Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Глутаминсинтетаза и глутаматсинтаза листьев пшеницы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Глутаминсинтетаза и глутаматсинтаза листьев пшеницы"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОЖШ т. А.Н." БАХА

КИМ ЭЛЪДАР ЭРНБСТОВИЧ

УДК 577.152.631

ГЛУТАМИНСШТЕТАЗА И ГЛУТАМАТСИНТАЗА ЛИСТЬЕВ ПШЕНИЦЫ

03.00.04 - Биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ' •диссерташш на соискание ученой степени кандидата биологических наук ■

На правах рукописи

Москва

1991

Работа выполнена в группе энэимологии ассимиляции аадлиака Ордена Ленина Института биохимия им. А.Н.Баха

Научный руководитель - доктор биологических наух,

профессор З.Г.Евстигнеева

Официальные оппонент« - доктор биологических

наук В.И.Муронец

-.кандидат биологических наук А.В.Софьиа

Ведущая организация - Институт почвоведения и

фотосинтеза АН СССР

Защита состоится " а^ТЛ^АЯ,* 1991 г. в 10 часов на заседании специализированного совета (К 002.9S.0I) по присуждению ученой степени кандидата биологических наук в Институте биохимии им. А.Н.Баха АН СССР (117071 Москва, Ленинский проспект, 33,корпус 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологический литературы АН СССР (117071 Москва, Ленинский проспект, 33,, корпус I).

Автореферат разослан я ЛУ 1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор биологических наук

М.И.Молчанов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРА ЯШ РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Зерновые культуры обеспечивают почти половину всех запасов белка для человечества. Еа.тлг-л направлением в решении задачи повышения продуктивности зерновых культур я увеличения их белковости является изучение энзимоло-гдя биохимических процессов, леяащих в основе усвоения растениями неорганического азота (Прянишников,1945; Кретович,1954).

Изучение уровня активности ферментов и органной топография процессов, определяющих усвоение неорганического азота (Измайлов, I98S), актуально как о теоретической, так и с практической точки зрения. На этой основе могут о успехом решаться не только вопросы диагностики обеспеченности растешь'! азотом, необходимости и сроков внесения азотннх удобрени,", но и вопросы способа внесения этих удобрений в целях получения максимальной продуктивности сельскохозяйственных растений.

Знание особенностей распределения активности •рерментов, катализирующих реакции ассимиляции минерального азота мояду различными органами, представляет значительный интерес в создании теоретических основ для целенаправленных селекционных работ по получению оортов о высокой ассимилирующей способностью и, соответственно, с повышенным Содержанием белка в зерне. Усвоение аммиака растениягди может происходить, в первую очередь, .с помощью фермента глутаминсинтетазы (ГС, КЭ 6.3.1.2.), а также глутачатдегидрогеназы (ГДГ, К5 1,4.1.2; I.4.I.3; 1.4.1.4).' Образующийся глутамин используется на синтез ряда ваннейших азотсодержащих соединений клетки, в том числе на синтез глутаишовой кислоты в реакции, катализируемой глута-матсинтазой (ГОГАТ, Г2> 1.4.1.13; 1.4.1.14; 1.4.7.1).

В настоящее время сложилось представление, что главный путь ассимиляции аммиака у растений проходит через реакции, катализируемые ТС и ГОГАТ, По сравнению с ГС и ГОГАТ из микроорганизмов и ряда высших растений ( /П/Л^ ¿га ,197б; Евстигнеева, 1988) у пшениш эти ферменты изучены недостаточно. Можно указать лишь работы В.Л.Кретовича с сотрудниками (Крето-вич, Евстигнеева, 1949; К{5етович, Яковлева, 1959), исследовавших биосинтез глутамина в проростках пшеницы и созревающем колосе, затем работу Стрсйта и Феллера ( Streit, fetter , 1983),

которые показали наличие двух форм ГС в листьях пшеницы, а также работы Е.В.Быковой (1387) и Н.Д.Алехиной с сотрудниками (1984, 1986) по изучению 1С из корней пленной. В отношении ГОГАТ пшеница известна лишь одна работа, посвященная изучении ферредоксинзависимой ГОГАТ Мд-ГОГАТ) из листьев пшенииы ( 1/7елр, ТЪлцг ,1987). Все вышесказанное предопределило постановку данной работы.

Целью работа явилось изучение ГС и ФдгГ0ГАТ из листьев псенкш. В задачи работы гходило:

1. Разработать метод очистки и 1.0лучить в гомогенном состоянии наиболее активную - хлоропластную форму 1С листьев пшеницы, изучить ее структуру, кинетику и регуляцг...).

2. Разработать метод очистки Фц-ГОГАТ из листьев пшеницы и на очищенном препарате определить наиболее важные кинетические параметры.

