Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гранулоцитарные сериновые протеиназы и их действие на калликреин-кининовую систему плазмы крови человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Гранулоцитарные сериновые протеиназы и их действие на калликреин-кининовую систему плазмы крови человека"

АКАДЕМИЯ НАУК РОССИИ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А. Н БАХА

РГб од

3 на правах рукописи

УДК 615.357.37.

НЕШКОВА Елена Андреевна

ГРАНУЛОЦИТАРНЫЕ СЕРИНОВЫЕ ПРОТЕИНАЗЫ И ИХ ДЕЙСТВИЕ НА КАЛЛИКРЕИН-КИНИНОВУЮ СИСТЕМУ ПЛАЗМЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

03.00.04 — Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1994

Работа выполнена в Российской медицинской академии последипломного образования МЗ РФ.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Яровая Г. А.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Гинодман Л. М.,

доктор биологических наук Васильев А. В.

Ведущая организация: Институт биомедицинской химии РАМН.

Защита диссертации состоится 1994 года

в 10.00 на заседании специализированного совета К 002. 96.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А. Н. Баха РАН (117071, г. Москва, Ленинский пр-т, 33, кор. 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы РАН (117071, г. Москва, Ленинский пр-т, 33, кор. 1).

Автореферат разослан 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

М. И. Молчанов

1 Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. В настоящее время установлена важная роль протеолитических ферментов в регуляции всех процессов жизнидеятельности. Исследование функций протеиназ в норме и патологии является одной из актуальных задач медицинской биохимии.

В последние годы большое внимание уделяется гранулоцитарным протеиназам, в частности эластазе и катепсину G, которые могут освобождаться из нейтрофильных лейкоцитов при воспалительных процессах (Ерюхин и др., 1989, Маянский и Маян-ский, 1989; Barrett et al, 1977; Bond & Batter, 1987). Известно, что эти ферменты, особенно эластаза, могут гидролизовать многие белки различных тканей и плазмы кропи .(Bieth, 1978; Fritz, 1980; Jochum et al., 1986). вызывая развитие тяжелых патологических состояний, таких как острое и хроническое воспаление, шок, тромбогеморрагия и pp.(Uehara et al., 1992, Sandsmo et al., 1983; Heem, 1992).

Особый интерес представляет изучение взаимодействия гранулоцитарных протеиназ с протеолитическими системами плазмы крови (гемокоагулирующая, фибрино-литическая, калликреин-кининовая, ангиотензин-рениновая, система комплемента),обеспечивающими процессы адаптации и защиты. В соответствии с современными представлениями, центральное место в регуляции активности всех протеолитических систем плазмы крови занимает калликреин-кининовая система. Изучение состояния этой системы при патологических состояниях необходимо для понимания процессов регуляции протеолитических систем плазмы крови. Известно, что пусковым механизмом активации протеолитических систем плазмы крови являются процессы взаимоактивации прекалликреина и фактора Хагемана с участием калликреина и высокомолекулярного кининогена (Revak etat., 1978; Kaplan eta!., 1987; Schmaier et al., 1987; Heem, 1992).

Однако, практически неизученным остается вопрос о влиянии протеолитических ферментов клеток крови, в частности, нейтрофильных лейкоцитов, участвующих в развитии воспалительной реакции организма, на калликреин-кининовую систему, что приводит к возникновению гемодинамичесих сдвигов , вплоть до развития дис-семилированного внутрисосудистого свертывания.

Цель работы. Целью настоящего исследования явилось изучение действия лейкоцитарных протеиназ (эластаэы и катепсина G) на ключевые компоненты каллик-реин-кининовой системы: прекалликреин, фактор Хагемана (XII фактор светывания

крови) и их активные формы, а так же разработка нового варианта спектрофотомет-

I

рического метода определения активности лейкоцитарной зластазы.

!

Задачи работы. В соответствии с поставленной целью были определены следующие конкретные задачи:

1. Выделить эластазу из полиморфноядерных лейкоцитов методом биоспецифической хроматографии и охарактеризовать физико-химические и энзиматические свойства полученного фермента.

