober, Bitensky, 1979]). В ходе многочисленных собственных опытов по экстракции PDE, необходимых, в частности, при получении очищенного фермента, у нас появились сомнения в точности этого положения. В результате дополнительных специальных экспериментов мы

обнаружили, что препараты НСП сетчатки быка, полученные по стандартной методике, действительно содержат заметную (20-30%) популяцию молекул PDE, плотно связанных мембранами. Такие молекулы нельзя было экстрагировать из мембран водными растворами с низкой ионной силой (в том числе и растворами, содержащими GTP и (или) высокие концентрации хелаторов EDTA и EGTA), однако они полностью элюировались в результате кратковременной обработки фоторецепторных мембран низкими концентрациями трипсина (2 мин, 10 мкг/мл). Совокупность всех этих данных привела нас к заключению, что субъединица PDEy могла бы играть важную роль в связывании фермента с мембраной. Дополнительно, основываясь на результатах ряда работ по исследованию природы связи между белками и мембранами (см. напр. [Ashendel, 1985; Silman, Futerman, 1987; Futerman et al., 1987; Low et al., 1987; Lochrie, Simon, 1988]), мы предположили, что связь PDEy с мембраной обеспечивается в результате ее ковалентной модификации компонентом липидной природы.

Последующие работы, выполненные в других лабораториях, действительно показали наличие липидной модификации PDE. Однако оказалось, что липидный компонент связан с каталитическими, а не ингибиторными субъединицами PDE [Ong et al., 1989]. Было обнаружено С-концевое изопренилирование и карбоксиметилирование а- и р-субъединиц PDE соответственно [Anant et al., 1992]. Оказалось также, что элюция PDE из мембран под действием трипсина (см. также [Wcnsel, Stryer, 1986]) обусловлена не хорошо известной деградацией субъединицы PDE у, а неизвестным ранее процессом отщепления нескольких С-концевых остатков каталитических субъединиц [Catty, Deterre, 1991].

Возможная функциональная роль этого феномена выглядит привлекательно: очевидно, что, изменяя соотношение свободной и связанной PDE, можно менять как степень ее активации трансдуцином, так и ее базальную активность. В рамках такого предположения укладывается и точка зрения, согласно которой липидная модификация PDE важна для ее связи с фоторецепторными мембранами (и) или подходящей взаимной ориентации по отношению к другим компонентам системы трансдукции, например, к трансдуцину [Ong et al., 1989].

Механизм регуляции соотношения между различными популяциями фермента пока ясен лишь в самых общих чертах. Был обнаружен низкомолекулярный белок, способный контролировать процесс иммобилизации PDE на мембране. Впервые этот белок был идентифицирован как неизвестная ранее 5-субъединица в составе препаратов PDE колбочек сетчатки быка [Gillespie, Beavo, 1988], а позднее и в составе растворимой (экстрагируемой изотонической средой) фракции PDE НСП сетчатки быка [Gillespie et al., 1989]. К настоящему времени показано, что 8-субъединица (Мг =17390) вызывает переход комплекса из мембранно-связанного состояния в раствор, связываясь с фенилированной С-концевой областью субъединиц PDEap [Florio et al., 1996]. В согласии с высказанной выше точкой зрения было также показано, что солюбилизация PDE НСП с помощью рекомбинантной 8-субъединицы снижает степень активации фермента трансдуцином [Cook etal.,2001].

cGMP-связывающие центры PDE и их возможная функциональная роль. В 1980 году было показано, что субъединицы PDE НСП сетчатки лягушки содержат

некаталитические центры связывания cGMP [Yamazaki et al., 1980]. Такой результат указывал на то, что PDE НСП может быть членом семейства обнаруженных ранее циклонуклеотид-зависимых циклонуклеотид-специфичных PDE (см. напр. [Beavo et al., 1970, 1971; 1994]). Это также означало, что значительная часть медиатора cGMP в НСП находится в связанном состоянии. Однако физиологическая роль некаталитических центров

связывания cGMP в НСП оставалась неясной. В 1982-1983 гг. нам удалось получить ряд данных, частично проясняющих этот вопрос.

Описываемые ниже данные были получены благодаря особенностям нашего экспериментального подхода. Вместо cGMP мы использовали в качестве субстрата сАМР в очень высокой концентрации (10-15 мМ). Это, а также относительно низкая активность PDE по отношению к сАМР, позволяли вести регистрацию активности фермента рН-метрическим методом в течение нескольких десятков минут, что резко отличало наш экспериментальный подход от традиционных измерений, выполняемых с использованием 0.5-1 мМ cGMP в течении 1-2 мин.

В результате таких опытов было неожиданно обнаружено, что базальная активность PDE в обесцвеченных препаратах НСП сетчатки быка, инъектируемых в измерительную систему при ЗО'С в конечной концентрации по белку около 100 мкг/мл, не остается постоянной в течении всего времени измерений. После первых 1-1.5 мин, в течение которого активность была близка к постоянной, ее величина начинала постепенно увеличиваться (время полу активации 3-4 мин) и через 7-10 мин достигала стабильного значения, превышающего начальную активность в 4-6 раз. Данное значение оставалось постоянным в течение последующего времени измерений (10-20 мин). Такой неожиданный результат был подвергнут экспериментальному анализу с целью уменьшить число его возможных объяснений. В контрольных опытах, в частности, было показано, что феномен активации характерен не только для фермента в составе НСП, но и для изолированной PDE, селективно экстрагированной из мембран [Kuhn, 1982,1983]. Однако он не наблюдался при использовании в качестве субстрата высоких концентраций cGMP.

Совокупность этих данных привела нас к рабочему предположению, согласно которому присутствие сАМР ведет в высвобождению cGMP из некаталитических центров связывания, что в свою очередь нарушает равновесие в системе апофермент-ингибитор и, как следствие, ведет к увеличению активности PDE. Такое заключение может вести к созданию целого ряда регуляторных схем, применимых для объяснения процессов адаптации фоторецептора к свету через регуляцию базальной активности PDE и уровня cGMP в НСП. Исследования последующих двух десятилетий в целом подтвердили правомерность этой рабочей гипотезы (см. напр. [Arshavsky et al., 1992; Cote, Brunnock, 1993; Cote et al., 1994; Artemyev et al., 1998; Norton et al., 2000; Моu et al., 1999; Мои, Cote, 2001; Yamazaki et al., 2002]. В наиболее законченном виде свидетельства в пользу такой точки зрения рассмотрены в работе Нортона и соавт. [Norton et al., 2000].

Глава HI. cGMP-епецифичная PDE - ключевой элемент системы фототрансдукции колбочек сетчатки. Сходство и различия систем регуляции активности PDE в палочках и колбочках.

После того, как стало принципиально ясно устройство системы фототрансдукции палочек сетчатки, возник вопрос, насколько универсален такой ферментативный каскад, есть ли он в других типах фоторецепторов, например, колбочках сетчатки. Действительно, колбочки генерируют очень быстрые ответы, обладают низкой чувствительностью, способны работать в широком диапазоне интенсивностей света (см. напр. [Baylor, Fuortes, 1970; Miller, Korenbrot, 1994; Miller et al., 1994; Tachibanaki et al., 2001]) и потому могли бы иметь иную, чем палочки, систему фототрансдукции. Для решения поставленного вопроса мы планировали искать в наружных сегментах колбочек (НСК) сетчатки PDE циклических нуклеотидов, а в случае успеха исследовать ее характеристики и, таким образом, выяснить ее функциональную роль. Такой подход - один из многих, но логически оправдан - именно

cGMP-специфичная PDE является наиболее характерной особенностью системы фототрансдукции в палочках.

В качестве экспериментальных животных были использованы суслики (Citellus undulates), являющиеся одними из немногих животных, сетчатки которых содержат преимущественно колбочки. В согласии с общепринятыми критериями (см. напр. [Ebrey, Koutalos, 2001]), 95% фоторецепторов сусликов являются колбочками [West, Dowling, 1975; Anderson, Fisher, 1976; Ahnelt, 1985], содержащими зрительный пигмент с Хтах 520 нм [Jakobs et al., 1985]. Однако, несмотря на то, что мы имели в своем распоряжении около 200 животных, общее количество фоторецепторного материала было очень невелико: по этому параметру сетчатка суслика уступает сетчатке быка более чем в 100 раз.

Частично очищенные препараты НСК получали в результате фракционирования гомогената сетчаток в ступенчатом градиенте плотности сахарозы как описано в методической части работы. Препараты НСК содержали пигмент с максимумом поглощения в районе 520 нм, который (1) обесцвечивался под действием видимого света, переходя в продукт с максимумом при 380 нм и регенерировал в темноте в присутствии 11-цис ретиналя. Это означало, что обнаруженный пигмент - родопсин колбочек в составе НСК. Содержание пигмента в сетчатке (65 пмоль), определенное методом дифференциальной спектроскопии, было близко к величине, полученной на основании данных микроскопии (100 пмоль).

Основная часть (70-80%) фосфодиэстеразной активности гомогената сетчаток приходилась на долю препарата НСК (измерения проводили после кратковременной обработки препаратов трипсином как описано в методической части работы). Остальная часть активности гомогената принадлежала стартовой фракции Ф47, причем ферменты фракции и препарата НСК были подобны друг другу по всем доступным для сравнения характеристикам. При центрифугировании препарата НСК в градиенте плотности сахарозы распределение активности совпадало с распределением пигмента. Таким образом, активность PDE в сетчатке суслика практически полностью обусловлена активностью эндогенного фермента фоторецепторных структур.

Дальнейшие сравнительные эксперименты показали, что ферменты НСК сетчатки суслика и НСП сетчатки быка подобны друг другу по кинетическим характеристикам (имерялись значения Кга для процессов гидролиза cGMP и сАМР, а также соотношения величин Vm для cGMP и сАМР до и после активации ферментов трипсином), по своей чувствительности к действию трипсина и термостабильности (Рис. 10). Как и PDE НСП, элюированный фермент НСК имеет к.м.м. около 180 kDa и pi ~ 5.5, (Рис.11). По нашим оценкам, ферменты колбочек и палочек близки по своей максимальной каталитической активности и содержанию в фоторецепторной клетке (1-2 молекулы ФДЭ на 100 молекул зрительного пигмента), что хорошо согласуется с современными данными, полученными независимыми методами (см. напр. [Zhang et al., 2003]).

В состав PDE НСК, по-видимому, входит ингибиторный компонент. По своей термостабильности и чувствительности к трипсину он подобен ингибиторной субъединице PDE НСП. Ингибиторы PDE палочек и колбочек оказались функционально взаимозаменяемыми (Рис. 12), что хорошо согласуется с данными о высокой степени гомологии структуры у-субъединиц PDE палочек и колбочек [Ovchinnikov et al., 1986; Hamilton, Hurley, 1990]. Кроме того, фермент НСК активировался светом, причем кофактором этого процесса является GTP (Рис. 13).

Рис. 10. Зависимости активности PDE (в % от макс, значения) препаратов НСК, Ф47 сетчатки суслика и НСП сетчатки быка от концентрации трипсина (А) и температуры преинкубации (Б). А - препараты НСК, Ф47 и НСП (концентрации по белку 135, 160 и 50 мкг/мл, соответственно) преинкубировали с трипсином в указанной концентрации 2 мин при 30°С. Протеолиз останавливали добавлением соевого ингибитора трипсина. Активность РЭЕ измеряли при 8 мМ сАМР (НСК, Ф47) или 2 мМ сАМР (НСП). Уровни ферментативной активности, принятые за 100% составляли 0.8, 0.12 и 3 мкмоль сАМР в мин на мг белка препаратов НСК, Ф47 и НСП, соответственно. Б - препараты преинкубировали в течение 10 мин при указанных температурах и быстро охлаждали до 10°С. Значения удельной скорости гидролиза 8 мМ сАМР, принятые за 100%, составляли 0.6, 0.08 и 9 мкмоль сАМР в мин на мг белка препаратов НСК, Ф47 и НСП, соответственно.

Рис. И. Гель-фильтрация экстрактов препаратов ИСК на колонке с Sephacгyl S-200 (А) и их IEF в градиенте плотности сахарозы в диапазоне рН 3-10 (Б). N - номера фракций. Стрелками показаны фракции, в которых элюировались белки-маркеры и декстран указанных значений мол. массы (х103). 1 - активность РВЕ (отн. ед.), 2 -поглощение элюата при 280 нм (А28о)> 3 - значение рН в полученных фракциях.

Рис. 12. Влияние ингибиторов И-НСК (АД») и И-НСП (В,Г) на скорость гидролиза сАМР препаратами НСК (А, В) и НСП (Б, Г). 12 - активность PDE до и после инкубации препаратов с трипсином, соответственно; 3-6 - активность ФДЭ в препаратах после добавления указанных количеств (мкл) препаратов И-НСК или И-НСП. Объем реакционной смеси 2 мл.

Рис. 13. Действие света и GTP на скорость гидролиза [14C]cGMP темповыми (А) и светоадаптированными (Б) препаратами НСК сетчатки суслика. GMP -

количество образовавшегося [14C]GMP (нмоль) в реакционной смеси (объем 30 мкл). Реакции инициировали добавлением [14C]GMP до конечных концентраций 2.5-3 мМ. Реакционная смесь содержала 3 мкл (А) и 15 мкл (Б) препаратов НСК двух независимых выделений. А) В отмеченные стрелками моменты времени в пробы добавляли 25 мкМ GTP и облучали образец светом (Х>540 Нм), обесцвечивающим около 10% зрительного пигмента (1). Кинетики гидролиза [14C]cGMP светоадаптированными и преинкубированными с 25 мкМ GTP препаратами НСК (2) или препаратами, проинкубированными с трипсином (3) приведены для сравнения. Б) Кинетики гидролиза [ 4C]cGMP обесцвеченными препаратами НСК в отсутствие GTP (1), в присутствии 25 мкМ GTP (2) и после обработки препарата НСК трипсином (3).

Совокупность данных о содержании, свойствах и регуляции cGMP-специфичной PDE в НСК дало веские основания считать, что этот фермент является ключевым элементом системы фототрансдукции не только в палочках, но и в колбочках сетчатки позвоночных. Эти данные однозначно свидетельствует в пользу того, что на доступном для нас в 80-х годах уровне сравнения системы фототрансдукции палочек и колбочек принципиально подобны. Действительно, последующие исследования показали, что PDE, как и Gt, в этих типах фоторецепторов очень близки друг другу по первичной структуре (см. напр. [Li et al., 1990; Lerea et al., 1986; Hurley, 1987]). В таком случае возникает вопрос - в чем же причина хорошо известных различий между палочками и колбочками как фотодетекторов? Предложенное нами объяснение основано на анализе большого пула электрофизиологических данных. Анализ показал, что начальные скорости активации PDE (число молекул активированной PDE в единицу времени) в палочках и колбочках близки, а кардинальным различием между палочками и колбочками является различие в системах инактивации. Это означает, что системы, ответственные за выключение (инактивацию) R*, Gt и PDE и восстановление исходной концентрации cGMP в палочках и колбочках различны. Очевидно, что в колбочках такие системы должны быть более быстродействующими и мощными, чем в палочках. Именно потому колбочка генерирует быстрый ответ, имеет низкую чувствительность и способна работать в гораздо более широком диапазоне интенсивностей света по сравнению с палочкой. . Аналогичная точка зрения была выражена позднее Пью и Лэмбом в известном аналитическом обзоре [Pugh, Lamb, 1993]. Авторы недавнего сравнительного обзора данных о системах фототрансдукции различных типов фоторецепторов также считают [Ebrey, Koutalos, 2001], что ключевые различия между палочками и колбочками лежит в процессах инактивации элементов каскада.

Успехи, достигнутые в последние годы в понимании молекулярных механизмов инактивации ключевых элементов системы фототрансдукции, не противоречат высказанной точки зрения. В частности, недавно было обнаружено, что содержание белка RGS9 (принципиальный компонент системы инактивации Gt [Arshavsky et al., 2002; He et al., 1998; Cowan et al., 2000]) в колбочках очень велико и практически равно содержанию у-субъединицы PDE (R : PDEy : RGS9 = 62 : 1:1), тогда как в палочках при том же соотношении R/PDEy содержание белка RGS9 в 10 раз ниже [Zhang et al., 2003]. Отмечены значительные отличия в системе инактивации родопсина, включающей в себя протеинкиназу, фосфорилирующую обесцвеченный зрительный пигмент и белок аррестин, динамически блокирующий взаимодействие между фосфорилированным пигментом и трансдуцином (см. напр. [Nork et al., 1993; Sakuma et al., 1996; Hisatomi et al., 1997; 1998; Tachibanaki et al., 2001]). Отмечены также и различия характеристик cGMP-зависимых каналов палочек и колбочек [Miller, Korenbrot, 1994; Miller et al., 1994; Haynes, Stotz, 1997; Frings et al., 1995; Picones, Korenbrot, 1995], которые могут приводить к различиям в кинетике концентрационных изменений ионов Са2+, играющих ключевую роль в запуске процессов инактивации основных элементов системы фототрансдукции [Arshavsky et al., 2002]. Детальное обсуждение этих и ряда других данных выходит за рамки настоящего изложения.

Глава IV. Исследование скорости диссоциации комплекса трансдуцин-GDP в присутствии фотоактивированного родопсина

Данная часть работы была выполнена в 1992-1993 гг. в Лаборатории Клеточной и Молекулярной Биофизики Центра Ядерных исследований в Гренобле (Франция) совместно с Нелли Беннетт и Андреем Фрейдиным. В начале 80-х годов сотрудники этой лаборатории Нелли Беннетт, Ив Дюпон, Клод Пфистер, Филипп Детерре при участии Германа Кюна под руководством Марка Шабра выполнила комплекс исследований (см. напр.[Кипп et al., 1981;

ВРЕМЯ (с) ВРЕМЯ (с)

Рис. 14. Индуцированная добавлением 100 мкМ GppNHp диссоциация лиганда в обесцвеченных препаратах НСП, преинкубированных с 0.13 мкМ |111(71)Р (А) или

[аИР]СТР(Б). Теоретические кривые, описывающие ход процессов диссоциации после добавления ОррМНр построены как описано в методической части при значении Т| - 7 с.

1 1 ■ 1 I I I < ■ I ■ I I ■ I I I I I I I ■ I I | I 1 I I I I I I ■ ! I II I I ! I I I t

0 100 200 300 400

Время (с)

Рис. 15. Кинетика активации PDE в препаратах НСП в присутствии

высокоочищенного GDP (В). Активность PDE измеряли рН-метрическим методом с помощью рН-электрода и электрометрического усилителя при временном разрешении 1 с в среде (2 мл), содержащей 40 мМ HEPES-NaOH, pH 8.0, 100 мМ КС1, 1мМ MgCI2 и 0.1 мМ СаС^ при концентрации бежа 2 мг/мл и 8 мМ сАМР. Коммерческие образцы GDP (0.1 мМ) активировали PDE почти также эффективно, как и 0.1 мМ GTP (А).

Bennett et al., 1982; Bennett, 1982; Bennett, DuPont, 1985; Vuong et al., 1984]), результата: которых создали основу современных представлений о механизмах функционирования G-белков (см. напр.[СпаЬге, Deterre,1989; Stryer, 1983;1986; 1987; 1988; 1991; 1993]).

Нами была предпринята попытка детального исследования вопроса о скорости фотоиндуцированной диссоциации комплекса Gt-GDP в препаратах НСП сетчатки быка. В отличие от проведенного ранее исследования мы располагали широким набором меченных нуклеотидов и рядом новых методов и подходов. Основным методом оставался метод ультрафильтрации на нитроцеллюлозных фильтрах НА 0.45 мкм (Millipore Corp., USA), но его временное разрешение было значительно улучшено благодаря определенным конструктивным особенностям установки, позволяющим промывать фильтры при скорости потока до 3-5 мл/с и, тем самым, сменить раствор в объеме фильтра (30 мкл) за несколько десятков мс [DuPont ,1984].

В первой серии опытов центры связывания в обесцвеченных препаратах НСП насыщали [ H]GDP, а затем регистрировали кинетику диссоциации [3H]GDP из центров связывания в результате добавления GppNHp (GTP[S]). В ряде случаев для насыщения центров использовали формирующий комплексы R*-Gt-[a32P]GDP после

гидролиза трифосфата (Рис.14). Во всех типах проведенных экспериментов время диссоциации было велико и составляло 6-7 сек (Рис.14).

К сожалению, эти эксперименты давали информацию о поведении лишь небольшой части центров. При попытках насытить лигандом (GDP) основную часть центров мы столкнулись с рядом проблем, затруднявших как интерпретацию изложенных выше результатов, так и проведение дальнейших исследований. Одна из них - наличие следовых количеств GTP (0.3-0.5%) в коммерческих препаратах GDP (см. напр. Рис. 15А), другая - процессинг нуклеотидов в препаратах НСП, ведущий к быстрому синтезу заметных количеств GTP из GDP. Для решения этих проблем мы (1) разработали метод очистки, снижающий содержание GTP в препаратах GDP до уровня 0.01-0.05% и (2) определили время 5-10 с), в течение которого заметных количество GTP не образуется (Рис. 15В). Все это позволило определить время 5-10 с), при котором процесс преинкубации центров связывания с высокими концентрациями (до 0.1-0.2 мМ) холодного GDP не сопровождается синтезом заметных количеств GTP. Дополнительно, мы выполнили измерения константы скорости ассоциации свободных центров (R*Ct(empty) с [y^SJGTP (k+i=3.6±0.5xl06 М"'с"') (Рис. 16), что позволило выбрать оптимальную концентрацию нуклеотида (1-4 мкМ), обеспечивающую высокое временное разрешение метода (до 50-100 мс) и в дальнейшем использовать процесс ассоциации [y^'SJGTP в качестве высокоскоростного зонда позволяющего следить за

свободными или быстро освобождающимися от GDP центрами в препаратах НСП.

Использование такого подхода позволило показать, что молекулы Gt, содержащие экзогенный GDP в результате кратковременной инкубации препарата с 0.1-0.2 мМ GDP (число таких центров составляло 50-60% от общего числа центров связывания) в присутствии R* высвобождают GDP за время 6-8 с (Рис. 17). Близкое значение времени диссоциации (6-7 сек) было получено в специальных экспериментах, в которых с помощью метода [у'^ОТР-зонда измеряли кинетику индуцированной родопсином (R*) диссоциации эндогенного GDP из активных центров транедуцина (данные не приводятся).

Отдельная серия экспериментов была выполнена с использованием «однооборотного» метода определения скорости гидролиза GTP в активном центре транедуцина и метода [y35S]GTP В контрольных опытах с помощью «однооборотного» метода было

определено время гидролиза GTP в активном центре транедуцина в используемом нами

Рис. 16. Кинетика ассоциации fy^SlGTP с комплексами R*Gt(empty) в препаратах НСП

при 45 нМ и 1 мкМ [у 8]СТР. Теоретические кривые, описывающие процесс ассоциации, построены при значениях Т], составляющих 7 с и 240 мс для 45 нМ и 1 мкМ [■у^СГР, соответственно. Уровень радиоактивности фильтров, не содержащих Gt, показан пунктиром.

Рис. 17. Кинетика инкорпорирования [y^SlGTP в препаратах НСП, преинкубированных с GDP. (1) Пробы НСП (R* мг/мл, R*»R, объем 0.1 мл)

инкубировали 8 с с очищенным GDP (100 мкМ) и затем быстро (<1 с) разбавляли 1 мл 2 мкМ В определенные интервалы времени (1-50 с) пробы фильтровали и

определяли радиоактивность фильтров. Теоретическая кривая, описывающая процесс диссоциации (1) построена при значении Т) = 8 с. Количество центров образцах, ассоциирующих с

[y35S]GTP, составляет около 60%. (2) Определение максимального уровня связываний [y^SlGTP выполняли без преинкубации образцов с GDP. (3) Определение фонового уровня связывания [Y^SJGTP выполненяли после преинкубации образцов НСП с 0.1 мМ GTP[S].

типе препаратов НСП сетчатки быка. Эта величина составила 18-19 с (Рис. 18). В основных опытах подавляющую часть центров в таких же образцах препаратов НСП быстро (1-2 с) заполняли холодным GTP, а затем с помощью метода [y^SJGTP'-зонда регистрировали кинетику появления свободных центров, появляющихся и затем быстро реагирующих с [y^SJGTP в результате двух относительно медленных процессов: гидролиза GTP до GDP и последующей диссоциации GDP. Кинетика суммарного процесса удовлетворительно описывалась суммой двух последовательных процессов с временами 18 (время гидролиза GTP в активном центре Gt) и 6 с (Рис. 19). Такой результат дал основания считать, что время 6-7 с характеризует процесс индуцируемой R* диссоциации комплексов R*Gt-GDP в препаратах НСП. Важно, что при такой постановке экспериментов время время 6-7 с характеризует подавляющее (>90%) количество центров связывания в препаратах НСП.

Часть экспериментов была выполнена с использованием очищенного транедуцина и фоторецепторных мембран, не содержащих водорастворимых белков. Очищенные комплексы Gt-[a P]GDP получали в результате его экстрации из НСП с помощью [a32P]GTP [Kuhn,1981] и последующего удаления свободного нуклеотида методом гель-фильтрации. Полученные комплексы быстро смешивали с фотоактивированными мембранами в присутствии 20 мкМ GTP[S] и затем регистрировали кинетику диссоциации комплексов станда|иным методом. Измеренное с помощью такого подхода время диссоциации Gt-[a3 P]GDP в присутствии R* составила 4-5 с.

Рис. 18 (леваа панель). Гидролиз [/2Р]СТР в активном центре Измерения выполняли как описано в методической части при 0.33 мкМ [/32Р]СТР и концентрации белка НСП 2 мг/мл. Теоретическая кривая построена при Т1 ~ 19 с.

Рис. 19 (правая панель). Кинетика инкорпорирования [у^СТР в препаратах НСП, преинкубированных с СТР. Измерения выполнены как описано в тексте. Теоретическая кривая (1) построена как описано в методической части при значениях Т] и Тг 18 с и 6 с, соответственно. (2) - связывание [у358]ОТР препаратом НСП без преинкубации с СТР.

Совокупность данных, полученных в настоящей работе при использовании широкого спектра методов и подходов на препаратах НСП сетчатки быка хорошо согласуется с результатами измерений, выполненных нами ранее на препаратах НСП сетчатки лягушки и показавших, что диссоциация комплексов Gt-GDP в присутствии активированного родопсина является медленным процессом. Отметим, что измеренное методом ультрафильтрации время диссоциации комплекса Gq-[a P]GDP в присутствии активированного мускаринового ацетилхолинового рецептора составило несколько секунд [Mukhopadhyay, Ross, 1999]. В системе, реконструированной из липидных везикул и очищенных Gt и PDE, активность PDE достигала максимума лишь через неколько секунд после активации значительного количества R в образце [Melia et al., 1997]. Все это подтверждает высказанное выше мнение о том, что GDP/GTP обмен не может обеспечить требуемую скорость активации транедуцина in vivo.

Глава V. Изоформ-специфичное взаимодействие NDP киназы с комплексом родопсин-трансдуцин.

Взаимодействие NDP киназы с фоторецепторными мембранами НСП сетчатки быка. Эффекты рН, ионов и нуклеотидов. Полученные нами данные свидетельствовали о том, что GDP/GTP обмен по своим скоростным характеристикам, скорее всего, не способен обеспечить требуемую скорость активации трансдуцина in vivo. Это заставляло вернуться к рассмотрению комплекса вопросов, связанных с гипотезой трансфосфорилирования, и в частности к вопросу о том, какой из компонентов НСП играет роль фосфотрансферазы, фосфорилирующей связанный GDP.

Результаты наших ранних исследований позволяли нам предполагать, что такую роль могла бы играть р-субъединица трансдуцина (см. напр. [Тищенков, Орлов, 1984]). Предположение о локализации фосфотрансферазы в пределах трансдуцинового комплекса выглядело вполне разумным, исходя из необходимости обеспечить высокую скорость процесса активации Gt. В рамки высказанной точки зрения укладывались и результаты более поздних исследований лаборатории Вейланда и Жакоба (см. напр. [Wieland et al., 1991; 1992; 1993]). В этих работах было обнаружено тиофосфорилированное состояние Р-субъединицы Gt и продемонстрирована принципиальная возможность последующего переноса фосфата на GDP в активном центре а-субъединицы трансдуцина. Достаточно увлекательно выглядели и данные, полученные нами в содружестве с лабораторией А. С. Спирина: фактор элонгации Ts (в отличие от фактора Tu) обладал высоким уровнем активности GDP киназы, причем распределение белка Ts и активности полностью совпадали при анализе препарата Ts методом IEF в полиакриламидном геле как в широком, так и узком диапазоне рН. Альтернативная точка зрения предполагала (см. Hanp.[Kimura, Nagata, 1979; Otero, 1990; Kimura, 1993]), что роль фосфотрансферазы, фосфорилирующей GDP, связанный GTP-связывающим белком, должна играть хорошо известная нуклеозиддифосфаткиназа (NDP киназа) (см. напр. [Parks, Agarval, 1973]).