3. Изучить распределение по органам растений пшеницы активностей основных ферментов ассимиляции азота в процессе вегетации

4. Исследовать вопрос, о наличии согласованности в индукции синтеза ГС и 1д-Г0ГАТ в листьях пшеницы.

Научная човдзна работы. В результате проведенных исследований обнаружено наличие двух форм ГС в листьях пшеницы: гито-зольной " хлоропластной. Разработан метод очистки хлоропласт-ной ГС.

Установлено, что хлоропластная ГС является олигомернш ферментом, состоящие« из 8 идентичных мономеров с молекулярной массой 53 ООО Да, для которых впервые изучены физико-химические и кинетические характеристики.

Показано наличие регуляции ГС хлоропластов листьев пшеницы по принципу отрицателиюй обратной связи рядом аминокислот.

Разработан метод частичной очистки 1>д-Г0ГАТ из листьев пшеницы и определены некоторые кинетические параметры фермента Обнаружено, что активность ключевых ферментов азотного обмена нитратредуктазы(НР), 1С, ГДГ, Фд-ГОГАТ на всем протяжении веге таиии коррелирует с дозой азотных удобрений, вносимых в почву, что создает благоприятные условия для усвоения; минерального азота яровой пшеницей. Исследовано распределение активности этих ферментов по органам растений пшеницы и показано, что ак-

тивность ГС намного выше, чем активность Фд-ГОГАТ и ГДГ. Наличия согласованности в регуляции синтеза П! и Фд-ГСГАТ рядом азотсодержащих метаболитов не обнаружено.

Практическая ценность работы. Полученный экспериментальный материал расширяет и углубляет общие представления для понимания процесса усвоения неорганического азота плениней. Обнаруженная зависимость мевду содержанием азота в почве л активностью ключевых ферментов азотного обмена в растениях таениш может служить показателем интенсивности процесса усвоения азота. Результаты работы могут быть использованы для разработки методов повышения белковости зерна пшеницы.,

■Апробагтя работы. Основные положения диссертации доложены на совместном заседании лаборатории метаболизма азота и биосинтеза белка и группы энзимология ассимиляции амгиаха Института биохимии им. А.Н.Баха АН СССР.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 работы, I работа сдана в печать.

Структ.уп и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов а списка литературы. Работа изложена на 129 страницах машинописного текста, иллюстрирована 16 ' рисунками, 10 таблицами и 2 схемами. Список литературы включает 178 наименований.

' МАТЕРИАЛЫ И МЕТОД! ИССЛЕДОВАНИЯ .

I. Опытный матечичл. В качестве объекта исследования были использованы растениг пшеницы ( ТнЬ'сит ае^Т/уил? I. ) двух сортов: яровая "Московская 35я и яровая "Казахстанская 4". В вегетационных опытах при выращивании на двух различных уровнях азота использовали яровую пшеницу сорта "Московская 35". Для всех остальных исследований использовалась яровая пшеница сорта "Казахстанская 4".

Проростки.пшенчцы выращивали в условиях оранжереи. В работе использовались 10-дневные проростки. В опытах по изучению активности основных ферментов ассимиляции азота в процессе вегетации на двух уровнях азотного питания, выращивание растений проводили в вегетационных сосудах во Всесоюзном научно-исследо-

вательском институте удобрений и агропочвоведения им. Д.Н. Пряшшникова. Азот вносили в форме Ca(N03)2 дробно. Количество азота, внесенное в сосуд, к урожаю составляло при недостат ке азота 0,2 г, а при высоком его уровне 1,5 г.

Для получения ферментных экстрактов замороженные в жидком азоте образцы разрушали растиранием их в ступке. Экстракции проводили двумя восовши частями буфера следующего состава: в случае очистки 1С - бы* трис- HCI с рН 7,4, 2мМ ЭДТА, 2м.'. 2 - меркаптоэтанола; в случае очистки Фд-ГОГАТ - 5СШ ка-лиЕ-фоо!атный буфер с рН 7,5, 100Д..1 KCI, £»¿.1 ЭДТА, O.IiS 2 -меркаптоэтанола.

2. Методы исследования.

. Определение активности глутаминсинтетазы проводили методом Эллиота ( £lhott ,1953), основанном на количественном измерении f -глута:лг.лгпдроксамата ( /•- ГГК), и трансфераз-нш методом ( Shapiro, Sta^fmant 1970).

Определение активности тлутаматдегидоогеназы проводили спектро^отометрически по образованию НАД* (Пшшанов, 1981).

Определение активности НАДН-РОГАТ проводили спектрофот метрическим методом, по образованию НАД* .( ffl'Ufj Stoe/t/no, 1972).

Активность Фд-ГОГАТ определяли по образованию L -глута мата по методу ( Л7а7оА et°7., 1980).