2. Получить методом аффинной хроматографии катепсин G из лейкоцитов человека и охарактеризовать его физико-химические и энзиматические свойства.

3. Исследовать действие лейкоцитарных зластазы и катепсина G на прекалликреин, фактор Хагемана и их активные формы.

4. Разработать метод определения активности зластазы, находящейся в комплек-

i

се с «1-протеиназным ингибитором.

I

Научная новизна. Показано, что высокоочищенные препараты лейкоцитарных протеиназ (эластаза и катепсин G) инактивируют ключевые факторы контактной активации протеолитических систем плазмы крови - калликреин, активный фактор Хагемана и их проферменты. Впервые продемонстрирована возможность определения активности лейкоцитарной зластазы в комплексе с а 1-протеиназным ингибитором.

Научно-практическое значение. Впервые выявлена роль протеиназ в регуляции активности капликреин-кининовой и гемокоагулирующей систем плазмы крови. Предложен вариант быстрого и эффективного метода очистки лейкоцитарных зластазы и катепсина G, позволяющий получать лейкоцитарные ферменты в высокоочи-щенном виде и препаративных количествах. Разработан метод определения активности эластазы в комплексе с а1-протеиназным ингибитором в плазме крови.Метод позволяет оценить интенсивность дегрануляционных процессов в нейтрофилах in vivo при патологических состояниях, связанных с воспалением. Высокая активность лейкоцитарной эластазы в плазме крови больного может служить показателем при прогнозировании осложнений течения воспалительных процессов.

Положения, выносимые на защиту.

1. Исследование действия эластазы и катепсина G на фактор Хагемана, прекал-ликреин и их активные формы осуществлено с помощью высокоочищэнных препаратов лейкоцитарных ферментов, выделенных с помощью биоспецифической хроматографии на гордокс-сефарозе, из одной порции лейкоцитарной массы. Характеристика энзиматических и физико-химических свойств препаратов гранулоцитарных сериновых протеиназ: эластазы и катепсина G.

2.Лейкоцитарная эластаза оказывает выраженное инактивирующее действие на ключевые ферменты калликреин-кининовой системы - фактор Хагемана, калликреин и их предшественники.

3. Лекоцитарный катепсин G инактивирует фактор Хагемана и его активную форму , оставляя интактными молекулы калликреина и прекалликреина.

4. Для определения степени дегрануляционной активности нейтрофилоо и уровня эластазы в русле крови разработан спектрофотометрический метод определения активности эластазы, связанной с «1-протеиназным ингибитором.

Апробация работы.

Материалы диссертации были доложены на VIII Международной конференции по протеолиэу (Германия, 1990 г.), на III Международном симпозиуме по ингибиторам и биологическому контролю (Югославия, 1991 г.), на III симпозиуме "Химия протеоли-тических ферментов" (Москва, 1993 г.), на международной конференции "Кинины'ЗЗ", (Бразилия, Сан-Пауло, 1993 г.).

Структура и объем работы.

Диссертационная работа содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов, выводы и список литературы; изложена на 79 страницах и включает 14 рисунков и 7 таблиц. Библиография включает150 источников, из них 9 - русские, 141 - иностранные источники.

з

!

Список сокращений.

BocAlaONp — N-tert-бутокси-карбонил-аланин-п-нитрофениловый эфир;

ВАЕЕ — Ы-бензоил-1_-аргинин-этиловый эфир;

ВТЕЕ — N-бензоил-и-тирозин-этиловый эфир;

MSAAPVpNA — метокси-сукцинил-аланил-аланил-пролил-валин-п-нитроанилид;

е-АКК — е-аминокапроновая кислота;

ИТС — ингибитор трипсина из бобов сои;

а1 ПИ - а1 — протеиназный ингибитор;

Дфф — диизопропилфторфосфат;

ФМСФ — фенилметилсульфонилфторид;

ДС-Na — додецилсульфат натрия;

CNBr — цианбромид;

I

ЛЭ — лейкоцитарная эластаза;

|

П1у1ЯЛ — полиморфноядерные лейкоциты;

ККС — калликреин-кининовая система;

ПААГ — полиакриламидный гель.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы.