Описанная ниже часть работы преимущественно выполнена в Отделе Молекулярной Биологии Токийского Столичного Института Геронтологии в содружестве с ее руководителем проф. Наримичи Кимурой. Выполненные Н. Кимурой в 70-х годах детальные исследования по проверке гипотезы Мартина Родбела о роли GTP в процессе гормон-зависимой активации аденилатциклазы привели его к заключению, что в системе присутствует NDP киназа, которая и производит GTP в результате фосфорилирования эндогенного GDP за счет экзогенного трифосфата [Kimura, Nagata, 1979]. Это и

определило его многолетний интерес к исследованиям NDP киназы как ферменту и как компоненту системы активации G белков. Система фототрансдуции НСП представлялась удобным объектом для исследования структурно-функциональных взаимодействий между NDP киназой и трансдуцином как типичным представителем семейства G белков.

Первоначально предполагалось очистить NDP киназу НСП сетчатки быка и исследовать ее имеющимися в лаборатории методами и как фермент и как белок. Однако, уже на первой стадии работы мы получили неожиданный результат: водорастворимая NDP киназа обратимо взаимодействовала с обесцвеченными фоторецепторными мембранами рН- и ион-зависимым образом (Рис. 20). Закисление среды сдвигало равновесие в пользу связанной формы NDP киназы, а связанный фермент переходил в свободное состояние в результате значительного разбавления препарата, сдвига рН в щелочную область, и при увеличении концентрации ионов Na+, K+, Са2+ и Mg2+, причем действие ионов носило кооперативный характер (Рис. 21). В отсутствие мембран экстрагированный при рН 8 фермент оставался водорастворимым во всем исследованном диапазоне рН. Кроме того, мембраны, лишенные основных периферических белков теряли свою способность взаимодействовать с ферментом. Это означало, что взаимодействие фермента с мембраной достаточно специфично, а центром связывания NDP киназы в мембране может быть один из периферических белков мембран НСП, например, трансдуцин.

Хорошо известно [Kuhn, 1980; 1983], что трансдуцин образует плотный комплекс с обесцвеченным родопсином. Этот комплекс диссоциирует на мембранный R* и свободный Gt при связывании трансдуцином GTP или его аналогов. Наши исследования показали, что NDP киназа, связанная с обесцвеченными мембранами НСП, элюируется при действии негидролизуемых аналогов GTP (Рис. 22), более того, зависимости элюции NDP киназы от концентрации нуклеотидов (Рис. 22) практически полностью совпадали с хорошо известными зависимостями (см. Hanp.[Kehleher et al., 1986; Yee, Liebman, 1978; Yamanaka et al., 1986]) для процесса элюции трансдуцина из мембран в результате индуцируемой нуклеотидами диссоциации комплекса R*Gt. Это означало, что центром связывания NDP киназы в мембране, скорее всего, является комплекс R*Gt. В согласии с этим, в присутствии трансдуцина наблюдается высокоаффинное GTP-зависимое связывание, в отсутствие Gt связывание характеризуется низким сродством и на зависит от GTP (см. далее). Добавление очищенного препарата Gt восстанавливало высокоаффинное GTP-зависимое связывание.

Таким образом, мы получили результаты, которые в отличие от многих других работ, убедительно показывали, что NDP киназа способна взаимодействовать с G белком. Важно, что NDP киназа взаимодействовует с Gt именно при образовании его комплекса с R*. С нашей точки зрения, такое промежуточное состояние необходимо для осуществления реакции трансфосфорилирования при формировании активного состояния трансдуцина.

Взаимодействие рекомбинантных а и ß изоформ NDP киназы крысы с мембранами НСП сетчатки быка. Гексамеры NDP киназы млекопитающих, в отличие от ферментов низших животных, состоят из двух типов низкомолекулярных консервативных, гомологичных субъединиц (степень гомологии субъединиц одного типа у изученных видов составляет 98-99%, степень гомологии разных субъединиц - около 90%, основные различия локализованы в вариабельных областях V1 и V2 (остатки 37-50 и 131-150, соответственно)) и, таким образом, представлены в клетке набором изоформ. Субъединицы кодируются двумя независимыми генами, которые экспрессируются

рн Концентрация СаС12 или MgCI2, мМ

Рис. 20. рН-завясимое распределение NDP кииазы между водорастворимой и мембранной фракциями в препаратах НСП. НСП суспендировали в 10 мМ буферных растворах (рН 5-8) при концентрации белка 100 мкг/мл (объем проб 200 мкл) и центрифугировали Супернатанты собирали, а осадки суспендировали (объем проб 200 мкл). Пробы (20 мкл) суспензий НСП (1), супернатантов (2) и суспензий мембран (3) использовали для измерений активности NDP киназы. Кривая 2 построена при А|МХ= 2,25 нмолей ADP/мин на 20 мкл, h=l и рН 6,95. Рис. 21. Вляняе CaCI¡ (1) я MgCl2 (2) на взаимодействие NDP киназы с мембранами в препаратах W-НСП при рН 5,5. W-НСП суспендировали в 10 мМ Mes-NaOH (рН 5.5) при концентрации белка 200 мкг/мл и различных концентрациях СаС12 и MgCl2 и центрифугировали. Супернатанты использовали для измерения активности NDP киназы. Кривые (сплошные линии) построены при Атю= 16.4 нмоль ADP/мин на 100 мкл, Ао = 2 нмоль ADP/мин на 100 мкл, h = 2 и К1/2 = 2,3 мМ (кривая 1), и Ащах— 16.4 нмоль ADP/мин на 100 мкл, А0 — 2 нмоль ADP/мин на 100 мкл, h = 2 и К|д = 4,2 мМ (кривая 2). Точки 3 и 4 получены при наличии в среде 5 мкМ GTP[S],

Ряс. 22. Элюция NDP кииазы, связанной с фоторецепторнымн мембранами, в присутствии производных GTP и АТР. Левая панель: Образцы суспензий НСП (1) и супернатантов, полученных при центрифугирования суспензий при рН 7,5 (2) или рН 5,5 в отсутствие (3) или присутствии (4) 5 мкМ ОТР[8] использовали для измерений активности N0? киназы (А) и иммунологического определения содержания белка МВР киназы (Б), мигрирующего при вВв-РАОЕ как полипептид с к.м.м. 17 кОа. Правая панель: Элюция N0? киназы, связанной с мембранами в препаратах ^ЩСП при рН 5,5, под влянием нуклеотидов. После добавления нуклеотидов ОТР^] (I), ОиоРР(ОТ)Р (2), ОиоРР(СН2)Р (3) или АаоРР(ОТ)Р (4) образцы центрифугировали, а супернатанты использовали для измерения активности. Кривые 1-3 построены при значениях К[д , равных 0,18 мкМ, 12 мкМ и 450 мкМ, соответственно.

тканеспецифичным образом; каждый из видов тканей характеризуется своим набором изоформ. Исследования рекомбинантных белков, состоящих из субъединиц только одного вида, показали, что такие изоформы практически неразличимы по своим ферментативным характеристикам и трехмерной структуре в кристалле. Физиологический смысл присутствия в клетке изоформ NDP киназы с практически одинаковыми каталитическими и структурными свойствами оставался неясным, хотя и являлся предметом интенсивных исследований многих лабораторий.

Описываемые ниже эксперименты были выполнены при использовании рекомбинантных а И Р изоформ NDP киназы крысы, гексамеры которых состояли только из одного типа субъединиц соответственно). Исследовались характеристики

связывания этих изоформ фермента крысы с фоторецепторными мембранами НСП сетчатки быка, лишенных собственной NDP киназы, но содержащих Gt (N-мембраны), и мембранами, свободными как от NDP киназы, так и от Gt (W-мембраны). Изучение таких модельных систем показало, что NDP киназа а крысы в данном типе опытов ведет себя практически аналогично эндогенному ферменту палочек сетчатки быка: связывается с N-мембранами при закислении среды (pHos ~ 6.4), элюируется поддействием Na+, К+, Са2+ и при практически тех же значениях их концентраций и кооперативном характере их действия (данные не приведены). Как и в случае эндогенного фермента, высокоаффинное GTP-зависимое связывание NDP киназы а наблюдалось в присутствии Gt, в его отсутствие связывание характеризовалось низким сродством и на зависело от GTP (Рис.

23), добавлении Gt к W-мембранам восстанавливало GTP-зависимое высокоаффинное связывание фермента с мембраной. Совокупность этих данных дополнительно показывает, что комплекс R*Gt является центром связывания NDP киназы.

Использование в экспериментах Р изоформы NDP киназы крысы дало неожиданный результат: оказалось, что сродство NDP киназы Р к Gt-содержащим N-мембранам примерно в 100 раз ниже по сравнению со сродством к ним изоформы (Рис.

24). Это позволяет предположить, что различные изоформы NDP киназы играют различную функциональную роль в клетке. Такое предположение находится в рамках современных представлений об NDP киназе как о мультифункциональном белке.

В настоящее время представления о NDP киназах - семействе ферментов, основной функцией которых, как предполагалось ранее [Parks, Agarval, 1973], является синтез различных NTP из соответствующих NDP за счет АТР, претерпели принципиальные изменения. В начале 90-х годов выяснилось, что ряд генов (Nm23), нарушение работы которых ведет к увеличению метастатического потенциала раковых клеток, кодируют субъединицы NDP киназы. Это положило начало новому этапу исследований, в результате которого было показано, что NDP киназы могут играть роль регуляторов транскрипции онкогенов и участвуют во многих клеточных процессах, таких как, например, дифференцировка клеток, метастазирование и апоптоз, причем эти функции NDP киназы не всегда связаны с ее активностью как фермента. Совокупность этих неожиданных данных привела к предположению о том, что NDP киназа является мультифункциональным белком и стимулировала всесторонние исследования белков этого семейства. Каким образом киназа вовлечена в регуляцию сложных клеточных процессов было неясно, однако ряд косвенных данных указывал на то, что, по крайней мере, часть своих функций она может реализовать через взаимодействие G белками (см. Hanp.[Kimura, Nagata, 1979; Otero, 1990; Kimura, 1993]). Данные, полученные нами в данной части работы, не только являются одним из первых прямых экспериментальных подтверждений этой точки зрения, но и демонстрирует, что наличие в клетках млекопитающих различных изоформ NDP киназы может играть принципиально важное функциональное значение.

Концентрация К* (цМ) Концентрация (1* (цМ)

Рис. 23. Трансдуцин - необходимый компонент высокоаффинного СТР-зависимого связывания N0? киназы а с мембранами НСП: удаление С1 снижает сродство мембран к N0? киназе а. Различные количества в^-содсржащих И-мембран («,□) или свободных от (Й W-мeмбpaн (*,о) смешивали с №Р киназой а в 10 мМ МеБ-ШОН (рН 5 5) в отсутствие («,•) или присутствие^,о) 5 мкМ СТРИ (СТРуБ), центрифугировали, а супернатанты использовали для измерения ферментативной активности

Рнс. 24. N0? киназы аи р имеют разное сродство к мембранам НСП. Различные количества (И-содержащих ^мембран смешивали с ШР киназами а (■) или Р (•) в 10 мМ Мев-ИаОН (рН 5.5), центрифугировали, а супернатанты использовали для измерения ферментативной активности.

Рис. 25. Зависимости квантового выхода q (А) и положения максимума спектра Ятн (В) флуоресценции NDP киназы а (*>о) и NDP киназы (5 (в, п), полученные в результате 4-6 независимых экспериментов по титрованию. Титрование в кислую или щелочную стороны проводили, начиная от рН 8 (•, ■). Светлыми символами (о, о) показаны результаты обратного титрования к нейтральным рН

Глава VI. Физико-химические свойства рекомбинантных а И Р изоформ NDP киназы крысы и их производных

Сравнительное исследование рекомбинантных а и Р изоформ NDP киназы крысы методом собственной белковой флуоресценции. В дальнейшей работе мы предприняли попытку выяснить физико-химические основы, определяющие различные функциональные роли изоформ МБР киназы в клетках млекопитающих. В качестве объектов исследования были выбраны рекомбинантные аир изоформы NDP киназы крысы, детально охарактеризованные выше. В качестве основного метода для сравнительного исследования был выбран метод собственной белковой флуоресценции.

Изоформы аир привлекательны для сравнительных флуоресцентных исследований: они содержат инвариантные триптофановые (Тгр78, Тгр133 и Тгр149) и тирозиновые (Туг52, Туг67, Туг147 и Туг152) остатки.

Результаты этого исследования оказались неожиданными. Изоформы обладали принципиально различными базовыми флуоресцентными характеристиками при рН 8. МБР киназа а оказалась уникальной: несмотря на наличие нескольких флуорофоров ее

спектр флуоресценции монокомпонентен (Яша* ~ 340.4 нм), квантовый выход уникально высок (д = 0.42), более того, при длинноволновом положении максимума спектра флуоресценции ее флуоресцирующие остатки обладают уникально низкой доступностью как ионным, так и нейтральному тушителям (Кгеь М"1 = 0.11 ± 0.3, 0.04 ± 0.003 и 0.14 ± 0.02 для Се*, Г и акриламида, соответственно). В отличие от этого, коротковолновая (Лти = 335 нм) ЫБР киназа [5 имеет двухкомпонентный спектр (Я] ~ 339 нм и = 77%; Л2 = 322 нм и Бг = 23%), обычный квантовый выход (д = 0.21± 0.02) и типичную доступность тушителям.

Изоформы вели себя принципиально различно и при рН титровании (Рис. 25). Квантовый выход и положение Яти NDP киназы Р были практически постоянны в диапазоне рН 5-10. В то же время при закислении среды от рН 8 до рН 5.5 наблюдалось значительное обратимое уменьшение квантового выхода флуоресценции NDP киназы а

до 0.32, сопровождающееся значительным коротковолновым сдвигом Я™* до 337.5 нм. Спектры флуоресценции при рН 5.5 были двухкомпонентными ~ 340 нм, Б] » 78% и ¿2 ~ 327 нм, $2 ~ 22%), а доступность флуорофоров нейтральному тушителя акриламиду

для основного компонента флуоресценции значительно увеличивалась Эти результаты дали основания считать, что изоформы принципиально различны по своей структурной лабильности: тогда как диапазоне рН 5-8 NDP киназа Р не претерпевает структурных перестроек, в этих же условиях NDP киназа а существует в двух структурно различных состояниях, равновесие между которыми регулируется значением рН среды. Зависимость квантового выхода флуоресценции NDP киназы а от рН, отражающая структурный переход (рН полуперехода 6.2), была практически подобна рН-зависимости процесса связывания этой изоформы с комплексом Это позволило сделать вывод о том, что способность NDP киназы а к высокоаффинному GTP-зависимому связыванию с обусловлена ее способностью переходить при закислении среды в определенное структурное состояние, характерной особенностью которого является повышенное сродство к комплексу R*Gt.

Анализ существующих данных по пространственной структуре NDP киназ, выполненный совместно с Э.А. Бурштейном и ЯК. Решетняк, показал, что обнаруженные в настоящей работе различия во флуоресцентных свойствах NDP киназ а И Р и их структурной лабильности, скорее всего, определяются различиями электростатической ситуации в этих белках., а не какими-либо различиями их структур при нейтральных рН.

По видимому, это же обстоятельство может быть ключевой причиной различий в поведении NDP киназ а И Р при взаимодействии с родопсин-трансдуциновым комплексом и, в более общем случае, их разных функциональных ролей в клетке.

В дополнительных исследованиях мы пытались выяснить вопрос о механизме действия ионов Na+, K+, Са2+ и Mg2+ на взаимодействие между комплексом R*Gt и NDP киназой а. Для этого мы детально исследовали NDP киназу а крысы с помощью двух независимых подходов. Во-первых, мы изучили влияние ионов на ее связывание с мембранами' НСП. Во-вторых, мы использовали метод собственной белковой флуоресценции и исследовали изолированную NDP киназу а в растворе в том же диапазоне условий. Сравнение данных, полученных двумя независимыми методами, показало, что мишенью действия ионов Na+, К+, Са2+ и Mg2+ является именно NDP киназа а, а не комплекс родопсин-трансдуцин. В присутствии ионов NDP киназа а переходит в новое структурное состояние, обладающее низким сродством к комплексу R*Gt.

Исследование рекомбинантных производных NDP киназ аир. Флуоресценция, связывание с комплексом R*Gt и термостабильность. Основные различия первичных структур NDP киназ (152 остатка) локализованы в вариабельных участках

^(остатки 37-50, 7 замен) и V2 (остатки 131-150, 6 замен). Логично допустить, что различия в поведении изоформ в той или иной экспериментальной системе могут быть обусловлены различиями в одной из вариабельных частей фермента. Для проверки такой возможности мы использовали пептиды, синтезированные Dr. N. Nomura (Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology), которые были подобны по первичной структуре вариабельным областям VI и V2 изоформ. Использовался также пептид, аналогичный по первичной последовательности одной из консервативных частей фермента и пептид, отличный по структуре от структуры любого из участков изучаемых белков. Выполненные эксперименты показали, что способность а изоформы NDP киназы (в отличие от Р изоформы) взаимодействовать с комплексом R*Gt, по-видимому, определяется свойствами локализованного на поверхности гексамера ее вариабельного участка V1: из всех использованных пептидов, только пептид, имитирующий участок V1 NDP киназы а, блокировал взаимодействие фермента НСП с фоторецепторными мембранами (данные не приведены). Такие результаты не только указывают на функциональную важность участка V1, но и дополнительно свидетельствуют о высокой специфичности взаимодействия NDP киназы комплексом родопсин-трансдуцин.

Дальнейшие эксперименты по выявлению структурной основы различий между изоформами NDP киназы, возможно определяющей все последующие функциональные различия в клетках млекопитающих, были выполнены использованием

генноинженерных производных а- и Р-изоформ NDP киназы крысы. Исследовались (1) характеристики их собственной белковой флуоресценции в широком диапазоне условий, (2) параметры их взаимодействия с комплексом R*Gt и (3) их термостабильность, определяемая методом остаточной ферментативной активности [Lascu et al., 1992]. Использованная в исследованиях химерная форма NDP киназы a (NDP киназа аР) состояла из N-концевой части (остатки 1-118) изоформы а и С-концевого участка (остатки 118-152) изоформы р, тогда как химера NDP киназа Ра содержала N-концевую часть (остатки 1-118) изоформы Р и С-концевую часть (остатки 118-152) изоформы а (исследование этих белков дает принципиальную возможность выяснить роль участков VI и V2). В работе также исследовали tag-формы (HA-NDP киназа Р, HA-NDP киназа аР и HA-NDP киназа Ра), которые содержали иммунологически уникальный гемагглютининовый (НА) эпитоп (YPYDVPDYA) между А1а2 и Asp3 (исследование tag-производных позволяет выявить роль N-концевой области молекулы). Дополнительными-

объектами исследований являлись мутантные формы NDP киназ а И ß и их tag-производные (M-NDP киназа a, M-NDP киназа р, HA-M-NDP киназа а и HA-M-NDP киназа р, соответственно), которые не обладали ферментативной активностью вследствие замены His 118 в активном центре на остаток аланина. Субъединицы всех исследованных белков содержали по 3 триптофановых (Тгр78,133 и 149) и 4 тирозиновых (Туг52,67,147 и 151) остатка. Гены изоформ а И ß NDP киназы крысы и их производных были сконструированы и экспрессированы в Е. coli в Отделе Молекулярной Биологии Токийского Института Геронтологии Н. Ишикавой (Dr. N. Ishikawa) и Ю. Ишиджимой (Dr. Y. Ishijima) под руководством проф. Н. Кимуры. Рекомбинантные белки были очищены до гомогенного состояния (чистота > 98%, метод SDS-PAGE) сотрудниками нашей лаборатории в результате аффинной хроматографии на АТР-агарозе.

В ходе исследований рекомбинантных белков с помощью перечисленных методов и подходов были получены результаты, позволившие заключить, что:

(1) уникальные флуоресцентные характеристики NDP киназы а и ее способность к конформационным перестройкам, которые принципиально отличают ее от изоформы р, определяются свойствами вариабельно 1 о участка V1;

(2) способность NDP киназы а взаимодействовать с комплексом R*Gt обусловлена вариабельной областью V1, тогда как вклад С-концевой вариабельной области V2 и начального участка N-концевой области мал.

(3) термостабильность изоформы i выше, чем термостабильностьформы

причем различия в их температурах инактивации обусловлены остатками, преимущественно локализованными в вариабельном участке V1.

Совокупность полученных в работе данных и выводов дает веские основания считать, что именно вариабельный участок V1 определяет функциональные различия а и Р изоформ NDP киназы в клетке. In vivo NDP киназа представлена набором изоформ, обусловленных различными комбинациями субъединиц, причем этот набор

характерен для каждого типа тканей. Такие особенности четвертичной структуры фермента могут быть дополнительной основой для его мультифункциональности.

Ранее мы предположили, что ключевыми различиями изоформ NDP киназы

являются различия электростатической ситуации в этих белках. Вариабельный участок VI, значение которого показано в данной части работы содержит замены Arg42Gln, His47Leu, происходящие с изменением заряда. Поэтому возможно, что именно эти замены и определяют все последующие различия свойств а И ß изоформ NDP киназы. Очевидно, что в дальнейших исследованиях эти остатки и должны быть главной мишенью для направленного мутагенеза.

Краткое заключение. Возможная участие NDP киназы в активации GTP-связывающих белков.

Успехи, достигнутые в последние 25 лет при исследовании систем фототрансдукции, принципиально расширили наши представления как о строении и механизмах функционирования систем клеточной трансдукции, так и об общих принципах работы биологических систем, способных к высококачественной обработке и передачи информации. Одним из ключевых достижений этой области является развитие представлений о GTP-связывающих белках как о двоичных элементах, которые могут быть основой сложно регулируемых молекулярных усилителей, способных не только быстро и значительно усилить биологически важный сигнал, но и обеспечить предельно низкий уровень собственных шумов и потому обладающих предельно высокой чувствительностью. Гетеротримерный GTP-связывающий белок (G белок) трансдуцин и

система фототрансдукции палочек сетчатки в целом оказались прекрасной моделью для изучения принципов построения и механизмов работы таких молекулярных усилителей.

Одним из принципиальных этапов в исследовании трансдуциновой системы является выяснение вопроса о том, каков же истинный механизм фотоактивации трансдуцина in vivo. Изложенные в работе причины теоретического и экспериментального характера заставили нас сомневаться в том, что хорошо известный, наблюдающийся in vitro, и, возможно, обеспечивающий активацию многих членов семейства GTP-связывающих белков в клетке механизм GDP/GTP обмена не может обеспечить требуемую скорость активации трансдуцина in vivo. С другой стороны, мы получили экспериментальные данные, которые можно рассматривать как указания на то, что таким механизмом могло бы быть индуцируемое фотоактивированным родопсином трансфосфорилирование GDP до GTP в активном центре трансдуцина. Потенциально такой механизм мог бы обеспечить высокую скорость активации трансдуцина при сохранении низкого уровня шума трансдуциновой системы в целом.

Одним из подходов к доказательству механизма трасфосфорилирования является поиск элемента, осуществляющего такую реакцию и демонстрацию с помощью тех или иных подходов его взаимодействия с родопсин-трансдуциновым комплексом. Первоначально, основываясь соображениях теоретического характера и косвенных экспериментальных данных, мы предположили, что такую роль могла бы играть субъединица трансдуцина. В ходе последующих совместных исследований нашей лаборатории и Отдела Молекулярной Биологии Токийского Столичного Института Геронтологии были получены указания на то, что роль специфической фосфотрансферазы могла бы играть хорошо известная NDP киназа, способная не только синтезировать NTP из соответствующих NDP и АТР, как считалось ранее, но и являющаяся мультифункциональным белком, участвующим в важных регуляторных процессах в клетке. В наших исследованиях было обнаружено [Orlov et al., 1998] высокоспецифичное GTP-зависимое взаимодействие между эндогенной NDP киназой НСП быка (а позднее, и рекомбинантной а изоформой NDP киназы крысы) и мембранным R*-Gt комплексом. Реально феномен такого взаимодействия удалось обнаружить благодаря применению метода светозависимой сорбции, использующего фоторецепторные мембраны как фотоаффинный сорбент [Kuhn, 1980], и позволившим ранее выявить такие ключевые компоненты системы фототрансдукции как трансдуцин, родопсинкиназа и аррестин. Дополнительно мы подобрали условия, позволившие стабилизировать такое взаимодействие, скорее всего, являющееся динамичным in vivo, и сделать его доступным для наблюдения с помощью относительно простых методов. Важно, что NDP киназа взаимодействовала с комплексом родопсин-трансдуцин - состоянием, которое является одним из ключевых промежуточных состояний в процессе быстрого формирования значительного количества активных молекул трансдуцина в ответ на фотолиз одиночной молекулы родопсина [Uhl et al., 1990; Pugh, Lamb, 1993; Helmreich, Hofinann, 1996]. В последующих работах мы подтвердили специфичность такого взаимодействия, и показали, что конформационная лабильность NDP киназы а и ее способность взаимодействовать с R*-Gt комплексом, т.е. свойствами, принципиально отличающими ее от гомологичной NDP киназы Р, скорее всего, обусловлена структурой и свойствами вариабельного участка V1. Одновременно эти и ряд других результатов также позволили выявить возможные ключевые физические причины, лежащие в основе разнообразия ее структурных и конформационных состояний и, как следствие, разнообразия ее функций в клетке.

Значительная часть данных о взаимодействии между NDP киназой (использовалась NDP киназа В человека (Nm23-H2), являющаяся аналогом NDP киназы а крысы) и Gt

была недавно подтверждена работами немецких исследователей [Cuello et al., 2003; Hippe et al., 2003], применявших независимые методы и подходы. Нельзя не отметить и многочисленные, появившиеся в последние годы и полученные с помощью современных методов и подходов данные, которые свидетельствуют о наличии взаимодействия между NDP киназой и различными представителями семейства GTP-связывающих белков. В целом, все эти результаты указывают на то, что взаимодействие между NDP киназой и GTP- связывающими белками является достаточно общим феноменом, имеющий важный функциональный смысл.

Возможно, что эта роль состоит в активации GTP-связывающих белков путем трансфосфорилирования связанного GDP. На это указывают результаты ряда недавних работ, в которых благодаря определенным экспериментальным приемам, удалось, как кажется, преодолеть известные трудности, возникающие при попытке однозначно доказать, что фосфорилированию NDP киназой подвергается именно связанный, а не диссоциировавший из активного центра GTP-связывающего белка GDP (см. напр. [Тищенков и соавт., 1982; Lacombe et al., 2000; Kimura et al., 2003]). В этих работах [Zhu et al., 1999; Otsuki et al., 2001 ], в частности, было показано, что NDP киназа способна фосфорилировать GDP, ковалентно связанный в активном центре GTP-связывающих белков Rad, Racl, Cdc42Hs и RhoA (гомологичен а-субъединице G-белков) в результате их предварительного УФ-облучения в присутствии GDP.

Совокупность изложенных данных позволяет предложить схему процесса активации трансдуцина, происходящего с участием NDP киназы (Рис. 26). Важно дополнительно отметить ряд свойств NDP киназы, делающих ее привлекательным участником процесса активации G-белков через механизм трансфосфорилирования. Действительно, активность NDP киназы очень высока и достигает 10 циклов в секунду. Очевидно, что столь активный фермент потенциально способен обеспечить требуемую скорость фосфорилирования связанного GDP. Кроме того, NDP киназа является гексамером с высокой степенью симметрии, независимо функционирующими каталитическими субъединицами и осуществляет катализ через образование промежуточного фосфорилированного состояния. Очевидно, что все эти свойства могут значительно облегчать ферменту участие в предполагаемом процессе. Более того, согласно нашим данным [Orlov et al., 1996; Orlov, Kimura, 1997], NDP киназа характеризуется некоторым сродством к R*. Это сродство невелико (Kd = 2-3 цМ) [Orlov et al., 1996; Orlov, Kimura, 1997] но, по-видимому, достаточно для того, чтобы комплекс между R* и NDP киназой был относительно долгоживущим (время диссоциации >1 мс) и не успевал диссоциировать в процессе быстрой замены активированного Gt-GTP на новый неактивный Gt-GDP. Это означает, что комплекс между R* и NDP киназой после своего образования будет действовать каталитически против большого числа неактивных молекул Gt (в рамках такой точки зрения, индуцируемое с помощью GTP высвобождение NDP киназы, наблюдаемое в наших условиях, может и не быть непременным этапом процесса активации каждой новой молекулы Gt in vivo). Следовательно, возможно, что высокая скорость активации Gt может быть обеспечена NDP киназой даже при ее низкой, по сравнению с Gt, концентрацией в НСП.