Определение актаы^тп КР проводили по Мульдеру ( Ерма ков, 1987).

За единицу активности принимали количество фермента, ха тализирущее образование 1:лкмоля определяемого вещества за I минут. Удельную активность виратлли числом единиц активности на I мг белка.

. Аналитический электрофорез проводили в 7,5,? полиакрил-амидном геле по методу Дэвиса ( J>avis , 1964).

Молекулярную массу олигомера 1С определяли методом гел! фильтрации на колонке с _ HW65.

Молекулярную массу мономера ГО определяли методом электрофореза в полиакрилаыидном геле в присутствии доде-дилсульфата натрия ( \Уг6ег} ûiLom, 1969).

Белок определяли по методу Лоури ( Lowryet о/. , 1951]

Содержание ач-.'.кака определяли по Несслеру в ыодифика-

ции Любимова ^Любимов и др., 1968).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

I. Исследование глутаминсинтетазы дз листьев ппегошы.

Из литератур!гых данных известно, что в листьях ппеняпы присутствует весьма активная ГС. Стрейт и Феллер ( Sí^/f , FeUer ,1983), а затем Е.В.Бккова (1987) показали наличие двух форм 1С, которые были идентифицированы ими как нитозоль-ная 1С I и хлоропластная 1С И, составляющие, по даниил Стрей-та и Феллера, соответственно 8% и 92# от общей активности. Поскольку более углубленнее исследования в этом направления не проводились, нами была предпринята работа по очистка ГС из листьев пшениш и исследованию физико-химических и кинетических свойств наиболее активной формы - 1С П, полученной нами в гомогенном состоянии.

1.1« Выделение глутаминсинтетазы из листьев пзенига.

Очистка глутаминсинтетазы из листьев пшениш представлена в табл. I.

Таблица I

Очистка глутаминсинтетазы из листьев пшениш

Cwm ! Обаий I давность ¡Выход. [Степень очистки ¡белок,Mr¡ Общая, ¡^дельная,} % ¡очястки í j ед. ! ед/мг j ,

г * • * 1

Í. ИСХОД1ШЙ

экстракт X32,00 7650 7,2 100,0 1,0

2. Высаливание ("H4)2so4

от 0 до 30?

насыщения 253,00 6300 • 25,0 83,0 3,5

3. Ионнообменная

на МАе-У . ,

_ 550 !Д 9,50 5240 551,0 68,5 76,5 4. Гель-фильтрашш ,

на ТсуорРог/.

VW6S- 2,45 2400 991,0 31,0 137,0

- б -

30 40

Номера фракций

Рис.1. Про]иль элвшш белков с колони; АШ-Гоуо-реяг? Элешш трис-аиетатом: I-белок, 2-кониентрачия элюенга, З-актшшостьГС

Экспериментальные данные показывает, что предложенный способ очистки позволяет получить гомогенный фермент с удельной активностью 991 ед/мг белка. Степень очистка 137,виход 31''.

На рис. I приведены результаты ионнообмениой хроматографии. Первш пахом выходит 1С Т, активность которой составляет С!? от общей активности Фермента. Фракция сильно загрязнена бш1ластш:ли белками и в дальнейшей работе не использовалась. Второй пик активности, составляющий 94.? и содержаний ГС П, собирался и использовался для дальнейшей очистки. В грубом экстракте присутствует нлзкомолекулврный ингибитор 11!, для удаления которого необходимо проводить гель-фильтрашш на се^а-дексе Г-25 ила продолзительный диализ.

1.2. Свойства, структура и кинетические характеристика . хлоропласиной глутаминсинтятазы пз листьев пшеницы. ,

Свойства.

1С П листьев пшениш инактивируется в ьрасутствиа умьрон-ных концентраций солей металлов, однако проявляет стабильность в присутствии органических солей с высокой ионной силой (табл. 2). Такая "чувствительность" ГС П к присутствию солей металлов с в то Ев время переносимость высокой войной силы органических солей является ее характерной особенностью.

Таблица 2

Влияние ионов солей на активность глутаминсинтетазы из хлоропластов пшеницы

Концентрация соли, 1А Время инкубации, час. • Относительная активность, % ст контроля

КС1 1 КаС1* ! МдС12 Токе-- Трпс-| Трис- -¡йлада- | НС1 ¡цитрат ¡ацетат ¡зол-НС!^^ |аце3^

I 16* 108 88

0,25 2 100 52 44

. 3 48 32 0

I 30 38 120

0,50 2 14 24 35

3 7 5 'о

I 20 28 132

1,00 2 ' 12 2 24

3 3 0 0

- - - - -

92 100 132 90 89 86

87 98 132 80 85 76

85 93 120 75 82 73

х) Измерения не проводились.