В работе были использованы следующие основные препараты и химические реактивы.

Лейкоцитарная масса-препарат Московского института гематологии и переливания крови.Прекалликреин, калликреин, (ЕС 3.4.21.34), фактор Хагемана (ЕС 3.4.21.38)- препараты полученные на кафедре биохимии Российской медицинской академии последипломного образования. Препараты прекалликреина имели удельную активность по ВАЕЕ 0,78-1,9 Е/мг белка. Калликреин получали путем активации препаратов прекалликреина, используя в качестве активатора трипсин(Kawiak et а/, 19S4). Препараты фактора Хагемана обладали удельной активностью 1,0-2,0 Е/мг белка (Доценко BJ1. и др., 1987). BocAlaONp, ВТЕЕ, орцеин-эластин - препараты фирмы "Serva", Германия. MSAAPVpNA-препарат фирмы "УНИХИМ", Россия. ВАЕЕ-пре-

J

парат фирмы "Reanal", Венгрия. Наборы низко- и высокомолекулярных белков-метчиков - препараты фирмы "Pharmacia Fine Chem", Швеция.

Активность ферментов определяли по скорости расщепления специфических природных и синтетических субстратов. Спектрофотометрическое определение скорости гидролиза BocAlaONp ферментами проводили по методу Visser&Blout (1972). Определение ВТЕЕ-эстеразной активности препаратов ферментов проводили методом Kang&Fuchs (1973).ВАЕЕ-эстеразную активность ферментов измеряли методом Trautshold&Werle (1961). Определение амидазной активности проводили с использованием в качестве субстрата MSAAPVpNA (Nakajima et а/., 1979) Для характеристики биологической активности исследовалась эластолитическая активность препаратов эластазы по скорости расщепления орцеин-эластина (Sachor et а/., 1955).

Аффинный сорбент - гордокс-сефарозу - получали по стандартной схеме, описанной Остерманом, (1985).

Концентрацию белка в препаратах ферментов определяли методом Bradford, (1976), используя в качестве стандарта альбумин сыворотки крови человека

Диск-электрофорез проводили в 10% полиакримидном геле при рН 4,5. Молекулярную массу ферментов определяли методом Laemmli, (1970)(Midget Electrophoresis System Pharmacia LKB Pribori AB) или градиентом (10-15%) полиакриламидного геля ("fast System", Pharmacia LKB Pribori AB).

Кинетические константы при гидролизе низкомолекулярных субстратов, рассчитывали по методу Lineweavera &Вигк, (1934).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Получение, очистка и физико-химические свойства эластазы и катепсина G из лейкоцитов человека.

Получены фукнционально чистые препараты лейкоцитарных ферментов - эластазы и катепсина G, которые использовались для изучения действия на основные компоненты ККС - прекалликреин, фактор Хагемана и их активные формы, и в качестве стандартов при разработке метода определения активности эластазы. За основу метода получения и очистки лейкоцитарной эластазы и катепсина G выбран метод BaughSJravis (1976), а именно: аффинная хроматография, с использованием в качестве лигандов ингибиторов Кунитца, что позволило получать ферменты с высокой

удельной активностью в препаративных количествах. Использование биоспецифической хроматографии на СМВг сефарозе 4В, коньюгированной с гордоксом, основным тканевым ингибитором трипсина Кунитца, позволило получить препараты лейкоцитарной эластазы (при элюировании фермента буфером рН 5,3) с удельной активностью до 25 мкмоль'мин"1 на мг белка, используя в качестве субстрата МЭААРУрМА, и до 10 мкмоль*мин"1 на мг препарата эластазы, используя в качестве субстрата БосА1аОМр; препараты катепсина Э, полученные с того же сорбента второй ступенью элюции с изменением рН элюирующего раствора обладали удельной активностью - 20-40 мкмоль*мин"' на мг белка при использовании в качестве субстрата ВТЕЕ (Нешкова Е.А. и др., 1993)

Рис. 1 Биоспецифическая хроматография эластазы на гордокс-сефарозе 4В, уравновешенной 0.05М трис-НС1 буфером, рН 7.8, содержащим 1М ЫаС1. Элюция эластазы прооедена при рН 5.3, катепсин С при рН 4.5.