Как отмечено выше, мы предполагали, что роль фосфотрансферазы могла бы играть ß субъединица трансдуцина. Такая точка зрения не противоречит существующим данным. Показано, что NDP киназа В человека (Nm23-H2), являющаяся аналогом NDP киназы а крысы, способна выступать в роли гистидинкиназы и фосфорилировать субъединицу трансдуцина по остатку His266, далее являющегося донором фосфата в фосфорилировании GDP в активном центре субъединицы трансдуцина [Guello et al., 2003; Hippe et al., 2003; Lutz et al., 2004]. Таким образом, ß субъединица трансдуцина

играет роль промежуточной фосфотрансферазы, участвующей в переносе фосфата от Hisl 18 в активном центре NDP киназы на GDP в активном центре G белка. Очевидно, что это приведет к некоторому усложнению представленной принципиальной схемы активации трансдуцина.

Рис. 26. Возможное действие NDP киназы в системе зрительной трансдукции. Схема основана на данных о взаимодействии между NDP киназой и трансдуцином (Gt) в присутствии возбужденного родопсина (R*) и предполагает, что это взаимодействие является частью процесса активации трансдуцина через фосфорилирование связанного GDP. (I) Молекула R* быстро (<0.1 мс) ассоциирует с неактивной формой трансдуцина (Gt-GDP). (И) Ассоциация NDP киназы с R* происходит позже. (III) NDP киназа фосфорилирует Gt-GDP, используя АТР (или NTP) и, таким образом, формирует активную форму трансдуцина Gt-GTP. (IV) Gt-GTP высвобождается. (V) Комплекс R*-NDP киназа является относительно долгоживущим (>1 мс) и поэтому работает каталитически со многими новыми молекулами Gt-GDP. После диссоциации R*-NDPK (VI), свободный R* снова ассоциирует с Gt-GDP (шаг I) и затем снова с NDP киназой (шаг И) и процесс активации трансдуцина повторяется до инактивации R*, протекающей с участием родопсинкиназы и аррестина.

В последние годы появилось большое количество данных, указывающих на возможность взаимодействия между NDP киназой и нуклеотидсвязывающими белками различных семейств (G-белки, низкомолекулярные GTP-связывающие белки семейства Ras, цитоскелетные АТР- и GTP-связывающие белки, шапероны, функциональные циклы каждого из которых требует участия АТР и ADP, факторы элонгации и инициации белкового синтеза, и т. д.). Все эти белков принципиально подобны друг другу по способности существовать в двух конформационно и функционально различных состояния, стабилизируемых нуклеозидди- и нуклеозидтрифосфатами (ADP, GDP и АТР, GTP, соответственно). Можно допустить, что в этих системах NDP киназа принимает участие в их активации посредством рассмотренного выше гипотетического механизма.

выводы

1. Обнаружено, что НСП сетчатки лягушки содержат гетеротримерный GTP-связывающий белковый комплекс, концентрация которого составляет 5-7% от концентрации R. По аналогии с подобным белком из НСП сетчатки быка, белковый комплекс назван трансдуцином (Gt). Показано, что при малых уровнях фотолиза молекула R* индуцирует образование значительного количества молекул Gt-GppNHp (активатор PDE). Сделан вывод о том, что трансдуцин может обеспечить первичное усиление зрительного стимула в палочках сетчатки. Выполнен анализ гипотезы, согласно которой активное состояние трансдуцина (Gt-GTP) формируется из неактивного состояния (Gt-GDP) в результате индуцируемого молекулой R* обмена связанного GDP на свободный GTP. Показано, что даже при соблюдении условий, способствующих максимальной скорости обмена, его скорость мала и не может обеспечить требуемую скорость фотоактивации Gt in vivo. Обнаружено, что в препаратах НСП сетчатки лягушки GDP, связанный трансдуцином, фосфорилируется с высокой скоростью до GTP в присутствии R* и АТР. Предполагается, что фотоиндуцированное фосфорилирование связанного GDP до GTP может лежать в основе быстрой активации трансдуцина в палочке.

2. Предложен «однооборотный» метод измерения скорости гидролиза GTP в активном центре Gt. Применение этого метода позволило показать, что время жизни активного состояния Gt в препаратах НСП в стандартных условиях велико (30-40 с), но резко уменьшается при понижении концентрации Са2+. Таким образом, впервые показана возможность регуляции времени жизни активного состояния трансдуцина.

3. Показано, что активированная PDE есть комплекс фермента с активной формой Gt. Обнаружена популяция PDE, плотно связанной с мембранами, но экстрагирующейся при обработке препаратов трипсином. Высказано предположение о наличии в составе PDE липидного компонента, подтвержденное результатами работ других лабораторий. Обнаружено увеличение базальной активности различных типов препаратов PDE при их длительной инкубации с сАМР. Высказано предположение о функциональной роли некаталитических cGMP-связывающих центров PDE.

4. Методом аффинной хроматографии на мелиттин-сефарозе в НСП сетчатки быка обнаружен ряд белков, взаимодействующих с сорбентом Са2+-зависимым образом. Белки с к.м.м. 21 Ша и 10 kDa были идентифицированы как кальмодулин и субъединицы белка S-100. Белки с к.м.м. 26 kDa были позднее идентифицированы другими авторами как (1) ингибитор родопсинкиназы рековерин, и (2) активаторы гуанилатциклазы GCAP-1 и GCAP-2. Методом аффинной хроматографии на кальмодулин-сефарозе показано Са2+-зависимое взаимодействие между Gt и кальмодулином.

5. Предпринята попытка выяснить природу ключевых компонентов системы зрительной трансдукции колбочек. Для этого разработан метод получения препарата НС колбочек (НСК) сетчатки суслика. Препарат НСК содержал PDE, подобную PDE НСП сетчатки быка по кинетическим характеристикам, молекулярной массе, значению pI, термостабильности, чувствительности к действию трипсина и содержанию в фоторецепторах. PDE в препаратах НСК активировалась при их облучении видимым светом в присутствии GTP и содержала ингибиторный компонент, функционально подобный ингибиторной у-субъединице PDE НСП. Сделан вывод о том, что НСК, как и НСП, содержат ферментативный каскад усиления, функционирующий с участием GTP-связывающего белка и PDE, подобной PDE НСП по всем исследованным характеристикам. Выполнен анализ, результаты которого позволили сделать вывод о том, что системы фототрансдукции палочек и колбочек подобны и различаются в системах, прекращающих развитие процесса активации после действия света и возвращающих элементы и систему в целом в первоначальное состояние. Именно этим можно объяснить хорошо известные различия палочек и колбочек в кинетике фотоответов и светочувствительности.

6. С помощью широкого спектра подходов и методов (в частности, при использовании метода быстрой фильтрации и применении радиоактивно меченных GDP и GTP) показано, что время диссоциации комплекса Gt-GDP в присутствии R* в различных типах препаратов НСП сетчатки быка составляет 4-6 с при 20*С. Таким образом, подтверждено высказанное нами ранее предположение о том, что обмен связанного GDP на свободный GTP не может обеспечить требуемую скорость фотоактивации трансдуцина в фоторецепторах позвоночных.

7. Обнаружено, что водорастворимая эндогенная NDP киназа в обесцвеченных препаратах НСП сетчатки быка способна к равновесному связыванию с мембранами. Такое взаимодействие зависит от концентрации Н*, Na+, K+, Са2+, Mg2+ и GTP[S]. Показано, что GTPfSj-зависимое взаимодействие NDP киназы с мембранами имеет место лишь в присутствии Gt, а мембраны, лишенные Gt, обладают лишь GTPfSJ-независимым и низким сродством к NDP киназе. Сделан вывод о том, что (1) центрами -зависимого связывания фермента являются мембранные комплексы между Gt и R\ a (2) их известная диссоциация под действием GTP[S] ведет к высвобождению NDP киназы. Использование в модельных экспериментах по связыванию рекомбинантных а- и Р-изоформ NDP киназы крысы показало, что взаимодействие фермента с мембраной является изоформ-специфичным: изоформа а взаимодействует с комплексами R*Gt подобно эндогенной NDP киназе НСП сетчатки быка, тогда как сродство изоформы Р к центрам связывания в по крайней мере в 100 слабее, чем сродство NDP киназы а. Представлены данные, указывающие на то, что различия в сродстве изоформ к комплексу R*Gt обусловлены различиями вариабельных участков V1 этих гомогексамеров, а влияние Н+ и катионов (Na+, K+, Са2+, Mg2+) на взаимодействие NDP киназы с комплексами R*Gt опосредуется их действием на фермент.

8. Изолированные высокогомологичные рекомбинантные гомогексамеры Ct И |3NDP киназы крысы (каждый из двух типов субъединиц содержат 3 триптофана (Тгр78, 133, и 149) и 4 тирозина (Туг 52, 67, 147, и 151)) исследовали методом собственной белковой флуоресценции в растворе в широком диапазоне условий среды. Обнаружено, что данные белки принципиально различны по своим флуоресцентным свойствам (квантовому выходу, положению максимума спектра флуоресценции и форме спектра) при нейтральных рН и их поведению при рН титровании. NDP киназа а подвергается структурным изменениям в диапазоне рН 5-8, тогда как NDP киназа р стабильна в этом диапазоне условий. Выполнен анализ, указывающий на то, что различия в конформационной лабильности и способности изоформ NDP киназы к взаимодействию с родопсин-транедуциновым комплексом могут иметь одну и ту же физическую основу, которая возможно одновременно определяет и известные различия в функциональной роли изоформ NDP киназы в клетке. Предполагается, что причиной таких различий, скорее всего, являются различия глобальных электростатических зарядов этих белков, а не какие-либо структурные различия между ними при нейтральных рН.

9. Выполнено сравнительное исследование рекомбинантных NDP киназ а и крысы р и их химерных, мутантных и tag-производных методом собственной белковой флуоресценции. Полученные результаты дают основания считать, что уникальные флуоресцентные свойства NDP киназы а и способность к конформационным перестройкам, отличающие ее от изоформы р, определяются свойствами N-концевого вариабельного участка V1, тогда как вклад С-концевой вариабельной области V2 и начального участка N-концевой области мал.. Принципиальная роль этого участка в свойствах изоформ была также подтверждена результатами экспериментов по связыванию производных фермента крысы с фоторецепторными мембранами и исследованию сравнительной термостабильности -изоформ и их производных методом остаточной ферментативной активности. Предполагается, что различия в структуре и свойствах участка VI определяют и функциональные различия изоформ в клетках млекопитающих.

10. Анализируется гипотеза, согласно которой функциональный смысл показанного в настоящей работе специфического взаимодействия между NDP киназой и R*-Gt комплексом отражает один из этапов участия этого фермента в процессе активации G белка палочек сетчатки. Рассмотрены преимущества схемы активации трансдуцина с участием NDP киназы.

Список основных публикаций

Фесенко Е.Е., Орлов НЛ., Кулаков В.Н., Фесенко Н.К. (1971) Прямые и обратные фотохимические реакции зрительного пигмента родопсина. В сб. «Биофизика живой клетки» (ред. Г.М. Франк), вып. 2,32-49.

Фесенко Е.Е., Орлов Н.Я., Кулаков В.Н. (1972а) Импульсный источник света м икр о секундной длительности для установки импульсного фотолиза. Приборы и техника эксперимента 5,187-188.

Фесенко Е.Е., Орлов Н.Я., Кулаков В.Н. (19726) Криостатдля установки импульсного фотолиза. Приборы и техника эксперимента 5,204-205.

Fesenko E.E., Orlov N.Ya., Fesenko N.K. (1972) Spectral-kinetic study ofthe visual pigment transitions. Abstr. paper of the 4th International Biophysical Congress, Moscow, v. 4, p. 13-14.

Фесенко Е.Е., Орлов Н.Я., Фесенко Н.К. (1973). Исследование первичных фотореакций родопсина. В сб. «Конформационные изменения биополимеров в растворах», Наука, Москва, стр. 131-137.

Фесенко Е.Е., Орлов Н.Я.( 1977а) Возможные причины сложной кинетики распада ранних промежуточных продуктов фотолиза родопсина. В сб. «Механизмы сенсорной рецепции» Наука, Ленинград, стр. 122-128.

Фесенко Е.Е., Орлов Н.Я.( 19776) Исследование перехода прелюмиродопсин-люмиродоисин в зрительном пигменте позвоночных. Мол. Биол. 11,147-157.

Орлов Н.Я., Гаспарян А.Г., Фесенко Е.Е. (1977а) Изучение осмотических свойств везикул, полученных при ультразвуковой обработке фрагментов наружных сегментов палочек сетчатки позвоночных. Тезисы V Конференции молодых ученых «Современные проблемы биологии», Минск, стр. 43.

Орлов Н.Я., Фесенко Е.Е., Казанцев СИ. (19776) Изоэлектрическая фокусировка родопсина. Мол. Биол. 10,1133-1141.

Гаспарян А.Г., Орлов Н.Я., Фесенко Е.Е. (1979) Реконструкция натриевого канала на искусственной липидной мембране, модифицированной компонентами наружных сегментов фоторецепторов. Тезисы докл. 11 Конференции молодых ученых Института Экспериментальной Биологии АН ССР Армении (Цахкадзор, 27-30 ноября 1979), стр. 34.

Фесенко Е.Е., Орлов Н.Я., Сатина Л.Я. (1980) Фосфорилированис белков в препаратах наружных сегментов палочек сетчатки быка. Мол. Биол. 14,787-794.

Гаспарян А.Г., Орлов Н.Я., Фесенко Е.Е. (1980) Быстрые фотоиндуцированные изменения светорассеивания фоторецепторных мембран позвоночных. I. Исследование препаратов наружных сегментов палочек сетчатки. Биофизика 25,87-92.

Орлов Н.Я., Гаспарян А.Г., Фесенко Е.Е. (1980) Быстрые фотоиндуцированные изменения светорассеивания фоторецепторных мембран позвоночных. II. Исследование суспензий, полученных при ультразвуковой обработке наружных сегментов палочек сетчатки. Биофизика 25, 63-69.

Фесенко Е.Е., Орлов Н.Я., Гаспарян А.Г., Колесников С.С. (1981) Молекулярные механизмы фоторецепции. V. Реконструкция натриевого канала на искусственной липидной мембране, модифицированной компонентами наружных сегментов фоторецепторов. Мол. Биол. 15, 12641275.

Гаспарян А.Г., Орлов Н.Я., Фесенко Е.Е. (1982) Моделирование плазматической мембраны наружных сегментов палочек сетчатки позвоночных. Тезисы докл. 1 Всесоюзного Биофизического Конгресса (Москва, 3-8 августа 1982), т. 2, стр. 81.

Шныров В.Л., Багиров И.Г., Жадан Г.Г., Орлов Н.Я., Тищенков В.Г., Лазарев Ю.А.(1982) Фазовые переходы в фоторецепторных мембранах.Тезисы докл. I Всесоюзного Биофизического Конгресса (Москва, 3-8 августа 1982), т. 1, стр. 176-177.

Тищенков В.Г., Грумбкова Л.О., Шныров В.Л., Орлов Н.Я. (1982) ГТФ-связывающий белковый комплекс фоторецепторов лягушки. Тезисы докл. I Всесоюзного Биофизического Конгресса (Москва, 3-8 августа 1982), т. 4, стр. 132.

Тищенков В.Г., Грумбкова Л.О., Орлов Н.Я. (1982) ГТФ-связывающий белковый комплекс -активатор фосфодиэстеразы наружных сегментов палочек сетчатки лягушки. Тезисы докл. IV Всесоюзного Симпозиума «Циклические нуклеотиды» (Минск, сентябрь 1982), стр. 149.

Тищенков В.Г., Грумбкова Л.О., Орлов Н.Я. (1982) Фосфорилирование связанного [14C]GDP в препаратах наружных сегментов палочек сетчатки лягушки. Докл. АН СССР 268,735-738.

Тищенков В.Г Орлов НЛ. (1983) Взаимодействие гуаниновых нуклеотидов с мембранами наружных сегментов палочек сетчатки лягушки. Биофизика 28,274-279.

Орлов Н.Я., Тищенков В.Г., Багиров И.Г., Шныров В.Л. (1983) GTP-связывающий белковый комплекс в наружных сегментах палочек сетчатки. Биофизика 28,793-799.

Тищенков В.Г., Орлов НЛ. (1983) Механизм формирования активного состояния ГТФ-связывающего белка в фоторецепторах позвоночных. Тезисы докл. IX Всесоюзной Конференции по Биохимии нервной системы (Ереван, 1983).

Орлов Н.Я., Тищенков В.Г. (1983) Функционирование и регуляция трансдуцина наружных сегментов палочек сетчатки лягушки. Тезисы докл. VI Всесоюзного Симпозиума «Химия белков и пептидов» (Рига, 21-25 ноября 1985), стр. 50-51.

Гулак П.В., Орлов С.Н., Шныров В.Л., Орлов Н.Я., Литвинов Н.Я., Покудин Н.И. Постнов Ю.В. (1983) Некоторые характеристики мембранных белков эритроцитов in spontaneously hypertensive rats. Кардиология 23, 59-62.

Gulak P.V., Orlov S.N., Pokudin N.I., Postnov Yu.V., Litvinov I.S., Orlov N.Ya., Shnyrov V.L. (1984) Microcalorimetry and electrophoresis of erythrocyte membrane of spontaneously hypertensive rats. J. Hypertension 2,81-84.

Тищенков В.Г., Орлов Н.Я. (1984) Аденилаткиназная и ГДФ-киназная активность наружных сегментов палочек сетчатки лягушки. Возможная функциональная роль ß-субъединицы трансдуцина. Мол. Биол. 18,776-785.

Калинин Е.В., Орлов Н.Я. (1985) Фотоактивация фосфодиэстеразы циклических нуклеотидов наружных сегментов палочек сетчатки быка в присутствие GDP и АТР. Тезисы докл. 8 Объединенного Симпозиума Биохимических Обществ СССР-ГДР «Проблемы современной биохимии и биотехнологии» (Рига, 1985), стр. 86-87.

Татарюнас А.Б., Орлов Н.Я., Карнаухов В.Н. (1985) Люминесцентные спектральные свойства липофусциновых гранул из сердечной мышцы крупного рогатого скота. Тезисы докл. «Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение», Рига, стр. 8182.

Орлов Н.Я., Калинин Е.В., Фрейдин А.А. (1985) Функционирование и регуляция молекулярных элементов ферментативного каскада в палочках сетчатки позвоночных. Тезисы докл. Всесоюзного Симпозиума «Зрение организмов и роботов» (Вильнюс, 1-3 октября 1985), т. 1, стр. 120-122.

Orlov N.Ya., Kalinin E.V. (1985) Mechanism of activation and regulation of the cyclic nucleotide phosphodiesterase in photoreceptors of bovine retina. Abstr. paper of the 13th International Biochemical Congress (Amsterdam, 1985) Tu-334, p. 314.

Орлов Н.Я., Калинин Е.В., Орлова Т.Г., Фрейдин А.А. (1985) Кинетическое поведение фосфодиэстеразы циклических нуклеотидов наружных сегментов фоторецепторов сетчатки в отсутствие активированного трансдуцина. Тезисы докл. V Всесоюзного Симпозиума «Циклические нуклеотиды и система регуляции ферментативных реакций» (Рязань, 1985), стр. 91.

Калинин Е.В., Орлов Н.Я. (1985) Участие АТР в процессе фотоактивации фосфодиэстеразы циклических нуклеотидов в наружных сегментах палочек сетчатки быка. Тезисы докл. V Всесоюзного Симпозиума «Циклические нуклеотиды и система регуляции ферментативных реакций» (Рязань, 1985), стр. 57.

Permyakov E.A., Shnyrov V.L., Kalinichenko L.P., Orlov N. Ya. (1985) Effect of a cation binding on the thermal transition in calmodilin. Biochim. Biophys. Acta 839,288-295.

Татарюнас А.Б., Орлов Н.Я., Карнаухов В.Н. (1987) Выделение липофусцина из миокарда крупного рогатого скота. Бюл. Эксп. Биол. Мед. 103(5), 543-546.

Пермяков Е.А., Калиниченко Л.П., Орлов Н.Я., Шныров В.Л. (1985) Эффект связывания катионов на индуцированные конформационные изменения калмодулина. Тезисы докл. VI Всесоюзн. Симпозиума «Конформационные изменения биополимеров в растворах» (Тбилиси, 1985), стр. 43.

Пермяков Е.А., Калиниченко Л.П., Орлов Н.Я., Шныров В.Л., Бурштейн Е.А. (1986) Эффект связывания катионов на термоиндуцированные переходы в калмодулине. Тезисы докл. V Всесоюзн. Биохимического Съезда Симп. (Киев, 1985), том. 2, стр. 6.

Kalinin E.V., Orlova T.G., Freidin A.A., Orlov N.Ya. (1986) Light-activated cGMP-specific phosphodiesterase in ground squirrel retinal photoreceptors. Abstr. paper of the 17th FEBS Meeting (West Berlin, August 24-29,1986) Fri. 06.03.37.

Орлов Н.Я., Калинин Е.В., Орлова Т.Г., Фрейдин А.А., Иваницкий Г.Р. (1986) Активность фосфодиэстеразы циклических нуклеотидов в препаратах наружных сегментах колбочек сетчатки суслика. Докл. АН СССР 286,454-457.

Орлов Н.Я., Калинин Е.В., Орлова Т.Г., Фрейдин А.А., Бурштейн Е.А. (1986) Система фототрансдукции фоторецепторов цветного зрения. Тезисы докл. 20-й Конференции физиологов Юга России, Ростов на Дону, т. 1, стр. 39-40.

Orlov N.Ya., Kalinin E.V., Orlova T.G., Freidin A.A. (1986) Elements of phototransduction system in colour vision photoreceptors. Abstr. paper of the VI General Meeting of the Eur. Society for Neurochemistry «Molecular Basic of Neural Functions» (Prague,l-6 September 1986) p. 276.

Калинин Е.В., Орлова Т.Г., Фрейдин А.А., Орлов Н.Я. (1987) Характеристики cGMP-специфичной фосфодиэстеразы в наружных сегментах фоторецепторов сетчатки суслика. Нейрохимия 6, 531543.

Orlov N.Ya., Kalinin E.V., Orlova T.G., Freidin A.A. (1988) Properties and content of cyclic nucleotide phosphodiesterase in photoreceptor outer segments of ground squirrel retina. Biochim. Biophys. Acta 954,325-335.

Калинин Е.В., Орлова Т.Г., Фрейдин А.А., Орлов Н.Я. (1988) Содержание cGMP-специфичной фосфодиэстеразы в наружных сегментах фоторецепторов сетчатки суслика. В сб. «Механизмы гибернации» (ред. С.Г. Колаева), Пущино, стр. 81-88.

Калинин Е.В., Орлова Т.Г., Фрейдин А.А., Орлов Н.Я. (1988) Регуляция активности cGMP-специфичной фосфодиэстеразы в наружных сегментах фоторецепторов сетчатки суслика. В сб. «Механизмы гибернации» (ред. С.Г. Колаева), Пущино, стр. 89-94.

Орлов Н.Я., Калинин Е.В., Орлова Т.Г., Грищенко В.М., Фрейдин А.А., (1988) Исследование элементов cGMP-специфичного каскада усиления систем фототрансдукции палочек и колбочек сетчатки. Тезисы докл. VI Всесоюзн. Симп. «Роль циклических нуклеотидов и вторичных посредников в регуляции ферментативных реакций» (Петрозаводск, 1988) стр. 85.

Орлов Н.Я., Фрейдин АЛ., Калинин Е.В., Орлова Т.Г., Грищенко В.М.(!989) Популяции cGMP-специфичной фосфодиэстеразы наружных сегментов палочек сетчатки, отличающиеся сродством к фоторецепторным мембранам. Докл. АН СССР 307,490 - 494.

Грищенко В.М., Орлова Т.Г., Фрейдин А.А., Орлов Н.Я. (1989) Кальций-зависимое связывание водорастворимых белковых компонентов препаратов наружных сегментов палочек сетчатки быка с мелиттин-сефарозой. Докл. АН СССР 307,1498 -1502.

Orlov N.Ya., Freidin A.A., Orlova T.G., Grishchenko V.M. (1989) Populations of cGMP-specific phosphodiesterase of the vertebrate retinal visual cells with different affinities to the photoreceptor membranes. Abstr. paper of the International Simposium «Molecular organization of biological structures» (Moscow, June 19-24), v. 1, p. 48.

Orlov N.Ya., Freidin A.A., Grishchenko V.M., Orlova T.G. (1989) Calcium-binding proteins in the preparations of bovine retinal rod outer segments. Abstr. paper of the International Simposium «Molecular organization of biological structures» (Moscow, June 19-24), v. 1, p. 46.

Freidin A.A., Grishchenko V.M., Orlova T.G., Orlov N.Ya., Burstein E.A.(1989) Calcium-binding proteins in the preparations of bovine retinal rod outer segments. Abstr. paper of the 19th FEBS Meeting (Rome, Italy, 1989) p. Tu-83.

Orlov N.Ya., Freidin A.A., Grishchenko V.M., Orlova T.G. (1990) Calcium ions and elements of the cGMP-specific phototransduction systems of retinal rods. Abstr. paper of the 8th Eur. Soc. Neurochem. Meeting (Leipzig, July 16-20,1990) p. 256.

Креймер Д.И., Ламаш Н.Е., Федосеев В.Я., Грищенко В.М., Орлова Т.Г., Фрейдин А.А., Орлов Н.Я. (1991) Изменения водорастворимых белков-мишеней, связывающих кальций-кальмодулин при эмбриогенезе яиц морского ежа. Онтогенез 22,421-429.

Permyakov E.A., Grishchenko V.M., Kalinichenko L.P., Orlov N.Ya., Kuwajiama K., Sugai S. (1991) Calcium-regulated interactions of human a-lactalbumin with bee venom melittin. Biophys. Chem. 39, 111-117.

Kreimer D.I., Fedoseev V.Ya., Grishchenko V.M., Orlova T.G., Fredin A.A., Orlov N.Ya. (1992) Water-soluble calcium - calmodulin-binding proteins in embryo of the sea urchin Strongylocentrotus intermedium. Сотр. Biochem. Physiol. 103B, 951-954.

Zherelova O.M., Grishchenko V.M., Orlova T.G., Orlov N.Ya. (1994) Purification of a protein from Nitellopsis obtusa cells and its involvement in the regulation of potential-dependent calcium channel. Сотр. Biochem. Physiol. 123C, 56-64.

Orlov N.Ya., Orlova T.G., Reshetnyak Ya.K., Burstein E.A., Kimura N. (1995) Study of recombinant rat nusleoside diphosphate kinases by intrinsic tryptophan fluorescence. Abstr. paper of the International Conference "Physics and Chemistry of Organic Luminophores'95", Kharkhov (Ukraine), p. 153.

Orlov N.Ya., Orlova T.G., Reshetnyak Ya.K., Burstein E.A., Kimura N. (1995) Comprative study of a and P-nusIeoside diphosphate kinases by protein tryptophan fluorescence spectroscopy. Abstr. paper of the International Meeting "Spectroscopy of Organic Compounds", Nezhgin (Ukraine), p. 153.

Kimura N., Shimada N., Fukuda M., Yasumoto Y., Ishii A., Ishikawa N, Orlov N.Ya. (1995) The role of NDP kinases/nm23 in cellular functions. Abstr. paper of the First International Workshop on nm23/NDP kinase (Paris, 11-13 October 1995) p. T28.

Orlov N.Ya., Kimura N.(1994) G-protein-dependent interaction of nucleoside diphosphate (NDP) kinase/nm23 with the bovine retinal rod outer segment (ROS) membranes. Abstr. paper of the Eighth International Conference of the International Society of Differentiation (ISD) (Hiroshima, Japan, October 22-26,1994), p. 143(091).

Orlov N.Ya., Orlova T.G., Nomura K., Hanai N, and Kimura N. (1996) Transducin-mediated, isoform-specific interaction of recombinant rat nucleoside diphosphate kinases with bleached bovine retinal rod outer segment membranes. FEBS Lett. 389,186-190.