Молекулярная масса олигомера била определена методом гель-фильтрацпн и составила 500 ООО Да.

Молекулярная масса мономера определена методом электрофореза в полиакрилачидном геле в присутствии додепилсульфата натрия к составила 63 ООО Да.. .

Кинетические характеристики хлоропластной 1С листьев ггше-

hi'ihi.

Кинетические характеристики активности фермента определяли гидроксаматным методом в присутствии Г.1д2+ (рН смеси 7,4). Била исследована зависимость активности 1С П от температуры. При 15 мин. инкубации максимальная активность наблюдалась при 40°С. Зависимость активности 1С П от времени инкубации имеет линейный характер в пределах от 0 до 15 минут. Оптимальное значение рН реакционной смеси для работы фермента равно 7,4. Зависимость активности 1С от концентрации в решшионной смеси имеет линейный характер в пределах 0 - 0,05 мг/мл.

lia рис. 2 представлена зависимость скорости реакции 1С от концентрации глутамата. Как видно из графика, эта зависимость характеризуется наличием положительной кооперативное^.. Инги-бирования избытком субстрата не наблюдается. Значение равно 7,7!/:,!, что близко к значению K,'ja,t для корней ппенииы.-7,2î.i.î (Быкова, IS87) и 1С корней тыквы - 6,2м,'.1 (Голова и др., 1964).

Зависимость активности фермента от концентрации гидроксил-амина (рис.3) характеризуется наличием положительной кооперативности и ингибированием избытком субстрата при концентрации гидроксиламина более 5л,1. Величина равна 2мМ.

Рис. 4 иллюстрирует зависимость активности ГС П от концентрации ATÎ при постоянной концентрации равной I5lîA. Величина I^32 для AÎÎ равна O.a.i.i. При концентрации ATJ виде 2мМ наблюдается субстратное ингибарование , что характерно для большинства растительных 1С при высоких концентрациях АТЗ.

1.3. Регуляция активности глутаминсинтатази хлороплаотов листьев пшенини аминокислотами.

Из литературных данных известно, что активность 1С высших растений ингибируется аминокислотами, для синтеза которых используется амидный или аминный азот глутамина (Евстигнеева,

1С П листьев пшеницы в координатах !Аихаэлиса-Мектен (А), .ЯаГтуи-вера-Берка (Б) и график Хилла (В)

ность ГС П листьев тгенииы в координатах .'.'ихаэлиса-Ментен (А), Лайнуивера-Берка (Б) и график Халда (В)

[АТТ] ,!.<.

Рис.4. Влияние А1Ф на активность ГС П

листьев пшениш в координатах Миха-* Элиса-Ментен (А), Лайнуивера-Берка (Б) в график Хилла (В)

Рис. 5. Влияягз аминокислот на активность ГС листьев паешшы при ненасыщающей 8 г.а (сплошная линия) и насыщающей 80 (пунктирная линия) концентрации глутачата: 1,1 -гли-, цин;2,2-аланин;3,3-аспарагин;4,4-аспарагиновая кислота

Пушкин, 1983). Наибольший ингибирущий эффект на ГС из корней пшенипы оказывают аспарагиновая кислота и аспарагян. Глинин а ■ аланин так яе ингибируют фермент (Быкова, 1987). Исходя из этих сведений, для изучения регуляции аминокислотами 1С П листьев пшеница нами в работе были выбраны те гв аминокислоты, которые оказывали ингибирувдий эффект на 1С корней пшеницы.

Влияние аминокислот на активность ГС П при насцщапздзй 80,¿.1 и ненасыщающей БкМ концентрациях глутамата представлено на рис.5, из которого видно, что исследованные аминокислоты ингибируют фермент; наибольший ингибирущий эффект показывает аспарагиновая кислота. Ингибирущий эффект аминокислот усиливается при ненасыщающей конгонтрацлл глута\тата, что, по-видимому, свидетельствует о наличии конкурент:;! мезду аминокислотами. и глутаматом за связывание с активным центром фермента. Полученные результаты близки к результатам опытов Е.В.Быковой (1987), полученных для корней пшеницы.

2. Исследование фероедоксинзавпспмой глутаматсинтазы из лгстьев пшенипы.

Литературных данных о свойствах Фц-ГОГАТ пшеницы практически нет, за исключением работы ( гл'елр, 1987),где определены некоторые свойства частично очищенного препарата Фд -ГОГАТ. В связи с этим нами была проведена работа по очистке Фд-ГОГАТ из листьев пшеницы и на полученном препарате определен ряд кинетических характеристик.

2.1. Выделение йерредоксинзависимой глутачатсинтазы из листьег тпеиипы.

Результаты очисгки Фд-ГОГАТ из листьев пшеницы представлены в табл. 3.