На рис. 1 приведены результаты одного из типичных опытов по выделению зла-стазы и катепсина й из одной порциии лейкоцитарной массы. Как видно из расположения кривых, эластаза элюируется с биосорбента пиком при рН 5,3, а катепсин в -

при рН 4,5, оба фермента отделяются друг от друга и баластных белков. При этом пикиактизности ферментов совпадают с соответствующими пиками белка при 280 нм.

Препараты, полученные нами методом ступенчатого элюирования с изменением рН элюирующего раствора с гордокс-сефарозы, не уступают по качеству коммерческим препаратам. Так, фирма "Sigma" и "Calbiochem" выпускают препараты эластазы с удельной активностью 22 мкмоль'мин*1 на мг белка, с использованием в качестве субстрата MSAAPVpNA.

Для характеристики и идентификации полученных нами лейкоцитарных ферментов была определена их молекулярная масса, исследованы электрофоретическая подвижность, температурная стабильность, рН оптимум действия, субстратная специфичность и ингибиторный спектр.

Субстратную специфичность препаратов эластазы определяли, используя в качэ-стве субстратов BAEE, ВТЕЕ, BocAlaONp и MSAAPVpNA. Препараты эластазы не расщепляли ВАЕЕ и ВТЕЕ. В таблице 1 представлены кинетические константы одного из полученных нами препаратов по низкомолекулярным субстра-там:ВссА1аОИр и MSAAPVpNA.

Таблица 1

Кинетические свойства эластазы из лейкоцитов человека

Субстрат рН t.°C kkat (с1) Km(mM) kkat/Km. М-1 с1

BocAlaONp 6.5 37 4.1 0.35 11714

MSAAPVpNA 7.5 37 11.7 0.10 117000

Величины полученных кинетических констант хорошо согласуются с данными, имеющимися в литературе (баид/)4 7>ат, 1976; 8/еЛ, 1986).

Способность эластазы расщеплять высокомолекулярные субстраты была определена по скорости расщепления орцеин-эластина. Соотношение скоростей расщепления орцеин-эластина препаратами лейкоцитарной эластазы, полученными в нашей лаборатории, и коммерческим препаратом панкреатической эластазы составляло 1:4. Подобное соотношение активностей лейкоцитарной и панкреатической эласта-

зы в отношении этого субстрата было получено ВаидЬ&Т^/з, 1976. а также ЗапоПо,Ва&сЬ,1971.

При исследовании действия ингибиторов на лейкоцитарную эластазу (0,3*10"6 М) было выявлено, что полное подавление активности эластаэы наблюдается при действии ИТС (2« 10'5 М) и инактиваторов сериновых протеиназ ФМСФ (6-10"4 М) и ДФФ (1'Ю"3 М). Овомукоид (9,7*10'5 М) и гордокс(7,5-10'5 М) ингибировали фермент на 65% и 20% соответственно. Максимальную скорость расцепления при использовании в качестве субстрата МБААРУрИА лейкоцитарная эластаза проявляла при рН 7,0-7,5.

При изучении температурной стабильности эластазы было установлено, что при прогревании в течение 3-х часов при 37°С активность фермента падает вдвое, а выдерживание при 45°С уменьшает эффективность препарата до 27% от начального уровня через 2 часа.

Диск-электрофорез в ПААГ выявил наличие трех основных и одной слабовыра-женной белковых зон. Молекулярные массы изоформ эластазы, определенные методом ¿.аетт//, 1970 в плоском вертикальном полиакриламидном геле, имели следующие величины 26300, 27800, 28900 Да. Такое же распределение по изоформам было выявлено ВаидЬ&Тгау'я, 1976.