Burstein E.A., Orlov N.Ya., Orlova T.G., Reshetnyak Ya. K., Kimura N. (1996) Comparative study of rat recombinant nucleoside diphosphate kinase alpha and beta by intrinsic tryptophan fluorescence. 3rd Internet World Congress on Biomedical Sciences (December 9-20), http://

rtc3iwc.rtc.riken.go.jp/CONGRESS/ SYMPO/SBC0203/AH0108/ TIT.HTM

Orlov N.Ya., Kimura N. (1996) Transducin-mediated, pH- and salt-dependent interaction of bovine and recombinant rat nucleoside diphosphate kinases with bleached bovine retinal rod outer segment membranes. 3rd Internet World Congress on Biomedical Sciences (December 9-20), http:// rtc3iwc.rtc.riken.go.jp/ CONGRESS/SYMPO/SBC0203/AG0107/ПТ.НТМ

Orlov N.Ya., Kimura N. (1997) Interaction of nucleoside diphosphate kinases with membranes of the bleached bovine retinal rod outer segments. Effects of pH, ions and guanine nucleotides. Abstracts of 41th Annual Meeting of the American Biophysical Society (New Orleans, USA, March 2-6, 1997), Biophys. J., v. 72, #2(2), p. A92 (M-Pos389).

Orlov N.Ya., Kimura N. (1997) Possible mechanism of rapid activation of G-protein transducin in vertebrate retinal rod outer segments. Abstracts of ХХХП1 Internatl. Congress of Physiological Sciences (St. Petersburg, Russia, 28 June - 2 July 1997), abstract # P082.06.

Orlov N.Ya., Orlova T.G., Reshetnyak Ya. K, Burstein E.A, Kimura N. (1997) Interaction of rat recombinant nucleoside diphosphate kinase O, with bleached bovine photoreceptor membranes. The possible mode of pH and salt effects. Biochem. Mol. Biol. International 41,189-198.

Orlov N.Ya., Kimura N. (1998) Interaction of nucleoside diphosphate kinase with membranes ofbleached bovine retinal rod outer segments. Effects ofpH, salts, and guanine nucleotides. Биохимия 63,171-179.

Орлов Н.Я., Фрейдин AA, Орлов Д.Н., Беннетт Н. (1998) Измерения скорости родопсин-индуцированной диссоциации комплексов трансдуцин-ГДФ в наружных сегментах палочек сетчатки быка. Междунар. конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 21-25 Сентября 1998) стр. 108-110.

Фрейдин А.А., Орлов Д.Н., Орлов Н.Я (1998) Активация сГМФ-специфичной фосфодиэстеразы наружных сегментов палочек сетчатки быка G-белком трансдуцином в присутствии ГТФ и его негидролизуемых аналогов. Междунар. конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 21-25 Сентября 1998) стр. 127-128.

Грищенко В.М., Орлова Т.Г., Фрейдин А.А., Орлов Н.Я. (1998) Са2+-зависимое взаимодействие водорастворимых белковых компонентов препаратов наружных сегментов палочек сетчатки быка с кальмодулин-сефарозой. Междунар. конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 21-25 Сентября 1998) стр. 99-100.

Orlov N.Ya., Orlova T.G., Reshetnyak Ya. К., Burstein E.A, Kimura N. (1999) Comparative study ofrat recombinant nucleoside diphosphate kinase by intrinsic tryptophan fluorescence. J. Biomolecular

Structure and Dynamics 16,955-968.

Ishijima Y., Shimada N., Fukuda M., Miyazaki H., Orlov N. Ya., Orlova T.G., Yamada T. and Kimura N.(1999) Overexpression of Nucleoside Diphosphate Kinases Induces Neurite Outgrowth and Their Substitution to Inactive Forms Leads to Suppression of Nerve Growth Factor- and Dibutyryl Cyclic AMP-induced Effects in PC12D Cells. FEBS Lett. 445,155-159.

Kimura N., Orlov N. Ya. (1999) Possible mechanism of G-protein transducin photo activation in vertebrate retinal rods. Abstracts of II Russian Biophysical Meeting (Moscow, 23-27 August 1999) pp. 102

Orlov N. Ya., Freidin A. A., Orlov D. N., Kimura N. (2001) Interaction between recombinant rat nucleoside diphosphate (NDP) kinase (X- and rhodopsin/G-protein transducin complex in bovine retinal membranes provides a novel possible mechanism of extremely rapid transducin activation in living rods. Abstract of International Symposium "Biological Motility: New Trends in Research" (Pushchino, 20-26 August 2001) pp. 107-108.

Orlov N. Ya., Reshetnyak Ya. K., Orlova T. G., Orlov D. N.. Burstein E. A., Ishijima Y., Kimura N. (2001) Comparative study of recombinant rat nucleoside diphosphate kinase and their tagged,

mutant and chimeras forms by protein fluorescence. Abstract of International Symposium "Biological Motility: New Trends in Research" (Pushchino, 20-26 August 2001) pp. 109-110.

Orlov N. Ya., Freidin A. A., Orlov D. N., Kimura N. (2001) Is nucleoside diphosphate kinase involved in rapid activation of retinal rod G-protein transducin. Abstract of Fourth International Congress of the Genetics, Biochemistry and Physiology ofNDP Kinase/NM23 (Tokyo, Japan, 6-8 November 2001) P.8.

Orlov N. Ya., Reshetnyak Ya. K., Orlova T. G., Orlov D. N., Burstein E. A., Ishijima Y., Kimura N. (2001) Structural and enzyme properties of recombinant rat nucleoside diphosphate kinase a and P and their tagged, mutant and chimeras forms. Protein fluorescence study. Abstract of Fourth International Congress of the Genetics, Biochemistry and Physiology of NDP Kinase/NM23 (Tokyo, Japan, 6-8 November 2001) P.2.

Orlov N. Ya., Reshetnyak Ya. K, Orlova T. G., Orlov D. N., Burstein E. A, Ishijima Y., Kimura N. (2001) Comparative study ofrecombinant rat nucleoside diphosphate kinases (NDPK) ttand |3 and their chimeras by protein fluorescence. Abstracts of 45th Annual Meeting of the American Biophysical Society (Boston, USA, February 21-25,2001), Biophys. J. 82, Abst.584.

Orlov N. Ya., Freidin A. A., Orlov D. N., Kimura N. (2003) Interaction of recombinant rat nucleoside diphosphate (NDP) kinase with rhodopsin/G-protein transducin complex in the bleached bovine retinal rod outer segment membranes. Possible mechanism of extremely rapid transducin activation. Биол. Мембраны 20,45-51.

Orlov N. Ya., Reshetnyak Ya. K., Orlova T. G., Orlov D. N.. Burstein E. A., Ishijima Y., Kimura N. (2003) Protein fluorescence study of chimeras and tagged forms of recombinant rat nucleoside diphosphate kinases ОС and p. Биол. Мембраны 20,52-58.

Орлов Д. Н., Ишиджима Ю., Орлов Н. Я., Кимура Н. (2003) Исследование химерных и tag-форм нуклеозиддифосфаткиназ альфа и бета крысы. Связывание с родопсин-трансдуциновым комплексом и термостабильность. Тезисы Международной Конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 16-18 июня 2003) стр. 106-108.

Orlov D.N., Ishijima Y., Orlov N.Ya., Kimura N. (2003) Thermal stability and binding properties of chimeric and tagged forms of recombinant rat nucleoside diphosphate kinase alpha and beta. Abstracts of Fifth International Congress of the Genetics, Biochemistry and Physiology of NDP Kinase/ NM23/ AWD, (Lexington, KY, U.S.A., October 13-16,2003) P7.

Orlov D.N., Ishijima Y., Orlov N.Ya., Kimura N. (2004) Investigation of chimeric and tagged forms of recombinant rat nucleoside diphosphate kinases a and p. Interaction with rhodopsin-transducin complex, thermal stability of the enzymes and hexamer stability. Abstracts of Internatl. Symposium "Biological Motility" dedicated to the memory of academician G.M. Frank (1904-1976) (Pushchino, May 23 - June 1,2004), pp. 144-145.

Орлов Д.Н., Ишиджима Ю., Орлов Н.Я., Кимура Н. (2004) Исследование химерных и tag-форм нуклеозиддифосфаткиназ " крысы. Связывание с родопсин-трансдуциновым комплексом и

термостабильность. Тезисы III Съезда Биофизиков России (Воронеж, 24-29 июня 2004 г.)

Орлов Н.Я., Фрейдин А.А. (2005) Возможные механизмы активации GTP-связывающих белков. Тезисы Международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 6-9 июня 2005 г.)

Принято к исполнению 27/04/2005 Исполнено 28/04/2005

Заказ № 799 Тираж: 100 экз

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 www.autoreferat га

'"Я 2005

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Орлов, Николай Яковлевич

Введение.

Содержание

Глава. I. Трансдуцин и другие GTP-связывающие белки. Механизмы их активации и регуляции.

1. GTP-связывающий белковый комплекс в НСП сетчатки лягушки.

2. GTP-связывающий белок трансдуцин - компонент молекулярного усилителя НСП сетчатки.

3. Скорость диссоциации комплекса трансдуцин-GDP в присутствии обесцвеченного родопсина в НСП сетчатки лягушки. Начальный этап исследовании.

4. Нуклеозиддифостаткиназная (GDP-киназная) активность препаратов НСП сетчатки лягушки и водорастворимых белков НСП. Светозависимое фосфорилирование GDP в препаратах НСП.

5. NDP киназа в препаратах факторов элонгации Е. coli Tu и Ts

6. Краткое заключение.

Глава II. Возможные механизмы регуляции системы фототраисдукции ионами кальция.

1. Скорость гидролиза GTP в активном центре трансдуцина.

2. Влияют ли ионы кальция на время жизни активного состояния трансдуцина? Экспериментальные результаты и предположения.

3. Водорастворимые Са2+-связывающие белки препаратов НСП сетчатки быка. Белки-мишени комплекса Са2+-кальмодулин.

Глава III. Активация и регуляция cGMP-специфичной фосфодиэстеразы

НСП сетчатки.

1. Активация cGMP-специфичной фосфодиэстеразы в препаратах наружных сегментов палочек сетчатки быка трансдуцином в присутствии GTP и его негидролизуемых аналогов.

2. Популяции cGMP-специфичной фосфодиэстеразы НСП сетчатки быка, отличающиеся сродством к фоторецепторным мембранам.

3. Возможная роль некаталитических cGMP-связывающих центров cGMP-специфичной фосфодиэстеразы НСП сетчатки позвоночных.

Глава IV. сСхМР-спенифичная фосфодиэстераза - ключевой элемент системы фототраисдукции колбочек сетчатки позвоночных. Сходство и различия систем регуляции активиости ФДЭ в палочках и колбочках сетчатки позвоночных.

I .сОМР-специфичная фосфодиэстераза - ключевой элемент системы фототраисдукции колбочек сетчатки позвоночных. Ю

2.0бсуждение результатов. Принципы фототраисдукции колбочек. Сходство и возможные различия механизмов фототраисдукции скотопической и фотопической систем зрения позвоночных

Глава V. Измерение времени диссоциации комплекса трансдуцин-GDP в присутствии обесцвеченного родопсина. Исследования 1992-1993 гг.

1.Введение

2.Материалы и .методы.

3.Результат ы.

4.0бсуждение результатов

5.Краткое заключение

Глава VI. Исследование 1992-1998 гг.: Изоформ-сиецифичное взаимодействие NDP кип азы с G-белком фоторецепторов сетчатки позвоночных трансдуцином.

1. Взаимодействие NDP киназы с мембранами обесцвеченных НСП сетчатки крупного рогатого скота. Эффекты рН, солей и гуаниловых нуклеотидов.

2. Специфичное к изоформам опосредуемое трансдуцином взаимодействие рекомбинантных NDP киназ крысы с мембранами НСП сетчатки быка.

3. Взаимодействие рекомбинантной NDP киназы а крысы с обесцвеченными мембранами НСП сетчатки быка. Возможный механизм влияния рН и солей.

Глава VII. Физико-хнмическне свойства рекомбинантных а и Р изоформ

NDP киназы крысы и их производных.

1. Сравнительное исследование рекомбинантных аир изоформ NDP киназы крысы методом собственной белковой флуоресценции.

2. Сравнительное исследование химерных, мутантных и tag-форм NDP киназы крысы методом собственной белковой флуоресценции.

3. Исследование термостабильности NDP киназ а и р и их производных.

5. Исследование стабильности NDP киназ как гексамеров.

Глава Vin. Заключительное обсуждение.Возможная функциональная роль

NDP киназ в клетках. Трансфосфорилирование связанного GDP.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы работы ключевых элементов систем фототрансдукции палочек и колбочек сетчатки позвоночных"

Актуальность проблемы. Наружный сегмент палочки (НСП) сетчатки позвоночных - специализированный отдел фоторецепторноп клетки, трансформирующий световое возбуждение в электрический сигнал. Он состоит из стопки особых замкнутых мембранных структур -дисков, окруженных плазматической мембраной. Диски содержат первичный и единственный акцептор видимого света в зрительной системе мембранный хромопротеид родопсин (R), а генератором выходного электрического сигнала является плазматическая мембрана. Косвенные, а затем и прямые измерения показали, что активация всего лишь одной молекулы родопсина из 107-109 молекул зрительного пигмента, присутствующих в НСП, ведет к появлению фотоответа, амплитуда которого составляет 3-5% от максимального [Baylor ct al., 1979]. Все это означало, что in vivo система (функционирует как счетчик одиночных фотонов, а внутри НСП локализован молекулярный усилитель, обладающий предельно высокой чувствительностью, огромным коэффициентом усиления, предельно низким уровнем собственных шумов и достаточно высоким быстродействием - длительность ответа на поглощение одиночного фотона лежит в секундном диапазоне времен [Baylor et al., 1979].

Вопрос о том, как построен и функционирует такой усилитель, несомненно, актуален. Он был и продолжает оставаться предметом тысяч исследований последних десятилетий. Столь пристальный интерес к этой проблеме оказался оправданным. Действительно, в результате многолетних усилий стали ясны общие принципы построения системы зрительной транедукции. Более того, стало очевидным, что эти принципы носят универсальный характерна сама фоторецепторная система является одним из наиболее совершенных примеров систем клеточной транедукции, аккумулируя в себе предельные свойства таких систем. Стало также очевидным, что система фототраисдукции палочек и колбочек сетчатки является простой и удобной экспериментальной моделью для изучения общих принципов высококачественной переработки информации в живых системах. Все это определяло и продолжает определять актуальность проблемы. Это показывает, что проблема носит общебиологический характер, а ее: актуальность далеко выходит за рамки актуальности вопросов, непосредственно связанных с пониманием принципов работы сенсорных систем.

Настоящая работа, основы, которой были, реально заложены в результате исследований, выполненных в лаборатории еще в 70-х годах, и которая продолжалась в течение по следующих 20 лет, имеет прямое отношение к поиску и всестороннем)' изучению ключевых элементов системы фототрансдукшш палочек и колбочек сетчатки позвоночных. Она непосредственно связана с исследованием механизмов функционирования этих элементов и принципов работы системы фототраисдукции в целом. Все это подчеркивает как актуальность выбранного направления исследовании, так и актульность и важность конкретных задач, решаемых в ходе нашей работы.

Цели и задачи исследования. 1) Началу современного этапа формирования представлений о механизме работы фоторецептора положила появившаяся в начале 70-х годов так называемая Са'^-медиаторная гипотеза Хэггинса [Hagins,l972; Hagins et al., 1970]. Гипотеза постулировала, что в НСП должен присутствовать медиатор - т.е. вещество или система веществ, передающих информацию через цитоплазму от мембран дисков на плазматическую мембрану диффузионным путем [Baylor, Fuortes, 1970; Hagins, 1972; Cone, 1973]. Основываясь на экспериментальных данных, согласно которым изменение концентрации ионов Са"* в сетчатке позвоночных приводит к изменению амплитуды и длительности" (фотоэлектрического ответа НСП, Хэггинс предположил [Hagins, 1972; Hagins et al., 1970], что роль медиатора в акте фоторецепции играют ионы кальция, а сам родопсин выполняет роль фотоактивирусмого ионного канала. Видимый спет, поглощаемый родопсином, индуцирует выход ионов кальция из внутрнднекового пространства, а изменение их концентрации в цитоплазме, в свою очередь ведет к изменению режима работы проводящих элементов плазматической мембраны НСП. Один из ключевых постулатов гипотезы состоял в том, что активация молекулы родопсина должна приводит к выходу значительного количества ионов Са2+ в цитоплазму НСП. Простота и изящество этой гипотезы привлекла внимание к ней многих исследователей, а се всесторонний анализ был предметом большого количества экспериментальных и теоретических работ в течение ряда лет. Однако несмотря на все усилия подтвердить основной постулат этой гипотезы и зарегистрировать выход значительного количества ионов Са2+ в ответ на активацию одной молекулы родопсина не удалось. Стало достаточно очевидным, .что ионы кальция, хотя и играют определенную роль в функционировании фоторецептора, вряд ли могут претендовать на роль первичного медиатора в акте фоторецепции.

Альтернативная точка зрения па природу медиатора в акте фоторецепции возникла также в начале 70-х годов и была стимулирована открытием сАМР и его роли как медиатора в процессах регуляции активности клеток внеклеточными гормонами. Попытки ряда исследователей [Bitensky et al., 1971; Miller et al., 1972] найти подобную систему в фоторецепторах привели к открытию в НСП cGMP-епецифичной фосфодиэстеразы (PDE), активирующейся при обесцвечивании незначительных количеств родопсина [Parmbacker et al., 1972; Pannbacker, 1974; Bitensky et al., 1972; 1973, 1975; Miki et al., 1975; Pober, Bitensky, 1979; Keirns et al., 1975]. Необычно высокое содержание PDE в НСП и ее огромная каталитическая активность делали ее потенциально способной быстро и значительно изменить концентрацию предполагаемого медиатора, в данном случае cGMP, в цитоплазме в ответ на свет. Несмотря на противоречивость данных о содержании cGMP в фоторецепторах и его концентрационных изменениях в ответ на свет, результаты экспериментов конца 70-х годов по электрофоретической инъекции этого соединения в НСП [Miller, Nicol, 1979, 1981; Miller, 1982] заставляли серьезно относится к cGMP как первичному медиатору в акте фоторецепции. Кроме того, стаю ясно, что длительность ответов паю чек в режиме счетчика одиночных фотонов достаточно велика и потому вполне может быть обеспечена функционированием некой ферментативной системы.

Сильный аргумент в пользу того, что PDE является ключевым ферментом системы фототрансдукци и палочек, был получен в 1978 г в результате исследований Ии и Либмана [Yee, Liebman, 1978]. Было показано, что при низких уровнях облучения активация одной молекулы родопсина в НСП ведет к активации значительного количества (до 500) молекул PDE. Таким; образом, был впервые обнаружен процесс, который потенциально мог бы обеспечить усиление зрительного стимула. Эти результаты делаш принципиально интересным вопрос о том, каким же образом одна молекула родопсина способна активировать значительное количество молекул PDE? Поиску ответа на этот вопрос и посвящена первая часть нашей работы.

Выполненные нами предварительные оценки, основанные на известных данных о диффузионной подвижности родопсина в мембране и концентрации PDE на поверхности диска показывали, что сам родопсин физически не способен взаимодействовать с требуемым количеством молекул PDE в мембране. Выходом из создавшегося положения могло быть предположения о натичие некоторого посредника в процессе активации PDE родопсином. Такой посредник должен удовлетворять ряду условий. Он должен быть диффузионно подвижен, присутствовать на поверхности диска в значительной концентрации и, что принципиально важно, быть способным запоминать кратковременное взаимодействие с обесцвеченным родопсином на время, достаточное для того, чтобы перенести эту информацию на молекулы PDE и держать их в активированном состоянии в течение относительно длительного времени. Иными словами, такой посредник должен обладать неким аналогом памяти. Анализ литературных данных, несмотря на их ограниченность, показывал, что таким посредником мог бы быть GTP-связываюший белок.

Предположение о возможности функционирования таких белков в процессе передачи возбуждения от рецепторов гормонов на каталитическую субъединицу аденилатциклазы, стимулированное открытием необходимости участия GTP в этом процессе [Rodbell et al., 1971], активно рассматривалось исследователями, работающими в этой области [Rodbell, 1980; Cassel, Seiinger, 1977; 1978; 1980; Blume, Foster, 1976]. В 1977 году было также показано, что GTP является необходимым участником процесса фотоактивации PDE и в фоторецепторах [Wheller et al., 1977; Wheller, Bitensky, 1977], a сам процесс утилизации GTP сопровождается медленным гидролизом этого нуклеотида. Совокупность этих данных и предположений и явилось для нас основанием для поиска GTP-связывающего белка в НСП сетчатки позвоночных. Поиск GTP-связывающего белка в НСП сетчатки позвоночных и всестороннее исследование его механизмов активации и регуляции и явилось одной из основных целей настоящей работы.

2) К началу следующего этапа наших исследований было ясно, что ключевой элемент системы фототранедукции палочек cGMP-епецифичная PDE - сложный мультисубъедииичный фермент, относящийся к подсемейству циклонуклеотидзависимых, циклонуклеотид-специфичных фосфодиэстераз, но отличающийся от них огромной каталитической активностью в присутствии GTP-связывающего белка НСП транедуцина и наличием низкомолекулярного белкового ингибитора, очень плотно связанного с каталитической частью и потому обеспечивающего предельно низкую активность огромной популяции молекул PDE в темповых палочках. В связи с этим вопрос о механизме активации PDE транедуцином и ее регуляции имели принципиальный интерес. В настоящей работе решалось ряд вопросов, связанных (1) с механизмом ее активации транедуцином; (2) природе ее связи с фоторецепторной мембраной и (3) регуляции ее базальной активности.

3) Несмотря на данные, свидетельствующие против роли ионов Ca2* как первичного медиатора, было ясно, что эти ионы, тем не менее, играют принципиально важную роль в регуляции параметров электрического ответа НСП на свет и, возможно, функционируют в системах обратной связи, инактивирующих ключевые элементы системы фототранедукции после та активации в ответ на поглощение кванта света, В связи с этим одной из целей настоящей работы являлся поиск Ca2' '-связывающих белков, которые могли бы опосредовать действие ионов Ca2*, а также поиск белков, которые являются мишенями для действия таких Са~+-связывающих белков, в частности, кальмодулина. Мы также пытались решить вопрос о связи между нуклеотидной и кальциевой цепях регуляции в НСП.

4) Несмотря на принципиальные успехи, достигнутые к середине 80-х годов в изучении системы фототранедукции палочек, принципы построения системы фототранедукции колбочек сетчатки позвоночных оставались неясными. Быстродействие колбочек, их низкая светочувствительность, а также ряд других их характеристик не исключали возможности того, что роль первичного медиатора в колбочках играют ионы Ca' . В связи с этим в настоящей работе предпринята попытка выяснить принципы построения системы фототранедукции колбочек, используя в качестве исходного объекта исследования сетчатки суслика, подавляющее количество фоторенепторов которых представлено колбочками. В результате этих исследований нами было показано, что системы фототрансдукции палочек и колбочек принципиально подобны, но отличаются на уровне систем, ииактинируюших ключевые элементы системы фототрансдукции после их активации в ответ на свет.

5) Система фототрансдукции палочек является одним из немногих систем, для которой с достаточно высокой точностью можно определить скорость активиции GTP-связывающего белка (в данном случае, транедуиина) в присутствии эндогенного активатора (в данном случае, обесцвеченного родопсина (R*)). В связи с этим одной из задач работы являлась попытка определить, способен ли постулируемый механизм активации G белков - обмен связанного GDP на свободный GTP (GDP/GTP обмен)-обесиечить требуемую скорость активации транедуцина в НСП. Для этого с помощью различных методов и подходов мы пытались определить скорость диссоциации GDP из активного центра транедуцина в присутствии R*. Одновременно были предприняты

- попытки (а) выяснить возможность активации транедуцина в результате индуцируемого молекулой R* фосфоршшрования связанного GDP до GTP и (б) определить природу компонента, способного осуществить такую реакцию.

6) В ходе наших исследований мы обнаружили, что хорошо известная водорастворимая нуклеозиддифосфаткиназа (NDP киназа) способна взаимодействовать с родопсин-трансдуциновым комплексом в фоторецепторной мембране НСП и высвобождаться из мембран при диссоциации этого комплекса в присутствии GTP. В опытах, выполненных с использованием рекомбинантных NDP кииаз крысы, нам удалось также обнаружить, что в такое взаимодействие вовлечена только одна из двух присутствующих в клетках млекопитающих высокогомолопгчных изоформ NDP кииазы. Полученные к тому времени данные других лабораторий свидетельствовали о том, что NDP киназа мультифункпиональный фермент, играющий принципиально важную роль в многочисленных регуляторных процессах в клетке в норме и патологии (канцерогенез, метастазирование), причем (функциональная роль изоформ различна. В связи с этим одной из задач работы явилось исследование рекомбинантных а и р изоформ NDP кииазы и их генноинженерных производных рядом физико-химических методов (в частности, методом собственной белковой флуоресценции и методом остаточной ферментативной активности) для; того, чтобы определить ключевую физическую основу различий изоформ, определяющих (а) различие их характеристик как белков, и как следствие, (б) различие их функциональных ролей в клетке.

Научная; новизна: В НСП сетчатки лягушки обнаружен водорастворимый гетеротримерный GTP-связывающий белковый комплекс (Gt, транедуцин, к.м.м. субъединиц 39, 36 и =10 KDa), молярная концентрация которого в НСП составляет 5-7% от концентрации родопсина. Центр связывания гуаниловых нуклеотидов (GDP или GTP) принадлежит субъединице с к.м.м 39 KDa. Показано, что обесцвеченный родопсин индуцирует переход комплекса из состояния Gt-GDP в состояние Gt-GTP. При малых уровнях фотолиза молекула R* индуцирует формирование значительного количества молекул Gt-GTP. Такие результаты означают, что транедуцин может обеспечивать первичное; усиление зрительного стимула = в палочках и; быть посредником в процессе передачи информации от молекулы R* на молекулы PDE.

Выполнен экспериментальный; анализ гипотезы, согласно которой активное состояние транедуцина (Gt-GTP) формируется из неактивного состояния (Gt-GDP) в результате индуцируемого R* обмена связанного GDP на свободный GTP (GDP/GTP обмен). Предварительные эксперименты, выполненные на препаратах НСП сетчатки лягушки при соблюдении условий, способствующих максимальной скорости обмена, показали, что скорость GDP/GTP обмена мала. В последующих специальных опытах, выполненных на различных типах препаратов фоторенепторных мембран НСП сетчатки быка с помощью широкого спектра подходов и методов (в частности, при использовании метода быстрой фильтрации и применении радиоактивно меченных GDP и GTP) показано, что время диссоциации комплекса Gt-GDP в присутствии R* в составляет 4-6 с при 20"С. Таким образом, полученные нами результаты делают маловероятным широко распространенное предположение о том, что обмен связанного GDP на свободный GTP может обеспечить требуемую скорость активации транедуцина в палочках в ответ на активацию молекулы родопсина (~103 молекул Gt/c).

Обнаружено, что в препаратах НСП сетчатки лягушки GDP, связанный транедуцином, способен фосфорилироваться до GTP в присутствии обесцвеченного родопсина и АТР. В исследованном интервале времен свободный GDP фосфорилированию - не подвергается. Процесс фосфорилирования протекает с высокой скоростью: в присутствии 50 мкМ АТР и 1% обесцвеченного родопсина весь связанный транедуцином GDP фосфорилируется за время < 3-5 с даже при 0°С. Высказано предположение о том, что фотоиндуцированное фосфорилирование связанного GDP до GTP может лежать в основе быстрой активации транедуцина в фоторецепторах.

Впервые высказано предположение о том, что скорость гидролиза GTP в активном центре транедуцина может определять время жизни его активного состояния и, следовательно, характеристики работы молекулярного усилителя НСП. Разработан так паз. «однооборотнын» метод измерения времени гидролиза GTP в активном центре транедуцина, определяющее время жизни активного состояния этого белка. Выполнены измерения скорости гидролиза GTP в активном центре транедуцина в препаратах НСП лягушки. Показано, что время гидролиза GTP в активном центре транедуцина в препаратах НСП резко уменьшается при понижении концентрации, ионов Са2+ до наномолярного уровня. Таким образом, впервые показана принципиальная возможность регуляции времени жизни активного состояния транедуцина. Последующее использование «однооборотного» метода измерения времени гидролиза GTP в активном центре транедуцина в других лабораториях за последнее десятилетие привели к открытию семейства белков RGS (Regulators of G protein Signalling), способных в комплексе с рядом дополнительных белков< увеличивать скорость гидролиза GTP в активном центре G белков.