Таблица 3 Очистка Фд-ГОГАТ из листьев пиенипы

Стадия очистки

Общий ! Активность ! !

белок,' |-гийая—17далъная"ЧВнЗ°Д» 1Степ9нь мг ! иодая, |удельная,. д 1отстт

2 ; 3 ? 4 ! 5 ? 6

Т. Исходный экстракт

1140,0 71,8 0,053 100

1.0

2.

, Сл ¿о ^о 50/ ¿?,/7 ¿О

- 12 -

Продолжение таблицы 3

I

! 2 ! 3 ! 4 ! 5 ! 6

3. Препарат после инкубации в течение 3 суток при

4° С 456,0 71,5 0,157 100 2,5

4. Длинная хрома-тограЪкя на АН-глутамат-сефа-розе

13,6 10,7 0,787 15 12,5

Как видно из таблицы, в результате этой процедуры достигается степень очистки 12,5 раз с выходом по активности 15%.

2.2. Кинетические характеристики ферредоксинзаввсимой глутй'.'.атсинтазы листьев пшеницы.

Для Од-ГОГЛТ листьев пшеницы бшш определены оптимальные условия для протекания реакции. Установлено, что зависимость активности Фд-ГОГАТ от концентрация белка в реакционной смеси смеет линейный характер в пределах 0 - 5лг/мл. Показано, что зависимость активности фермента от временя инкубации носит линейный характер вплоть до 60 мин. Оптимум рН для действия ферментов - 7,5. Сермент максимально активен при 40°С.

На рис. 6 представлена зависимость скорости реакции Фд -ГОГАТ от концентрации гдут.илана. Значение К^3* в 1,2мМ. Рис.7 иллюстрирует зависимость активности Од-ГОГАТ от концентрация 2-оксоглутарата. Ее ли чина К^325 для 2-оксоглутарата равна 0,55ы.М. Кривые, насыщения Фд-ГОГАТ листьев тле ниш для обоих субстратов подчиняются гиперболической зависимости, что характерно для большинства растительных Фд-ГОГАТ.

3. Регуляция Ферментов ассимиляции азота у пшеницы.

3.1. Активность Ферментов . первичного усвоения азота в различных органах пшеницы в процессе вегетации.

Применение азотных удобрений является надежнш способом, повышения уровня белка в зерне при одновременном повышении урожайности (Павлов, 1967; Минеев, Павлов, 1981). Однако известно, что с;повышением дозы удобрения коэффициент использования азо-

ñ л

ною

aw/us'чхооннихав шгич!гз1гх

£

( > t.;

W

m

В

ё И: а>

а) t* "i

t-:

« '( i.;

а) га V'

Л С1 п.

H

о 1 ; .0

№ 1

г ; с: . 1

к ( !

ÍU

-Ç • ■ (■:

; ^

« J

i i а)

i н г -I

>1 fj

а;

>4

» H 1

I о га

H о я

m Г4

я. M l^í

СО д п,

н f+ о

£ а о

i-.

о ГС я

о ж

Л к m

? g я

см СО S

» * р.

s g

иэ £ m

« а>

о .q

о H

к о

Y щ

S1« Oí

f-1

CD

g p-t g

<м п 1

к w

o>

• г-

•

о

л 4

и

К ш

:г л

а

S -si я

ад

о о

аи/Яе'чмонашив нвнигэи^

.Я

та растением снижается, и значительная часть удобрения сл источником загрязнения почвы и воды. Кроме того, в этих ж ловаях большие количества нитратов накапливаются в вегета ной массе, что свидетельствует о том, что растение не мож полностью усваивать поступивший в него.азот. Установлено, оптималънш является дробное внесение удобрений частично посеве, частично в период цветения и начала формирования зерна.

Поскольку эффективность усвоения растениями неоргани ких форм азота определяется уровнем активности ключевых ф ментов ассимиляции азота можно преддолоаить, что дробное сеяие оптималышх доз азота позволяет поддерживать в раст такой уровень активности, который обеспечивает его эффект ное усвоение.

В связи с этим, было проведено исследование активное ферментов, катализирущих последовательные реакции усвоон нитратов и затем аммиака: IIP, ГС, Фд-ГОГАТ и ГДГ в наземн вегетативных и репродуктивных органах яровой пшеницы "Мое екая - .3" при недостаточной и высокой обеспеченности азота ди\ эксперименты проводились сошестно с сотрудниками Все ног научно-исследовательского института удобрений и arpo поведения им. Д.Н.Прянишникова А.Н.Павловым, С.В.Кирнос Е.Н.Черновой.

Изменение активности ферментов ассимиляции азота в о; пах шеницы в процессе вегетации, а такае активность ферм тов ассимиляции азота в колоса пиеняиы в фазе молочной сп сти на недостаточной и оптимальной дозе азота представлен; таблицах 4 и 5, соответственно..