Препараты катепсина в, полученные по указанной схеме имели удельную активность 20-40 мкмоль'мин'1 на мг белка по ВТЕЕ,выходом по эстеролитической активности 85-90 % и не проявляли активности в отношении низкомолекулярных синтетических субстратов, специфичных для эластазы (ВосА1а(ЭДр, МБААРУрЫА). Оптиму-мум рН энзиматического действия для катепсина й составил около 8,0; Кт имела величину равную 1,8 тМ при использовании в качестве субстрата ВТЕЕ .

Молекулярная масса катепсина в, определенная в градиентном геле с ДС-Ыа была равна 27 кДа.

Катепсин в проявлял большую устойчивость по отношению к повышенным температурам чем эластаза - через 4 часа прогревания при 37°С и 45°С активность фермента составляла 85% и 80% от начальной активности. С целью определения чувствительности катепсина С к ингибиторам сериновых протеиназ были использованы следующие ингибиторы: овомукоид (2,2*10"5 М) ИТС(3.0-10'5 М). гордокс (2.2-10 5 М),

ФМСФ (0,6*1 CT3 М) и е-АКК (3,0-10"2 М). Как показали результаты, все ингибиторы подавляли активность катепсина G на 50-65%, е-АКК - лишь на 20%.

Представленные результаты свидетельствуют, что предложенный метод получения лейкоцитарных ферментов - эластазы и катепсина G из одной порции лейкоцитарной массы прост и не уступает по эффективности известным ранее, а свойства полученных ферментов соответствуют таковым для препаратов эластазы и катепсина G, полученными другими авторами.

2. Действие лейкоцитарных эластазы и катепсина G на фактор Хагемана, прекалликреин и их активные формы.

В соответствии с современными представлениями пусковым звеном регулятор-ных механизмов взаимодействующих систем гемокоагуляции, фибринолиза, кинино-и ангиотензиногенеза, а также систем комплемента, является взаимоактивизацчя прекалликреина и фактора Хагемана в так называемой "контактной" фазе. Молекулярные механизмы взаимодействия участников контактной активизации протеолиза исследованы достаточно детально (Berrettin et al., 1987; Kaplan et al., 1987 и др.). Нарушение механизмов регуляции активности ключевой системы плазмы крови - ККС, а следовательно и других протеолитических систем, приводит к патологическим состояниям, сопровождающимся воспалительной реакцией организма. Однако действие грзнулоцитарных протеиназ, секретируемых из гранулоцитов при воспалении на важнейшие ключевые протеиназы практически не изучено.

Результаты, полученные при исследовании воздействия основных сериновых лейкоцитарных протеиназ, эластазы и катепсина G, на ключевые ферменты ККС показали, что лейкоцитарные ферменты инактивируют данные ключевые факторы. Эла-стаза инактиаирует прекалликреин, фактор Хагемана и их активные формы. Анализ данных показал, что 1мЕ эластазы за одну минуту способна инактивировать 50% потенциальной активности фактора Хагемана и его активной формы. Инактивирующее действие эластазы в отношении прекалликреина и калликреина примерно в 20 раз ниже, чем ее инактивирующая способность в отношении фактора Хагемана(рис. 2).

Катепсина G, в отличие от эластазы, не влиял на активность калликреина и потенциальную активность прекалликреина даже в течение 30 минут инкубации. Фактор Хагемана, в нативной и активированной форме, оказался столь же неустойчивым к

M II II

Рис. 2 Инактивируюшее действие лейкоцитарной эластазы на нативный фактор Хагемана ((XII), прекалликреин (ПК) и их активные формы (IXIIa, К) в зависимости от времени инкубации (в % от начальной активности).

действию катепсина G, как и к действию эластазы. Расчеты показали, что 1 мЕ ка-тепсина G за 1 минуту способна инактивировать 0,1-0,2 мЕ/мин нативной или активной формы фактора Хагемана (Рис.3).