Выполнены эксперименты, показавшие что активированная; ФДЭ есть комплекс фермента с транедуцином. Подобная точка зрения подтверждена в ряде последующих работ и стала общепринятой. Показано наличие: популяции PDE, плотно связанной с мембраной, но экстрагирующейся из нее при кратковременной обработке препаратов низкими концентрациями трипсина. Высказано предположение о наличии.в составе PDE липидного якоря, иммобилизующего PDE на мембране. Подобное предположение нашло свое последующее экспериментальное подтверждение в ряде работ других лабораторий. Обнаружено развивающееся; во времени: увеличение активности различных типов препаратов PDE НСП при гидролизе сАМР; Высказано предположение о функциональной роли некаталитических центров связывания cGMP.

Предпринята попытка выяснить природу ключевых компонентов системы зрительной транедукции колбочек. Для этого разработан метод получения препарата НС фоторецепторов сетчатки суслика, основная; часть зрительных клеток которой представлена колбочками. Полученный препарат содержал зрительный пигмент с ожидаемым максимумом спектра поглощения при 520 нм и содержат PDE, близкую PDE наточек по содержанию в фоторецепторной клетке, кинетическим характеристикам, мол. массе, р1, термостабильпости, чувствительности к действию трипсина, наличию в се составе термостабильного белкового ингибитора и способности активироваться в присутствие обесцвеченного зрительного пигмента и вТР. Это дало основание считать, что сОМР-сиецифичная РЭЕ является эндогенным ферментом колбочек, а колбочки, как и палочки, содержат ферментативный каскад усиления, функционирующий с участием сОМР-снецифичной РОВ и ОТР-связывающсго белка. Выполнен анализ, результаты которого позволили сделать вывод о том, что системы фототрансдукции палочек и колбочек подобны и различаются в системах, прекращающих развитие процесса активации после действия света и возвращающих элементы и систему в целом в первоначальное состояние. Именно этим можно объяснить хорошо известные различия палочек и колбочек в кинетике фотоответов и светочувствительности.

Методом аффинной хроматографии на мелиттин-сефарозе обнаружен ряд белков, взаимодействующих с сорбентом Са2*-зависимым образом. Один из белков (к.м.м. 21 кОа) был идентифицирован как кальмодулин. Белки с мол. массой около 26 кОа были позднее идентифицированы в других лабораториях как (1) рековерин, ингибирующнй родопсинкиназу в тсмноадаптированных фоторецепторах и снимающий".ингибирующнй. эффект при понижении ионов кальция в цитоплазме НСП в ответ на свет и (2) как белки ОСАР-1, ОСАР-2, участвующие в процессе активации гуанилатциклазы при свето индуцируемом понижении концентрации ионов Са2+ в фоторецепторах. Совокупность этих данных способствовала формированию современных представлений о роли ионов в формировании первичного ответа фоторецепторов позвоночных.

Показано,что водорастворимая ЫОР киназа в препаратах НСП сетчатки быка способна к равновесному связыванию с обесцвеченными фоторецепторными мембранами. Такое равновесное взаимодействие находится под контролем концентрацииТГ и катионов Ыа+, К+, Са2+ или Мд2*. Обнаружено, что: 1) мембраносвязанная ЫБР киназа-высвобождается в присутствии низких концентраций СЩБ]; 2) ОТР[5]-зависимое взаимодействие ЫБР киназы с обесцвеченными мембранами имеет место лишь в присутствии трансдуцина; 3) мембраны, лишенные 01, характеризуются низким сродством к МБР киназе и взаимодействуют с ферментом ОТР[8]-независимым образом. Предполагается, что ОТР[8]-зависимое взаимодействие КОР киназы с обесцвеченными мембранами НСП опосредуется с помощью 01, а центрами связывания фермента являются комплексы между 01 и И.*. Рассматривается возможность участия КОР киназы в процессе быстрой; фотоактивации 01. В последующих модельных экспериментах исследовалось взаимодействие рекомбинантных а- и Р-изоформ КОР киназы крысы с обесцвеченными мембранами: НСП сетчатки быка. Показано, что изоформа а способна к рН, катион- и ОТР[8]-зависимому взаимодействию с мембранами подобно эндогенной >ГОР киназе НСП сетчатки быка, а трансдуцин является необходимым партнером такого взаимодействия. Обнаружено, ОТР-зависимое взаимодействие является изоформ-специфичным: кажущееся сродство изоформы Р к центрам связывания в фоторецепторных мембранах по крайней мере в 100 слабее, чем сродство КБР киназы а. Представлены косвенные данные, указывающие на то, что различия в сродстве изоформ к; родопсин-трансдуциновому комплексу обусловлены различиями вариабельных участков VI этих гомогексамеров. Показано, что именно КБР киназа является мишенью для действия Н+ и катионов (На*, К*, Са"" или 1 Mgrи опосредует их влияние на взаимодействие: между НБР киназой и родопсин-трансдуциновым комплексом.

Изолированные высокогомологичные рекомбинантные гомогексамеры а и Р НБР киназы крысы (каждый из двух типов субъединиц содержат 3 триптофана (Тф78, 133, и 149) и 4 тирозина (Тут 52, 67, 147, и 151)) были детально исследованы методом собственной белковой флуоресценции в растворе. Обнаружено, что данные белки принципиально различны по своим флуоресцентным свойствам (квантовому выходу, положению максимума спектра флуоресценции и форме спектра) при нейтральных рН н их повелению при рН титровании. Обнаружено, что ЫОР киназа а подвергается структурным изменениям в диапазоне рН 5-8, тогда как ЫОР киназа р стабильна в этом диапазоне условий. Выполнен анализ, указывающий на то, что различия в конформационной лабильности и спсобности изоформ ЫОР киназы к взаимодействию с родопсин-трансдуциновым комплексом могут иметь одну и ту же физическую основу, которая возможно одновременно определяет и известные различия в функциональной роли изоформ ЫОР киназы в клетке. Предполагается, что причиной таких различий, скорее всего, являются различия глобальных электростатических зарядов этих белков, а не какие-либо структурные различия между ними при нейтральных рН. Выполнены расчеты, показывающие возможность того, что Туг52 в а-изоформе ЫОР киназы крысы находится в форме депротонированного тирозината. Существование данной формы Туг52 позволяет объяснить такие необычные флуоресцентные свойства ИОР киназы а как (1) длинноволновое положение максимума спектра флуоресценции (Х™^ = 341 им) при предельно низкой доступности внешним тушителям, и (2) необычно высокий квантовый выход (<7 = 0. 42).

Выполнено сравнительное исследование рекомбинантных КОР киназ а и крысы р и их химерных, мутантных и 1ад-производных методом собственной белковой флуоресценции. Полученные результаты дают основания считать, что уникальные флуоресцентные свойства ЬГОР киназы а и способность к конформационным перестройкам, отличающие ее от изоформы р, определяются свойствами вариабельного участка VI. Возможно, что различия в структуре и свойствах этого участка и определяют функциональные различия изоформ а и Р в клетке. Показано, что участок VI также определяет способность ЫОР киназы а взаимодействовать с О-белками и различия в термостабильности а- и Р-производных фермента. Сделан вывод о том, что дальнейшие исследования по выявлению основ функциональных различий между изоформами ЫОР киназы млекопитающих должны сводиться к изучению точечных мутантных форм КОР киназы по вариабельным аминокислотным остаткам участка VI. Наиболее вероятными заменами, определяющими функциональные различия изоформ аир крысы, являются замены /\rg42Gln. Шз47Ьеи и /\sn69His. В дальнейших исследованиях эти аминокислотные остатки должны быть главной мишенью для направленного мутагенеза.

Анализируется гипотеза, согласно которой функциональный смысл обнаруженного в настоящей работы специфического взаимодействия между КОР киназой и комплексом отражает один из этапов участия этого фермента в процессе активации О белка палочек сетчатки. Рассмотрены преимущества схемы активации транедуцина с участием ЬГОР киназы.

Научно-практическое значение работы. Результаты работы »г высказанные предположения значительно расширяют наши представления как о молекулярных механизмах работы фото рецепторов сетчатки позвоночных, так и об общих принципах работы систем клеточной транедукции. Они также способствуют углублению наших представлений о принципах построения систем, осуществляющих высококачественный информационный процеесинг в клетке.

Сравнительное исследование палочек и колбочек показало принципиальное подобие их систем фототранедукции. Одновременно выявлены ключевые элементы молекулярного усилителя, изменение которых принципиально меняет основные свойства фоторецепторов позвоночных.

Разработанный нами однооборотный метод измерения времени гидролиза ОТР в активном центре СТР-связывающих белков нашел широкое применение во многих лабораториях нашей страны и за рубежом. Данный метод позволил получить результаты, способствующие формированию современных представлений о молекулярных механизмах регуляции времени жизни активного состояния белков этого семейства.

Полученные данные вносят заметный вклад в понимание вопроса о физиологическом смысле присутствия в клетках млекопитающих высококонсервативных изоформ ЫБР киназы с близкими структурными и каталитическими свойствами. Сделаны предположения о физической основе различий между изоформами, которая, по видимому, и определяет все известные различия в функциональной роли изоформ ЫБР киназы в клетке. Такие выводы представляют интерес в связи с многочисленными данными об участии различных изоформ МБР киназы во многочисленных процессах клеточной регуляции (процессы клеточной трансдукции, дифференцировка, регуляция экспрессии генов) в норме и патологии (канцерогенез, метастазирование, апоптоз).

ГЛЛВЛ. I. ТРЛНСДУЦИН И ДРУГИЕ GTP-СВЯЗЫВЛЮЩИЕ БЕЛКИ. МЕХАНИЗМЫ ИХ АКТИВАЦИИ И РЕГУЛЯЦИИ (1980-1985 гг.)

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Орлов, Николай Яковлевич

выводы

1. Обнаружено, что НСП сетчатки лягушки содержат гстсротримерный GTP-связывающий белковый комплекс, концентрация которого составляет 5-7% от концентрации II. По аналогии с подобным белком из НСП сетчатки быка, белковый комплекс назван транедуцином (Gt). Показано, что при малых уровнях фотолиза молекула R* индуцирует образование значительного количества молекул Gt-GppNHp (активатор PDE). Сделан вывод о том, что транедуцин может обеспечить первичное усиление зрительного стимула в палочках сетчатки. Выполнен анализ гипотезы, согласно которой активное состояние трапедуципа (Gt-GTP) формируется из неактивного состояния (Gt-GDP) в результате индуцируемого молекулой II* обмена связанного GDP на свободный GTP. Показано, что даже при соблюдении условий, способствующих максимальной скорости обмена, его скорость мала и не может обеспечить требуемую скорость фотоактивации Gt in vivo. Обнаружено, что в препаратах НСП сетчатки лягушки GDP, связанный транедунином, фосфорилируется с высокой скоростью до GTP в присутствии R* и ЛТР. Предполагается, что фотоиндуцированное фосфорилировапис связанного GDP до GTP может лежать в основе быстрой активации транедуцина в палочке.

2. Предложен «однооборотный» метод измерения скорости гидролиза GTP в активном центре Gt. Применение этого метода позволило показать, что время жизни активного состояния Gt в препаратах НСП в стандартных условиях велико (30-40 с), но резко уменьшается при понижении концентрации Са2+. Таким образом, впервые показана возможность регуляции времени жизни активного состояния транедуцина.

3. Показано, что активированная PDE есть комплекс фермента с активной формой Gt. Обнаружена популяция PDE, плотно связанной с мембранами, но экстрагирующейся при обработке препаратов трипсином. Высказано предположение о наличии в составе PDE липидпого компонента, подтвержденное результатами работ других лабораторий. Обнаружено увеличение базальной активности различных типов препаратов PDE при их длительной инкубации с сАМР. Высказано предположение о функциональной роли некаталитических cGMP-связывающих центров PDE.

4. Методом аффинной хроматографии на мелиттин-сефарозе в НСП сетчатки быка обнаружен ряд белков, взаимодействующих с сорбентом Са21-зависимым образом. Белки с к.м.м. 21 kDa и 10 kDa были идентифицированы как кальмодулип и субъединицы белка S-100. Белки с к.м.м. 26 kDa были позднее идентифицированы другими авторами как (1) ингибитор родопсипкиназы рековерин, и (2) активаторы гуаиилатциклазы GCAP-1 и GCAP-2. Методом аффинной хроматографии на кальмодулин-сефарозе показало Са2 ^зависимое взаимодействие между Gt и кал ьм о дул и ном.

5. Предпринята попытка выяснить природу ключевых компонентов системы зрительной транедукцин колбочек. Для этого разработан метод получения препарата НС колбочек (ИСК) сетчатки суслика. Препарат НС К содержал PDE, подобную PDE НСП сетчатки быка по кинетическим характеристикам, молекулярной массе, значению pi, термостабильности, чувствительности к действию трипсина и содержанию в фоторецепторах. PDE в препаратах НСК активировалась при их облучении видимым светом в присутствии GTP и содержала ингибиторный компонент, функционально подобный ингибиторной у-субъединице PDE НСП. Сделан вывод о том, что НСК, как и НСП, содержат ферментативный каскад усиления, функционирующий с участием GTP-связывающего белка и PDE, подобной PDE НСГ1 по всем исследованным характеристикам. Выполнен анализ, результаты которого позволили сделать вывод о том, что системы фототрансдукции палочек и колбочек подобны и различаются п системах, прекращающих развитие процесса активации после действия света и возвращающих элементы и систему п целом и первоначальное состояние. Именно этим можно объяснить хорошо известные различия палочек и колбочек п кинетике фотоответов и светочувствительности.

6. С помощью широкого спектра подходов и методов (в частности, при использовании метода быстрой фильтрации и применении радиоактивно меченных GDP и GTP) показано, »по время диссоциации комплекса Gt-GDP в присутствии R* в различных типах препаратов НСП сетчатки быка составляет 4-6 с при 20°С. Таким образом, подтверждено высказанное нами рапсе предположение о том, что обмен связанного GDP на свободный GTP не может обеспечить требуемую скорость фотоактивации транедуцнна в фоторсцепторах позвоночных.

7. Обнаружено, что водорастворимая эндогенная NDP кип аза в обесцвеченных препаратах НСП сетчатки быка способна к равновесному связыванию с мембранами. Такое взаимодействие зависит от концентрации Н+, Na+, К+, Ca2*, Mg2* и GTP[S]. Показано, что GTP[S]-3aBiiCHMoe взаимодействие NDP киназы с мембранами имеет место лишь в присутствии Gt, а мембраны, лишенные Gt,. обладают лишь GTPtSJ-незавнснмым и низким сродством к NDP кипазс. Сделай вывод о том, что (1) центрами GTP[S]-завнеимого связывания фермента являются мембранные комплексы между Gt и R*, а (2) их известная диссоциация под действием GTP[S] ведет к высвобождению NDP киназы. Использование в модельных экспериментах по связыванию рскомбинантных а- и ß-изоформ NDP киназы крысы показало, что взаимодействие фермента с мембраной является нзоформ-специфнчным: изоформа а взаимодействует с комплексами R*Gt подобно эндогенной NDP киназс НСП сетчатки быка, тогда как сродство изоформы ß к центрам связывания п по крайней мере в 100 слабее, чем сродство NDP киназы а. Представлены данные, указывающие на то, что различия в сродстве нзоформ к комплексу R*Gt обусловлены различиями вариабельных участков VI этих гомогексамеров, а влияние Н+ и катионов (Na+, К+, Са2\ Mg2*)-на взаимодействие NDP киназы с комплексами R*Gt опосредуется их действием на фермент.

8. Изолированные высокогомологпчные рекомбинантные гомогексамеры а и ß NDP киназы крысы (каждый из двух типов субъединиц содержат 3 триптофана ( Ггр78, 133, и 149) и 4 тирозина (Туг 52, 67, 147, и 151)) исследовали методом собственной белковой флуоресценции в растворе в широком диапазоне условий среды. Обнаружено, что данные белки принципиально различны по своим флуоресцентным свойствам (квантовому выходу, положению максимума спектра флуоресценции и форме спектра) при нейтральных pH и их поведению при pH титровании. NDP киназа а подвергается структурным изменениям в диапазоне pH 5-8, тогда как NDP киназа ß стабильна в этом диапазоне условий. Выполнен анализ, указывающий на то, что различия в конформационной лабильности и способности изоформ NDP киназы к взаимодействию с родопсин-трансдуциновым комплексом;могут иметь одну и ту же физическую основу, которая ■ возможно одно временно определяет и известные различия в функциональной роли изоформ NDP киназы в клетке. Предполагается, что причиной таких различий, скорее всего, являются различия глобальных электростатических зарядов этих белков, а не какие-либо структурные различия между ними при нейтральных pH.

9. Выполнено сравнительное исследование рекомбинантных NDP киназ а и крысы ß и их химерных, мутаптных и tag-производных методом собственной белковой флуоресценции. Полученные результаты дают основания считать, что уникальные флуоресцентные свойства NDP киназы а и способность к конформационным перестройкам, отличающие ее от изоформы р, определяются свойствами N-концевого вариабельного участка VI, тогда как вклад С-концевой вариабельной области V2 и начального участка N-концевой области мал. Принципиальная роль этого участка в свойствах изоформ была также подтверждена результатами экспериментов по связыванию производных фермента крысы с фоторецепторными мембранами и исследованию сравнительной термостабильности а- и Р-изоформ и их производных методом остаточной ферментативной активности. Предполагается, что различия в структуре и свойствах участка VI определяют и функциональные различия изоформ а и Р в клетках млекопитающих.

10. Анализируется гипотеза, согласно которой функциональный смысл показанного в настоящей работе специфического взаимодействия между NDP киназой и R*-Gt комплексом отражает один из,этапов учасг1ад этого фермента-в процессе-активации побелка палочек сетчатки. Рассмотрены преимущества схемы активации трансдуцина с участием NDP киназы.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Орлов, Николай Яковлевич, Пущино

1. Абдулаев Н.Г., Артамонов И.Д. (1984) Биоорганическая химия зрительного процесса. Биол. Мембраны 1 (8), 775-793.

2. Артамонов И.Д., Золотарев A.C., Костина М.Б. и др. (1983) Первичная структура родопсина. Биоорган, химия 9(10), 1301-1316.

3. Бурштейн, Э.А. (1977) Собственная флуоресценция белка. Природа и применение. Итоги науки и техники (серия Биофизика) т.7, ВИНИТИ, М.

4. Бурштейн Э.А., Емельяненко В.И., Веденкина Н.С. (1981) Тез. Докл. IV Всесоюзн. Конф. по спектроскопии биополимеров, Харьков, стр. 25-26.

5. Вепринцев Д.Б. (1977) Термодинамические и структурные аспекты связывания белками ионов металлов. Дисс. канд. биол. наук., Пущино.

6. Волотовский И.Д., Конев C.B. (1986) Структурная динамика фоторецепторного аппарата. "Наука и Техника", Минск.

7. Гаспарян А.Г., Орлов Н.Я., Фесенко Е.Е. (1980) Быстрые фотоиндуцированные изменения светорассеяния препаратов фоторецепторных мембран позвоночных. I. Изучение препаратов наружных сегментов палочек сетчатки. Биофизика 25, 87-92.

8. Дижур Ф.М., Аршавский В.Ю., Каулен А.Д., Филиппов П.П. (1986) О механизме светозависимой активации трансдуцина родопсином. ГДФ/ГТФ-обмен или фосфорилирование связанного с трансдуцином ГДФ. Биол. мембраны 3(7), 691-696.

9. Демченко А.П., Ладохин A.C., Костржевская Е.Г. (1987) Структурно-динамические свойства окружения триптофанового остатка в мелиттине. Молек. Биол. (Москва) 21(3), 633-671.

10. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты, т. 1, Мир., М., стр. 270, 1982.

11. Думлер И. Л. (1974) Фосфодиэстераза наружных сегментов палочек сетчатки глаза: свойства, активирование и ингибирование. Биохимия, 39 (5), 1091-1096.

12. Думлер И. Л., Этингоф Р.Н. (1973) Белковый ингибитор фосфодиэстеразы. Докл. АН СССР 213 (5), 1197-1200.

13. Емельяненко В.И. (1991) Аналитическое представление формы спектров флуоресцентных стандартов. Калибровка флуориметра на спектральную чувствительность. Ж. Прикл. Спектроскопии 55(4), 587-593.

14. Крутецкая З.И., Лебедев O.E. (1992) Структурно-функциональная организация G-белков и связанных с ними рецепторов. Цитология 34, 24-45.

15. Овчинников Ю.Л., Лбдулаев Н.Г., Фейгина М.Ю. и др. (1982) Полная аминокислотная последовательность зрительного родопсина. Биоорган, химия 8(10), 1424-1427.

16. Орлов Д.Н. (2004) Сравнительное исследование химерных, мутантных и tag-форм нуклеозиддифосфаткиназы крысы. Дисс. канд. биол. наук, Пущино.

17. Орлов Н.Я. (1976) Исследование фотохимических и конформационных превращений родопсина. Дисс. канд. физ.-мат. наук, Пущино.

18. Орлов Н.Я., Фесенко Е.Е., Казанцев С.И. (1977) Изоэлектрическая фокусировка родопсина. Молек. Биология 10,1133-1141.

19. Рыбин В.О., Гуреева A.A., Ткачук В.А. (1986) Связана ли фотоиндуцированная активация фосфодиэстеразы сетчатки быка с трансфосфорилированием нуклеотидов. Биол. мембраны. 3 (5), 498-505.

20. Тищенков В.Г., Грумбкова JI.,Орлов Н.Я. (1982) Фосфорилирование связанного l4C.GDP в препаратах наружных сегментов палочек сетчатки лягушки. Докл.АН СССР, 268, 735738.

21. Тищенков В.Г., Орлов Н.Я. (1983) Взаимодействие гуаниловых нуклеотидов с фоторецепторными мембранами наружных сегментов палочек сетчатки лягушки. Биофизика 28, 274-279.

22. Ткачук В.А. (1981) Третий Всесоюзный Симпозиум по циклическим нуклеотидам. Биохимия 4, 761-765.

23. Фесенко Е.Е., Крапивинский Г.Б. (1986) Эффект света, АТР и GTP на связывание cGMP в наружных сегментах палочек сетчатки лягушки. Возможный механизм возбуждения фоторецептора. Докл. АН СССР 287, 1255-1259.

24. Фесенко Е.Е., Орлов Н.Я. (1977) Исследование кинетики перехода прелюмиродопсина в люмиродопсин в зрительном пигменте позвоночных. Молек. Биология 11, 147-157.

25. Филиппов П.П. (1999) Фототрансдукция и кальций. Биол. Мембраны 16 (2), 159-168.

26. Уотсон Дж. (1967) Молекулярная биология гена Мир., Москва

27. Abomev, S.M., Burstein Е.А. (1992) Resolution of tryptophan fluorescence spectra into elementary components. Molecular Biology (Moscow) 26, 1350-1361.

28. Ahnelt P. K. (1985) Characterization of the color related receptor mosaic in the ground squirrel retina. Vision Res. 25,1557-1567.

29. Ames J.B., Dizhoor A.M., Ikura M., Palczevvski K., Stryer L. (1999) Three-dimensional Structure of Guanylyl Cyclase Activating Protein-2, a Calcium-sensitive Modulator of Photoreceptor Guanylyl Cyclases J. Biol. Chem. 274 (27), 19329-19337.

30. Anant J. S., Ong O. C., Xie H., Clarke S., O'Brien P. J., Fung, B. K.-K. (1992) In vivo differential prenylation of retinal cyclic GMP phosphodiesterase catalytic subunits. J. Biol. Chem. 267, 687-690.

31. Anderson D.H., Fisher S.K. (1976) The photoreceptor of Diurnal Squirrels: Outer segment structure, disc shedding, and protein renewal. J. Ultrastructure Res. 55, 119-141.

32. Anderson R.E., Maude M.B., Pu G.A., Hollyfield J.G. (1985) Effect of light on the metabolism of lipids in the rat retina. J Neurochem. 44 (3), 773-778.

33. Angleson J. K., Wensel T. G. (1993) A GTPase-accelerating factor for transducin, distinct from its effector cGMP phosphodiesterase, in rod outer segment membranes. Neuron 11, 939-949.

34. Angleson J.K., Wensel T.G. (1994) Enhancement of rod outer segment GTPase accelerating protein activity by the inhibitory subunit of cGMP phosphodiesterase. J. Biol. Chem. 269, 16290-16296.

35. Arai K.-I., Kawakita M., Kaziro Y. (1974) Stusies on the polypeptide elongation factors from E. coli. J. Biochem. 76, 293-306.

36. Arnaud-Dabernat S., Bourbon P.M., Dierich A., Le Meur M., Daniel J.Y. (2003) Knockout mice as model systems for studying nm23/NDP kinase gene functions. Application to the nm23-Ml gene. J. Bioenerg. Biomembr. 35(1), 19-30.

37. Arshavsky V.Y., Dizhoor A.M., Kaulen A.D., Shestakova I.K., Philipov P.P. (1985) A light-scattering study of the effects of rhodopsin phosphorylation on its interactions with transducin. Biol. Membr., 2, 5-10 (In Russian)

38. Arshavsky V.Yu., Bownds M.D. (1992) Regulation of deactivation of photoreceptor G protein by its target enzyme and cGMP. Nature, 357, 416-417.

39. Arshavsky V.Y., Lamb T.D., Pugh E.N., Jr. (2002) G protein and phototransduction. Annu. Rev. Physiol. 64, 153-157.

40. Arshavsky V.Y., Dumke C.L., Zhu Y., Artemyev N.O., Skiba N.P., et al. (1994) Regulation of transducin GTPase activity in bovine rod outer segments. J. Biol. Chem. 269 19882-19887.

41. Arshavsky V. Y., Pugh E. N., Jr. (1998) Lifetime regulation of G protein-effector complex: emerging importance of RGS proteins. Neuron 20, 11-19.

42. Artemyev N. O., Arshavsky V. Y., Cote R. H. (1998) Photoreceptor phosphodiesterase: interaction of inhibitory gamma subunit and cyclic GMP with specific binding sites on catalytic subunits. Methods 14,93-104.

43. Artemyev N.O., Rarick H.M., Mills J.S., Skiba N.P., Hamm H.E. (1992) Sites of interaction between rod G-protein a-subunit and cGMP-phosphodiesterase y-subunit. Mechanism for the phosphodiesterase activation mechanism. J. Biol. Chem., 267, 25067-25072.

44. Asano T., OgasawaraN., Kitajiama S., Sano M. (1986) Interaction ofGTP-binding proteins with calmodulin. FEBS Lett., 203(2), 135-138.

45. Ashendel C.L. (1985) The phorbol ester receptor: a phospholipid-regulated protein kinase. Biochim. Biophys. Acta 822 (2), 219-242.

46. Babu K.R., Dukkipati A., Birge R.R., Knox B.E. (2001) Regulation of phototransduction in short-wavelength cone visual pigments via the retinylidene Schiff base counterion. Biochemistry 40, 13760-13766.

47. Barkdoll A.E., Pugh E.N., Sitaramayya A. (1988) Kinetics of the hydrolysis of 8-bromo-cyclic GMP by the light-activated phosphodiesterase of toad rods. J. Neurochem. 50, 839-846.

48. Barkdoll A.E., Pugh E.N., Jr., Sitaramayya A. (1989) Calcium dependence of the activation and inactivation kinetics of the light-activated phosphodiesterase of retinal rods. J. Gen. Physiol. 93, 1091-1108.

49. Baehr W., Dewlin M.J., Applebury M.L. (1979) Isolation and characterization of cGMP phosphodiesterase from bovine rod outer segments. J. Biol. Chem. 254, 11669-11677.

50. Baehr W., Morita E.A., Swanson R.J., Applebury M.L. (1982) Characterization of rod outer segment G-protein. J. Biol. Chem. 257, 6452-6460.

51. Baylor D.A., Fuortes M.G.F. (1970) Electrical responses of single cones in the turtle. J. Physiol. 207, 77-92.

52. Baylor D.A., Nunn B.J. (1982) Electrical signaling in vertebrate photoreceptor. Methods Enzymol. 81, 403-423;

53. Baylor D.A., Lamb T.D., Yau K.-W. (1979) Membrane current of single rod outer segments. J. Physiol. 288, 589-611.

54. Baylor D.A., Lamb T.D., Yau K.-W. (1979) Responses of retinal rods to single photons. J. Physiol. 288, 613-634.

55. Baylor D.A., Matthews G., Yau K.-W. (1980) Two components of electrical dark noise in toad retinal rod outer segments. J. Physiol. 309, 591-621.

56. Baylor D.A., Nunn B.J., Schnapf J.L. (1984) The photocurrent, noise and spectral sensitivity of rods of the monkey Macaca fascicularis. J. Physiol. (Lond.) 357, 575-607.

57. Beaven G.H. (1961) Adv. Spectrosc. 2, 330-428.

58. Beavo J.A., Conti M., Heaslip R.J. (1994) Multiple cyclic nucleotide phosphodiesterases. Mol. Pharmacol. 46, 399-405.