Сравнение активностей HP, ГС и ГДГ в различных орган; пшеницы позволяет сделать заключение о наличии прямой зав; мости активностей ферментов, катализируких реакции ассим шш неорганического азота, а такse Фд-ГОГАТ от дозы мине] ного азота, внесенного з почву.

При недостатке азота активность всех исследованных ф< тов на протяжении вегетации была практически на порядок hi чем при его высокой дозе. Как видно из полученных данных, ное внесение высокой дозы азотных удобр.ниЗ не приводит к россии синтеза ключевых ферментов азотного обмена, и, еле;

вегетппли на недостаточной г -риант 1; и оптимальной (вариант 2) дозе азота

1 I | | Фазы в е г е т а ц и и

Орган (Вариант! » 1 кущение 11 .1 1 ¡начало трубу- сере дина { ; кования ;трубкования; колошение ^ие^ерна" 1 ¡молочная ¡спелость

' I ! 2 ! 3 ! 4 • ! 5 ! 6 ! 7 ! 8

Листья Стебла

1

2

1 2

Активность НР,

Листья - I 0,12 0,12 0,54 0,42 0,06 0,006

2 2,28 3,60 7,62 3,30 0,90 0,240

Стебли I _*) 0,06 0,18 0,48 0,18 0,018

2 - ■ 0,30 0,31 0,72 0,54 0,120'

Активность ПЗ,

3,37 20,52

5,35 128,63

3,44 23,21

51,74 474,25

57,59 33£,01

раст.

191,02 1925,10

114,89 1306,10

21,72 253,89

65,54 254,5?

12,23 334,37

28,04 523,26

«л I

Продолжение таблицы 4.

■г » im » 2 ! з ! 4 ! 5 —г --' » о i 7 î е

Активность ¿w TY1T4T мкмоль глутамата

АША1'"ч.'орган Грает;-

Листья 1 2 0,17 1,05 0,19 3,76 0,50 5,56 0,34 4,17 0,12 4,82 0,05 1,37

Стебля 1 2 - _ 0,34 3,11 1,03 3,45 1,35 2,39 0,31 1,97

• Активность титр миноль НАД* Ч-орган ipacT.

Листья 1 2 2,37 25,63 14,06 193,32 16,73 144,61 10,61 83,45 13,47 159,19 6,13 98,64

Стебля 1 2 - 1,64 11,14 28,79 172,18 26,95 423,54 54,15 378,05 93,48 498,47

^Измерения не проводились

тельно, процесс усвоения пшеницей азота при такой илио-п-н ии происходит в течение всей вегетация достаточно интьш:иыю.

Максимальная активность ферментов в листьях и итегшр наблюдается в период середины трубкованкя и начала нолоагц.ы пшениш. Активность всех исллецоьаиных Лшрминтов оциншоио коррелирует с дозой азота как в листьях, так и в «леб.ичх. ни-рост активности ферментов в варианте на высокой дозе h.joivi хорошо соответствует результатам С.В.Кпрпос с соавт. (I^'ft), ш> казаваих, что увеличение уровня азотного питания прл^j.;ht к увеличению урожая и Зелковистости зерна пшеницы. ¡¡¡-и ичмипинии уровня азота от низкого до высокого масса эешт ылш,. лась более чем в четыре раза.

Даяние таблицы 4 позволяют сделать заключение, чш асси -цг.ляцг'.п неорганического азота в реакциях, каталазируечих IIP, Р;, ГДГ, осуществляется как в листьях, так и в стеблях риив-нлй, а интенсивность процесса изменяется в течение вегатш .ы, Активность IIP, кроме стадии колошения, била вша в ли.дь ях, чем в стеблях, в то время как активность ГДГ бш« вше в стеблях. ГС, активности которой в период начала колглинля бы ла на порядок выъа, чем активность ГДГ, и на два порядка,чвм активность Фд-ГОГАТ, в начале вегетации была более акгиька в листьях, а в конце - в стеблях.

Таблица 5

Активность ферментов ассимиляции азога в коло :в гг-чнины 'В .{азе молочной спелости на недостаточной ^ дриант I) и опт1"лальиоЙ (вариаит 2) дозе азота

Активность

Чешуя I 0,006 20,75 7,80 0,10

2 0,012 196,43 53,43 0,18

Зерно I 0,018 111,84 41,02 0

2 0,078 662,22 229,41 1,30

Из данных таблицы 5 видно, что в фазе молочной спелости ••ьп'нч активность исследуемых ферментов в колосе (чешуи и зерна), как и в вегетативных органах, была вше в случае высокой цозн впота. В зерне по сравнению с чешуями активность исследу-л>.шх ¡ерментов была выше л 2-3 раза. В чешуях и зернах наибо-г лпе шсока активность ГС. А.Н.Павловым с соавт. (1981) было нпк.Г'Г'ано, что зерновки пшеницы в фазе молочной спелости способны к первичному усвоению минерального азота - нитратного и аммонийного. Таким образом, при усилении потока неорганического ч:»отл в колос нет опасности накопления нитратов в зерне.