Итак, на основании приведенных данных можно заключить, что основные гранулярные протеинаэы ПМЯЛ, эластаза и катепсин G, не активируют прекалликреин и XII фактор свертывания крови ни в начальной, ни в последующих стадиях взаимодействия. Наши данные совпали с результатами, полненными Schmidt et а/., 1975, однако не подтвердили выводов Meieretal., 1989, о начальном активирующем, а затем инак-тивирующем действии на фактор Хагемана эластазы тучных клеток и базофилов, идентичной, по мнению авторов, эластазе лейкоцитов.

4 В 12 мЕ като-псин С

Рис. 3 Действие кателсина в нейтрофилов человека, в ивисныостиог количества, на фактор Хагеиана и его активную форму (в % от их начальной активности).

Таким образом, нейтральные протеиназы, освобождаемые из гранул «ейтрофила во внеклеточное пространство при активном фагоцитозе или дегрануляции клеток, могут играть патогенетическую роль при многих состояниях, характеризующихся нарушением функций основных протеолитических систем плазмы крови.

3. Разработка метода определения лейкоцитарной эластазы, находящейся в комплексе с «1-протеимазным ингибитором в плазме крови человека.

Определение активности уровня лейкоцитарной эластазы в плазме крови является важным показателем интенсивности процессов активации и дегрануляции ПМЯЛ, степени развития воспалительной реакции и высокого риска развития тромбогемор-рагических нарушений.

Прямое определение активности эластазы в плазме крови связано с определенными трудностями, обусловленными, а основном, быстрым образованием стабильного комплекса с £г1ПИ, имеющим высокую константу скорости ассоциации (107 М'1с"1) (Г/зт^а/уегел, 1933; ВеаПу «Г а!, 1980). Поэтому количество ЛЭ в сыворотке крови

•.) л .1 с т a :i а

Г'«с. 4 Подавление г.емкоцмт»риой эластазы (И-протеииазиым ингибитором, содержащимся а 50 мкл сыворотки кроен донора, no BocAlaONp (кривая 1) и по MSAAPVpNA (кривая 2). Собственная активность эластазы - кривые 3 и 4.

обычно оценивают иммунохимическими методами (Dunn et al., 1985; Neumann et al., 1984).

Одним из немногих синтетических субстратов ЛЭ, расщепляющихся в присутствии а1ПИ плазмы крови и позволяющих определять ее активность, является BocAlaONp (Парфенкова и др., 1989). Другие синтетические субстраты ЛЭ, в частности специфический тетрапептидный хромагенный субстрат MSAAPVpNA, эластазой, находящейся в плазе крови , не расщепляется.

Результаты одного из экспериментов по определению активности ЛЭ после ее добавления в плазму крови представлены на рис. 4. Из рисунка видно, что в присутствии а1 ПИ плазмы крови не происходит полного подавления эстеразной активности ЛЭ, о чем свидетельствует расщепление BocAlaONp. Однако, амидазной активности фермента по гидролизу MSAAPVpNA в этих условиях обнаружить не удалось. Исходя из этого экспериментального факта, свидетельствующего об отсутствии полного подавления эстеразной активности ЛЭ, было высказано предположение, что в присутствии BocAlaONp (0.3 М) и органического растворителя, ацетонитрила (8%), используемого для растворения субстрата, происходит освобождения ЛЭ из комплекса с

а1ПИ. Для проверки этого предположения были подобраны условия, способствующие ослаблению связывания эластазы с а1ПИ и позволяющие определять активность фермента в присутствии этого ингибитора. Активность экзогенной ЛЭ в плазме крови изучали в зависимости от рН среды предварительной инкубации, кони,гит-рации органического растворителя и концентрации субстрата. В результп-показано, что предварительная инкубация ЛЭ с «1ПИ плазмы крови (полноту бирования добавленной в плазму крови ЛЭ «1ПИ тестировали по отсутствию глг,--дазной активности) при низком рН (2,5 - 3) и различных концентрациях органически растворителей (ацетона, ацетонитрила) позволяет выявлять ЛЭ до 60% добавленной активности (по гидролизу ВосА1аО^).