59. Beavo J.A., Hardman J.G., Sutherland E.W. (1970) Hydrolysis of cyclic guanosine and adenosine 3',5'-monophosphates by rat and bovine tissues. J. Biol. Chem. 245, 5649-5655.

60. Beavo J.A., Hardman J.G., Sutherland E.W. (1971) Stimulation of adenosine 3',5'-monophosphate hydrolysis by guanosine 3',5'-monophosphate. J. Biol. Chem. 246, 3841—3846.

61. Bennett N., Clerk A. (1989) Activation of cGMP phosphodiesterase in retinal rods: mechanism of interaction with the GTP-binding protein (transducin). Biochem. 28 (18), 7418-7424.

62. Bennett N., Ildefonce M., Crouzy S., Chapron Y., Clerk A. (1989) Direct activation of cGMP-dependent channels of retinal rods by the cGMP phosphodiesterase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(10), 3634-3638.

63. Bennett N., Michel-Villaz M., Kuhn H. (1982) Light-induced interaction between rhodopsin and GTP-binding protein. Metarhodopsin II is the major photoproduct involved. Eur. J. Biochem., 127, 97-103.

64. Bennett N. (1982) Light-induced interaction between rhodopsin and the GTP-binding protein. Relation with phosphodiesterase activation. Eur. J. Biochem., 123, 133-139.

65. Bennett N., Dupont Y. (1985) The G-protein of retinal rod outer segments (transducin): Mechanism of interaction with rhodopsin and nucleotides. J. Biol. Chem., 260, 7,4156-4168.

66. Berberich S.J., Postel E.H. (1995) PuF/NM23-H2/NDPK-B transactivates a human c-myc promoter-CAT gene via a functional nuclease hypersensitive element. Oncogene 10, 2343-2347.

67. Biernbaum M.S., Bownds M.D. (1985) Frog rod outer segments with attached inner segment ellipsoids as an in vivo model for photoreceptors on the retina. J. Gen. Physiol. 85, 83—105.

68. Bigay J, Faurobert E, Franco M, Chabre M. (1994) Roles of lipid modifications of transducin subunits in their GDP-dependent association and membrane binding. Biochemistry. 33, 1408114090.

69. Biggs J., Hersperger E., Steeg P., Liotta L.A., Shearn A. (1990) A gene that is homologous to a mammalian gene associated with tumor metastasis codes for nucleoside diphosphate kinase. Cell 63, 933-940."

70. Biggs J., Tripoulas N., Hersperger E., Dearolf C., Shearn A. (1988) Analysis of the lethal interaction between the prune and Killer of prune mutations of Drosophila. Genes and Dev. 2, 1333-1343.

71. Bignetti E., Sorbi T., Tirindelli R. (1986) Effect of fluoride on the phosphodiesterase of bovine photoreceptors. Vision Res. 26, 383-389.

72. Bilan P.J,. Moyers J.S., Kahn C.R. (1998) The ras-related protein rad associates with the cytoskeleton in a non-1 ipid-dependent manner. Exp. Cell Res. 242(2), 391-400.

73. Biosca J.A., Eisenberg E. (1990) The interaction of AMP-PNP and PPi with actomyosin. J. Biol. Chem., 265, 18, 10221-10225.

74. Bitensky M.W., Gorman R.E., Miller W.H. (1971) Adenyl cyclase as a link between photon capture and changes in membrane permeability of frog photoreceptors. Proc. NatL Acad. Sci. USA 68, 561-562 (317-335).

75. Bitensky M.W., Miller W.H., Gorman R.E., Neufeld A.H., Robinson R. (1972) Advances in Cyclic Nucleotide Res. 1, 317-335.

76. Bitensky MAV., Miki N., Mareus F.R., Keirns J.J. (1973) The role of cyclic nucleotides in visual excitation. Life Sci. 13, 1451-1472.

77. Blume A.J., Foster C.J. (1976) Neuroblastoma adenylate cyclase. Role of 2-chloroadenosine, prostaglandin El and guanine nucleotides in regulation of activity. J. Biol. Chem. 251, 3399 -3404.

78. Bornancin F., Pfister C., Chabre M. (1989) The transitory complex between photoexcited rhodopsin and transducin. Reciprocal interaction between the retinal site in rhodopsin and the nucleotide site in transducin. Eur. J. Biochem., 184, 687-698.

79. Bornancin F., Franco M., Bigay J., Chabre M. (1992) Functional modification of transducin induced by cholera or pertussis-toxin-catalyzed ADP-rybosylation, Eur. J. Biochem. 210, 33-44.

80. Bourne H.R., Stryer L. (1992) The target set the tempo. Nature, 358, 541-542.

81. Bradford M. M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72:248-254.

82. Brandt D. R., Ross E. M. (1986) GTPase activity of the stimulatory GTP-binding regulatory protein of adenylate cyclase, Gs. Accumulation and turnover of enzyme-nucleotide intermediates, J. Biol. Chem. 261, 1656 1664.

83. Brown J.E., Rubin L.J., Ghalayini A.J. Tarver A.P., Irvine R.F., Berridge M.J., Anderson R.E. (1984) myo-Inositol polyphosphate may be a messenger for visual excitation in Limulus photoreceptors. Nature 311 (5982), 160-163.

84. Brown R.L. (1992) Functional regions of the inhibitory subunit of retinal rod cGMP phosphodiesterase identified by site-specific mutagenesis and fluorescence spectroscopy. Biochemistry 31 (25), 5918-5925.

85. Brown R.L., Stryer L. (1989) Expression in bacteria of functional inhibitory subunit of retinal rod cGMP phosphodiesterase. Proc Natl Acad Sci USA. 86(13), 4922-4926.

86. Bruckert F., Catty P., Deterre P., Pfister C. (1994) Activation of phosphodiesterase by transducin in bovine rod outer segments: characteristics of the successive binding of two transducins. Biochemistry 33, 12625-12634.

87. Bracket F., Vuong T.M., Chabre M. (1988) Light and GTP dependence of transducin solubility in retinal rods. Further analysis by near-red light scattering.- Eur. J. Biochem., 16, 207-218.

88. Bukolova-Orlova T.G., Yukelson L.Ya., Burstein E.A. (1974) Fluorescence of neurotoxins from Middle-Asian cobra venom. Biochim. Biophys. Acta 342, 275-280.

89. Burgess W.H., Jemiolo D.K., Kreitsinger R.H. (1980) Interaction of calcium and calmodulin in the presence of sodium dodecyl sulfate. Biochim. Biophys. Acta 623(2), 257-270.

90. Burstein E.A., Vedenkina N.S., Ivkova M.N. (1973) Fluorescence and the location of tryptophan residues in protein molecules. Photochem. Photobiol. 18, p. 263-279.

91. Burstein E.A., Abornev S.M., Reshetnyak YaK. (2001) Decomposition of- tryptophan fluorescence spectra into log-normal components. I. Decomposition algorithms. Biophys. J. 81(3), 1699-1709.

92. Burstein E.A., Emelyanenko V.I. (1996) Log-normal description of fluorescence spectra of organic fluorophores. Photochem. Photobiol. 64(2), 316-320.

93. Busel E.P., Bushueva T.L., Burstein E.A. (1970) Optika i Spektroskopia 29, 501-507 (In Russian).

94. Bushueva T.L., Busel E.P., Bushuev V.N., Burstein E.A. (1974) Studia biophys. 44, 129-140.

95. Bushueva T.L., Busel E.P., Burstein E.A.(1975) Studia biophys. 52, 41-52.

96. Cabrera J. L., de Freitas F., Satpaev D. K., Slepak V. Z. (1998) Identification of the Gbeta5-RGS7 protein complex in the retina. Biochem. Biophys. Res. Commun. 249, 898-902.

97. Calvert P.D., Govardovskii V.I., Krasnoperova N., Anderson R.E., Lem J., Makino C.L. (2001) Membrane protein diffusion sets the speed of rod phototransduction. Nature 411(6833), 90-94.

98. Calvert P.D., Govardovskii V.I., Arshavsky V.Y., Makino C.L. (2002) Two temporal phases of light adaptation in retinal rods. J. Gen. Physiol. 119 (2), 129-145.

99. Cassel D., Selinger Z. (1977) Mechanism of adenylate cyclase activation by cholera toxin: inhibition of GTP hydrolysis at regulatory site. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 3307-3311.

100. Cassel D., Selinger Z. (1978) Mechanism of adenylate cyclase activation through the P-adrenergic receptor: catecholamine-induced displacement of bound GDP by GTP, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75,4155-4159.

101. Cassel D., Selinger Z. (1980) Activation of turkey erythrocite adenylate cyclase and broking of the catecholamine-stimulated GTP-factor in the ADP ribosylation of the GTP-dependent regulatory component. J. Biol. Chem. 255, 1252-1258.

102. Catty P., Deterre P. (1991) Activation and solubilization of the retinal cGMP-specific PDE by limited proteolysis. Role of the C-terminal domeain of the p-subunit. Eur. J. Biochem. 199, 263269.

103. Catty P., Pfister C., Bruckert F., Deterre P. (1992) The cGMP phosphodiesterase-transducin complex of retinal rods. Membrane binding and subunits interaction. J. Biol. Chem. 267 (27), 19489-19493.

104. Chabre M. (1987) The G protein connection: is it in the membrane or the cytoplasm? TIBS, 12, 213-215.

105. Chabre M., Deterre P. (1989) Molecular mechanism of visual transduction. Eur. J. Biochem., 179,255-266.

106. Chen R.F. (1967) Analyt. Letts. 1, 35-42.

107. Chen C.K., Burns M.E., He W., Wensel T.G., Baylor D.A., Simon M.I. (2000) Slowed recovery of rod photoresponse in mice lacking the GTPase accelerating protein RGS9-1. Nature 403, 557560.

108. Chiadmi M.; Morera S., Lascu I., Dumas C., Le Bras G., Veron M., Janin J. (1993) Crystal structure of the Awd nucleotide diphosphate kinase from Drosophila. Structure 1(4), 283-293.

109. Clerc A., Bennett N. (1992) Activated cGMP phosphodiesterase of retinal rods: a complex with transducin alpha subunit. J. Biol. Chem. 267, 6620-6627.

110. Cohen L., Mohr R., Chen Y.Y., Huang M., Kato R., Dorin D., Tamanoi F., Goga A., Afar D., Rosenberg N., Witte O. (1994) Transcriptional activation of a ras-like gene (kir) by oncogenic tyrosine kinases. Proc Natl Acad Sci U S A 91(26), 12448-12452.

111. Cook T.A., Ghomashchi F., Gelb M.H., Florio S.K., Beavo J. A. (2001) The S Subunit of Type 6 Phosphodiesterase Reduces Light-induced cGMP Hydrolysis in Rod Outer Segments. J. Biol. Chem 276 (7), 5248-5255.

112. Coleman D.E., Berghuis A.M., Lee E., Linder M.E., Gilman AG., Sprang S.R. (1994b) Structures of active conformations of Gi alpha 1 and the mechanism of GTP hydrolysis. Science 265, 1405-1412.

113. Coleman D.E., Lee E., Mixon M.B., Linder M.E., Berghuis A.M., Gilman A.G., Sprang S.R. (1994a) Crystallization and preliminary crystallographic studies of Gi alpha 1 and mutants of Gi alpha 1 in the GTP and GDP-bound states. J. MoL Biol. 238, 630-634.

114. Coleman D. E., Sprang S. R. (1998) Crystal structure of the G protein Gi alpha 1 complexed with GDP and Mg a crystallographic titration experiment. Biochemistry 37, 14376-14385.

115. Cone R. A. (1973) The internal transmitter model for visual excitation: some quantitative implication. In: Biochemistry and Physiology of visual pigments (Ed. Langer H.) SpringerVerlag, N-Y, 267-282.

116. Conway B.E., Bockris J.O'M., Ammar I.A. (1951)Trans. Faraday Soc. 47,756-766.

117. Cornog J.L., Jr., Adams W.R. (1963) Biochim. Biophys. Acta 66, 356-365.

118. Cote R.H., Brunnock, M.A. (1993) Intracellular cGMP concentration in rod photoreceptors is regulated by binding to high and moderate affinity cGMP binding sites. J. Biol. Chem. 268, . 17190-17198.

119. Cote R.H., Bownds M.D., Arshavsky V.Y. (1994) cGMP binding sites on photoreceptor phosphodiesterase: role in feedback regulation of visual transductioa Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4845—4849.

120. Cowan C. W., Fariss R. N., Sokal I., Palczewski K., Wensel T. G. (1998) High expression levels in cones of RGS9, the predominant GTPase accelerating protein of rods. Proc. Natl. Acad. Sci. US A 95, 5351-5354.

121. Cowan C.W., He W„ Wensel T.G. (2000) RGS proteins: lessons from the RGS9 subfamily. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 65, 341-359.

122. Cowan C.W., Wensel T.G., Arshavsky V.Y. (2000) Enzymology of GTPase acceleration in phototransduction. Methods Enzymol. 315, 524-538.

123. Dabernat S., Larou M., Masse K., Dobremez E., Landry M., Mathieu C., Daniel J.Y. (1999) Organization and expression of mouse nm23-Ml gene. Comparison with nm23-M2 expression. Gene 236(2), 221-230.

124. Daemen F.J.M. (1973) Vertebrate rod outer segment membranes. Biochim. Biophys Acta 300, 255-288.

125. D'Amours M.R., Cote R.H. (1999) Regulation of photoreceptor phosphodiesterase catalysis by its non-catalytic cGMP-binding sites. Biochem. J. 340, 863-869.

126. Dearolf C.R., Hersperger E., Shearn A. (1988) Developmental consequences of awdb3, a cell-autonomous lethal mutation of Drosophila induced by hybrid dysgenesis. Dev. Biol. 129(1), 159-168.

127. Dearolf CR, Tripoulas N, Biggs J, Shearn A. (1988) Molecular consequences of awdb3, a cell-autonomous lethal mutation of Drosophila induced by hybrid dysgenesis. Dev. Biol. 129(1): 169178.

128. De la Rosa A., Williams R.L., Steeg P.S. (1995) Nm23/nucleoside diphosphate kinase: toward a structural and biochemical understanding of its biological functions. Bioessays 17(1), 53-62.

129. Del Priore L.V., Lewis A. (1983) Calcium-dependent activation and deactivation of rod outer segment phosphodiesterase is calmodulin-independent. Biochem.Biophys. Res. Commun. 113, 317-324.

130. Demchenko A.P. (1986) UV Spectroscopy of Proteins. Springer-Verlag, Berlin e. a.

131. Deterre P., Bigay J., Forquet, F, Robert M., Chabre M. (1988) cGMP phosphodiesterase of retinal rods is regulated by two inhibitory subunits. Proc. Natl. Acad.Sci. 85, 2424-2429.

132. Detwiler P.B., Ramanathan S., Sengupta A., Shraiman B.I. (2000) Engineering Aspects of Enzymatic Signal Transduction: Photoreceptors in the Retina. Biophys. J. 79,2801-2817.

133. Deville-Bonne D., Sellam O., Merola F., Lascu I., Desmadril M., Veron M. (1996) Phosphorylation of nucleoside diphosphate kinase at the active site studied by steady-state and time-resolved fluorescence. Biochemistry 35(46), 14643-14650.

134. Dizhoor A. (2000) Regulation of cGMP synthesis in photoreceptors: role in signal transduction and congenital diseases of the retina. Cellular Signalling 12, 711-719.

135. Dizhoor A. M., Lowe D. G., Olshevskaya E. V., Laura R. P., Hurley J. B. (1994) The human photoreceptor membrane guanylyl cyclase, RetGC, is present in outer segments and is regulated by calcium and a soluble activator. Neuron 12,1345-1352.

136. Dizhoor A. M., Ray S., Kumar S., Niemi G., Spencer M., Brolley D., Walsh K.A., Philipov P.P. Hurley J. B., Stryer L. (1991) Recoverin: calcium sensitive activator of retinal rod guanvlate cyclase. Science 251, 915-918.

137. Dratz E.A., Lewis J.W., Schaechter L.E., Kliger O.S. (1987) Retinal rod GTPase turnover rate increases with concentration: a key in control of visual excitation? Biochem. Biophys. Res. Com., 146, 379-386.

138. Dufourcq J., Faucon J.F. (1977) Intrinsic fluorescence study of lipid-protein interaction in membrane models. Binding of melittin, an amphipathic peptide, to phospholipids vesicles. Biochim. Biophys. Acta 467, 1-11.

139. Dumas C., I. Lascu, S. Morera, F. Glaser, R. Fourme, V. Wallet, M.-L.Lacombe, M. Veron, J. Janin (1992) X-rays structure of nucleoside diphosphate kinase. EMBO J. II, 3203-3208.

140. Dumke C.L., Arshavsky V.Y., Calvert P.D., Bownds M.D., Pugh E.N., Jr. (1994) Rod outer segment structure influences the apparent kinetic parameters of cyclic GMP phosphodiesterase. J. Gen. Physiol. 103, 1071-1098.

141. Dumler I.L., Etingof R.N. (1976) Protein inhibitor of cyclic adenosine 3',5'-monophosphate phosphodiesterase in retina. Biochim. Biophys. Acta 429, 474-484.

142. DuPont Y. (1984) A rapid-filtration technique for membrane fragments or immobilized enzymes: measurements of substrate binding or ion fluxes with a few-millisecond time resolution. Analytical Biochem., 142, 504-510.

143. Ebrey T., Koutalos Y. (2001) Vertebrate Photoreceptors. Progress in Retinal and Eye Research 20(1), 49-94.

144. Eckstein F., Cassel D., Lefkovitz H., Lowe M., Selinger Z. (1979) Guanosine 5-0-(2-thiodiphosphate). An inhibitor of adenylate cyclase stimulation by guanine nucleotides and fluoride ions. J. BioLChem., 254, 19, 9829-9834.

145. Edidin, M. (1987) Rotational and lateral diffusion of membrane proteins and lipids: phenomena and function. Curr. Top. Membr. Transp. 29, 91-127.

146. EftinkM.R., Ghiron C.A. (1981) Anal. Biochem. 114, 199-227.

147. Emeis D., Hofmann K.P. (1981) Shift in the relation between flash-induced metarhodopsin I and metarhodopsin II within the first 10% rhodopsin bleaching in bovine disc membranes. FEBS Lett., 136(2), 201-207.

148. Emeis D., Kuhn H., Reichert J., Hofmann P. (1982) Complex formation between metarhodopsin II and GTP-binding protein in bovine photoreceptor membranes leads to shift of the photoproduct equilibrium. FEBS Lett. 136, 201-207.

149. Erickson M.A., Lagnado L., Zozulya S., Neubert T.A., Stryer L., Baylor D.A. (1998) The effect of recombinant recoverin on the photoresponse of truncated rod photoreceptors. Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A. 95, 6474-6479.

150. Ermilov A. N., Olshevskava E.V., Dizhoor A.M. (2001) Instead of Binding Calcium. One of the EF-hand Structures in Guanylyl Cyclase Activating Protein-2 Is Required for Targeting Photoreceptor Guanylyl Cyclase. J. Biol. Chem. 276 (51), 48143-48148.

151. Ernst O.P., Bieri C., Vogel HM Hofmann K.P. (2000) Intrinsic biophysical monitors oftransducin activation: fluorescence, UV-visible spectroscopy, light scattering, and evanescent field techniques. Methods Enzymol., 315,471-489.

152. Faucon J.F., Dufourcq J., Lussan C. (1979) The self-association of melittin and its binding to lipids: an intrinsic fluorescence polarization study. FEBS Lett. 102,187-190.

153. Faurobert E., Hurley J. B. (1997) The core domain of a new retina specific RGS protein stimulates the GTPase activity of transducin in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94,2945- 2949.

154. Fasano O., Crechet J.-B., Parmeggiani A. (1982) Preparation of nucleotide free elongation factor Tu and its stabilization by the antibiotic kirromycin. Analyt. Biochem., 124, 53-58 (and other articles).

155. Faurobert E., Otto-Bruc A., Chardin P., Chabre, M. (1993) EMBO J., 12, 4191-4198.

156. Fawzi A.B.,.Northup J.K. (1990) Guanine nucleotide binding characteristics of transducin: essential role of rhodopsin for rapid exchange of guanine nucleotides.- Biochem., 29, 3804 -3812.

157. Felber S., Breuer H.P., Petruccione F., Honerkamp J., Hofmann K.P. (1996) Stochastic simulation of the transducin GTPase cycle. Biophys J., 71(6), 3051-3063:

158. Fcsenko E.E., Kolesnikov S.S., Lyubarsky A.L. (1985) Induction by cyclic GMP of catiomc conductance in plasma membrane of retinal rod outer segment. Nature 313,310-313.

159. Fersht, A. (1977) Enzyme Structure and Mechanism (San Francisco, CA, W.H. Freeman).

160. Ferguson K.M., Higashijima T., Smigel M.D., Gilman A.G. (1986) The influence of bound GDP on the kinetics of guanine nucleotide binding to G proteins. J. Biol. Chem., 261, 16, 73937399.

161. Fesenko E.E., Krapivinsky G.B. (1986) Cyclic GMP-binding sites and light control of free cGMP concentration in vertebrate rod photoreceptors.- Photochem. Photobiophys., 13, 345-358.

162. Finlin B.S., Andres D.A. (1997) Rem is a new member of the Rad- and Gem/Kir Ras-related GTP-binding protein family repressed by lipopolysaccharide stimulation. J. Biol. Chem. 272(35), 21982-21988.

163. Fleishman D.,Denisevich M. (1979) Cuanylate cyclase of isolated bovine rod axonemes. Biochem., 18, 5060-5066.

164. Florio S.K., Prusti R.K., Beavo J. A. (1996) Solubilization of membrane-bound phosphodiesterase by the rod phosphodiesterase recombinant 5-subunit. JBC 271, 24036-24047.

165. Frings S., Seifert R., Godde M., Kaupp U. B. (1995) Profoundly different calcium permeation and blockage determine the specific function of distinct cyclic nucleotide-gated channels. Neuron 15,169-179.

166. Fukada Y., Yoshizawa T., Saito T., Ohguro H., Akino T. (1990) Binding of GTP to transducin is not inhibited by arrestin and phosphorylated rhodopsin. FEBS Lett. 261,2,419-422.

167. Fung B.K.-K. (1983) Characterization of transducin from bovine retinal outer segments. 1. Separation and reconstitution of the subunits. J. Biol. Chem., 258, 17, 10495-10502.

168. Fung B.K.-K., Stryer L. (1980) Photolyzed rhodopsin catalyzes the exchange of GTP for bound GDP in retinal rod outer segments. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 77, 5, 2500-2504.

169. Fung B.K.-K., Hurley J.B., Stryer L. (1981) Flow of information in the light-triggered cyclic nucleotide cascade of vision. Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 78, 1, 152-156.

170. Fung B.K., Lieberman B.S., Lee R.H. (1992) A third form of the G protein beta subunit. 2. Purification and biochemical properties. J. Biol. Chem. 267(34), 24782-24788.

171. Futerman A.H., Raviv D., Michaelson D.M., Silman I. (1987) Differential susceptibility to phosphatidylinositol-specific phospholipase C of acetylcholinesterase in excitable tissues of embryonic and adult Torpedo ocellata. Brain Res. 388 (2), 105-112.

172. Ghalayini A.L., Anderson R.E. (1984) Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate: light-mediated breakdown in the vertebrate retina. Biochem. Biophys. Res. Commun. 124 (2), 503-506.

173. Chiadmi M., Morera S., Lascu I., Dumas C., Le Bras G., Veron M., Janin J. (1993) Crystal structure of the Awd nucleotide diphosphate kinase from Drosophila. Structure 1(4), 283-293.

174. Giartosio A., Erent M., Cervoni L., Morera S., Janin J., Konrad M., Lascu I. (1996) Thermal stability of hexameric and tetrameric nucleoside diphosphate kinases. Effect of subunit interaction. J. Biol. Chem. 271(30), 17845-17851

175. Gillespie P.G., Beavo J.A. (1988) Characterization of a bovine cone photoreceptor phosphodiesterase purified by cyclic GMP-sepharose chromatography. J. Biol. Chem. 263, 8133-8141.

176. Gillespie P. G., Prusti R. K., Apel E. D., Beavo J. A. (1989) A soluble form of bovine rod photoreceptor PDE has a novel 15-kDa subunit. J. Biol. Chem 264, 12187-12193.

177. Gilman A.G. (1987) G-proteins: transducers of receptor-generated signals. Ann. Rev. Biochem. 56,615-649.

178. Gilman A.G. (1995) Nobel Lecture. G proteins and regulation of adenylyl cyclase. Biosci Rep. 15, 65-97.

179. Godchaux W., Ill, Zimmerman W.F. (1979) Membrane-dependent guanine nucleotide binding and GTPase activities of soluble protein from bovine rod cell outer segments. J. Biol. Chem., 254, 7874-7884.

180. Gorodovikova E. N., Gimelbrant A. A., Senin I. I., Philippov P. P. (1994) Recoverin mediates the calcium effect upon rhodopsin phosphorylation and cGMP hydrolysis in bovine retina rod cells. FEBS Lett. 349,187-190.

181. Gray-Keller M.P., Biernbaum M.S., Bownds M.D. (1990) Transducin activation in electropermeabilized frog rod outer segments is highly amplified, and a portion equivalent to phosphodiesterase remains membrane-bound. J. Biol. Chem. 265, 15323-15332.

182. Gray-Keller M.P., Detwiler P.B. (1994) Regulation of the cAMP synthesis by calcium in rods. Neuron 13, 846-861.

183. Guy P.M., Koland J.G., Cerione R.A. (1990) Rhodopsin-stimulated activation-deactivation cycle of transducin: Kinetics of the intrinsic fluorescence response of the alpha-subunit.- Biochem., 29, 30, 6954-6964.

184. Hagins W.A. (1972) The visual process: excitatory mechanisms in the primary receptor cells. Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 1, 131-158.

185. Hagins W.A., Yoshikami S. (1974) A role for Ca2v in excitation of retinal rods and cones. Exp. Eye Res. 18, 299-305.

186. Hagins W.A., Penn R.D., Yoshikami S. (1970) Dark current and photocurrent in retinal rods. Biophys. J. 10, 380-412.

187. Hall S.W., KuhnH. (1986) Eur. J. Biochem.,161, 551-556.

188. Hamilton S. E., Hurley J. B. (1990) A phosphodiesterase inhibitor specific to a subset of bovine retinal cones. J. BioL Chem. 265, 11259-11264.

189. Hamilton S. E., Prusti R. K., Bentley J. K., Beavo J. A., Hurley, J. B. (1993) Affinities of bovine photoreceptor cGMP phosphodiesterases for rod and cone inhibitory subunits. FEBS Lett. 318, 157-161.

190. Hargrave P.A., McDowell J.H., Curtis D.R., Wang J.K., Jusczak E., Fong L.-L., Rao J.K.M., Argos P. (1983) The structure of bovine rhodopsin. Biophys. Struct. Mech. 9,235-244.

191. Haynes L. W. (1992) Block of the cyclic GMP-gated channel of vertebrate rod and cone photoreceptors by l-cis-diltiazem. J. Gen. Physiol. 100, 783-801.

192. Haynes L. W. (1995) Permeation of internal and external monovalent cations through the catfish cone photoreceptor cGMP-gated channel. J. Gen. Physiol. 106, 485-505.

193. Haynes L. W., Stotz S. C. (1997) Modulation of rod, but not cone, cGMP-gated photoreceptor channels by calcium-calmodulin. Vis. Neurosci. 14,233-239.

194. Haynes, L., Yau, K.-W. (1985) Cyclic GMP-sensitive conductance in outer segment membrane of catfish cones. Nature 317,61-64.

195. Haynes, L. W., Yau, K.-W. (1990) Single-channel measurement from the cyclic GMP-activated conductance of catfish retinal cones. J. Physiol. 429,451-481.

196. Haynes L.W., Kay A.R., Yau, K.W. (1986) Single cyclic GMP-activated channel activity in excised patches of rod outer segment membrane. Nature 321, 66-70.

197. He W., Cowan C.W., Wensel T.G. (1998) RGS9, a GTPase accelerator for phototransduction. Neuron 20, 95-102.

198. Heck M., Hofinann K.P. (1993) G protein effector coupling: a real-time light-scattering assay for transducin-phosphodiesterase interaction. Biochemistry 32, 8220-8227.

199. Heck M., Hofinann K.P. (2001) Maximal rate and nucleotide dependence of rhodopsin-catalyzed transducin activation —initial rate analysis based on a double displacement mechanism. J. Biol. Chem., 276, 10000-10009.

200. Heck M, Pulvermuller A, Hofinann KP.(2000) Light scattering methods to monitor interactions between rhodopsin-containing membranes and soluble proteins. Methods Enzymol., 315, 329347.