Следует отметить, что как при недостатке азота, так и при и„о',.:!.»! азотной нагрузке активность НР и Фд-ГОГАТ в вегетатив-Н11Х органах пшеницы на протяжении вегетации била значительно

Ч1.'М активность 1С и ГДГ. Следовательно, при усвоении плота растением активность НР может ограничивать поток аммо-т:!'чюго азота в систему его ассимиляции, а активность Фд-ГОГАТ - ограничивать синтез глутаминовой кислоты в тандеме реакций ГС/Фд-ГОГАТ.

II.'¿еоменты ассимиляции аммиака у гшениш и регуляция их синтеза.

¡Ьогля была поставлена задача изучить вопрос о координации регуляции синтеза 1С и ГОГАТ как системы ферментов, катализи-¡■учих последовательно реакции, обеспечивающие клетку глута-V(ч!' л1 и глутаматом. До настоящего времени этот вопрос не бил иг.еледоьчн, хотя априорно эта система всегда рассматривается ценс.твующая координорованно.

Как ухе отаечалось выше, 1С/Г0ГАТ цикл в последние годы рассматривается как тандем ферментов, играющий ведущую роль в ассимиляции растениями аммгдка. Однако, имеются данные, что при высокой концентрации аммиака у растений его ассимиляция происходит с участием ГДГ. Например, в созревающих колосьях (Лирное и др., 1988) роль ГДГ становится очень ванной. Е.Д. ¡гипнтов! с соавт.(1985) показали, что увеличение концентрации л?.* ЮЖ1Я в корнях и листьях пшенипы приводит к снижению активности 1С, особенно в корнях, и увеличению активности ГДГ.

В свяри с этим в задачи работы входило исследование ин-■1""или синтеза 1С и тд-ЮГ,\Т в проростках пшеницы при инфиль-

рати ряда азотсодержащих соединений гум винснснин нощ.ш:;! о аличии согласованности и регуляции их

Данные по влиянию азотсодержащих соединен;!.! на синтез ГОГАГ приводятся в таблице 6.

Тиблина о

Влияние нитрата, аммония, глутамата и глутаишш на синтез ГС и ГОГАТ

лфильтрируемое соединение, ¡сспозншш 6 ч.

«2 О

кяо3 (НН4)1^Р04 Глутамат Глут а;.'.ин

]{Я03 (Ш!4)112Р04 Глута-.'.ат Глу:

Относительная активность,%

Относи !>;Л1.н..-,н у - г,-паи глсг'.ыю^-ь,

ГС

Фд-ГОГАТ

100 128 93

125 136

100

200

126 274 239

Л и

ь я

с т

1С0 170 112 146 120

К о р н в

нет активности

то аз

и

1С

100 У9 03 114 Н4

100

151 114 2-17 223

С'.МЫ Л?

100 132 1.,0 I -;7 121

нет Ь и и! и Ньсч ,1

та

н

п

II

Результат опитс с ин£иль грацией в проростка пианипи не-ганических форм аэо^а, а такжа глутамина и гдутааата, ш^'анп , что в листьях наиболзо высокая удельная шссивность 1С а -ГОГАТ наблюдается при ин^ильтрашш глутамата н глутамина. фильтрация аммония в листьях снимет активность 1С. Уроьеи;, -ГОГАТ во всех вариантах онитов вше, чаи в контроле. Мы едполагаем, что глутамат и глутачпц, являясь наилуч&мми еуб» ратаьш для синтеза ряда аминокислот и других азотооцергащах . единений, способствуют интенсификация азотного обмена и, в а числе, синтеза ряда ферментов. Таким отразим, их да..стаие, эоятно, не является специфичным в качестве индукторов саняе-исследуемых ферментов. Однако, полностью исключать спеии-

!>нчноеть действия каждого из инфильтрированных метаболитов

псе 7!£ НеЛЬЗЯ,

Чтобы уточнить причину увеличения активности ферментов при инфильтрации азотсодержащих метаболлтов были поставлены oiiHTii с инфильтрацией этих метаболитов совместно с ингибитора ми синтеза белка. Полученные данные позволяют заключить, что имеет место индукш1Я синтеза, а не активирование этих ферменте п. Так, активность листьев при инфильтрации гдутамата в при' сутствии хлирам[-еникола ниже на 5СЙ по сравнению с опытами бе: х лорам ¡«никола. На основании данных об ингибировании синтеза I'J листьев хлорамреняколом можно предположить, что он осуществляется на 70 S рибосомах хлоропластов.