Обычно определение активности ЛЭ, с использованием ВосА!аОМр, растворимость которого в водной среде ограничена, проводят по методу У/^ег&в/ои?, (1972) при конечной концентрации субстрата 0,3 тМ, т.е. при концентрации не превышающей одной Кт.

Изменение состава буферного раствора (заявка на выдачу патента за №93001185/14 от 28.1.93), в котором проводилось определение активности ЛЭ, по-

( !■]()' [.-■] М

па чо 1» ''<> '■'<' '•'■'--м 1;

Им

Рис. 5 Зависимость активности лейкоцитарной эластазы в присутствии плазменного и1-ПИ от концентрации ВосА1аО^.

А: кривая 1 - активность фермента, кривая 2 -активность фермента« присутствии -ли при увеличении концентрации субстрата до ЗтМ. Б: то же в координатах Лайнуивера-Верка.

зволило увеличить концентрацию субстрата до 2,5 тМ, что привело к 100% выявлению добавленной эластазы. На рис.5 показана зависимость активности эластазы от концентрации субстрата(А). Те же результаты, представленыые в координатах Лай-нуивера-Верка (рис.5Б), свидетельствуют, что процесс возможного освобождения эласггазы из комплекса с «1ПИ происходит по кинетике активации фермента суб-

I

стратом.

Полученные данные по 100% выявлению активности ЛЭ (экзогенной) в плазма крови по гидролизу 0осА1аО№р были подтверждены экспериментами определения активности препарата лейкоцитарной эластазы в присутствии очищенного препарата «1Г1И (Таблица 2). Из -таблицы 2 видно, что лейкоцитарная эластаза проявляет 100% своей активности в данных условиях.

Таблица 2

Активность лейкоцитарной эластазы в присутствии коммерческого препарата «1ПИ

Препарат/активность 1 Субстраты

МЭААРУрМ (нмоль/мин«проба) ВосА1аСМр (нмоль/мин'проба)

Лейкоцитарная эластаза *' 13,3 24,6

Лейкоцитарная эластаза +а1 протеиназный ингибитор**' 0,0 25,0

' Инкубационная смесь состояла из 100 мкл фермента (530 мЕ/мл по МЭААРУрЫА) и 100 мкл 0,1 М трис-НС1 буфера, рН в,0. Время инкубации - 5 мин. В пробу для измерения активности отбирали аликвоту объемом 50 мкл.

'Инкубационная смесь состояла из 100 мкл фермента (530 мЕ/мл по МБААРУрМА) и 20 мкл а1ПИ (5 иг/мп) и ВО мкл 0,1 М трис-НС| буфера, рН 8,0. Время инкубации - 5 мин. Объем пробы - 50 мкл.

Из рис. 6 приведены кривые, отражающие активность экзогенной лейкоцитарной эластазы (0,25мкг - 0,75 мкг на пробу), в присутствии находящейся в комплекса са1-ПИ, содержащего в 50 мкл разведенной в 50 рас сыворотки крови, по двум синтетическим субстратам. Кривая на рис. 6 А демонстрирует полное подавление активности эластазы плазменным ингибитором, по гидролизу МБААРУрОД, тогда как данные определения активности фермента по ВосА1аОКр (рис. б В) при максимальной кон-

нЕ/п1хЛз

эластаи

Рис. 6 Активность экзогенной лейкоцитарной эластазы из в присутствии плазменного <;1 -П'1 при использовании МБААРУрМА (А) и 6осА1аОНр (Б) в качестве субстратов. Кривые А1 и Е1 собственная активность эластазы; кривые А2 и Б2 - активность эластазы (добавленной в плазму крови) в присутствии а1-ЛИ.

центрации субстрата в специально составленном буферном растворе свидетельствуют о полном выявлении активности эластазы.

Коэффициент вариабельности активности экзогенной эластазы в сыворотке с использованием ВосА1аОМр при количествах вносимого фермента 0,15-0,4мкг соста-. сил 23-37%, 0,5-0,75 мкг -10-13%.