201. Helmreich E.J., Hofinann K.P. (1996) Structure and function of proteins in G-protein-coupled signal transfer. Biochim.Biophys.Acta, 1286(3), 285-322.

202. Heizmann C.W., Berchtold M.W. (1987) Cell Calcium 8(1), 1-41.

203. Henderson S.R., Reuss H., Hardie R.C. (2000). Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca2+. J. Physiol. 524, 179-194.

204. Heo Y. J., Kim S. Y., Kim E., Lee K.-J. (1997) Quanternary structural analysis of nucleoside diphosphate kinases using capillary electrophoresis. J. Chromatography 781, 251-261

205. Hepler J. R., Kozasa T., Smrcka A. V., Simon M. I., Rhee S. G., Sternweis P. C., Gilman, A. G. (1993) J. Biol. Chem., 268, 14367-14375.

206. Higashijima T., Ferguson K.M., Sternweis P.C., Ross E.M., Smigel M.D., Gilman A.G. (1987a) The effect of activating ligands on the intrinsic fluorescence of guanine nucleotide-binding regulatory proteins. J.Biol.Chem., 262, 2, 752-756.

207. Higashijima T., Ferguson K.M., Smigel M.D., Gilman A.G. (1987b) The effect of GTP and Mg"+onthe GTPase activity and the fluorescent properties of Go. J. Biol. Chem., 262, 2, 757761.

208. Higashijima T., Ferguson KM., Sternvvcis P.C., Smigel M.D., Gilman A.G. (1987c) Effect of Mg++ anil beta/gamma-subunit complex on the interaction of guanine nucleotides with G proteins. J. Biol. Chem., 262,2, 762-766.

209. Hingorani V.N., Ho Chang L.-F., Ho Y.-K. (1989) Chemical modification of bovine transducin: probing the GTP-binding site with affinity analogous. Biochem., 28, 18, 7423-7432.

210. Hisatomi O., Imanishi Y., Satoh T., Tokunaga, F. (1997) Arrestins expressed in killifish photoreceptor cells. FEBS Lett. 411, 12-18.

211. Hisatomi O., Matsuda S., Satoh T., Kotaka S., Imanishi Y., Tokunaga F. (1998) A novel subtype of G-protein-coupled receptor kinase, GRK7, in teleost cone photoreceptors. FEBS Lett. 424, 159-164.

212. Hu G., Jang G.-F., Cowan C.W., Wensel T.G., Palczewski K. (2001) Phosphorylation of RGS9-1 by an Endogenous Protein Kinase in Rod Outer Segments. J. Biol. Chem. 276(25), 22287-22295

213. Huintorel P., Simon C., Pantaloni D. (1984) NDPK from brain. Purification and effect on microtubule assembly in vitro. Eur. J. Biochem., 144 , 233-241.

214. Hofmann KP. (1985) Effect of GTP on the rhodopsin-G-protein complex by transient formation of extra metarhodopsin II. Biochim. Biophys. Acta., 810 (2), 278-281.

215. Hurley J.B; (1987) Molecular properties of the cGMP cascade of vertebrate photoreceptors. Ann. Rev. Physiol. 49, 793-812.

216. Hurley J.B., Stryer L. (1982) Purification and characterization of the gamma regulatory subunit of the cGMP phosphodiesterase from retinal rod outer segments. J. Biol. Chem. 257, 11094— 11099.

217. Hurwitz R.L., Bunt-Milam A.H., Beavo J.A. (1984) Immunologic characterization of the photoreceptor outer segment cyclic GMP phosphodiesterase. J. Biol. Chem. 259, 8612-8618.

218. Jakobs G.H., Neitz J., Croguale M. (1985) J. Comp. Neurol. 156A, 503-509

219. Jakobs M., Smith H., Taylor E.W. (1974) Tubulin: nucleotide binding and enzyme activity. J. Mol. Biol. 89,455-468.

220. Janin J., Dumas C., Morera S., Xu Y., Meyer P., Chiadmi M., Chefils J. (2000) Three-Dimentional Structure of Nucleoside Diphospate Kinase. J. Bioenerg. Biomembranes 32(3), 215225.

221. John J., Sohmen R., Feuerstein J., Linke R., Wittinghofer A., Goody R.S. (1990) Kinetics of interaction of nucleotides with nucleotide-free H-ras p21. Biochemistry 29(25), 6058-6065.

222. Kahlert M:, Hofinann K.P. (1991) Reaction rate and collisional efficiency of the rhodopsin-transducin system in intact retinal rods. Biophys J., 59(2), 375-386.

223. Kahlert M., Konig B., Hofinann K.P. (1990) Displacement of rhodopsin by GDP from three-loop interaction with transducin depends critically on the diphosphate beta-position. J. Biol. Chem., 265,31, 18928-18932.

224. Kameni Tcheudji J.F., Lebeau L., Virmaux N., Maftei C.G., Cote R.H., Lugnier C., Schultz P. (2001) Molecular organization of bovine rod cGMP-phosphodiesterase 6. J. MoL Biol. 310 (4), 781-791.

225. Kamps K.M., Hofmann K.P. (1986) ATP can promote activation and deactivation of the rod cGMP-phosphodiesterase. Kinetic light scattering on intact rod outer segments. FEBS Lett., 24, 208(2), 241-247.

226. Kamps K.M., Reichert J., Hofinann K.P. (1985) .Light-induced activation of the rod phosphodiesterase leads to a rapid transient increase of near-infrared light scattering. FEBS Lett., 188(1), 15-20.

227. Karlsson A., Mesnildrey S., Xu Y., Morera S., Janin J., Veron M. (1996) Nucleoside diphosphate kinase. Investigation of the intersubunit contacts by site-directed mutagenesis and crystallography. J. Biol. Chem. 271(33), 19928-19934

228. Kaupp U.B. (1995) Family of cyclic nucleotide gated ion channels. Curr. Opin. Neurobiol.5, 434-442.

229. Kawamura S., Bownds M.D. (1981) Light adaptation of the cyclic GMP phosphodiesterase of frog photoreceptor membranes mediated by ATP and calcium ions. J. Gen. Physiol. 77(5), 571591.

230. Kawamura S. (1993) Rhodopsin phosphorylation as a mechanism of cyclic GMP phosphodiesterase regulation by S-modulin. Nature 362, 855-857.

231. Kawamura S., Kuvvata O., Yamada M., Matsuda S., Hisatomi O., Tokunaga F. (1996) Photoreceptor protein s26, a cone homologue of S-modulin in frog retina. J. Biol. Chem. 271, 21359-21364.

232. Kawamura S., Murakami M. (1991) Calcium-dependent regulation of cyclic GMP phosphodiesterase by a protein from frog retinal rods. Nature 349, 420-423.

233. Kaziro Y. (1978) Role of GTP in polypeptide chain elongation. Biochim. Biophys. Acta, 505, 95-127.

234. Kelleher D.J., Dudycz L.W., Wright G.E., Johnson G.L. (1986) Mol. Pharmacol., 30, 603-608.

235. Keirns J.J., Miki N., Bitensky M.W., Keirns M. (1975) A link between rhodopsin and disk membrane cyclic nucleotide phosphodiesterase. Action spectrum and sensitivity to illumination. Biochem. 14, 2760-2766.

236. Kennedy M.J., Sowa M.E., Wensel T.G., Hurley J.B. (2003) Acceleration of key reactions as a strategy to elucidate the rate-limiting chemistry underlying phototransduction inactivation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44 (3), 1016-1022.

237. Klenchin V.A., Calvert P.D., Bownds M.D. (1995) Rhodopsin kinase inhibition by recoverin. JBC270, 16147-16152.

238. Kleuss C., Scherubl H., Hescheler J., Schultz G., Wittig B. (1992) Different beta-subunits determine G protein interaction with transmembrane receptors. Nature, 358,424-427.

239. Kim S.Y., Chang K.H., Doh H.J., Jung J.A., Kim E., Sim C.J., Lee K.J. (1997) Rapid purification and characterization of nucleoside diphosphate kinase isoforms using ATP-sepharose affinity column chromatography. Mol Cells. 7(5), 630-634.

240. Kimura N., Nagata N. (1979) Mechanism of stimulation adenylate cyclase by GDP and glucagons in the rat plasma membranes. J. Biol. Chem. 254(9), 3451-3457.

241. Kimura N. (1993) Role of nucleoside diphosphate kinase in G-protein action, in: GTPases in Biology, Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 108/11 (Dickey, B.F., and Birnbaumer, L., eds ) Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg, pp. 485-498.

242. Kimura N., Shimada N. (1983) GDP does not mediate but rather inhibits hormonal signal to adenylate cyclase. J. BioL Chem. 258,2278-2283.

243. Kimura N., Shimada N. (1986) GTP-activated GTP binding protein(Gs) in membranes achieved by hormone plus GDP does not serve as a substrate for ADP-ribosylation by cholera toxin. Biochem. Biophys. Res. Commua 134, 928-936.

244. Kimura N., Shimada N. (1988a) Membrane-associated nucleoside diphosphate kinase from rat liver. Purification, characterization, and comparison with cytosolic enzyme. J. Biol. Chem. 263, 4647-4653.

245. Kimura N., Shimada, N. (1988b) Direct interaction between membrane-associated nucleoside diphosphate kinase and GTP-binding protein(Gs), and its regulation by hormones and guanine nucleotides. Biochem. Biophys. Res. Commun. 151, 248-256.

246. Kimura N., Shimada N. (1990) Evidence for complex formation between GTP binding protein(Gs) and membrane-associated nucleoside diphosphate kinase. Biochem Biophys. Res. Commun. 168, 99-106.

247. Kimura N., Shimada N., Nomura KL, Watanabe K. (1990). Isolation and characterization of a cDNA clone encoding rat nucleoside diphosphate kinase. J. Biol. Chem. 265, 15744-15749.

248. Kimura N., Shimada N., Fukuda M., Ishijima Y., Miyazaki H., Ishii A., Takagi Y., Ishikawa N. (2000) Regulation of cellular functions by nucleoside diphosphate kinases in mammals. J. Bioenerg. Biomembr. 32(3), 309-315.

249. Kimura T., Ting J. (1971) Biochem. Biophys. Res. Communs. 45, 1227-1231.

250. King T.P., Sobotka A.K., Kochoumain L., Lichtenstein L.M. (1976) Allergens of honey bee venom. Arch. Biochem Biophys. 172, 661- 671.

251. Kincaid R.L., Coulson C.C. (1985) Rapid purification of calmodulin and S-100 protein by affinity chromatography with melittin immobilized to sepharose. Biochem. Biophys. Res. Commun. 133(1), 256-264.

252. Kincaid R.L., Vaughan M. (1979) Sequential absorption-electrophoresis combined procedure for purification of calcium-dependent cyclic nucleotide phosphodiesterase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76(10), 4903-4907.

253. Kobilka B.K., Matsui H., Kobilka T.S., Yang-Feng T.L., Francke U., Caron M.G., Lelkowitz R.J., Regan J.W. (1987) Cloning, sequencing, and expression of the gene coding for the human platelet alpha 2-adrenergic receptor. Science 238, 650-656.

254. Koch, K. -W. (1991) Purification and identification of photoreceptor guanylate cyclase. J. Biol. Chem. 266, 8634-8637.

255. Koch K.-W., Stryer L. (1988) Highly cooperative feedback control of retinal rod guanylate cyclase by calcium ions. Nature 334 (6177), 64-66.

256. Koch K-W., Eckstein F., Stryer L. (1990) Stereochemical course of the reaction catalyzed by guanylate cyclase from bovine retinal rod outer segments. J. Biol. Chem. 265(17), 9559-9663.

257. Kokame K., Fukada Y., Yoshizawa T., Takao T., Shimonishi Y. (1992) Lipid modification at the N terminus of photoreceptor G protein alpha-subunit. Nature, 359, 749-752.

258. Krapivinsky G.B., Tishchenkov V.G., Fesenko E.E. (1980) Molecular mechanisms of photoreception. IV. Ca2+-inhibited GTPase of rod outer segments of the frog retina. Bochim. Biophys. Acta, 614(2), 435-445.

259. Kreimer D.I., Fedoseev V.Y., Grishchenko V.M., Orlova T.G., Freidin A.A., Orlov N.Ya. (1992) Water-soluble Ca:<~-calmodulin-binding proteins in embryo of the sea urchin Strongylocentrotus intermedins. Comp. Biochem. Physiol. 103B(4), 951-954.

260. Kroll S., Phillips W.J., Cerione R.A. (1989) The regulation of the cGMP-PDE by GDP-bound form of the alpha subunit of transduein. J. Biol. Chem., 264, 8, 4490-4497.

261. Kubo T., Fukuda K., Mikami A., Maeda A., Takahashi H., Mishina M., Haga T., Haga K., Iehiyama A., Kanagawa K.( 1986a) Cloning, sequencing and expression of complementary DNA encoding the muscarinic acetylcholine receptor. Nature 323,411-416.

262. Kuhn H. (1980) Light- and GTP-regulated interaction of GTPase and other proteins with bovine photoreceptor membranes. Nature 283, 587-589.

263. Kuhn H. (1981) Interaction of the rod cell proteins with the disc membrane: influence of light, ionic strenght and nucleotides. Curr. Top. Membr. Transp., 15, 171-201.

264. Kuhn H., Bennett N., Michel-Villaz M., Chabre M. (1981) Interaction between photoexcited rhodopsin and GTP-binding protein: Kinetic and stoichiometric analysis from light-scattering changes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78(11), 6873-6877.

265. Maguire J., Santoro T., Jensen P., Siebenlist U., Yewdell J., Kelly K. (1994) Gem: an induced, immediate early protein belonging to the Ras family. Science 265 (5169), 241-244.

266. Makino E.R., Handy J.W., Li T., Arshavsky V.Y. (1999) The GTPase activating factor for transducin in rod photoreceptors is the complex between RGS9 and type 5 G-protein P subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 1947-1952.

267. Malinski J. A., WenselT.G. (1992) Membrane stimulation of cGMP phosphodiesterase activation by transducin: comparison of phospholipid bilayers to rod outer segment membranes. Biochemistry, 31, 9502-9512.

268. Malinski J., Zera E., Angleson, J., Wensel T. (1996) High Affinity Interactions of GTPyS with the Heterotrimeric G Protein, Transducin. J. Biol. Chem. 271, 12919-12924.

269. Mangels L.A., Neubig R.R., Hamm H.E., Gnegy xVI.E. (1992) Calmodulin binding distinguishes between beta gamma subunits of activated G protein and transducin. Biochem. J., 283, 683-690.

270. Mani R.S., Boves B.E., Kay C.M. (1982) Biochemistry 31, 2607-2612.

271. Matthews H. R., Murphy R. L. W., Fain G. L., Lamb T. D. (1988) Photoreceptor adaptation is mediated by cytoplasmic calcium concentration. Nature 334, 67-69.

272. Margulis A., Pozdnyakov N., Sitaramayya A. (1996) Activation of bovine photoreceptor guanylate cyclase by S-100 proteins. BiochemBiophys Res Commun. 218 (I), 243-247.

273. Marzesco A.M., Galli T., Louvard D., Zahraoui A. (1998) The rod cGMP phosphodiesterase delta subunit dissociates the small GTPase Rabl3 from membranes. J. Biol. Chem. 273 (35), 22340-22345.

274. McEntaffer R. L., Natochin M., Artemyev N. O. (1999) Modulation of transducin GTPase activity by chimeric RGS16 and RGS9 regulators of G protein signaling and the effector molecule. Biochemistry 38,4931-4937.

275. Mehler E.L. (1990) Protein Eng. 3,415-417.

276. Mehler E.L., Eichele G. (1984) Biochemistry 23, 3887-3891.

277. Melia T.J., Jr., Cowan C.W., Angleson J.K., Wensel T.G. (1997) A comparison of the efficiency of G protein activation by ligand-free and light-activated forms of rhodopsin. Biophys. J. 73, 3182-3191.

278. Melia T.J., Malinski J.A., He F., Wensel T.G. (2000) Enhancement of phototransduction protein interactions by lipid surfaces. J. Biol. Chem. 275, 3535-3542.

279. Miki N., Baraban J.M., Keirns J.J., Boyee J.J., Bitensky M. W. (1975) Purification and properties of the cyclic nucleotide phosphodiesterase of rod outer segments. J. Biol. Chem. 250, 6320-6327.

280. Miller W.H., Gorman R.E., Bitensky M.W. (1972) Cyclic adenosine monophosphate: function in: photoreceptors. Science 174, 295-297.

281. Miller W.H. (1982) Physiological evidences that light-mediated decrease in cyclic GMP is intermediary process in retinal rod transduction. J. Gen. Physiol. 80, 103-123.

282. Miller W.H., Nicol G.D. (1979) Evidence that cGMP regulates membrane potential in rod photoreceptors. Nature 280, 64-66.

283. Miller W.H., Nicol G.D. (1981) Cyclic GMP-induced depolarization regulates and increased response latency in rods: antagonism by light. Curr. Top. Membr. Transport 15, 417-436.

284. Miller J. L., Korenbrot J. I. (1994) Differences in calcium homeostasis between retinal rod and: cone photoreceptor revealed by the effects of voltage on the cGMP-gated conductance in intact cells. J. Gen. Physiol. 104, 909-940.

285. Miller J. L., Picones A M., Korenbrot, J. I. (1994) Differences in transduction between rod and cone photoreceptors: an exploration of the role of calcium homeostasis. Curr. Opin. Neurobiol. 4, 488-495.

286. Milon L., Meyer P., Chiadmi M., Munier A, Johansson M., Karlsson A., Lascu I., Capeau J., Janin J., Lacombe M.L. (2000) The human nm23-H4 gene product is a mitochondrial nucleoside diphosphate kinase. J. Biol. Chem. 275(19), 14264-14272.

287. Mixon M.B., Lee E., Coleman D.E., Berghuis AM., Gilman A.G., Sprang S.R. (1995) Tertiary and quaternary structural changes in Gi alpha 1 induced by GTP hydrolysis. Science 270, 954

288. Molday R. S., Kaupp U. B. (2000) Ion channels of vertebrate photoreceptors. In: Molecular mechanism in visual transduction (D. G. Stavenga, W. J. DeGrip, and E. N. Pugh, Jr. eds) Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, The Netherlands, p. 143-182.

289. Morelli A., Damonte G., Panfoli I., Pepe I. (1989) Proteins of rod outer segments of toad retina: binding with calmodulin and with GTP. Biochem. Biophys. Res. Commun. 163 (1), 363-369.

290. Morera S, Lacombe ML, Xu Y, LeBras G, Janin J. (1995) X-ray structure of human nucleoside diphosphate kinase B complexed with GDP at 2 A resolution. Structure 3(12), 1307-1314.

291. Moyers J.S., Bilan P.J., Reynet C., Kahn C.R. (1996) Overexpression of Rad inhibits glucose uptake in cultured muscle and fat cells. J. Biol. Chem. 271(38), 23111-23116

292. Moyers J. S., Bilan P.J., Zhu J., Kahn C.R. (1999) Rad and Rad-related GTPases interact with calmodulin and calmodulin-dependent protein kinase II. J. Biol. Chem. 272(18), 11832-11839

293. Mou H., Grazio H.J. 3rd, Cook T.A., Beavo J.A., Cote R.H. (1999) cGMP binding to noncatalytic sites on mammalian rod photoreceptor PDE is regulated by binding of its gamma and delta subunits. J.B.C. 274(26), 18813-18820.

294. Mou H., Cote R. H. (2001) The catalytic and GAF domains of the rod cGMP phosphodiesterase (PDE6) heterodimer are regulated by distinct regions of its inhibitory gamma subunit. J. Biol. Chem. 276, 27527-27534.

295. Mukhopadhyay, S., and Ross, E.M. (1999) Rapid GTP binding and hydrolysis by Gq promoted by receptor and GTPase-activating proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 9539-9544.

296. Munos-Dorado J., Inouye M., Inouye S. (1990a) Nucleoside diphosphate kinase from Myxococcus xanthus. I. Cloning and sequencing of the gene. J. Biol. Chem., 265, 5, 2702-2706.

297. Munos-Dorado J., Inouye M., Inouye S. (1990b) Nucleoside diphosphate kinase from Myxococcus xanthus. II. Biochemical Characterization. J. BioL Chem., 265, 5,2707-2712.

298. Muradov K.G., Granovsky A.E., Schey K.L., Artemyev N.O. (2002) Direct interaction of the inhibitory gamma-subunit of Rod cGMP phosphodiesterase (PDE6) with the PDE6 GAFa domains. Biochemistry 41(12), 3884-3890.

299. Nagao S., Yamazaki A., Bitensky M.W. (1987) Calmodulin and calmodulin-binding proteins in amphibian rod outer segments. Biochemistry 26, 1659-1665.

300. Nancy V., Callebaut I., El Marjou A., de Ginzburg J. (2002) The delta subunit of retinal rod cGMP phosphodiesterase regulates the membrane association of Ras and Rap GTPases. J.BioI.Chem. 277(17), 15076-15084.

301. Nathans J., Hogness D.S. (1983) Isolation, sequence analysis, and intronexon arrangement of the gene encoding bovine rhodopsin. Cell 34 (3), 807-814.

302. Natochin M., Granovsky A. E., Artemyev N. O. (1997) Regulation of transducin GTPase activity by human retinal RGS. J. Biol. Chem. 272, 17444-17449.

303. Navon S.E., Fung B.K.-K. (1984) Characterization of transducin from bovine retinal rod outer segments. Mechanism and effects of cholera toxin-catalyzed ADP-ribosylation. J. Biol. Chem., 259,6686-6693.

304. Nicol G.D., Miller W.H.(1978) cGMP injected into retinal rod outer segments increase latency and amplitude of response to illumination. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 5217-5220.

305. Nikoriov S., Engheta H., Pugh E.N., Jr. (1998) Kinetics of recovery of the dark-adapted salamander rod photoresponse. J. Gen. Physiol. 111, 7-37.

306. Noel J.P., Hamm H.E., Sigler P.B. (1993) The 2.2 A crystal structure of transducin-alpha complexed with GTP gamma S. Nature 366,654-663.

307. Nork T. M., Mangini N. J., Millecchia L. L. (1993) Rods and cones contain antigenically distinctive S-antigens. Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. 34,2918-2925.

308. Ong O.C., Ota I.M., Clarke S., Fung B.K.-K. (1989) The membrane binding domain of rod cGMP phosphodiesterase is posttranslationally modified by methyl esterification at C-terminal cysteine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86,9238-9242.

309. Ong O. C., Fung B. K. -K. (1997) Structure of the human cone transducin G gamma subunit gene. Invest. Ophthal. Vis. Sci. 38, SI 124.

310. Ong O. C., Yamane H. K., Phan K. B., Fong H. K. W., Bok D., Lee R. H., Fung, B. K. -K. (1995) Molecular cloning and characterization of the G protein gamma subunit of cone photoreceptors. J. Biol. Chem. 270, 8495-8500.

311. Orlov N.Ya, Kimura N. (1998) Interaction of nucleoside diphosphate kinase with membranes of bleached bovine retinal rod outer segments. Effects of pH, salts, and guanine nucleotides. Biochemistry (Moscow) 63, 171-179.

312. Orlov N.Ya., Orlova T.G., Nomura K., Hanai N., Kimura N. (1996) Transducin-mediated, isoforms-specific interaction of recombinant rat nucleoside diphosphate kinases with bleached bovine retinal rod outer segments membranes. FEBS Lett., 389, 186-190.

313. Orlov N.Ya., Orlova T.G., Reshetnyak Ya. K, Burstein E.A., Kimura N. (1999) Comparative study of recombinant rat nucleoside diphosphate kinases a and p by intrinsic protein fluorescence. J.Biomol. Struct. & Dynamics 16, 955-968

314. Otero A.S., Breitwieser G.E., Szabo G. (1988) Activation of muscarinic potassium currents by ATP-gamma-S in atrial cells. Science, 242,443-445.

315. Otero A.S. (1990) Transphosphorylation and G protein activation. Biochem. Pharmacol., 39, 1399-1404.

316. Otero A.S. (2000) NM23/nucleoside diphosphate kinase and signal transduction. J. Bioenerg. Biomembr. 32 (3), 269-275.

317. Otsuki Y., Tanaka M., Yoshii S., Kawagoe N., Nakaya K., Sugimura H. (2001) Tumor metastasis suppressor nm23-Hl regulates Racl GTPase by interaction with Tiaml. Proc. Natl. Acad. Sci. 98(8), 4385-4390.

318. Otto-Bruc A., Antonny B., Minh Vuong T., Chardin P., Chabre M. (1993) Interaction between the retinal cyclic GMP phosphodiesterase inhibitor and transducin. Kinetics and affinity studies. Biochemistry 32, 8636-86345.

319. Otto-Bruc A., Antonny B., Vuong T.M. (1994) Modulation of the GTPase activity of transducin. Kinetic studies of reconstituted systems. Biochemistry 33, 15215-15222.

320. Otto-Bruc A., Vuong T.M., Antony B. (1994) GTP-dependent binding of Gi, G(o) and Gs to the gamma-subunit of the effector of Gt. FEBS Lett. 343, 183-187.

321. Ovchinnikov Yu.A. (1982) Rhodopsin and bacteriorhodopsin: structure-function relationships. FEBS Lett. 148, 179-191.

322. Padmanabham B., Pahler A., Katayanagi K., Miyagawa M., Watanabe K, Kimura N., Matsuzaki T. (1996) 3rd Internet World Congress on Biomedical Sciences (December 9-20), http://www.3iwc.riken.go.jp/CONGRESS/SYMPO/SBC0203/AG0107/TIT.HTM

323. Paglia M.J., Mou H., Cote R.H. (2002) Regulation of photoreceptor phosphodiesterase (PDE6) by phosphorylation of its inhibitory gamma subunit re-evaluated. J. Biol. Chem. 277(7), 50175023.

324. Palczewski K, Polans A. S., Baehr W., Ames J. B. (2000) Ca2+-binding proteins in the retina: structure, function, and the etiology of human visual diseases. BioEssays 22, 337-350.

325. Pan J.Y., Fieles W.E., White A.M., Egerton M.M., Silberstein D.S. (2000) Ges, A human GTPase of the Rad/Gem/Kir family, promotes endothelial cell sprouting and cytoskeleton reorganization. J. Cell Biol. 149(5), 1107-1116.

326. Pannbacker R.G., Fleishman D.E., Reed D.W. (1972) Cyclic nucleotide phosphodiesterase: high activity in mammalian photoreceptor. Science 175, 757-758.

327. Pannbacker R.G. (1974) Cyclic nucleotide metabolism in human photoreceptors. Invest. Ophthalmol. 13, 535-538.

328. Panico J., Parkes J.H., Liebman P. A. (1990) The effect of GDP on rod outer segment G protein interactions. J. Biol. Chem., 265, 31, 18922-18927.

329. Pages F., Deterre P., Pfister C.(1992) Enhanced GTPase activity of transducin when bound to cGMP phsphodiesterase in bovine retinal rods. J. Biol. Chem., 267,31,22018-22021.

330. Parks, R.E., Jr., AgarwaL, R.P. (1973) In The Enzymes, Vol. 8, Academic Press, New-York, pp. 307-334

331. Parkes J.H., Liebman P. A., Pugh E.N., Jr. (1979) Comparison of delay in hydrolysis of cGMP in ROS suspensions with rate of formation of metarhodopsin II. Invest. Ophthalmol.-Vis. Sci., 20, 22(SuppI.).

332. Parkes J.H., Liebman P.A. (1982) pH dependence of light sensitive PDE activation matches fraction of bleached rhodopsin converted to metarhodopsin II. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 22, 44 (Suppl.).

333. Parkes J.H., Liebman P.A. (1982) Temperature and pH dependence of the metarhodopsin I -metarhodopsin II kinetics and equilibrum in bovine rod disk membrane suspensions.- Biochem., 23, 5054-5061.

334. Peng Y.-W., Robishaw J. D., Levine M. A., Yau, K.-W. (1992) Retinal rods and cones have distinct G protein beta and gamma subunits. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10882-10886.

335. Penningroth S.P., Kirschner M.W. (1977) Nucleotide binding and phosphorylation in microtubule assembly in vitro. J. Mol. Biol. 115, 643-676.

336. Pepe I.M., Boero A., Vergani L., Panfoli I., Cugnoli C. (1986) Effect of light and calcium on cGMP synthesis in rod outer segments of toad retina. Biochim. Biophys. Acta, 889,271-276.

337. Pepperberg D.R., Kahlert M., Krause A., Hofinann K.P. (1988) Photic modulation of a highly sensitive, near-infrared light-scattering signal recorded from intact retinal photoreceptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 85(15), 5531-5535.