Индуцированной синтез 'бд-ГОГАТ листьев такие сильнее инг; оируотся хлорамрениколом, чем циклогекелмидом, следовательно этот (;.ерс.;ент синтезируется в хлоропластах, что согласуется с датами для 1>д-Г0ГАТ из других растений ( mcr/oA et al. , 197!

Walhçrove et al , 1972; Si/zi/t/ et al. , 1981)..

11;.1ичие согласованности в индукции синтеза ГС и Фд-ГОЕАТ локализованных в хлоропластах, позволило бы с большей определенностью говорить об этих последовательных реакциях как о ме^ тл5гь..1ческом процессе, управляемом уже на уровне синтеза фар,— ;ло!ттного белка. Однако, полученные нами данные для ГС и Фд-ГчГА'Г листьев пшеницы не позволяют сделать такой вывод. KpoMi того, во всех вариантах опытов уровень активности Фд-ГОГАТ на чм гк)]"пдка нале активности ГГ ( табл. 4,5).

Опыты с инфильтрацией метиошшсулъфоксимина показали, Toi охот ингибитор, специфичный для ГС, не ингибирует 1Ш 5д-Г0ГАТ ни 1МЛН-ГДГ.

В L В О Д Ы

1. Разработан метод очистки глутаминсинтетазы из хлоропластов листьев пшеиипн, позволяющий получить гомогенный при электрофорезе в ПААГ фермент с удельной активностью 991 ед/мг бялка и выходом 31|.

2. Рпервые изучены физико-химические и кинетические хара ■пншетики глутаминсинтетазы хлоропластов листьев пшеницы. Оп-I й,;еле.на молекулярная масса олигомера и ыономера глутаминсин-тетазн из хлоропластов листьев пшеницы 500 ООО и 63 ООО Да,

.;:<пГИОТ1!ТВеНИО.

3. Установлено, что зависимость активности глутяыпнсмн-i-тазы от концентрации субстратов - гдутамата, х'идриксиламтш и АТФ - имеет негиперболический характер.

4. Обнаружено наличие в грубом экстракте листьиь шшншш низкомолекулярного ингибитора глутаминсилтетазы, а ïhkaî .та* тивация хлоропластной глутаминсинтетазн в присутсяыш умеренных концентраций MgCI2, HaCI, KCl и стабильность фермента в присутствии органических солей с высокой ионной силой.

5. Разработан метод, позволяющий получить частично очищенный препарат ферредоксинзависимой глутаматсинтазы из листьии пшеницы с удельной активностью фермента 0,787 ед/'мг белка и выходом 15%. Зависимость активности фермента от концентрашш глттамина и 2-оксоглутарата имеет гиперболический характер.

6. В результате проведенных исследований показано, что дробное внесение оптимальных доз азотных удобрений увели -чивает примерно на порядок активность нитратредуктазы, глута-мпнсинтетазы, глутаматдегидрогеназы и ферредоксинзависимой глутаматсинтазы на протяжении вегетации.

7. В репродуктивных органах - чешуях и зерне - в {азе молочной спелости обнаружена высокая активность глутаминсинтетазн и глутаматдегидрогеназы и низкая -нитратредуктазы и (*м>пи-доксиНзавасимой глутаматсинтазы.

8. Выявлено, что активность нитратредуктазы и ферродок--синэашюмой глутаматсинтазы намного шиш активности 1 'гут'ма:! синтета _ во всех наземных органах растений пшенигш на ьсох стадиях развития.

9. Согласованности в индукции синтеза глутаминсинтета:ш и ферредоксинзависимой глутаматсинтазы азотсодердалими соединениями не обнаружено.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1, Ким Э.Э., Быкова Е.В., Евстигнеева З.Г., Кретович и. >.. Ферменты ассимиляции аммиака у пшеницы и регуляция их оин п: ^ Прикл. биохи;.;. и микробиол.-1990. -Т.26, ЯЗ.-С.364-170.

2. Ким Э.Э., Соловьева H.A., Сиделышкова Л. И., Kbcti< неева З.Г., Кретович В.Л., Чернова E.H., Кирнос C.B., Пни-лов А.Н. Активность ферментов первичного усвоения нвщИсши ческого азота в различных органах пшеницы в процессе ьипид-

Iгии // Нрикл.биохим. и мнкробиол. -I99I.-T.27, йЗ.-С.428-432.

3. Кпм Э.Э., Евстигнеева З.Г. Влияние различных азотсодержащих соединений на активность ферментов ассимиляции я:юта в проростках пшеницы И Сб.-.Повышение устойчивости и продуктивности зерновых культур, Алма-Ата, "Наука", 1991, <!\ 213-216.