Приведенные в настоящей работе сведения об условиях выявления полной активности ЛЭ е присутствии а1-ПИ позволили разработать метод определения эндогенной ЛЭ а плазме крови. Низкие значения рН преинкубации комплекса (ЛЭ - а1-ПИ), присутствие органических растворителей, высокая концентрация субстрата создают условия для полного выявления активности ЛЭ в присутствии а1-ПИ.

Предложенный метод был использован нами для оценки эластазоподобной активности в сыворотке крови здоровых людей и при некоторых патологических состояниях, связанных с воспалением.

выводы

1. Предложен эффективный, относительно простой метод получения препаратов эластазы и катепсина G из лейкоцитов человека. Метод основан на использовании бяоспцифической хроматографии.

а) Получены высокоочищенные препараты эластазы с удельной активностью 18 -25 мкмоль'мин"1 на мг белка (субстрат MSAAPVpNA).

б)¡Получены высокоочищенные препараты катепсина G с удельной активностью 20-40 мкмоль-мин'1 на мг белка (субстрат ВТЕЕ).

2. Лейкоцитарная эластаза инактмвирует фактор Хагемана (XII фактор системы свертывания), прекалликреин и их активные формы. Скорость инактивации фактора Хагемана и его активной формы в 20 раз выше чем скорость инактивации прекаллик-реинаи калликреина.

3. Лейкоцитарный катепсин G инактивирует фактор Хагемана и его активную форму; инактивирующее действие фермента на прекалликреин и калликреин не обнаружено.

4. Разработан спектрофотометрический метод оценки активности ЛЭ по гидролизу BocAlaONp; условия проведения определения (рН среды, ионная сила, концентрации органических растворителей и субстрата) позволяют определять активность лейкоцитарной эластазы в присутствии al-ПИ плазмы крови (заявка на выдачу патента за №93001185/14 от 28.1.93).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Varovaya GA, Dotsenko V.L, Neshkova ЕА

Action of some human granulocyte proteinases on serum kallikrein, (actor Xlla and their precursors.

"Proteases Inhibitors". Abstracts of 8th Conf. of Proteolyses. 1990, Wildbankreuth near Tegernsee, Germany, P. 44.

2. Yerovaya GA., Dotsenko V.L, Neshkova ЕЛ

Action of leukocyte elastase and cathepsin G on plasma contact phase components. Ill International Symp. on Proteinase Inhibitors and Biological control. 1991, Brdo, Yugoslavia, June 23-27, P. 55.

3. Dotsenko V.L, Neshkova EA., Yarovaya GA.

The regulating interrelationship of some serine proteinases from leukocyte with the human

plasma kallikrein-kinin system.

Agents and Actions Suppl. 1992, V. 38111, P. 144-156.

4. Yarovaya G.A., Shutov E.B., Dotsenko V.L., Ermolenko V.M., Neshkova E.A. Interaction between leukocyte proteinases and plasma kallikrein-kinin system (KKS) as a possible reason of disturbances in haemostasis during chronic renal failure (CRF) and hemodialysis (HD).

Abstract Book ofKinin'93, Brazir, Guaruja, SP-Brazil, October 17-22, 1993, P. 42

5. Нешкова E.A., Доценко ВЛ., Яровая ГА.

Оценка активности лейкоцитарной эластазы, находящейся в комплексе cal-протв-иназным ингибитором в плазме крови.

Ill симпозиум "Химия протеолитических ферментов, поев, памяти В.К. Антонова'. 1993, 24-28 апреля, С. 95.

6. Нешкова ЕА., Доценко BJ1., Яровая Г.А.

Эффективный одноэтапный метод получения эластазы и катепсина G из лейкоцитов человека.

Биохимия. 1993, Т. 58, № 12, С. 1886-1892.

7. Доценко ВЛ., Нешкова Е.А., Яровая Г.А.

Выявление лейкоцитарной эластазы из комплекса с плазменным а-1 протеиназньш ингибитором по ее энзиматической активности с синтетическим субстратом. Вопр. мед. химии. 1994, Т. 40, № 3, С. 20-25.

«п .Пс»«» ilO-lOO