338. Pereira-Leal J.B., Seabra M.C. (2000) The mammalian Rab Family of small GTPases: definition of family and subfamily sequence motifs suggests mechanism for functional specificity in the Ras superfamily.- J. Mol. Biol. 301, 1077-1087.

339. Permyakov E.V., Shnyrov V.L., Kalinichenko L.P., Orlov N.Ya. (1985) Effect of cation binding on thermal transition of calmodulin. Biochim. Biophys. Acta 830(3), 288-295.

340. Pfister C„ Kuhn H., Chabre M. (1983) Interaction between photoexcited rhodopsin and peripheral enzymes in frog rods. Influence of the post-metarhodopsin II decay and phosphorylation rate of rhodopsin. Eur. J. Biochem., 136,489-499.

341. Philp N. J., Chang W., Long K. (1987) Light-stimulated protein movement in rod photoreceptor cells of the rat retina. FEBS Lett. 225, 127-132.

342. Phillips W.J., Cerione R.A. (1988) The intrinsic fluorescence of the alpha-subunit of transducin. Measurement of receptor-dependent guanine nucleotide exchange. J. Biol. Chem., 263, 30, 15498-15505.

343. Phillips W.J., Trukawinski S., Cerione R. (1989) An antibody-induced enhancement of the transducin-stimulated cyclic GMP phosphodiesterase activity. J. Biol. Chem., 264, 28, 16679 -16688.

344. Picones A., Korenbrot J. I. (1995) Permeability and interaction of Ca2+ with cGMP-gated ion channels differ in retinal rod and cone photoreceptors. Biophys. J. 69, 120-127.

345. Pober J.S., Bitensky M.W. (1979) Light-regulated enzymes of vertebrate retinal rods. Advances in Cyclic Nucleotide Res. 11,265-309.

346. Postel E.H., Berberich S.J., Flint S.J., Ferrone C.A. (1993) Human c-myc transcription factor PuF identified as nm23-H2 nucleoside diphosphate kinase, a candidate suppressor of tumor metastasis. Science 261(5120), 478-480.

347. Postel'E.H., Weiss V.H., Beneken J., Kartane A. (1996) Mutational analysis of NM23-H2/NDP kinase identifies the structural domains critical to recognition of a c-myc regulatory element. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 6892-6897.

348. Postel E.H., Berberich S.J., Rooney J.W., Kaetzel D.M. (2000) Human NM23/Nucleoside diphosphate kinase regulates gene expression through DNA binding to nuclease-hypersensitive transcriptional elements. J. Bioenerg. Biomembranes 32 (3) 277-284.

349. Postel E.H., Abramczyk B.A., Gursky S.K., Xu Y. (2002) Structure-based mutational and functional analysis identify human NM23-H2 as a multifunctional enzyme. Biochemistry 41(20), 6330-6337

350. Pozdnyakov N., Yoshida A., Cooper N.G. Margulis A., Duda T., Sharma R.K., Sitaramayya A. (1995) A novel calcium-dependent activator of retinal rod outer segment membrane guanylate cyclase. Biochemistry. 34 (44), 14279-14283.

351. Pozdnyakov N., Margulis Л., Sitaramayya A. (1998) Identification of effector binding sites on S100 beta: studies with guanylate cyclase and p80, a retinal phosphoprotein. Biochemistry 37 (30), 10701-10708;

352. Presecan E., Vonica A., Lascu I. (1989) NDPK from human Erythrocytes: Purification, molecular mass and subunit structure. FEBS Lett., 250,2,629- 632.

353. Pugh E.N., Jr. (1987) The nature and identity of internal excitational transmitter of vertebrate phototransduction. Ann. Rev. Physiol. 49, 715-741.

354. Pugh E.N., Jr. (1999) Variability in single photon responses: a cut in the Gordianknot of rod phototransduction? Neuron 23,205-208.

355. Pugh E.N., Jr., Cobbs W.H. (1986) Visual transduction in vertebrate rods and cones: a tale of two transmitters, calcium and cyclic GMP. Vis. Res. 26(10), 1613-1643.

356. Pugh E.N., Jr., Lamb T.D. (1993) Amplification and kinetics of the activation steps in phototransduction. Biochim. Biophys. Acta 1141,111-149.

357. Pugh E.N., Jr., Nikonov S., Lamb T.D. (1999) Molecular mechanisms of vertebrate light adaptation. Curr. Opin. Neuro bio 1. 9,410-418;

358. Pulvermüller A., Gieß A., Heck M., Wottrich R., Schmitt A., Ernst O.P., Choe H.-W, Hofinann K.P., Wolfrum; U. (2002) Calcium-Dependent Assembly of Centrin-<j-Protein-Complex in Photoreceptor Cells. Molecular and Cellular BioL 22(7), 2194-2203.

359. Ratto et: al. (1988) Identification of adenylyl cyclase activity in rod; photoreceptor cells. J. NeuroscL 9, 87-119.

360. Ratto G.M., Payne R., Owen W.G., Tsien R.Y. (1988) The concentration of cytosolic free calcium in vertebrate rod outer segments measured with fura-2. J. NeuroscL 8(9), 3240-3246.

361. Reike F., Baylor D.A. (1998) Origin of reproducibility in the responses of retinal rods to single photons. Biophys. J., 75, 1836-1857.

362. Rens-Domiano S., Hamm H.E. (1995) Structural and functional relationships of heterotrimeric G-proteins. FASEB J. 9,1059-1066.

363. Reshetnyak. YaK., Burstein E.A. (1997) Biophys. J. 72, A89.

364. Reshetnyak YaK., Burstein E.A. (2001) Decomposition of tryptophan fluorescence spectra into log-normal components. II. The statistical proof of discreteness of tryptophan classes in proteins. Biophys. J; 81 (3), 1710-1734.

365. Reynet C., Kahn C.R. (1993) Rati: a member of the Ras family overexpressed in muscle of type II diabetic humans. Science 262(5138), 1441-1444

366. Rispoli G., Detwiller P.B. (1990) NTP modulate the light-regulated channel in detached rod outer segments. Biophys. J. 57, 368a.

367. Robinson J.B., Jr., Brems D.N., Stellwagen E. (1981) A monoisomeric NDPK capable of complete phosphorylation. J. Biol. Chem. 256, 10796-10773.

368. Rodbell M.( 1995a) Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 34, 1420-1433.

369. Rodbell M. (1995b) Nobel lecture. Signal transduction: evolution of an idea. Biosci. Rep. 15(3), 117-133.

370. Rodbell M., Birnbaumer L., Pohl S. L., Krans H. M. J. (1971) The glucagons-sensitive adenyl cyclase system in plasma membranes of rat liver. V. An obligatory role of guanylnucleotides in glucagons action. J. Biol. Chem. 246(6), 1877-1882.

371. Rodbell M. (1980) The role of hormone receptors and GTP regulatory proteins in membrane transduction. Nature 284, 17-22.

372. Roobol K., Mo Her W. (1981) Protein synthesis in Artemia salina. Eucaryotic elongation factor eEF-Ts is phosphotransphosphorylase. Molec. Biol. Rep. 7, 197-202.

373. Rosengard A.M., Krutzsch H.C., Shearn A., Biggs J.R., Barker E., Margulies I.M., King C.R., Liotta L.A., Steeg P.S. (1989) Reduced Nm23/Awd protein in tumour metastasis and aberrant Drosophila development. Nature 342(6246), 177-180.

374. Ross, E.M. (1989) Signal sorting and amplification through G protein-coupled receptors. Neuron 3, 141-152.

375. Ross E.M., Wilkie T.M. (2000) GTPase-activating proteins for heterotrimeric G proteins: regulators of G protein signaling (RGS) and RGS-like proteins. Annu. Rev. Biochem. 69, 795827.

376. Sakmar T.P., Menon S.T., Marin E.P., A wad E.S. (2002) Rhodopsin: Insights from recent structural studies. Annu. Rev. Biophys. BiomoL Struct. 31,443-484.

377. Sagoo M.S., Lagnado L. (1997) G-protein deactivation is rate-limiting for shut-off of the phototransduction cascade. Nature 389,392-395.

378. Sakuma H., Inana G., Murakami A., Higashide T, McLaren M.J. (1996) Immunolocalization of X-arrestin in human cone photoreceptors. FEBS Lett. 382, 105-110.

379. Sanada K-, Shimizu F., Kamevama K., Haga K., Haga T., Fukada Y. (1996) Calcium-bound recoverin targets rhodopsin kinase to membranes to inhibit rhodopsin phosphorylation. FEBS Lett. 384, 227-230.

380. Sather W.A., Detwiler P.B. (1987) Intracellular biochemical manipulation of phototransduction in detached rod outer segments. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84,9290-9294.

381. Seifert R., Rosental W., Scultz G., Wieland T., Gierschick P., Jakobs K.(1988) The role of nucleoside diphosphate kinase reactions in G protein activation of NADPH oxidase by guanine and adenine nucleotides. Eur. J. Biochem., 175, 1, 51-55.

382. Silman I., Futerman A.H. (1987a) Modes of attachment of acetylcholinesterase to the surface membrane. Eur. J. Biochem. 170 (I), 11-22.

383. Silman I., Futerman A. H. (1987b) Posttranslational modification as a means of anchoring acetylcholinesterase to the cell surface. Biopolymers. 26 (Suppl) S241-S253.

384. Sitaramayya A., Harkness J., Parkes J.H., Gonzales-Oliva C., Liebman P.A. (1986) Kinetic studies suggest that light-activated cGMP phosphodiesterase is a complex with G-protein subunits. Biochemistry 25, 651-656.

385. Sitaramayya A., Casadevall C., Bennett N., Hakki S. (1988) Contribution of the guanosine triphosphatase activity of G protein to termination of light-activated cGMP hydrolysis in retinal rod outer segments. Biochemistry, 27,4880-4888.

386. Sitaramayya A., Pozdnyakov N., Margulis A., Yoshida A. (2000) Calcium-dependent activation of membrane guanylate cyclase by S100 proteins. Methods Enzymol. 315,730-742.

387. Schleicher A., Hofinann K.P. (1983) Time-resolved angular dependent measurement of triggered light scattering changes in biological suspensions. J. Biochem. Biophys. Methods, 8(3), 227-237.

388. Schleicher A., Hofinann K.P. (1987) Kinetic study on the equilibrium between membrane-bound and free photoreceptor G-protein. J. Membr. Biol., 95(3), 271-281.

389. Schiebel E., Bornens M. (1995) In search of a function for centrins. Trends Cell Biol. 5, 197201.

390. Shimada N. Ishikawa N., Munakata Y., Toda T., Watanabe fC, Kimura N. (1993) J. Biol. Chem. 268,2583-2589.

391. Skiba N.P., Hopp J.A., Arshavsky V.Y. (2000) The effector enzyme regulates the duration of G protein signaling in vertebrate photoreceptors by increasing the affinity between transducin and RGS protein. J. BioL Chem. 275, 32716-32720.

392. Skiba NP, Yang CS, Huang T, Bae H, Hamm HE. (1999) The cc-helical domain of Gat determines specific interaction with regulator of G protein signaling 9. J. Biol. Chem. 274, 8770-8778.

393. Slep K.C., Kercher M.A., He W., Cowan C.W., Wensel T.G., Sigler P.B. (2001) Structural determinants for regulation of phosphodiesterase by a G protein at 2.0 A. Nature 409 (6823), 1071-1077.

394. Slepak V. Z., Artemyev N. O., Zhu Y., Dumke C. L., Sabacan L., Sondek J., Hamm H. E., Bownds M. D., Arshavsky V. Y. (1995) An effector site that stimulates G-protein GTPase in photoreceptors. J. Biol. Chem. 270, 14319-.

395. Smith N.P., Lamb T.D. (1997) The a-wave of the human electroretinogram recorded with a minimally invasive technique. Vision Res. 37,2943—2952.

396. Sondek J., Bohm A., Lambright D.G., Hamm H.E., Singer P.B. (1996) Crystal structure of a G-protein beta gamma dimer at 2.1 A resolution. Nature 379, 369-374.

397. Sondek J., Lambright D.G., Noel J.P., Hamm H.E., Sigler P.B. (1994) GTPase mechanism of G proteins from the 1.7 A crystal structure of transducin alpha-GDP-AIF.». Nature 372, 276-279.

398. Sowa M.E., He W., Wensel T.G., Lichtarge O. (2000) A regulator of G protein signaling interaction surface linked to effector specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 1483-1488.

399. Sowa M.E., He W., Slep K.C., Kercher M.A., Lichtarge O., Wensel T.G. (2001) Prediction and confirmation of a site critical for effector regulation of RGS domain activity. Nat. Struct. Biol. 8, 234-237.

400. Stahl J. A., Leone A., Rosengard A. M., Porter L., King C. R., Steeg P. S. (1991). Cancer Res. 51,445-449.

401. Starace D.M., Knox B.E. (1997) Activation of transducin by a Xenopus short wavelength visual pigment. J. Biol. Chem. 272, 1095-1100.

402. Steeg PS, de la Rosa A, Flatow U, MacDonald NJ, Benedict M, Leone A (1993) Nm23 and breast cancer metastasis. Breast Cancer Res Treat 25(2), 175-187.

403. Steeg P.S., Palmieri D., Ouatas T., Salerno M. (2003) Histidine kinases and histidine phosphorylated proteins in mammalian cell biology, signal transduction and cancer. Cancer Lett. 190(1), 1-12

404. Stryer L. (1983) Transducin and the cyclic GMP phosphodiesterase: amplifier proteins in vision. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 48, 841- 852.

405. Stryer L. (1986) Cyclic GMP cascade of vision. Annu. Rev. Neurosci., 9, 87-119.

406. Stryer L. (1987) Visual transduction: Desing and recurring motifs. Chemica Scripta 27B, 161171.

407. Stryer L. (1988) Molecular basis of visual exitation. Cold Spring Symp. Quantitative Biol. LIII, 283-293.

408. Stryer L. (1991) Visual excitation and recovery. J. Biol. Chem., 266, 17, 10711-10714.

409. Stryer L. (1993) Molecular mechanism of visual exitation. Harvey Lectures 87,129-143.

410. Szabo A.G., Lynn K., Krajcarski D., Rayner D.M. (1979) J. Luminescence, 18,582-586.

411. Tachibanaki S., Tsushima S., Kawamura S. (2001) Low amplification and fast visual pigment phosphorylation as mechanisms characterizing cone photoresponses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 14044-14049.

412. Tatischeff I., Klein R., Duquesne M. (1976) A new fluorescent photoproduct of tryptophan evidenced by long wavelength excitation of fluorescence. Photochem Photobiol. 24(5), 413-416.

413. Tchorbanov B., Aleksiev B., Atanasov B., Bukolova-Orlova T.G., Burstein E.A. (1977) Subfractionation and reconstitution of a neurotoxic complex of Bulgarian viper Vipera ammodytes ammodytes. FEBS Lett. 76, 266 268.

414. Tepper AD, Dammann H, Bominaar AA, Veron M. (1994) Investigation of the active site and the conformational stability of nucleoside diphosphate kinase by site-directed mutagenesis. J Biol Chem. 269(51), 32175-32180.

415. Timmons L., Sheara A. (2000) Role of AWD/nucIeoside diphosphate kinase in Drosophila development. J. Bioenerg Biomembr. 32(3), 293-300.

416. Ting T.D., Ho Y.-K. (1991) Molecular mechanism of GTP hydrolysis by bovine transducin: Pre-steady-state kinetic analyses. Biochem., 30, 37, 8996-9007.

417. Tsang S. H., Burns M. E., Calvert P. D., Gouras P., Baylor D. A., Goff S. P., Arshavsky V. Y. (1998) Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo. Science 282, 117-121.

418. Tyminski P.N., O'Brien D.F. (1984) Rod outer segment phosphodiesterase binding and activation in reconstituted membranes. Biochemistry, 23, 3986-3993.

419. Uhi R., Ryba N.I. (1990) Transducin activation and deactivation in rod systems of different structural integrity. Attempts at a focussed view through scattered light. Biochim Biophys Acta, 1054(1), 56-68.

420. Uhl R., Wagner R., Ryba N. (1990) Watching G proteins at work. Trends Neurosci., 13(2), 6470.

421. Vincent S.P., Grenier S., Mioskovvski C., Salesse C., Luc Lebeau L. (2001) Probing the Transducin Nucleotide Binding Site with GDP Analogues. Bioorg. Medicinal Chem. Lett. 11, 1185-1188.

422. Vissers P.M., Bovee-Geurts P.H., Portier M.D., KJaassen C.H., De Grip W.J. (1998) Large-scale production and purification of the human green cone pigment: characterization of late photo-intermediates. Biochem. J. 330,1201-1208.

423. Volotovski I.D., Ryba N.J., Watts A. (1985) Effect of calmodulin on the structural state of photoreceptor membranes and rhodopsin-containing phospholipid vesicles. Biochem. Biophys. Res. Commun., 129(2), 517-521.

424. Vogel H.(1981) Incorporation of melittin into phosphatidylcholine bilayers. Study of binding and conformational changes. FEBS Lett. 134,37-42, 1981

425. Vuong T.M., Chabre M., Stryer L. (1984) Millisecond activation of transducin in the cyclic nucleotide cascade of vision. Nature, 311,659-661.

426. Vuong T.M., Chabre M. (1990) Subsecond deactivation of transducin by endogenous GTP hydrolysis. Nature, 346, 71-74,1990.

427. Vuong T.M., Chabre M. (1991) Deactivation kinetics of the transduction cascade of vision. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 9813-9817.

428. Vuong T.M., Pfister C., Worcester D.L., Chabre M. (1987) The transducin cascade is involved in the light-induced structural changes observed by neutron diffraction on retinal rod outer segments. Biophys. J., 52, 10, 587-594.

429. Wagner R., Ryba N., Uhl R. (1989) Calcium regulates the rate of rhodopsin disactivation and the primary amplification step in visual transduction. FEBS Lett., 242(2), 249-254.

430. Wagner R., Ryba N., Uhl R. (1988b) Sub-second turnover of transducin GTPase in bovine rod outer segments. A light scattering study. FEBS Lett., 234(1), 44-48.

431. Wagner P.D., Vu N.-D. (1995) Phosphorylation of ATP-citrate lyase by nucleoside diphosphate kinase. J. BioL Chem. 270,21758-21764

432. Wall M.A., Coleman D.E., Lee E., Iniguez-Lluhi J.A., Posner B.A., Gilman A.G., Sprang S.R. (1995) The structure of the G protein heterotrimer Gi alpha 1 beta 1 eamma 2. Cell 83, 10471058.

433. Waloga G., Anderson R.E. (1985) Effects of inositol-1,4,5-trisphosphate injections into salamander rods.Biochem Biophys Res Commun. 126 (I), 59-62.

434. Watson N., Linder M. E., Druey K. M., Kehrl J. H., Blumer K. J.(1996) RGS family members: GTPase-activating proteins for heterotrimeric G-protein alpha-subunits. Nature 383, 172-177.

435. Watson A.J., Aragay A.M., Slepak V.Z., Simon M.I. (1996) A novel form of the G protein beta subunit Gbeta5 is specifically expressed in the vertebrate retina. J. Biol. Chem. 271, 2815428160.

436. Webb P.A., Perisic O., Mendola C.E., Backer J.M., Williams R.L. (1995) The crystal structure of a human nucleoside diphosphate kinase, NM23-H2. J. Mol. Biol. 251(4), 574-587.

437. Weissbach H., Miller D.L., Hachmaun J. (1970) Studies on the role of factor Ts in polypeptide synthesis. Arch. Biochem. Biophys. 137, 262-269.

438. Wensel T.G., Stryer L. (1986) Reciprocal control of retinal rod cyclic GMP phosphodiesterase by its 'gamma' subunit and transducin. Proteins: Structure, Function, and Genetics 1,90-99.

439. Wensel T.G., Stryer L. (1990) Activation mechanism of retinal rod cyclic GMP phosphodiesterase probed by fluorescein-labeled inhibitory subunit. Biochemistry 29, 21552161.

440. Wensel T.G. (2002) RGS9-1 phosphorylation and Ca2+. Adv. Exp. Med. Biol. 514, 125-129

441. Wessling-Resnick M., Johnson G.L. (1987a) Allosteric behavior in transducin activation mediated by rhodopsin. Initial rate analysis of guanine nucleotide exchange. J. Biol. Chem., 262, 8, 3697-3705.

442. Wessling-Resnick M., Jonhson G. L. (1987b) Transducin interactions with rhodopsin. Evidence for positive cooperative behavior. J. Biol. Chem., 262, 26, 12444-12447.

443. West R.W., Dowling J.E. (1975) Anatomical evidence for cone and rod-like receptors in the gray squirrel, ground squirrel and prairie dog retinas. J. Comparative Neurol. 159,439-460.

444. West M., Kung-fu H., Kamata T.(1990) A novel membrane factor stimulates guanine nucleotide exchange reaction of ras proteins. FEBS Lett., 259,2, 245-248.

445. Whelan J. P., McGinnis J. F. (1988) Light-dependent subcellular movement of photoreceptor proteins. J. Neurosci. Res. 20, 263-270.

446. Wieland T., Jakobs K.H. (1989) Receptor-regulated formation of GTPyS with subsequent persistent Gs-protein activation in membrane of human platalets. FEBS Lett., 245, 1-2, 189-193.

447. Wieland T., Ulibarri I., Gierschik P., Hall A., Aktories K., Jakobs K.H. (1990) Interaction of recombinant rho A GTP-binding proteins with photoexcited rhodopsin. FEBS Lett. 274(1-2), 111-114

448. Wieland T., Ronzani, M., Jakobs K.H.(1992) Stimulation and inhibition of human platelet adenylyl cyclase by thiophosphorylated transducin P-subunits. J. Biol. Chem. 267, 20791 -20797.

449. Willardson, B.M., Pou, B., Yoshida, T., Bitensky M.W. (1993) Cooperative binding of the retinal rod G-protein, transducin, to light-activated rhodopsin. J. Biol. Chem. 268, 6371-6382.

450. Willardson B.M., Wilkins J.F., Yoshida T., Bitensky M.W. (1996) Regulation of phosducin phosphorylation in retinal rods by Ca27caImodulin-dependent adenylyl cyclase. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93, 1475-79.

451. Whalen M.M., Bitensky M.W. (1989) Comparison of the phosphodiesterase inhibitory subunit interaction of frog and bovine rod outer segments. Biochem. J. 259(1), 13-19.

452. Wheller G.L., Bitensky M.W. (1977) A light-activated GTPase in vertebrate photoreceptors: Regulation of light-activated cyclic GMP phosphodiesterase. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74, 4238-4242.

453. Wheller G.L., Yamazaki A., Bitensky M.W. (1981) A GTP-protein activator of phosphodiesterase which forms in response to bleached rhodopsin. J. Cyclic Nucleotide Res. 7, 95-104.

454. Wheller G.L., Matuo Y., Bitensky M.W. (1977) Light-activated GTPase in vertebrate photoreceptors. Nature, 269, 822-824.

455. Whitlock G.G., Lamb T.D. (1999) Variability in the time course of single photon responses from toad rods: termination of rhodopsin's activity. Neuron 23, 337-351.

456. Wolfrum U., Salisbury J. L. (1998) Expression of centrin isoforms in the mammalian retina. Exp. Cell Res. 242:10-17.

457. Wolfrum U., Schmitt A. (2000) Rhodopsin transport in the membrane of the connecting cilium of mammalian photoreceptor cells. Cell Motil. Cytoskeleton 46, 95-107.

458. Woodruff M.L., Bownds M.D. (1979) Amplitude, kinetics and reversibility of light-induced decrease in guanosine 3'-5'-cyclic monophosphate in isolated frog retinal rod outer segments. J. Gen. Physiol., 73, 629 653.

459. Yamanaka G., Eckstein F., Stryer L. (1985) Stereochemistry of the guanyl nucleotide binding site of transducin probed by phosphorothioate analogues of GTP and GDP. Biochem., 24, 8094 -8101.

460. Yamanaka G., Eckstein F., Stryer L. (1986) Interaction of retinal transducin with guanosine triphosphate analogues: specificity of the y-phosphate binding region. Biochemistry, 25, 61496153.

461. Yamazaki A., Bitensky M.W., Garsia-Sainz J. A. (1987b) The GTP-binding protein of rod outer segments. II. An essential role for Mg++ in signal amplification. J. Biol. Chem., 262, 19, 93249331.

462. Yamazaki A., Bondarenko V.A., Dua S., Yamazaki M., Usukura J., Hayashi F. (1996) Possible stimulation of retinal rod recovery to dark state by cGMP release from a cGMP phosphodiesterase noncatalytic site. J Biol Chem. 271(51), 32495-32498.

463. Yamazaki A., Stein P.J., Cheraoff N., Bitensky M.W. (1983) Activation mechanism of rod outer segment cyclic GMP phosphodiesterase. J. Biol. Chem. 258, 8188-8194.

464. Yamazaki A., Tatsumi M., Torney D.C., Bitensky M.W. (1987a) The GTP-binding protein of rod outer segments. I. Role of each subunits in the GTP hydro lytic cycle. J. Biol. Chem.-, 262, 19, 9316-9323.

465. Yamazaki A., Hayashi F., Tatsumi M., Bitensky M.W., George J.S. (1990) Interaction between the subunits of transducin and cGMP PDE in Rana catesbiana rod photoreceptors. J.B.C. 265, (20), 11539-11548

466. Yamazaki A., Sen I., Bitensky M.W., Casnellie J.E., Greengard P. (1980) Cyclic GMP specific, high affinity, noncatalytic binding sites on light-activated phosphodiesterase. J. Biol. Chem. 255, 11619-11624.

467. Yang Z., Wensel T.G. (1992) Inorganic pyrophosphatase from bovine retinal rod outer segments. J. Biol. Chem. 267(34), 24634-24640.

468. Yau K.-W., Nakatani K. (1985) Light-suppressible, cyclic GMP-sensitive conductance in the plasma membrane of truncated rod outer segment. Nature, 317, 252-255.

469. Yee R., Liebman P.A. (1978) Light-activated phosphodiesterase of the rod outer segments. Kinetics and parameters of activation and deactivation.- J. Biol. Chem., 253, 8902-8909.

470. Yoshikami S., Hagins W.A. (1970) Ionic basis of dark current and photocurrent of retinal rods. Biophys. J. 10, 60a.

471. Yoshikami S., Hagins W.A. (1973) Control of the dark current in vertebrate rods and cones. Biochemistry and physiology of visual pigments (Ed. Langer H.) Springer-Verlag Inc., N.Y., 245-255.

472. Yuen P.T.S., Graeff R.M., Walseth T.F.,Goldberg N.D. (1989) Non-identity of cGMP as the guanine nucleotide stimulated to bind to ROS by light and ATP. Exp. Eye Res., 49, 75-85.

473. Zelent B., Veklich Yu„ Murray J., Parkes J.H., Gibson S., Liebman P.A. (2001) Rapid irreversible G protein alpha subunit misfolding due to intramolecular kinetic bottleneck that precedes Mg2+ "Lock" after GTP/GDP exchange. Biochemistry, 40, 9647-9656.

474. Zhang J.H., Simonds W.F. (2000) Co-purification of brain G-protein P5 withRGS6 and RGS7. J. Neurosci. 20, RC59-NIL13.

475. Zhang X., Wensel T.G., Kraft T.W. (2003) GTPase Regulators and Photoresponses in Cones of the Eastern Chipmunk. J. Neurosci. 23(4), 1287-1295.

476. Zhang Z., Melia T.J., He F., Yuan C., McGough A., Schmid M.F., Wensel T.G. (2004) How a G protein binds a membrane. J. Biol Chem. 279(32), 33937-33945

477. Zhu X., Boman A.L., Kuai J., Gieplak W., Kahn R. (2000) Effector Increase the affinity of ADP-ribosylation factor for GTP to increase binding. J. Biol. Chem. 275(18), 13465-13475. (Please, see this work for role of GDP in active site of Gt)

478. Zhu J., Bilan P.J., Moyers J.S., Antonetti D.A., Kahn C.R. (1996) Rad, a novel Ras-related GTPase, interacts with skeletal muscle beta-tropomyosin. J. Biol. Chem. 271 (2),768-73.

479. Zimmerman A.L. (1995) Cyclic nucleotide gated channels. Curr. Opin. Neurobiol. 5, 296-303.

480. Zimmerman A.L., Baylor D.A. (1986) Cyclic GMP-sensitive conductance of retinal rods consists of aqueous pores. Nature 321, 70-72.

481. Zozulya V., Stryer L. (1992) Calcium-myristoyl protein switch. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 11569-11573.1. Благодарности

482. Я глубоко признателен моим родителям Я.М. Орлову и М.Ф. Орловой и моему деду Ф.П. Дымченко. Появление этой работы доставило бы им огромную радость.